CN102368903B - 大豆事件127和与其相关的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供涉及耐受抑制AHAS的除草剂的转基因大豆植物的组合物和方法。提供具有赋予对抑制AHAS的除草剂的耐受性的突变的AHAS编码序列的事件127大豆植物。在经鉴定的染色体位置处具有事件127核酸分子的事件127大豆植物，可包含具有至少SEQ ID NO：5和/或6核酸序列的基因组/转基因连接。事件127的基因组插入位点的特征提供提高的育种效率，并使得能够利用分子标记来跟踪繁殖种群及其后代中的转基因插入物。提供用于鉴定、检测及使用事件127大豆植物的各种方法和组合物。

Description

大豆事件127和与其相关的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2009年1月7日提交的美国专利临时申请号61/143,049的权益，所述申请的全部内容在此引作参考。
经由EFS-WEB提呈的序列表的引用
本申请经由EFS-Web电子提交，包括以文本文档格式电子提交的序列表。该文本文档文件含有在2010年1月5日创建的标题为“1378358.txt”的序列表，为47,052个字节大小。该文本文档文件中含有的序列表是本说明书的部分，在此以其整体引作参考。
领域
本发明一般涉及分子生物学，涉及用于提高植物对抑制乙酰羟酸合成酶的除草剂的耐受性的组合物及方法和用于杂草控制的组合物及方法。
背景
大豆(Glycine max)在世界上很多地区是重要作物。已将生物技术方法应用于大豆以改进农学性状和产物质量。在大豆生产中重要的一种这类农学性状是对除草剂的耐受性，尤其是对草甘膦除草剂的耐受性。随着草甘膦耐受性大豆使用的扩展，耐受草甘膦的杂草也出现了。因此，为了控制杂草，需要耐受除草甘膦外的除草剂的大豆植物。
植物例如大豆中转基因(例如提供除草剂耐受性的转基因)的表型表达，受到基因本身结构及其在植物基因组中的整合位置二者的影响。同时，基因组中不同位置的转基因(在外来DNA中)的存在，将以不同方式影响植物的总体表型。通过基因操作在农艺方面或工业方 面成功地将商业上感兴趣的性状引入植物中，可能是取决于不同因素的漫长过程。遗传转化的植物实际上的转化和再生仅是一系列选择步骤的开始，所述一系列选择步骤包括大量遗传表征、育种和田间试验评估，最终通向选择优良事件(event)。
因为在作物改良中增加了遗传修饰的使用以改进转基因向商业品种的基因渗入，所以明确地检测和/或鉴定特定转基因事件的能力越来越重要，以便分开GMO和非GMO产品及鉴定专有物质。仍然需要开发既快速又简单不需大量实验室设备的方法，用于检测特定转基因事件。另外，用于检测特定事件的方法在以下方面将有益：遵从规则，所述规则要求对源自重组作物植物的食品进行预先市场批准和标记；或用于环境监测、野外作物性状监测或来自作物收获物的产品的监测；以及用于确保受监管条款或合同条款管辖的各方遵守。
简述
在一个实施方案中，本发明提供用于在栽培区控制杂草的方法，所述方法包括：将有效量的非选择性除草剂施用于具有包含事件127核酸分子的大豆植物的栽培区。
在另一实施方案中，本发明提供用于控制作物田(crop field)中耐受草甘膦的杂草的方法，所述方法包括：将有效量的抑制AHAS的除草剂施用于具有包含事件127核酸分子的大豆植物的作物田。
在又一实施方案中，本发明提供具有SEQ ID NO：1的1312-6069位核酸序列的分离的核酸分子。
在另一实施方案中，本发明亦提供具有异源核酸分子的转基因大豆植物，所述异源核酸分子具有SEQ ID NO：1的核苷酸1302-6079的核酸序列。
本发明亦提供分离的核酸引物对，所述核酸引物对包含能够扩增事件127核酸分子的第一和第二分离的核酸分子。
在另一实施方案中，本发明提供用于鉴定生物学样品中的事件127核酸分子的试剂盒，所述试剂盒包括第一和第二核酸引物，其中第一和第二核酸引物能够扩增事件127核酸分子。
本发明亦提供用于鉴定事件127大豆植物的方法，所述方法包括：(a)形成混合物，所述混合物包含含有大豆DNA的生物学样品和能够扩增事件127特异性核酸分子的第一和第二核酸引物；(b)在允许第一和第二核酸引物扩增事件127特异性核酸分子的条件下，让混合物反应；和(c)检测扩增的片段核酸分子的存在情况，其中存在大豆事件127特异性核酸分子，表明大豆植物为事件127大豆植物。
在再一实施方案中，本发明提供用于鉴定具有事件127核酸分子的大豆植物的方法，所述方法包括：(a)形成混合物，所述混合物包含含有大豆DNA的生物学样品和能够与事件127特异性核酸分子杂交的核酸分子探针；(b)在允许核酸分子探针与事件127特异性核酸分子杂交的条件下，让混合物反应；和(c)检测所述探针与DNA的杂交情况，其中存在核酸分子探针与大豆DNA的杂交表明存在事件127核酸分子。
本发明进一步提供用于提高包含事件127核酸分子的大豆植物的产量的方法，所述方法包括：将有效量的抑制AHAS的除草剂施用于一种或多种包含事件127核酸分子的大豆植物和周围区域，其中所述抑制AHAS的除草剂减少周围区域的杂草生长；和从所述一种或多种大豆植物收获种子。
在另一实施方案中，本发明提供用于对耐受抑制AHAS的除草剂的大豆植物进行育种的方法，所述方法包括：(a)让包含事件127核酸分子的大豆植物与第二种大豆植物杂交；(b)从步骤(a)的杂种获得种子；(c)从所述种子获得DNA样品；和(d)检测样品中事件127核酸分子的存在情况，其中存在事件127核酸分子表明所述种子能够产生耐受抑制AHAS的除草剂的大豆植物。
本发明亦提供包含事件127核酸分子的大豆植物的种子。
在又一实施方案中，本发明提供用于检测生物学样品中事件127核酸分子的存在情况的方法，所述方法包括：(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品和能够扩增事件127特异性核酸分子的第一和第二核酸引物；(b)在允许第一和第二核酸引物扩增包含事件127特异性核酸分子的核酸分子的条件下，让混合物反应；和(c)检测扩增的核酸分子的存在情况，其中存在事件127特异性核酸分子表明样品含有事件127核酸分子。
在另一实施方案中，本发明提供用于检测生物学样品中的事件127核酸分子的方法，所述方法包括：(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品和能够与事件127特异性核酸分子杂交的核酸探针；(b)在允许探针与事件127特异性核酸分子杂交的条件下，让混合物反应；和(c)检测杂交的核酸分子的存在情况，其中存在事件127特异性核酸分子表明样品含有事件127核酸分子。
本发明亦提供用于检测生物学样品中事件127插入核酸分子的存在情况的方法，所述方法包括：(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品和能够扩增事件127插入核酸分子的第一和第二引物；(b)在允许第一和第二核酸引物扩增包含事件127插入核酸分子的核酸分子的条件下，让混合物反应；和(c)检测扩增的核酸分子的存在情况，其中存在事件127插入核酸分子表明样品含有事件127插入DNA。
在再一实施方案中，本发明提供用于检测生物学样品中事件127插入核酸分子的存在情况的方法，所述方法包括：(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品和能够与事件127插入核酸分子区退火的第一引物和能够与宿主细胞基因组中的侧翼核酸分子退火的第二引物；(b)在允许第一和第二核酸引物产生包含事件127插入核酸分子片段的扩增核酸分子的条件下，让混合物反应；和(c)检测扩增的核酸分子的存在情况，其中存在事件127插入核酸分子片段表明样品含有事件127插入DNA。
在另一实施方案中，本发明提供用于栽培大豆植物的方法，所述方法包括：(a)提供包含事件127核酸分子的大豆种子；(b)在允许种子发芽以产生生长中的包含事件127核酸分子的大豆植物的条件下，将大豆种子种植在生长培养基中；和(c)让生长培养基、种子或植物与包含至少一种选自以下的组分的除草剂组合物接触：咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、其彼此的组合及其与至少一种其它活性成分的组合。
在又一实施方案中，本发明提供用于检测样品中的事件127多肽的方法，所述方法包括：从大豆植物获得生物学样品；和对样品进行至少一种免疫学测定，其中所述测定能够检测事件127多肽。
本发明亦提供用于检测生物分子的装置，所述装置包括：具有表面的固相支持体；和至少一种与固相支持体表面连接的事件127诊断分子。
附图简述
图1A提供质粒pAC321的示意图。图1B提供用于转化的含有AHASL5’UTR、csr1-2编码序列和AHASL3’UTR的pAC321的PvuII片段的示意图。标明了用于拷贝数、缺乏主链和两代间的稳定性的DNA印迹分析的限制性酶位点(NcoI、XbaI、SpeI)。
图2提供大豆事件127植物的一个实例的育种历史的示意图。
图3提供pAC321 PvuII转化片段与大豆事件127插入物的比对的示意图。
图4A-4C提供实施例3中所述的大豆事件127植物的一个实例中插入物拷贝数的DNA印迹杂交结果。图4D提供用于杂交实验的探针的相对位置的示意图。
图5提供显示在实施例3中所述的大豆事件127植物的一个实例中缺乏载体主链序列的DNA印迹杂交结果。图5A提供用探针VP1的结果，图5B提供用探针VP2的结果。图5C提供127事件序列上的杂交区的相对位置的示意图。
图6提供事件127序列两代间稳定性的DNA印迹杂交分析结果。图6A提供用5’UTR探针的结果。图6B提供用AHAS探针的结果。图6C提供用3’UTR探针的结果。图6D提供各个探针在事件127序列上的杂交区域的示意图。
图7提供大豆事件127植物的一个实例中的插入物和侧翼序列的图示。亦标明用于实施例3中所述的序列测定的6个扩增子。
图8提供大豆事件127插入物和侧翼区的全长核酸序列(SEQ ID NO：1)。1-1311位代表5’侧翼DNA，1312-6069位代表编码经修饰的AHASL蛋白的插入DNA，6070-10,656位代表3’侧翼DNA。
图9提供实施例3中所述的大豆事件127植物的一个实例中AtSec 61γ亚基转录的RT-PCR分析的凝胶电泳结果。
图10提供501bp开放阅读框(ORF)转录的RT-PCR分析的凝胶电泳结果，所述开放阅读框通过在实施例3中所述的大豆事件127植物的一个实例的3’侧翼连接处插入csr1-2编码序列的376bp重复来创建。
图11提供实施例3中所述的事件127-特异性PCR检测方法实例的凝胶电泳结果。
图12提供用于产生事件127的DNA，即来自pAC321构建体的6156bp的PvuII片段(SEQ ID NO：4)。
详述
本发明提供表现出对抑制AHAS的除草剂有耐受性的大豆植物，所述抑制AHAS的除草剂为例如咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶磺酰苯胺除草剂和/或嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂。本发明大豆植物含有位于大豆基因组的特征位置的插入的核酸分子。亦提供用于与所公开的大豆植物一起使用的方法和组合物。
