KR20120088532A - 대두 이벤트 １２７ 및 이에 관한 방법 - Google Patents

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Abstract

본원은 트랜스제닉 AHAS-억제성 제초제 저항성 대두 식물과 관련된 조성물 및 방법을 제공한다. AHAS-억제성 제초제에 대한 내성을 부여하는 돌연변이된 AHAS 코딩 서열을 갖는 이벤트 127 대두 식물을 제공한다. 확인된 염색체 위치에서 이벤트 127 핵산 분자를 갖는 이벤트 127 대두 식물은 적어도 서열 5 및/또는 6의 핵산 서열을 갖는 게놈/트랜스진 접합부를 포함할 수 있다. 이벤트 127의 게놈 삽입 부위의 특성화는 향상된 육종 효율을 제공하며, 그의 군집 및 자손을 육종하는데 있어서 분자 마커를 이용하여 트랜스진 삽입물의 추적을 가능하게 한다. 이벤트 127 대두 식물을 확인, 검출 및 사용하기 위한 다양한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

대두 이벤트 １２７ 및 이에 관한 방법 {SOYBEAN EVENT 127 AND METHODS RELATED THERETO}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2009년 1월 7일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/143,049에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
EFS-웹을 통해 제출된 서열 목록에 대한 참조
본원은 EFS-웹을 통해 전자적으로 출원되었고, .txt 포맷의 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. .txt 파일은 2010년 1월 5일자로 작성된 표제 "1378358.txt"의 서열 목록을 함유하며, 그 크기는 47,052 바이트이다. 이 .txt 파일에 담긴 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
분야
본 발명은 일반적으로 아세토히드록시산 신타제 억제성 제초제에 대해 식물의 내성을 증가시키기 위한 분자 생물학 및 조성물 및 방법, 및 잡초를 방제하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
대두 (글리신 맥스(Glycine max))는 세계 많은 지역에서 중요한 작물이다. 농경학적 특성 및 생산물의 품질을 개선시키기 위해 생물공학적 방법이 대두에 적용되어 왔다. 대두 생산에 있어서 중요한 하나의 이같은 농경학적 특성은 제초제 내성, 특히 글리포세이트 제초제에 대한 내성이다. 글리포세이트 내성 대두의 사용이 증가함에 따라, 글리포세이트에 대해 내성이 있는 잡초가 발생하였다. 이에 따라, 잡초를 관리하기 위해 글리포세이트 이외의 제초제에 대해 내성을 가진 대두 식물이 필요하다.
식물, 예컨대 대두에서 트랜스진 (에컨대 제초제 내성을 제공하는 것)의 표현형 발현은 유전자 그 자체의 구조 및 식물 게놈에서 그의 통합 위치 둘 모두에 의해 영향을 받는다. 동시에, 게놈 내 다른 위치에의 (외래 DNA 내의) 트랜스진의 존재는 다른 방식으로 식물의 전체적인 표현형에 영향을 미칠 것이다. 상업상 관심 특성을 유전자 조작에 의해 식물에 농경학상 또는 산업상 성공적으로 도입하는 것은, 다양한 인자에 따라 매우 긴 절차일 수 있다. 유전적으로 형질전환된 식물의 실제적인 형질전환 및 재생은 일련의 선별 단계에서 단지 첫번째일 뿐이고, 여기에는 궁극적으로 엘리트 이벤트가 선별되게 하는 광범위한 유전적 특성화, 육종, 및 야외 실지에서의 평가가 포함된다.
상업적 품종으로 트랜스진의 유전자이입을 개선시키기 위해 작물 개선에 있어서 유전적 변형의 증가된 사용으로 인해, GMO 및 비-GMO 제품을 구분하고, 특화된 물질을 확인하기 위해 특정 트랜스제닉 이벤트를 명확하게 검출하고/거나 확인하는 능력이 점점 중요해지고 있다. 빠르면서 간단한, 광범위한 실험실을 준비할 필요없이 특정 트랜스제닉 이벤트를 검출하기 위한 방법을 개발할 필요가 여전히 존재한다. 또한, 특정 이벤트를 검출하는 방법은 시장 진입전 승인을 요구하는 규제에 따르는데 도움이 될 것이고, 재조합 작물 식물로부터 유래된 음식의 표시하는데 도움이 되거나, 또는 환경 모니터링, 밭의 작물에서 특성을 모니터링하거나, 또는 작물 수확물로부터 유래된 제품을 모니터링하는데 사용하기에 도움이 될 것일 뿐만 아니라, 당사자의 규제 또는 계약 조건의 준수를 보장하는데 사용하기에도 도움이 될 것이다.
개요
한 실시양태에서, 본 발명은 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 대두 식물이 존재하는 경작 구역에 유효량의 비선택적인 제초제를 적용하는 것을 포함하는, 경작 구역에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 대두 식물이 존재하는 농경지에 유효량의 AHAS-억제성 제초제를 적용하는 것을 포함하는, 농경지에서 글리포세이트 내성 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 위치 1312 내지 6069의 핵산 서열을 갖는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 서열 1의 뉴클레오티드 1302 내지 6079의 핵산 서열을 갖는 이종 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 대두 식물을 제공한다.
본 발명은 또한 이벤트 127 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 제1 및 제2 단리된 핵산 분자를 포함하는 단리된 핵산 프라이머 쌍을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 이벤트 127 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 제1 및 제2 핵산 프라이머를 포함하는, 생물학적 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자를 확인하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 대두 DNA 및 이벤트 127 특이적 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 제1 및 제2 핵산 프라이머를 함유하는 생물학적 샘플을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; (b) 제1 및 제2 핵산 프라이머가 이벤트 127 특이적 핵산 분자를 증폭시키도록 하는 조건하에서 혼합물을 반응시키는 단계; 및 (c) 증폭된 단편 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 이벤트 127 대두 식물을 확인하는 방법을 제공하며, 이때 대두 이벤트 127 특이적 핵산 분자의 존재는 대두 식물이 이벤트 127 대두 식물임을 나타낸다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 (a) 대두 DNA 및 이벤트 127 특이적 핵산 분자에 혼성화될 수 있는 핵산 분자 프로브를 함유하는 생물학적 샘플을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; (b) 핵산 분자 프로브가 이벤트 127 특이적 핵산 분자에 혼성화되도록 하는 조건하에서 혼합물을 반응시키는 단계; 및 (c) DNA에 대한 프로브의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하는 이벤트 127 핵산 분자를 갖는 대두 식물을 확인하는 방법을 제공하며, 이때 대두 DNA에의 핵산 분자 프로브의 혼성화의 존재는 이벤트 127 핵산 분자의 존재를 나타낸다.
본 발명은 추가로, AHAS-억제성 제초제의 유효량을 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 대두 식물 및 주변 구역에 적용하고, 이때 AHAS-억제성 제초제는 주변 구역에서 잡초 성장을 감소시키는 것인 단계; 및 하나 이상 대두 식물로부터 종자를 수확하는 단계를 포함하는, 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 대두 식물의 수확량을 증가시키는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 대두 식물을 제2 대두 식물과 교배시키는 단계; (b) 단계 (a)의 교배로부터 종자를 수득하는 단계; (c) 종자로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계; 및 (d) 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 AHAS-억제성-제초제-저항성 대두 식물의 육종 방법을 제공하며, 이때 이벤트 127 핵산 분자의 존재는 종자가 AHAS-억제성-제초제-저항성 대두 식물을 생산할 수 있음을 나타낸다.
본 발명은 또한 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 대두 식물의 종자를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) DNA 및 이벤트 127 특이적 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 제1 및 제2 핵산 프라이머를 함유하는 생물학적 샘플을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; (b) 제1 및 제2 핵산 프라이머가 이벤트 127 특이적 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자를 증폭시키도록 하는 조건하에서 혼합물을 반응시키는 단계; 및 (c) 증폭된 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 이때 이벤트 127 특이적 핵산 분자의 존재는 샘플이 이벤트 127 핵산 분자를 함유함을 나타낸다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) DNA 및 이벤트 127 특이적 핵산 분자에 혼성화될 수 있는 핵산 프로브를 함유하는 생물학적 샘플을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; (b) 프로브가 이벤트 127 특이적 핵산 분자에 혼성화되도록 하는 조건하에서 혼합물을 반응시키는 단계; 및 (c) 혼성화된 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자를 검출하는 방법을 제공하며, 이때 이벤트 127 특이적 핵산 분자의 존재는 샘플이 이벤트 127 핵산 분자를 함유함을 나타낸다.
본 발명은 또한 (a) DNA 및 이벤트 127 삽입물 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 제1 및 제2 프라이머를 함유하는 생물학적 샘플을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; (b) 제1 및 제2 핵산 프라이머가 이벤트 127 삽입물 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자를 증폭시키도록 하는 조건하에서 혼합물을 반응시키는 단계; 및 (c) 증폭된 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 이벤트 127 삽입물 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 이때 이벤트 127 삽입물 핵산 분자의 존재는 샘플이 이벤트 127 삽입물 DNA를 함유함을 나타낸다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) DNA 및 숙주 세포 게놈 내에서 이벤트 127 삽입물 핵산 분자 영역에 어닐링될 수 있는 제1 프라이머 및 플랭킹 핵산 분자에 어닐링될 수 있는 제2 프라이머를 함유하는 생물학적 샘플을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; (b) 제1 및 제2 핵산 프라이머가 이벤트 127 삽입물 핵산 분자의 단편을 포함하는 증폭된 핵산 분자를 생성하도록 하는 조건하에서 혼합물을 반응시키는 단계; 및 (c) 증폭된 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 이벤트 127 삽입물 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 이때 이벤트 127 삽입물 핵산 분자의 단편의 존재는 샘플이 이벤트 127 삽입물 DNA를 함유함을 나타낸다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 대두 종자를 제공하는 단계; (b) 대두 종자가 발아되도록 하는 조건하에서 종자를 성장 배지에 식재하여 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 성장 대두 식물을 생산하는 단계; 및 (c) 성장 배지, 종자, 또는 식물을 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 이들 서로간의 조합물, 및 이와 하나 이상의 다른 활성 성분과의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 제초 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 대두 식물을 성장시키는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 대두 식물로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 샘플에 대해, 이벤트 127 폴리펩티드를 검출할 수 있는 하나 이상의 면역학적 검정을 수행하는 단계를 포함하는, 샘플에서 이벤트 127 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 표면을 갖는 고체 지지체; 및 고체 지지체의 표면에 부착된 하나 이상의 이벤트 127 진단 분자를 포함하는, 생물 분자를 검출하는데 사용하기 위한 장치를 제공한다.
도 1a는 플라스미드 pAC321의 개략적인 도면을 제공한다. 도 1b는 형질전환에 사용된 AHASL 5' UTR, csr1-2 코딩 서열 및 AHASL 3' UTR을 함유하는 pAC321의 PvuII 단편의 개략적인 도면을 제공한다. 카피 수, 골격의 부재 및 세대간 안정성의 서던 블롯 분석에 사용되는 효소의 제한 부위 (NcoI, XbaI, SpeI)를 표시한다.
도 2는 한 예의 대두 이벤트 127 식물의 육종 이력의 개략적인 도면을 제공한다.
도 3은 대두 이벤트 127 삽입물을 함유하는 pAC321 PvuII 형질전환 단편을 정렬한 것의 개략적인 도면을 제공한다.
도 4a-4c는 실시예 3에서 기재한 바와 같은 한 예의 대두 이벤트 127 식물에서 삽입물 카피 수의 서던 블롯 혼성화 결과를 제공한다. 도 4d는 혼성화 실험에 사용된 프로브의 상대적 위치의 개략적인 도면을 제공한다.
도 5는 실시예 3에서 기재한 바와 같은 한 예의 대두 이벤트 127 식물에서의 벡터 골격 서열의 부재를 보여주는 서던 블롯 혼성화의 결과를 제공한다. 도 5a는 프로브 VP1을 이용한 결과를 제공하며, 도 5b는 프로브 VP2를 이용한 결과를 제공한다. 도 5c는 127 이벤트 서열 상의 혼성화 영역의 상대적 위치의 개략적인 도면을 제공한다.
도 6은 이벤트 127 서열의 세대간 안정성의 서던 블롯 혼성화 분석의 결과를 제공한다. 도 6a는 5' UTR 프로브를 이용한 결과를 제공한다. 도 6b는 AHAS 프로브를 이용한 결과를 제공한다. 도 6c는 3' UTR 프로브를 이용한 결과를 제공한다. 도 6d는 각각의 프로브의 이벤트 127 서열에 대한 혼성화 영역의 개략적인 도면을 제공한다.
도 7은 한 예의 대두 이벤트 127 식물에서의 삽입물 및 플랭킹 서열의 다이아그램을 제공한다. 또한, 실시예 3에서 기재한 바와 같은, 서열분석에 사용된 6개의 앰플리콘을 나타낸다.
도 8은 대두 이벤트 127 삽입물 및 플랭킹 영역에 대한 전장 핵산 서열 (서열 1)을 제공한다. 위치 1-1311은 5' 플랭킹 DNA를 나타내고, 위치 1312-6069는 변형된 AHASL 단백질을 코딩하는 삽입물 DNA를 나타내고, 위치 6070-10,656은 3' 플랭킹 DNA를 나타낸다.
도 9는 실시예 3에서 기재한 바와 같은 한 예의 대두 이벤트 127 식물에서의 AtSec 61γ 서브유닛의 전사의 RT-PCR 분석의 겔 전기영동 결과를 제공한다.
도 10은 실시예 3에서 기재한 바와 같은 한 예의 대두 이벤트 127 식물에서, 3' 플랭킹 접합부에 csr1-2 코딩 서열의 376 bp 복제물을 삽입하여 제작한 501 bp 오픈 리딩 프레임 (ORF) 전사의 RT-PCR 분석의 겔 전기영동 결과를 제공한다.
도 11은 실시예 3에서 기재한 바와 같은 이벤트 127 특이적 PCR 검출 방법의 예의 겔 전기영동 결과를 제공한다.
도 12는 이벤트 127을 생성하는데 사용된 DNA, 즉 pAC321 구축물로부터의 6156 bp PvuII 단편 (서열 4)을 제공한다.
본 발명은 AHAS-억제성 제초제, 예컨대 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 트리아졸로피리미딘 술포아닐리드 제초제, 및/또는 피리미딜 옥시벤조에이트 제초제에 대한 내성이 입증된 대두 식물을 제공한다. 본 발명의 대두 식물은 대두 게놈에서 특징적인 위치에 위치한 삽입된 핵산 분자를 함유한다. 또한, 개시된 대두 식물과 함께 사용하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명을 추가로 상세히 기재하기 전에, 하기 용어들을 먼저 정의할 것이다.
I. 정의
본원에서 사용된 용어 "대두" 및 "대두 식물"은 글리신 맥스 식물을 의미하며, 대두로 육종될 수 있는 모든 식물 품종을 포함한다. 용어 "대두 식물"은 식물 부분을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "식물 부분"은 식물 세포, 식물 기관, 식물 원형질체, 식물이 재생될 수 있는 식물 세포 조직 배양물, 식물 캘러스, 식물 무리, 및 식물 또는 식물의 부분, 예컨대 배, 화분, 배주, 종자, 종자 꼬투리, 잎, 꽃, 가지, 과실, 꽃자루, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 자엽, 배축 등 내의 무손상 식물 세포를 포함한다. 곡물은 종을 성장시키거나 재생시키는 것 이외의 목적으로 상업적 재배자에 의해 생산된 성숙한 종자를 의미하는 것으로 의도된다. 재생된 식물의 자손, 유도체, 변이체 및 돌연변이체의 부분이 이벤트 127 핵산 분자를 포함한다면, 이들도 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
"이벤트 127 핵산 분자"는 서열 1의 위치 1312-6069로부터의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자; 위치 653에 상응하여 천연 세린이 아닌 아스파라긴 (S653N)을 함유하는 AHASL 단백질을 갖는 AHAS 효소의 변형된 형태의 발현을 제공하는 전통적인 식물 육종에 의해 수득된 그의 변이체 (AHAS 효소의 변형된 형태는 정상적으로는 야생형 AHAS 효소의 효소 활성을 억제하는 AHAS 억제제에 대해 내성을 나타냄); 또는 이들 중 임의의 것의 상보물을 지칭한다. 이벤트 127 핵산 분자는 서열 1의 위치 1312-6069에 플랭킹된 추가의 서열 (또는 변이체의 경우, 5' 및 3' 위치에 플랭킹된 추가의 서열)을 함유할 수 있다.
"이벤트 127 영역"은 적어도 이벤트 127 핵산 분자의 단편을 포함하고, 이벤트 127 식물을 나타내는 핵산 분자를 지칭한다. 이벤트 127 영역은 5' 및/또는 3' 접합부 영역, 삽입물 DNA, 또는 삽입물 DNA의 csr1-2 복제물의 접합부 영역 중 하나 이상을 삽입물 DNA의 나머지와 함께 포함할 수 있다. 또한, 5' 및/또는 3' 플랭킹 서열 DNA가 추가로 그 안에 포함될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "이벤트 127 특이적 핵산 분자"는 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자를 구분해서 확인하거나 또는 그러한 분자를 구분해서 확인할 수 있는 핵산 분자 서열을 지칭한다. 이벤트 127 특이적 핵산 분자는 형질전환 이벤트로 인해 삽입물 DNA 내에 접합부 영역 및 특유의 돌연변이 또는 복제물을 포함할 수 있다. 예를 들어, PCR 반응에서 서열 37 및 38의 핵산 서열을 갖는 PCR 프라이머를 사용하면 이벤트 127 핵산 분자를 나타내는 앰플리콘이 증폭된다.
"이벤트 127 분자"는 이벤트 127 핵산 분자로부터 유래되거나, 그로부터 수득되거나 또는 그에 의해 코딩된 핵산 분자, 폴리펩티드 분자 및 기타 생물 분자를 지칭한다.
"이벤트 127 진단 분자"는 이벤트 127 핵산 분자를 직접적으로 또는 간접적으로 검출하는데 사용할 수 있는 분자를 지칭한다. 이벤트 127 진단 분자에는 이벤트 127 핵산 분자 또는 이같은 핵산 분자로부터 발현된 폴리펩티드를 검출하는 방법에 사용할 수 있는 핵산 분자, 예컨대 프라이머 및 프로브, 항체 및 그의 결합 부위 보유 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab'), 및 H 도메인 결실 항체), 폴리펩티드, 및 그의 유도체, 핵산 유사체, 압타머 등이 포함된다.
본원에서 사용되는 "삽입물 DNA"는 형질전환 과정을 통해 식물 물질에 도입된 이종 DNA를 지칭하며, 본원에서 설명하는 바와 같은 형질전환에 사용되는 본래 DNA와는 다른 DNA를 포함한다. "이벤트 127 삽입물 핵산" 및 "이벤트 127 삽입물 DNA"는 서열 1의 위치 1312-6069의 핵산 서열을 갖는 핵산 분자를 지칭한다 (이는 이벤트 127을 생성하는데 사용되는 DNA, 즉 도 12에서 제공되는 pAC321 구축물로부터의 6156 bp PvuII 단편 (서열 4)과는 다름).
"이벤트 127" 식물, 세포, 종자, 식물 부분 또는 식물 조직은 이벤트 127 핵산 분자를 함유하고, 바람직하게는 적어도 하나의 이벤트 127 특이적 핵산을 함유하는 임의의 식물, 세포, 종자, 식물 부분 또는 식물 조직을 지칭한다. 이벤트 127 식물은 BPS-CV127-9로 지칭되는 것과 같은, 서열 1의 서열을 갖는 핵산 분자를 함유하는 이벤트 127-9 대두 식물을 포함한다.
용어 "플랭킹 DNA"는 유기체, 예컨대 식물에서 삽입된 핵산 분자의 바로 상류 또는 하류에 자연적으로 존재하며, 인접하여 존재하는 게놈 DNA를 지칭한다. 본원에서 사용된 "플랭킹 영역" 또는 "플랭킹 서열"은 본래의 외래 삽입물 DNA 분자의 바로 상류 (5')에서 인접하여 위치하거나, 또는 바로 하류 (3')에서 인접하여 위치하는 적어도 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 1000, 1500, 2000, 2500, 또는 5000 염기 쌍 이상의 서열을 지칭한다. 이벤트 127의 플랭킹 영역의 비제한적인 예로는 서열 2 및 3 및 그의 변이체 및 단편을 들 수 있고, 서열 2는 서열 1의 위치 1-1311을 나타내며, 서열 3은 서열 1의 위치 6070-10,656을 나타낸다.
외래 삽입물 DNA를 무작위로 통합시키는 형질전환 절차는 각각의 형질전환체에 대해 특징적이고 특유의 상이한 플랭킹 영역을 함유하는 개별적인 형질전환체를 야기할 것이다. 전통적인 교배를 통해 재조합 DNA를 식물에 도입하는 경우, 그의 플랭킹 영역은 일반적으로 본래의 형질전환체의 그것과 다르지 않을 것이다. 개별적인 형질전환 이벤트는 또한 이종 삽입물 DNA 조각 및 게놈 DNA, 또는 2개의 게놈 DNA 조각, 또는 2개의 이종 DNA 조각 사이에 특유의 접합부를 함유할 것이다.
"접합부 지점"은 2개의 특정 DNA 단편이 연결되는, 예를 들어 삽입물 DNA가 플랭킹 DNA에 연결되는 지점이다. 접합부 지점은 또한 형질전환된 유기체 내에 존재하며, 2개의 DNA 단편은 천연 유기체에서 발견되는 것에서 변형된 방식으로 서로 연결된다. 본원에서 사용되는 "접합부 DNA" 또는 "접합부 영역"은 접합부 지점을 포함하는 DNA를 지칭한다. 대두 이벤트 127로부터의 DNA에서 접합부 지점의 비제한적인 예에는 언급한 바와 같은, 예를 들어 서열 5 및 6의 서열이 포함되며, 여기서 서열 5는 서열 1의 위치 1311-1312를 나타내고 서열 6은 서열 1의 위치 6069-6070을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "트랜스제닉"은 유전자형이 이종 핵산의 존재에 의해 변경된 임의의 세포, 세포주, 캘러스, 조직, 식물 부분, 또는 식물을 포함하며, 처음에 그렇게 변경된 트랜스제닉 뿐만 아니라 처음 재생된 이벤트로부터 유성 교배 또는 무성 증식에 의해 제작된 것이 포함되는 것으로 이해하여야 한다. 본원에서 사용된 용어 "트랜스제닉"은 종래의 식물 육종 방법 또는 자연 발생 이벤트, 예컨대 무작위 교배 수정, 비-재조합 바이러스 감염, 비-재조합 박테리아 형질전환, 비-재조합 전위, 또는 자발적 돌연변이에 의한 게놈 (염색체 또는 염색체 밖) 변경은 포함하지 않는다.
"형질전환"은 핵산 단편을 숙주 유기체의 게놈 내로 전달함으로써 유전적으로 안정한 유전이 이루어지는 것을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 유기체로서 지칭된다. 식물 형질전환 방법의 예는 당업계에 공지되어 있는 것들이 포함되고, 이하에서 개시한다.
"트랜스제닉 이벤트"는 관심 트랜스진을 포함하는 핵산 발현 카세트를 포함하는 이종 DNA 구축물(들)에 의한 식물 세포의 형질전환, 식물의 게놈으로의 트랜스진 삽입으로 인한 식물 군집의 재생, 및 특정 게놈 위치로의 삽입을 특징으로 하는 특정 재생 식물의 선별에 의해 생성된다. 이벤트는 표현형 면에서 트랜스진(들)의 발현을 특징으로 한다. 유전적 수준에서, 이벤트는 식물의 유전자 구조의 일부이다.
본원에서 사용된 "샘플"은 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 함유하는 임의의 샘플을 포함하고, 식물, 식물 물질로부터 유래된 것이나 또는 예컨대, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 식물 물질을 포함하거나 그로부터 유래된 식품 또는 사료 (신선한 것 또는 가공된 것)와 같은 제품 내의 것이다.
형질전환과 관련하여 "도입" 또는 "도입된"이란, 이종 DNA 구축물이 식물 세포의 내부에 접근하는 방식으로 구축물을 식물에 제공하는 것을 의도한다. 본 발명의 식물 및 방법은 핵산 구축물을 식물에 도입하는 특정 방법에 의존하지 않고, 다만 핵산 구축물이 적어도 하나의 식물 세포의 내부에 접근토록 한다. 핵산 구축물을 식물에 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이들로 한정되는 것은 아니지만 안정한 형질전환 방법, 일시적 형질전환 방법 및 바이러스 매개 방법이 포함된다.
용어 "자손"은 이벤트 127 식물 및 또 다른 품종 사이의 유성 교배 (예를 들어 이종교배, 자가교배 또는 역교배)에 의해 생산된 식물을 지칭한다. 반복친과의 반복적인 역교배 이후에도, 이벤트 127 모로부터의 삽입된 DNA 및/또는 플랭킹 DNA는 동일한 염색체 위치에서 교배 자손에 존재하며, 이는 예를 들어 이벤트 127 특이적 영역을 스크리닝하는 것에 의해 확인할 수 있다.
핵산 분자와 관련하여 본원에서 사용되는 "이종"은 외래 종 기원이거나, 또는 동일한 종 기원일 경우 의도적인 인간 개입에 의해 그의 천연 형태로부터 조성 및/또는 게놈 로커스가 변형된 핵산 분자이다.
"단리된" 또는 "정제된" 핵산 분자, 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분은 정상적으로는 그의 자연 발생 환경에서 발견되는 핵산 분자와 동반되거나 이와 상호작용하는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는다. 따라서, 단리된 또는 정제된 핵산 분자는 재조합 기술에 의해 생산되는 경우 다른 세포 물질 또는 배양 배지를 실질적으로 함유하지 않거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 기타 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는다.
"프로브"는 검출가능한 표지 또는 리포터 분자, 예를 들어 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제 또는 효소 등이 부착된 단리된 핵산 분자이다. 이러한 프로브는 표적 핵산 분자의 가닥에, 본 발명의 경우에는 대두 식물 유래의 것이든 이벤트로부터의 DNA를 포함하는 샘플 유래의 것이든지 간에 대두 이벤트 127 식물 생물 물질로부터 단리된 DNA의 가닥에 상보적이다. 프로브는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 뿐만 아니라, 표적 DNA 서열의 존재를 특이적으로 검출할 수 있는 폴리아미드 및 그 밖의 프로브 물질을 포함한다.
본원에서 사용되는 "프라이머"는 핵산 혼성화에 의해 상보적인 표적 DNA 가닥에 어닐링되어 프라이머와 표적 DNA 가닥 사이에 하이브리드를 형성한 후, 폴리머라제, 예를 들어 DNA 폴리머라제에 의해 표적 DNA 가닥을 따라 연장될 수 있는 단리된 핵산 분자이다. "프라이머 쌍"은, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 다른 종래의 핵산 증폭 방법에 의한 표적 핵산 서열의 증폭에 사용하기 위한 프라이머의 쌍을 지칭한다. "폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 특정한 DNA 절편의 증폭에 사용되는 기술이다.
"라인" 또는 "계통"은 일반적으로 어느 정도로 순계교배되고, 일반적으로 동질 유전자이거나 거의 동질 유전자인 동일한 직계관계의 개체 그룹이다.
본 발명와 관련하여 용어 "교배된" 또는 "교배"는 식물의 경우, 자손 (즉, 세포, 종자, 또는 식물)을 생산하기 위한, 예를 들어 수분을 통한 생식세포의 융합을 의미한다. 상기 용어는 유성 교배 (한 식물로부터 다른 식물로의 수분) 및, 식물의 경우에, 자배 (자가 수분, 즉 화분과 배주가 동일 식물 유래인 경우) 둘 모두를 포함한다.
용어 "유전자이입"은 하나의 유전적 배경으로부터 다른 유전적 배경으로 목적하는 유전자좌의 대립유전자의 전달을 지칭한다. 한 방법에서, 목적하는 대립유전자는 2 종의 모 사이의 유성 교배를 통해 유전자이입될 수 있으며, 이때 적어도 하나의 모는 그의 게놈에 목적하는 대립유전자를 갖는다.
II. 대두 이벤트 127 식물
트랜스제닉 AHAS 억제제 내성 대두 식물에 관한 조성물 및 방법을 제공한다. 그러한 조성물은 이벤트 127 대두 식물을 포함한다. 이벤트 127 대두 식물은 본원에서 정의된 바와 같이, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유래의 이미다졸리논-내성 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 유전자 (csr1-2)를 대두 게놈으로 삽입 또는 유전자이입하는 것에 의해 야생형 또는 비형질전환된 대두 식물로부터 변형된 것이다. 일부 실시양태에서, csr1-2 유전자의 대두 게놈으로의 삽입은 위치 653에 상응하여 천연 세린이 아닌 아스파라긴 (S653N)을 함유하는 AHASL 단백질을 갖는 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 효소의 변형된 형태가 발현되게 한다. AHAS 효소는 분지쇄 아미노산 생합성에 중요하며, 특정 제초제 (AHAS-억제성 제초제)에 의해 억제된다. AHAS 유전자에서의 변형은 이러한 억제를 극복하게 하여 광범위한 AHAS-억제성 제초제에 대한 내성을 제공한다. 따라서, 대두 이벤트 127 식물은 적어도 하나의 AHAS-억제성 제초제에 대해 내성을 갖거나, 또는 이벤트 127 핵산 분자가 없는 대두 식물에 비해 증가된 양의 적어도 하나의 AHAS-억제성 제초제에 대해 내성을 갖는다.
AHAS 억제제 내성을 부여하는 핵산 분자는 대두 게놈의 특징적인 위치에 삽입되어 127 이벤트를 생성하는 것으로 확인되었다. 언급된 염색체 위치에서 이벤트 127 핵산 분자를 보유하는 이벤트 127 대두 식물은, 한 실시양태에서, 최소한 서열 5 및/또는 6의 핵산 분자 서열을 갖는 하나 이상의 게놈/트랜스진 접합부를 포함한다. 이벤트 127의 게놈 삽입 부위의 특성화는 향상된 육종 효율을 제공하고, 육종 군집 및 그의 자손에서 트랜스진 삽입을 추적하는 분자 마커의 사용을 가능케 한다. 이벤트 127 대두 식물의 확인, 검출 및 사용을 위한 다양한 방법 및 조성물을 본원에서 제공한다.
csr1-2 발현 카세트, 플라스미드 pAC321로부터의 PvuII 단편은 대두 게놈 내의 단일의 특징적인 유전자좌에 통합되어 이벤트 127을 야기한다. 한 실시양태에서, 이벤트 127 내에 삽입된 csr1-2 카세트는 플라스미드 pAC321로부터의 본래의 형질전환 단편과 비교하여 3개의 점 돌연변이를 함유하며, 하나의 돌연변이는 AHAS 코딩 서열 내에 있고, 다른 2개는 AHASL 3' 비번역 영역 (UTR)의 하류에 있다. 그러한 돌연변이는 코딩 서열에서 G에서 A로의 돌연변이를 포함하며, 이는 R272에서 K272로의 아미노산 치환을 갖는 AHAS 폴리펩티드의 발현을 야기한다. 점 돌연변이의 서던 블롯 분석 및 서열 확인은 삽입이 적어도 8 세대에 걸쳐 안정함을 나타낸다. 이벤트 127 내에 삽입된 DNA는 또한, 3' 통합 지점 직전에 csr1-2 코딩 서열의 일부인 376 염기 쌍 (bp) 복제물을 함유한다 (복제물은 서열 1의 위치 5694-6069로 표시됨). 이러한 복제된 376 bp 절편은 3' 플랭킹 서열로 연장된 501 bp 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 야기한다. 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR) 결과는 이러한 501 bp ORF가 전사되지 않음을 시사한다. 일부 실시양태에서, 이벤트 127 핵산 분자는 또한 형질전환에 사용되는 DNA 단편의 성분인 아라비돕시스 SEC61 γ 서브유닛 유전자 로커스 (At3g48570)의 대부분을 함유한다. 다른 실시양태에서, SEC61 γ 서브유닛 유전자는 대두 이벤트 127 식물에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 이하의 실시예에서 보다 상세하게 개시하는 바와 같이, RT-PCR 실험은 아라비돕시스 SEC61 γ 서브유닛 유전자가 이벤트 127 잎 조직에서 약하게 전사됨을 보여준다. 약 1.3 킬로베이스 (kb)의 전체 5' 플랭킹 대두 DNA는 약 4.6 kb의 3' 플랭킹 대두 DNA와 함께 서열분석되었다. 플랭킹 서열 정보는 본 발명에 따라 이벤트 127 특이적 정성적 PCR 검출 방법을 개발하는데 사용될 수 있다. 이벤트 127 핵산 분자의 그 밖의 특징, 예컨대 확인된 점 돌연변이 및 복제는 그의 자손 및 유도체를 비롯한 이벤트 127 식물을 검출하기 위해 본원에서 제공되는 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 이벤트 127 식물은 AHAS-억제성 제초제의 적용에 대해 내성이 있다. 이벤트 127 식물은 50 g ai/ha 내지 약 500 g ai/ha, 70 g ai/ha 내지 약 400 g ai/ha, 및 70 g ai/ha 내지 약 300 g ai/ha의 제초제 적용량과 동등한 양을 포함하는 적용 수준에서 AHAS-억제성 제초제의 수준에 대해 내성 또는 향상된 내성을 나타낸다. 그러한 내성은 또한 제초제의 상업적 적용 수준의 1X, 2X, 3X, 4X, 5X, 또는 그 이상의 AHAS-억제성 제초제 수준에 대한 내성을 포함할 수 있다.
AHAS-억제성 제초제에 대한 내성은 제초제 내성을 결정하는 임의의 방법으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 대두 이벤트 127 식물은 적절한 대조군 식물과 비교하여 대조군 식물에 의해 표출되는 손상에 비해 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 90％, 100％, 150％, 200％, 250％, 300％, 400％, 500％, 600％, 700％, 800％, 900％, 또는 1000％ 이상 만큼 손상을 덜 나타내는 경우 AHAS-억제성 제초제 또는 다른 화학물질에 대한 내성이 입증될 수 있다. 이러한 방식으로, AHAS-억제성 제초제 또는 다른 화학물질에 대해 내성이 있는 식물은 적절한 대조군 식물과 비교하여 "개선된 내성"을 나타낸다. 제초제 또는 다른 화학물질 처리로 인한 손상은 당업자에게 적합하다고 여겨지는 식물 성장 또는 식물 안녕의 임의의 파라미터를 평가하는 것에 의해 평가된다. 손상은 개별적인 식물 또는 식물 그룹의 적합한 파라미터의 육안 관찰 및/또는 통계적 분석에 의해 평가될 수 있다. 따라서, 손상은 예를 들어 식물 키, 식물 중량, 잎 색깔, 개화, 생식력, 수확량, 종자 생산 등과 같은 파라미터를 평가하는 것에 의해 평가될 수 있다. 손상은 또한 발달의 특정 단계 (예를 들어, 성숙 또는 개화)까지 걸리는 시간 또는 특정 화학물질 및/또는 제초제 처리로부터 식물이 회복되기까지 걸리는 시간을 평가하는 것에 의해 평가될 수 있다.
AHAS-억제성 제초제 또는 다른 화학물질에 의해 유발된 손상은 이벤트 127 식물을 제초제로 처리하거나 제초제와 접촉시킨 후 다양한 시점에 평가할 수 있다. 손상은 대조군 식물이 최대의 손상을 나타내는 대략의 시점에 평가할 수 있거나, 또는 제초제 또는 다른 화학물질을 처리하지 않은 대조군 식물이 처리했을때의 크기 또는 단계에 비해 측정가능하게 성장하고/거나 발달한 시간 이후에 평가할 수 있다. 또한, 손상은 시험 식물을 제초제로 처리한 후 다양한 시점, 예를 들어 제12시 또는 제1일, 제2일, 제3일, 제4일, 제5일, 제6일, 제7일, 제8일, 제9일, 제10일, 제11일, 제12일, 제13일, 제14일, 또는 제3주, 제4주, 또는 그 보다 긴 시점에서 평가할 수 있다. 임의의 평가 시점은 시험 식물 및 대조군 식물의 처리에 반응한 차이의 검출이 가능하다면 적합하다.
