JP2012514472A - 大豆イベント127及びそれに関する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2009年1月7日提出の米国仮出願第61/143,049号の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、EFS−Webを介して電子的に提出され、テキストフォーマットで電子的に提出された配列表を含む。テキストファイルは、2010年1月5日に作成された「1378358.txt」と題された配列表を含み、サイズは47,052バイトである。このテキストファイルに含まれる配列表は本明細書の一部であり、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用する場合、「大豆」及び「大豆植物」はGlycine max植物を意味し、大豆を育種できるすべての植物種を含む。「大豆植物」という用語は、植物部位を含む。本明細書において使用する場合、「植物部位」という用語は、植物細胞、植物器官、植物プロトプラスト、植物が再生され得る植物細胞組織培養、植物のカルス、植物塊及び植物又は植物の一部中の無傷な植物細胞、例えば、胚、花粉、胚珠、種子、種子の鞘、葉、花、枝、果実、茎、根、根端、葯、子葉、胚軸などを含む。穀物は、種の成長又は再生以外の目的のための、商業的栽培者により生産される成熟種子を意味することを意図する。再生植物の子孫、誘導体、変異体及び突然変異体もまた本発明の範囲内に含まれ、イベント127核酸分子を含むこれらの部位も提供される。
トランスジェニックAHAS阻害剤耐性大豆植物に関する組成物及び方法を提供する。このような組成物は、イベント127大豆植物を含む。イベント127大豆植物は、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼの大型サブユニット遺伝子のシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(csr1−2)から本明細書に定義の大豆ゲノムへの挿入又は遺伝子移入によって、野生型又は非形質転換大豆植物から改変されている。いくつかの実施形態において、csr1−2遺伝子の大豆ゲノムへのインサートは、天然のセリン(S653N)ではなく653位に対応するアスパラギンを含有するAHASLタンパク質を有する、改変型のアセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)酵素の発現をもたらす。AHAS酵素は、分枝型アミノ酸の生合成にとって重要であり、特定の除草剤(AHAS阻害性除草剤)により阻害される。AHAS遺伝子の改変はこの阻害を克服し、したがって、広範囲のAHAS阻害性除草剤に対する耐性をもたらす。したがって、大豆イベント127植物は少なくとも1種のAHAS阻害性除草剤に対して耐性であり、又はイベント127核酸分子を欠いた大豆植物と比較して、少なくとも1種のAHAS阻害性除草剤に対して耐える量が増加する。
本発明は、単離されたイベント127核酸分子をさらに提供する。本明細書において使用する場合、「核酸分子」という用語の使用は、DNAを含む核酸分子に限定する意図のものではなく、任意のヌクレオチド、例えば、リボヌクレオチド及びリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの組合せを含むことができる。このようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは、天然発生分子及び合成類似体の両方を含む。核酸分子は、限定するものではないが、一本鎖型、二本鎖型、ヘアピン、ステム−アンド−ループ構造などを含むすべての配列型をさらに包含する。一実施形態において、イベント127核酸分子は、配列番号1の1312から6069位の核酸配列を有する核酸分子を含む。別の実施形態において、イベント127核酸分子は、配列番号1の1302から6079位のヌクレオチド配列を有する核酸分子を含む。
開示されたイベント127大豆植物は、さらなるイベント127大豆植物、例えば子孫植物を生み出す育種方法を使用する育種プログラムに使用できる。このような育種方法は、例えばさまざまな地理的領域における商業生産における使用又はさらなる大豆育種集団の生産のために、大豆植物の生産に使用できる。
イベント127形質と組み合わせた形質を有する大豆植物は、イベント127大豆植物から得られた植物材料又は部分の形質転換によって生産できる。さらなる形質を、技術者に利用可能な任意の形質転換方法を使用してイベント127大豆植物内に組み合わせることができる。したがって、イベント127大豆植物は、イベント127大豆植物内にさらなる異種核酸分子を導入する形質転換方法における使用のための植物材料の供給源として使用できる。例えば、形質質転換ベクターを調製し、対象遺伝子をイベント127大豆植物内に導入し、多数の導入形質を有する大豆植物を生産できる。
例えば、子孫及び誘導体を含む大豆植物から得られた試料由来の、生物学的試料中のイベント127核酸分子を特定及び/又は検出するための方法及び組成物を提供する。このような方法は、任意の生物学的材料においてイベント127領域又は核酸分子の特定及び/又は検出における使用を見出す。このような方法は、例えば、種子の純度を確認する方法及びイベント127核酸分子のための種地において種子をスクリーニングする方法を含む。一実施形態において、生物学的試料中の127インサート核酸分子を特定する方法を提供し、この方法は生物学的試料と、イベント127核酸分子を増幅できる第1及び第2の核酸プライマーとの混合物を形成するステップ、第1及び第2の核酸プライマーが大豆イベント127核酸分子を増幅可能な条件下で混合物を反応させるステップ、及び増幅されたイベント127核酸分子の存在又は不在を検出するステップを含む。いくつかの実施形態において、イベント127核酸分子はイベント127特異的核酸分子である。