在进一步详述本发明之前，将首先定义以下术语。
I.定义
本文所用术语“大豆”和“大豆植物”意指大豆(Glycine max)植物，包括可产大豆的所有植物品种。术语“大豆植物”包括植物部分。本文所用术语“植物部分”包括植物细胞、植物器官、植物原生质体、来自可再生植株的植物细胞组织培养、植物愈伤组织、植物块和在植物或植物部分(例如晶胚、花粉、胚珠、种子、种子荚果、叶、花、枝条、果实、茎、根、根尖、花药、子叶、胚轴等)中完整的植物细胞。谷物意指由商业栽培者为了除栽培或繁殖物种外的目的生产的成熟的种子。再生植株的后代、衍生物、变体和突变体亦包括在本发明范围内，前提是这些部分包含事件127核酸分子。
“事件127核酸分子(event 127 nucleic acid molecule)”是指以下核酸分子，其包含来自SEQ ID NO：1的1312-6069位的核酸序列；通过传统植物育种获得的其变体，所述变体提供用于表达AHAS酶的修饰形式，所述AHAS酶的修饰形式具有对应于653位含有天冬酰胺而不是天然丝氨酸(S653N)的AHASL蛋白，其中AHAS酶的修饰形式表现出耐受AHAS抑制剂，所述AHAS抑制剂正常应抑制野生型AHAS酶的酶活性；或这些中任一种的互补序列。事件127核酸分子可含有在SEQ ID NO：1的1312-6069位侧翼的另外的序列(或对于变体，在5’和3’位置侧翼的另外的序列)。
“事件127区”是指包括至少事件127核酸分子片段并指示事件127植物的核酸分子。事件127区可包括以下中一种或多种：5’和/或3’连接区、插入DNA或插入DNA的csr1-2重复与插入DNA的其余部分的连接区。此外，其中可另外包括5’和/或3’侧翼序列DNA。
本文所用术语“事件127特异性核酸分子”是指区别地鉴别或能够区别地鉴别样品中的事件127核酸分子的核酸分子序列。事件127特异性核酸分子可包括因转化事件产生的插入DNA的连接区及独特突变或重复。例如，在PCR反应中使用具有SEQ ID NO：37和38核酸序列的PCR引物导致扩增子的扩增，这指示事件127核酸分子。
“事件127分子”是指源自事件127核酸分子、从其获得或由其编码的核酸分子、多肽分子和其它生物分子。
“事件127诊断分子”是指可用于直接或间接检测事件127核酸分子的分子。事件127诊断分子包括可在检测事件127核酸分子或由所述核酸分子表达的多肽的方法中使用的核酸分子，例如引物和探针、抗体及其保留结合位点的片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)和缺失H-结构域的抗体)、多肽及其衍生物、核酸类似物、适体等。
本文所用“插入DNA”是指经由转化过程引入到植物材料中的异源DNA，包括与用于本文所解释的这类转化中的初始DNA不同的DNA。“事件127插入核酸”和“事件127插入DNA”是指具有SEQ ID NO：1的1312-6069位核酸序列的核酸分子(其不同于用于产生事件127的DNA，即来自图12中提供的pAC321构建体的6156bp的PvuII片段(SEQ ID NO：4))。
“事件127”植物、细胞、种子、植物部分或植物组织是指含有事件127核酸分子的任何植物、细胞、种子、植物部分或植物组织，其优选含有至少一种事件127特异性核酸。事件127植物包括含有具有SEQ ID NO：1序列的核酸分子的事件127-9大豆植物，例如称为BPS-CV127-9的大豆植物。
术语“侧翼DNA”是指天然存在于生物体例如植物中紧接插入核酸分子的上游或下游并与之邻接的基因组DNA。本文所用“侧翼区”或“侧翼序列”是指至少10、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000个碱基对或更多的序列，其位于初始外来插入DNA分子的紧接上游(5’)并与之邻接或紧接下游(3’)并与之邻接。事件127侧翼区的非限制性实例在SEQ ID NO：2和3和其变体及片段中提出，其中SEQ ID NO：2代表SEQ ID NO：1的1-1311位，SEQ ID NO：3代表SEQ ID NO：1的6070-10,656位。
导致外来插入DNA随机整合的转化程序，导致产生含有对每一转化体特征性和独特性的不同侧翼区的各个转化体。当通过传统杂交将重组DNA引入到植物中时，其侧翼区通常与初始转化体的侧翼区没有变化。各个转化事件亦将含有在异源插入DNA和基因组DNA片段之间或两个基因组DNA片段之间或两个异源DNA片段之间的独特连接。
“连接点”是其中两个特异性DNA片段连接的点，例如其中插入DNA连接侧翼DNA的点。连接点亦存在于转化生物体中，其中两个DNA片段以自天然生物体中发现的方式改变的方式连接在一起。本文所用“连接DNA”或“连接区”是指包含连接点的DNA。来自大豆事件127的DNA中的连接点的非限制性实例，包括例如SEQ ID NO：5和6中提出的序列，其中SEQ IDNO：5代表SEQ ID NO：1的1311-1312位，SEQ ID NO：6代表SEQ ID NO：1的6069-6070位。
应该理解，本文所用术语“转基因的”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型已通过存在异源核酸来改变，其包括最初如此改变的那些转基因学以及通过有性杂交或无性繁殖从初始再生事件产生的那些。本文所用术语“转基因的”不包括通过以下方法对基因组(染色体的或染色体外的)的改变：常规植物育种方法；或天然存在的事件，例如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。
“转化”是指将核酸片段转移到宿主生物体基因组，导致遗传上稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物体称为“转基因的”生物体。植物转化方法的实例包括本领域已知和以下公开的那些方法。
“转基因事件”如下产生：通过用一种或多种异源DNA构建体转化植物细胞，所述异源DNA构建体包括包含目的转基因的核酸表达盒；因将转基因插入到植物基因组中所致的植物群再生；和选择特征为插入到特定基因组位置的特定的再生植物。事件的表型特征为表达一种或多种转基因。在遗传水平，事件是植物遗传组成的部分。
本文所用“样品”包括含有核酸分子或多肽的任何样品，其源自植物、植物材料或在产品中，所述产品为例如但不限于包含或源自植物材料的食物或饲料产品(新鲜的或经过加工的)。
在转化情境中的“引入”或“被引入”，意指以使构建体获得进入植物细胞内部这样的方式将异源DNA构建体提呈给植物。本发明植物 和方法不依赖将核酸构建体引入到植物的特定方法，只要核酸构建体获得进入植物的至少一个细胞的内部即可。用于将核酸构建体引入植物的方法为本领域已知，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
术语“后代”是指通过在事件127植物和另一品种之间有性杂交(例如异型杂交、自交或回交)产生的植物。即使是在与回归亲本反复回交后，来自事件127亲本的插入的DNA和/或侧翼DNA也在相同的染色体位置存在于杂交后代中，并可例如通过针对事件127特异性区进行筛选来鉴定。
本文提及核酸分子所用的“异源的”为来源于外来物种的核酸分子，或若其来自同一物种，则通过故意的人为干预在组成和/或基因组基因座方面自其天然形式进行修饰。
“分离的”或“纯化的”核酸分子或其生物学活性部分，大体上或基本上不含通常在其天然存在的环境中发现的伴随所述核酸分子或与其互相作用的组分。因此，分离的或纯化的核酸分子大体上不含其它细胞物质或当通过重组技术产生时的培养基，或当为化学合成时大体上不含化学前体或其它化学药品。
“探针”是指与可检测标记或报道分子(例如放射性同位素、配体、化学发光剂、酶等)连接的分离的核酸分子。所述探针与靶标核酸分子的链互补，在本发明情况下，与来自大豆事件127植物生物学材料的分离的DNA链互补，所述生物学材料来自大豆植物或来自包含来自所述事件的DNA的样品。探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包括可特异性检测靶标DNA序列存在情况的聚酰胺及其它探针材料。
本文所用“引物”为以下分离的核酸分子，其能够通过核酸杂交与互补的靶标DNA链退火，以在引物与靶标DNA链之间形成杂合体，然后可通过聚合酶例如DNA聚合酶将其沿着靶标DNA链延伸。“引物对”是指用于例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规核酸扩增方法来扩增靶标核酸分子的引物对。“聚合酶链式反应”或“PCR”为用于扩增特定DNA区段的技术。
“系”或“株”为同样家系的个体组，其通常被近交到一定程度并通常为同基因或接近同基因的。
本发明上下文中的术语“被杂交”或“杂交”，意指配子融合，例如在植物情况下经由授粉以产生后代(即细胞、种子或植株)。该术语包括有性杂交(一个植株由另一个植株来授粉)和在植物情况下的自交(自花授粉，即当花粉及胚珠来自同一个植株时)二者。
术语“基因渗入”是指将来自一个遗传背景的遗传基因座的所期需的等位基因传送到另一个遗传背景。在一种方法中，可通过两个亲本间的有性杂交来使所期需的等位基因基因渗入，其中至少一个亲本在其基因组中具有所期需的等位基因。
II.大豆事件127植物
提供了涉及耐受AHAS抑制剂的转基因大豆植物的组合物和方法。所述组合物包含事件127大豆植物。如下修饰野生型或非转化大豆植物获得事件127大豆植物：通过将拟南芥(Arabidopsis thaliana)的耐受咪唑啉酮的乙酰羟酸合酶大亚基基因(csr1-2)插入或基因渗入到本文所定义的大豆基因组中。在某些实施方案中，将csr1-2基因插入到大豆基因组提供乙酰羟酸合酶(AHAS)酶修饰形式的表达，所述修饰形式具有含对应于653位的天冬酰胺而不是天然丝氨酸(S653N)的AHASL蛋白。AHAS酶对于支链氨基酸的生物合成很重要，受到某些除草剂(抑制AHAS的除草剂)的抑制。对AHAS基因的修饰克服了该抑制，从而提供对大范围的抑制AHAS的除草剂的耐受性。因此，大豆事件127植物耐受至少一种抑制AHAS的除草剂，或与缺乏事件127核酸分子的大豆植物相比，对增加量的至少一种抑制AHAS的除草剂有耐受性。
发现赋予AHAS抑制剂耐受性的核酸分子被插入到了大豆基因组的特征位置，由此产生127事件。在一个实施方案中，在列举的染色体位置具有事件127核酸分子的事件127大豆植物，包含具有至少 SEQ ID NO：5和/或6的核酸分子序列的一个或多个基因组/转基因连接。事件127的基因组插入位点的特征提供提高的繁殖效能，使得能够使用分子标记以在繁殖群及其后代中跟踪转基因插入物。本文提供了用于鉴别、检测和使用事件127大豆植物的各种方法和组合物。