본 발명은 추가로 이벤트 127 핵산 분자를 함유하고 NCIMB 특허 기탁 번호 41603으로 기탁된 대두 라인 CV603 ("BPS-CV127-9"로도 공지됨)의 종자 및 그로부터 유래된 식물, 식물 세포, 및 종자를 포함한다. 본 출원인(들)은 이벤트 127 핵산 분자를 함유하는 적어도 2500 개의 대두 식물의 종자를 2008년 12월 22일자로 영국 스코틀랜드 애버딘 AB2 1RY 23 세인트 마샬 드라이브 소재의 NCIMB (National Collections of Industrial, Food, and Marine Bacteria)에 기탁하였고, 기탁에 대해 NCIMB 수탁 번호 41603을 할당받았다. 이러한 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 조항 하에 유지될 것이다. 이러한 기탁은 단지 당업자의 편의를 위한 것이며, 기탁이 35 U.S.C. § 112 하에 요구되는 것이라고 인정하는 것은 아니다. 2008년 12월 22일자로 NCIMB에 기탁된 종자는 Embrapa (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria)에 의해 유지되는 기탁물로부터 취해진 것이다. 이러한 기탁물에의 접근은 출원이 특허 상표청에 계류중일때 요청에 따라 특허청장이 인정하는 자가 이용가능할 것이다. 출원의 임의의 특허청구범위가 허여된 경우, 출원인(들)은 37 C.F.R. § 1.808에 따라 영국 스코틀랜드 애버딘 AB2 1RY 23 세인트 마샬 드라이브 소재의 NCIMB (National Collections of Industrial, Food, and Marine Bacteria)에 기탁된 이벤트 127 핵산 분자를 함유하는 적어도 2500 개의 대두 식물 종자 기탁 샘플(들)을 공중이 이용가능하게 할 것이다. 이러한 대두 라인 CV603 종자 기탁물은 공공 기탁소인 NCIMB 기탁소에서 30 년, 또는 가장 최근의 요청 이후 5 년 동안, 또는 특허의 효력을 유지하는 동안 (어느 시점 중에서 느린 시점) 유지될 것이며, 이 기간 동안 생존이 불가능해지면 대체될 것이다. 또한, 출원인(들)은 기탁시 샘플의 생육력의 표시를 제공하는 것을 포함하여, 37 C.F.R. §§ 1.801-1.809의 모든 요구사항을 수용한다. 출원인(들)은 생물 물질의 전달 또는 그의 시중에서의 운송에 대해 법에서 부과하는 임의의 규제를 고려하지 않을 어떤 권한도 갖지 않는다. 출원인(들)은 식물 품종 보호법 (7 USC 2321 et seq.) 하에서 대두 라인 CV603에 적용가능한 본 특허 또는 특허권 하에 허여된 권리의 어떤 침해도 고려하지 않는다. 승인되지 않은 종자 증식은 불허한다. 종자는 규제될 수 있다.
본 발명의 이벤트 127 대두 식물은 또한 이벤트 127 대두 식물에 대해 생성된 초기 형질전환의 자손, 유도체, 변이체, 및 돌연변이체를 포함한다. 그러한 식물은 육종 기록, 제초제 내성 방법, 분자 검출 방법, 본원에서 개시하는 방법, 및 이들의 조합을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 그러한 식물을 확인하는 임의의 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 이벤트 127 대두 식물은 S653N 돌연변이가 결여된 내인성 AHAS 효소의 활성을 방해하는 적어도 하나의 제초제 (AHAS-억제성 제초제)에 대해 내성이 있다. AHAS 효소의 활성을 방해하는 제초제로는 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 트리아졸로피리미딘 제초제, 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제, 술포닐아미노-카르보닐트리아졸리논 제초제, 또는 이들의 혼합물 또는 조합물이 포함된다. 한 실시양태에서 그러한 제초제는 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 또는 이들의 혼합물이다. 이미다졸리논 제초제에는 퍼슈트® (이마제타피르), 카드레® (이마자픽), 랩터® (이마자목스), 셉터® (이마자퀸), 어서트® (이마제타벤즈), 아르세날® (이마자피르), 상기 언급한 제초제 중 임의의 것의 유도체, 및 상기 언급한 제초제 중 2 이상의 혼합물 또는 조합물, 예를 들어 이마자피르/이마자목스 (오디세이®)가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이미다졸리논 제초제는 또한, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-니코틴산, [2-(4-이소프로필)-4-] [메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-3-퀴놀린카르복실산]산, [5-에틸-2-(4-이소프로필-] 4-메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-니코틴산, 2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-5-(메톡시메틸)-니코틴산, [2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-] 이미다졸린-2-일)-5-메틸니코틴산, 및 메틸[6-(4-이소프로필-4-] 메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-m-톨루에이트 및 메틸 [2-(4-이소프로필-4-메틸-5-] 옥소-2-이미다졸린-2-일)-p-톨루에이트의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서는, 5-에틸-2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-니코틴산 및 [2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-]일)-5-(메톡시메틸)-니코틴산이 이용된다. 또 다른 실시양태에서는, [2-(4-이소프로필-4-]메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-5-(메톡시메틸)-니코틴산이 이용된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 술포닐우레아 제초제에는 클로르술푸론, 메트술푸론 메틸, 술포메투론 메틸, 클로리무론 에틸, 티펜술푸론 메틸, 트리베누론 메틸, 벤술푸론 메틸, 니코술푸론, 에타메트술푸론 메틸, 림술푸론, 트리플루술푸론 메틸, 트리아술푸론, 프리미술푸론 메틸, 시노술푸론, 아미도술푸론, 플루자술푸론, 이마조술푸론, 피라조술푸론 에틸, 할로 술푸론, 아짐술푸론, 시클로술푸론, 에톡시술푸론, 플라자술푸론, 플루피르술푸론 메틸, 포람술푸론, 요오도술푸론, 옥사술푸론, 메소술푸론, 프로술푸론, 술포술푸론, 트리플록시술푸론, 트리토술푸론, 상기 언급한 제초제 종 임의의 것의 유도체, 및 상기 언급한 제초제 중 2 이상의 혼합물이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 트리아졸로피리미딘 제초제에는 클로란술람, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람 및 페녹스술람이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 피리미디닐옥시벤조에이트 (또는 피리미딜 카르복시) 제초제에는 비스피리박, 피리티오박, 피리미노박, 피리벤족심 및 피리프탈리드가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 술포닐아미노-카르보닐트리아졸리논 제초제에는 플루카르바존 및 프로폭시카르바존이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
피리미디닐옥시벤조에이트 제초제는 피리미디닐티오벤조에이트 제초제와 관련이 있고, 미국 잡초 학회 (Weed Science Society of America)에서 피리미디닐티오벤조에이트 제초제의 표제 하에 일반화될 수 있는 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명의 제초제는 상기 기재된 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 피리미디닐티오벤조에이트 제초제를 추가로 포함한다.
III. 핵산 분자
본 발명은 또한 단리된 이벤트 127 핵산 분자를 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산 분자"의 사용은 핵산 분자를 DNA를 포함하는 것으로 제한하고자 하는 것이 아니고, 임의의 뉴클레오티드, 예컨대 리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드의 조합을 포함할 수 있다. 그러한 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드는 자연 발생 분자 및 합성 유사체를 둘 모두 포함한다. 핵산 분자는 또한 단일 가닥 형태, 이중 가닥 형태, 헤어핀, 줄기-및-루프 구조 등을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 모든 서열 형태를 포함한다. 한 실시양태에서, 이벤트 127 핵산 분자는 서열 1의 위치 1312 내지 6069의 핵산 서열을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이벤트 127 핵산 분자는 서열 1의 뉴클레오티드 1302 내지 6079의 서열을 갖는 핵산 분자를 포함한다.
이벤트 127 핵산 분자는 또한 서열 1의 단편을 포함한다. 뉴클레오티드 서열의 "단편"은 임의의 길이, 예컨대 적어도 7, 15, 20, 25, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 550, 650, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 (nt) 길이일 수 있다. 이들 단편은 진단 프로브 및 프라이머를 비롯하여 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아님) 다양한 용도를 갖는다. 물론, 더 큰 단편, 예컨대 길이가 601-8000 nt인 것도 또한, 전부는 아니더라도 서열 1의 뉴클레오티드 서열의 대부분에 상응하는 단편으로서 본 발명에 따라 유용하다. 예를 들어 길이가 적어도 20 nt인 단편은, 예를 들어 서열 1의 뉴클레오티드 서열로부터의 20 개 이상의 인접 염기를 포함하는 단편을 의도한다.
이벤트 127 식물은 이미다졸리논 억제성 제초제에 대해 저항성 또는 내성을 제공할 수 있는 S653N 돌연변이를 갖는, AHASL 코딩 서열을 갖는 트랜스제닉 발현 카세트를 포함한다. 카세트는 추가로 AHASL 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 5' 및 3' 조절 서열을 포함한다. "작동가능하게 연결된"은 2 이상의 요소 사이의 기능적 연결을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 관심 핵산 분자 및 조절 서열 (예를 들어, 프로모터) 사이의 작동가능한 연결은 관심 핵산 분자의 발현을 가능하게 하는 기능적 연결이다. 작동가능하게 연결된 요소는 인접하거나 또는 인접하지 않을 수 있다. 2개의 단백질 코딩 영역이 연결되었음을 언급하는데 사용된 경우, 작동가능하게 연결된이란 코딩 영역이 동일한 리딩 프레임 내에 존재함을 의도한다.
이에 따라, 대두 이벤트 127 식물 내의 발현 카세트는 5'-3' 전사 방향으로, 식물에서 기능적인 전사 및 번역 개시 영역 (예를 들어, 프로모터), AHASL S653N 코딩 영역, 및 전사 및 번역 종결 영역을 함유한다. "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3' 쪽에 위치한다. 프로모터 서열은 근위 및 보다 원위의 상류 요소를 포함할 수 있고, 후자의 요소는 종종 인핸서라 지칭된다. 따라서, "인핸서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 뉴클레오티드 서열이며, 프로모터의 본래 요소 또는 프로모터의 수준 또는 조직 특이성을 향상시키기 위해 삽입된 이종 요소일 수 있다. 프로모터는 그 전체가 천연의 유전자로부터 유래될 수 있거나, 또는 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 또는 심지어 합성 뉴클레오티드 절편을 포함할 수 있다. 당업자는 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 발달의 상이한 단계에서, 또는 상이한 환경 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음을 이해한다. 핵산 단편이 대부분의 세포 유형에서 대부분의 시점에 발현되도록 하는 프로모터를 흔히 "항시성 프로모터"라 칭한다.
한 실시양태에서, 대두 이벤트 127 식물 내의 발현 카세트는 아라비돕시스 탈리아나 csr1-2 프로모터 및 csr1-2 전사 종결 영역의 제어하에, 작동가능하게 연결된 성분으로서 AHASL S653N 코딩 서열을 함유한다. 발현 카세트는 핵산 구축물 pAC321로부터의 PvuII 단편으로서 유래된다. 한 실시양태에서, 발현 카세트는 서열 4을 서열을 갖는다.
이벤트 127 핵산 분자의 검출 및/또는 확인을 위한 다양한 방법에서 사용할 수 있는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 실시양태에서, "단리된" 핵산 분자는 핵산 분자가 유래되는 유기체의 게놈 DNA에서 핵산 분자와 자연적으로 플랭킹된 서열 (즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열) (예를 들어 단백질 코딩 서열)이 존재하지 않는 것이다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 핵산 분자가 유래되는 세포의 게놈 DNA에서 핵산 분자와 자연적으로 플랭킹된 뉴클레오티드 서열을 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 또는 0.1 kb 미만으로 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 5 및/또는 6으로 언급된 접합부 DNA 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 5 및/또는 6으로 언급된 접합부 DNA 서열 또는 그의 변이체 및 단편을 포함한다. 접합부 DNA 서열의 단편 및 변이체는 이벤트 127 DNA를 구분해서 확인하는데 적합하다. 본원의 다른 부분에서 논의되는 바와 같이, 그러한 서열은 샘플에서 이벤트 127 삽입물 DNA를 검출하는데 사용하기 위한 프라이머 및/또는 프로브로서 용도가 발견된다.
다른 실시양태에서, 이벤트 127 식물, 이벤트 127 삽입물 DNA, 또는 이벤트 127 특이적 핵산 분자를 검출할 수 있는 핵산 분자를 제공한다. 그러한 서열은 서열 5 및/또는 6으로 언급된 핵산 분자 또는 그의 변이체 또는 그의 상보물을 포함하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이벤트 127 핵산 분자를 검출하는데 사용되는 핵산 분자는 서열 5 및/또는 6으로 언급된 서열 또는 그의 상보물을 포함한다. 이벤트 127 핵산 분자, 이벤트 127 삽입물 DNA, 또는 이벤트 127 특이적 영역을 검출하는 핵산 분자의 단편 및 변이체는 이벤트 127 식물을 구분해서 확인하는데 적합하다. 본원의 다른 부분에서 논의되는 바와 같이, 그러한 서열은 프라이머 및/또는 프로브로서의 용도가 발견된다. 추가로, 서열 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 67, 68, 69, 70으로 언급된 서열, 또는 그의 상보물, 또는 서열 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 67, 68, 69, 70의 변이체 및 단편, 또는 그의 상보물을 포함하거나 이들로 이루어진 단리된 DNA 뉴클레오티드 프라이머 서열을 제공한다.
한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 특정 프라이머 쌍은 이하에서 나타내는 전방향 및 역방향 프라이머를 포함한다 (확인된 서열 1에 대한 상대적인 위치). 프라이머는 327 염기 쌍의 밴드 크기를 생성할 것으로 예측된다.
Figure pct00001
핵산 서열과 관련하여 본원에서 사용되는 "변이체"는 실질적으로 유사한 서열을 지칭한다. 핵산 분자의 경우, 변이체는 5' 및/또는 3' 말단에서의 결실 (예를 들어, 말단 절단); 천연 핵산 분자 내의 하나 이상의 내부 부위에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실 및/또는 부가; 및/또는 천연 핵산 분자 내의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상 뉴클레오티드의 치환을 갖는 핵산 분자를 포함한다.
본원에서 개시하는 것과 같은 임의의 프라이머 조합이 이벤트 127 특이적 영역을 검출하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있다 (예를 들어, 서열 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 67, 68, 69, 및 70). 프라이머 쌍의 비제한적 예에는 서열 35 및 36; 서열 37 및 38; 서열 39 및 40; 서열 41 및 42; 서열 43 및 44, 서열 67 및 68, 서열 69 및 70이 포함된다. 본 발명에 따라 개시된 방법에 사용하기 위한 추가의 프라이머 및 프라이머 쌍을 또한 설계할 수 있다.
제공되는 방법에 사용하기 위한 프로브 및 프라이머는 표적 DNA 서열에 결합하고 생물학적 샘플, 예를 들어 시험할 식물로부터 수득한 샘플에서 핵산 분자를 특이적으로 검출하고/하거나 확인하는데 충분한 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 혼성화 조건 또는 반응 조건은 이러한 결과를 달성하기 위해 조작자가 결정할 수 있음을 인식한다. 이러한 길이는 선택한 검출 방법에 유용한 임의의 길이, 예컨대 8, 10, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 뉴클레오티드 이상, 또는 약 11-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 그러한 프로브 및 프라이머는 매우 엄격한 혼성화 조건하에서 표적 서열에 특이적으로 혼성화될 수 있다. 표적 DNA 서열과 상이하며, 표적 DNA 서열을 특이적으로 검출하고/거나 확인하는 능력을 보유한 프로브를 종래의 방법으로 설계할 수 있지만, 실시양태에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열과 인접한 뉴클레오티드의 완전한 DNA 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 프로브 및 프라이머는 표적 핵산 분자와 약 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상의 서열 동일성 또는 상보성을 공유할 수 있거나 (예를 들어, 서열 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44), 또는 표적 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6 개 이상의 뉴클레오티드 만큼 상이할 수 있다 (예를 들어, 서열 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44). 프로브가 프라이머로서 사용될 수 있지만, 이는 일반적으로 표적 DNA 또는 RNA에 결합되도록 설계되며, 증폭 공정에서 사용되지 않는다.
일부 실시양태에서, 특정 프라이머를 사용하여 이벤트 DNA의 단편을 증폭시켜 "특정 프로브"로서 사용될 수 있는 앰플리콘을 생산하거나, 또는 앰플리콘 그 자체가 생물학적 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자를 확인하는데 검출될 수 있다. 별법적으로, 프로브는 증폭 이벤트의 검출을 위해 PCR 반응 동안 사용될 수 있다 (예를 들어, 택맨(Taqman) 프로브 또는 MGB 프로브) (소위 실시간 PCR). 프로브가 샘플에 결합되도록 하는 조건하에서 프로브가 생물학적 샘플 내의 핵산 분자에 혼성화된 경우, 이러한 결합은 검출될 수 있으며, 이에 따라 생물학적 샘플 내의 이벤트 127의 존재가 드러난다. 이같은 결합된 프로브의 확인은 당업계에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 프로브는 최적화된 조건하에서 이벤트의 5' 또는 3' 플랭킹 영역을 포함하는 영역에 특이적으로 혼성화되는 서열이며, 또한 바로 인접하는 삽입물 DNA의 일부도 포함하여 접합부 영역에 걸쳐 존재한다. 특정 프로브는 이벤트 127 핵산 분자의 특이적 영역과 적어도 80％, 80 내지 85％, 85 내지 90％, 90 내지 95％, 및 95 내지 100％ 동일한 (또는 상보적인) 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "증폭된 DNA" 또는 "앰플리콘"은 핵산 주형의 일부인 표적 핵산 분자의 핵산 분자 증폭의 생성물을 지칭한다. 예를 들어, 유성 교배로 인한 대두 식물이 이벤트 127 핵산 분자를 함유하는지 여부를 결정하기 위해, 대두 식물 조직 샘플로부터 추출된 DNA를, 삽입된 이종 DNA의 삽입 부위에 인접한 플랭킹 서열로부터 유래된 제1 프라이머 및 삽입된 이종 DNA로부터 유래된 제2 프라이머를 포함하는 DNA 프라이머 쌍을 이용한 핵산 분자 증폭 방법에 사용하여 이벤트 127 핵산 분자의 존재를 진단하거나 나타내는 앰플리콘을 생성한다. 이벤트 127 영역의 "진단"을 위해 생물학적 샘플 내 이벤트 127 영역의 존재 또는 부재를 구별하는 임의의 방법 또는 검정을 사용하는 것이 의도된다. 별법적으로, 제2 프라이머는 플랭킹 서열로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 프라이머 쌍은 발현 구축물의 삽입된 전체 핵산 분자 뿐만 아니라 트랜스제닉 삽입물의 플랭킹 서열, 예를 들어 서열 1을 포함하는 앰플리콘이 생성되도록, 삽입된 DNA의 양 측면 상의 플랭킹 서열로부터 유래될 수 있다. 앰플리콘은 또한 이벤트 진단을 위한 길이 및 서열을 갖는다 (예를 들어, 이벤트 127 영역으로부터의 접합부 DNA를 함유함). 앰플리콘은 프라이머 쌍 + 하나의 뉴클레오티드 염기 쌍의 길이 합으로부터 DNA 증폭 프로토콜에 의해 생성될 수 있는 임의의 앰플리콘 길이까지 길이가 다양할 수 있다. 플랭킹 서열로부터 유래된 프라이머 쌍의 구성원은 삽입된 DNA 서열과 떨어져서 위치할 수 있으며, 그 거리는 1개의 뉴클레오티드 염기 쌍에서 증폭 반응의 한계까지, 또는 약 2만개의 뉴클레오티드 염기 쌍까지 다양할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 프라이머 쌍은 삽입물 DNA, 또는 삽입물 DNA의 단편을 증폭시키도록 설계될 수 있다. 그러한 프라이머 쌍은 생물학적 샘플에서 이벤트 127 삽입물 DNA의 존재를 검출하는데 유용하다. 용어 "앰플리콘"의 사용은 DNA 열 증폭 반응에서 형성될 수 있는 프라이머 이량체에 대해서는 구체적으로 제외된다.
특정 실시양태에서, 유용한 프라이머 쌍은 삽입물 DNA 및 플랭킹 5' 또는 3' 게놈 DNA 사이의 접합부 지점과 중첩되는 하나의 프라이머를 포함할 것이다. 그러한 프라이머는 5' 플랭킹 DNA 내지 삽입물 DNA 사이의 접합부 지점 (즉, 서열 1의 위치 1311 내지 1312의 접합부) 주위 뿐만 아니라 삽입물 DNA 내지 3' 플랭킹 DNA 사이의 접합부 지점 (즉, 서열 1의 위치 6069 내지 6070 사이의 접합부) 주위에서 설계될 수 있다. 그러한 프라이머는 플랭킹 영역 또는 삽입물 DNA로부터의 약 10개의 뉴클레오티드 및 삽입물 DNA 또는 플랭킹 영역 내의 접합부 지점에 걸친 적어도 1개의 뉴클레오티드와 혼성화되도록 설계될 수 있다. 따라서, 예를 들어 프라이머는 적어도 다음의 서열 1의 위치: 1311-1321, 1302-1312, 6060-6070, 및/또는 6069-6079로 표시되는 뉴클레오티드와 혼성화되도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 유용한 프라이머 쌍은 삽입물 DNA의 csr1-2 코딩 서열의 복제된 부분의 5' 말단 (서열 1의 위치 5694) 내지 인접한 삽입물 DNA (즉, 서열 1의 위치 5693) 사이의 접합부 지점과 중첩되는 하나의 프라이머를 포함할 것이다. 그러한 프라이머는 복제된 영역 또는 인접한 삽입물 DNA로부터의 약 10개의 뉴클레오티드 및 접합부 지점에 걸친 적어도 1개의 뉴클레오티드와 혼성화되도록 설계될 수 있다 (예를 들어, 서열 1의 적어도 5693-5603, 또는 적어도 5684-5694).
본 발명에서의 용도를 위한 프로브 및 프라이머의 제조 및 사용 방법은 당업계에 공지되어 있다. PCR 프라이머 쌍은 공지된 서열로부터, 예를 들어 그러한 목적을 위해 의도된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 벡터 NTI 버전 6 (인포맥스 인크.(Informax Inc.), 메릴랜드주 베데스다 소재)의 PCR 프라이머 분석 툴; 프라이머셀렉트 (디엔에이스타 인크.(DNASTAR Inc.), 위스콘신주 매디슨 소재); 및 프라이머 (버전 0.5ⓒ, 1991, 화이트헤드 생의학 연구소(Whitehead Institute for Biomedical Research), 메사추세츠주 캠브리지 소재)를 이용하는 것에 의해 유래될 수 있다. 추가로, 서열은 시각적으로 스캐닝될 수 있고, 프라이머는 당업자에 공지된 가이드라인에 의해 수작업으로 확인될 수 있다
IV. 육종 방법
개시된 이벤트 127 대두 식물을 육종 방법을 이용하는 육종 프로그램에 사용하여 추가의 이벤트 127 대두 식물, 예컨대 자손 식물을 생산할 수 있다. 그러한 육종 방법은 예를 들어 상이한 지리적 영역에서 상업적 생산에 사용하기 위한 대두 식물을 생산하는데 사용될 수 있거나, 또는 추가의 대두 육종 군집을 생산하는데 사용될 수 있다.
또한, 이벤트 127 대두 식물을 육종 방법을 이용하는 육종 프로그램에 사용하여 AHAS 억제제 내성에 더하여 추가의 제초제, 예컨대 글리포세이트, 글루포시네이트, 및/또는 디캄바에 대한 내성의 조합과 같은 추가의 관심 특성을 갖는 대두 식물을 생산할 수 있다 ("축적된 특성" 또는 "특성 축적"이라고도 칭함). 또한, 이벤트 127 대두 식물을 육종 방법을 이용하는 육종 프로그램에 사용하여 다중 AHAS-억제성 제초제 내성 코딩 서열을 갖는 대두 식물을 생산할 수 있다. 또한, 개시된 식물을 육종 방법을 이용하는 육종 프로그램에 사용하여 AHAS-억제성 제초제 내성 특성에 더하여 인풋 특성(input trait), (예컨대 질환 및 병원체 저항성, 예컨대 Bt 유전자에 의해 부여되는 것), 및 아웃풋 특성(output trait), 예컨대 오일 및 단백질 품질 및 양을 비롯한 다른 농업상 중요한 특성을 갖는 식물을 생산할 수 있다.
개시된 AHAS-억제성 제초제 내성 대두 식물의 육종 방법은 (a) 이벤트 127 대두 식물을 제2 대두 식물과 교배하는 단계; 및 (b) 교배로부터 종자를 수득하는 단계를 포함한다. 수득된 종자를 추가로 스크리닝하여 이벤트 127 핵산 분자를 갖는 DNA를 함유하는 종자를 확인할 수 있다. 그러한 방법은 추가로 교배 종자로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계 및 이벤트 127 핵산 분자의 존재 또는 부재에 대해 샘플을 검정하는 단계를 수반할 수 있다. 별법적으로, AHAS-억제성 제초제 내성에 대해 종자를 스크리닝하여 이벤트 127 DNA를 함유하는 종자 또는 자손을 확인할 수 있다.
이벤트 127 대두 식물은 대두에 대해 이용가능한 임의의 육종 방법을 이용하여 육종할 수 있다. 예를 들어, 먼저 트랜스제닉 이벤트 127 대두 식물 (또는 제초제 내성을 부여하는 실시양태의 발현 카세트에 의한 형질전환으로부터 유래된 그의 자손)로부터 성장된 제1 모 대두 식물 및 제초제 내성 표현형이 결여된 제2 모 대두 식물을 유성 교배하여 다수의 제1 자손 식물을 생산하는 단계; 이어서 목적하는 제초제 내성을 나타내는 제1 자손 식물을 선별하는 단계; 제1 자손 식물을 자배시켜 다수의 제2 자손 식물을 생산하는 단계; 이어서 목적하는 제초제 내성을 나타내는 제2 자손 식물을 선별하는 단계에 의해 이벤트 127 대두 식물을 육종할 수 있다. 이들 단계는 추가로 제1 제초제 내성 자손 식물 또는 제2 제초제 내성 자손 식물을 제2 모 대두 식물 또는 제3 모 대두 식물과 역교배시켜 목적하는 제초제 내성을 나타내는 대두 식물을 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 추가로 표현형에 대해 자손을 검정하는 것을 요구되지 않음을 인식한다. 본원의 다른 곳에서 개시하는 다양한 방법 및 조성물을 사용하여 이벤트 127 삽입물을 검출하고/거나 확인할 수 있다.
또한, 독립적으로 분리되는 2개의 첨가된 외인성 유전자를 함유하는 자손을 생산하기 위하여 2개의 상이한 트랜스제닉 식물을 또한 유성 교배시킬 수 있음을 이해하여야 한다. 적절한 자손의 자배는 첨가된 외인성 유전자가 둘 모두 동형접합체인 식물을 생산할 수 있다. 또한, 영양 번식과 같이, 모 식물과의 역교배 및 비트랜스제닉 식물과의 이종교배가 고려된다. 그러나, 이같은 식물을 생성하기 위해 임의의 방법을 이용할 수 있다.
이벤트 127 핵산 분자를 함유하는 순계교배된 대두 라인은 대두 품종을 생산하는데 사용하기 위해, 그리고 새롭고 특징적인 순계교배 대두 라인을 만들기 위한 육종 프로그램에서 모 식물로서 사용하기 위해 개발될 수 있다. 순계교배된 대두 라인은 종종 전통적인 육종 및/또는 분자적 유전자이입 기술을 통한 신규 특성의 유전자이입을 위한 표적으로서 사용된다. 순계교배된 라인의 동형접합성 및 표현형 안정성을 결정하기 위해 많은 분석 방법이 이용가능하다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 이벤트 127 대두 식물이 생산되게 하는 핵산 분자는 제2 제초제, 예컨대 글리포세이트에 대한 저항성을 부여하는 핵산 분자에 의해 분자적 축적으로 조작될 수 있다. 다른 실시양태에서, 분자적 축적은 추가로 제3 제초제에 대한 내성을 부여하는 적어도 하나의 부가적인 핵산 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 서열은 글루포시네이트에 대한 내성을 부여하고, 특정 실시양태에서, 서열은 패트(pat)를 포함한다.
다른 실시양태에서 본 발명의 이벤트 127 대두 식물은 하나 이상의 관심 특성을 포함하고, 일부 실시양태에서 이벤트 127 DNA는 관심 핵산 분자 서열 및/또는 특성의 임의의 조합과 축적되어 목적하는 특성의 조합을 갖는 식물을 생성한다. 본원에서 사용된 바와 같은 특성은 특정 서열 또는 서열의 그룹으로부터 유래된 표현형을 지칭한다. 예를 들어, 제초제 내성 핵산 분자는 살충 및/또는 살곤충 활성을 갖는 폴리펩티드, 예컨대 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 독성 단백질 (Bt 단백질), 렉틴 등을 코딩하는 임의의 다른 핵산 분자와 축적될 수 있다. 생성된 조합은 또한 관심 핵산 분자 중 임의의 하나의 다중 카피를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 대두 이벤트 127 DNA는 다른 제초제-내성 특성이 축적되어 추가로 개선된 특성을 갖는 본 발명의 트랜스제닉 식물을 생성할 수 있다. 그러한 실시양태에 사용될 수 있는 다른 제초제-내성 핵산 분자에는 다른 작용 방식으로 글리포세이트 또는 AHAS 억제제에 대한 내성을 부여하는 것, 예를 들어 글리포세이트 옥시도-리덕타제 효소를 코딩하는 유전자가 포함된다. 대두 이벤트 127 DNA와 조합될 수 있는 다른 특성으로는 식물에 보다 높은 수준의 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 생산 능력을 부여하는 핵산 분자로부터 유래된 것이 포함된다. 대두 127 이벤트와 조합될 수 있는 다른 특성으로는 술포닐우레아 및/또는 이미다졸리논에 대한 내성을 부여하는 것이 포함된다.
일부 실시양태에서, 대두 이벤트 127 DNA는 예를 들어 파라-히드록시페닐피루베이트 (HPP)를 호모겐티세이트로 변환시키는 반응을 촉매하는 효소인 히드록시페닐피루베이트디옥시게나제로 축적될 수 있다. 이러한 효소를 억제하고 효소에 결합하여 HPP의 호모겐티세이트로의 변환을 억제하는 분자가 제초제로서 유용하다. 식물에서 이같은 제초제에 대한 내성을 부여하는 특성은 당업계에 공지되어 있다. 대두 이벤트 127 DNA와 축적될 수 있는 적합한 제초제-내성 특성의 다른 예에는 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 핵산 분자 (2,4-D 및 기타 페녹시 옥신 제초제 뿐만 아니라 아릴옥시페녹시프로피오네이트 제초제에 대한 내성을 부여하는 것으로 보고됨) 및 디캄바 내성 핵산 분자가 포함된다.
대두 이벤트 127 DNA와 함께 조합될 수 있는 제초제 내성 특성의 다른 예에는 외인성 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제를 코딩하는 핵산 분자에 의해 부여되는 것이 포함된다. 외인성 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제를 함유하는 식물은 효소 글루타민 신타제를 억제하는 글루포시네이트 제초제에 대해 개선된 내성을 나타낼 수 있다. 대두 이벤트 127 DNA와 함께 조합될 수 있는 제초제 내성 특성의 다른 예에는 변경된 프로토포르피리노겐 옥시다제 (프로톡스) 활성을 부여하는 핵산 분자에 의해 부여되는 것이 포함된다. 그러한 핵산 분자를 함유하는 식물은 프로톡스 효소를 표적으로 하는 임의의 제초제 품종 ("프로톡스 억제제"라고도 칭함)에 대해 개선된 내성을 나타낼 수 있다.
AHAS 억제제 내성 특성과 함께 조합될 수 있는 제초제 내성 특성의 다른 예에는 식물, 예컨대 대두 식물에 적어도 하나의 제초제에 대한 내성을 부여하는 것이 포함된다. 특정 제초제에 대한 내성이 다양한 식물과 마찬가지로 제초제 내성 대두는 당업계에 공지되어 있다. 이들 내성과 관련이 있는 특성(들)은 육종에 의해 또는 다른 방법을 통해 이벤트 127 대두 식물과 조합되어 본 발명의 식물 뿐만 아니라 그의 사용 방법을 제공할 수 있다.
대두 이벤트 127 DNA는 또한 적어도 하나의 다른 특성과 조합되어, 동물 사료용으로 바람직한 특성, 예컨대 높은 오일 함량; 아미노산 조성, 단백질 함량, 개선된 소화력 또는 변경된 지방산 조성을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 목적하는 특성이 조합된 품종을 추가로 포함하는 본 발명의 식물을 생산할 수 있다.
대두 이벤트 127 DNA는 또한 다른 바람직한 특성, 예컨대 무독성 및 질환 저항성 유전자, 예컨대 대두 낭종 선충류 저항 특성, 예를 들어 SCN, 및 가공 또는 가공품에 바람직한 특성, 예컨대 증가된 오일 함량 또는 변형된 지방산 조성과 조합될 수 있다 (예를 들어, 지방산 데새투라제 유전자; 및 중합체 또는 바이오플라스틱 (예를 들어, 베타-케토티올라제, 폴리히드록시부티레이트 신타제, 및 아세토아세틸-CoA 리덕타제)은 폴리히드록시알카노에이트 (PHA)의 발현을 용이하게 함). 또한 제초제 내성 핵산 분자를 임의의 농경학적 특성을 제공하는 핵산 분자와 조합할 수 있다.
이러한 축적된 조합은 임의의 공지된 방법론에 의해 식물을 육종하거나, 또는 유전적 형질전환을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 임의의 방법으로 제작할 수 있다. 서열이 식물을 유전적으로 형질전환시킴으로써 축적된 경우, 관심 핵산 분자 서열은 임의의 시간에 임의의 순서로 조합될 수 있다. 특성은 형질전환 카세트의 임의의 조합에 의해 제공된 관심 핵산 분자와의 공동-형질전환 프로토콜에서 동시에 도입될 수 있다. 예를 들어, 2개의 서열이 도입되는 경우, 2개의 서열은 별개의 형질전환 카세트에 함유되거나 (트랜스) 또는 동일한 형질전환 카세트 상에 함유될 수 있다 (시스). 서열의 발현은 동일한 프로모터에 의해 또는 상이한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 특정 경우에, 관심 핵산 분자의 발현을 억제하는 형질전환 카세트를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 다른 억제 카세트 또는 과다발현 카세트의 임의의 조합과 조합되어, 식물에서 목적하는 특성의 조합을 생성할 수 있다. 핵산 분자는 부위 특이적 재조합 시스템을 이용하여 목적하는 게놈 위치에 축적될 수 있는 것으로 추가로 인식된다.
또한, 이벤트 127 DNA를 갖는 대두 식물을 육종하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 이벤트 127 대두 식물 또는 그의 유도체를 제2 대두 모 식물과 교배하는 단계; (b) 교배로부터 종자를 수득하는 단계; (c) 하나 이상의 종자로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계; 및 (d) 이벤트 127 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
V. 형질전환된 식물
또한 이벤트 127 대두 식물로부터 수득한 식물 물질 또는 부분의 형질전환에 의해 이벤트 127 특성과 조합된 특성을 갖는 대두 식물을 생산할 수 있다. 추가의 특성은 당업자가 이용가능한 임의의 형질전환 방법에 의해 이벤트 127 대두 식물과 조합될 수 있다. 따라서, 이벤트 127 대두 식물은 이벤트 127 대두 식물에 추가의 이종 핵산 분자를 도입하기 위한 형질전환 방법에 사용하기 위한 식물 물질의 공급원으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 형질전환 벡터는 관심 유전자를 이벤트 127 대두 식물에 도입하여 다중의 도입 특성을 갖는 대두 식물을 생산하기 위해 제조될 수 있다.