本発明は、イベント127植物又はイベント127核酸分子を検出するキットをさらに提供し、このキットは、イベント127核酸分子を増幅できる第1及び第2の核酸プライマーを含む。得られた増幅されたイベント127核酸分子は、直接検出され得る、又はDNAを含有する生物学的試料との反応においてハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
本発明は、雑草又は望ましくない植物を防除するための方法及び組成物をさらに提供する。この方法は、一般的に有効量の1種又は複数種の非選択性除草剤を、1種又は複数種のイベント127大豆植物を含有する耕作地又は作物畑に適用するステップを含む。任意の雑草は開示の方法で防除できるが、いくつかの実施形態において、この方法は、AHAS阻害性除草剤に対して感受性の、地域又は田畑中の雑草又は望ましくない植物を、まず特定するステップを含むことができる。
1種又は複数種のイベント127大豆植物を有する耕作地に有効量のAHAS阻害性除草剤を適用するステップ、及び大豆植物に由来する種子の収穫ステップを含む、大豆植物(単数又は複数)の収率を上げる方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、大豆植物(単数又は複数)の収率の増加は、大豆植物(単数又は複数)の局所地域において成長する、通常は大豆植物(単数又は複数)と競合するであろう雑草の減少の結果である。
本発明は、開示された大豆127植物に適用するための農業用組成物をさらに提供する。このような組成物は、除草剤、防かび剤、抗菌剤、肥料などを含むことができる。一実施形態において、この農業用組成物は、1種若しくは複数種の除草剤又は1種若しくは複数種の除草剤と別の農業用組成物、例えば防かび剤、抗菌剤、肥料などとの組合せを含む、除草組成物である。
b1)脂質生合成阻害剤;
b2)アセト乳酸シンターゼ阻害剤(AHAS阻害剤);
b3)光合成阻害剤;
b4)プロトポルフィリノーゲン−IXオキシダーゼ阻害剤;
b5)白化除草剤;
b6)エノールピルビニルシキミ酸−3−リン酸合成酵素阻害剤(EPSP阻害剤);
b7)グルタミンシンターゼ阻害剤;
b8)7,8−ジヒドロプロテイン酸シンターゼ阻害剤(DHP阻害剤);
b9)有糸分裂阻害剤;
b10)長鎖脂肪酸合成の阻害剤(VLCFA阻害剤);
b11)セルロース生合成阻害剤;
b12)脱共役除草剤;
b13)オーキシン除草剤;
b14)オーキシン輸送阻害剤;
b15)ベンゾイルプロップ、フラムプロップ、フラムプロップ−M、ブロモブチド、クロルフルレノール、シンメチリン、メチルダイムロン、エトベンザニド、ホサミン、メタム、ピリブチカルブ、オキサジクロメホン、ダゾメット、トリアジフラム及び臭化メチルからなる群から選択される他の除草剤、並びに
それらがカルボキシ基を有するという条件で、活性化合物Bの農業的に許容可能な塩及び活性化合物Bの農業的に許容可能な誘導体
から選択されるさらなる活性化合物を含む。
b1)脂質生合成阻害剤の群から:クロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ、シハロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ−P、フェチアプロップ、フルアジホップ、フルアジホップ−P、ハロキシホップ、ハロキシホップ−P、イソキサピリホップ、メタミホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ−P、トリホップ、アロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、クロプロキシジム、シクロキシジム、プロホキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、ブチレート、シクロエート、ジアルレート、ジメピペレート、EPTC、エスプロカルブ、エチオレート、イソプロリネート、メチオベンカルブ、モリネート、オルベンカルブ、ペブレート、プロスルホカルブ、スルファルレート、チオベンカルブ、チオカルバジル、トリアルレート、ベルノレート、ベンフレセート、エトフメセート及びベンスリド;
b2)AHAS阻害剤の群から:アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロロスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメトスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、ピリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフルオキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム、ペノキススラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド及びピリチオバック;