来自质粒pAC321的PvuII片段的csr1-2表达盒在大豆基因组的单个特征性遗传基因座整合，产生事件127。在一个实施方案中，相对于来自质粒pAC321的原始转化片段，事件127中插入的csr1-2盒含有三个点突变，其中一个突变在AHAS编码序列，另两个在AHASL 3’非翻译区(UTR)的下游。所述突变包括编码序列中G到A的突变，其导致表达具有R272到K272的氨基酸取代的AHAS多肽。点突变的DNA印迹分析和序列验证，表明插入物在至少8代内稳定。事件127中插入的DNA亦含有直接在3’整合点前面的csr1-2编码序列部分的376个碱基对(bp)重复(重复由SEQ ID NO：1的5694-6069位来代表)。所述重复的376bp区段产生延伸到3’侧翼序列的501bp的开放阅读框(ORF)。逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)结果表明，该501bp ORF未被转录。在某些实施方案中，事件127核酸分子亦含有拟南芥SEC61γ亚基基因座(At3g48570)的大部分，其为用于转化的DNA片段的组分。在其它实施方案中，SEC61γ亚基基因可在大豆事件127植物中表达。例如，如以下实施例所更详细地公开，RT-PCR实验显示拟南芥SEC61γ亚基基因在事件127叶组织中弱转录。总共约1.3千碱基(kb)的5’侧翼大豆DNA与约4.6kb的3’侧翼大豆DNA一起测序。可将侧翼序列信息用于开发本发明事件127-特异性定性PCR检测方法。事件127核酸分子的其它特性，例如经鉴定的点突变和重复，亦可用于本文提供的方法中，用于检测包括后代及其衍生物在内的事件127植物。
本发明事件127植物对抑制AHAS的除草剂的施用耐受。事件127植物对抑制AHAS的除草剂在以下施用水平的水平表现出耐受或提高的耐受，所述施用水平包括等同于施用50g ai/ha-约500g ai/ha、70g ai/ha-约400g ai/ha以及70g ai/ha-约300g ai/ha除草剂量的量。 所述耐受亦可包括耐受抑制AHAS的除草剂施用的商业水平的1X、2X、3X、4X、5X或更大倍数量的所述除草剂水平。
可通过测定除草剂耐受性的任何方法来测定对抑制AHAS的除草剂的耐受。例如，如果与合适的对照植物相比，显示伤害小于对照植物所表现出的伤害达至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％或更多，那么可证明大豆事件127植物耐受抑制AHAS的除草剂或其它化学药品。以该方式，耐受抑制AHAS的除草剂或其它化学药品的植物，与合适的对照植物相比显示“改进的耐受性”。通过评价植物生长的任何参数或本领域技术人员充分认为合适的参数，来评估因除草剂或其它化学药品处理而产生的伤害。可通过肉眼检查和/或通过统计学分析个体植株或植株群的合适参数来评估伤害。因此，例如，可通过评价诸如植株高度、植株重量、叶的颜色、开花、繁殖力、产量、种子生产等参数来评估伤害。亦可通过评价到特定发育阶段(例如成熟或开花)消逝的时间，或植物从用特定化学药品和/或除草剂处理直到恢复所消逝的时间，来评估伤害。
可在用除草剂处理或接触事件127植物后的不同时间，评估用抑制AHAS的除草剂或其它化学药品引起的伤害。可大约在对照植物表现出最大伤害的时间来评估伤害，或可一段时期后来评估，所述时期中用除草剂或其它化学药品处理的对照植物相对于给予处理时的大小或阶段可测量地生长和/或发育。另外，可在用除草剂处理测试植物后的不同时间例如12小时或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或3周、4周或更长时间，评估伤害。只要允许检测测试植物和对照植物响应处理的差异，任何时间评估都合适。
本发明进一步包括含有事件127核酸分子的大豆CV603系(亦称为“BPS-CV127-9”)的种子和源自所述种子的植物、植物细胞及种子，所述大豆CV603系以NCIMB专利保藏号41603保藏。申请人于2008年12月22日在国家工业、食品和海洋细菌保藏中心(NationalCollections of Industrial，Food，and Marine Bacteria，NCIMB)(23 St.Machar Drive，Aberdeen AB2 1RY，Scotland，United Kingdom)保藏了至少2500粒含有事件127核酸分子大豆植物的种子，保藏物指派的NCIMB登记号为41603。遵照国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约的条款保持这些保藏物。该保藏仅因对本领域技术人员的方便而进行，并不承认保藏需要在35U.S.C.§112之下进行。从Embrapa(Empresa Brasileira dePesquisa Agropecuaria)维护的保藏处获得2008年12月22日保藏在NCIMB的种子。在本申请待审期间，专利和商标事务专员(Commissioner of Patents and Trademarks)和在提出请求后由事务专员确定有资格的人员可获得该保藏物。在批准本申请中的任何权利要求后，申请人将依照37C.F.R.§1.808让公众可获得保藏物的样品，该保藏物为在国家工业、食品和海洋细菌保藏中心(NCIMB)(23 St.Machar Drive，Aberdeen AB2 1RY，Scotland，United Kingdom)保藏的至少2500粒含有事件127核酸分子的大豆植物的种子。该大豆CV603系种子的保藏物将在NCIMB保藏处(其为公共保藏处)保持30年时间或于最近请求后5年或专利可实施期(以时间较长者为准)，如果在该期间种子失活的话会更换。另外，申请人满足37C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供保存时样品生存力指示。申请人无权放弃法律关于生物材料转移或其商业运输强制的任何限制。申请人不放弃对该专利赋予的其权利或遵循植物品种保护法(Plant Variety Protection Act)(7 USC 2321，参照以下)适用于大豆CV603系的权利的任何侵犯。禁止未经授权的种子繁殖。所述种子可受管制。
本发明事件127大豆植物亦包括产生事件127大豆植物的初始转化事件的后代、衍生物、变体和突变体。可用鉴定所述植物的任何方法来鉴定所述植物，所述方法包括但不限于育种记录、除草剂耐受法、分子检测方法、本文公开的方法及其组合。
本发明事件127大豆植物耐受至少一种除草剂，所述除草剂干扰缺乏S653N突变的内源性AHAS酶(抑制AHAS的除草剂)的活性。干 扰AHAS酶活性的除草剂包括：咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂、磺酰基氨基-羰基三唑啉酮除草剂或其混合物或组合。在一个实施方案中，所述除草剂为咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂或其混合物。咪唑啉酮除草剂包括但不限于：PURSUIT (咪草烟)、CADRE (甲基咪草烟)、RAPTOR (甲氧咪草烟)、SCEPTER (灭草喹)、ASSERT (咪草酯(imazethabenz))、ARSENAL (灭草烟)、前述任一种除草剂的衍生物和前述除草剂中的两种或更多种的混合物或组合，例如灭草烟/甲氧咪草烟(ODYSSEY )。咪唑啉酮除草剂亦可选自但不限于：2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、[2-(4-异丙基)-4-][甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-3-喹啉羧]酸、[5-乙基-2-(4-异丙基-]4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸、[2-(4-异丙基-4-甲基5-氧代-2-]咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸以及[6-(4-异丙基4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-间-甲苯甲酸甲酯和[2-(4-异丙基-4-甲基-5-]氧代-2-咪唑啉-2-基)-对-甲苯甲酸甲酯的混合物。在一个实施方案中，使用5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸和[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-]基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。在另一实施方案中，使用[2-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。
可用于本发明的磺酰脲除草剂包括但不限于：氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、噻吩磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、烟嘧磺隆、胺苯磺隆、砜嘧磺隆、氟胺磺隆、醚苯磺隆、氟嘧磺隆(primisulfuron methyl)、醚磺隆、酰嘧磺隆、啶嘧磺隆(fluzasulfuron)、唑吡嘧磺隆、吡嘧磺隆、吡氯磺隆、四唑嘧磺隆、环丙嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟嘧啶磺隆(flupyrsulfuron methyl)、甲酰胺磺隆、碘磺隆(iodosulfuron)、环氧嘧磺隆、甲磺胺磺隆、氟磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、三氟甲磺隆、前述任一种除草剂的衍生物和前述除草剂中两种或更多种的混合物。本发明三唑并嘧啶除草剂包括但不限于：氯酯磺草胺(cloransulam)、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草 唑胺和五氟磺草胺。本发明嘧啶基氧基苯甲酸酯(或嘧啶羧酸)除草剂包括但不限于：双草醚(bispyribac)、嘧草硫醚(pyrithiobac)、嘧草醚(pyriminobac)、嘧啶肟草醚和环酯草醚(pyriftalid)。磺酰基氨基-羰基三唑啉酮除草剂包括但不限于：氟酮磺隆(flucarbazone)和丙苯磺隆(propoxycarbazone)。
应该认识到，嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂与嘧啶基硫代苯甲酸酯除草剂有关，可由美国杂草科学协会(Weed Science Society of America)归于嘧啶基硫代苯甲酸酯除草剂目录下。因此，本发明除草剂进一步包括嘧啶基硫代苯甲酸酯除草剂，其包括但不限于上述嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂。
III.核酸分子
本发明亦提供分离的事件127核酸分子。本文所用术语“核酸分子”并非意欲将核酸分子限于包含DNA，而是可包括任何核苷酸，例如核糖核苷酸和核糖核苷酸及脱氧核糖核苷酸的组合。所述脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物二者。核酸分子亦包括所有序列形式，所述序列形式包括但不限于：单链形式、双链形式、发夹、干环结构等。在一个实施方案中，事件127核酸分子包括具有SEQ ID NO：1的1312-6069位核酸序列的核酸分子。在另一实施方案中，事件127核酸分子包括具有SEQ ID NO：1的1302-6079核苷酸序列的核酸分子。