그러한 방법에 사용하기 위한 형질전환 벡터는 본원에서 기재하는 것을 비롯하여 임의의 관심 유전자로 형질전환된 식물을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 형질전환 벡터는 선별가능한 마커, 및 도입하고자 하는 것으로 전형적으로 형질전환된 이벤트 127 대두 식물에서 발현되는 관심 유전자를 포함할 수 있다. 이같은 선별가능한 마커는 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 관심 유전자는 도입하고자 하는 목적하는 특성에 따라 다르다. 예를 들어, 식물에서 지방산 조성을 변형시키는 것, 식물의 아미노산 내용을 변경시키는 것, 식물의 곤충 및/또는 병원체 방어 기전을 변경시키는 것 등을 비롯한 표현형에서의 다양한 변화가 관심거리일 수 있다. 이들 결과는 식물에서 이종 생성물의 발현 또는 내인성 생성물의 증가된 발현을 제공하는 것에 의해 달성될 수 있다. 별법적으로, 상기 결과는 식물에서 하나 이상의 내인성 생성물, 특히 효소 또는 보조인자의 발현을 감소시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 이러한 변화는 형질전환된 식물의 표현형의 변화를 야기한다.
본 발명의 방법에 임의의 형질전환 벡터를 사용할 수 있다. 다수의 식물 형질전환 벡터 및 식물을 형질전환하는 방법이 이용가능하다. 형질전환 방법은 본원에서 기재한 바를 비롯한 임의의 특성을 이벤트 127 삽입물에 의해 제공되는 AHAS-억제성 제초제 내성 특성과 함께 축적시키는데 사용될 수 있다.
VI. 검출 방법
생물학적 샘플에서, 예를 들어 자손 및 유도체를 비롯하여 대두 식물로부터 수득한 샘플로부터 이벤트 127 핵산 분자를 확인하고/거나 검출하기 위한 방법 및 조성물을 또한 제공한다. 그러한 방법은 임의의 생물 물질에서 이벤트 127 영역 또는 핵산 분자를 확인하고/거나 검출하는데 사용된다. 그러한 방법으로는, 예를 들어 종자 순도를 확인하는 방법 및 이벤트 127 핵산 분자에 대해 종자 소집단 내의 종자를 스크리닝하는 방법이 포함된다. 한 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 127 삽입물 핵산 분자를 확인하는 방법이 제공되고, 이는 생물학적 샘플 및 이벤트 127 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 제1 및 제2 핵산 프라이머의 혼합물을 형성하는 단계; 제1 및 제2 핵산 프라이머가 대두 이벤트 127 핵산 분자를 증폭시키도록 하는 조건 하에서 혼합물을 반응시키는 단계; 및 증폭된 이벤트 127 핵산 분자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이벤트 127 핵산 분자는 이벤트 127 특이적 핵산 분자이다.
또한, 대두 DNA 및 대두 이벤트 127 핵산 분자에 혼성화될 수 있는 핵산 분자 프로브를 갖는 생물학적 샘플을 함유하는 혼합물을 형성하는 단계, 핵산 분자 프로브가 이벤트 127 핵산 분자에 혼성화되도록 하는 조건하에서 혼합물을 반응시키는 단계, 및 샘플에서 핵산 분자 프로브가 이벤트 127 핵산 분자에 혼성화되었는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자를 확인하는 방법을 제공하며, 이때 혼성화의 존재는 이벤트 127 핵산 분자의 존재를 나타낸다.
본 발명의 방법은 또한 생물학적 샘플에서 이벤트 127 삽입물 핵산 분자를 확인하고/거나 검출하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자를 확인하는 방법을 제공하며, 이는 생물학적 샘플 및 이벤트 127 삽입물 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 제1 및 제2 핵산 프라이머의 혼합물을 형성하는 단계; 제1 및 제2 핵산 프라이머가 이벤트 127 삽입물 핵산 분자를 증폭시키도록 하는 조건하에서 혼합물을 반응시키는 단계; 및, 증폭된 이벤트 127 삽입물 핵산 분자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다.
또한, DNA 및 이벤트 127 핵산 분자에 혼성화될 수 있는 핵산 분자 프로브를 갖는 생물학적 샘플을 함유하는 혼합물을 형성하는 단계, 핵산 분자 프로브가 이벤트 127 핵산 분자에 혼성화되도록 하는 조건하에서 혼합물을 반응시키는 단계, 및 샘플에서 핵산 분자 프로브가 이벤트 127 핵산 분자에 혼성화되었는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자를 확인하는 방법을 제공하며, 이때 혼성화의 존재는 이벤트 127 핵산 분자의 존재를 나타낸다.
추가로, 생물학적 샘플에서 이벤트 127 영역을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 이벤트 127 영역으로는 이벤트 127 삽입물 DNA, 5' 접합부 영역, 3' 접합부 영역, 5' 플랭킹 영역, 3' 플랭킹 영역, 형질전환 이벤트로 인한 삽입물 DNA 내의 특유의 돌연변이 또는 복제물, 또는 이들의 임의의 것의 조합 및 단편이 포함된다.
생물학적 샘플은 이벤트 127 핵산 분자를 갖는 DNA가 존재하는지 여부를 결정하고자 하는 임의의 샘플을 포함할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 임의의 식물 물질, 또는 식물 물질, 예컨대 이들로 한정되는 것은 아니지만 식품 또는 사료를 포함하거나 이로부터 유래된 물질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "식물 물질"은 식물 또는 식물 부분에서 수득되거나 그로부터 유래된 물질을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 대두 조직을 포함한다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 대두 잎 조직으로부터 수득된다. 또 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 대두 종자 조직으로부터 수득된다.
본 발명의 방법을 이용하여 임의의 이벤트 127 관련 핵산 분자를 검출하고/거나 확인할 수 있다. 예를 들어, 검출될 수 있는 핵산 분자로는 DNA, mRNA, cDNA 등이 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여 이벤트 127 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 검출하고/거나 확인할 수 있다. 검출되고/거나 확인된 핵산 분자는 삽입물 DNA에서 확인된 돌연변이, 예를 들어 S653N 또는 R272K 등을 갖는 AHAS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 프로모터 서열, 종결 서열, 그러한 서열의 단편, 및 이들의 조합을 비롯한 이벤트 127 삽입물 DNA의 임의의 단편을 포함할 수 있다.
본원에서 개시하는 방법에 사용하기 위한 프라이머 및 프로브는 통상적인 방법, 예를 들어 서열의 재클로닝 및 서열분석에 의해 개시된 서열을 확인 (및, 필요한 경우 교정)하는데 사용될 수 있다. 핵산 분자 프로브 및 프라이머는 표적 DNA 서열을 특이적으로 검출한다. 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법을 사용하여 샘플 내의 트랜스제닉 이벤트로부터의 핵산 분자의 존재를 검출 또는 확인할 수 있다. "특이적으로 검출한다"는 핵산 분자가 127 특이적 영역을 증폭시키기 위한 프라이머로서 사용될 수 있거나 또는 핵산 분자가 엄격한 조건하에서 이벤트 127 특이적 영역을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 프로브로서 사용될 수 있는 것으로 의도된다. 127 이벤트 또는 127 이벤트의 특이적 영역의 특이적 검출을 가능하게 하는 혼성화의 수준 또는 정도는 핵산 분자를 이러한 영역이 결여된 핵산 분자로부터의 127 특이적 영역을 구분하여 이벤트 127 분자를 구분해서 확인하게 하는데 충분하다. "이벤트 127 핵산 분자의 증폭을 가능하게 하는 충분한 서열 동일성 또는 상보성을 공유한다"란, 서열이 이벤트 127 핵산 분자를 갖는 핵산 분자의 단편 또는 전장에 걸쳐 적어도 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 동일성 또는 상보성을 공유함을 의도한다.
특정 증폭 프라이머 쌍을 이용한 표적 핵산 분자의 증폭 (예를 들어, PCR에 의함)과 관련하여, "엄격한 조건"은 DNA 열 증폭 반응에서 상응하는 야생형 서열 (또는 그의 상보물)을 갖는 프라이머가 결합하여 바람직하게는 이벤트 127 핵산 분자를 갖는 확인가능한 증폭 생성물 (앰플리콘)을 생성하도록 프라이머 쌍이 표적 핵산 분자에 혼성화되게 하는 조건이다. PCR 접근법에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 PCR 반응에서 사용하여 이벤트 127 핵산 분자를 증폭시키도록 설계될 수 있다. PCR 프라이머 및 PCR 클로닝을 설계하는 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 특정 PCR 프로토콜에서 다수의 파라미터를 특정 실험실 조건으로 조정할 필요가 있을 수 있으며, 유사한 결과의 수집이 가능하도록 약간 변형될 수 있음을 이해한다. 이러한 조정은 당업자에게 명백할 것이다.
개시된 방법에 사용하기 위한 프라이머는 임의의 127 핵산 분자를 증폭시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이벤트 127 핵산 분자 단편을 함유하는 식물을 나타내는 영역을 증폭시킬 수 있도록 프라이머 쌍을 설계할 수 있다. 한 실시양태에서, 그러한 프라이머 쌍은 단일 접합부, 예를 들어 5' 접합부 영역 또는 3' 접합부 영역을 포함하는 영역을 증폭시킬 수 있다. 그러한 프라이머 쌍은 플랭킹 염색체 영역 (예를 들어 5' 또는 3' 플랭킹 영역)으로부터 삽입물 DNA의 방향으로 신장을 프라이밍할 수 있는 하나의 프라이머를 포함하며, 제2 프라이머는 플랭킹 염색체 영역에서 삽입물 DNA로부터 제1 프라이머 방향으로 프라이밍할 수 있다. 이같은 프라이머 쌍은 접합부 영역을 포함하는 핵산 분자를 증폭시킨다. 일부 실시양태에서, 증폭 쌍에 사용된 프라이머 중 하나는 접합부 영역 중 하나 (예를 들어, 5' 또는 3' 접합부 영역)에 걸친 영역에 어닐링될 수 있고, 염색체 영역 방향 또는 삽입물 방향으로 증폭시킬 수 있다. 이같은 방법에 사용하기 위한 플랭킹 염색체 영역 프라이머는 5' 또는 3' 플랭킹 염색체 영역에 어닐링될 수 있고, 삽입물 방향으로 증폭을 프라이밍할 수 있다. 다른 실시양태에서, 프라이머 쌍은 2개의 접합부를 증폭시킬 수 있도록 설계될 수 있다.
이같은 방법에서 사용하기 위해 5' 또는 3' 플랭킹 영역에 어닐링될 수 있는 다른 예의 적합한 프라이머를 설계할 수 있으며, 서열 1의 위치 1-1311 또는 서열 1의 위치 6070 내지 10,656의 핵산 분자에 어닐링될 수 있는 약 10 또는 12개 내지 약 40개의 뉴클레오티드의 프라이머 서열을 포함할 수 있다.
별법적으로, 식물 게놈에 걸쳐 어닐링될 수 있는 무작위 프라이머를 개발할 수 있으며, 삽입물 특이적 프라이머와 함께 사용하여 삽입물 DNA 및 플랭킹 서열의 단편을 포함하는 핵산 분자를 증폭시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 삽입물 특이적 프라이머는 삽입물 특이적 프라이머를 사용하여 증폭한 단편의 검출이 가능하도록 표지될 수 있다. 다른 실시양태에서, 결과적으로 증폭된 핵산 분자는 표지된 프로브와 혼성화되어 이벤트 127 핵산 분자를 확인하거나 검출할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 전체 삽입물 DNA 또는 이벤트 127 DNA를 나타내는 삽입물의 일부를 증폭시키는 프라이머 쌍을 개발할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 삽입물의 5' 및 3' 플랭킹 영역으로부터 프라이밍되는 프라이머를 이용하여 전체 삽입물 DNA를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 설계할 수 있다. 별법적으로, 이벤트 127 삽입물 영역 만을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 설계하여 삽입물의 존재를 확인할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플에서 삽입물의 존재를 검출하는데 사용하기 위해, 플라스미드 pAC321의 PvuII 단편 내의 임의의 영역을 증폭시키기 위한 프라이머를 설계할 수 있다. 이같은 프라이머에는 서열 1의 위치 1312 내지 6069 영역을 비롯하여 삽입물 DNA의 임의의 영역을 증폭시킬 수 있는 것이 포함된다. 일부 실시양태에서, 삽입물 DNA의 아라비돕시스 탈리아나 돌연변이체 AHAS 코딩 서열 (예를 들어 위치 2762 내지 4774 또는 그의 단편), 또는 삽입물의 코딩 서열 및 조절 서열의 임의의 조합을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 개발할 수 있다.
증폭된 핵산 분자 (앰플리콘)는 이벤트 127 핵산 분자의 검출을 가능하게 하는 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 앰플리콘은 길이가 약 10, 50, 100, 200, 300, 500, 700, 100, 2000, 3000, 4000, 5000 뉴클레오티드 이상일 수 있다.
일부 실시양태에서, 이벤트 127 핵산 분자의 하나 이상의 특이적 영역을 검출할 수 있다.
본 발명의 방법에 이벤트 127 핵산 분자가 증폭 및/또는 검출되도록 하는 임의의 프라이머를 이용할 수 있다. 한 실시양태에서, 프라이머는 서열 1의 서열을 갖는 핵산 분자에 상응하는 이벤트 127 핵산 분자, 예컨대 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 이상의 인접 뉴클레오티드에 대해 상보성을 포함하거나 상보적이고, 또는 서열 1의 서열을 갖는 핵산 분자의 상보성을 포함하거나 상보적이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 제1 및 제2 프라이머는 서열 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 67, 68, 69, 및 70의 핵산 분자를 포함하며, 이때 제1 또는 제2 프라이머는 이벤트 127 핵산 분자를 증폭시키기 위해 핵산 분자와 충분한 서열 동일성 또는 상보성을 공유한다. 추가 실시양태에서, 제1 및 제2 프라이머는 서열 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 67, 68, 69, 및 70에서 언급된 서열 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함할 수 있다. 프라이머는 대두 이벤트 127 영역을 증폭시키는데 충분한 임의의 길이, 예를 들어 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 15, 또는 30 또는 약 7-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45 뉴클레오티드 이상일 수 있다.
상기 기재한 바와 같이, 특정 실시양태에서, 유용한 프라이머 쌍은 삽입물 DNA 및 플랭킹 5' 또는 3' 게놈 DNA 사이의 접합부 지점과 중첩되는 하나의 프라이머를 포함할 것이다. 이같은 프라이머는 5' 플랭킹 DNA 및 삽입물 DNA 사이의 접합부 지점 (즉, 서열 1의 위치 1311 내지 1312의 접합부) 주위 뿐만 아니라 삽입물 DNA 및 3' 플랭킹 DNA 사이의 접합부 지점 (즉, 서열 1의 위치 6069 내지 6070의 접합부) 주위에서 설계될 수 있다. 이같은 프라이머는 플랭킹 영역 또는 삽입물 DNA로부터의 약 10개의 뉴클레오티드 및 삽입물 DNA 또는 플랭킹 영역 내 접합부 지점에 걸친 적어도 1개의 뉴클레오티드와 혼성화되도록 설계될 수 있다. 따라서, 예를 들어 프라이머는 적어도 다음과 같은 서열 1의 위치: 1311-1321, 1302-1312, 6060-6070, 및/또는 6069-6079로 표시되는 뉴클레오티드와 혼성화되도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 유용한 프라이머 쌍은 삽입물 DNA의 csr1-2 코딩 서열의 복제되는 부분의 5' 말단 (서열 1의 위치 5694) 및 인접 삽입물 DNA 부분의 3' 말단 (즉 서열 1의 위치 5693) 사이의 접합부 지점과 중첩되는 하나의 프라이머를 포함할 것이다. 이같은 프라이머는 복제된 영역 또는 인접 삽입물 DNA로부터의 약 10개의 뉴클레오티드 및 접합부 지점에 걸친 적어도 1개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 서열 1의 적어도 5693-5603, 또는 적어도 5684-5694)와 혼성화되도록 설계될 수 있다.
본원의 다른 부분에서 논의되는 바와 같이, 이벤트 127 핵산 분자를 PCR 증폭시키기 위해, 예를 들어 실시간 PCR을 비롯한 임의의 방법을 이용할 수 있다.
이에 따라, 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 방법은 (a) 생물학적 샘플로부터 DNA 샘플을 추출하는 단계; (b) DNA 프라이머 분자 쌍을 제공하는 단계 (예를 들어, 대두 이벤트 127 영역을 증폭시키는 서열 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 67, 68, 69, 및 70의 임의의 조합), (예를 들어 i) 서열 35 및 서열 36의 서열, ii) 서열 37 및 서열 38, iii) 서열 39 및 서열 40, iv) 서열 41 및 서열 42, v) 서열 43 및 서열 44, vi) 서열 67 및 서열 68, 및 vii) 서열 69 및 서열 70이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아님); (c) DNA 증폭 반응 조건을 제공하는 단계; (d) DNA 증폭 반응을 수행하여 DNA 앰플리콘 분자를 생성하는 단계; 및 (e) DNA 앰플리콘 분자를 검출하는 단계를 포함하며, 이때 DNA 증폭 반응에서의 DNA 앰플리콘 분자의 검출은 샘플 내에 이벤트 127 핵산 분자가 존재함을 나타낸다. 핵산 분자를 프라이머 또는 프로브로서 제공하기 위해서는, 사용되는 특정 용매 및 염 농도 하에서 안정한 이중 가닥 구조를 형성할 수 있도록 서열내에서 오직 충분히 상보적일 필요가 있다.
혼성화 기술에서, 표적 이벤트 127 핵산 분자에 선택적으로 혼성화되는 핵산 분자를 전부 또는 일부 사용할 수 있다. "엄격한 조건" 또는 "엄격한 혼성화 조건"이란, 핵산 분자 프로브 조건을 지칭할 경우 프로브가 그러한 조건하에서 다른 서열에 비해 검출가능하게 더 높은 정도로 (예를 들어, 적어도 배경의 2배 초과) 그의 표적 서열에 혼성화되는 것을 의도한다. 특정 증폭 프라이머 쌍을 이용한 표적 핵산 분자의 증폭과 관련하여 (예를 들어, PCR에 의함), "엄격한 조건"이란 프라이머 쌍이 표적 핵산 분자에 혼성화되도록 하는 조건이며, 프라이머는 그에 상응하는 야생형을 갖는다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 다양한 상황에 따라 다양할 것이다. 혼성화 및/또는 세척 조건의 엄격성을 제어함으로써, 프로브에 100％ 상보적인 표적 서열을 확인할 수 있다 (상동성 프로빙). 별법적으로, 보다 낮은 정도의 동일성이 검출되도록 엄격한 조건을 조정하여 서열 내에서 일부 미스매칭이 일어나게 할 수 있다 (이종성 프로빙). 일반적으로, 프로브는 길이가 약 1000개 뉴클레오티드 미만이거나 또는 길이가 500개 뉴클레오티드 미만이다.
본원에서 사용되는 실질적으로 동일하거나 또는 상보적인 서열은 고도로 엄격한 조건하에서 핵산 분자와 비교되는 핵산 분자의 상보물에 특이적으로 혼성화할 핵산 분자이다. DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격성 조건, 예를 들어 약 45℃에서의 6X 나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트 (SSC)에 이어 50℃에서의 2X SSC로의 세척은 당업자에게 공지되어 있다. 전형적으로, 혼성화 및 검출을 위한 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.5 M Na 이온 미만, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 기타 염) 및 온도가 단 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우 적어도 약 30℃, 장 프로브 (예를 들어, 50개 뉴클레오티드 초과)의 경우 적어도 약 60℃인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 낮은 엄격성 조건의 예는 37℃에서의 30％ 내지 35％ 포름아미드, 1 M NaCl, 1％ SDS (나트륨 도데실 술페이트)의 완충 용액에 의한 혼성화, 및 50 내지 55℃에서의 1X 내지 2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산삼나트륨)으로의 세척을 포함한다. 중등도의 엄격성 조건의 예는 37℃에서의 40 내지 45％ 포름아미드, 1.0 M NaCl, 1％ SDS에서의 혼성화, 및 55 내지 60℃에서의 0.5X 내지 1X SSC로의 세척을 포함한다. 높은 엄격성 조건의 예는 37℃에서의 50％ 포름아미드, 1 M NaCl, 1％ SDS에서의 혼성화, 및 60 내지 65℃에서의 0.1X SSC로의 세척을 포함한다. 임의로, 세척 완충제는 약 0.1％ 내지 약 1％ SDS를 포함할 수 있다. 혼성화 지속시간은 일반적으로 약 24 시간 미만, 통상적으로 약 4 내지 약 12 시간이다. 세척 지속시간은 평형에 이르는데 충분한 최소한의 길이의 시간일 것이다.
혼성화 반응에서, 특이성은 전형적으로 혼성화 이후 세척의 함수이고, 중요한 인자는 이온 강도 및 최종 세척 용액의 온도이다. DNA-DNA 하이브리드의 경우, Tm은 문헌 [Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284]의 방정식: Tm = 81.5℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (％ GC) - 0.61 (％ form) - 500/L으로부터 근사값을 구할 수 있고; 여기서 M은 1가 양이온의 몰농도이고, ％ GC는 DNA 내의 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 백분율이며, ％ form은 혼성화 용액 중 포름아미드의 백분율이고, L은 염기 쌍 내의 하이브리드의 길이이다. Tm은 (규정된 이온 강도 및 pH 하에서의) 상보적 표적 서열의 50％가 완전하게 매칭되는 프로브에 혼성화되는 온도이다. Tm은 각각 1％의 미스매칭에 대해 약 1℃만큼 감소되므로; Tm, 혼성화 및/또는 세척 조건을 목적하는 동일성의 서열에 혼성화하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 90％ 이상의 동일성을 갖는 서열을 고려하는 경우, Tm은 10℃ 감소될 수 있다. 일반적으로, 규정된 이온 농도 및 pH에서 특정 서열 및 그의 상보물에 대해 열 융점 (Tm) 보다 약 5℃ 낮은 엄격한 조건이 선택된다. 그러나, 극도로 엄격한 조건은 열 융점 (Tm)보다 1, 2, 3 또는 4℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고; 중등도로 엄격한 조건은 열 융점 (Tm)보다 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있으며; 낮은 엄격성 조건은 열 융점 (Tm)보다 11, 12, 13, 14, 15 또는 20℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다. 방정식, 혼성화 및 세척 조성물, 및 목적하는 Tm을 이용하여, 당업자는 혼성화 및/또는 세척 용액의 엄격성에서의 변화가 고유하게 기재됨을 이해할 것이다. 목적하는 정도의 미스매칭이 Tm을 45℃ (수용액) 또는 32℃ (포름아미드 용액) 미만으로 되게 하는 경우, 더 높은 온도를 사용할 수 있도록 SSC 농도를 증가시키는 것이 적합하다. 표적 DNA 분자에 대한 프로브의 혼성화는 형광 태그, 방사성 태그, 항체 기반 태그, 및 화학발광 태그를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 검출할 수 있다.
핵산 분자가 상보성을 나타낼 경우, 핵산 분자는 또 다른 핵산 분자의 "상보물"이라 지칭된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 분자 중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드와 상보적일 때, 분자는 "완전한 상보성"을 나타낸다고 지칭된다. 두 분자가 적어도 통상의 "낮은 엄격성" 조건 하에서 서로가 어닐링된 상태로 유지되게 하는 충분한 안정성을 가지고 서로 혼성화할 수 있다면, 이들은 "최소한 상보적"이라고 지칭된다. 유사하게, 분자가 통상의 "높은 엄격성" 조건 하에서 서로가 어닐링된 상태로 유지되게 하는 충분한 안정성을 가지고 서로 혼성화할 수 있다면, 분자는 "상보적"이라고 지칭된다.
다른 실시양태에서, 발현된 아라비돕시스 탈리아나 AHAS 폴리펩티드를 검출하는 것에 의해 이벤트 127 식물을 검출 또는 확인할 수 있다. AHAS 폴리펩티드의 검출에는 임의의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 발현된 AHAS 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위해 도입된 AHAS 단백질에 대해 생성된 항체를 이용할 수 있다.
이벤트 127 핵산 분자 또는 그의 앰플리콘을 검출하기 위해, 유전자 조각 분석(Genetic Bit Analysis)을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 임의의 방법을 이용할 수 있다. 한 방법에서, 인접 플랭킹 DNA 서열 및 삽입된 DNA 서열 둘 모두에 중첩되는 DNA 올리고뉴클레오티드를 설계한다. 다른 실시양태에서, 이벤트 127 특이적 앰플리콘이 생성되게 하는 DNA 프라이머 올리고를 설계한다. 올리고뉴클레오티드는 마이크로웰 플레이트의 웰에 고정된다. 관심 영역의 PCR 이후에, 단일 가닥 PCR 생성물은 고정된 올리고뉴클레오티드에 혼성화될 수 있고, DNA 폴리머라제 및 예상되는 다음 염기에 특이적인 표지된 ddNTP를 이용한 단일 염기 연장 반응을 위한 주형으로서 제공할 수 있다. 판독은 형광 또는 ELISA에 기초하여 수행될 수 있다. 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 연장으로 인한 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 나타낸다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 또 다른 검출 방법은 파이로시퀀싱 (Pyrosequencing) 기술이다. 이 방법에서는, 인접 DNA 및 삽입물 DNA 접합부에 중첩되는 올리고뉴클레오티드를 설계하거나, 또는 이벤트 127 특이적 영역을 증폭시킬 수 있는 한 쌍의 올리고를 이용한다. 올리고뉴클레오티드는 관심 영역으로부터의 단일 가닥 PCR 생성물에 혼성화되고 (삽입된 서열에서 하나의 프라이머 및 플랭킹 서열에서 하나의 프라이머), DNA 폴리머라제, ATP, 술푸릴라제, 루시페라제, 아피라제, 아데노신 5' 포스포술페이트 및 루시페린의 존재하에서 인큐베이션된다. dNTP를 개별적으로 첨가하고, 광신호로 혼입 결과를 측정한다. 광신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 또는 다중 염기 연장으로 인한 트랜스진 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 나타낸다.
본 발명의 앰플리콘을 검출하는데 또한 형광 편광을 이용할 수 있다. 이러한 방법을 이용할 경우, 플랭킹 및 삽입된 DNA 접합부에 중첩되는 올리고뉴클레오티드를 설계하거나, 또는 이벤트 127 특이적 영역을 증폭시킬 수 있는 한 쌍의 올리고를 이용한다. 올리고뉴클레오티드는 관심 영역으로부터의 단일 가닥 PCR 생성물에 혼성화되고 (삽입된 DNA에서 하나의 프라이머 및 플랭킹 DNA 서열에서 하나의 프라이머), DNA 폴리머라제 및 형광 표지된 ddNTP의 존재하에서 인큐베이션된다. 단일 염기 연장에 의해 ddNTP가 혼입된다. 혼입은 형광계를 사용하여 편광의 변화로 측정할 수 있다. 편광의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 연장으로 인한 트랜스진 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 나타낸다.
또한, 이벤트 127 핵산 분자의 존재를 검출하고 정량하기 위해 택맨® 유전자 발현 검정 (PE 어플라이드 바이오시스템즈(PE Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티 소재)을 이용할 수 있다. 간략하게, 플랭킹 및 삽입물 DNA 접합부에 중첩되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계하거나, 또는 이벤트 127 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 한 쌍의 올리고를 이용한다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입물 DNA에서 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서 하나의 프라이머)를 열안정성 폴리머라제 및 dNTP의 존재하에 사이클링한다. FRET 프로브의 혼성화의 결과로 FRET 프로브 상의 켄칭 모이어티로부터 형광 모이어티가 절단되고 방출된다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 플랭킹/트랜스진 삽입물 서열의 존재를 나타낸다.
또한 개시된 방법에 분자 비콘을 이용할 수 있다. 간략하게, 플랭킹 및 삽입물 DNA 접합부에 중첩되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계하거나, 또는 127 특이적 영역을 증폭시킬 수 있는 한 쌍의 올리고를 이용한다. FRET 프로브의 특유의 구조로 인해, 형광 및 켄칭 모이어티가 매우 근접하게 유지되는 2차 구조를 갖게 된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입물 DNA 서열에서 하나의 프라이머 및 플랭킹 서열에서 하나의 프라이머)를 열안정성 폴리머라제 및 dNTP의 존재 하에 사이클링한다. 성공적인 PCR 증폭 후, FRET 프로브가 표적 서열에 혼성화함으로써 프로브 2차 구조가 제거되고, 형광 및 켄칭 모이어티의 공간적인 분리가 일어난다. 형광 신호가 생성된다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 플랭킹/트랜스진 삽입물 서열의 존재를 나타낸다.
앰플리콘 내에서 발견되는 서열에 특이적인 프로브를 이용한 혼성화 반응은 본 발명의 PCR 반응에 의해 생성되는 앰플리콘을 검출하는데 사용되는 또 다른 방법이다.
또 다른 실시양태에서, 이벤트 127 핵산 분자에 의해 생성된 폴리펩티드를 검출하는 방법에 의해 이벤트 127 핵산 분자를 검출하거나 확인할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 개시하는 방법을 이용하여 csr-1AHAS 유전자의 발현 생성물을 검출할 수 있다. 이같은 방법은 삽입된 이벤트 127 핵산 분자에 의해 생성되는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 결합 단백질을 사용하는 것을 수반할 수 있다. 이같은 방법으로는, 면역학적 검정, 예컨대 ELISA (효소 연결된 면역 흡착 검정), 항원 검정, 면역염색, 면역-조직화학, 단백질 칩 검정, 방사성면역침전법 검정, 신속 멤브레인 면역크로마토그래피 검정 및 신속 스틱 면역크로마토그래피 검정 (측방 유동 시험)이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에서 개시하는 방법은 예를 들어, 진단 분자 (예컨대 프라이머 및/또는 프로브)를 기판 상에 부착하여 장치, 예를 들어 어레이 또는 마이크로어레이를 형성하거나 또는 멀티 웰 플레이트를 형성하는 것에 의해, 초고속 기술에서 사용하기 위해 조정될 수 있다. 장치는 임의의 유용한 포맷, 예컨대 칩, 슬라이드, 플레이트, 멤브레인, 섬유, 비드, 스트립, 스틱, 매트, 격자, 막대, 직물, 용기 벽 등으로 제공될 수 있다. 또한, 기판은 이용가능한 임의의 물질, 예컨대 유리, 세라믹, 겔 (예를 들어 히드로겔, 마이크로겔, 모조겔), 및 중합체 물질 (예를 들어 플라스틱, 실리콘, 불소중합체)로 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명의 장치 및 방법에 사용하기 위한 기판으로는 실리카 칩, 나일론 멤브레인, 광학 섬유, 멀티 웰 플레이트 등이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 프로브 또는 다른 이벤트 127 진단 분자는 공유 결합, 배위 결합, 및 비공유 결합 (예를 들어 이온 결합, 수소 결합, 친유성 인력)과 같은 이용가능한 임의의 부착 방법을 이용하여 기판에 부착할 수 있다.
발현의 초고속 검출, 확인 또는 모니터링을 위한 어레이 기반 방법을 이용하여 이벤트 127 핵산 분자 혼성화 표적을 측정할 수 있다. 이러한 '칩' 기반 접근법은 해당 유전자의 발현을 정량적으로 측정하기 위해 유전자 특이적 혼성화 표적으로서 핵산 분자의 마이크로어레이를 사용하는 것을 수반한다. 대형 서열 내의 모든 뉴클레오티드는 동시에 시험될 수 있다. 혼성화는 뉴클레오티드 서열을 효율적으로 분석하는데 사용될 수 있다.
이용가능한 임의의 마이크로어레이 방법을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 예를 들어, 마이크로어레이 방법은 모든 가능한 하위서열을 대표하는 한 세트의 올리고뉴클레오티드 또는 cDNA 분자에의 혼성화에 의해 분석하고자 하는 서열을 비교할 수 있다. 제2 방법은 샘플을 올리고뉴클레오티드 또는 cDNA 프로브의 어레이에 혼성화시킨다. 이벤트 127 표적 서열의 하위서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 cDNA 분자로 이루어진 어레이를 사용하여 표적 서열의 정체를 결정하고, 그의 양을 측정하고, 표적 및 참고 서열 사이의 차이를 검출할 수 있다. 핵산 분자 마이크로어레이를 또한 단백질 분자 또는 그의 단편으로 스크리닝하여, 단백질 분자 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 결정할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 그 밖의 마이크로어레이 진단 방법으로는, 예를 들어, 미국 공개공보 번호 2007/0298423에 개시된 것이 포함된다.
따라서, 이벤트 127 핵산 분자는 임의의 이용가능한 방법을 이용하는 것에 의해 샘플 내에서 확인 또는 검출될 수 있다. 그러한 방법으로는, 겔 분리 기술, 핵산 블롯 검출 (예를 들어, 서던 혼성화, 노던 혼성화), 정성적, 반정량적 또는 정량적 PCR, 변형된 AHASL의 발현을 검출하기 위한 면역검정 (예를 들어 임의의 이뮤노글로불린, 모노클로날 항체, 단일 쇄 항체, 또는 결합 영역 보유 항체 단편을 이용한 ELISA, 스트립 검정 (예를 들어 측방 유동 스트립)), 및 마이크로어레이 또는 "마이크로칩" 기반 검출 검정이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자의 존재를 검출하거나 확인하기 위해 질량 분광측정법 또는 핵 자기 공명 (NMR) 기술을 사용하는 것을 수반할 수 있다.
이같은 검출 방법에 유용한 장치를 또한 본원의 다양한 실시양태에서 제공하며, 그러한 장치는 표면을 갖는 고체 지지체; 및 그에 부착된 적어도 하나의 이벤트 127 진단 분자를 포함한다. 이는 혼성화 검정 장치, 면역검정 장치, 수용체 리간드 결합 검정 장치, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 장치일 수 있다.
VII. 키트
또한 본 발명은 이벤트 127 식물, 또는 이벤트 127 핵산 분자를 검출하기 위한 키트를 제공하며, 이때 키트는 이벤트 127 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 제1 및 제2 핵산 프라이머를 포함한다. 결과적인 증폭된 이벤트 127 핵산 분자는 직접 검출될 수 있거나, 또는 DNA를 함유하는 생물학적 샘플과의 반응에서 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 "키트"는 방법 실시양태를 수행하기 위한 목적의, 보다 특히 생물학적 샘플에서 127 이벤트를 확인하고/거나 검출하기 위한 목적의 한 세트의 시약을 지칭한다. 키트는 사용될 수 있으며, 그의 성분은 품질 제어 (예를 들어 종자 소집단의 순도), 식물 물질, 또는 이들로 한정되는 것은 아니지만 식품 또는 사료와 같은 식물 물질을 포함하거나 그로부터 유래된 물질에서 이벤트 127 핵산 분자의 검출의 목적으로 특이적으로 조정될 수 있다.
구체적 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자를 확인하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 제1 및 제2 프라이머를 포함하며, 제1 및 제2 프라이머는 이벤트 127 핵산 분자를 증폭시킬 수 있다. 추가 실시양태에서, 키트는 또한 이벤트 127 핵산 분자를 검출하기 위한 핵산 분자를 포함한다. 키트는 예를 들어, 서열 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 및 44의 서열을 갖는 핵산 분자를 포함하는 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함할 수 있으며, 제1 또는 제2 프라이머는 이벤트 127 핵산 분자를 증폭시키기 위해 핵산 분자에 대해 충분한 서열 상동성 또는 상보성을 공유한다. 예를 들어, 구체적 실시양태에서, 제1 프라이머 또는 제2 프라이머는 서열 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 67, 68, 69 및 70의 서열을 갖는 핵산 분자의 단편을 포함하며, 제1 또는 제2 프라이머는 이벤트 127 분자를 증폭시키기 위해 핵산 분자에 대해 충분한 서열 상동성 또는 상보성을 공유한다. 프라이머 쌍은 서열 5의 서열을 갖는 핵산 분자의 단편 및 서열 6의 서열을 갖는 핵산 분자의 단편을 포함할 수 있거나, 또는 별법적으로, 프라이머 쌍은 i) 서열 35 및 서열 36, ii) 서열 37 및 서열 38, iii) 서열 39 및 서열 40, iv) 서열 41 및 서열 42, v) 서열 43 및 서열 44, vi) 서열 67 및 서열 68, 및 vii) 서열 69 및 서열 70의 서열로부터 선택될 수 있다. 추가 실시양태에서, 제1 및 제2 프라이머는 서열 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 67, 68, 69, 및 70으로 언급되는 서열 중 어느 하나 또는 그러한 서열의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 프라이머는 이벤트 127 분자를 증폭시키는데 충분한 임의의 길이일 수 있고, 예를 들어 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 15, 또는 30개 또는 약 7-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45개 뉴클레오티드 이상일 수 있다.