b3)光合成阻害剤の群から:アトラトン、アトラジン、アメトリン、アジプロトリン、シアナジン、シアナトリン、クロラジン、シプラジン、デスメトリン、ジメタメトリン、ジプロペトリン、エグリナジン、イパジン、メソプラジン、メトメトン、メトプロトリン、プロシアジン、プログリナジン、プロメトン、プロメトリン、プロパジン、セブチラジン、セクブメトン、シマジン、シメトン、シメトリン、テルブメトン、テルブチラジン、テルブチリン、トリエタジン、アメトリジオン、アミブジン、ヘキサジノン、イソメチオジン、メタミトロン、メトリブジン、ブロマシル、イソシル、レナシル、テルバシル、ブロムピラゾン、クロリダゾン、ジミダゾン、デスメジファム、フェニソファム、フェンメジファム、フェンメジファム−エチル、ベンゾチアズロン、ブチウロン、エチジムロン、イソウロン、メタベンズチアズロン、モノイソウロン、テブチウロン、チアザフルロン、アニスロン、ブツロン、クロルブロムロン、クロレツロン、クロロトルロン、クロロクスロン、ジフェノクスロン、ジメフロン、ジウロン、フェヌロン、フルオメツロン、フルオチウロン、イソプロツロン、リヌロン、メチウロン、メトベンズロン、メトブロムロン、メトクスロン、モノリヌロン、モヌロン、ネブロン、パラフルロン、フェノベンズロン、シズロン、テトラフルロン、チジアズロン、シペルクアット、ジエタムクアット、ジフェンゾクアット、ジクアット、モルファムクアット、パラクアット、ブロモボニル、ブロモキシニル、クロロキシニル、ヨードボニル、イオキシニル、アミカルバゾン、ブロモフェノキシム、フルメジン、メタゾール、ベンタゾン、プロパニル、ペンタノクロル、ピリダート及びピリダホル;
b4)プロトポルフィリノーゲン−IXオキシダーゼ阻害剤の群から:アシフルオルフェン、ビフェノックス、クロメトキシフェン、クロルニトロフェン、エトキシフェン、フルオロジフェン、フルオログリコフェン、フルオロニトロフェン、ホメサフェン、フリルオキシフェン、ハロサフェン、ラクトフェン、ニトロフェン、ニトロフルオルフェン、オキシフルオルフェン、フルアゾラート、ピラフルフェン、シニドン−エチル、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルミプロピン、フルチアセット、チジアジミン、オキサジアゾン、オキサジアルジル、アザフェニジン、カルフェントラゾン、スルフェントラゾン、ペントキサゾン、ベンズフェンジゾン、ブタフェナシル、ピラクロニル、プロフルアゾル、フルフェンピル、フルプロパシル、ニピラクロフェン及びエトニプロミド;
式中、可変のR8からR13を以下のように定義する:R8、R10は水素、ハロゲン、C1〜C6−アルキル、C1〜C6−ハロアルキル、C1〜C6−アルコキシ、C1〜C6−ハロアルコキシ、C1〜C6−アルキルチオ、C1〜C6−アルキルスルフィニル又はC1〜C6−アルキルスルホニルであり、R9は、チアゾール−2−イル、チアゾール−4−イル、チアゾール−5−イル、イソオキサゾール−3−イル、イソオキサゾール−4−イル、10イソオキサゾール−5−イル、4,5−ジヒドロイソオキサゾール−3−イル、4,5−ジヒドロイソオキサゾール−4−イル及び4,5−ジヒドロイソオキサゾール−5−イルからなる群から選択される複素環基であり、述べた9個の基は、非置換であっても又はハロゲン、C1〜C4−アルキル、C1〜C4−アルコキシ、C1〜C4−ハロアルキル、C1〜C4−ハロアルコキシ又はC1〜C4−アルキルチオによる一置換若しくは多置換、例えば一、二、三、若しくは四置換であってもよく、R11は、水素、ハロゲン又はC1〜C6−アルキルであり、R12は、C1〜C6−アルキルであり、R13は水素又はC1〜C6−アルキルである;
b6)EPSPシンターゼ阻害剤の群から:グリホセート;
b7)グルタミンシンターゼ阻害剤の群から:グルホシネート及びビラナホス;
b8)DHPシンターゼ阻害剤の群から:アスラム;
b9)有糸分裂阻害剤の群から:ベンフルラリン、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、フルクロラリン、イソプロパリン、メタプロパリン、ニトラリン、オリザリン、ペンジメタリン、プロジアミン、プロフルラリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス、ジチオピル、チアゾピル、プロピザミド、テブタム、クロルタール、カルベタミド、クロルブファム、クロルプロファム及びプロファム;
b10)VLCFA阻害剤の群から:アセトクロル、アラクロル、ブタクロル、ブテナクロル、デラクロル、ジエタチル、ジメタクロル、ジメテナミド、ジメテナミド−P、メタザクロル、メトラクロル、S−メトラクロル、プレチラクロル、プロパクロル、プロピソクロル、プリナクロル、テルブクロル、テニルクロル、キシラクロル、アリドクロル、CDEA、エプロナズ、ジフェナミド、ナプロパミド、ナプロアニリド、ペトキサミド、フルフェナセット、メフェナセット、フェントラザミド、アニロホス、ピペロホス、カフェンストロール、インダノファン及びトリジファン;
b11)セルロース生合成阻害剤の群から:ジクロベニル、クロルチアミド、イソオキサベン及びフルポキサム;
b12)脱共役剤除草剤の群から:ジノフェナート、ジノプロプ、ジノサム、ジノセブ、ジノテルブ、DNOC、エチノフェン及びメジノテルブ;
b13)オーキシン系除草剤の群から:クロメプロップ、2,4−D、2,4,5−T、MCPA、MCPAチオエチル、ジクロルプロップ、ジクロルプロップ−P、メコプロップ、メコプロップ−P、2,4−DB、MCPB、クロラムベン、ジカンバ、2,3,6−TBA、トリカムバ、キンクロラック、キンメラック、クロピラリド、フルロキシピル、ピクロラム、トリクロピル及びベナゾリン;
b14)オーキシン輸送阻害剤の群から:ナプタラム、ジフルフェンゾピル;
b15)ベンゾイルプロップ、フラムプロップ、フラムプロップ−M、ブロモブチド、クロルフルレノール、シンメチリン、メチルジムロン、エトベンザニド、ホサミン、メタム、ピリブチカルブ、オキサジクロメホン、ダゾメット、トリアジフラム及び臭化メチル
である。
10重量部のAHAS阻害性除草剤を90重量部の水又は水溶性溶媒に溶解する。代替として、湿潤剤又は他の補助剤を加える。AHAS阻害性除草剤は水で希釈すると溶解し、それによって10%(w/w)のAHAS阻害性除草剤を含む製剤を得る。
20重量部のAHAS阻害性除草剤を70重量部のシクロヘキサンに溶解し、10重量部の分散剤、例えばポリビニルピロリドンを加える。水で希釈して分散液を得、それによって、20%(w/w)のAHAS阻害性除草剤を含む製剤を得る。