事件127核酸分子亦包括SEQ ID NO：1片段。核苷酸序列“片段”可具有任何长度，例如至少7、15、20、25、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、550、650、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3500、4000、4500或更多个核苷酸(nt)长。这些片段具有多种用途，所述用途包括但不限于诊断探针和引物。当然，按照本发明较长的片段例如601-8000nt长的片段亦有用，对应于大部分(如果不是全部)SEQ ID NO：1核苷酸序列的片段也是如此。例如，至少20nt 长的片段意为包含例如来自SEQ ID NO：1核苷酸序列的20个或更多个连续碱基的片段。
事件127植物包含具有AHASL编码序列的转基因表达盒，所述序列具有能够提供对咪唑啉酮抑制性除草剂的抗性或耐受性的S653N突变。表达盒另外包括可操作地与AHASL编码序列连接的5′和3′调控序列。“可操作地连接”意指在两个或更多个元件之间功能上连接。例如，目的核酸分子与调控序列(例如启动子)之间的可操作连接，是使得允许表达目的核酸分子的功能连接。可操作地连接的元件可为邻接或非邻接。当可操作地连接用于指两个蛋白编码区的连接时，其意指编码区处于同一个读框内。
因此，大豆事件127植物中的表达盒以转录的5′-3′方向含有在植物中有功能的转录起始区及翻译起始区(例如启动子)、AHASL S653N编码区和转录终止区及翻译终止区。“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的核苷酸序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3′。启动子序列可包含近侧和更远侧上游元件，后述元件通常称为增强子。因此，“增强子”为可刺激启动子活性的核苷酸序列，可为启动子的固有元件或插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以其整体得自天然基因，或由源自自然界发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含人工合成核苷酸区段。本领域技术人员应理解，不同启动子可在不同组织或细胞类型中或在发育的不同阶段或因响应不同的环境条件指导基因的表达。引起核酸片段在大部分细胞类型中于大部分时间表达的启动子，通常被称为“组成型启动子”。
在一个实施方案中，大豆事件127植物中的表达盒含有作为可操作地连接的组分的AHASL S653N编码序列(在拟南芥csr1-2启动子控制下)和csr1-2转录终止区。表达盒作为PvuII片段得自核酸构建体pAC321。在一个实施方案中，表达盒具有SEQ ID NO：4的序列。
提供分离的核酸分子，其可用于各种用于检测和/或鉴定事件127核酸分子的方法中。在一个实施方案中，“分离的”核酸分子不含在 所述核酸分子源自的生物体的基因组DNA中天然位于所述核酸分子侧翼的序列(即位于所述核酸的5′和3′端的序列)(例如蛋白质编码序列)。例如，在不同实施方案中，分离的核酸分子可含有在所述核酸分子源自的细胞的基因组DNA中天然位于所述核酸分子侧翼的核苷酸序列的不到约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb。
在某些实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO：5和/或6中提出的连接DNA序列。在其它实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO：5和/或6中提出的连接DNA序列或其变体及片段。连接DNA序列的片段和变体适用于区别地鉴定事件127DNA。如本文另外地方所讨论，所述序列可用作用于检测样品中的事件127插入DNA的引物和/或探针。
在其它实施方案中，提供可检测事件127植物、事件127插入DNA或事件127特异性核酸分子的核酸分子。这类序列包括包含SEQ ID NO：5和/或6中提出的核酸分子或其变体或其互补序列的任何核酸分子。在某些实施方案中，用于检测事件127核酸分子的核酸分子，包含SEQ ID NO：5和/或6中提出的序列或其互补序列。检测事件127核酸分子、事件127插入DNA或事件127特异性区的核酸分子的片段和变体，适用于区别地鉴定事件127植物。如本文其它地方所论述，这类序列可用作引物和/或探针。另外提供分离的DNA核苷酸引物序列，其包含以下序列或由其组成：SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、67、68、69、70中提出的序列或其互补序列；或SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、67、68、69、70的变体和片段或其互补序列。
在一个实施方案中，本文使用的特异性引物对包含以下所示的正向和反向引物(具有所表示的SEQ ID NO：1的相对位置)。预测引物产生327个碱基对大小的带。
本文关于核酸序列所用“变种”是指基本上相似的序列。对于核酸分子而言，变体包括以下核酸分子，其具有5′和/或3′端缺失(例如截平)；在天然核酸分子的一个或多个内部位点缺失和/或添加一个或多个核苷酸；和/或在天然核酸分子的一个或多个位点取代一个或多个核苷酸。
引物的任何组合可用于本发明，例如如本文公开用于检测事件127特异性区域的那些(例如SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、67、68、69和70)。引物对的非限制性实例包括：SEQ ID NO：35和36；SEQ ID NO：37和38；SEQ ID NO：39和40；SEQ IDNO：41和42；SEQ ID NO：43和44，SEQ ID NO：67和68，SEQ ID NO：69和70。亦可根据本发明设计另外的引物和引物对，用于所公开的方法中。
用于所提供的方法中的探针和引物为足够长的核苷酸以与靶标DNA序列结合，并特异性检测和/或鉴定生物学样品中的核酸分子，所述样品为例如自待检测的植物获得的样品。公认杂交条件或反应条件可由操作者确定，以达到该结果。该长度可具有可用于所选择的检测方法的任何长度，例如8、10、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、700个核苷酸或更长，或约11-20、20-30、30-40、40-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800之间或更多个核苷酸长。所述探针和引物可在高严格杂交条件下与靶标序列特异性杂交。符合实施方案的探针和引物可与靶标序列在连续核苷酸上具有完全DNA序列同一性，但探针不同于靶标DNA序列，可通过常规方法来设计保留特异性检测和/或鉴别靶标DNA序列的能力的探针。因此，探针和引物可与靶标核酸分子(例如SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44)共享约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性或互补性，或可因1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸而不同于靶标序列(例如SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44)。探针可用作引物，但通常被设计为与靶标DNA或RNA结合，并且不用于扩增过程。
在某些实施方案中，特异性引物可用于扩增事件DNA的片段以产生扩增子，所述扩增子可用作“特异性探针”，或可检测扩增子本身，用来鉴定生物学样品中的事件127核酸分子。或者，可在PCR反应期间使用探针以允许可检测扩增事件(例如Taqman探针或MGB探针)(所谓实时PCR)。当探针在允许探针与样品结合的条件下与生物学样品中的核酸分子杂交时，可检测该结合，从而允许指示生物学样品中事件127的存在情况。本领域业已阐述结合的探针的这类鉴定。在一个实施方案中，探针是这样的序列，其在最佳条件下与包含事件的5′或3′侧翼区的区域特异性杂交，并还包含与之邻接的插入DNA的部分，从而跨越连接区。特异性探针可包含与事件127核酸分子的特异性区域具有以下同一性(或互补性)的序列：至少80％、80-85％、85-90％、90-95％和95-100％。
本文所用“扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板的部分的靶标核酸分子的核酸分子扩增的产物。例如，为了测定产生于有性杂交的大豆植物是否含有事件127核酸分子，可使从大豆植物组织样品提取的DNA经历核酸分子扩增方法，以产生诊断或指示事件127核酸分子的存在情况的扩增子，所述扩增方法使用包括源自与插入的异源DNA的插入位点毗连的侧翼序列的第一引物和源自插入的异源DNA的第二引物的DNA引物对。对于“诊断”事件127区，意欲使用辨别生物学样品中事件127区是否存在的任何方法或测定。或者，第二引物可源自侧翼序列。在其它实施方案中，引物对可源自插入的DNA两侧上的侧翼序列，以便产生包含表达构建体的完整插入核酸分子以及位于转基因插入序列侧翼的序列的扩增子，例如SEQ ID NO：1。扩增子具有一定长度并具有亦可诊断事件的序列(例如含有来自事件127区的连接DNA)。扩增子长度可介于引物对的联合长度加一个核苷酸碱基对到可由DNA扩增方案产生的扩增子的任何长度之间。源自侧翼序列的引物对的成员可位于离插入的DNA序列一定距离的位置，所述距离可介于一个核苷酸碱基对到多至扩增反应限度或约2万个核苷酸碱基对的范围。在另一实施方案中，可将引物对设计为扩增插入DNA或插入DNA的片段。可将所述引物对用于检测生物学样品中事件127插入DNA的存在情况。术语“扩增子”的使用明确排除可在DNA热扩增反应中形成的引物二聚物。
在某些实施方案中，有用的引物对包含与在插入DNA和侧翼5’或3’基因组DNA之间的连接点重叠的一个引物。可将这类引物沿着5’侧翼DNA和插入DNA之间的连接点(即SEQID NO：1的1311和1312位之间的连接)以及插入DNA和3’侧翼DNA之间的连接点(即SEQ IDNO：1的6069和6070位之间的连接)设计。可将这类引物设计为与来自侧翼区或插入DNA的约10个核苷酸杂交并且与跨越插入DNA或侧翼区的连接点的至少1个核苷酸杂交。因此，例如，引物可包含设计为与由至少SEQ ID NO：1的以下位置代表的核苷酸杂交的核苷酸序列：1311-1321、1302-1312、6060-6070和/或6069-6079。
在其它实施方案中，有用引物对包含与在插入DNA的csr1-2编码序列的重复部分的5’端(SEQ ID NO：1的5694位)和毗连的插入DNA(即SEQ ID NO：1的5693位)之间的连接点重叠的一个引物。可将所述引物设计为与来自重复的区域或毗连的插入DNA的约10个核苷酸杂交并且与跨越连接点的至少1个核苷酸(例如SEQ ID NO：1的至少5693-5703或至少5684-5694)杂交。