추가로, 이벤트 127 영역을 특이적으로 검출할 수 있는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 DNA 검출 키트를 제공하며, 이때 핵산 분자는 서열 5 및/또는 6에 대해 인접 뉴클레오티드 상동성 또는 상보성을 갖는 충분한 길이의 적어도 하나의 DNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 검출 키트는 서열 5 및/또는 6을 갖는 핵산 분자를 포함하거나, 또는 서열 5 및/또는 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 것과 같은, 이벤트 127 영역을 특이적으로 검출하는 서열과 혼성화되는 서열을 포함한다.
VIII. 잡초의 방제 방법
또한 본 발명은 잡초 또는 원치않는 식물을 방제하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 방법은 일반적으로 하나 이상의 비선택적인 제초제의 유효량을 하나 이상의 이벤트 127 대두 식물을 함유하는 경작 구역 또는 농경지에 적용하는 것을 수반한다. 임의의 잡초가 개시된 방법에 의해 방제될 수 있지만, 일부 실시양태에서, 방법은 먼저 구역 또는 밭의 잡초 또는 원치않는 식물이 AHAS-억제성 제초제에 영향을 받기 쉬운 것으로서 확인하는 것을 수반할 수 있다.
경작 구역에서 잡초를 방제하고, 경작 구역에서 잡초 또는 원치않는 식물의 발생 또는 출현을 방지하고, 작물을 생산하고, 작물 안전성을 높이는 방법을 제공한다. 용어 "방제" 및, 예를 들어 "잡초를 방제하는"에서와 같은 그의 파생어는 잡초 및/또는 원치않는 식물의 성장, 발아, 재생, 및/또는 증식을 억제하고/거나; 잡초 및/또는 원치않는 식물의 출현 또는 활성을 사멸, 제거, 파괴, 또는 달리 감소시키는 것 중 하나 이상을 지칭한다.
본 발명의 방법은 구역에서 잡초 또는 원치않는 식물을 임의의 측정가능한 양만큼 방제할 수 있으며, 예컨대 동일한 양 및 유형의 제초제로 처리하지 않은 구역과 비교하여 구역에서 잡초 또는 원치않는 식물의 양을 적어도 약 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 만큼 감소시킬 수 있다. 잡초 또는 원치않는 식물의 방제는 임의의 재현가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 한 실시양태에서, 잡초 또는 원치않는 식물의 방제는 제초제로 처리한 구역에서 자라는 잡초 또는 원치않는 식물의 수를 계수하고, 유사한 크기의 비처리 구역에서 자라는 잡초 또는 원치않는 식물의 수와 비교하여 측정한다.
또한 본 발명은 이벤트 127 대두 식물의 종자를 파종 전 및/또는 예비발아 이후에 AHAS-억제성 제초제와 접촉시켜 잡초 또는 원치않는 식물을 방제하는 방법을 제공한다. 방법은 추가로, 예를 들어 적합한 성장 배지, 예컨대 밭 토양 또는 온실 내의 화분 배지에 종자를 파종하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 특히 종자의 인접한 부근에서 잡초 및/또는 원치않는 식물을 방제하는데 용도가 발견된다.
잡초는, 가장 넓은 의미에서, 원치않는 위치에서 자라는 모든 식물을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 방법에 의해 방제될 수 있는 잡초에는, 예를 들어 쌍자엽 및 단자엽 잡초가 포함된다. 개시된 방법을 이용하여 방제할 수 있는 쌍자엽 잡초로는: 시나피스(Sinapis), 레피디움(Lepidium), 갈리움(Galium), 스텔라리아(Stellaria), 마트리카리아(Matricaria), 안테미스(Anthemis), 갈린소가(Galinsoga), 케노포디움(Chenopodium), 우르티카(Urtica), 세네시오(Senecio), 아마란투스(Amaranthus), 포르툴라카(Portulaca), 크산티움(Xanthium), 콘볼불루스(Convolvulus), 이포모에아(Ipomoea), 폴리고눔(Polygonum), 세스바니아(Sesbania), 암브로시아(Ambrosia), 시르시움(Cirsium), 카르두스(Carduus), 손쿠스(Sonchus), 솔라눔(Solanum), 로리파(Rorippa), 로탈라(Rotala), 린데르니아(Lindernia), 라미움(Lamium), 베로니카(Veronica), 아부틸론(Abutilon), 에멕스(Emex), 다투라(Datura), 비올라(Viola), 갈레옵시스(Galeopsis), 파파베르(Papaver), 센타우레아(Centaurea), 트리폴리움(Trifolium), 라눈쿨루스(Ranunculus), 및 타락사쿰(Taraxacum) 속의 잡초가 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 개시된 방법을 이용하여 방제할 수 있는 단자엽 잡초로는: 에키노클로아(Echinochloa), 세타리아(Setaria), 파니쿰(Panicum), 디기타리아(Digitaria), 플레움(Phleum), 포아(Poa), 페스투카(Festuca), 엘레우시네(Eleusine), 브라키아리아(Brachiaria), 롤리움(Lolium), 브로무스(Bromus), 아베나(Avena), 시페루스(Cyperus), 소르굼(Sorghum), 아그로피론(Agropyron), 시노돈(Cynodon), 모노코리아(Monochoria), 핌브리스틸리스(Fimbristyslis), 사기타리아(Sagittaria), 엘레오카리스(Eleocharis), 시르푸스(Scirpus), 파스팔룸(Paspalum), 이스카에뭄(Ischaemum), 스페노클레아(Sphenoclea), 닥틸로크테니움(Dactyloctenium), 아그로스티스(Agrostis), 알로페쿠루스(Alopecurus), 및 아페라(Apera) 속의 잡초가 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 의해 방제될 수 있는 특정 잡초로는 농업상 중요한 잡초, 예컨대 이포모에아 spp., 콤멜리나(Commelina) spp., 트리닥스 프로쿰벤스(Tridax procumbens), 에우포르비아(Euphorbia) spp., 시다(Sida) spp., 비덴스(Bidens) spp., 갈린소가(Galinsoga) spp., 솔라눔(Solanum) spp., 크산티움(Xanthium) spp., 케노포디움(Chenopodium) spp., 스페르마코세 라티폴리아(Spermacoce latifoelia), 리카르디아 브라실리엔시스(Richardia brasiliensis), 손쿠스 올레라세오우스(Sonchus oleraceous), 코니자(Conyza) spp., 아마란투스(Amaranthus) spp., 아칸토스페르뭄(Acanthospermum) spp., 힙티스(Hyptis) spp.가 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 포르툴라카 올레라세아(Portulaca oleracea), 카시아 오브투시폴리아(Casia obtusifolia) 및 또한 시페루스(Cyperus) spp.의 시페라세아스 종, 뿐만 아니라 브라키아리아(Brachiaria) spp., 디기타리아(Digitaria) spp., 파니쿰(Panicum) spp., 세타리아(Setaria) spp., 소르굼 할레펜세(Sorghum halepense), 에크노클로아(Echnochloa) spp., 엘레우시네 인디카(Eleusine indica), 및 펜니세툼(Pennisetum) spp.를 비롯한 잔디 종의 방제도 포함한다. 비선택적인 이미다졸리논 제초제의 사용에 의해, 개시된 방법은 콤멜리나 spp., 코니자 spp., 카마에시세 히르타(Chamaesise hirta), 스페르마코세 라티폴리아(Spermacoce latifolia), 리카르디아 브라실리엔시스, 이포모에아 spp., 에우포르비아 헤테로필라(Euphorbia heterophylla), 에크노클로아 spp. 및 카시아 오브투시폴리아와 같은 방제하기 어려운 잡초를 방제하는데 유익하다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 방제될 수 있는 잡초에는, 예를 들어 확인된 위치에서 자라고 있는 원치않는 작물 식물이 포함된다. 예를 들어, 메이즈 식물이 대두 식물의 밭에서 원치않는 것이면, 이벤트 127 대두 식물을 대부분 포함하는 밭에 존재하는 자생 메이즈 식물을 잡초로 간주할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 방제될 수 있는 원치않는 식물에는 이전 계절에 특정 밭에 미리 식재한 식물, 또는 인접한 구역에 식재한 식물이 포함되며, 대두, 옥수수, 카놀라, 목화, 해바라기 등을 비롯한 작물 식물이 포함된다. 일부 측면에서, 작물 식물은 제초제, 예컨대 글리포세이트 또는 글루포시네이트 제초제에 대해 내성이 있을 수 있거나, 또는 AHAS-억제성 제초제에 대해 내성이 있을 수 있다.
본원에서 사용되는 "경작 구역" 또는 "경작된 구역"은 하나 이상의 식물, 예컨대 이벤트 127 대두 식물을 성장시키고자 하는 임의의 영역을 포함한다. 그러한 경작 구역으로는 이벤트 127 대두 식물이 경작되는 밭 (예컨대 농경지, 야외 실지 등), 온실, 성장 챔버 등이 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
방법은 경작 구역에 이벤트 127 대두 종자 또는 대두 식물을 식재하는 것을 포함하고, 일부 실시양태에서는 작물, 종자, 잡초, 원치않는 식물, 토양, 또는 그의 경작 구역에 유효량의 관심 제초제를 적용하는 것을 포함한다. 제초제는 이벤트 127 대두 식물을 경작하는 동안 언제든 적용할 수 있다. 제초제는 작물을 경작 구역에 식재하기 이전 또는 이후에 적용될 수 있다. 이같은 제초제 적용은 AHAS-억제성 제초제, 또는 그의 조합물을 적용하는 것을 포함할 수 있다.
용어 "유효량"은 경작 구역에서 잡초 또는 원치않는 식물 방제의 임의의 관측가능한 측정을 가능하게 하는데 충분한 제초제의 양을 의미한다. AHAS-억제성 제초제의 유효량은 약 50 g ai/ha 내지 약 500 g ai/ha, 약 50 g ai/ha 내지 약 400 g ai/ha, 또는 약 50 g ai/ha 내지 약 300 g ai/ha의 범위일 수 있다. AHAS-억제성 제초제의 유효량은 또한, 약 70 g ai/ha, 140 g ai/ha, 또는 280 g ai/ha일 수 있다. 본 발명의 방법에서 AHAS-억제성 제초제의 효과적인 적용률은 환경을 비롯한 많은 인자에 의해 영향을 받을 수 있고, 실제 사용 조건하에서 결정되어야 한다. 잡초 또는 원치않는 식물 방제는 이벤트 127 대두가 존재하지 않는 구역에서 그러한 방제에 사용되는 양과 유사하거나 또는 그 보다 많은 비율로 AHAS-억제성 제초제를 하나 이상 적용하는 것에 의해 수득될 수 있다. 그러한 적용률로는 70 g ai/ha, 140, 또는 280 g ai/ha의 적용률, 또는 이와 동등한 적용률이 포함된다. 전형적인 상업적 적용률은 AHAS-억제성 제초제 약 70 g ai/ha이다 (또한 1X 적용률이라고도 함).
일부 실시양태에서, 유효량은 방제하고자 하는 잡초 또는 원치않는 식물이 내성을 가지는 양보다 더 큰 AHAS-억제성 제초제의 양일 수 있다. 예를 들어, 잡초 또는 원치않는 식물이 70 g ai/ha의 적용에 대해서는 내성을 갖지만 140 g ai/ha의 적용에 대해서는 영향을 받기 쉬운 실시양태에서, 유효량은 140 g ai/ha이다.
따라서, 본 발명은 유효량의 비선택적인 제초제를 하나 이상의 이벤트 127 대두 식물이 존재하는 경작 구역에 적용하는 것을 포함하는, 경작 구역에서 잡초 또는 원치않는 식물 성장을 방제하는 방법을 제공한다.
또한, 유효량의 AHAS-억제성 제초제를 하나 이상의 이벤트 127 대두 식물이 존재하는 경작 구역에 적용하는 것을 포함하는, 경작 구역에서 글리포세이트 내성 잡초 또는 식물을 방제하는 방법을 제공한다.
또한, 유효량의 AHAS-억제성 제초제를 하나 이상의 이벤트 127 대두 식물이 존재하는 경작 구역에 적용하는 것을 포함하는, 경작 구역에서 AHAS-억제성 제초제 내성 잡초 또는 식물을 방제하는 방법을 제공한다. 그러한 실시양태에서, 유효량의 AHAS-억제성 제초제는 잡초를 방제하기에 충분하지만, 이벤트 127 대두 식물에는 실질적으로 어떤 영향도 갖지 않는 양으로 적용된다.
일부 실시양태에서, 잡초는 구역에 이벤트 127 대두의 종자를 식재하기 전에 방제될 수 있다. 예를 들어, 비선택적인 제초제, 예컨대 AHAS-억제성 제초제를 종자를 식재하기 전에 구역에서 잡초를 감소시키거나 제거하기 위한 유효량으로 종자 식재 전에 구역에 적용할 수 있다. 그러한 적용은 잡초를 방제하는데 효과적인 식재 전 임의의 시간량으로, 예를 들어 식재 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상 이루어질 수 있다. 또한, 농업용 조성물의 임의의 조합을 이같은 방법에 적용할 수 있다.
다른 실시양태에서, 잡초는 이벤트 127 대두 종자를 식재한 후에 방제할 수 있다. 예를 들어, AHAS-억제성 제초제를 자라는 대두 식물, 식물 부분, 자라는 식물 주변 및 그에 인접한 성장 배지 (예컨대 토양), 또는 대두 이벤트 127 식물 또는 식물들이 자라는 구역, 즉 국지 환경에, 구역에서 잡초를 방제하는데 효과적인 양으로 적용할 수 있다. 자라는 대두 이벤트 127 식물은 임의의 발달 단계에 있을 수 있다. 몇몇 그러한 실시양태에서, 자라는 대두는 제초제 적용 시에 적어도 제1 본엽 단계에 있다. 또한, 임의의 농업용 조성물 조합을 이러한 방법에 적용할 수 있다.
농업용 조성물의 조합을 방법에서 사용하는 경우, 그러한 조합은 제초제, 살진균제, 살세균제, 살곤충제 등의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, AHAS-억제성 제초제는 5-에놀피루빌쉬키메이트 3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 억제성 제초제, 글루타민 신타제 (GS) 억제성 제초제, 프로토포르피리노겐 [IX] 옥시다제 (PPO) 억제성 제초제, 옥신 제초제, 또는 이들의 조합과 같은 다른 제초제와 조합될 수 있다.
IX. 수확량을 증가시키는 방법
또한, 유효량의 AHAS-억제성 제초제를 하나 이상의 이벤트 127 대두 식물이 존재하는 경작 구역에 적용하는 단계 및 대두 식물로부터 종자를 수확하는 단계를 포함하는, 대두 식물 또는 식물들의 수확량을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대두 식물 또는 식물들의 수확량의 증가는 대두 식물 또는 식물들의 국지 구역에서 자라는 잡초를 감소시킨 결과이다 (이는 정상적으로는 대두 식물 또는 식물들과 경쟁할 것임).
이같은 방법을 이용하는 것에 의해, 구역 내 대두 수확량은 대두 이벤트 127 식물이 존재하지 않는 비슷한 구역에 비해 증가될 수 있다. 대두의 수확량은 유효량의 AHAS-억제성 제초제를 적용한 이벤트 127 대두 식물이 존재하지 않는 구역인 비슷한 구역으로부터 수득한 것에 비해 5％, 6％, 7％, 8％, 9％, 10％, 11％, 12％, 13％, 14％, 15％, 20％, 25％ 이상을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 임의의 양만큼 증가될 수 있다.
X. 농업용 화학 조성물
또한 본 발명은 개시된 대두 127 식물에 적용하기 위한 농업용 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 제초제, 살진균제, 살세균제, 비료 등을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 농업용 조성물은 하나 이상의 제초제 또는 하나 이상의 제초제와 또 다른 농업용 조성물, 예컨대 살진균제, 살세균제, 비료 등의 조합물을 포함하는 제초용 조성물이다.
임의의 제초제를 대두 이벤트 127 작물, 작물 부분, 또는 이벤트 127 대두 식물을 함유하는 경작 구역에 적용할 수 있다. 제초제의 분류 (즉, 클래스 및 서브클래스로의 제초제의 그룹화)는 당업계에 익히 공지되어 있고, HRAC (제초제 저항성 작용 위원회) 및 WSSA (미국 잡초 학회)에 의한 분류를 포함한다. HRAC 분류는 예를 들어, 전세계 웹사이트 hracglobal.com/Publications/ClassificationofHerbicideModeofAction/tabid/222/Default.aspx에서 이용가능하다. HRAC 분류의 축약 버전 (상응하는 WSSA 그룹과 관련된 주석 포함).
일부 실시양태에서, 본 발명은 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 트리아졸로피리미딘 제초제, 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제, 술포닐아미노카르보닐트리아졸리논 제초제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 AHAS-억제성 제초제의 사용을 수반하는 방법을 제공한다. 이들 방법에서, AHAS-억제성 제초제는 종자 처리, 토양 처리 및 잎 처리를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, AHAS-억제성 제초제는 하나 이상의 추가의 농업용 조성물, 예컨대 추가의 제초제, 살진균제, 살세균제, 항바이러스성 조성물 또는 이들의 조합물과 조합될 수 있다. 조합물로 사용하기 위한 추가의 제초제에는 술파미드 제초제, 유기포스페이트 제초제 및 벤조티아디아지논 제초제를 비롯한 임의의 제초제가 포함된다. 술파미드 제초제에는 사플루페나실이 포함되지만 이로 한정되는 것은 아니다. 유기포스페이트 제초제에는 글리포세이트 및 글루포시네이트가 포함되지만 이로 한정되는 것은 아니다. 벤조티아디아지논 제초제에는 벤타존이 포함되지만 이로 한정되는 것은 아니다. 이같은 조합물로 사용하기 위한 살진균제에는 피라클로스트로빈이 포함되지만 이로 한정되는 것은 아니다.
AHAS-억제성 제초제 조성물의 조합물에 의한 처리 및/또는 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제 조성물 및 하나 이상의 추가의 농업용 조성물에 의한 처리는 그러한 조성물의 혼합물을 적용하는 것에 의해, 그러한 조성물을 동시적용하는 것에 의해, 그러한 조성물을 순차적으로 적용하는 것에 의해, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, AHAS-억제성 제초제 조성물은 적어도 하나의 A) AHAS-억제성 제초제 및 클래스 b1) 내지 b15)의 제초제 B)로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 활성 화합물을 포함한다:
b1) 지질 생합성 억제제;
b2) 아세토락테이트 신타제 억제제 (AHAS 억제제);
b3) 광합성 억제제;
b4) 프로토포르피리노겐-IX 옥시다제 억제제;
b5) 표백 제초제;
b6) 에놀피루빌 쉬키메이트 3-포스페이트 신타제 억제제 (EPSP 억제제);
b7) 글루타민 신테타제 억제제;
b8) 7,8-디히드로프테로에이트 신타제 억제제 (DHP 억제제);
b9) 유사분열 억제제;
b10) 장쇄 지방산 합성 억제제 (VLCFA 억제제);
b11) 셀룰로스 생합성 억제제;
b12) 탈커플링 제초제;
b13) 옥신 제초제;
b14) 옥신 수송 억제제;
b15) 그 밖의 벤조일프로프, 플람프로프, 플람프로프-M, 브로모부티드, 클로르플루레놀, 신메틸린, 메틸디무론, 에토벤자니드, 포사민, 메탐, 피리부티카르브, 옥사지클로메폰, 다조메트, 트리아지플람 및 메틸 브로마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 제초제, 및
활성 화합물 B의 농업상 허용되는 염 및 활성 화합물 B의 농업상 허용되는 유도체 (이들이 카르복실기를 갖는 것을 단서로 함).
다른 경우에서, 적어도 하나의 A) AHAS-억제성 제초제 및 적어도 하나의 제초제 B의 이같은 조합물은 독성완화제 C와 함께 사용될 수 있다 (이같은 독성완화제는 또한 적어도 하나의 AHAS-억제성 제초제와 함께 사용될 수 있음). 독성완화제 C는: 베녹사코르, 클로퀸토세트, 시오메트리닐, 디클로르미드, 디시클로논, 디에톨레이트, 펜클로라졸, 펜클로림, 플루라졸, 플룩소페님, 푸릴아졸, 이속사디펜, 메펜피르, 메페네이트, 나프탈산 무수물, 2,2,5-트리메틸-3-(디클로로아세틸)-1,3-옥사졸리딘 (R-29148), 4-(디클로로아세틸)-1-옥사-4-아자스피로[4.5]데칸 (AD-67; MON 4660) 및 옥사베트리닐, 활성 화합물 C의 농업상 허용되는 염 및 활성 화합물 C의 농업상 허용되는 유도체 (이들이 카르복실기를 갖는 것을 단서로 함)로부터 선택될 수 있다.
AHAS-억제성 화합물과 함께 사용될 수 있는 제초제 B의 예는 다음과 같다:
b1) 지질 생합성 억제제: 클로라지포프, 클로디나포프, 클로포프, 시할로포프, 디클로포프, 페녹사프로프, 페녹사프로프-p, 펜티아프로프, 플루아지포프, 플루아지포프-P, 할록시포프, 할록시포프-P, 이속사피리포프, 메타미포프, 프로파퀴자포프, 퀴잘로포프, 퀴잘로포프-P, 트리포프, 알록시딤, 부트록시딤, 클레토딤, 클로프록시딤, 시클록시딤, 프로폭시딤, 세톡시딤, 테프랄록시딤, 트랄콕시딤, 부틸레이트, 시클로에이트, 디알레이트, 디메피페레이트, EPTC, 에스프로카르브, 에티올레이트, 이소폴리네이트, 메티오벤카르브, 몰리네이트, 오르벤카르브, 페불레이트, 프로술포카르브, 술팔레이트, 티오벤카르브, 티오카르바질, 트리알레이트, 베르놀레이트, 벤푸레세이트, 에토푸메세이트 및 벤술리드의 군으로부터의 것;
b2) AHAS-억제제: 아미도술푸론, 아짐술푸론, 벤술푸론, 클로리무론, 클로르술푸론, 시노술푸론, 시클로술파무론, 에타메트술푸론, 에톡시술푸론, 플라자술푸론, 플루피르술푸론, 포람술푸론, 할로술푸론, 이마조술푸론, 요오도술푸론, 메소술푸론, 메트술푸론, 니코술푸론, 옥사술푸론, 프리미술푸론, 프로술푸론, 피라조술푸론, 림술푸론, 술포메투론, 술포술푸론, 티펜술푸론, 트리아술푸론, 트리베누론, 트리플록시술푸론, 트리플루술푸론, 트리토술푸론, 이마자메타벤즈, 이마자목스, 이마자픽, 이마자피르, 이마자퀸, 이마제타피르, 클로란술람, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람, 페녹스술람, 비스피리박, 피리미노박, 프로폭시카르바존, 플루카르바존, 피리벤족심, 피리프탈리드 및 피리티오박의 군으로부터의 것;
b3) 광합성 억제제: 아트라톤, 아트라진, 아메트린, 아지프로트린, 시아나진, 시아나트린, 클로라진, 시프라진, 데스메트린, 디메타메트린, 디프로페트린, 에글리나진, 이파진, 메소프라진, 메토메톤, 메토프로트린, 프로시아진, 프로글리나진, 프로메톤, 프로메트린, 프로파진, 세부틸라진, 세크부메톤, 시마진, 시메톤, 시메트린, 테르부메톤, 테르부틸라진, 터부트린, 트리에타진, 아메트리디온, 아미부진, 헥사지논, 이소메티오진, 메타미트론, 메트리부진, 브로마실, 이소실, 레나실, 테르바실, 브롬피라존, 클로리다존, 디미다존, 데스메디팜, 펜이소팜, 펜메디팜, 펜메디팜-에틸, 벤즈티아주론, 부티우론, 에티디무론, 이소우론, 메타벤즈티아주론, 모노이소우론, 테부티우론, 티아자플루론, 아니수론, 부투론, 클로르브로무론, 클로레투론, 클로로톨루론, 클로록수론, 디페녹수론, 디메푸론, 디우론, 페누론, 플루오메투론, 플루오티우론, 이소프로투론, 리누론, 메티우론, 메토벤주론, 메토브로무론, 메톡수론, 모노리누론, 모누론, 네부론, 파라플루론, 페노벤주론, 시두론, 테트라플루론, 티디아주론, 시페르쿼트, 디에탐쿼트, 디펜조쿼트, 디쿼트, 모르팜쿼트, 파라쿼트, 브로모보닐, 브로목시닐, 클로록시닐, 요오도보닐, 이옥시닐, 아미카르바존, 브로모페녹심, 플루메진, 메타졸, 벤타존, 프로파닐, 펜타노클로르, 피리데이트, 및 피리다폴의 군으로부터의 것;
b4) 프로토포르피리노겐-IX 옥시다제 억제제: 아시플루오르펜, 비페녹스, 클로메톡시펜, 클로르니트로펜, 에톡시펜, 플루오로디펜, 플루오로글리코펜, 플루오로니트로펜, 포메사펜, 푸릴옥시펜, 할로사펜, 락토펜, 니트로펜, 니트로플루오르펜, 옥시플루오르펜, 플루아졸레이트, 피라플루펜, 시니돈-에틸, 플루미클로락, 플루미옥사진, 플루미프로핀, 플루티아세트, 티디아지민, 옥사디아존, 옥사디아르길, 아자페니딘, 카르펜트라존, 술펜트라존, 펜톡사존, 벤즈펜디존, 부타페나실, 피라클로닐, 프로플루아졸, 플루펜피르, 플루프로파실, 니피라클로펜 및 에트니프로미드의 군으로부터의 것;
b5) 표백 제초제: 메트플루라존, 노르플루라존, 플루페니칸, 디플루페니칸, 피콜리나펜, 베플루부타미드, 플루리돈, 플루오로클로리돈, 플루르타몬, 메소트리온, 술코트리온, 이속사클로르톨, 이속사플루톨, 벤조페납, 피라졸리네이트, 피라족시펜, 벤조비시클론, 아미트롤, 클로마존, 아클로니펜, 4-(3-트리플루오로메틸페녹시)-2-(4-트리플루오로메틸페닐)피리미딘, 및 또한 하기 화학식 I의 3-헤테로시클릴-치환된 벤조일 유도체의 군으로부터의 것:
[화학식 I]
Figure pct00002
(상기 식에서, 가변기 R8 내지 R13은 이하에서 정의하는 바와 같음: R8, R10 은 수소, 할로겐, C1-C6-알킬, C1-C6-할로알킬, C1-C6-알콕시, C1-C6-할로알콕시, C1-C6-알킬티오, C1-C6-알킬술피닐 또는 C1-C6-알킬술포닐이고; R9는 티아졸-2-일, 티아졸-4-일, 티아졸-5-일, 이속사졸-3-일, 이속사졸-4-일, 이속사졸-5-일, 4,5-디히드로이속사졸-3-일, 4,5-디히드로이속사졸-4-일 및 4,5-디히드로이속사졸-5-일로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로시클릭 라디칼이고, 여기서 언급된 9개의 라디칼은 비치환될 수 있거나, 또는 할로겐, C1-C4-알킬, C1-C4-알콕시, C1-C4-할로알킬, C1-C4-할로알콕시 또는 C1-C4-알킬티오에 의해 모노- 또는 폴리치환, 예를 들어 모노-, 디-, 트리- 또는 테트라치환될 수 있고; R11은 수소, 할로겐 또는 C1-C6-알킬이고; R12는 C1-C6-알킬이고; R13은 수소 또는 C1-C6-알킬임);
b6) EPSP 신타제 억제제: 글리포세이트의 군으로부터의 것;
b7) 글루타민 신타제 억제제: 글루포시네이트 및 빌라나포스의 군으로부터의 것;
b8) DHP 신타제 억제제: 아술람의 군으로부터의 것;
b9) 유사분열 억제제: 벤플루랄린, 부트랄린, 디니트라민, 에탈플루랄린, 플루클로랄린, 이소프로팔릴, 메탈프로팔린, 니트랄린, 오리잘린, 펜디메탈린, 프로디아민, 프로플루랄린, 트리플루랄린, 아미프로포스-메틸, 부타미포스, 디티오피르, 티아조피르, 프로피자미드, 테부탐, 클로르탈, 카르베타미드, 클로르부팜, 클로르프로팜 및 프로팜의 군으로부터의 것;
b10) VLCFA 억제제: 아세토클로르, 알라클로르, 부타클로르, 부테나클로르, 델라클로르, 디에타틸, 디메타클로르, 디메텐아미드, 디메텐아미드-P, 메타자클로르, 메톨라클로르, S-메톨라클로르, 프레틸라클로르, 프로파클로르, 프로피소클로르, 프리나클로르, 테르부클로르, 테닐클로르, 크실라클로르, 알리도클로르, CDEA, 에프로나즈, 디펜아미드, 나프로파미드, 나프로아닐리드, 페톡사미드, 플루페나세트, 메페나세트, 펜트라자미드, 아닐로포스, 피페로포스, 카펜스트롤, 인다노판 및 트리디판의 군으로부터의 것;
b11) 셀룰로스 생합성 억제제: 디클로베닐, 클로르티아미드, 이속사벤 및 플루폭삼의 군으로부터의 것;
b12) 탈커플링 제초제: 디노페네이트, 디노프로프, 디노삼, 디노세브, 디노테르브, DNOC, 에티노펜 및 메디노테르브의 군으로부터의 것;
b13) 옥신 제초제: 클로메프로프, 2,4-D, 2,4,5-T, MCPA, MCPA 티오에틸, 디클로르프로프, 디클로르프로프-P, 메코프로프, 메코프로프-P, 2,4-DB, MCPB, 클로람벤, 디캄바, 2,3,6-TBA, 트리캄바, 퀸클로락, 퀸메락, 클로피랄리드, 플루록시피르, 피클로람, 트리클로피르 및 베나졸린의 군으로부터의 것;
b14) 옥신 수송 억제제: 나프탈람, 디플루펜조피르의 군으로부터의 것;
b15) 벤조일프로프, 플람프로프, 플람프로프-M, 브로모부티드, 클로르플루레놀, 신메틸린, 메틸딤론, 에토벤자니드, 포사민, 메탐, 피리부티카르브, 옥사지클로메폰, 다조메트, 트리아지플람 및 메틸 브로마이드.
그룹 b1) 내지 b15)의 활성 화합물 B 및 활성 화합물 C는 제초제 및 독성완화제로 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [The Compendium of Pesticide Common Names (전세계 웹 상에서 hclrss.demon.co.uk/index.html 사이트에서 이용가능함)]; [Farm Chemicals Handbook 2000 Vol. 86, Meister Publishing Company, 2000]; [B. Hock, C. Fedtke, R. R. Schmidt, Herbizide, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1995]; [W. H. Ahrens, Herbicide Handbook, 7th Edition, Weed Science Society of America, 1994]; 및 [K. K. Hatzios, Herbicide Handbook, Supplement to 7th Edition, Weed Science Society of America, 1998]를 참조한다. 2,2,5-트리메틸-3-(디클로로아세틸)-1,3-옥사졸리딘 [CAS 번호 52836-31-4]은 또한 명칭 R-29148으로 공지된다. 4-(디클로로아세틸)-1-옥사-4-아자스피로[4.5]데칸 [CAS 번호 71526-07-03]은 또한 명칭 AD-67 및 MON 4660으로 공지된다. 화학식 II의 표백 제초제는 WO 96/26202, WO 97/41116, WO 97/41117 및 WO 97/41118에 개시되어 있다.
활성 화합물 C로서, 조성물은 이하에서 열거하는 화합물 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: 베녹사코르, 클로퀸토세트, 디클로르미드, 펜클로라졸, 펜클로림, 플룩소페님, 푸릴아졸, 이속사디펜, 메펜피르, 2,2,5-트리메틸-3-(디클로르아세틸)-1,3-옥사졸리딘, 4-(디클로로아세틸)-1-옥사-4-아자스피로[4.5]데칸 및 옥사베트리닐 및/또는 농업상 허용되는 그의 염 및/또는, COOH 기를 갖는 화합물의 경우, 농업상 허용되는 유도체.
활성 성분의 조합을 함유하는 조성물은 활성 화합물 A로서 적어도 하나의 AHAS-억제성 화합물 및 클래스 b1) 내지 b15)로부터 선택된 적어도 하나의 제초제 및, 적절한 경우 하나 이상의 독성완화제 C를 포함하는 2원 및 3원 조성물일 수 있다.
성분 A로서 적어도 하나의 AHAS-억제성 화합물 및 적어도 하나의 제초제 B를 포함하는 2원 조성물의 경우, 활성 화합물 A:B의 중량비는 1:500 내지 10:1의 범위, 1:100 내지 10:1의 범위, 1:50 내지 10:1의 범위, 또는 1:25 내지 5:1의 범위일 수 있다.
적어도 하나의 AHAS-억제성 화합물 및 적어도 하나의 독성완화제 C를 포함하는 2원 조성물의 경우, 활성 화합물 A:C의 중량비는 통상적으로 1:100 내지 10:1, 1:50 내지 10:1의 범위, 또는 1:25 내지 5:1의 범위이다.
성분 A로서 AHAS-억제성 화합물, 적어도 하나의 제초제 B 및 적어도 하나의 독성완화제 C를 모두 포함하는 3원 조성물의 경우, 성분 A:B:C의 상대적 중량비는 10:1:1 내지 1:500:10, 10:1:1 내지 1:100:10, 10:1:1 내지 1:50:1, 또는 5:1:1 내지 1:25:5의 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, 3원 조성물의 경우 제초제 B 대 독성완화제 C의 중량비는 50:1 내지 1:10의 범위이다.
미국 특허 제7,375,058호 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있는 제초용 활성 혼합물이 또한 대두 이벤트 127 식물과 관련된 처리에 사용될 수 있다.