15重量部のAHAS阻害性除草剤を7重量部のキシレンに溶解し、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム及びエトキシル化ヒマシ油(それぞれ5重量部)を加える。水で希釈してエマルジョンを得、それによって15%(w/w)のAHAS阻害性除草剤を含む製剤を得る。
25重量部のAHAS阻害性除草剤を35重量部のキシレンに溶解し、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム及びエトキシル化ヒマシ油(それぞれ5重量部)を加える。この混合物に、乳化装置(例えばUltraturrax)を用いて30重量部の水を導入し、均質なエマルジョンを得る。水で希釈してエマルジョンを得、それによって25%(w/w)のAHAS阻害性除草剤を含む製剤を得る。
振とうさせたボールミルにおいて、20重量部のAHAS阻害性除草剤を粉砕し、10重量部の分散剤、湿潤剤及び70重量部の水又は有機溶媒を加えて微細なAHAS阻害性除草剤の懸濁液を得る。水で希釈してAHAS−阻害性除草剤の安定な懸濁液を得、それによって20%(w/w)のAHAS阻害性除草剤を含む製剤を得る。
50重量部のAHAS阻害性除草剤を、細かく粉砕し、50重量部の分散剤及び湿潤剤を加えて、技術装置(例えば、押し出し機、噴霧塔、流動床)を用いて水分散性又は水溶性の顆粒として作製する。水で希釈してAHAS−阻害性除草剤の安定な懸濁液又は溶液を得、それによって50%(w/w)のAHAS阻害性除草剤を含む製剤を得る。
75重量部のAHAS阻害性除草剤をローターステーターミルにおいて粉砕し、25重量部の分散剤、湿潤剤及びシリカゲルを加える。水で希釈してAHAS−阻害性除草剤の安定な懸濁液又は溶液を得、それによって75%(w/w)のAHAS阻害性除草剤を含む製剤を得る。
振とうさせたボールミルにおいて、20重量部のAHAS阻害性除草剤を粉砕し、10重量部の分散剤、1重量部のゲル化湿潤剤及び70重量部の水又は有機溶媒を加えて、微細なAHAS阻害性除草剤懸濁液を得る。水で希釈してAHAS阻害性除草剤の安定な懸濁液を得、それによって20%(w/w)のAHAS阻害性除草剤を含む製剤を得る。このゲル製剤は、種子処理としての使用に適している。
5重量部のAHAS阻害性除草剤を微細に粉砕し、95重量部の微細に分割したカオリンと密に混合する。これにより、5%(w/w)のAHAS阻害性除草剤を有するダスト散布可能な製品が得られる。
0.5重量部のAHAS阻害性除草剤を微細に粉砕し、95.5重量部の担体を合わせ、それによって0.5%(w/w)のAHAS阻害性除草剤を含む製剤が得られる。通常の方法は、押し出し、噴霧乾燥又は流動床である。これにより顆粒を得、希釈せずに葉面使用に適用される。
トランスジェニック大豆(Glycine max L.)植物を、イミダゾリノン系除草剤に抵抗性をもたらす突然変異アセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニット(AHASL)コーディング配列を含有する、プラスミドpAC321由来のDNAの線状化断片(PvuII)を使用して開発した。pAC321プラスミドは、653位に対応する位置に、天然のセリンではなくアスパラギンを有する、突然変異シロイヌナズナAHASL遺伝子(csr1−2)(S653N)コーディング配列を含有する。AHAS(S653N)コーディング配列は、天然のシロイヌナズナAHASプロモーター配列及び転写終止配列の調節下にある。例えば、米国特許公開第2005/0034187号を参照されたく、この全体は参照により本明細書に組み込まれる。PvuII断片は、シロイヌナズナAHASLプロモーター、除草剤耐性シロイヌナズナAHASLl(csr1−2)コーディング配列及びシロイヌナズナAHASLターミネーターを含む。このプロモーター、コーディング配列及びターミネーターのカセットは、本明細書においてcsr1−2カセットと称される。
以下の表1に示すように、大豆イベント127の初代形質転換体を、によりT4世代まで維持した。
A:DNA及びRNAの単離及び定量の方法
DNAを、改変臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)法(Carlsonら、1991年)を介して大豆の葉組織から単離した。シリカゲル乾燥させた葉の組織を液体窒素で凍結し、Autogrinder(Autogen;Holliston、MA)により粉砕した。粉砕した組織を予備加熱した、2%(w/v)のCTAB、100mMのTris−HCl、1.4MのNaCl、1%(w/v)のポリビニルピロリドン(PVP)、20mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、pH9.5(5ml/60mg乾燥葉組織)及びβ−メルカプトエタノール(10μl/ml緩衝液)からなる抽出緩衝液とともに、74℃において20分間インキュベートした。2440×gにおいて10分間の遠心分離後、上清を、等量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)で2回抽出した。DNAを、0.7容量のイソプロパノールで沈殿させ、0.5mg/mlのRNase A(Invitrogen;Carlsbad、CA)を、最終濃度約500ng/μlになるように加えたTE緩衝液(10mMのTris−HCl、1mMのEDTA、pH8.0)に溶解した。単離DNAを、Hoechst33258染料(Invitrogen)を用い、仔ウシ胸腺DNA(Invitrogen)をDNA基準として使用して、Packard FluoroCount(商標)BF10000 Microplate Fluorometer(Packard Instrument Company;Meriden、CT)において蛍光光度計ユーザーマニュアルに従って定量した。