用于制备和使用用于本发明的探针和引物的方法为本领域已知。PCR引物对可源自已知序列，例如通过用预期用于此目的的计算机程序，例如：Vector NTI版本6中的PCR引物分析工具(Informax Inc.，Bethesda Md.)；PrimerSelect(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)；和Primer(版本1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，Mass.)。另外，可目视审查序列和用本领域技术人员已知的指导方针手工鉴定引物。
IV.育种方法
可使用育种方法将所公开的事件127大豆植物用于育种程序，以产生另外的事件127大豆植物，例如后代植物。所述育种方法可用于产生例如用于不同地理区域的商业生产的大豆植物，或产生另外的大豆繁殖种群。
另外，可使用育种方法将事件127大豆植物用于育种程序，以产生这样的大豆植物，其具有与AHAS抑制剂耐受性联合的其它目的性状(亦称为“叠加的性状”或“性状叠加”)，例如对另外除草剂的抗性的组合，所述另外除草剂为例如草甘膦、草铵膦和/或麦草畏。另外，可使用育种方法将事件127大豆植物用于育种程序，以产生具有多个抑制AHAS的除草剂抗性编码序列的大豆植物。此外，可用育种方法将公开的植物用于育种程序，以产生具有与其它农艺上重要的性状组合的抑制AHAS的除草剂耐受性状的植物，所述其它性状包括输入性状(例如疾病和病原体抗性，例如由Bt基因所赋予的抗性)和产出性状，例如油和蛋白质质量和数量。
所公开的培育抑制AHAS的除草剂抗性大豆植物的方法包括以下步骤：(a)让事件127大豆植物与第二种大豆植物杂交；和(b)从杂种获得种子。可进一步筛选获得的种子以鉴定含有具有事件127核酸分子的DNA的种子。所述方法还可包括获得来自杂种种子的DNA样品，和测定样品是否存在事件127核酸分子。或者，可针对抑制AHAS的除草剂耐受性筛选种子，以鉴定含有事件127DNA的种子或后代。
可用任何可获得的大豆育种方法培育事件127大豆植物。例如，事件127大豆植物可如下培育：首先通过让自转基因事件127大豆植物(或其源自用赋予除草剂耐受性的实施方案的表达盒转化的后代)生长的第一亲本大豆植物，与缺乏除草剂耐受表型的第二亲本大豆植物有性杂交，由此产生众多第一代后代植物；然后选择表现出所期需的除草剂耐受性的第一代后代植物；以及将第一代后代植物自交，从而产生众多第二代后代植物；然后选择表现出所期需的除草剂耐受性的 第二代后代植物。这些步骤可进一步包括让第一代除草剂耐受性后代植物或第二代除草剂耐受性后代植物与第二亲本大豆植物或第三亲本大豆植物回交，由此产生表现出所期需的除草剂耐受性的大豆植物。另外认可的是，无需测定后代表型。可将本文别处公开的各种方法和组合物用于检测和/或鉴定事件127插入物。
亦应理解的是，两种不同的转基因植物亦可有性杂交以产生含有两种独立分离的附加外源基因的后代。合适后代的自交可产生两种附加的外源基因的纯合植物。亦考虑与亲本植物回交和与非转基因植物异型杂交，营养体繁殖也是如此。然而，可采用任何方法来产生所述植物。
可培育含有事件127核酸分子的近亲繁殖大豆系，用于生产大豆品种和作为亲本植物用于在育种程序中以产生新的独特的近交大豆系。近交大豆系通常用作通过传统育种和/或分子基因渗入技术基因渗入新性状的靶标。可利用很多分析方法来测定近交系的纯合性和表型稳定性。
在某些实施方案中，可将导致产生本发明事件127大豆植物的核酸分子，工程改造为含赋予第二除草剂(例如草甘膦)抗性的核酸分子的分子叠加物(stack)。在其它实施方案中，分子叠加物进一步包含至少一种赋予对第三除草剂耐受性的另外的核酸分子。在一个实施方案中，所述序列赋予对草铵膦的耐受性，在特定实施方案中，所述序列包含pat。
在其它实施方案中，本发明事件127大豆植物包含一种或多种目的性状，在某些实施方案中，为了产生含所期需性状组合的植物，让事件127DNA与核酸分子序列和/或目的性状的任何组合叠加。本文所用性状是指源自特定序列或序列群的表型。例如，耐受除草剂的核酸分子可与编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的任何其它核酸分子叠加，所述多肽为例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白(Bt蛋白)、凝集素等。所产生的组合亦可包括任一种目的核酸分子的多个拷贝。
在某些实施方案中，可让大豆事件127 DNA与其它耐受除草剂的性状叠加，以产生含进一步改进的特性的本发明转基因植物。可用于这类实施方案的其它耐受除草剂的核酸分子，包括通过其它作用方式赋予对草甘膦或AHAS抑制剂耐受性的核酸分子，例如编码草甘膦氧化还原酶的基因。可与大豆事件127 DNA组合的其它性状，包括源自赋予植物产生较高水平5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)能力的核酸分子的性状。可与大豆127事件组合的其它性状包括赋予对磺酰脲和/或咪唑啉酮耐受性的性状。
在某些实施方案中，大豆事件127 DNA可与例如羟苯基丙酮酸双加氧酶叠加，所述酶催化对羟苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的反应。抑制该酶并与该酶结合以抑制HPP转化为尿黑酸的分子，可用作除草剂。赋予植物耐受所述除草剂的性状为本领域已知。可与大豆事件127 DNA叠加的合适的除草剂耐受性性状的其它实例，包括芳氧基链烷酸双加氧酶核酸分子(据说其赋予对2，4-D和其它苯氧基生长素类除草剂以及对芳氧基苯氧基丙酸除草剂的耐受性)和耐受麦草畏的核酸分子。
可与大豆事件127 DNA组合的除草剂耐受性性状的其它实例，包括由编码外源草丁膦乙酰基转移酶的核酸分子赋予的性状。含有外源草丁膦乙酰基转移酶的植物可表现出改进的对草铵膦除草剂的耐受性，所述草铵膦除草剂抑制谷氨酰胺合酶这种酶。可与大豆事件127 DNA组合的除草剂耐受性性状的其它实例，包括由赋予改变的原卟啉原氧化酶(protox)活性的核酸分子赋予的性状。含有所述核酸分子的植物可表现出改进的对靶向protox酶的多种除草剂(亦称为“protox抑制剂”)中任何一种的耐受性。
可与AHAS抑制剂耐受性性状组合的除草剂耐受性性状的其它实例，包括赋予植物(例如大豆植物)对至少一种除草剂的耐受性的性状。除草剂耐受性大豆为本领域已知，对具体除草剂的耐受性不同的植物也是如此。可通过育种或经由其它方法将负责这些耐受性的一种 或多种性状与事件127大豆植物组合，以提供本发明植物以及其使用方法。
大豆事件127DNA亦可与至少一种其它性状组合，以产生另外包含多种所期需性状组合的本发明植物，所述性状组合包括但不限于：对动物饲料所期需的性状，例如高油含量、氨基酸组成、蛋白质含量、改进的消化性或改变的脂肪酸组成。
大豆事件127 DNA亦可与其它所期需性状组合，所述期需性状为例如无毒性和疾病抗性基因，例如大豆孢囊线虫(cyst nematode)抗性性状，例如SCN，和对加工或加工产物所期需的性状，例如提高的油含量或改良的脂肪酸组成(例如脂肪酸去饱和酶基因；和聚合物或生物塑料(例如β-酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合酶和乙酰乙酰-CoA还原酶)促进聚羟基烷酸酯(PHA)表达)。人们亦可将除草剂耐受性核酸分子与提供任何农艺性状的核酸分子组合。
可通过任何方法产生这些叠加的组合，所述方法包括但不限于通过任何已知方法或遗传转化培育植物。若通过遗传转化植物来叠加序列，则可在任何时间及以任何次序组合目的核酸分子序列。可在共转化方案中让所述性状与通过转化盒的任何组合提供的目的核酸分子同时引入。例如，若引入两个序列，则所述两个序列可包含在分开的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)中。可通过相同的启动子或不同的启动子来驱动序列表达。在某些情况下，可期需引入抑制目的核酸分子表达的转化盒。这可与其它抑制盒或过表达盒的任何组合联合，以在植物中产生所期需的性状组合。进一步认可的是，核酸分子可用位点特异性重组系统在期需基因组位置叠加。
亦提供培育具有事件127 DNA的大豆植物的方法，其中所述方法包括：(a)让事件127大豆植物或其衍生物与第二大豆亲本植物杂交；(b)从杂种获得种子；(c)从一个或多个种子获得DNA样品；和(d)检测事件127核酸分子的存在情况。
V.转化的植物
亦可通过转化自事件127大豆植物获得的植物材料或部分，来产生具有与事件127性状组合的性状的大豆植物。可用任何技术人员可获得的转化方法将另外的性状组合到事件127大豆植物中。因此，可将事件127大豆植物用作植物材料来源，用于将另外的异源核酸分子引入到事件127大豆植物的转化方法中。例如，可制备转化载体以将目的基因引入到事件127大豆植物中，以产生具有多种引入的性状的大豆植物。
可将用于所述方法的转化载体用于产生转化有任何目的基因(包括本文所述目的基因)的植物。转化载体可包括待引入且通常在转化的事件127大豆植物中表达的选择性标记和目的基因。所述选择性标记为本领域已知。本发明目的基因视待引入的期需性状而变化。例如，各种表型变化可为目的，所述目的包括改变植物中的脂肪酸组成，改变植物的氨基酸含量，改变植物防御昆虫和/或病原体的机制等。可通过在植物中提供异源产物表达或提高内源性产物的表达来得到这些结果。或者，可通过在植物中提供降低一种或多种内源性产物、特别是酶或辅因子的表达来得到这些结果。这些变化导致转化的植物的表型变化。
任何转化载体可用于本发明方法。可获得多种用于转化植物的植物转化载体和方法。转化方法可用于让任何性状与由事件127插入物提供的抑制AHAS的除草剂耐受性的性状叠加，所述任何性状包括本文所述的性状。
VI.检测方法
亦提供用于鉴定和/或检测生物学样品中事件127核酸分子的方法和组合物，所述样品为例如自大豆植物包括后代和衍生物获得的样品。所述方法可用于鉴定和/或检测任何生物学材料中事件127区或核酸分子。所述方法包括例如确证种子纯度的方法，和用于针对事件127核酸分子筛选种子批中的种子的方法。在一个实施方案中，提供了用于鉴定生物学样品中的127插入核酸分子的方法，所述方法包括形成生物学样品和能够扩增事件127核酸分子的第一和第二核酸引 物的混合物；让混合物在允许第一和第二核酸引物扩增大豆事件127核酸分子的条件下反应；和检测是否存在扩增的事件127核酸分子。在某些实施方案中，事件127核酸分子为事件127特异性核酸分子。
亦提供用于鉴定生物学样品中的事件127核酸分子的方法，所述方法包括形成含有具有大豆DNA的生物学样品和能够与大豆事件127核酸分子杂交的核酸分子探针的混合物，让混合物在允许核酸分子探针与事件127核酸分子杂交的条件下反应，和检测核酸分子探针是否与样品中的事件127核酸分子杂交，其中存在杂交表明存在事件127核酸分子。
亦可将本发明方法用于鉴定和/或检测生物学样品中的事件127插入核酸分子。在一个实施方案中，提供用于鉴定生物学样品中事件127核酸分子的方法，所述方法包括形成生物学样品和能够扩增事件127插入核酸分子的第一和第二核酸引物的混合物；让混合物在允许第一和第二核酸引物扩增事件127插入核酸分子的条件下反应；和检测是否存在扩增的事件127插入核酸分子。