프로토포르피리노겐 [IX] 옥시다제 (PPO) 억제성 제초제가 또한 본 발명의 조성물에서 사용된다. PPO-억제성 제초제는 당업계에 공지되어 있고, 디페닐에테르 제초제 (니트로페닐 에테르 제초제 포함), 예컨대 아시플루오르펜 (5-[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시]-2-니트로벤조산), 비페녹스 (메틸 5-(2,4-디클로로페녹시)-2-니트로벤조에이트), DPEI (5-[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시]-2-니트로아세토페논 옥심-o-(아세트산, 메틸 에스테르)), DPEII (5-[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시]-3-메톡시프탈리드), 에톡시펜 ((1S)-1-카르복시에틸 2-클로로-5-[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시]벤조에이트), 포메사펜 (5-[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시]-N-(메틸술포닐)-2-니트로벤즈아미드), 락토펜 (에틸 O-[5-(2-클로로-α,α,α-트리플루오로-p-톨릴옥시)-2-니트로벤조일]-DL-락테이트) 및 옥시플루오르펜 (2-클로로-1-(3-에톡시-4-니트로페녹시)-4-(트리플루오로메틸)벤젠)이 포함되지만 이로 한정되는 것은 아니다. PPO-억제성 제초제에는 또한 디카르복스이미드 제초제, 예컨대 N-페닐-프탈이미드 플루미클로락 ([2-클로로-5-(시클로헥스-1-엔-1,2-디카르복스이미도)-4-플루오로페녹시]아세트산), 플루미옥사진 (N-(7-플루오로-3,4-디히드로-3-옥소-4-프로프-2-이닐-2H-1,4-벤즈옥사진-6-일)시클로헥스-1-엔-1,2-디카르복스아미드)가 포함된다. PPO-억제성 제초제에는 트리아졸리논 제초제, 예컨대 카르펜트라존 (α,2-디클로로-5-[4-(디플루오로메틸)-4,5-디히드로-3-메틸-5-옥소-1H-1,2,4-트리아졸-1-일]-4-플루오로벤젠프로판산), 및 술펜트라존 (N-[2,4-디클로로-5-[4-(디플루오로메틸)-4,5-디히드로-3-메틸-5-옥소-1H-1,2,4-트리아졸-1-일]페닐]메탄술폰아미드)가 추가로 포함된다. PPO-억제성 제초제에는 또한 니피라클로펜 (1-[2,6-디클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-4-니트로-1H-피라졸-5-아민) 및 피라플루펜 (2-클로로-5-(4-클로로-5-디플루오로메톡시-1-메틸피라졸-3-일)-4-플루오로페녹시아세트산)이 포함되지만 이로 한정되는 것은 아닌 페닐피라졸 제초제가 포함된다. PPO-억제성 제초제에는 또한 옥사디아졸론 제초제, 예컨대 옥사디아존 (3-[2,4-디클로로-5-(1-메틸에톡시)페닐]-5-(1,1-디메틸에틸)-1,3,4-옥사디아졸-2(3H)-온) 및 옥사디아르길 (5-tert-부틸-3-[2,4-디클로로-5-(프로프-2-이닐옥시)페닐]-1,3,4-옥사디아졸-2(3H)-온)이 포함된다. PPO-억제성 제초제에는 티아디아졸론 제초제, 예컨대 플루티아세트 ([[2-클로로-4-플루오로-5-[(테트라히드로-3-옥소-1H,3H-[1,3,4]티아디아졸로[3,4-a]피리다진-1-일리덴)아미노]페닐]티오]아세트산); 뿐만 아니라 자갈 및 시에베르니흐 (Zagar and Sievernich)의 US2008254985의 섹션 III.4) (그 전문이 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 것이 추가로 포함된다.
옥신 제초제가 또한 본 발명의 조성물에서 사용된다. 옥신 제초제에는 작용 기전이 옥신 모방체 또는 옥신 억제제 (항옥신제)인 제초 활성 성분을 포함하는 것이 포함된다. 옥신 제초제의 예로는 피클로람 (4-아미노-3,5,6-트리클로로피콜린산); 디캄바 (3,6-디클로로-2-메톡시벤조산); 클로피브르산 ((p-클로로페녹시)이소부티르산); 2-(4-클로로페녹시)-2-메틸프로판산); 베나졸린 (4-클로로-2-옥소-3-벤조티아졸아세트산; 4-클로로-2-옥소벤조티아졸린-3-일-아세트산); TIBA (2,3,5-트리요오도벤조산); 2,3,6-TBA (2,3,6-트리클로로벤조산); 트리클로피르 (3,5,6-트리클로로-2-피리딜옥시아세트산); 퀸클로락 (3,7-디클로로퀴놀린-8-카르복실산); 및 옥신-모방성 또는 옥신-차단성 페녹시 제초제, 예를 들어 페녹시아세트산, 페녹시프로피온산 및 페녹시부티르산 제초제, 예를 들어: 2,4-D ((2,4-디클로로페녹시)아세트산), MCPA ((4-클로로-2-메틸페녹시)아세트산), 2,4-DB (4-(2,4-디클로로페녹시)부티르산), 2,4-DEP (트리스[2-(2,4-디클로로페녹시)에틸]포스페이트), 4-CPA (4-클로로페녹시아세트산), 2,4,5-T ((2,4,5-트리클로로페녹시)아세트산), 디클로르프로프 (2-(2,4-디클로로페녹시)프로판산), 페노프로프 (2-(2,4,5-트리클로로페녹시)프로판산) 및 메코프로프 (2-(2-메틸-4-클로로-페녹시)프로피온산)이 포함되지만 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 농업용 조성물의 조합물의 예로는: 이마자피르 및 이마자픽; 이마자피르 및 벤타존; 이마자피르, 이마자픽 및 벤타존; 이마자피르 및 피라클로스트로빈; 이마자피르, 이마자픽 및 피라클로스트로빈; 이마자피르 및 사플루페나실; 이마자피르, 이마자픽 및 사플루페나실; 이마자픽, 사플루페나실 및 글리포세이트; 이마자피르, 이마자픽, 사플루페나실 및 글리포세이트; 이마자픽 및 글리포세이트; 이마자피르 및 글리포세이트; 이마자피르, 사플루페나실 및 글리포세이트; 및 사플루페나실 및 글리포세이트가 포함된다.
적용 전에, 제초제, 예컨대 AHAS-억제성 제초제는 통상적인 제제, 예를 들어 용액, 에멀젼, 현탁액, 분진, 분말, 페이스트 및 과립으로 전환될 수 있다. 사용 형태는 의도되는 특정 목적에 좌우되고; 각각의 경우에, 본 발명에 따른 화합물의 미세하고 균일한 분포가 보장되어야 한다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 제제는 임의의 공지된 방식으로, 예를 들어 활성 화합물을 농약 제제에 적합한 보조제, 예컨대 용매 및/또는 담체, 원하는 경우 유화제, 계면활성제 및 분산제, 보존제, 소포제, 동결방지제로 증량시킴으로써, 종자 처리 제제의 경우에는 또한 임의로 착색제 및/또는 결합제 및/또는 겔화제로 증량시킴으로써 제조될 수 있다.
제제에서 사용하기 위한 적합한 용매의 예로는 물, 방향족 용매 (예를 들어 솔베소(Solvesso) 제품, 크실렌), 파라핀 (예를 들어, 광유 분획), 알콜 (예를 들어, 메탄올, 부탄올, 펜탄올, 벤질 알콜), 케톤 (예를 들어, 시클로헥사논, 감마-부티로락톤), 피롤리돈 (NMP, NOP), 아세테이트 (글리콜 디아세테이트), 글리콜, 지방산 디메틸아미드, 지방산 및 지방산 에스테르가 포함된다. 용매 혼합물이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 제제에서 사용하기 위한 적합한 담체의 예로는 분쇄된 천연 광물 (예를 들어 카올린, 점토, 활석, 백악) 및 분쇄된 합성 광물 (예를 들어, 고도로 분산성인 실리카, 실리케이트)이 포함된다.
본 발명의 제제에서 사용하기 위한 적합한 유화제에는 비이온성 및 음이온성 유화제 (예를 들어 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르, 알킬술포네이트 및 아릴술포네이트)가 포함된다.
본 발명의 제제에서 사용하기 위한 분산제의 예로는 리그닌-술파이트 폐액 및 메틸셀룰로스가 포함된다.
본 발명의 제제에서 사용하기 위한 적합한 계면활성제에는 리그노술폰산, 나프탈렌술폰산, 페놀술폰산, 디부틸나프탈렌술폰산, 알킬아릴술포네이트, 알킬 술페이트, 알킬술포네이트, 지방 알콜 술페이트, 지방산 및 황산화 지방 알콜 글리콜 에테르의 알칼리 금속, 알칼리 토금속 및 암모늄 염, 또한 술폰화 나프탈렌 및 나프탈렌 유도체와 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산과 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌 옥틸페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸페놀, 옥틸페놀, 노닐페놀, 알킬페놀 폴리글리콜 에테르, 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 트리스테아릴페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴 폴리에테르 알콜, 알콜 및 지방 알콜 에틸렌 옥시드 축합물, 에톡실화 피마자 오일, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 에톡실화 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알콜 폴리글리콜 에테르 아세탈, 소르비톨 에스테르, 리그노술파이트 폐액 및 메틸셀룰로스가 포함된다.
직접 스프레이가능한 용액, 에멀젼, 페이스트 또는 오일 분산액의 제조에 적합한 물질은 중간 내지 높은 비점의 광유 분획, 예컨대 등유 또는 디젤유이고, 또한 콜타르유 및 식물성 또는 동물성 기원의 오일, 지방족, 시클릭 및 방향족 탄화수소, 예를 들어 톨루엔, 크실렌, 파라핀, 테트라히드로나프탈렌, 알킬화 나프탈렌 또는 이들의 유도체, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 시클로헥산올, 시클로헥사논, 이소포론, 고도로 극성인 용매, 예를 들어 디메틸 술폭시드, N-메틸피롤리돈 또는 물이다.
또한, 동결방지제 예컨대 글리세린, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 살세균제가 제제에 첨가될 수 있다.
본 발명의 제제에서 사용하기 위한 적합한 소포제에는 예를 들어 스테아르산규소 또는 스테아르산마그네슘을 기재로 하는 소포제가 포함된다.
본 발명의 제제에서 사용하기 위한 적합한 보존제에는 예를 들어, 디클로로페놀 및 벤질알콜헤미포름알데히드가 포함된다.
본 발명의 종자 처리 제제는 결합제 및 임의로 착색제를 또한 포함할 수 있다.
결합제를 개시된 종자 제제에 첨가하여, 처리 후 종자 상의 활성 물질의 접착을 개선시킬 수 있다. 적합한 결합제는 블록 공중합체 EO/PO 계면활성제, 뿐만 아니라 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리부텐, 폴리이소부틸렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌아민, 폴리에틸렌아미드, 폴리에틸렌이민 (루파솔(Lupasol)®, 폴리민(Polymin)®), 폴리에테르, 폴리우레탄, 폴리비닐아세테이트, 틸로스 및 이러한 중합체들로부터 유도된 공중합체이다.
임의로, 또한 착색제가 제제에 포함될 수 있다. 종자 처리 제제를 위한 적합한 착색제 또는 염료는 로다민(Rhodamin) B, 씨.아이.(C.I.) 피그먼트 레드 112, 씨.아이. 솔벤트 레드 1, 피그먼트 블루 15:4, 피그먼트 블루 15:3, 피그먼트 블루 15:2, 피그먼트 블루 15:1, 피그먼트 블루 80, 피그먼트 옐로우 1, 피그먼트 옐로우 13, 피그먼트 레드 112, 피그먼트 레드 48:2, 피그먼트 레드 48:1, 피그먼트 레드 57:1, 피그먼트 레드 53:1, 피그먼트 오렌지 43, 피그먼트 오렌지 34, 피그먼트 오렌지 5, 피그먼트 그린 36, 피그먼트 그린 7, 피그먼트 화이트 6, 피그먼트 브라운 25, 베이직 바이올렛 10, 베이직 바이올렛 49, 애시드 레드 51, 애시드 레드 52, 애시드 레드 14, 애시드 블루 9, 애시드 옐로우 23, 베이직 레드 10, 베이직 레드 108이다.
적합한 겔화제의 예는 카라긴 (사티아겔(Satiagel)®)이다.
분말, 살포용 물질 및 살분성 제품은 활성 물질을 고체 담체와 혼합함으로써 또는 동시에 분쇄함으로써 제조될 수 있다.
과립, 예를 들어 코팅된 과립, 함침된 과립 및 균질 과립은 활성 화합물을 고체 담체에 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 고체 담체의 예는 무기 토류, 예컨대 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 카올린, 아타클레이, 석회석, 석회, 백악, 교회 점토, 황토, 점토, 돌로마이트, 규조토, 황산칼슘, 황산마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄된 합성 물질, 비료, 예를 들어 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아, 및 채소 기원의 제품, 예컨대 곡분, 목피분, 목분 및 견과피분, 셀룰로스 분말 및 기타 고체 담체이다.
일반적으로, 제제는 0.01 내지 95 중량％, 바람직하게는 0.1 내지 90 중량％의 제초제, 예를 들어 AHAS-억제성 제초제를 포함한다. 제초제는 90 중량％ 내지 100 중량％, 바람직하게는 95 중량％ 내지 100 중량％의 순도 (NMR 스펙트럼에 따름)로 사용될 수 있다. 종자 처리 목적으로, 각각의 제제가 2-10배 희석되어, 즉시 사용가능한 제제 내의 활성 화합물의 농도가 중량 기준으로 0.01 내지 60 중량％, 바람직하게는 0.1 내지 40 중량％에 이를 수 있다.
본 발명의 AHAS-억제성 제초제는 스프레이, 분무, 살분, 살포 또는 살수에 의해 그 자체로, 제제 형태로 또는 이로부터 제조된 사용 형태로, 예를 들어 직접 스프레이가능한 용액, 분말, 현탁액 또는 분산액, 에멀젼, 오일 분산액, 페이스트, 살분성 제품, 살포용 물질 또는 과립의 형태로 사용될 수 있다. 사용 형태는 의도된 목적에 전적으로 좌우되며; 이는 각각의 경우에 본 발명에 따른 AHAS-억제성 제초제의 가장 미세한 가능한 분포를 확실히 하도록 의도된다.
수성 사용 형태는 물을 첨가함으로써 에멀젼 농축물, 페이스트 또는 습윤성 분말 (스프레이가능한 분말, 오일 분산액)로부터 제조될 수 있다. 에멀젼, 페이스트 또는 오일 분산액을 제조하기 위해, 그 자체로의 물질 또는 오일 또는 용매에 용해된 물질이 습윤제, 점착제, 분산제 또는 유화제에 의해 물에서 균질화될 수 있다. 그러나, 활성 물질, 습윤제, 점착제, 분산제 또는 유화제, 및 적절한 경우 용매 또는 오일로 구성된 농축물을 제조하는 것이 또한 가능하고, 이러한 농축물은 물로 희석하기에 적합하다.
즉시 사용가능한 제제 내의 활성 화합물 농도는 상대적으로 광범위한 범위 내에서 다양할 수 있다. 일반적으로, 이는 0.0001 내지 10 중량％, 바람직하게는 0.01 내지 1 중량％이다.
또한, 본 발명의 AHAS-억제성 제초제는 95 중량％ 초과의 활성 화합물을 포함하는 제제를 적용하거나, 또는 심지어 첨가제 없이 활성 화합물을 적용하는 것이 가능한, 초미량(ultra-low-volume) 방법 (ULV)에서 성공적으로 사용될 수 있다.
하기는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 AHAS-억제성 제초제 제제의 예이다:
1. 잎 적용을 위한 물로 희석되는 제품. 종자 처리 목적으로, 이러한 제품은 희석된 상태로 또는 희석되지 않은 상태로 종자에 적용될 수 있다.
A) 수용성 농축물 (SL, LS)
10 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 90 중량부의 물 또는 수용성 용매에 용해시킨다. 별법적으로, 습윤제 또는 다른 보조제를 첨가한다. 물로 희석하여 AHAS-억제성 제초제를 용해시키고, 이에 의해 10％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 함유하는 제제가 수득된다.
B) 분산성 농축물 (DC)
10 중량부의 분산제, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈을 첨가하면서 20 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 70 중량부의 시클로헥사논에 용해시킨다. 물로 희석하여 분산액을 수득하고, 이에 의해 20％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 함유하는 제제가 수득된다.
C) 유화성 농축물 (EC)
칼슘 도데실벤젠술포네이트 및 피마자 오일 에톡실레이트 (각각의 경우 5 중량부)를 첨가하면서 15 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 7 중량부의 크실렌에 용해시킨다. 물로 희석하여 에멀젼을 수득하고, 이에 의해 15％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 함유하는 제제가 수득된다.
D) 에멀젼 (EW, EO, ES)
칼슘 도데실벤젠술포네이트 및 피마자 오일 에톡실레이트 (각각의 경우 5 중량부)를 첨가하면서 25 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 35 중량부의 크실렌에 용해시킨다. 이 혼합물을 유화기 (예를 들어 울트라투락스(Ultraturrax))에 의해 30 중량부의 물에 도입하고, 균일한 에멀젼으로 만든다. 물로 희석하여 에멀젼을 수득하고, 이에 의해 25％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 함유하는 제제가 수득된다.
E) 현탁액 (SC, OD, FS)
교반 볼 밀에서, 10 중량부의 분산제, 습윤제 및 70 중량부의 물 또는 유기 용매를 첨가하면서 20 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 세분하여, 미세 AHAS-억제성 제초제 현탁액을 수득한다. 물로 희석하여 AHAS-억제성 제초제의 안정한 현탁액을 수득하고, 이에 의해 20％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 함유하는 제제가 수득된다.
F) 수분산성 과립 및 수용성 과립 (WG, SG)
50 중량부의 분산제 및 습윤제를 첨가하면서 50 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 미세하게 분쇄하고, 기술적 기기 (예를 들어, 압출, 스프레이 타워, 유동층)에 의해 수분산성 또는 수용성 과립으로서 제조한다. 물로 희석하여 AHAS-억제성 제초제의 안정한 분산액 또는 용액을 수득하고, 이에 의해 50％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 함유하는 제제가 수득된다.
G) 수분산성 분말 및 수용성 분말 (WP, SP, SS, WS)
25 중량부의 분산제, 습윤제 및 실리카 겔을 첨가하면서 75 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 회전자-고정자 밀에서 분쇄한다. 물로 희석하여 AHAS-억제성 제초제의 안정한 분산액 또는 용액을 수득하고, 이에 의해 75％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 함유하는 제제가 수득된다.
H) 겔-제제 (GF)
교반 볼 밀에서, 10 중량부의 분산제, 1 중량부의 겔화제 습윤제 및 70 중량부의 물 또는 유기 용매를 첨가하면서 20 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 세분하여, 미세 AHAS-억제성 제초제 현탁액을 수득한다. 물로 희석하여 AHAS-억제성 제초제의 안정한 현탁액을 수득하고, 이에 의해 20％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 함유하는 제제가 수득된다. 이러한 겔 제제는 종자 처리제로서 사용하기에 적합하다.
2. 잎 적용을 위한 희석되지 않은 상태로 적용되는 제품. 종자 처리 목적으로, 이러한 제품은 희석된 상태로 종자에 적용될 수 있다.
A) 살분성 분말 (DP, DS)
5 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 미세하게 분쇄하고, 95 중량부의 미분된 카올린과 함께 치밀하게 혼합한다. 이렇게 하여 5％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 갖는 살분성 제품을 수득한다.
B) 과립 (GR, FG, GG, MG)
0.5 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 미세하게 분쇄하고, 95.5 중량부의 담체와 회합시켜, 0.5％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 함유하는 제제가 수득된다. 현 방법은 압출, 스프레이-건조 또는 유동층이다. 이렇게 하여 잎 사용을 위한 희석되지 않은 상태로 적용되는 과립을 수득한다.
통상적인 종자 처리 제제에는 예를 들어 유동성 농축물 FS, 용액 LS, 건식 처리용 분말 DS, 슬러리 처리용 수분산성 분말 WS, 수용성 분말 SS 및 에멀젼 ES 및 EC, 및 겔 제제 GF가 포함된다. 이러한 제제들은 희석된 상태로 또는 희석되지 않은 상태로 종자에 적용될 수 있다. 종자에의 적용은 파종 전에 또는 종자 상에 직접적으로 수행된다.
한 실시양태에서, FS 제제가 종자 처리에 사용된다. 전형적으로, FS 제제는 1 내지 800 g/ℓ의 활성 성분, 1 내지 200 g/ℓ의 계면활성제, 0 내지 200 g/ℓ의 동결방지제, 0 내지 400 g/ℓ의 결합제, 0 내지 200 g/ℓ의 안료 및 1 ℓ 이하의 용매, 바람직하게는 물을 포함할 수 있다.
종자 처리를 위해, 본 발명의 이벤트 127 대두 식물의 종자를 제초제, 예컨대 아미도술푸론, 아짐술푸론, 벤술푸론, 클로리무론, 클로르술푸론, 시노술푸론, 시클로술파무론, 에타메트술푸론, 에톡시술푸론, 플라자술푸론, 플루피르술푸론, 포람술푸론, 할로술푸론, 이마조술푸론, 요오도술푸론, 메소술푸론, 메트술푸론, 니코술푸론, 옥사술푸론, 프리미술푸론, 프로술푸론, 피라조술푸론, 림술푸론, 술포메투론, 술포술푸론, 티펜술푸론, 트리아술푸론, 트리베누론, 트리플록시술푸론, 트리플루술푸론, 트리토술푸론, 이마자메타벤즈, 이마자목스, 이마자픽, 이마자피르, 이마자퀸, 이마제타피르, 클로란술람, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람, 페녹스술람, 비스피리박, 피리미노박, 프로폭시카르바존, 플루카르바존, 피리벤족심, 피리프탈리드, 피리티오박 및 이들의 혼합물과 같은 AHAS-억제성 제초제로 이루어진 군으로부터 선택된 제초제, 또는 AHAS-억제성 제초제를 포함하는 제제로 처리한다.
용어 종자 처리는 당업계에 공지된 모든 적합한 종자 처리 기술, 예컨대 종자 드레싱, 종자 코팅, 종자 살분, 종자 침지 및 종자 펠렛화를 포함한다.
본 발명의 한 변형에 따라, 본 발명의 추가 대상은 조성물/제제, 예를 들어 과립 제제로서의 AHAS-억제성 제초제를 함유하는 어느 하나의 과립 제제 (임의로 하나 이상의 고체 또는 액체 담체, 농업상 허용되는 담체 및/또는 임의로 하나 이상의 농업상 허용되는 계면활성제를 함유함)를 적용함으로써, 특히 종자 이랑(drill) 내로 적용함으로써 토양을 처리하는 방법이다. 예를 들어, 곡류, 메이즈, 목화 및 해바라기의 모판에서 이러한 방법이 유리하게 사용된다.
본 발명은 또한 아미도술푸론, 아짐술푸론, 벤술푸론, 클로리무론, 클로르술푸론, 시노술푸론, 시클로술파무론, 에타메트술푸론, 에톡시술푸론, 플라자술푸론, 플루피르술푸론, 포람술푸론, 할로술푸론, 이마조술푸론, 요오도술푸론, 메소술푸론, 메트술푸론, 니코술푸론, 옥사술푸론, 프리미술푸론, 프로술푸론, 피라조술푸론, 림술푸론, 술포메투론, 술포술푸론, 티펜술푸론, 트리아술푸론, 트리베누론, 트리플록시술푸론, 트리플루술푸론, 트리토술푸론, 이마자메타벤즈, 이마자목스, 이마자픽, 이마자피르, 이마자퀸, 이마제타피르, 클로란술람, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람, 페녹스술람, 비스피리박, 피리미노박, 프로폭시카르바존, 플루카르바존, 피리벤족심, 피리프탈리드 및 피리티오박으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 AHAS-억제성 제초제를 포함하는 종자 처리 제제로 코팅되거나 이를 함유하는 종자를 포함한다.
용어 "종자"는 진정 종자, 종자 조각, 뿌리순, 구경, 구근, 과실, 덩이줄기, 꺾꽂이 순 및 꺾꽂이 묘조 등을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 모든 종류의 종자 및 식물 번식체(propagule)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서는, 진정 종자를 이용한다. "진정 종자"는 배를 함유하고, 예를 들어 영과 또는 수과로서 과피 또는 쉘 내에 둘러싸인 것을 함유할 수 있는, 종피 또는 종각, 뿐만 아니라 종자-유사 생식 구조 내에 둘러싸인 숙성된 식물 배주를 지칭한다.
용어 "~로 코팅되고/거나 ~를 함유하는"은 활성 성분이 적용 시에 대부분 번식 생성물의 표면 상에 있지만, 적용 방법에 따라 얼마간의 성분은 번식 생성물 내로 침투될 수 있다는 것을 일반적으로 의미한다. 상기 번식 생성물이 (재)식재되는 경우, 이는 활성 성분을 흡수할 수 있다.
AHAS-억제성 제초제 또는 AHAS-억제성 제초제를 포함하는 제제에 의한 종자 처리 적용은 식물의 파종 전에 및 식물의 출아 전에 종자에 스프레이 또는 살분함으로써 수행된다.
종자의 처리에서, 상응하는 제제는 유효량의 AHAS-억제성 제초제 또는 AHAS-억제성 제초제를 포함하는 제제로 종자를 처리함으로써 적용된다. 본원에서, 적용률은 종자 100 ㎏ 당 일반적으로 0.1 g 내지 10 kg의 a.i. (또는 a.i.의 혼합물 또는 제제), 바람직하게는 종자 100 ㎏ 당 1 g 내지 5 kg, 특히 종자 100 ㎏ 당 1 g 내지 2.5 kg이다. 상추와 같은 특정 작물에 대해서, 적용률이 더 높을 수 있다.
이벤트 127 대두 식물 상에 적용되는 임의의 제초제 제제는 "탱크-믹스" 조성물로서 제조될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 각각의 성분 또는 성분들의 조합은 서로 개별적으로 저장될 수 있다. 그 후, 성분은 적용 전에 서로 혼합될 수 있다. 전형적으로, 이러한 혼합은 적용 직전에 수행된다. 탱크-믹스 공정에서, 혼합 전에 각각의 성분은 전형적으로 물 또는 적합한 유기 용매 내에 존재한다. 이러한 제제의 제조 방법 및 그에 대한 지침은 당업계에 공지되어 있다.
상기 방법은 이벤트 127 대두 식물과 함께 사용될 제초제 조합물의 개발을 추가로 가능하게 한다. 이러한 방법에서, 경작 구역 내의 환경 조건이 평가된다. 평가될 수 있는 환경 조건에는 토지 및 표면 물 오염 염려, 작물의 의도된 용도, 작물 내성, 토양 잔류물, 경작 구역에 존재하는 잡초, 토성, 토양의 pH, 토양내 유기 물질의 양, 적용 장비 및 경운 재배가 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 환경 조건의 평가시, 제초제 조합물의 유효량이 작물, 작물 부분, 작물의 종자 또는 경작 구역에 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이벤트 127 대두 식물에 적용되는 제초제는 감수성 잡초 또는 원치않는 식물의 성장 개시를 방지하는 역할을 하고/거나 관심 구역에서 자라는 잡초 또는 원치않는 식물에 손상을 유발하는 역할을 한다. 일부 실시양태에서, 제초제 또는 제초제 혼합물은 후속적으로 관심 구역 (즉, 밭 또는 경작 구역)에 식재되는 작물에 영향을 미치는 잡초 또는 원치않는 식물에 대해 이들 효과를 발휘한다. 방법에서, 제초제 조합물의 적용은 동시에 수행될 필요는 없다. 작물이 식재되는 밭이 작물이 경작 구역에 있는 기간 동안 언젠가 적용된 검출가능한 양의 제1 제초제 및 제2 제초제를 함유하는 한, 작물은 본 발명에 따른 제초제의 혼합물로 처리된 것으로 간주된다. 따라서, 제공된 방법은 "출아전," "출아후," "식재전 혼입"이고/거나 식재 전에 종자 처리를 수반하는 제초제의 적용을 포함한다.
또한, 이벤트 127 대두 식물의 종자를 코팅하는 방법이 제공된다. 방법은 유효량의 제초제 또는 제초제 조합물 (본원에 개시된 바와 같음)로 종자를 코팅하는 것을 포함한다. 그 후, 종자는 경작 구역에 식재될 수 있다. 유효량의 제초제 또는 제초제 조합물 (본원에 개시된 바와 같음)을 포함하는 코팅을 갖는 이벤트 127 대두 식물의 종자가 추가로 제공된다.
"출아전"은 식물이 토양으로부터 보이게 출아하기 전 및/또는 종자의 발아전 관심 구역 (예를 들어, 밭 또는 경작 구역)에 적용되는 제초제를 지칭한다. "출아후"는 식물이 토양으로부터 보이게 출아한 후 구역에 적용되는 제초제를 지칭한다. 몇몇 예에서, 용어 "출아전" 및 "출아후"는 관심 구역 내의 잡초 또는 원치않는 식물과 관련하여 사용되고, 몇몇 예에서 이들 용어는 관심 구역 내의 작물 식물과 관련하여 사용된다. 잡초 또는 원치않는 식물과 관련하여 사용되는 경우, 이들 용어는 관심 구역에 존재하거나 존재하는 것으로 여겨지는 특정 유형의 잡초 또는 잡초의 종 또는 원치않는 식물에만 적용될 수 있다. 임의의 제초제는 출아전 및/또는 출아후 처리에 적용될 수 있으나, 몇몇 제초제는 출아전 또는 출아후 적용되는 경우 잡초 또는 잡초들 또는 원치않는 식물의 방제에 보다 효과적인 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 림술푸론은 출아전 및 출아후 활성 둘 모두를 갖지만, 다른 제초제는 출아전 (메톨라클로르) 또는 출아후 (글리포세이트) 활성을 우세하게 갖는다. 특정 제초제의 이들 특성은 당업계에 공지되어 있고, 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 추가로, 당업자는 본 발명의 트랜스제닉 식물과 함께 사용하기 위한 적절한 제초제 및 적용 시간 및/또는 본 발명의 트랜스제닉 식물이 식재될 구역을 용의하게 선별할 수 있을 것이다. "식재전 혼입"은 식재전 토양으로의 화합물의 혼입을 수반한다.
따라서, 작물을 성장시키고/거나 잡초 또는 원치않는 식물을 방제하는 개선된 방법이 제공된다 (예를 들어, 잡초 또는 원치않는 식물을 더 잘 방제하기 위해 관심 작물을 식재하기 전에 하나 이상의 제초제로 구역을 처리하는 "식재전 전소(burn down)"). "무경운" 또는 "저경운" (또한 "감소 경운"이라고 지칭됨)인, 작물을 성장시키고/거나 잡초 또는 원치않는 식물을 방제하는 방법이 추가로 제공된다. 이러한 방법에서, 토양은 전통적인 방법과 비교하여 성장 주기 동안 경작되지 않거나 또는 덜 빈번하게 경작되며; 이들 방법은 노동력 및 연료 비용을 포함하는, 다르게 추가 경작으로 인해 초래되는 비용을 절약할 수 있다.
방법은 여러 부류의 제초제의 동시 및/또는 순차 적용의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 오직 1종의 제초제 또는 다른 화학물질, 예를 들어 이미다졸리논 제초제로 본 발명의 식물 및/또는 관심 구역 (예를 들어, 밭 또는 경작 구역) 및/또는 잡초 및/또는 원치않는 식물을 처리하는 것을 수반한다.
제초제를 관심 구역 (및 그 안의 임의의 식물)에 적용하는 시점은 잡초 또는 원치않는 식물 방제의 최적화에 중요할 수 있다. 제초제를 적용하는 시점은 관심 구역 내의 식물의 크기 및/또는 식물의 성장 및/또는 발달의 단계, 예를 들어 구역에서 자라는 작물 식물 또는 잡초 또는 원치않는 식물과 관련하여 결정될 수 있다. 식물의 성장 및/또는 발달의 단계는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 대두 식물은 정상적으로 VE (출아), VC (단소엽화), V1 (첫 삼출겹잎), 및 V2 에서 VN으로 알려진 식물 성장 단계를 통해 발달한다. 이어서 대두는 광주기 신호에 반응하여 생식 생장상으로 전환되고; 생식 단계는 R1 (꽃이 피기 시작), R2 (꽃이 만개), R3 (꼬투리가 생기기 시작), R4 (꼬투리가 꽉참), R5 (종자가 생기기 시작), R6 (종자가 완성됨), R7 (성숙 시작), 및 R8 (완전히 성숙됨)을 포함한다. 따라서, 예를 들어 제초제 또는 다른 화학물질을 식물이 성장하고 있는 관심 구역에 적용하는 시점은 특정 구역 내의 식물의 일부 또는 전체가 적어도 특정 크기 및/또는 성장 및/또는 발달의 단계에 도달한 시점, 또는 특정 구역 내의 식물의 일부 또는 전체가 아직 특정 크기 및/또는 성장 및/또는 발달의 단계에 도달하지 않은 시점일 수 있다.
일부 실시양태에서, 이벤트 127 대두 식물은 출아후 제초제 처리에 대한 개선된 내성을 나타낸다. 예를 들어, 이벤트 127 식물은 더 높은 용량의 제초제에 대한 내성, 더 광범위한 범위의 제초제에 대한 내성 (즉, 더 많은 AHAS 억제제 화학에 대한 내성)을 가질 수 있고/거나, 적절한 대조 식물과 비교하여 발달의 더 빠른 시점 또는 더 이후 시점에 적용되는 제초제의 용량에 대한 내성을 가질 수 있다.
상이한 화학물질, 예컨대 제초제는 상이한 "잔류" 효과, 즉, 화학물질 또는 제초제에 의한 처리가 처리된 구역에서 성장하고 있는 식물에 대한 효과를 계속 갖는 상이한 시간의 양을 갖는다. 이러한 효과는 처리된 구역 (예를 들어, 밭 또는 경작 구역)의 원하는 미래 목적에 따라 원하는 것이거나 원치않는 것일 수 있다. 따라서, 윤작 계획은 각각의 작물을 위해 사용될 처리로부터의 잔류 효과 및 동일한 구역에서 후속적으로 성장될 작물에 대한 효과에 기초하여 선택될 수 있다. 당업자는 제초제의 잔류 효과를 평가하는데 사용될 수 있는 기술에 친숙하며; 예를 들어, AHAS를 억제하는 작용을 하는 제초제는 잔류 활성 수준이 다양하다. 다양한 제초제에 대한 잔류 활성은 당업계에 공지되어 있고, 또한 다양한 환경 인자, 예를 들어 토양 수분 수준, 온도, pH 및 토양 조성 (토성 및 유기 물질)에 따라 다양하다고 공지되어 있다. 이벤트 127 대두 식물은 제초제의 잔류 활성에 대한 개선된 내성이 이로운 작물을 성장시키는 방법에서 특히 사용된다.
또한, 본 발명의 대두 이벤트 127 식물은 제초제 처리와 함께 작물 상에 사용되는 추가 화학물질, 예컨대 독성완화제, 아주반트, 예컨대 암모늄 술포네이트 및 작물 오일 농축물 등에 의한 처리에 대한 개선된 내성을 제공한다.