トランス遺伝子プローブとして使用するDNA断片の位置を、図1Bに示す。ベクター骨格プローブを、図5C示す。特定されたトランス遺伝子及びベクタープローブの作製に使用するためのPCRプライマーを、以下の表3に提供する。これら5種の重複プローブは全プラスミドに及ぶ。具体的には、プローブ1はAHASLプロモーター領域に及び、プローブ2はcsr1−2コーディング配列、プローブ3はAHASL終止領域並びにプローブ4及び5は、一緒に完全ベクター骨格(VB)を含む。プローブDNA断片を、プラスミドpAC321を鋳型として使用してPCR増幅によって作製した。プローブ(それぞれ25〜50ng)を、Rediprime(標識)II DNA Labeling System(Amersham;Piscataway、NJ)を使用して製造業者の指示書に従って、50μCiの(α−32P)−dCTP(3000Ci/mmol)(MP Biomedicals;Irvine、CA)で放射標識した。標識したプローブを、Spin−X(登録商標)Centrifuge Tube Filter(Corning Costar Corporation;Acton、MA)を用いて精製した。
サザンブロット分析を使用して、csr1−2発現カセットのコピー数及び完全性を決定し、イベント127中のプラスミド骨格の不在を確認した。制限酵素NcoI、SpeI及びXbaIを使用して、イベント127植物及び非トランスジェニック対照のConquistaから得たゲノムDNAを消化した。pAC321 PvuII形質転換断片を、図3において大豆イベント127を用いてアライメントした。大豆を形質転換させるために使用したプラスミドpAC321由来のPvuII断片を図3の上部に示す。大豆イベント127中のトランス遺伝子インサートに含有されないこの断片の部分を、対角の縞模様で満たされた四角で示す。大豆イベント127中のトランス遺伝子インサート及び隣接ゲノム大豆DNAの特徴を図の下部に示す。PvuII形質転換断片のマップ及びトランス遺伝子挿入領域のマップの間に描かれた垂直の破線の間のDNAは両方のDNA断片に共通である。サザンブロット分析に関する制限部位を示す。PvuII形質転換断片のナンバリングシステムは、図1のpAC321プラスミドマップのナンバリングシステムに対応する。大豆イベント127インサートに関するナンバリングシステムは、1番が、大豆ゲノム隣接配列(灰色の四角で示された隣接配列)の5’末端の第1ヌクレオチドである図8のナンバリングシステムに対応する。csr1−2カセット中の単一のNcoI制限部位は、csr1−2コーディング配列の5’末端に位置し、NcoIを有するイベント127のゲノムDNAの消化は、csr1−2カセット由来のDNAを含有する2つの断片を作製することが予測された。両方の断片はcsr1−2カセット中のNcoI部位及び隣接大豆ゲノム配列中の最も近いNcoI部位により画定される。5’隣接大豆ゲノム配列中に1つのSpeI制限部位及びイベント127中のAHASL3’UTRの下流に2つのSpeI制限部位がある。XbaI制限部位は、完全csr1−2発現カセットに隣接する。サザンハイブリダイゼーションにより検出されることが期待されるDNA断片の数及びサイズを、以下の表7に記載する。
インバースPCRを使用して、挿入されたcsr1−2カセットに隣接する大豆ゲノムDNAの配列を得た(Trigliaら、1988年)。イベント127のF7世代由来のゲノムDNA(1μg)を、15ユニットのXbaI、SpeI、HindIII、NcoI、EcoRI、BamHI又はBglIIを用いて20μlの反応量で3時間消化した。XbaI、HindIII、NcoI及びEcoRIの消化物を、65℃において、20分間インキュベートし、酵素を不活性化し、一方BamHI及びBglII消化物はイソプロパノール沈殿に供した。T4DNAリガーゼ(800ユニット、New England Biolabs)を、各消化反応液に直接加えた。さらに水を加え、反応量を200μlにした。反応液を16℃において一晩インキュベートし、環状化DNAをインバースPCRの鋳型として直接使用した。トランス遺伝子隣接配列を、GeneAmp(登録商標)XL PCRキット(Applied Biosystems; Foster City、CA)を用いて増幅した。100μlのプライマリーPCRは、1×製造業者に供給されたPCR緩衝液、200μMの各dNTP、25ngの環状化ゲノムDNA断片、1.2mMの酢酸マグネシウム、2ユニットのrTth DNAポリメラーゼXL及び0.2μMの各プライマリーPCRプライマーを含有した。100μlネスティッドPCRは、プライマリーPCRの1:50希釈液の10μlを鋳型として使用したことを除き、プライマリーPCRと同じ成分を含有した。プライマリーPCR及びネスティッドPCRを、GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)において実施した。プライマー及びネスティッドプライマーの配列を、以下の表4に提供する。初めの94℃における1分の変性ステップ後、94℃、94℃15秒、60℃8分及び72℃2分を30サイクル実施し、その後、最終の72℃において、10分間の伸長ステップを続けた。
6種のPCRにより作製されたアンプリコンを、全インサート及び近接大豆ゲノム配列を含むジャンクションに及ぶように設計した(図7)。挿入されたDNAの完全配列を、これらの6種の重複断片をPCR増幅し、その後DNA配列分析することによって得た。配列PCR増幅に使用したプライマーの配列を、表5に提供する。形質転換断片の配列に対する配列不一致を含有するPCRアンプリコンを、rTth DNAポリメラーゼXLを用いて再増幅した。PCR産物をZymo DNA Clean&Concentrator(商標)5を用いて精製し、両方の鎖の配列に関して、直接シーケンシング及びプライマーウォーキンングによってPhred 40のクオリティレベルまで配列決定した。DNAシーケンシングを上記のように実施した。