亦提供用于鉴定生物学样品中的事件127核酸分子的方法，所述方法包括形成含有具有DNA的生物学样品和能够与事件127核酸分子杂交的核酸分子探针的混合物，让混合物在允许核酸分子探针与事件127核酸分子杂交的条件下反应，和检测核酸分子探针是否与样品中的事件127核酸分子杂交，其中存在杂交表明存在事件127核酸分子。
进一步提供用于检测生物学样品中的事件127区的方法。可用本发明方法检测的事件127区，包括事件127插入DNA、5’连接区、3’连接区、5’侧翼区、3’侧翼区、因转化事件而产生的插入DNA的独特突变或重复或者其任何组合及片段。
生物学样品可包括任何样品，人们期需测定其中是否存在具有事件127核酸分子的DNA。例如，生物学样品可包括任何植物材料或包含或源自植物材料的材料，例如但不限于粮食或饲料产品。本文所用“植物材料”是指获自或源自植物或植物部分的材料。在具体实施方 案中，生物学样品包含大豆组织。在其它实施方案中，生物学样品自大豆叶组织获得。在其它实施方案中，生物学样品自大豆种子组织获得。
可用本发明方法检测和/或鉴别任何事件127-相关核酸分子。例如，可检测的核酸分子包括但不限于DNA、mRNA、cDNA等。在其它实施方案中，可用本发明方法检测和/或鉴定由事件127核酸分子编码的多肽。被检测和/或鉴定的核酸分子可包括事件127插入DNA的任何片段，包括经鉴定的插入DNA的突变，例如编码具有S653N或R272K等的AHAS多肽的核酸分子、启动子序列、终止序列、所述序列的片段及其组合。
可将本文所公开的方法中使用的引物和探针用于通过常规方法确证(必要时校正)所公开的序列，例如通过再克隆(re-cloning)和序列测定所述序列。核酸分子探针和引物特异性检测靶标DNA序列。任何常规核酸杂交或扩增方法可用于检测或鉴定样品中来自转基因事件的核酸分子的存在情况。“特异性检测”意指可将核酸分子用作引物来扩增127特异性区，或可将核酸分子用作在严格条件下与具有事件127特异性区的核酸分子杂交的探针。允许特异性检测127事件或127事件特异性区的杂交的水平或程度，足以将含127特异性区的核酸分子与缺乏该区的核酸分子区别开，藉此允许区别地鉴定事件127分子。“共享足以允许事件127核酸分子扩增的序列同一性或互补性”，意指序列与具有事件127核酸分子的核酸分子的片段共享至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或互补性或跨越所述核酸分子全长。
关于用特定扩增引物对扩增靶标核酸分子(例如通过PCR)，“严格条件”为在DNA热扩增反应中允许引物对与靶标核酸分子杂交的条件，具有对应的野生型序列(或其互补序列)的引物与所述靶标核酸分子结合，并优选产生具有事件127核酸分子的可鉴别的扩增产物(扩增子)。在PCR方法中，可将寡核苷酸引物设计用于PCR反应以扩增事件127核酸分子。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法通常为本 领域已知。应该理解，可能需要将特异性PCR方案中的多个参数按具体的实验条件进行调整，可稍作修改但仍允许获得相似结果。这些调整对本领域技术人员显而易见。
可将用于所公开方法的引物用于扩增任何127核酸分子。例如，可设计能够扩增表明植物含有事件127核酸分子片段的区域的引物对。在一个实施方案中，所述引物对可扩增包含单个连接例如5’连接区或3’连接区的区域。所述引物对包括能够引发从侧翼染色体区(例如5’或3’侧翼区)以插入DNA方向延伸的一个引物，而第二个引物能够在染色体侧翼区中从插入DNA以第一引物方向引发。所述引物对扩增包含连接区的核酸分子。在某些实施方案中，用于扩增对中的引物之一能够与跨越连接区(例如5’或3’连接区)之一的区域退火，并能够以染色体区方向或以插入物方向扩增。用于所述方法的侧翼染色体区引物可能能够与5’或3’侧翼染色体区退火，并引发以插入物方向扩增。在其它实施方案中，可设计能够扩增两个连接的引物对。
可设计能够与5’或3’侧翼区退火的合适引物的其它实例用于所述方法，其可包含能够与SEQ ID NO：1的1-1311位或SEQ ID NO：1的6070-10,656位核酸分子退火的约10或12-约40个核苷酸的引物序列。
或者，可开发能够在整个植物基因组退火的随机引物，其可与插入物特异性引物联合使用，以扩增包含插入DNA和侧翼序列片段的核酸分子。在某些实施方案中，可标记插入物特异性引物以使得可检测用插入物特异性引物扩增的片段。在其它实施方案中，可让得到的扩增的核酸分子与标记的探针杂交，以鉴定或检测事件127核酸分子。
在另一实施方案中，可开发扩增整个插入DNA或指示事件127 DNA的插入物部分的引物对。例如，在某些实施方案中，可将引物对设计为用从插入物的5’和3’侧翼区引发的引物来扩增整个插入DNA。或者，可设计这样的引物对，其能够仅扩增事件127插入物区域，以鉴定插入物的存在情况。例如，可将引物设计为扩增质粒 pAC321的PvuII片段内的任何区，用于检测生物学样品中插入物的存在情况。所述引物包括能够扩增插入DNA的任何区域的引物，所述任何区域包括SEQ ID NO：1的1312和6069位之间的区域。在某些实施方案中，可开发这样的引物对，其能够扩增插入DNA的拟南芥突变体AHAS编码序列(例如2762到4774位或其片段)或编码序列与插入物调控序列的任何组合。
扩增的核酸分子(扩增子)可具有允许检测事件127核酸分子的任何长度。例如，扩增子可为约10、50、100、200、300、500、700、100、2000、3000、4000、5000个核苷酸长或更长。
在某些实施方案中，可检测事件127核酸分子的一个或多个特别的区域。
在本发明方法中可采用允许事件127核酸分子被扩增和/或检测的任何引物。在一个实施方案中，引物包含事件127核酸分子或与其互补，例如包含对应于具有SEQ ID NO：1序列的核酸分子或与其互补的8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个连续核苷酸。例如，在某些实施方案中，第一和第二引物包含SEQID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、67、68、69和70的核酸分子，其中第一或第二引物与所述核酸分子共享足够扩增事件127核酸分子的序列同一性或互补性。在再另外的实施方案中，第一和第二引物可包含SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、67、68、69和70中提出的序列的任何之一或任何组合。引物可具有足以扩增大豆事件127区的任何长度，包括例如至少6、7、8、9、10、15、20、15或30或约7-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45个核苷酸或更长。
如上所述，在某些实施方案中，有用引物对包括与在插入DNA和侧翼5’或3’基因组DNA之间的连接点重叠的一个引物。可将所述引物沿着在5’侧翼DNA和插入DNA之间的连接点(即SEQ ID NO：1的1311和1312位之间的连接)，以及在插入DNA和3’侧翼DNA之间的连接点(即SEQ ID NO：1的6069和6070位之间的连接)设计。可将所述引物设计为与来自侧翼区或插入DNA的约10个核苷酸和与跨越插入DNA或侧翼区的连接点的至少1个核苷酸杂交。因此，例如，引物可包含设计为与由SEQ ID NO：1的至少以下位置代表的核苷酸杂交的核苷酸序列：1311-1321、1302-1312、6060-6070和/或6069-6079。
在其它实施方案中，有用引物对包括与在插入DNA的csr1-2编码序列的重复部分的5’端(SEQ ID NO：1的5694位)和相邻插入DNA部分的3’端(即SEQ ID NO：1的5693位)之间的连接点重叠的一个引物。可将所述引物设计为与来自重复区域或相邻插入DNA的约10个核苷酸和与跨越连接点的至少1个核苷酸(例如SEQ ID NO：1的至少5693-5703或至少5684-5694)杂交。
如本文别处所论述，可采用PCR扩增事件127核酸分子的任何方法，包括例如实时PCR。
因此，在某些实施方案中，提供检测生物学样品中事件127核酸分子的存在情况的方法。所述方法包括：(a)从生物学样品提取DNA样品；(b)提供DNA引物对分子(例如SEQ IDNO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、67、68、69和70中的任何组合，其中所述组合扩增大豆事件127区)，其包括但不限于以下序列：i)SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；ii)SEQ IDNO：37和SEQ ID NO：38；iii)SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40；iv)SEQ ID NO：41和SEQ IDNO：42；v)SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44；vi)SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68；和vii)SEQ IDNO：69和SEQ ID NO：70；(c)提供DNA扩增反应条件；(d)进行DNA扩增反应，藉此产生DNA扩增子分子；和(e)检测DNA扩增子分子，其中DNA扩增反应中DNA扩增子分子的检测，表明样品中存在事件127核酸分子。为了让核酸分子作为引物或探针，仅需要序列中的互补性足以能够在所采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定双链结构。
在杂交技术中，可采用选择性与靶标事件127核酸分子杂交的核酸分子的全部或部分。当提及核酸分子探针条件的“严格条件”或“严格杂交条件”时，意指在该条件下探针与其靶标序列杂交的可检测程度大于其它序列(例如至少背景的2倍)。关于用特定扩增引物对扩增靶标核酸分子(例如通过PCR)，“严格条件”为允许引物对与靶标核酸分子杂交的条件，所述核酸分子与具有对应野生型的引物杂交。严格条件为序列依赖性的，在不同环境中将不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶标序列(同源性探测)。或者，可调整严格条件以使序列有某些错配，由此检测较低的同一性程度(异源性探测)。通常探针小于约1000个核苷酸长或小于500个核苷酸长。