또한, 개시된 방법은 훨씬 더 넓은 스펙트럼의 농업상 보호를 제공하는 다성분 혼합물을 형성하기 위한, AHAS-억제성 제초제 또는 제초제들의 혼합물, 뿐만 아니라, 하나 이상의 다른 살곤충제, 살진균제, 살선충제, 살세균제, 살비제, 성장 조절제, 화학불임제, 통신화학물질, 기피제, 유인제, 페로몬, 섭식 자극제 또는 다른 생물학적으로 활성인 화합물 또는 곤충병원성 박테리아, 바이러스 또는 진균의 사용을 포함할 수 있다. 방법에서 사용될 수 있는 이러한 농업용 보호제의 예로는: 살곤충제, 예컨대 아바멕틴, 아세페이트, 아세타미프리드, 아미도플루메트 (S-1955), 아베르멕틴, 아자디라크틴, 아진포스-메틸, 비펜트린, 빈페나제이트, 부프로페진, 카르보푸란, 카르탑, 클로르페나피르, 클로르플루아주론, 클로르피리포스, 클로르피리포스-메틸, 크로마페노지드, 클로티아니딘, 시플루메토펜, 시플루트린, 베타-시플루트린, 시할로트린, 람다-시할로트린, 시페르메트린, 시로마진, 델타메트린, 디아펜티우론, 디아지논, 디엘드린, 디플루벤주론, 디메플루트린, 디메토에이트, 디노테푸란, 디오페놀란, 에마멕틴, 엔도술판, 에스펜발레레이트, 에티프롤, 페노티오카르브, 페녹시카르브, 펜프로파트린, 펜발레레이트, 피프로닐, 플로니카미드, 플루벤디아미드, 플루시트리네이트, 타우-플루발리네이트, 플루페네림 (UR-50701), 플루페녹수론, 포노포스, 할로페노지드, 헥사플루무론, 히드라메틸논, 이미다클로프리드, 인독사카르브, 이소펜포스, 루페누론, 말라티온, 메타플루미존, 메타알데히드, 메타미도포스, 메티다티온, 메토밀, 메토프렌, 메톡시클로르, 메토플루트린, 모노크로토포스, 메톡시페노지드, 니텐피람, 니티아진, 노발루론, 노비플루무론 (XDE-007), 옥사밀, 파라티온, 파라티온-메틸, 페르메트린, 포레이트, 포살론, 포스메트, 포스파미돈, 피리미카르브, 프로페노포스, 프로플루트린, 피메트로진, 피라플루프롤, 피레트린, 피리달릴, 피리프롤, 피리프록시펜, 로테논, 리아노딘, 스피노사드, 스피로디클로펜, 스피로메시펜 (BSN 2060), 스피로테트라메이트, 술프로포스, 테부페노지드, 테플루벤주론, 테플루트린, 테르부포스, 테트라클로르빈포스, 티아클로프리드, 티아메톡삼, 티오디카르브, 티오술탑-나트륨, 트랄로메트린, 트리아자메이트, 트리클로르폰 및 트리플루무론; 살진균제, 예컨대 아시벤졸라르, 알디모르프, 아미술브롬, 아자코나졸, 아족시스트로빈, 베날락실, 베노밀, 벤티아발리카르브, 벤티아발리카르브-이소프로필, 비노미알, 비페닐, 비테르타놀, 블라스티시딘-S, 보르도 혼합물 (삼염기성 황산구리), 보스칼리드/니코비펜, 브로무코나졸, 부피리메이트, 부티오베이트, 카르복신, 카르프로파미드, 카프타폴, 카프탄, 카르벤다짐, 클로로넵, 클로로탈로닐, 클로졸리네이트, 클로트리마졸, 옥시염화구리, 구리 염, 예컨대 황산구리 및 수산화구리, 시아조파미드, 시플루나미드, 시목사닐, 시프로코나졸, 시프로디닐, 디클로플루아니드, 디클로시메트, 디클로메진, 디클로란, 디에토펜카르브, 디페노코나졸, 디메토모르프, 디목시스트로빈, 디니코나졸, 디니코나졸-M, 디노캅, 디스코스트로빈, 디티아논, 도데모르프, 도딘, 에코나졸, 에타코나졸, 에디펜포스, 에폭시코나졸, 에타복삼, 에티리몰, 에트리디아졸, 파목사돈, 페나미돈, 페나리몰, 펜부코나졸, 펜카라미드, 펜푸람, 펜헥사미드, 페녹사닐, 펜피클로닐, 펜프로피딘, 펜프로피모르프, 펜틴 아세테이트, 펜틴 히드록시드, 페르밤, 페르푸라조에이트, 페림존, 플루아지남, 플루디옥소닐, 플루메토베르, 플루오피콜리드, 플루옥사스트로빈, 플루퀸코나졸, 플루퀸코나졸, 플루실라졸, 플루술파미드, 플루톨라닐, 플루트리아폴, 폴페트, 포세틸-알루미늄, 푸베리다졸, 푸랄락실, 푸라메타피르, 헥사코나졸, 히멕사졸, 구아자틴, 이마잘릴, 이미벤코나졸, 이미녹타딘, 요오디카르브, 이프코나졸, 이프로벤포스, 이프로디온, 이프로발리카르브, 이소코나졸, 이소프로티올란, 카수가마이신, 크레속심-메틸, 만코제브, 만디프로파미드, 마네브, 마파니피린, 메페녹삼, 메프로닐, 메탈락실, 메트코나졸, 메타술포카르브, 메티람, 메토미노스트로빈/페노미노스트로빈, 메파니피림, 메트라페논, 미코나졸, 미클로부타닐, 네오-아소진 (제2철 메탄아르소네이트), 누아리몰, 옥틸리논, 오푸라세, 오리사스트로빈, 옥사딕실, 옥솔린산, 옥스포코나졸, 옥시카르복신, 파클로부트라졸, 펜코나졸, 펜시쿠론, 펜티오피라드, 페르푸라조에이트, 포스폰산, 프탈리드, 피코벤자미드, 피콕시스트로빈, 폴리옥신, 프로베나졸, 프로클로라즈, 프로시미돈, 프로파모카르브, 프로파모카르브-히드로클로라이드, 프로피코나졸, 프로피넵, 프로퀴나지드, 프로티오코나졸, 피라클로스트로빈, 프리아조포스, 피리페녹스, 피리메타닐, 피리페녹스, 피롤니트린, 피로퀼론, 퀸코나졸, 퀴녹시펜, 퀸토젠, 실티오팜, 시메코나졸, 스피록사민, 스트렙토마이신, 황, 테부코나졸, 테크라젠, 테클로프탈람, 테크나젠, 테트라코나졸, 티아벤다졸, 티플루자미드, 티오파네이트, 티오파네이트-메틸, 티람, 티아디닐, 톨클로포스-메틸, 톨리플루아니드, 트리아디메폰, 트리아디메놀, 트리아리몰, 트리아족시드, 트리데모르프, 트리모르프아미드 트리시클라졸, 트리플록시스트로빈, 트리포린, 트리티코나졸, 우니코나졸, 발리다마이신, 빈클로졸린, 지넵, 지람 및 족사미드; 살선충제, 예컨대 알디카르브, 옥사밀 및 페나미포스; 살세균제, 예컨대 스트렙토마이신; 살비제, 예컨대 아미트라즈, 키노메티오나트, 클로로벤질레이트, 시헥사틴, 디코폴, 디에노클로르, 에톡사졸, 페나자퀸, 펜부타틴 옥시드, 펜프로파트린, 펜피록시메이트, 헥시티아족스, 프로파르기트, 피리다벤 및 테부펜피라드; 및 생물 작용제, 예를 들어 곤충병원성 박테리아, 예컨대 바실루스 투린기엔시스 아종 아이자와이(Bacillus thuringiensis subsp. Aizawai), 바실루스 투린기엔시스 아종 쿠르스타키(Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki) 및 바실루스 투린기엔시스의 캡슐화된 델타-내독소 (예를 들어, Cellcap, MPV, MPVII); 곤충병원성 진균, 예컨대 녹색 무스카르딘 진균; 및 곤충병원성 바이러스, 예를 들어 바큘로바이러스, 뉴클레오폴리헤드로 바이러스 (NPV), 예컨대 HzNPV, AfNPV; 및 그라뉼로시스 바이러스 (GV), 예컨대 CpGV가 포함된다. 방법에서 사용되는 이들 다양한 혼합 파트너 대 다른 조성물 (예를 들어, 제초제)의 중량비는 전형적으로 100:1 내지 1:100, 또는 30:1 내지 1:30, 10:1 내지 1:10, 또는 4:1 내지 1:4이다.
생물학적으로 유효량의 관심 AHAS-억제성 제초제 또는 제초제들의 혼합물, 및 유효량의 적어도 하나의 추가 생물학적으로 활성인 화합물 또는 작용제를 포함하는 조성물이 추가로 제공되고, 적어도 하나의 계면활성제, 고체 희석제 또는 액체 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 생물학적으로 활성인 화합물 또는 작용제의 예는 살곤충제, 예컨대 아바멕틴, 아세페이트, 아세타미프리드, 아미도플루메트 (S-1955), 아베르멕틴, 아자디라크틴, 아진포스-메틸, 비펜트린, 빈페나제이트, 부프로페진, 카르보푸란, 클로르페나피르, 클로르플루아주론, 클로르피리포스, 클로르피리포스-메틸, 크로마페노지드, 클로티아니딘, 시플루트린, 베타-시플루트린, 시할로트린, 람다-시할로트린, 시페르메트린, 시로마진, 델타메트린, 디아펜티우론, 디아지논, 디플루벤주론, 디메토에이트, 디오페놀란, 에마멕틴, 엔도술판, 에스펜발레레이트, 에티프롤, 페노티오카르브, 페녹시카르브, 펜프로파트린, 펜발레레이트, 피프로닐, 플로니카미드, 플루시트리네이트, 타우-플루발리네이트, 플루페네림 (UR-50701), 플루페녹수론, 포노포스, 할로페노지드, 헥사플루무론, 이미다클로프리드, 인독사카르브, 이소펜포스, 루페누론, 말라티온, 메타알데히드, 메타미도포스, 메티다티온, 메토밀, 메토프렌, 메톡시클로르, 모노크로토포스, 메톡시페노지드, 니티아진, 노발루론, 노비플루무론 (XDE-007), 옥사밀, 파라티온, 파라티온-메틸, 페르메트린, 포레이트, 포살론, 포스메트, 포스파미돈, 피리미카르브, 프로페노포스, 피메트로진, 피리달릴, 피리프록시펜, 로테논, 스피노사드, 스피로메시펜 (BSN 2060), 술프로포스, 테부페노지드, 테플루벤주론, 테플루트린, 테르부포스, 테트라클로르빈포스, 티아클로프리드, 티아메톡삼, 티오디카르브, 티오술탑-나트륨, 트랄로메트린, 트리클로르폰 및 트리플루무론; 살진균제, 예컨대 아시벤졸라르, 아족시스트로빈, 베노밀, 블라스티시딘-S, 보르도 혼합물 (삼염기성 황산구리), 브로무코나졸, 카르프로파미드, 카프타폴, 카프탄, 카르벤다짐, 클로로넵, 클로로탈로닐, 옥시염화구리, 구리 염, 시플루페나미드, 시목사닐, 시프로코나졸, 시프로디닐, (S)-3,5-디클로로-N-(3-클로로-1-에틸-1-메틸-2-옥소프로필)-4-메틸벤자미드 (RH 7281), 디클로시메트 (S-2900), 디클로메진, 디클로란, 디페노코나졸, (S)-3,5-디히드로-5-메틸-2-(메틸티오)-5-페닐-3-(페닐-아미노)-4H-이미다졸-4-온 (RP 407213), 디메토모르프, 디목시스트로빈, 디니코나졸, 디니코나졸-M, 도딘, 에디펜포스, 에폭시코나졸, 파목사돈, 페나미돈, 페나리몰, 펜부코나졸, 펜카라미드 (SZX0722), 펜피클로닐, 펜프로피딘, 펜프로피모르프, 펜틴 아세테이트, 펜틴 히드록시드, 플루아지남, 플루디옥소닐, 플루메토베르 (RPA 403397), 플루모르프/플루모를린 (SYP-L190), 플루옥사스트로빈 (HEC 5725), 플루퀸코나졸, 플루실라졸, 플루톨라닐, 플루트리아폴, 폴페트, 포세틸-알루미늄, 푸랄락실, 푸라메타피르 (S-82658), 헥사코나졸, 이프코나졸, 이프로벤포스, 이프로디온, 이소프로티올란, 카수가마이신, 크레속심-메틸, 만코제브, 마네브, 메페녹삼, 메프로닐, 메탈락실, 메트코나졸, 메토미노스트로빈/페노미노스트로빈 (SSF-126), 메트라페논 (AC375839), 미클로부타닐, 네오-아소진 (제2철 메탄아르소네이트), 니코비펜 (BAS 510), 오리사스트로빈, 옥사딕실, 펜코나졸, 펜시쿠론, 프로베나졸, 프로클로라즈, 프로파모카르브, 프로피코나졸, 프로퀴나지드 (DPX-KQ926), 프로티오코나졸 (JAU 6476), 피리페녹스, 피라클로스트로빈, 피리메타닐, 피로퀼론, 퀴녹시펜, 스피록사민, 황, 테부코나졸, 테트라코나졸, 티아벤다졸, 티플루자미드, 티오파네이트-메틸, 티람, 티아디닐, 트리아디메폰, 트리아디메놀, 트리시클라졸, 트리플록시스트로빈, 트리티코나졸, 발리다마이신 및 빈클로졸린; 살선충제, 예컨대 알디카르브, 옥사밀 및 페나미포스; 살세균제, 예컨대 스트렙토마이신; 살비제, 예컨대 아미트라즈, 키노메티오나트, 클로로벤질레이트, 시헥사틴, 디코폴, 디에노클로르, 에톡사졸, 페나자퀸, 펜부타틴 옥시드, 펜프로파트린, 펜피록시메이트, 헥시티아족스, 프로파르기트, 피리다벤 및 테부펜피라드; 및 생물 작용제, 예를 들어 곤충병원성 박테리아, 예컨대 바실루스 투린기엔시스 아종 아이자와이, 바실루스 투린기엔시스 아종 쿠르스타키 및 바실루스 투린기엔시스의 캡슐화된 델타-내독소 (예를 들어, Cellcap, MPV, MPVII); 곤충병원성 진균, 예컨대 녹색 무스카르딘 진균; 및 곤충병원성 바이러스, 예를 들어 바큘로바이러스, 뉴클레오폴리헤드로 바이러스 (NPV), 예컨대 HzNPV, AfNPV; 및 그라뉼로시스 바이러스 (GV), 예컨대 CpGV이다. 방법은 또한 무척추동물 해충에 대해 독성인 단백질 (예컨대 바실루스 투린기엔시스 델타-내독소)을 발현하도록 유전적으로 형질전환된 식물의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 외인적으로 적용되는 무척추동물 해충 방제 화합물의 효과는 발현된 독소 단백질과 상승작용적일 수 있다.
따라서, 상기 방법은 AHAS-억제성 제초제 또는 AHAS-억제성 제초제 조합물을 사용할 수 있고, 살곤충제 및/또는 살진균제, 및/또는 다른 농업용 화학물질, 예컨대 비료의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조합된 처리의 사용은 추가 잡초 종에 대한 활성 스펙트럼을 확장시키고 임의의 저항성 생물형의 증식을 억제할 수 있다.
실시양태는 하기 실시예에서 추가로 한정된다. 이들 실시예는 단지 예시적으로 제공된 것임을 이해하여야 한다. 상기의 논의 및 이러한 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 확인할 수 있고, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서, 본 발명의 실시양태를 다양한 용법 및 조건에 적응시키기 위해 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있다. 따라서, 본원에서 나타내고 기재한 것들에 더하여, 본 발명의 실시양태의 다양한 변형이 상기의 설명으로부터 당업자에게 분명해질 것이다. 또한 이러한 변형은 하기하는 특허청구범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1: 트랜스제닉 식물의 제조
이미드아자올리논 제초제에 대해 저항성을 제공하는 돌연변이체 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 코딩 서열을 함유하는 플라스미드 pAC321로부터의 선형화된 DNA 단편 (PvuII)을 이용하여 트랜스제닉 대두 (글리신 맥스 L.) 식물을 개발하였다. pAC321 플라스미드는 위치 653에 상응하여 천연 세린이 아닌 아스파라긴 (S653N)을 갖는 돌연변이된 아라비돕시스 탈리아나 AHASL 유전자 (csr1-2) 코딩 서열을 함유한다. AHAS (S653N) 코딩 서열은 천연 A. 탈리아나 AHAS 프로모터 서열 및 전사 종결 서열의 제어하에 있다. 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 공개공보 번호 2005/0034187호를 참조한다. PvuII 단편은 아라비돕시스 AHASL 프로모터, 제초제 내성 아라비돕시스 AHASLl (csr1-2) 코딩 서열 및 아라비돕시스 AHASL 종결인자를 포함한다. 이 프로모터, 코딩 서열 및 종결인자 카세트를 본원에서는 csr1-2 카세트라 지칭한다.
상업적 품종 "콘퀴스타(Conquista)"의 단일 대두 종자의 정단 분열조직으로부터 유래된 배발생 축 조직을 유전자주입 형질전환에 사용하였다. 유전자주입 형질전환 (미세입자 투사법 또는 입자 투사법) (문헌 [Aragao, F. J. L., et al., Theor. Appl. Genet. 1996; 93:142-150])을 이용하여 csr1-2 유전자를 함유하는 대두 형질전환 이벤트를 생성시켰다. 투사법 이전에, csr1-2 유전자 단편을 함유하는 DNA를 미시적 금 입자 상에 침전시켰다. 이어서 침전된 DNA 및 입자를 플라스틱 대형운반체 위에 놓고, 정지 스크린이 대형운반체를 보유하도록 높은 속도로 가속시켰다. DNA와 함께 입자가 계속해서 흐르게하고, 최종적으로 대두 식물 세포를 통과하여 도입되게 하였다. 투사된 세포를 50 g ai/ha 이마자피르, 이미다졸리논 제초제 당량을 함유하는 선택 배지로 옮기고, csr1-2 유전자에 의해 형질전환된 세포들만 계속해서 자라게 하였다. 이러한 과정으로부터 내성 T0 식물이 확인되었고, 대두 이벤트 127이라 명명하였다 (도 1).
실시예 2: 라인 발생
대두 이벤트 127의 초기 형질전환체를 자가교배 ("자배")에 의해 하기 표 1에서 제공하는 바와 같이 T4 세대로 유지시켰다.
Figure pct00003
9 그루의 T3 식물 (E01, E02, E03, E04, E05, E06, E07, E09, 및 E10)로부터의 종자의 유전 분석 결과 트랜스진 분리가 항상 단순한 멘델 패턴을 따르지 않는 것으로 밝혀졌고, 이는 하나를 초과하는 활성 로커스가 존재함을 시사한다. 이마자피르에 대한 내성에 대해 멘델 분리를 나타내고 정상 표현형을 가진 T3 식물로부터의 T4 자손 (E09, E10, 및 E05)을 비트랜스제닉 품종 (BRS137, 콘퀴스타, 및 BR97-7066)과 교배시켜 4개의 군집을 발생시켰다 (표 2, 도 2).
Figure pct00004
F2 및 F3 세대에서, 정상 표현형 및 이마자피르에 대한 내성을 갖는 패밀리 및 개별 식물을 온실에서 선택하였다. 트랜스제닉 콘퀴스타 (T4-E10) x 비트랜스제닉 콘퀴스타 간의 교배인 F2 군집에서 이마자피르 (100 g ai/ha)에 대한 내성에 대한 분리 패턴 (38 내성:13 비내성)은 이벤트 127을 함유하는 트랜스제닉 라인 V03-603 (CV-603)의 단일 우성 유전자가 이마자피르에 대한 내성을 제어함을 보여주었다.
4회 교배 각각으로부터의 F4 및/또는 F5 라인 (표 2)을 이용한 후속 야외 실지는 후속 분석 및 발생을 위한 엘리트 대두 라인으로서 이벤트 127을 함유하는 라인 V03-603의 선택을 지지하였다. 3번 반복하는 난괴법 및 분할 처리법을 이용하여 4개의 위치에 야외 실지를 식재하였다. 엔트리를 주구로 하고, 이마자피르 적용률 (0, 70, 240, 또는 280 g ai/ha)은 하위구로 하였다. 식재 후 제 18-21 일에 식물을 스프레이하고, 적용 후 제 14 일에 평가하였다. 손상 퍼센트에 대해 식물을 평가하였다 (0 = 플롯 내에 사멸된 식물이 전혀 없음 → 100 = 플롯 내의 모든 식물이 사멸됨). 수집한 추가의 데이터로는 식물 키, 종자 수확량, 종자 크기, 개화까지의 일수 및 성숙까지의 일수가 포함되었다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
실시예 3: 분자 특성화
A: DNA 및 RNA 단리 및 정량화 방법
변형된 세틸 트리메틸 브롬화암모늄 (CTAB) 방법 (문헌 [Carlson et al., 1991])을 통해 대두 잎 조직으로부터 DNA를 단리하였다. 실리카 겔-건조된 잎 조직을 액체 질소로 동결시키고, 자동분쇄기 (오토겐(Autogen); 메사추세츠주 홀리스톤 소재)를 이용하여 분쇄하였다. 분쇄된 조직을 2％ (w/v) CTAB, 100 mM 트리스-HCl, 1.4 M NaCl, 1％ (w/v) 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 20 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), pH 9.5 (5 ml/60 mg 건조된 잎 조직) 및 β-메르캅토에탄올 (10 ㎕/ml 완충제)로 이루어진 예열된 추출 완충제와 함께 74℃에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 2440 x g에서 10 분 동안 원심분리한 후, 동 부피의 클로로포름/이소아밀 알콜 (24:1)을 이용하여 상청액을 2회 추출하였다. 0.7 부피의 이소프로판올로 DNA를 침전시키고, 약 500 ng/㎕의 최종 농도로 첨가된 0.5 mg/ml RNase A (인비트로겐(Invitrogen); 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 함유하는 TE 완충제 (10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 용해시켰다. 단리된 DNA를 훽스트(Hoechst) 33258 염료 (인비트로겐)로 DNA 표준물질로서 사용된 송아지 흉선 DNA (인비트로겐)와 함께 팩커드 플루오로카운트(Packard FluoroCount)™ BF10000 마이크로플레이트 형광계 (팩커드 인스트루먼트 컴퍼니(Packard Instrument Company); 코넥티커트주 메리덴 소재) 상에서 형광계 사용 설명서에 따라 정량하였다.
퀴아젠(Qiagen) RNeasy 미니 키트 (퀴아젠; 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 이용하여 이벤트 127의 F7 및 F8 세대 식물 유래의 실리카겔-건조된 어린 잎 및 비트랜스제닉 모 대두 품종 콘퀴스타의 잎으로부터 전체 RNA를 추출하였다. 약 25 mg의 실리카겔-건조된 잎 조직을 액체 질소로 동결시키고, 자동분쇄기로 분쇄하였다. 제조업체의 지침에 따라 전체 RNA 단리 절차를 수행하였다. RNeasy 미니 키트 사용 설명서의 권유에 따라 RNase-무함유 DNase (퀴아젠)를 이용하여 온-칼럼 DNase 소화시켜 전체 RNA 표본으로부터 임의의 대두 게놈 DNA를 제거하였다. 바이오메이트(BioMate)™ 3 분광광도계 (써모 엘렉트론 코포레이션(Thermo Electron Corporation); 메사추세츠주 왈탐 소재)를 이용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 단리된 RNA를 정량하였다.
B: 프로브 단리 및 표지 방법.
트랜스진 프로브로서 사용된 DNA 단편의 위치를 도 1b에 나타내었다. 벡터 골격 프로브는 도 5c에 나타내었다. 확인된 트랜스진 및 벡터 프로브를 생성하는데 사용하기 위한 PCR 프라이머를 하기 표 3에 제공하였다. 이들 5개의 중첩 프로브는 함께 전체 플라스미드에 걸쳐있다. 구체적으로, 프로브 1은 AHASL 프로모터 영역에 걸쳐있고, 프로브 2는 csr1-2 코딩 서열에 걸쳐있으며, 프로브 3은 AHASL 종결인자 영역에 걸쳐있고, 프로브 4 및 5는 함께 완전한 벡터 골격 (VB)을 커버한다. 프로브 DNA 단편은 주형으로서 플라스미드 pAC321을 이용한 PCR 증폭에 의해 생성하였다. 프로브 (각각 25 - 50 ng)를 제조업체의 지침에 따라 레디프라임(Rediprime)™ II DNA 표지 시스템 (아머샴(Amersham); 뉴욕주 피스카타웨이 소재)을 이용하여 50 μCi의 (α-32P)-dCTP (3000 Ci/mmol) (MP 바이오메디칼스(MP Biomedicals); 캘리포니아주 어번 소재)로 방사성표지하였다. 표지된 프로브를 스핀-X® 원심분리 튜브 필터 (코닝 코스터 코포레이션(Corning Costar Corporation); 메사추세츠주 액톤 소재)로 정제하였다.
Figure pct00008
C: 카피 개수, 삽입 완전성 및 안정성.
서던 블롯 분석을 사용하여 csr1-2 발현 카세트의 카피 개수 및 완전성을 결정하고, 뿐만 아니라 이벤트 127에서의 플라스미드 골격의 부재를 확인하였다. 제한 효소 NcoI, SpeI 및 XbaI를 사용하여 이벤트 127 식물 및 비트랜스제닉 대조군 콘퀴스타로부터 수득한 게놈 DNA를 소화시켰다. 도 3에서 pAC321 PvuII 형질전환 단편을 대두 이벤트 127 삽입물과 함께 정렬하였다. 대두를 형질전환시키는데 사용된 플라스미드 pAC321로부터의 PvuII 단편은 도 3의 상단에 나타내었다. 대두 이벤트 127 내의 트랜스진 삽입물 내에 함유되지 않은 이 단편의 부분은 사선으로 채워진 박스로 나타내었다. 대두 이벤트 127 내의 트랜스진 삽입물 및 플랭킹 게놈 대두 DNA를 특성화한 것은 도면의 하단에 나타내었다. PvuII 형질전환 단편 및 트랜스진 삽입 영역 지도 사이에 도시한 수직 점선 사이의 DNA는 두 DNA 단편에서 공통된다. 서던 블롯 분석과 관련된 제한 부위를 나타내었다. PvuII 형질전환 단편의 넘버링 시스템은 도 1에 나타낸 pAC321 플라스미드 지도의 그것과 상응한다. 대두 이벤트 127 삽입물에 대한 넘버링 시스템은 도 8에서의 그것과 상응하며, 여기서 #1은 대두 게놈 플랭킹 서열의 5' 말단의 첫번째 뉴클레오티드이다 (플랭킹 서열은 회색 박스로 나타냄). csr1-2 카세트 내의 단일 NcoI 제한 부위는 csr1-2 코딩 서열의 5' 말단에 위치하며, NcoI에 의한 이벤트 127의 게놈 DNA 소화는 csr1-2 카세트로부터의 DNA를 함유하는 2 개의 단편을 생성할 것으로 예상된다. 두 단편은 모두 csr1-2 카세트 내의 NcoI 부위 및 플랭킹 대두 게놈 서열 내의 최근접 NcoI 부위로 규정된다. 5' 플랭킹 대두 게놈 서열 내에는 1 개의 SpeI 제한 부위가 존재하고, 이벤트 127 내의 AHASL 3' UTR의 하류에는 2 개의 SpeI 제한 부위가 존재한다. XbaI 제한 부위는 완전한 csr1-2 발현 카세트에 플랭킹된다. 서던 혼성화에 의해 검출될 것으로 예상되는 DNA 단편의 개수 및 크기를 이하의 표 7에 열거하였다.
Figure pct00009
예상되는 단편 크기는 이벤트 127 식물 내의 클로닝된 삽입물 및 플랭킹 서열을 기초로 하여 추정하였다. 5' UTR 프로브 및 3' UTR 프로브는 각각 XbaI 부위와 중첩되어, 플라스미드 pAC321의 XbaI 단편 둘 모두와 혼성화된다 (도 4a 및 4c의 레인 11에서 점으로 표시됨). 이벤트 127 영역의 서열 분석은 csr1-2 코딩 영역의 작은 부분이 3' 트랜스진 통합 부위의 바로 상류에서 복제됨을 나타내었고, 이는 서던 블롯 결과에서 확인된 800 bp 밴드의 정체를 확인시켜주었다.
이벤트 127의 F8 세대 및 비트랜스제닉 대조군 콘퀴스타로부터의 게놈 DNA (7 ㎍)를 상기에서 열거한 제한 효소 (8 유닛/㎍ DNA)를 이용하여 효소 제조업체 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs); 메사추세츠주 입스위치 소재; 또는 아머샴)가 명시한 조건하에서 40 ㎕의 부피 중에서 밤새 소화시켰다. 제한 소화물을 10 cm 길이의 0.8％ 아가로스 겔 중에서의 전기영동에 의해 분리시켰다. 겔을 0.25 N HCl 중에 약 20 분간 침지시켜 DNA를 추가로 단편화하고, 0.4 N NaOH로 약 30 분 동안 변성시켰다. 겔을 2X NaCl/나트륨 시트레이트 용액 (SSC)으로 세정하고, 변성된 DNA를 전달 완충제로서 0.4 N NaOH를 이용하여 하이본드(Hybond) N+ 나일론 멤브레인 (아머샴)으로 옮겼다. 문헌 [Sambrook et al., (1989)]에 따라 서던 혼성화를 수행하였다. 멤브레인을 65℃에서 2-4 h 동안 예비혼성화시키고, 하이베이드 맥시 14 (Hybaid MAXI 14) 혼성화 오븐 (써모 엘렉트론 코포레이션) 내에서 65℃에서 밤새 20 - 30 ml (약 0.2 ml/㎠)의 혼성화 완충제 (2x SSC, 0.6％ SDS, 50 mM Na2HPO4, 1x 덴하르트 용액, 2.5 mM EDTA, 5％ 덱스트란 술페이트, pH 7.2) 중에서 혼성화시켰다. 혼성화 이후에, 멤브레인을 2x SSC, 0.5％ SDS (1 ml/㎠)로 실온에서 15 분 동안, 2x SSC, 0.1％ SDS (4 ml/㎠)로 65℃에서 30 분 동안, 마지막으로 0.1x SSC, 0.1％ SDS (4 ml/㎠)로 65℃에서 15 분 동안 세척하였다. 세척한 후, 멤브레인을 플라스틱 랩으로 감싸고, 증감지를 갖는 카세트 내의 방사성 신호 강도에 따라 하이퍼필름(Hyperfilm)™ MP 필름 (아머샴)에 2-5 일 동안 -80℃에서 노출시켰다.
또한, 상기한 바와 같이 서던 블롯 분석을 수행하여 다세대에 걸친 삽입물의 안정성을 모니터링하였다. T4, F4, F8 및 F9 세대로부터 식물 물질을 수득하였다 (도 2). 이들 샘플로부터의 게놈 DNA를 NcoI 및 SpeI로 소화시키고 (상기에서 기재한 바와 같음), 상기한 바와 같이 서던 블롯 분석을 수행하였다.
이벤트 127 내의 삽입물의 카피 개수는 상기에서 기재한 방법을 이용하여 NcoI, SpeI 및 XbaI 제한 효소로 소화시킨 이벤트 127 F8 세대 식물로부터의 게놈 DNA의 서던 블롯 분석에 의해 평가하였다.
서던 블롯 분석 결과를 도 4a, 4b, 및 4c에 제공한다. 비트랜스제닉 대두 품종 콘퀴스타의 게놈 DNA (레인 1, 5 및 9); pAC321의 1-게놈 카피 등가물과 혼합된 콘퀴스타 (레인 2, 6 및 10); 또는 2-게놈 카피 등가물과 혼합된 콘퀴스타 (레인 3, 7 및 11); 및 F8 세대로부터의 대두 이벤트 127의 게놈 DNA (레인 4, 8 및 12)를 기재한 바와 같은 NcoI (1-4), SpeI (5-8) 및 XbaI (9-12) 제한 효소로 소화시켰다. 블롯을 프로브 5' UTR (도 4a), 프로브 AHAS (도 4b) 및 프로브 3' UTR (도 4c)과 혼성화시켰다. 첫번째 및 마지막 레인 (M으로 표시한 것)은 λ/HindIII 래더를 함유하고; 밴드 크기는 킬로베이스로 나타내었다. 도 4d는 서던 혼성화 프로브 및 이벤트 127 삽입물 사이의 상동성 영역을 나타낸다. 도 4b의 화살표는 3' 플랭킹 서열 접합부에서 이벤트 127 내에 존재하는 csr1-2의 부가적인 376 bp 단편을 함유하는 대략 885 bp의 SpeI 단편을 나타낸다.
모든 3 개의 제한 효소로 소화시키고 3 개의 프로브와 혼성화시킨 비트랜스제닉 콘퀴스타 DNA는 어떤 신호도 나타내지 않았는데, 이는 내인성 대두 AHASL 유전자도, 내인성 대두 Sec61 γ 서브유닛 유전자도 사용된 서던 블롯 엄격성 조건에서 검출되지 않음을 나타낸다 (도 4, 레인 1, 5 및 9). 상이한 효소 및 프로브 조합으로 처리한 이벤트 127 F8 세대로부터의 DNA 샘플은, SpeI 소화물이 AHASL 코딩 서열 프로브와 혼성화되는 것을 제외하고 (추가로 약 800 bp의 작은 밴드를 가짐 (도 4b, 레인 8, 화살표)), 모두 단일 밴드를 나타내었다 (도 4a, b, 및 c, 레인 4, 8 및 12). 이러한 AHASL-혼성화 800 bp SpeI 단편은 AHASL 코딩 서열의 작은 단편이 이벤트 127 내의 3' 플랭킹 서열 접합부에서 반복된다는 관찰결과와 일치하였다 (완전한 서열에 대한 섹션; 실시예 3E 참조). 모든 주요 밴드는 pAC321의 1-게놈 카피 등가물과 대략 유사한 신호 강도를 가졌다.
NcoI로 소화시키고 At AHASL 5' UTR로 프로브화한 이벤트 127로부터의 게놈 DNA는 크기가 대략 4.5 kb인 혼성화 밴드를 생성하였다. 이 밴드의 크기는 삽입물 내의 NcoI 부위 (nt 2761, 도 4d) 및 대략 4.5 kb 상류의 5' 게놈 대두 플랭킹 서열 내의 NcoI 부위에 의해 규정되는 단일 DNA 단편의 생성물과 일치하였다. AtAHASL 코딩 서열 또는 AtAHASL 3'UTR로 프로브화한 동일한 소화물은 크기가 대략 9.0 kb인 혼성화 밴드를 생성하였다. 이 밴드의 크기는 삽입물 내의 NcoI 부위 (nt 2761, 도 4d) 및 대략 9.0 kb 하류의 3' 대두 게놈 플랭킹 서열 내의 NcoI 부위에 의해 규정되는 단일 DNA 단편과 일치하였다.
SpeI에 의한 이벤트 127 게놈 DNA의 소화 및 At AHASL 5' UTR에 의한 프로브화는 대략 크기가 4.4 kb인 혼성화 밴드를 생성하였다. 이는 삽입물 내의 SpeI 부위 (nt 5620, 도 4d) 및 대략 4.4 kb 상류의 대두 게놈의 5' DNA 플랭킹 서열 내의 SpeI 제한 부위 (nt 1268, 도 4d)로부터의 단일 DNA 단편의 생성물과 일치하였다. 이러한 상류 SpeI 부위의 존재는 이벤트 127의 5' 플랭킹 서열의 분석으로 확인하였다 (플랭킹 서열에 대한 섹션; 실시예 3D 참조). At AHASL 코딩 서열 또는 At AHASL 3' UTR로 프로브화된 동일한 소화물 역시 상기한 동일한 단편에 상응하는 4.4 kb 혼성화 밴드를 생성하였다. 또한, SpeI 소화물을 At AHASL 코딩 서열로 프로브화한 경우 대략 크기가 0.8 kb인 혼성화 밴드가 검출되었는데, 이는 3' 플랭킹 DNA 서열 접합부에 csr1-2 유전자의 376 bp 절편을 함유하는 단일 SpeI DNA 단편과 일치하였다. 이러한 혼성화 단편은 DNA 삽입물 내의 SpeI 부위 및 0.8 kb 하류의 대두 게놈 내 SpeI 부위 (nt 5620 - 6505, 도 4d)로부터 생성되었다. 0.8 kb 혼성화 밴드는 At AHASL 3' UTR 프로브에 의해서는 검출되지 않았는데, 이는 At AHASL 3' UTR DNA가 0.8 kb 단편 내에 포함되지 않으며, 삽입물 내의 SpeI nt 5620 부위가 csr1-2 유전자의 376 bp 절편에 인접함을 나타낸다. 따라서, 형질전환에 사용된 플라스미드 pAC321의 선형 PvuII 단편 내의 뉴클레오티드 5622 및 5719에서의 SpeI 제한 효소 부위 (도 1b에 나타낸 것)는 이벤트 127 게놈 내의 DNA 삽입물에 포함되지 않는다. 이는 DNA 삽입물의 DNA 서열 분석에 의해 확인되었다 (완전한 서열 섹션; 실시예 3E 참조). pAC321 혼합 대조군 내의 280 및 97 bp의 보다 작은 예상되는 SpeI 단편은 본 방법을 이용한 검출 수준 아래에서 신호를 생성할 것이다.
이벤트 127 게놈 DNA를 XbaI로 소화하고 At AHASL 5' UTR에 의해 프로브화한 경우 대략 10 kb 크기의 단일 혼성화 밴드가 나타났다. 형질전환에 사용된 선형 DNA 내의 XbaI 제한 부위의 위치에 기초하면 (도 1b), 이벤트 127 게놈 내의 DNA 삽입물 내로부터 생성된 대략 5.7 kb의 혼성화 밴드가 예상되었다. 그러나, 이벤트 127 내의 DNA 삽입물의 DNA 서열 분석은 선형 형질전환 DNA 내의 어떤 XbaI 제한 부위도 DNA 삽입물 내에 포함되지 않았음을 보여주었다 (완전한 서열에 대한 섹션; 실시예 3E 참조). 따라서, 10 kb 혼성화 밴드는 삽입물에 플랭킹된 5' 및 3' DNA 서열 내의 XbaI 제한 부위로부터 생성된 것이다 (nt 410 및 10652, 도 4d). 따라서, At AHASL 코딩 서열 또는 At AHASL 3' UTR에 의해 프로브화된 동일한 소화물은 상기한 동일한 DNA 단편에 상응하는 동일한 10 kb 혼성화 밴드를 생성하였다.