イベント特異的PCRを、DNA隣接配列及びインサート配列の両方から得られた情報を使用して開発した。4対のプライマーを設計し、プライマー中の個々の対の1つのプライマーは5’大豆隣接配列にあり、他方はcsr1−2カセット中にある。イベント特異的PCRに使用するプライマーの配列を、以下の表10に提供する。
イベント特異的定量的PCRを検出のために設計し、イベント127核酸大豆が試料中に存在する核酸の全量の0.08%及び5%の間で試料中に存在する場合、種子の混合バッチ中のイベント127核酸を正確且つ精密に定量する。この方法において、介在するプローブとともに2対のプライマーを使用する。イベント特異的PCRに使用するプライマーの配列を、以下の表11に提供する。
3つの鋳型のない対照(NTC)/系を実施し、試薬の純度を検証する。各試料(未知)を、100ngゲノムDNA/反応液で分析する。
RT−PCRを実施して、csr1−2コーディング配列の一部の376bpの重複又は大豆イベント127中に存在するAtSec61γ遺伝子のどちらが転写されたかを決定した。全RNAを、Qiagen OneStep RT−PCR Kit(Qiagen)を使用するRT−PCRの鋳型として使用した。AtSec61γコーディング配列のRT−PCR分析に関して、葉及び根に由来するシロイヌナズナの全RNA試料を陽性対照としてさらに使用した。シロイヌナズナの全RNA試料は、TRIzol試薬(Invitrogen)を用いてDNase処理を行わずに調製した。RT−PCR反応液は、全容量50μl中に1×Qiagen OneStep RT−PCR Buffer、400μMの各dNTP、0.6μMの各プライマー、2μlのQiagen OneStep RT−PCR Enzymeミックス、及び500ng若しくは125ngの全RNAを含有した。RT−PCRを、GeneAmp PCR System 9700を使用して実施した。50℃におけるリバース転写ステップの30分後、PCR増幅を、以下の条件下:95℃における15分の変性ステップ1サイクル;94℃で30秒、64℃で30秒及び72℃で1分を30サイクル並びに;72℃における10分間の伸長を1サイクルで実施した。RT−PCR分析に使用したプライマーの配列を、以下の表12に提供する。
3種のPCR反応を実施し、非トランスジェニック大豆品種Conquista中の挿入部位を特徴付けた。本研究に使用したPCRプライマーは、イベント127のゲノム中の新規な発現カセットに隣接する5’及び3’ゲノム領域に関して決定されたDNA配列に由来した。
DNA配列アセンブリを、Staden Pregap4及びGap4(Staden、1996年)を用いて実施した。クローニングし、期待したインサート配列のアライメントを、LI−COR AlignIRソフトウェア(Licor Biotechnology;Lincoln、NE)を用いて実施した。隣接配列を、利用可能な公共のDNAデータベース(GenBank+EMBL+DDBJ+PDB配列すべて)及びBLAST分析(Altschulら、1997年)を介したBASF Plant Science所有のDNAデータベースに対して問い合わせた。30コドン又はそれ以上のオープンリーディングフレームを、Vector NTI v9.0のORF分析機能(Invitrogen)を用いて特定した。
A.(例4A):発芽後適用
3つの野外実験を、ブラジルの中心地域の3か所の異なる場所:Santo Antonio de Posse、SP、Embrapa RiceのAgricultural Research Station(ARS)及びSanto Antonio de Goias、GOのBeans(CNPAF)及びUberaba、MGのEmbrapa−Epamig(CTTP)に設置した。各用地の雑草のまん延を、表13に提示した。
3つの野外実験を、ブラジルの中心地域の3か所の異なる場所:Santo Antonio de Posse、SP、Embrapa RiceのAgricultural Research Station(ARS)及びSanto Antonio de Goias、GOのBeans(CNPAF)及びUberaba、MGのEmbrapa−Epamig(CTTP)に設置した。これらの各用地の雑草のまん延を、表17に提示した。
イミダゾリノン系除草剤が耕作地で成長する望ましくないグリホセート耐性の雑草及び作物の防除に使用できるかどうかを決定するために、温室実験を実施した。グリホセート抵抗性植物の種子を、発芽後適用のためにメトロミックス及び発芽前適用のためにNorth Carolinaの土並びに遅延放出性肥料を土壌表面に使用して、4.5インチのポットに植え付けた。植物を、葉上潅水を用いて温室で維持した。
非トランスジェニック同系対照(ヌル)及び他の非トランスジェニック(既存)大豆品種(基準)と比較した、イミダゾリノン系除草剤に対する耐性を有するトランスジェニック大豆系(イベント127)の農学的、表現型的及び生物季節学的特徴を評価するために、野外試験を実施した。この目的のために、市販の大豆生産の代表的地域であり、遺伝子型が適応されるブラジルの現場において研究を実施した。
定性的ゲルに基づくPCRアッセイ法を、種子及び穀物試料中のイベント127核酸の検出に使用するために開発した。この方法は、非トランスジェニック大豆のDNAの混合物中の0.05%のイベント127大豆のDNAを検出できた。
大豆イベント127植物を、(1)イミダゾリノン系除草剤(単数又は複数)、(2)ストロビルリン系防かび剤及び(3)イミダゾリノン系除草剤(単数又は複数)とストロビルリン系防かび剤と組合せを用いて処理した。
Claims (54)