本文所用基本上同一或互补的序列为在高严格条件下，与其正与之比较的核酸分子的互补序列特异性杂交的核酸分子。本领域技术人员已知促进DNA杂交的合适的严格条件，例如约45℃6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着50℃以2X SSC洗涤。通常用于杂交和检测的严格条件为以下条件：其中在pH 7.0-8.3下盐浓度小于约1.5M Na离子，通常为约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)，对于短探针(例如10-50个核苷酸)，温度至少约30℃，对于长探针(例如大于50个核苷酸)，温度至少约60℃。加入去稳定剂例如甲酰胺亦可获得严格条件。低严格条件实例包括用30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃杂交，和用1X-2X SSC(20XSSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)在50-55℃洗涤。中严格条件实例包括用40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS在37℃杂交，和用0.5X-1X SSC在55-60℃洗涤。高严格条件实例包括用50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS在37℃杂交，和用0.1X SSC在60-65℃洗涤。任选洗涤缓冲液可包含约0.1％-约1％SDS。杂交持续时间通常小于约24小时，通常约4-约12小时。洗涤持续时间将至少为足以达到平衡的时间长度。
在杂交反应中，特异性通常为杂交后洗涤的函数，关键因子是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂合体，Tm可根据Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284方程近似计算：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂合体中的碱基对长度。Tm为50％的互补靶标序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定离子强度和pH下)。对每错配1％，Tm降低约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以与所期需同一性的序列杂交。例如，若探寻具有≥90％同一性的序列，则Tm可降低10℃。通常选择严格条件为在限定离子强度和pH下低于特定序列及其互补序列的热熔点(Tm)约5℃。然而，非常严格条件可利用在低于热熔点(Tm)1、2、3或4℃下的杂交和/或洗涤；中严格条件可利用低于热熔点(Tm)6、7、8、9或10℃下的杂交和/或洗涤；低严格条件可利用低于热熔点(Tm)11、12、13、14、15或20℃下的杂交和/或洗涤。利用方程、杂交和洗涤组成及所期需Tm，普通技术人员理解的是，固有地阐述杂交和/或洗涤溶液严格性的变化。若期需的错配程度导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，最理想是提高SSC浓度，以便可使用较高温度。可通过本领域技术人员已知的多种方法来检测探针与靶标DNA分子的杂交，这些方法可包括但不限于：荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。
若核酸分子与另一核酸分子表现出互补性，则认为该核酸分子为另一核酸分子的“互补序列”。如本文所用，当核酸分子之一的每一个核苷酸与另一分子的核苷酸互补时，认为分子表现出“完全互补性”。若两个分子在至少常规“低严格性”条件下，可彼此以允许它们保持彼此退火的足够稳定性来杂交，则认为它们具有“最小的互补性”。同样地，若分子在常规“高严格性”条件下，可彼此以允许它们保持彼此退火的足够稳定性来杂交，则认为它们具有“互补性”。
在其它实施方案中，可通过检测表达的拟南芥AHAS多肽来检测或鉴定事件127植物。可将任何方法用于检测AHAS多肽。例如，可将针对引入的AHAS蛋白产生的抗体用于检测AHAS多肽的表达的存在情况。
可将任何方法用于检测事件127核酸分子或其扩增子，所述方法包括但不限于遗传位分析(Genetic Bit Analysis)。在一种方法中，设计使邻接侧翼DNA序列和插入的DNA序列两者重叠的DNA寡核苷酸。在其它实施方案中，设计DNA引物寡核苷酸提供事件127特异性扩增子。将寡核苷酸固定在微孔板的孔中。在目的区域PCR后，可让单链PCR产物与固定的寡核苷酸杂交，并用作单碱基延伸反应的模板，所述延伸反应使用DNA聚合酶和对所预期的下一个碱基特异的标记ddNTP。读出可基于荧光或ELISA。信号表明由于成功地扩增、杂交和单碱基延伸所致而存在插入序列/侧翼序列。
用于本发明方法的另一检测方法是焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术。在该方法中，设计使邻接DNA和插入DNA连接重叠的寡核苷酸，或采用可扩增事件127特异性区的寡核苷酸对。寡核苷酸与来自目的区域的单链PCR产物杂交(一个引物在插入物的序列中，一个在侧翼序列中)，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酶、腺苷5′磷酸硫酸酐和荧光素存在下孵育。单独地加入dNTP，掺入产生可测量的光信号。光信号表明由于成功扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸所致而存在转基因插入序列/侧翼序列。
亦可将荧光偏振用于检测本发明扩增子。使用该方法，设计使侧翼和插入DNA连接重叠的寡核苷酸，或采用可扩增事件127特异性区的寡核苷酸对。寡核苷酸与来自目的区域的单链PCR产物杂交(一个引物在插入DNA中，一个在侧翼DNA序列中)，并在DNA聚合酶和荧光-标记的ddNTP存在下孵育。单碱基延伸导致掺入ddNTP。可用荧光计测量作为偏振变化的掺入。偏振变化表明由于成功扩增、杂交和单碱基延伸所致而存在转基因插入序列/侧翼序列。
亦可将Taqman 基因表达测定(PE Applied Biosystems，Foster City，Calif.)用于检测和定量测定事件127核酸分子的存在情况。简言之，设计使侧翼和插入DNA连接重叠的FRET寡核苷酸探针，或采用可扩增事件127核酸分子的寡核苷酸对。FRET探针和PCR引物(一个引物在插入DNA序列中，一个在侧翼基因组序列中)在热稳定聚合酶和dNTP存在下循环。FRET探针杂交导致从FRET探针上的猝灭部分裂解并释放荧光部分。荧光信号表明由于成功扩增及杂交所致而存在侧翼/转基因插入序列。
在所公开的方法中亦可采用分子信标。简言之，设计使侧翼和插入DNA连接重叠的FRET寡核苷酸探针，或采用可扩增127特异性区的寡核苷酸对。FRET探针的独特结构导致其含有保持荧光和猝灭部分紧密接近的二级结构。FRET探针和PCR引物(一个引物在插入DNA序列中，一个在侧翼序列中)在热稳定聚合酶和dNTP存在下循环。在成功PCR扩增后，FRET探针与靶标序列杂交导致失去探针的二级结构，在空间上分开了荧光和猝灭部分。产生荧光信号。荧光信号表明由于成功扩增和杂交所致而存在侧翼/转基因插入序列。
使用对在扩增子内发现的序列特异的探针的杂交反应，是用于检测本发明PCR反应产生的扩增子的又一种方法。
在另一实施方案中，可通过检测由事件127核酸分子产生的多肽的方法来检测或鉴定事件127核酸分子。例如，可用本文所公开的方法检测csr-1 AHAS基因的表达产物。所述方法可涉及使用能够结合由插入的事件127核酸分子产生的多肽的结合蛋白。所述方法包括但不限于免疫学测定，例如ELISA(酶联免疫吸附测定)、抗原测定、免疫染色、免疫组织化学、蛋白质芯片测定、放射免疫沉淀测定、快速膜免疫色谱测定和快速条(rapid stick)免疫色谱测定(侧流测试)。
本文所公开的方法可适用于高通量技术，例如通过连接基材上的诊断分子(例如引物和/或探针)以形成装置例如阵列或微阵列或多孔板。可以以任何有用形式提供所述装置，例如芯片、滑片、板、膜、纤维、珠粒、条、棒、垫、格栅、杆、织物、容器壁等。另外，基材 可由可获得的任何材料制备，所述材料为例如玻璃、陶瓷、凝胶(例如水凝胶、微凝胶、假凝胶)和聚合材料(例如塑料、硅酮、含氟聚合物)。因此，用于本发明装置和方法的基材包括但不限于：二氧化硅芯片、尼龙膜、光纤、多孔板等。可使用可获得的任何连接方法让探针或其它事件127诊断分子与基材连接，所述方法为例如共价结合、配位结合和非共价结合(例如离子结合、氢键合、亲脂吸引力)。
可利用基于阵列的方法用于高通量检测、鉴定或监测表达，以测量事件127核酸分子杂交靶标。该基于“芯片”的方法涉及用核酸分子微阵列作为基因特异性杂交靶标以定量测量相应基因的表达。可同时查询大序列中的每一个核苷酸。可将杂交用于有效分析核苷酸序列。
可将可利用的任何微阵列方法用于本发明方法中。例如，微阵列方法可将待通过杂交分析的序列与代表所有可能亚序列的寡核苷酸或cDNA分子组进行比较。第二种方法让样品与寡核苷酸或cDNA探针的阵列杂交。可将由与事件127靶标序列的亚序列互补的寡核苷酸或cDNA分子组成的阵列，用于测定靶标序列的同一性，测量其量，和检测靶标和参考序列之间的差异。亦可用蛋白分子或其片段筛选核酸分子微阵列，以测定特异性结合蛋白分子或其片段的核酸分子。用于本发明方法的其它微阵列诊断方法包括例如美国专利公开号2007/0298423所公开的方法。
因此，可用任何可获得的方法鉴定或检测样品中的事件127核酸分子。所述方法包括但不限于：凝胶分离技术、核酸印迹检测(例如DNA杂交、RNA杂交)、定性PCR、半定量或定量PCR、用于检测修饰AHASL的表达的免疫测定(例如使用任何免疫球蛋白、单克隆抗体、单链抗体或保留结合区的抗体片段的ELISA、条测定(例如侧流条))和基于微阵列或“微芯片”的检测测定。在其它实施方案中，所述方法可涉及使用质谱或核磁共振(NMR)技术，以检测或鉴定生物学样品中事件127核酸分子的存在情况。
可用于所述检测方法的装置亦在其不同实施方案中提供，所述装置包含：具有表面的固相支持体；和与其连接的至少一种事件127诊断分子。这些可为杂交测定装置、免疫测定装置、受体-配体结合测定装置或本领域已知的任何其它装置。
VII.试剂盒
本发明亦提供用于检测事件127植物或事件127核酸分子的试剂盒，其中所述试剂盒包括能够扩增事件127核酸分子的第一和第二核酸引物。可直接检测获得的扩增的事件127核酸分子，或在与含有DNA的生物学样品的反应中用作杂交探针。
本文所用“试剂盒”是指用于实施方法实施方案目的的试剂组，更具体地，是用于鉴定和/或检测生物学样品中127事件的试剂组。可将试剂盒用于以下目的或针对以下目的对其组分进行明确调整：质量控制(例如种子批纯度)、检测植物材料或包含或源自植物材料的材料中的事件127核酸分子，所述材料为例如但不限于食物或饲料产品。