도 4에 나타낸 서던 블롯 상의 모든 혼성화 밴드의 개수 및 크기 분석은 csr1-2 유전자의 단일 기능적 카피를 함유하는 이벤트 127 대두 게놈 내의 단일 DNA 삽입물, 뿐만 아니라 csr1-2 유전자의 5' 말단 상의 단백질 SEC61γ 코딩 서열, 및 삽입물의 3' 말단에서 csr1-2 유전자의 376 bp 절편을 함유하는 단일 DNA 단편이 통합된 것과 일치하였다.
벡터 골격 DNA를 포함하지 않는 pAC321의 PvuII 제한 단편으로 형질전환을 수행하였지만, 서던 블롯 연구를 수행하여 이벤트 127 게놈 내의 플라스미드 pAC321 벡터 DNA의 부재를 확인하였다. 이벤트 127 내에 통합된 임의의 벡터 골격이 존재하는지 여부를 결정하기 위해, 상기한 서던 분석에 사용된 것과 동일한 블롯 세트 (도 4)를 2 개의 벡터 골격 특이적 프로브와 혼성화시켰다 (도 5). 예상되는 바와 같이, 비트랜스제닉 콘퀴스타 게놈 DNA를 함유하는 레인에서는 어떤 혼성화 밴드도 검출되지 않았다. 형질전환 플라스미드 pAC321의 1- 또는 2-게놈 카피 등가물과 혼합된 비트랜스제닉 콘퀴스타 게놈 DNA는 예상되는 크기의 혼성화 밴드를 나타내었다 (표 7). 블롯을 프로브 VP1 (도 5a) 및 프로브 VP2 (도 5b)와 혼성화시켰다. 이벤트 127 F8 세대 DNA에서 어떤 혼성화 밴드도 검출되지 않았는데, 이는 어떤 벡터 골격 DNA도 본 이벤트의 대두 게놈에 통합되지 않았음을 나타낸다. 도 5c는 pAC321의 성분과 관련하여 프로브 VP1 및 VP2의 위치를 보여준다.
이벤트 127 내의 삽입물의 안정성을 결정하기 위해, 4 개의 상이한 세대, T4, F4, F8 및 F9 (도 2)로부터의 DNA 샘플을 서던 블롯 분석하였다. 게놈 DNA 샘플을 NcoI 및 SpeI로 소화시키고, 형질전환에 사용된 전체 DNA 단편에 걸쳐있는 At AHASL 5' UTR, At AHASL 코딩 서열 또는 At AHASL 3' UTR 프로브로 프로브화하였다 (도 1b). 이들 제한 효소 및 프로브의 조합은 이벤트 127 내의 DNA 삽입물에 대해 특유의 지문을 제공하였다 (도 4). 비트랜스제닉 콘퀴스타 게놈 DNA를 음성 대조군으로 사용하고, pAC321의 1- 및 2-게놈 카피 등가물과 혼합된 콘퀴스타를 양성 대조군으로 사용하였다 (도 6). NcoI 또는 SpeI에 의해 소화된 이벤트 127 T4 세대 DNA로부터 모든 3 개의 프로브에 의해 다중 밴드가 검출되었는데, 이는 T4 세대가 다중 카피의 csr1-2 카세트를 함유함을 나타낸다. 그러나, F4, F8 및 F9 세대로부터의 DNA는 모두 삽입물 및 카피 수 분석에서 이미 관찰된 것 (도 4)과 동일한 서던 패턴 (도 6)을 나타내었다. 이러한 결과는 T4 세대 내의 삽입물의 다중 카피가 T4 및 콘퀴스타 사이의 교배 자손에서 분리되었으며, 오직 단일 카피만이 선택된 분리 개체 내에 보유되어 있음을 나타낸다. 게다가, 이러한 단일 카피는 후속 세대에서 안정하게 유전된다.
D: 삽입물 DNA의 5' 및 3' 말단에 플랭킹된 게놈 서열
역-PCR을 이용하여 삽입된 csr1-2 카세트에 플랭킹된 대두 게놈 DNA의 서열을 수득하였다 (문헌 [Triglia et al., 1988]). 이벤트 127 F7 세대로부터의 게놈 DNA (1 ㎍)를 15 유닛의 XbaI, SpeI, HindIII, NcoI, EcoRI, BamHI 또는 BglII로 20 ㎕ 반응 부피 중에서 3 시간 동안 소화시켰다. XbaI, HindIII, NcoI 및 EcoRI 소화물을 65℃에서 20 분 동안 인큐베이션하여 효소를 불활성화시킨 한편, BamHI 및 BglII 소화물은 이소프로판올 침전시켰다. T4 DNA 리가제 (800 유닛, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 각 소화 반응에 직접 첨가하였다. 또한 물을 첨가하여 반응 부피가 200 ㎕가 되게 하였다. 반응물을 16℃에서 밤새 인큐베이션시키고, 원형 DNA를 역-PCR을 위한 주형으로서 직접 사용하였다. 진앰프(GeneAmp)® XL PCR 키트 (어플라이드 바이오시스템즈; 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 이용하여 트랜스진 플랭킹 서열을 증폭시켰다. 100 ㎕ 1차 PCR은 1x 제조업체-공급 PCR 완충제, 200 μM의 각각의 dNTP, 25 ng의 원형 게놈 DNA 단편, 1.2 mM 마그네슘 아세테이트, 2 유닛의 rTth DNA 폴리머라제 XL, 및 0.2 μM의 각각의 1차 PCR 프라이머를 함유하였다. 100 ㎕ 이중 PCR은 주형으로서 1차 PCR의 1:50 희석물 10 ㎕를 사용하는 것을 제외하고, 1차 PCR과 동일한 성분을 함유하였다. 1차 및 이중 PCR은 진앰프 PCR 시스템 9700 (어플라이드 바이오시스템즈) 상에서 수행하였다. 1차 및 2중 프라이머의 서열을 이하의 표 4에 제공한다. 94℃에서의 초기 1 분 변성 단계 이후에, 94℃에서 15 초, 60℃에서 8 분 및 72℃에서 2 분을 30 사이클 수행한 후 72℃에서 최종 10 분 연장 단계를 수행하였다.
Figure pct00010
PCR 반응을 완료한 후, 생성물을 자이모 DNA 클린 & 콘센트레이터(Zymo DNA Clean & Concentrator)™-5 (자이모 리서치(Zymo Research); 캘리포니아주 오렌지 소재)로 정제하였다. PCR 생성물을 직접 서열분석하거나, 또는 클로닝 이후에 서열분석하였다. PCR 생성물 또는 클로닝된 단편이 1 kb 보다 더 길 경우, 프라이머 워킹을 이용하여 전장 서열을 수득하였다. DNA 가닥을 둘 모두 서열분석하여, 각 염기에서 Phred 40 보다 더 큰 서열 품질을 수득하였다. 서열분석은 어플라이드 바이오시스템즈 사의 빅다이(BigDye)™ 터미네이터 v3.1 레디 반응 사이클 시퀀싱 키트 및 ABI 3730 DNA 애널라이저를 이용하여 행하였다.
XbaI 소화물로부터 증폭된 3' 플랭킹 PCR 생성물은 약 6 kb였고, 증폭이 너무 약하여 직접 서열분석을 위한 충분한 DNA를 수득할 수 없었다. 따라서, PCR 생성물을 SpeI로 소화하고, 생성된 제한 단편 (하나는 약 800 bp이고, 다른 것은 약 5.2 kb)을 DNA 폴리머라제 I, 대형 (클레나우) 단편 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)으로 처리하여 블런트 말단을 생성하고, pCR®-블런트 II-TOPO 클로닝 벡터 (제로 블런트(Zero Blunt)® 토포(TOPO)® PCR 클로닝 키트; 인비트로겐)로 클로닝하였다. 각 단편의 10 개의 클론을 제한 소화에 의해 확인하고, 프라이머 워킹에 의해 서열분석하였다. 제한 단편의 접합부를 접합부에 걸친 PCR 증폭 및 서열분석에 의해 확인하였다.
3 kb DNA 단편을 이벤트 127 F7 세대 게놈 DNA의 분자내적으로 원형화된 NcoI 소화물로부터 역 PCR에 의해 증폭시켰다. 단편의 양 말단의 서열분석은 이것이 트랜스진 삽입물의 5' 측면으로부터 특이적으로 증폭됨을 보여주었다. 단편을 추가로 서열분석하여 1.3 kb의 5' 대두 플랭킹 게놈 서열을 수득하였다. 6 kb DNA 단편을 이벤트 127 F7 세대 게놈 DNA의 XbaI 소화물로부터 역 PCR에 의해 증폭시키고, 서브클로닝 이후에 전체적으로 서열분석하였다. 수득된 서열은 그것이 삽입물의 3' 측면에서 플랭킹되었음을 보여주었다. 5' 및 3' 플랭킹 영역으로부터의 프라이머를 이용하여 비트랜스제닉 품종 콘퀴스타 DNA의 PCR 분석을 행하여, 플랭킹 서열이 식물 게놈에 본래 존재했음을 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음).
전체 대두 이벤트 127 트랜스진 삽입물 서열을 5' 및 3' 플랭킹 서열과 함께 도 8에 나타내었다 (서열 1). 이용가능한 공중 DNA 데이터베이스 (모든 진뱅크(GenBank) + EMBL + DDBJ + PDB 서열) 및 바스프(BASF) 식물 과학 특화 DNA 데이터베이스에 대해 시험된 5' 플랭킹 서열의 BLAST 분석으로 특화된 대두 발현된 서열 태그 (EST)와의 서열 동일성 영역이 밝혀졌고, 확인된 플랭킹 서열의 기원이 천연 대두 DNA임을 확인하였다. 예상되는 오픈 리딩 프레임에 대해 서열을 추가로 분석하였다. 그 결과 삽입의 5' 말단의 상류에 플랭킹 서열의 뉴클레오티드 941 내지 1255의 315 bp ORF가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 5' 플랭킹 서열을 형질전환 서열과 정렬하여 통합 지점이 예상되는 ORF의 종결 코돈으로부터 60 bp 하류인 뉴클레오티드 1312 (도 8; 서열 1)임을 밝혀내었다.
3' 플랭킹 서열의 분석으로 3' 통합 지점 앞에 csr1-2 코딩 서열의 일부 (도 8의 뉴클레오티드 3768-4143; 서열 1)와 단지 단일 뉴클레오티드 만큼 상이한 376 bp 서열 절편이 존재하는 것으로 밝혀졌다. 3' 플랭킹 서열 접합부에의 이러한 376 bp 서열의 삽입은 트랜스진 삽입물로부터 3' 플랭킹 서열로 연장된 501 bp의 ORF를 생성하였다. 이러한 ORF의 잠재적인 전사를 RT-PCR에 의해 조사하였다. 이용가능한 공중 DNA 데이터베이스 (모든 진뱅크 + EMBL + DDBJ + PDB 서열) 및 바스프 식물 과학 특화 DNA 데이터베이스에 대해 시험된 3' 플랭킹 서열의 BLAST 분석으로 대두 카탈라제 유전자에 대한 근위 3' 플랭킹 서열에서 서열 유사성 영역이 밝혀졌다 (수탁 번호 Z12021). 그러나, 통합 지점은 잠재적인 유전자 상동체의 약 500 bp 상류이고, 추정 코딩 서열은 통합 지점의 약 2.4 kb 하류이다. 따라서, 가능한 카탈라제 상동체가 활성 유전자라 하더라도, 삽입에 의해 영향을 받지 않을 것이다. 또한, 원위 3' 플랭킹 서열 영역은 특화된 대두 EST와 서열 동일성을 공유하였다.
비트랜스제닉 콘퀴스타의 게놈으로부터 이벤트 127 통합 부위를 PCR 증폭시키기 위한 연구를 수행하였다. 삽입 부위를 증폭시키기 위한 5' 플랭킹 영역에의 하나의 프라이머 및 3' 플랭킹 영역에의 제2 프라이머를 포함하는 PCR 프라이머 세트 A 및 B는 주형으로서 비트랜스제닉 품종 콘퀴스타로부터의 게놈 DNA를 이용할 경우 증폭된 DNA 생성물을 생성하지 않았다. 3' 플랭킹 서열에 대해 특이적인 프라이머를 포함하는 PCR 프라이머 세트 C는 비트랜스제닉 품종 콘퀴스타 DNA로부터 증폭 생성물을 생성하지 않은 반면, 이벤트 127로부터의 게놈 DNA에 의해서는 예상되는 앰플리콘이 생성되었다 (데이터는 나타내지 않음). 이는 프라이머 세트 C에 의해 증폭된 DNA 단편이 이벤트 127 내에는 존재하지만 콘퀴스타 게놈의 동일한 배경에는 존재하지 않음을 보여주며, 이는 이벤트 127에서 삽입 부위에서의 DNA 재배열이 일어남을 시사한다. 이는 삽입된 DNA 및 게놈 대두 DNA의 접합부에 근접해서 csr1-2 코딩 영역으로부터 복제된 서열의 376 bp 절편이 확인된 것과 일치한다.
E. 삽입물 DNA의 완전한 서열
6 개의 PCR 생성된 앰플리콘이 전체 삽입물 뿐만 아니라 인접 대두 게놈 서열과의 접합부에 걸쳐 있도록 설계하였다 (도 7). 이러한 6 개의 중첩 단편을 PCR 증폭시킨 후 DNA 서열 분석하여 삽입된 DNA의 완전한 서열을 수득하였다. PCR 증폭에 사용된 프라이머의 서열을 표 5에 제공한다. 형질전환 단편의 서열과 관련하여 서열 불일치를 함유하는 PCR 앰플리콘을 rTth DNA 폴리머라제 XL로 재증폭시켰다. PCR 생성물을 자이모 DNA 클린 & 콘센트레이터™-5로 정제하고, 직접 서열분석 및 프라이머 워킹에 의해 Phred 40의 품질 수준에 대해 양 가닥을 서열분석하였다. DNA 서열분석은 상기한 바와 같이 수행하였다.
Figure pct00011
서던 블롯 분석은 트랜스진 삽입물이 완전한 csr1-2 발현 카세트를 함유함을 시사하였지만, 삽입물의 클로닝 및 서열분석을 수행하여 삽입물 완전성을 확인하였다. 택 DNA 폴리머라제를 이용하여 6 개의 중첩 앰플리콘을 PCR 증폭시켜 삽입된 DNA의 완전한 서열을 수득하였다 (도 7). 완전한 대두 이벤트 127 삽입물 서열은 csr1-2로부터 3' 통합 지점에의 376 bp 단편의 삽입을 제외하고 길이가 4758 bp였고, 서열은 3 개의 점 돌연변이를 제외하고 형질전환 단편 서열과 동일하였다 (도 8; 서열 1). 점 돌연변이 중 하나는 AHASL 코딩 서열에서의 G→A 돌연변이로, 이는 R272에서 K272로 아미노산을 변화시킨다. 이는 보존적 아미노산 치환이며, 제초제 내성 또는 At AHAS 단백질의 효소적 특성에 영향이 없다. 다른 2 개의 돌연변이에는 G→A 돌연변이 및 G→C 돌연변이가 포함되며, 이들은 둘 모두 csr1-2 유전자의 3'UTR의 하류에 위치하여 유전적으로 침묵한다.
대두 이벤트 127의 생산 및 육종 개발에 있어서 AHASL 코딩 서열 내의 G→A 돌연변이가 언제 발생되었는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 먼저, 삽입물의 서열분석에 사용되는 PCR4 반응 (도 7)을 주형으로서 이벤트 127 T4 및 F8 세대 둘 모두로부터의 게놈 DNA를 이용하여 시작하고, PCR 생성물을 서열분석하였다. 이벤트 127 T4 세대로부터의 서열은 예상되는 (pAC321) 서열과 다르지 않았다. T4 세대가 다중 카피의 삽입물을 함유하며 PCR4 생성물이 다양한 삽입물 카피로부터의 서열의 혼합물일 것임을 고려하여, 5' 플랭킹 서열에의 전방향 프라이머
Figure pct00012
및 csr1-2 코딩 서열에의 역방향 프라이머
Figure pct00013
를 이용하여 2.5 kb의 이벤트 127 로커스-특이적 PCR 앰플리콘을 설계하였다. PCR 생성물을 직접 서열분석하였다. 서열 비교 결과 G→A 돌연변이가 또한 이벤트 127 T4 세대에도 존재함이 밝혀졌는데, 이는 돌연변이가 T4 세대 이전의 어느 시점에 발생되었고 (데이터는 나타내지 않음), 후속 8 세대 동안 유지되었음을 나타낸다.
최초 형질전환 서열은 본래 AHASL 프로모터 및 5' UTR로서 가공된 2.5 kb 절편을 함유하였다. 최근의 서열 분석으로 이러한 서열 절편이 또한 SEC61의 감마 서브유닛, 복합 수송 단백질을 코딩하는 종전의 가공되지 않은 아라비돕시스 유전자도 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이벤트 127 삽입물 서열은 완전한 코딩 서열을 비롯하여 대부분의 AtSec61 γ 서브유닛 유전자를 함유하였다. 아라비돕시스 정보 자원(The Arabidopsis Information Resource)에 의해 가공된 AtSec61γ 5' UTR은 5' 트랜스진 통합 부위로부터 18 뉴클레오티드 하류에서 시작된다. 이에 따라, 삽입물은 AtSec61.γ 유전자에 대한 완전한 천연 프로모터를 함유하지 못할 것이다.
대두 이벤트 127 내의 삽입물에서 발견되는 아라비돕시스 AtSEC61 γ 서브유닛 유전자의 가능한 전사를 RT-PCR을 이용하여 평가하였다. 주형으로서 이벤트 127의 F7 세대로부터 추출한 DNase 처리된 전체 RNA를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 2 개의 내인성 대두 유전자, Iota 및 GmSec61 γ에 대해 특이적인 프라이머를 양성 대조군으로 사용하여 주형 RNA의 품질을 확인하였다. 또한 양성 대조군으로서 DNase 처리하지 않은 아라비돕시스 잎 및 뿌리 조직으로부터의 전체 RNA를 사용하였다. 그 결과 내인성 대두 양성 대조군, Iota 및 GmSec61 γ은 둘 모두 어린 대두 잎 조직에서 강력하게 전사된 반면, 이벤트 127 F7 세대의 AtSec61 γ 서브유닛 유전자는 단지 약하게 전사된 것으로 나타났다. 도 9의 화살표는 이벤트 127로부터 증폭된 AtSec61 γ 서브유닛에 상응하는 희미한 RT-PCR 생성물을 나타낸다. 이벤트 127의 F7 세대로부터의 증폭된 393 bp AtSec61 γ 서브유닛 DNA 밴드는 아라비돕시스 잎 및 뿌리로부터 증폭된 것과 크기가 같았다 (도 9). 또한 동일한 쌍의 프라이머는 아라비돕시스 잎 및 뿌리 샘플 내 오염 게놈 DNA로부터 예상되는 크기, 965 bp의 밴드를 증폭시켰다. 이벤트 127 RT-PCR 생성물의 동일성을 확인하기 위해, 이를 서열분석하고 AtSec61 γ 서브유닛의 예상되는 mRNA 서열과 비교하였다 (데이터는 제공하지 않음). 양 서열을 매칭시켰고, AtSec61 γ 서브유닛이 이벤트 127의 잎에서 약하게 전사되는 것으로 나타났다.
3' 플랭킹 서열 접합부에 근접하여 csr1-2 코딩 서열의 376 bp 부분의 삽입 (도 7)은 501 bp ORF를 만들었다. 이 ORF의 가능한 전사를 RT-PCR 분석에 의해 조사하였다. 2가지 상이한 양의 RNA 주형, 500 ng 및 125 ng을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 이벤트 127 F8 세대 게놈 DNA를 ORF 특이적 프라이머와의 양성 대조군 반응에 사용하였다. 대두 Iota 유전자에 특이적인 프라이머를 양성 대조군 반응에 사용하여 주형 RNA의 품질을 확인하였다. ORF 특이적 프라이머는 이벤트 127 게놈 DNA로부터 435 bp 단편을 증폭시켰다. 그러나, 주형으로서 어린 잎 조직으로부터의 전체 RNA를 사용한 경우 어떤 검출가능한 RT-PCR 생성물도 관찰되지 않았는데, 이는 ORF가 이벤트 127에서 발현되지 않음을 시사한다 (도 10).
F. 정성적 이벤트 특이적 검출의 PCR 검정
DNA 플랭킹 서열 및 삽입물 서열 둘 모두로부터 수득한 정보를 이용하여 이벤트 특이적 PCR을 개발하였다. 각 쌍의 하나의 프라이머는 5' 대두 플랭킹 서열에 대한 것이고, 다른 것은 csr1-2 카세트에 대한 것인 4 쌍의 프라이머를 설계하였다. 이벤트 특이적 PCR에 사용하기 위한 프라이머의 서열을 하기 표 10에 제공한다.
Figure pct00014
길이상 약 200 내지 약 400 bp 사이의 PCR 생성물을 증폭시기키 위한 프라이머를 설계하였다. 이벤트 127 및 비트랜스제닉 품종 콘퀴스타 둘 모두로부터의 게놈 DNA를 주형으로서 사용하였다. PCR을 반응 당 25 ng의 주형 DNA, 200 μM의 각 dNTP, 0.4 μM의 각 프라이머 및 1 유닛의 택 DNA 폴리머라제를 이용하여 25 ㎕의 전체 부피로 수행하였다. 94℃에서의 초기 4 분 변성 이후에, 94℃에서 30 초, 60℃ (이벤트 PCR1 및 3) 또는 66℃ (이벤트 PCR2 및 4)에서 30 초, 및 72℃에서 45 초의 30 사이클을 수행한 후, 72℃에서 최종 10 분 연장시켰다. 6 개의 다른 식재 위치로부터의 대두 이벤트 127 및 비트랜스제닉 품종 콘퀴스타의 각 4종의 식물을 "이벤트 PCR3" 프라이머 세트를 이용한 정성적 PCR에 의해 분석하였다.
모든 4종의 PCR은 대두 이벤트 127로부터 특이적으로 예상되는 크기의 생성물을 생성하였고 (도 11a), 이는 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자를 검출하는데 임의의 4종의 프라이머 세트를 사용할 수 있음을 시사한다. 6 개의 상이한 식재 위치로부터 수집한 이벤트 127 대두 식물 및 비트랜스제닉 품종 콘퀴스타 샘플로 이벤트 특이적 PCR 생성물 3을 추가로 확인하였다. 그 결과 PCR 생성물 3이 모든 24 개의 이벤트 127 대두 샘플에서 특이적으로 증폭되었지만, 비트랜스제닉 대조군 품종 콘퀴스타에서는 그렇지 않은 것으로 나타났다 (도 11b 및 c).
G. 정량적 이벤트 특이적 검출의 PCR 검정
이벤트 127 핵산 대두가 샘플 내 존재하는 핵산의 전체량의 0.08％ 내지 5％로 샘플에 존재하는 경우, 종자의 혼합 배치 내의 이벤트 127 핵산을 검출하고 정밀하고 정확하게 이를 정량하기 위해 이벤트 특이적 정량적 PCR을 설계하였다. 이 방법에서, 2 쌍의 프라이머를 개입 프로브와 함께 사용하였다. 이벤트 특이적 PCR에 사용하기 위한 프라이머 서열을 하기 표 11에 제공한다.
Figure pct00015
본 택맨 기반 검정에서, 2가지의 상이한 반응 혼합물에서 각각의 사이클 동안 이벤트 특이적인 PCR 생성물의 수준을 내인성 대조군의 그것과 비교하였다.
검정 포맷은 2 가지 PCR 시스템 각각에 대한 표준 곡선을 이용하였고; 각 표준 곡선은 각각 3중 측정치로부터 유래된 4개의 기준점으로 구성되었다. 표준물질은 10％ 이벤트 127 대두 DNA를 함유하는 20 ng/㎕의 전체 게놈 DNA 용액 (표준물질 1)을 제조하고, 후속하여 희석 완충제로 연속 1:5 희석 (표준물질 2 내지 4)하여 생성하였다. 시스템 당 3 개의 주형 부존재 대조군 (NTC)을 구동시켜 시약의 순도를 확인하였다. 각 샘플 (비공지)을 반응 당 100 ng 게놈 DNA에서 분석하였다.
이벤트 및 내인성 PCR 프로브를 FAM (여기 495 nm; 방출 520 nm)에 접합시켰다. 길이가 100 bp 미만인 짧은 앰플리콘을 생성하기 위한 프라이머를 설계하였다. 이벤트 127 대두 (10％) 및 콘퀴스타 (비-GM) (90％)로부터의 게놈 DNA의 혼합물을 20 ng/㎕로 희석시켰다. 표준 곡선을 위해, 이어서 이것을 10 ng/㎕ 연어 정자 DNA를 이용하여 20, 4, 및 0.8 ng 대두 DNA (반응 부피는 5 ㎕임)로 희석하였다. PCR 반응을 모든 표준물질 성분 (우라실-N-글리코실라제를 함유하는 택맨 유니버셜 PCR 마스터 혼합물 (앰프이레이스(AmpErase)®UNG, ABI))을 함유하는 96 웰 플레이트에서 25 ㎕ 부피로 수행하였다. 이벤트 PCR을 위해, 프라이머를 400 nM 농도로 첨가하고, 프로브를 100 nM 농도로 첨가하였다. 내인성 PCR을 위해, 프라이머를 150 nM의 농도로 첨가하고, 프로브를 50 nM 농도로 첨가하였다. 검정은 어플라이드 바이오시스템즈 7500 신속 실시간 PCR 시스템 상에서 구동하였다. 50℃에서 2 분 및 95℃에서 10 분의 초기 단일 사이클 이후에, 95℃에서 15 초 및 60℃에서 60 초의 45 사이클을 수행하였다. 이벤트 127 대두 및 비트랜스제닉 품종 콘퀴스타의 각 3개의 샘플 및 혼합물을 정량적 PCR에 의해 분석하였다.
H. 복제 및 SEC61 γ 유전자 분석
대두 이벤트 127 내에 존재하는 csr1-2 코딩 서열 일부의 376 bp 복제물 또는 AtSec61 γ 유전자가 전사되었는지 여부를 결정하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 전체 RNA를 퀴아젠 원스텝 RT-PCR 키트 (퀴아젠)를 이용한 RT-PCR을 위한 주형으로서 사용하였다. AtSec61 γ 코딩 서열의 RT-PCR 분석을 위해, 잎 및 뿌리로부터의 아라비돕시스 전체 RNA 샘플을 또한 양성 대조군으로서 사용하였다. 아라비돕시스 전체 RNA 샘플을 DNase로 처리하지 않고 트리졸(TRIzol) 시약 (인비트로겐)으로 제조하였다. RT-PCR 반응물은 1x 퀴아젠 원스텝 RT-PCR 완충제, 400 μM의 각 dNTP, 0.6 μM의 각 프라이머, 2 ㎕의 퀴아젠 원스텝 RT-PCR 효소 혼합물, 및 500 ng 또는 125 ng의 전체 RNA를 전체 부피 50 ㎕로 함유하였다. 진앰프 PCR 시스템 9700을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 50℃에서의 30 분 역전사 단계 이후에, 다음과 같은 조건하에서 PCR 증폭을 실시하였다: 95℃에서의 15 분 변성 단계 1회; 94℃에서 30 초, 64℃에서 30 초, 및 72℃에서 1 분의 30 사이클; 및 72℃에서의 10 분 연장 1회. RT-PCR 분석에 사용된 프라이머 서열을 표 12에 제공한다.
내인성 대두 Sec61γ 서브유닛 및 Iota 유전자를 양성 대조군으로서 사용하였다. 대두 Iota 서브유닛 유전자는 대두에서 항시적이고 편재하여 발현되었다 (문헌 [Yamamoto and Knap, 2001]).
Figure pct00016
I. 통합 부위의 PCR 분석
3번의 PCR 반응을 수행하여 비트랜스제닉 대두 품종 콘퀴스타 내의 삽입 부위를 특성화하였다. 본 연구에 사용된 PCR 프라이머는 이벤트 127의 게놈 내의 신규한 발현 카세트에 플랭킹된 5' 및 3' 게놈 영역에 대해 결정된 DNA 서열로부터 유래된 것이다.
PCRA용 PCR 프라이머 (하기 표 13 참조)는 전방향 프라이머가 5' 플랭킹 서열에 결합되고 역방향 프라이머가 3' 통합 지점 직후의 3' 플랭킹 서열에 결합되도록 설계하였다. PCRB용 프라이머는 전방향 프라이머가 5' 플랭킹 서열에 결합되고 역방향 프라이머가 3' 플랭킹 서열의 원위 말단에 근접하여 결합되도록 설계하였다. PCRC용 프라이머는 둘 모두 3' 플랭킹 서열 내에 결합되도록 설계하였다.
Figure pct00017
PCRA 및 PCRC는 퀴아젠 택 DNA 폴리머라제를 이용하여 수행하고, PCR2는 진앰프® XL PCR 키트를 이용하여 수행하였다. 25 ng의 이벤트 127 또는 콘퀴스타 DNA를 모든 PCR 증폭에 사용하였다. 퀴아젠 택 DNA 폴리머라제를 이용한 PCR을 위해, 반응물은 1x 퀴아젠 PCR 완충제, 200 μM의 각 dNTP, 0.4 μM의 각 프라이머 및 1 유닛의 택 DNA 폴리머라제를 25 ㎕ 전체 부피로 함유하였다. 94℃에서의 초기 4 분 변성 단계 이후에, 94℃에서 30 초, 66℃에서 45 초 및 72℃에서 2 분의 30 사이클을 수행한 후, 72℃에서 최종 10 분 연장 단계를 수행하였다.
진앰프® XL PCR 키트를 이용한 PCR을 위해, 반응물은 주형 DNA를 제외하고 플랭킹 서열의 클로닝에 사용된 것과 동일한 성분을 함유하였다. 94℃에서 초기 1 분 변성 단계 이후에, 94℃에서 1 분 및 66℃에서 10 분의 30 사이클을 수행한 후, 72℃에서 최종 10 분 연장시켰다.
J. 생물정보학 분석.
스타덴 프레갭4(Staden Pregap4) 및 갭4 (문헌 [Staden, 1996])를 이용하여 DNA 서열을 어셈블리시켰다. 클로닝된 삽입물 서열 및 예상되는 삽입물 서열의 정렬은 LI-COR 얼라인IR 소프트웨어 (리코르 바이오테크놀로지(Licor Biotechnology); 네브래스카주 링컨 소재)를 이용하여 수행하였다. 플랭킹 서열을 이용가능한 공중 DNA 데이터베이스 (모든 진뱅크+EMBL+DDBJ+PDB 서열) 및 바스프 식물 과학 특화 DNA 데이터베이스에 대해 BLAST 분석 (문헌 [Altschul et al., 1997])을 통해 시험하였다. 벡터 NTI v9.0 (인비트로겐)의 ORF 분석 함수에 의해 30 코돈 이상의 오픈 리딩 프레임이 확인되었다.
이들 실험의 결과에 기초하면, 대두 이벤트 127은 csr1-2의 완전한 발현 카세트 뿐만 아니라, AtSec61 γ 서브유닛 유전자의 5' UTR, 전체 코딩 서열, 및 3' UTR을 포함하는 4758 bp의 단일 카피 삽입물을 함유하였다. csr1-2 유전자로부터의 376 bp의 코딩 서열 반복부는 또한 플랭킹 서열과의 3' 접합부에 통합되었다. 어떤 벡터 골격 서열도 대두 게놈 내에 통합되지 않은 것으로 확인되었다. 삽입물은 8 육종 세대에 걸쳐 안정적으로 유전되었는데, 이는 이러한 삽입물이 대두 게놈 내에 안정하게 통합되었음을 보여준다. csr1-2 발현 카세트에는 3개의 점 돌연변이가 존재하며: 하나는 돌연변이체 AHASL 단백질의 제초제 내성 또는 효소적 특성에 영향이 없는 AHASL 코딩 서열 내의 보존적 돌연변이이고, 2 개는 3' UTR의 하류의 돌연변이이다. 삽입물의 3' 말단에 플랭킹된 DNA에서 대두 게놈 DNA의 재정렬이 발생한 것으로 보이며, 이는 아마도 DNA 통합 과정 동안 발생했을 것이다. 삽입물은 형질전환에 사용된 DNA 단편에 포함된 AtSec61 γ 서브유닛 유전자의 코딩 서열을 함유하였다. 이 유전자는 단지 약하게만 전사되었다. csr1-2 코딩 서열의 376 bp 단편은 501 bp의 새로운 ORF를 만들었다. RT-PCR 실험은 이러한 ORF의 어떤 검출가능한 전사도 나타내지 않았다.
실시예 4: 잡초 방제
A. 실시예 4A: 출아후 적용
브라질의 중심 영역의 3가지 상이한 위치: 상파울루주 산또 안또니오 데 봇세 소재의 ARS (Agricultural Research Station), 고이아스주 산또 안또니오 데 고이아스 소재의 CNPAF (Embrapa Rice and Beans), 및 미나스제라이스주 우베라바 소재의 CTTP (Embrapa-Epamig)에서 3 가지의 밭 실험을 수립하였다. 각 부위의 잡초 발생을 표 13에 나타낸다.
<표 13>
Figure pct00018
CYPRO = 시페루스 로툰두스(Cyperus rotundus); BOILF = 스페르마코세 라티폴리아; COMBE = 콤멜리나 벤가렌시스(Commelina benghalensis); EPHHL = 에우포르비아 헤테로필라; SIDRH = 시다 롬비폴리아(Sida rombifolia); RCHBR = 리카르디아 브라실리엔시스; IPOGR = 이포모에아 그란디폴리아(Ipomoea grandifolia).
식재로부터 수확까지의 모든 절차는 모든 3 개의 위치에서 동일하였다. 잡초의 잎이 2 내지 4 개 달리고, 대두 작물의 첫번째 세 잎이 완전히 펼쳐지면 제초제를 출아후 초기에 적용하였다. 난괴법을 3 중으로 사용하였다. 주요 처리를 표 15에 나타내었다.
Figure pct00019
이미다졸리논 제초제를 이미다졸리논 내성 대두 (이벤트 127로부터 유래된 것)에 적용하고, 글리포세이트를 라운드업 레디(Roundup Ready) 대두 (발리오사 RR(Valiosa RR))에 적용하였다 (이들은 각 위치에 나란히 식재됨). 이미다졸리논 제초제 (이마자피르 및 키픽스)는 비이온성 아주반트 - 대쉬(Dash) - 와 함께 0.25％ v/v로 적용하였다. 모든 제초제를 적용하는데 190 kpa에 170 l/ha를 전달하는 80015 저압 노즐이 장착된 CO2 배낭형 스프레이기를 사용하였다. 모든 대두 종자를 5 cm 깊이 및 380,000 종자/ha 군집으로 50 cm 행 간격으로 식재하였다.
작물 손상은 0에서 100의 스케일 (0은 손상이 없는 것이고 100은 작물이 사멸된 것임)에 기초하여 제15 및 제30 적용후 일수 (DAA)에 평가하였다. 제초제 효능은 0에서 100 스케일 (0은 방제를 하지 않은 것이고 100은 완전히 방제한 것)에 기초하여 제15, 제30 및 제60 DAA에 평가하였다.