- イベント127核酸分子を含む大豆植物を有する耕作地に、有効量の非選択性除草剤を適用するステップを含む、耕作地において雑草を防除する方法。
- イベント127核酸分子がイベント127特異的核酸分子を含む、請求項1に記載の方法。
- イベント127核酸分子が配列番号1の核酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 非選択性除草剤が、(A)AHAS阻害性除草剤、(B)AHAS阻害性除草剤の組合せ、又は(C)(A)若しくは(B)と、EPSPS阻害性除草剤、GS阻害性除草剤、PPO阻害性除草剤、オーキシン系除草剤及びそれらの組合せからなる群から選択される除草剤との組合せを含む、請求項1に記載の方法。
- AHAS阻害性除草剤が、イマザピル、イマザピック又はそれらの任意の組合せを含む、請求項4に記載の方法。
- 雑草がグリホセートに抵抗性である、請求項1に記載の方法。
- イベント127核酸分子を含む大豆植物を有する作物畑に、有効量のAHAS阻害性除草剤を適用するステップを含む、作物畑においてグリホセート耐性雑草を防除する方法。
- 大豆植物が配列番号1の核酸配列を有する核酸分子を含む、請求項7に記載の方法。
- イベント127核酸分子がイベント127特異的核酸分子を含む、請求項7に記載の方法。
- AHAS阻害性除草剤が、イマザピル又はイマザピックである、請求項7に記載の方法。
- 配列番号1の1312から6069位の核酸配列を含む単離核酸分子。
- 核酸分子が組み換え核酸構築体である、請求項11に記載の単離核酸分子。
- 請求項11に記載の単離核酸分子を含む大豆植物。
- 配列番号1のヌクレオチド1302から6079位の核酸配列を含む異種核酸分子を含む、トランスジェニック大豆植物。
- 大豆植物がAHAS阻害性除草剤に抵抗性である、請求項14に記載のトランスジェニック大豆植物。
- イベント127核酸分子を増幅できる第1及び第2の単離核酸分子を含む、核酸プライマーの単離対。
- 第1の単離核酸分子が配列番号37、39、41、43及び67からなる群から選択される、請求項16に記載の核酸プライマーの単離対。
- 第2の単離核酸分子が配列番号38、40、42、44及び68からなる群から選択される、請求項16に記載の核酸プライマーの単離対。
- 第1の単離核酸分子が配列番号41を含み、第2の単離核酸分子が配列番号42を含む、請求項16に記載の核酸プライマーの単離対。
- 前記対が、配列番号1の核酸配列を有する核酸分子を増幅できる、請求項19に記載の核酸プライマーの単離対。
- 第1及び第2の核酸プライマーを含み、第1及び第2の核酸プライマーがイベント127核酸分子を増幅できる、生物学的試料中のイベント127核酸分子を特定するキット。
- 第1及び第2の核酸プライマーが、配列番号1の核酸配列を有する核酸分子又はその断片を増幅できる、請求項21に記載のキット。
- (a)大豆DNA及びイベント127特異的核酸分子を増幅できる第1及び第2の核酸プライマーを含有する生物学的試料を含む混合物を形成するステップ、
(b)第1及び第2の核酸プライマーが、イベント127特異的核酸分子を増幅できる条件下で混合物を反応させるステップ、並びに
(c)増幅された断片の核酸分子の存在を検出し、大豆イベント127特異的核酸分子の存在が、大豆植物がイベント127大豆植物であることを示すステップ
を含む、イベント127大豆植物を特定する方法。 - (a)大豆DNA及びイベント127特異的核酸分子とハイブリダイズできる核酸分子プローブを含有する生物学的試料を含む混合物を形成するステップ、
(b)核酸分子プローブと、イベント127特異的核酸分子とがハイブリダイズできる条件下で混合物を反応させるステップ、並びに
(c)プローブとDNAのハイブリダイゼーションを検出し、核酸分子プローブと大豆DNAとのハイブリダイゼーションの存在が、イベント127核酸分子の存在を示すステップ
を含む、イベント127核酸分子を有する大豆植物を特定する方法。 - イベント127核酸分子を含む大豆植物において収率を増加させる方法であって、
有効量のAHAS阻害性除草剤を、イベント127核酸分子を含む1種又は複数種の大豆植物及び周辺地域に適用し、AHAS阻害性除草剤が、周辺地域における雑草の成長を減少させるステップ、並びに
1種又は複数種の大豆植物から種子を収穫するステップを含む方法。 - (a)イベント127核酸分子を含む大豆植物と第2の大豆植物とを交雑するステップ、
(b)ステップ(a)の交雑種から種を得るステップ、
(c)種子からDNA試料を得るステップ、並びに
(d)試料中のイベント127核酸分子の存在を検出し、イベント127核酸分子の存在が、この種子がAHAS阻害性除草剤抵抗性大豆植物を生み出すことができることを示すステップを含む、AHAS阻害性除草剤抵抗性大豆植物を育種する方法。 - イベント127核酸分子を含む大豆植物の種子。
- イベント127核酸分子が配列番号1の核酸配列を含む、請求項27に記載の種子。
- イベント127核酸分子を含む種子の代表的試料がNCIMB受託番号41603で寄託された、請求項28に記載の種子。
- 請求項27に記載の種子を成長させることによって生産される、大豆植物又はそれらの部位。
- (a)DNA並びにイベント127特異的核酸分子を増幅できる第1及び第2の核酸プライマーを含有する生物学的試料を含む混合物を形成するステップ、
(b)第1及び第2の核酸プライマーがイベント127特異的核酸分子を含む核酸分子を増幅できる条件下で混合物を反応させるステップ、並びに
(c)増幅された核酸分子の存在を検出し、イベント127特異的核酸分子の存在が、この試料がイベント127核酸分子を含有することを示すステップ
を含む、生物学的試料中のイベント127核酸分子の存在を検出する方法。 - 生物学的試料が大豆植物から得られる、請求項31に記載の方法。
- (a)DNA及びイベント127特異的核酸分子とハイブリダイズできる核酸プローブを含有する生物学的試料を含む混合物を形成するステップ、
(b)プローブと、イベント127特異的核酸分子とがハイブリダイズできる条件下で混合物を反応させるステップ、並びに
(c)ハイブリダイズされた核酸分子の存在を検出し、イベント127特異的核酸分子の存在が、この試料がイベント127核酸分子を含有することを示すステップ
を含む、生物学的試料中のイベント127核酸分子を検出する方法。 - 生物学的試料が大豆植物から得られる、請求項33に記載の方法。
- (A)イベント127核酸分子を含む大豆種子を提供するステップ、
(B)種子が発芽し、イベント127核酸分子を含む成長大豆植物を生ずることができる条件下で、大豆種子を成長培地に播くステップ、並びに
(C)成長培地、種子又は植物を、イミダゾリノン系除草剤、スルホニル尿素系除草剤、それらの相互の組合せ及びそれらと少なくとも1種の他の有効成分との組合せからなる群から選択される少なくとも1種の成分を含む除草剤組成物と接触させるステップ
を含む、大豆植物を成長させる方法。 - ステップ(C)をステップ(B)の前に実施し、成長培地と除草剤組成物を接触させるステップを含む、請求項35に記載の方法。
- ステップ(C)をステップ(B)の後に実施し、植物又は成長培地を、植物が成長培地から発芽した後で接触させるステップを含む、請求項35に記載の方法。
- 除草剤組成物が、(1)少なくとも1種のイミダゾリノン系除草剤又は少なくとも1種のスルファミド系除草剤或いは両方と、(2)防かび剤、抗菌剤、有機リン酸エステル系除草剤、スルファミド系除草剤、ベンゾチアジアジノン系除草剤及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1種の他の有効成分との組合せを含む、請求項35に記載の方法。
- 除草剤組成物が、イマザピル若しくはイマザピック、又は
(A)イマザピル及びイマザピックの組合せ;
(B)イマザピル、イマザピック、及びベンタゾンの組合せ;
(C)イマザピル、イマザピック、及びピラクロストロビンの組合せ;
(D)イマザピル、イマザピック、及びサフルフェナシルの組合せ;
(E)イマザピル、イマザピック、サフルフェナシル、及びグリホセートの組合せ;
(F)イマザピル及びベンタゾンの組合せ;
(G)イマザピル及びピラクロストロビンの組合せ;
(H)イマザピル及びサフルフェナシルの組合せ;
(I)イマザピル、サフルフェナシル、及びグリホセートの組合せ;
(J)イマザピル及びグリホセートの組合せ;
(K)イマザピック及びグリホセートの組合せ;
(L)イマザピック、サフルフェナシル、及びグリホセートの組合せ;並びに
(M)サフルフェナシル及びグリホセートの組合せ
のうちの任意の1つを含む、請求項35に記載の方法。 - イベント127核酸分子が、配列番号1のヌクレオチド1302から6069位の核酸配列を有する、請求項35に記載の方法。
- 大豆植物から生物学的試料を得るステップ、並びに
試料について、少なくとも1種の免疫学的アッセイを実施し、このアッセイがイベント127ポリペプチドを検出できるステップ
を含む、試料中のイベント127ポリペプチドを検出する方法。 - 免疫学的アッセイが、ELISA(酵素結合免疫吸着測定法)、免疫染色、免疫組織化学法、タンパク質チップアッセイ、放射性免疫沈降法、イムノクロマト膜による迅速アッセイ、イムノクロマトスティックによる迅速アッセイ及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項41に記載の方法。
- 表面を有する固体支持体、及び
固体支持体の表面に結合した少なくとも1種のイベント127診断分子
を含む、生体分子の検出に使用する装置。 - 固体支持体が、(A)ガラス、ゲル、ポリマー、プラスチック、弾性素材、セラミック、金属及びそれらの組合せからなる群から選択される、若しくは(B)プレート、チップ、膜、棒、スティック、ビーズ、ファイバー、マット、格子、布、血管壁及びそれらの組合せからなる群から選択される、又は(C)(A)及び(B)の両方から選択される、請求項43に記載の装置。
- イベント127診断分子が、核酸塩基のオリゴマープローブ、アプタマー、抗体及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項43に記載の装置。
- 核酸塩基のオリゴマープローブが核酸類似体を含む、請求項45に記載の装置。
- 抗体が、モノクローナル抗体、一本鎖抗体及びイベント127ポリペプチドに対する結合特異性を保有する免疫反応性の抗体断片からなる群から選択される、請求項45に記載の装置。
- 診断分子(単数又は複数)が、共有結合、配位結合及び非共有結合から選択される方法によって表面に固定されている、請求項43に記載の装置。
- 基質が、免疫クロマトグラフ用ストリップを含む、請求項43に記載の装置。
- 装置が複数の画定されたゾーンのアレイを含み、個々のゾーンが(a)固体支持体の表面の一部及びそれに結合する(b)少なくとも1種のイベント127診断分子を含む、請求項43に記載の装置。
- イベント127診断分子が、イベント127核酸分子、イベント127ポリペプチド、それらに特異的な抗体、前述の検出可能に標識された形態、これらの任意の誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項43に記載の装置。
- 前記方法が、ストロビルリンを耕作地に適用するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ストロビルリンがピラクロストロビンを含む、請求項52に記載の方法。
- 前記方法が、ストロビルリンを耕作地に適用するステップをさらに含む、請求項7に記載の方法。
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