하기 표 16은 제초제를 적용했을때 구역에 존재하던 잡초에 대한 이러한 핵심 처리의 효능을 보여준다. 이들 결과에 따르면, 이마자피르 및 이마자피르+이마자픽 조합물은 유사한 효능을 가졌다. 제30 DAA에, 이들 두 제품은 7 종의 중요한 브라질 잡초에 대해 모두 효과적이었다: CYPRO (87％), COMBE (87-90％), EPHHL (85-87％), IPOGR (90-91％), BOILF (82-83％), SIDRH (86-87％) 및 RCHBR (83％). 제60 DAA에, 이미다졸리논 제초제는 출아후 적용한 경우 CYPRO, COMBE, RCHBR 및 IPOGR에 대해 글리포세이트 보다 월등하였다.
Figure pct00020
실시예 4B: 전소 적용
브라질의 중심 영역의 3가지 상이한 위치: 상파울루주 산또 안또니오 데 봇세 소재의 ARS (Agricultural Research Station), 고이아스주 산또 안또니오 데 고이아스 소재의 CNPAF (Embrapa Rice and Beans), 및 미나스제라이스주 우베라바 소재의 CTTP (Embrapa-Epamig)에서 3 가지의 밭 실험을 수립하였다. 이들 각 구역에서의 잡초 발생을 표 17에 나타낸다.
Figure pct00021
BRAPL = 브라키아리아 플란타기네아(Brachiaria plantaginea); DIGHO = 디기타리아 호리존탈리스(Digitaria horizontalis); CYPRO = 시페루스 로툰두스; COMBE = 콤멜리나 벤가렌시스; EPHHL = 에우포르비아 헤테로필라; IPOGR = 이포모에아 그란디폴리아; GASPA = 갈린소가 파르비플로라(Galinsoga parviflora); BIDPI = 비덴스 필로사(Bidens pilosa).
식재로부터 수확까지의 모든 절차는 모든 3 개의 위치에서 동일하였다. 대두를 식재하기 5 일 전에 전소시킨 곳에 제초제를 적용하였다.
난괴법을 3 중으로 사용하였다. 주요 처리를 표 18에 열거하였다.
Figure pct00022
이벤트 127로부터 유래된 이미다졸리논 내성 대두를 5 cm 깊이 및 380,000 종자/ha 군집으로 50 cm 행 간격으로 식재하였다. 이미다졸리논 제초제는 비이온성 아주반트, 대쉬와 함께 0.25％ v/v로 적용하였다. 모든 제초제를 적용하는데 190 kpa에 170 l/ha를 전달하는 80015 저압 노즐이 장착된 CO2 배낭형 스프레이기를 사용하였다 (표 18).
작물 손상은 0에서 100의 스케일 (0은 손상이 없는 것이고 100은 작물이 사멸된 것임)에 기초하여 제15 및 제30 식재후 일수 (DAP)에 평가하였다. 제초제 효능은 0에서 100 스케일 (0은 방제를 하지 않은 것이고 100은 완전히 방제한 것)에 기초하여 제15, 제30 및 제60 DAP에 평가하였다.
표 19는 전소 적용시 구역에 존재하던 잡초에 대한 이러한 핵심 처리의 효능을 보여준다. 제30 및 제60 DAA에서의 결과는 글리포세이트와 비교하여 이미다졸리논 제초제의 잔류 효과를 보여주었다. 제30 DAA에, 이마자피르+이마자픽 조합물은 이마자픽에 비해 약간 더 나았지만, 이들 둘 모두 BRAPL (85％), DIGHO (95％), CYPRO (88％), COMBE (75-94％), EPHHL (95％), IPOGR (75％), GASPA (84-95％) 및 BIDPI (79-93％)에 대해 효과적이었다. 글리포세이트는 어떤 잔류 활성도 갖지 않았고, 제30 및 제60 DAA에 상기 8 종의 잡초에 대해 효과가 없었다.
Figure pct00023
실시예 4C: 글리포세이트 내성 식물의 방제
이미다졸리논 제초제가 경작 구역에서 자라는 원치않는 글리포세이트 내성 잡초 및 작물을 방제하는데 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 온실 연구를 수행하였다. 글리포세이트 저항성 식물의 종자를 출아후 적용의 경우에는 메트로 믹스(metro mix) 및 출아전 적용의 경우에는 노스 카롤리나 토양(North Carolina soil)을 이용하여 (토양 표면 상에 서서히 방출되는 비료를 함유함) 4.5 인치 포트에 식재하였다. 오버헤드 살수하면서 식물을 온실 내에 유지시켰다.
글리포세이트 저항성 대두, 옥수수, 및 쥐꼬리망초 각각의 5 개의 개별 식물에 대해 글리포세이트, 이마자피르, 또는 이마자픽의 스프레이 처리를 출아후 또는 출아전에 적용하였다. 출아후 스프레이는 옥수수 및 대두의 경우에는 2-본엽 단계에, 쥐꼬리망초의 경우에는 9-본엽 단계에 수행하였다. 글리포세이트는 774 g ae/ha의 비율로 적용하고, 이마자피르 및 이마자픽 제초제는 20 g ai/ha, 40 g ai/ha, 80 g ai/ha, 160 g ai/ha, 및 240 g ai/ha의 비율로 적용하였다. 전체 손상 비율 퍼센트를 제14 처리후 일수 (DAT) 및 제25 처리후 일수 (DAT)에 육안으로 결정하였다. 처리되지 않은 대조군 식물은 연구 어디에서도 육안으로 보이는 손상을 나타내지 않았다. 출아후 시험의 결과를 표 20에 요약하였고, 출아전 연구의 결과를 표 21에 요약하였다. 결과는 5 개의 개별 식물의 평균으로 제공하였다.
Figure pct00024
Figure pct00025
이들 결과는 이미다졸리논 제초제가 글리포세이트 내성 잡초 및 작물을 출아전 또는 출아후에 방제할 수 있음을 보여준다. 한가지 장점은 글리포세이트가 더 이상 방제에 효과적이지 않은 저항성 잡초 및 원치않는 식물을 방제하는데 이미다졸리논 제초제를 이벤트 127 식물과 함께 사용할 수 있다는 것이다.
실시예 4D: 대두 이벤트 127을 이용하여 증가된 대두 생산
비트랜스제닉 동질 유전자 대조군 (무반응) 및 다른 비트랜스제닉 (종래의) 대두 품종 (대비)과 관련하여 이미다졸리논 제초제에 대해 내성을 갖는 트랜스제닉 대두 라인 (이벤트 127)의 농경학적, 표현형, 및 생물계절 특성을 평가하기 위해 야외 실지를 수행하였다. 이를 위해, 대표적인 상업적 대두 생산 구역이며 모든 유전자형이 적응되어 있는 브라질의 밭 위치에서 연구를 수행하였다.
모든 밭 위치에서 5 가지의 처리 (표 22)를 난괴법으로 4회 반복하였다. 각각의 포트는 동일한 플롯의 열 사이의 간격이 0.5 m이고 인접한 플롯의 열 사이의 간격이 1.0 m인 6 개의 8 m-긴 열로 이루어졌다. 표현형 및 농경학적 측정치는 3rd 및 4th 열 내의 식물로부터 결정하였다.
이러한 평가에 포함된 5 가지의 처리는 이러한 연구의 목적을 충족시키기 위한 적절한 데이터를 생성하는데 요구되는 특정 대두 유전자형 및 제초제 제제 (이미다졸리논 및 비이미다졸리논 제초제)의 조합을 대표한다.
본 평가에 2 가지의 제초제 처리가 사용되었다: 1) 이마자피르, 70 g ai/ha의 비율로 스프레이함, 및 2) 볼트, 벤타존 (400 g ai/ha) 및 아시플루오르펜 (170 g ai/ha)의 조합물, 570 g ai/ha의 비율로 스프레이함. 상이한 대두 유전자형 및 제초제 제제를 조합하여 5 가지의 처리를 만들었다 (표 22). 이들 5 가지의 처리 (T1, T2, T3, T4, T5)는 실험 설계에서 완전한 반복을 구성한다.
Figure pct00026
실험물을 브라질 내 7 개의 실험 농장에 식재하였다 (표 23). 농장은 대두 생산의 대표적인 구역이며 대두 유전자형이 적응된 구역인 영역 내에 위치하였다. 모든 위치는 바이오안전성에 관한 인증 (CQB)을 받았고, 확립된 기반시설, 실험실 설비 및 밭 장비, 및 농업 연구에 경험이 있고 바이오안전에 대해 훈련을 받은 인력을 구비하였다.
Figure pct00027
대두 유전자형의 표현형 및 거동을 설명하는데 흔히 사용되는 다양한 특성들을 기록하여 이벤트 127, 동질 유전자 대조군, 및 대비 품종의 표현형, 생물계절, 및 농경학적 유사성을 결정하였다. (달리 나타내지 않는 한) 특성은 모든 위치의 모든 플롯을 대상으로 기록하였다. 튜키(Tukey) 시험을 이용하여 특정 특성에 대한 현저한 효과를 갖게 하는 산포 요인의 평균을 비교하였다 (ANOVA에 의해 결정).
위치별 평균으로는, 이마자피르 (T1) 또는 볼트 (T2)에 의한 이벤트 127의 성능 및 이마자피르 (T3)에 의한 동질 유전자 대조군의 성능이 발아, 최종 직립, 녹색 줄기, 도복, 개화까지의 일수, 성숙까지의 일수, 또는 수확량에 있어서 현저하게 다르지 않았다 (표 24). 오직 식물의 키 및 종자 크기 만이 T1과 T3 사이에 현저하게 달랐고, 오직 종자 크기 만이 T2와 T3 사이에 현저하게 달랐다. 또한, T1 및 T2에 대한 특성 평균 위치에서는 어떤 차이점도 현저하게 다르지 않았다 (표 24).
Figure pct00028
본 연구의 결과는 이미다졸리논 제초제를 적용하지 않은 다른 상업적 품종과 동등한 잔류 활성을 갖는 이미다졸리논 제초제를 적용한 후 수확량 수준을 유지시키는데 이벤트 127을 함유하는 대두 라인을 이용할 수 있음을 보여준다.
실시예 5: 정성적 이벤트 특이적 검출을 위한 겔 기반 PCR 검정
종자 및 곡물 샘플에서 이벤트-127 핵산을 검출하는데 사용하기 위한 정성적 겔-기반 PCR 검정 방법을 개발하였다. 이 방법은 비트랜스제닉 대두 DNA 혼합물에서 0.05％ 이벤트-127 대두 DNA를 검출할 수 있다.
곡물 및 종자 샘플을 25 ml 분쇄용 비커에서 30 초 동안 30 Hz에서 믹서밀 MM 400 (레트슈(Retsch); 독일 한 소재)을 이용하여 분쇄하여 균질한 분말을 수득하였다. CTAB (세틸 트리메틸 브롬화암모늄) 완충제를 이용하여 0.1 - 1 g 분쇄된 곡물 샘플로부터 게놈 DNA를 추출한 후, 클로로포름:옥탄올 추출하고 알콜 침전시켰다. 생성된 침전물을 용해시키고, 남아있는 억제제는 게놈-팁 20/G 중력류 칼럼 (퀴아젠; 독일 힐덴 소재)을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거하였다.
분광광도계 나노드롭 ND-1000 (펙랩 바이오테크놀로지(Peqlab Biotechnologie); 독일 에르란겐 소재)을 이용하여 260 및 280 nm (A260/280) 및 260 및 230 nm (A260/230)의 파장에서의 샘플 흡광도의 비율을 결정하여 DNA의 농도 및 순도를 검정하였다. 1.8에 근접한 A260/280 비 및 1.8 보다 높은 A260/230을 갖는 DNA를 후속 PCR을 위해 선택하였다.
이벤트 127 특이적 영역을 증폭시키기 위해 또 다른 세트의 프라이머를 개발하였고, 대두 특이적 유전자를 내인성 대조군으로서 사용하였다. 이벤트 특이적 PCR 검정은 이벤트 127에 특유한 트랜스진 삽입물-천연 대두 게놈 DNA 접합부를 표적으로 한다. 모든 PCR 증폭은 T1 열 순환기 (바이오메트라(Biometra); 독일 괴틴겐 소재)에서 수행하였다. 100 ng의 게놈 DNA를 각 PCR 반응에서 주형으로 사용하였다.
글리신 맥스 (대두) 렉틴 유전자 (Le1), (진뱅크 수탁 번호 K00821)를 검출하기 위해 대두 특이적 PCR 시스템을 참고 시스템으로 사용하였다. 렉틴 유전자 PCR을 위한 프라이머 서열 및 PCR 순환 조건은 문헌 [Hird et al., (J. AOAC Int., 86: 66-71 (2003))]으로부터 조정하였다. 프라이머 서열은 SoyLec-F
Figure pct00029
및 SoyLec-R
Figure pct00030
이었다. 70 염기 쌍 (bp)의 대두에 특이적인 단편을 증폭시키기 위한 프라이머를 설계하였다.
내인성 대조군에 대한 PCR은 반응 당 100 ng의 게놈 DNA, 200 μM의 dNTP, 2 mM MgCl2, 500 nM의 각 프라이머 및 1 유닛의 택 DNA 폴리머라제를 이용하여 20 ㎕의 전체 부피로 수행하였다. 94℃에서의 초기 2 분 변성 이후, 94℃에서 30 초, 60℃에서 30 초, 및 72℃에서 30 초의 32 사이클을 수행한 후, 72℃에서 최종 1 분 연장시켰다.
상기 프라이머 및 조건을 이용한 반응을 벼 (오리자 사티바(Oryza sativa)), 평지씨 (브라시카 나푸스(Brassica napus)), 목화 (고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum), 2가지 상이한 라인), 메이즈 (지 마이스(Zea mays)), 대두 콘퀴스타, 대두 이벤트 127로부터 수득한 개개의 DNA 샘플, 및 DNA 부존재 주형 (대조군으로서)을 이용하여 수행하였고, 아가로스 겔 상에 구동하였다. 대두 식물 (콘퀴스타 및 이벤트 127)로부터의 DNA 샘플에서는 70 염기 쌍의 생성물이 수득된 반면, 다른 샘플에서는 어떤 증폭 생성물도 수득되지 않았다. 따라서, 내인성 대조군 프라이머는 대두로부터 게놈 DNA를 특이적으로 검출할 수 있다.
5' 삽입물-게놈 대두 DNA 접합부에서 이벤트 127 대두에 대한 이벤트 특이적 검정을 수립하였다. 전방향 프라이머 결합 부위는 천연 게놈 대두 DNA 내에 위치하였고
Figure pct00031
, 역방향 프라이머의 결합 부위는 127 삽입물 내에 위치하였다
Figure pct00032
. 반응은 116 염기 쌍 (bp)의 단편을 증폭시켰다.
이벤트 특이적 프라이머 (127-61F 및 127-176R)의 특이성은 100 ng 게놈 DNA (벼 (오리자 사티바(Oryza sativa)), 평지씨 (브라시카 나푸스(Brassica napus)), 목화 (고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum), 메이즈 (지 마이스(Zea mays)), 대두 GTS 40-3-2, 대두 305423, 대두 356043, 대두 A2704-12, 대두 콘퀴스타, 대두 이벤트 127, 및 주형 부존재 대조군)를 이용하여 결정하였다. 이벤트 특이적 반응을 위한 PCR은 반응 당 100 ng의 주형 DNA, 200 μM의 dNTP, 2 mM MgCl2, 500 nM의 각 프라이머 및 1 유닛의 택 DNA 폴리머라제를 이용하여 20 ㎕ 전체 부피로 수행하였다. 94℃에서 초기 2 분 변성 이후에, 94℃에서 30 초, 56℃에서 30 초, 및 72℃에서 30 초의 32 사이클을 수행한 후, 72℃에서 최종 1 분 연장시켰다.
샘플 내의 대두 이벤트 127의 부재 또는 존재는 에티듐 브로아미드 염색된 4％ 아가로스 겔에서 증폭된 이벤트 127 특이적 116 bp PCR 단편을 분리시켜 결정하였다.
이벤트 127 특이적 116 bp PCR 단편은 대두 이벤트 127 샘플에 상응하는 모든 반응물에서 수득된 반면, 다른 샘플 중에서는 어느 것에서도 127 특이적 PCR 단편이 수득되지 않았다. 따라서, 이벤트 특이적 프라이머 127-61F 및 127-176R은 이벤트 127 대두 식물로부터 DNA를 특이적으로 검출할 수 있다. 증폭된 이벤트 특이적 앰플리콘 서열을 이용한 뉴클레오티드 서열 검색은 DNA-DNA BLASTN (Basic Local Alignment Search Tool) 분석을 이용할 경우 어떤 100％ 동일한 매치도 확인하지 못했다.
127-61F 및 127-176R 프라이머를 이용하여 반응의 검출 한계를 결정하기 위해, 이벤트 127 DNA를 콘퀴스타 DNA로 후속 희석시켜 규정된 이벤트 127 DNA 함량 (100％, 1％, 0.5％, 0.1％, 0.05％, 및 0％)을 함유하는 표준물질을 생성하였다. 각 희석에서, 상기에서 논의한 조건을 이용하여 22회 반복된 PCR 증폭을 수행하였다. 시스템 당 하나의 DNA 주형 부존재 대조군 (NTC)을 구동시켜 시약의 순도를 확인하였다.
이벤트 127 특이적 PCR 생성물 (116 bp 단편)이 시험된 0.05％ 내지 100％ 이벤트 127 DNA 범위의 모든 희석물에서 검출되었다. 모든 비트랜스제닉 대두 샘플이 대두 특이적 PCR 증폭에서 예상되는 앰플리콘의 존재에 의해 증폭가능한 DNA를 갖는 것으로 밝혀졌지만, 예상된 바와 같이, 비트랜스제닉 대두 샘플 또는 주형 부존재 대조군 (NTC)에서는 어떤 이벤트 127 특이적 밴드도 검출되지 않았다. 127-61F 및 127-176R 프라이머를 이용하여 신뢰성있게 검출될 수 있는 샘플 내 가장 낮은 이벤트 127 DNA의 양은 0.05％이다.
127-61F 및 127-176R 프라이머를 이용한 이벤트 특이적 PCR에 의해 상대적 LOD가 95％ 신뢰성으로 0.1％ 미만인 것으로 나타났다. 또한, 127-61F 및 127-176R 프라이머는 0％ 이벤트 127 참조물 (100％ 비트랜스제닉 대두) 또는 주형 부존재 대조군 반응물에서는 어떤 검출가능한 PCR 생성물도 증폭시키지 않았다.
PCR 반응에서 어닐링 온도를 달리한 영향을 평가하기 위해, 4 개의 샘플 (비트랜스제닉 콘퀴스타 대두 DNA 배경에서 희석된 0％, 0.05％, 1％, 및 100％의 이벤트 127 대두 DNA)을 54℃ 및 58℃의 어닐링 온도로 3 중 실험으로 분석하였다. 그 결과 최적 어닐링 온도에서 ±2℃ 만큼 벗어난 어닐링 온도는 이벤트 127 특이적 DNA를 100％ 정확하게 검출하게 하는 것으로 나타났다.
상이한 PCR 플랫폼의 영향을 평가하기 위해, 3 개의 샘플 (비트랜스제닉 콘퀴스타 대두 DNA 배경에서 희석된 0.05％, 1％, 및 100％ 이벤트 127 대두 DNA)을 ABI 7500 신속 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈; 독일 다름스타드트 소재)을 이용하여 3 중으로 분석하였다. 0％ 이벤트 127 샘플 (100％ 콘퀴스타 DNA) 및 DNA 주형 부존재 샘플을 대조군으로서 포함시켰다.
그 결과 상이한 PCR 기기에서 127-61F 및 127-176R 프라이머를 이용한 이벤트 127 특이적 PCR 검정의 양호한 성능이 밝혀졌다. 상대적인 검출 한계는 모든 3가지의 반응물에서 0.05％였다. 예상되는 바와 같이, 비트랜스제닉 대두 DNA 배경 또는 주형 부존재 대조군에서 0％ 이벤트 127 DNA를 함유하는 샘플에서는 어떤 PCR 생성물도 검출되지 않았다.
실험실 사이의 검정 재현성 (실험실간 전환성)을 평가하기 위해, 별개의 실험실에서 2가지의 독립적인 실험을 수행하였다. 비트랜스제닉 대두 DNA 배경 내에 0.05％ 내지 100％ 이벤트 127 DNA 함량을 함유하는 상이한 샘플을 반응당 100 ng 게놈 DNA를 이용하여 DNA 엔진 이수 열 순환기 (바이오라드(BioRad); 독일 뮌헨 소재) 상에서 2 번의 독립적인 실험으로 2 중으로 분석하였다. 그 결과 실험실 사이의 검정 재현성 (실험실간 전환성)이 양호한 것으로 나타났다. 결과는 100％, 1％, 및 0.5％ 이벤트 127 DNA 샘플에 의해 100％ 양성인 결과로 나타났다. 또한, 0.1％ 및 0.05％ 이벤트 127 DNA 샘플에 의해서는 적어도 95％ 양성인 결과가 수득되었고 (상대적 LOD≤0.05％로 추정됨), 0％ 이벤트 127 DNA 샘플 또는 주형 부존재 대조군에서는 어떤 양성 결과도 수득되지 않았다.
127-61F 및 127-176R 프라이머를 이용한 정성적 이벤트 특이적, 겔 기반 PCR 검출 방법은 비트랜스제닉 대두 DNA 배경 내의 0.05％ 이벤트 127 DNA의 혼합물에서 이벤트 127 특이적 표적 서열을 검출할 수 있었다. 비트랜스제닉 대두 DNA 또는 다른 트랜스제닉 이벤트만을 함유하는 샘플은 어떤 것도 검출가능한 이벤트 127 특이적 PCR 생성물을 생성하지 못했고, 이로 인해 방법의 특이성이 실험적으로 입증되었다.
실시예 6: 이미다졸리논 및 스트로빌루린의 조합물과 함께 대두 이벤트 127을 이용하여 증가된 식물 건강
대두 이벤트 127 식물을 (1) 이미다졸리논 제초제 또는 제초제들, (2) 스트로빌루린 살진균제, 및 (3) 이미다졸리논 제초제 또는 제초제들과 스트로빌루린 살진균제의 조합물로 처리하였다.
대두 이벤트 127 식물을 25 cm 직경의 포트에서 5 식물/포트로 성장시켰다. 제초제(들) 및/또는 살진균제의 다양한 적용 (하기 표 X에 기재함)은 처리 1-16의 경우에는 시딩 후 제 23 일에, 처리 17-32의 경우에는 시딩 후 제 24 일에 행하였다.
Figure pct00033
Figure pct00034
제1, 제7, 및 제14 적용후 일수 (DAA)에, 식물에 대해 식물독성, 활기, 식물 키, 상대적 광합성, 상대적 SPAD (즉, 잎 클로로필/녹색도의 상대적 측정), 및 기공 전도도를 평가하였다.
하기 표 26에 나타낸 바와 같이, 이마자픽 또는 이마자픽 + 이마자피르에 의한 처리에 피라클로스트로빈을 첨가한 것은 순 광합성을 현저하게 증가시켰고, 전체적인 식물 녹화 (상대적인 SPAD)를 증가시켰고, 특정 시점에 피라클로스트로빈을 처리하지 않은 특정 처리에 비해 기공 전도도를 증가시켰다.
Figure pct00035
이는 AHAS-억제성 제초제 (또는 제초제들)과 피라클로스트로빈의 조합물이 이벤트 127 콩 식물에 놀라운 정도의 이점을 제공함을 보여준다.
NCIMB NCIMB41603 20081222
SEQUENCE LISTING <110> BASF AGROCHEMICAL PRODUCTS B.V. EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUARIA - EMBRAPA <120> SOYBEAN EVENT 127 AND METHODS RELATED THERETO <130> 13783-58 <140> <141> <150> 61/143,049 <151> 2009-01-07 <160> 70 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10656 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1 gtgagactcc aacagcaaga gtcactttgt agcccactca aataaatgtg aacattaata 60 ggtggatttg gacaatacag gccccttgtt ttaacaaggt cttgcagttt cacttaaaaa 120 ttcatagtag ttagaagaac taatattatg tgccaactga caataaaaga aaaaacaatc 180 tttccaattt atattacaca taagacacag cctgaaaaaa gaagagagca tgtatctgta 240 aacaagttag gcatgatgcc aaaggagcag cagcataaca aaacaaacga aaattacaag 300 aaaatatggc ttaccagcat ggttgctggg aaggactgga tcaagaagtg agcggcaatc 360 aacaagtgtt actacagcat acttttctct ttgataatca ggaaggcatc tagaggtcca 420 tgcagcaatc attccagctg cagcaagtgc cccacaaagt ttgatccctc ttgatttgca 480 tccctacatg atcttgcata attagcttaa acccatcaag ctagctacca gatcataagc 540 aaaaagtgag 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Claims (54)

  1. 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 대두 식물이 존재하는 경작 구역에 유효량의 비선택적인 제초제를 적용하는 것을 포함하는, 경작 구역에서 잡초를 방제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 이벤트 127 핵산 분자가 이벤트 127 특이적 핵산 분자를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 이벤트 127 핵산 분자가 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 비선택적인 제초제가 (A) AHAS-억제성 제초제, (B) AHAS-억제성 제초제들의 조합물, 또는 (C) (A) 또는 (B)와, EPSPS-억제성 제초제, GS 억제성 제초제, PPO-억제성 제초제, 옥신 제초제, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 제초제의 조합물을 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, AHAS-억제성 제초제가 이마자피르, 이마자픽 또는 이들의 임의의 조합물인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 잡초가 글리포세이트에 저항성인 방법.
  7. 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 대두 식물이 존재하는 농경지에 유효량의 AHAS-억제성 제초제를 적용하는 것을 포함하는, 농경지에서 글리포세이트 내성 잡초를 방제하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 대두 식물이 서열 1의 핵산 서열을 갖는 핵산 분자를 포함하는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 이벤트 127 핵산 분자가 이벤트 127 특이적 핵산 분자를 포함하는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, AHAS-억제성 제초제가 이마자피르 또는 이마자픽인 방법.
  11. 서열 1의 위치 1312 내지 6069의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  12. 제11항에 있어서, 재조합 핵산 구축물 내에 존재하는 단리된 핵산 분자.
  13. 제11항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 대두 식물.
  14. 서열 1의 뉴클레오티드 1302 내지 6079의 핵산 서열을 포함하는 이종 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 대두 식물.
  15. 제14항에 있어서, AHAS-억제성 제초제에 대해 저항성인 트랜스제닉 대두 식물.
  16. 이벤트 127 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 제1 및 제2 단리된 핵산 분자를 포함하는, 단리된 핵산 프라이머 쌍.
  17. 제16항에 있어서, 제1 단리된 핵산 분자가 서열 37, 39, 41, 43, 및 67로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단리된 핵산 프라이머 쌍.
  18. 제16항에 있어서, 제2 단리된 핵산 분자가 서열 38, 40, 42, 44, 및 68로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단리된 핵산 프라이머 쌍.
  19. 제16항에 있어서, 제1 단리된 핵산 분자가 서열 41을 포함하고, 제2 단리된 핵산 분자가 서열 42를 포함하는 것인 단리된 핵산 프라이머 쌍.
  20. 제19항에 있어서, 서열 1의 핵산 서열을 갖는 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 것인 단리된 핵산 프라이머 쌍.
  21. 제1 및 제2 핵산 프라이머를 포함하고, 제1 및 제2 핵산 프라이머는 이벤트 127 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 것인, 생물학적 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자를 확인하기 위한 키트.
  22. 제21항에 있어서, 제1 및 제2 핵산 프라이머가 서열 1의 핵산 서열 또는 그의 단편을 갖는 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 것인 키트.
  23. (a) 대두 DNA 및 이벤트 127 특이적 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 제1 및 제2 핵산 프라이머를 함유하는 생물학적 샘플을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    (b) 제1 및 제2 핵산 프라이머가 이벤트 127 특이적 핵산 분자를 증폭시키도록 하는 조건하에서 혼합물을 반응시키는 단계; 및
    (c) 증폭된 단편 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하고, 대두 이벤트 127 특이적 핵산 분자의 존재는 대두 식물이 이벤트 127 대두 식물임을 나타내는 것인, 이벤트 127 대두 식물을 확인하는 방법.
  24. (a) 대두 DNA 및 이벤트 127 특이적 핵산 분자에 혼성화될 수 있는 핵산 분자 프로브를 함유하는 생물학적 샘플을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    (b) 핵산 분자 프로브가 이벤트 127 특이적 핵산 분자에 혼성화되도록 하는 조건하에서 혼합물을 반응시키는 단계; 및
    (c) DNA에 대한 프로브의 혼성화를 검출하는 단계
    를 포함하고, 대두 DNA에의 핵산 분자 프로브의 혼성화의 존재는 이벤트 127 핵산 분자의 존재를 나타내는 것인, 이벤트 127 핵산 분자를 갖는 대두 식물을 확인하는 방법.
  25. AHAS-억제성 제초제의 유효량을 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 대두 식물 및 주변 구역에 적용하고, 이때 AHAS-억제성 제초제는 주변 구역에서 잡초 성장을 감소시키는 것인 단계; 및
    하나 이상 대두 식물로부터 종자를 수확하는 단계
    를 포함하는, 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 대두 식물의 수확량을 증가시키는 방법.
  26. (a) 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 대두 식물을 제2 대두 식물과 교배시키는 단계;
    (b) 단계 (a)의 교배로부터 종자를 수득하는 단계;
    (c) 종자로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계; 및
    (d) 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하고, 이벤트 127 핵산 분자의 존재는 종자가 AHAS-억제성-제초제-저항성 대두 식물을 생산할 수 있음을 나타내는 것인, AHAS-억제성-제초제-저항성 대두 식물의 육종 방법.
  27. 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 대두 식물의 종자.
  28. 제27항에 있어서, 이벤트 127 핵산 분자가 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 것인 종자.
  29. 제28항에 있어서, 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 종자의 대표적인 샘플이 NCIMB 수탁 번호 41603 하에 기탁된 것인 종자.
  30. 제27항의 종자를 성장시켜 생산한, 대두 식물 또는 그의 부분.
  31. (a) DNA 및 이벤트 127 특이적 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 제1 및 제2 핵산 프라이머를 함유하는 생물학적 샘플을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    (b) 제1 및 제2 핵산 프라이머가 이벤트 127 특이적 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자를 증폭시키도록 하는 조건하에서 혼합물을 반응시키는 단계; 및
    (c) 증폭된 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하고, 이벤트 127 특이적 핵산 분자의 존재는 샘플이 이벤트 127 핵산 분자를 함유함을 나타내는 것인, 생물학적 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 생물학적 샘플이 대두 식물로부터 수득된 것인 방법.
  33. (a) DNA 및 이벤트 127 특이적 핵산 분자에 혼성화될 수 있는 핵산 프로브를 함유하는 생물학적 샘플을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    (b) 프로브가 이벤트 127 특이적 핵산 분자에 혼성화되도록 하는 조건하에서 혼합물을 반응시키는 단계; 및
    (c) 혼성화된 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하고, 이벤트 127 특이적 핵산 분자의 존재는 샘플이 이벤트 127 핵산 분자를 함유함을 나타내는 것인, 생물학적 샘플에서 이벤트 127 핵산 분자를 검출하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 생물학적 샘플이 대두 식물로부터 수득된 것인 방법.
  35. (A) 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 대두 종자를 제공하는 단계;
    (B) 대두 종자가 발아되도록 하는 조건하에서 종자를 성장 배지에 식재하여 이벤트 127 핵산 분자를 포함하는 성장 대두 식물을 생산하는 단계; 및
    (C) 성장 배지, 종자, 또는 식물을 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 이들 서로간의 조합물, 및 이와 하나 이상의 다른 활성 성분과의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 제초 조성물과 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 대두 식물을 성장시키는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 단계 (C)를 단계 (B) 이전에 행하고, 이는 성장 배지를 제초 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 단계 (C)를 단계 (B) 이후에 행하고, 이는 식물이 성장 배지로부터 출아된 이후에 식물 또는 성장 배지를 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 제초 조성물이 (1) 하나 이상의 이미다졸리논 제초제, 또는 하나 이상의 술파미드 제초제, 또는 이들 둘 모두와, (2) 살진균제, 살세균제, 유기포스페이트 제초제, 술파미드 제초제, 벤조티아디아지논 제초제 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 활성 성분의 조합물을 포함하는 것인 방법.
  39. 제35항에 있어서, 제초 조성물이 이마자피르, 이마자픽, 또는 하기 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법:
    (A) 이마자피르 및 이마자픽의 조합물;
    (B) 이마자피르, 이마자픽, 및 벤타존의 조합물;
    (C) 이마자피르, 이마자픽, 및 피라클로스트로빈의 조합물;
    (D) 이마자피르, 이마자픽, 및 사플루페나실의 조합물;
    (E) 이마자피르, 이마자픽, 사플루페나실, 및 글리포세이트의 조합물;
    (F) 이마자피르 및 벤타존의 조합물;
    (G) 이마자피르 및 피라클로스트로빈의 조합물;
    (H) 이마자피르 및 사플루페나실의 조합물;
    (I) 이마자피르, 사플루페나실, 및 글리포세이트의 조합물;
    (J) 이마자피르 및 글리포세이트의 조합물;
    (K) 이마자픽 및 글리포세이트의 조합물;
    (L) 이마자픽, 사플루페나실, 및 글리포세이트의 조합물; 및
    (M) 사플루페나실 및 글리포세이트의 조합물.
  40. 제35항에 있어서, 이벤트 127 핵산 분자가 서열 1의 뉴클레오티드 1302 내지 6069의 핵산 서열을 갖는 것인 방법.
  41. 대두 식물로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및
    샘플에 대해, 이벤트 127 폴리펩티드를 검출할 수 있는 하나 이상의 면역학적 검정을 수행하는 단계
    를 포함하는, 샘플에서 이벤트 127 폴리펩티드를 검출하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 면역학적 검정이 ELISA (효소 연결된 면역흡착 검정), 면역염색 검정, 면역-조직화학 검정, 단백질 칩 검정, 방사성면역침전 검정, 신속 멤브레인 면역크로마토그래피 검정, 신속 스틱 면역크로마토그래피 검정, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  43. 표면을 갖는 고체 지지체; 및
    고체 지지체의 표면에 부착된 하나 이상의 이벤트 127 진단 분자
    를 포함하는, 생물 분자를 검출하는데 사용하기 위한 장치.
  44. 제43항에 있어서, 고체 지지체가 유리, 겔, 중합체, 플라스틱, 탄성체, 세라믹, 금속 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 (A), 또는 플레이트, 칩, 멤브레인, 막대, 스틱, 비드, 섬유, 매트, 격자, 직물, 용기 벽 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 (B), 또는 (A) 및 (B) 둘 모두로부터 선택된 (C)인 장치.
  45. 제43항에 있어서, 이벤트 127 진단 분자가 핵염기 올리고머 프로브, 압타머, 항체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 장치.
  46. 제45항에 있어서, 핵염기 올리고머 프로브가 핵산 유사체를 포함하는 것인 장치.
  47. 제45항에 있어서, 항체가 이벤트 127 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 보유하는 모노클로날 항체, 단일 쇄 항체 및 면역반응성 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 장치.
  48. 제43항에 있어서, 진단 분자(들)이 공유, 배위 및 비공유 결합으로부터 선택된 방법에 의해 표면에 고정된 것인 장치.
  49. 제43항에 있어서, 기판이 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 것인 장치.
  50. 제43항에 있어서, 다수의 한정된 구역의 어레이를 포함하며, 각각의 구역은 (a) 고체 지지체의 표면의 일부, 및 그에 부착된 (b) 하나 이상의 이벤트 127 진단 분자를 포함하는 것인 장치.
  51. 제43항에 있어서, 이벤트 127 진단 분자가 이벤트 127 핵산 분자, 이벤트 127 폴리펩티드, 그에 특이적인 항체, 상기의 검출가능하게 표지된 형태, 이들 중 임의의 것의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 장치.
  52. 제1항에 있어서, 스트로빌루린을 경작 구역에 적용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 스트로빌루린이 피라클로스트로빈을 포함하는 것인 방법.
  54. 제7항에 있어서, 스트로빌루린을 경작 구역에 적용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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