在具体实施方案中，提供用于鉴定生物学样品中的事件127核酸分子的试剂盒。所述试剂盒包括第一和第二引物，其中第一和第二引物能够扩增事件127核酸分子。在另外的实施方案中，试剂盒亦包括用于检测事件127核酸分子的核酸分子。试剂盒可包括例如第一引物和第二引物，所述引物包含具有以下序列的核酸分子：SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43和44，其中第一或第二引物与所述核酸分子共享足以扩增事件127核酸分子的序列同源性或互补性。例如，在特定实施方案中，第一引物或第二引物包含具有以下序列的核酸分子片段：SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、67、68、69和70，其中第一或第二引物与所述核酸分子共享足以扩增事件127分子的序列同源性或互补性。引物对可包含具有SEQ ID NO：5序列的核酸分子的片段和具有SEQ ID NO：6序列的核酸分子的片段，或备选地，引物对可选自以下序列：i)SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；ii)SEQ ID NO：37和SEQID NO：38；iii)SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40；iv)SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42；v)SEQID NO：43 和SEQ ID NO：44；vi)SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68；和vii)SEQ ID NO：69和SEQID NO：70。在另外实施方案中，第一和第二引物可包含以下提出的序列中的任一种或任何组合：SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、67、68、69和70。引物可具有足以扩增事件127分子的任何长度，包括例如至少6、7、8、9、10、15、20、15或30或约7-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45个核苷酸或更长。
进一步提供DNA检测试剂盒，所述试剂盒包括可特异性检测事件127区的至少一种核酸分子，其中核酸分子包含至少一种DNA分子，其具有足够长度的与SEQ ID NO：5和/或6同源或互补的连续核苷酸。在某些实施方案中，DNA检测试剂盒包括具有SEQ ID NO：5和/或6的核酸分子，或包括与特异性检测事件127区的序列杂交的序列，例如选自SEQ ID NO：5和/或6的序列。
VIII.控制杂草的方法
本发明亦提供用于控制杂草或不想要的植物的方法和组合物。所述方法通常涉及将有效量的一种或多种非选择性除草剂施用至含有一种或多种事件127大豆植物的栽培区或作物田。尽管所公开的方法可控制任何杂草，但在某些实施方案中，所述方法可涉及首先鉴定在区域或田野中对抑制AHAS的除草剂易感的杂草或不想要的植物。
提供用于控制栽培区杂草、防止栽培区杂草或不想要的植物的发育或出现、生产作物和提高作物安全性的方法。术语“控制”及其派生例如“控制杂草”，是指以下一种或多种：抑制杂草和/或不想要的植物生长、发芽、繁殖和/或增殖；和/或杀死、除掉、破坏或另外减少杂草和/或不想要的植物的出现和/或活性。
本发明方法可以以任何可测量的量控制区域内的杂草或不想要的植物，例如与不用同样量及类型的除草剂处理的区域相比，减少区域内杂草或不想要的植物的量达至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。可通过任何可重复的测量手段来测量对杂草或不想要的植物的控制。在一个实施方案中，通过对用 除草剂处理的区域内生长的杂草或不想要的植物的数目进行计数，并与相似大小的未处理区域内的杂草或不想要的植物的数目进行比较，来测量对杂草或不想要的植物的控制。
本发明亦提供用于通过在播种前和/或催芽后用抑制AHAS的除草剂接触事件127大豆植物的种子，来控制杂草或不想要的植物的方法。所述方法可进一步包括将种子播种例如在合适的生长培养基例如田间土壤中或在温室的盆栽培养基中。所述方法尤其可用于控制紧邻种子的附近中的杂草和/或不想要的植物。
杂草就最广泛含义来说应理解为意指生长在非期需的场所的所有植物。
可通过本发明方法控制的杂草包括例如双子叶杂草和单子叶杂草。可用所公开方法控制的双子叶杂草包括但不限于以下属的杂草：白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、拉拉藤属(Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛滕菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、刺酸模属(Emex)、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草属(Trifolium)、毛茛属(Ranunculus)和蒲公英属(Taraxacum)。可用所公开的方法控制的单子叶杂草包括但不限于以下属的杂草：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、 属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高粱属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草 属(Fimbristyslis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、藨草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)和阿披拉草属(Apera)。可由本发明方法控制的具体杂草包括但不限于：农业上重要的杂草，例如番薯属物种(Ipomoea spp.)、鸭跖草属物种(Commelina spp.)、羽芒菊(Tridax procumbens)、大戟属物种(Euphorbia spp.)、黄花稔属物种(Sida spp)、鬼针草属物种(Bidens spp.)、牛滕菊属物种(Galinsoga spp)、茄属物种(Solanum spp.)、苍耳属物种(Xanthium spp)、藜属物种(Chenopodium spp.)、阔叶丰花草(Spermacoce latifólia)、巴西墨苜蓿(Richardia brasiliensis)、苦苣菜(Sonchus oleraceous)、白酒草属物种(Conyza spp)、苋属物种(Amaranthus spp.)、刺苞菊属物种(Acanthospermum spp.)、山香属物种(Hyptisspp.)、马齿苋(Portulaca oleracea)、决明(Casia obtusifolia)；和亦包括控制莎草属物种(Cyperus spp.)的莎草种以及以下草种类，其包括：臂形草属物种(Brachiaria spp.)、马唐属物种(Digitaria spp.)、黍属物种(Panicum spp.)、狗尾草属物种(Setaria spp.)、石茅高粱(Sorghum halepense)、稗属物种(Echnochloa spp.)、牛筋草(Eleusine indica)和狼尾草属(Pennisetum spp)。在使用非选择性咪唑啉酮除草剂的情况下，所公开的方法有对难以控制的杂草的控制具有优势，所述杂草为例如：鸭跖草属物种、白酒草属物种、Chamaesise hirta、阔叶丰花草、巴西墨苜蓿、番薯属物种、猩猩草(Euphorbiaheterophylla)、稗属物种和决明。
另外，可通过本发明方法控制的杂草包括例如生长在确定场所的不想要的作物植物。例如，如果玉米植物在大豆植物田中是不想要的，则可认为在主要包含事件127大豆植物的田中的自生生长的玉米植物为杂草。
可通过本发明方法控制的不想要的植物包括在前面季节在特定田中先前种植的植物，或种植在毗邻区的植物，包括作物植物，包括大豆、玉米、芸苔、棉花、向日葵等。在某些方面，作物植物可耐受 除草剂，例如草甘膦或草铵膦除草剂，或可耐受抑制AHAS的除草剂。
本文所用“栽培地区”或“栽培区”包括人们期望在其中生长一种或多种植物例如事件127大豆植物的任何区域。所述栽培区包括但不限于：事件127大豆植物耕种于其中的田地(例如作物田、田间试验等)、温室、生长室等。
所述方法包括用事件127大豆种子或大豆植物种植栽培区，在某些实施方案中，将有效量的目的除草剂施用于作物、种子、杂草、不想要的植物、土壤或其栽培区。可在耕种事件127大豆植物期间的任何时间施用除草剂。可在将作物种植在栽培区之前或之后施用除草剂。所述除草剂施用可包括施用抑制AHAS的除草剂或其组合。
术语“有效量”意指足以导致在栽培区中任何可观察量度的杂草或不想要的植物控制的除草剂的量。抑制AHAS的除草剂的有效量可介于约50g ai/ha-约500g ai/ha、约50gai/ha-约400g ai/ha或约50g ai/ha-约300g ai/ha。抑制AHAS的除草剂的有效量亦可为约70g ai/ha、140g ai/ha或280g ai/ha。本发明方法中对于抑制AHAS的除草剂的施用有效率可受包括环境在内的多种因素影响，应该在实际使用条件下确定。对杂草或不想要的植物的控制可如下获得：通过以类似于或大于用于在不含事件127大豆的区域中的这类控制的量的比例(rate)一次或多次施用抑制AHAS的除草剂。所述施用比例包括以下或等同于以下的施用比例：70g ai/ha、140或280g ai/ha。典型的商业施用比例为约70g ai/ha的抑制AHAS的除草剂，亦称为1X施用比例。
在某些实施方案中，有效量可为大于待控制的杂草或不想要的植物耐受的量的抑制AHAS的除草剂量。例如，在其中杂草或不想要的植物耐受70g ai/ha施用但对140g ai/ha施用易感的实施方案中，那么有效量为140g ai/ha。
因此，本发明提供在栽培区控制杂草或不想要的植物生长的方法，所述方法包括将有效量的非选择性除草剂施用于具有一种或多种事件127大豆植物的栽培区。
亦提供在栽培区控制耐受草甘膦的杂草或植物的方法，所述方法包括将有效量的抑制AHAS的除草剂施用于具有一种或多种事件127大豆植物的栽培区。
亦提供在栽培区控制抑制AHAS的除草剂耐受性杂草或植物的方法，所述方法包括将有效量的抑制AHAS的除草剂施用于具有一种或多种事件127大豆植物的栽培区。在所述实施方案中，以足以控制杂草同时对事件127大豆植物基本上不具影响的量施用有效量的抑制AHAS的除草剂。
在某些实施方案中，可在区域内种植事件127大豆种子之前控制的杂草。例如，可在种植种子之前以有效量施用非选择性除草剂例如抑制AHAS的除草剂，以在种植种子之前减少或除去区域内的杂草。所述施用可在对控制杂草有效的种植之前的任何时间量进行，例如种植前的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。另外，可在所述方法中施用任何农用组合物的组合。
在其它实施方案中，可在种植事件127大豆种子后控制杂草。例如，可将抑制AHAS的除草剂以有效控制区域内杂草的量，施用于生长的大豆植物、植物部分、生长的植物周围及其毗连的生长介质(例如土壤)或其中一种或多种大豆事件127植物正生长的区域(即局部环境)。生长的大豆事件127植物可处于任何发育阶段。在某些所述实施方案中，在施用除草剂时生长的大豆至少处于第一片真叶阶段。另外，可在所述方法中施用任何农用组合物的组合。
当将农用组合物的组合用于所述方法中时，所述组合可包括除草剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀虫剂等的组合。例如，抑制AHAS的除草剂可与其它除草剂组合，所述其它除草剂为例如抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(EPSPS)的除草剂、抑制谷氨酰胺合酶(GS)的 除草剂、抑制原卟啉原[IX]氧化酶(PPO)的除草剂、生长素类除草剂或其组合。
IX.提高产量的方法
亦提供增加一种或多种大豆植物产量的方法，所述方法包括将有效量的抑制AHAS的除草剂施用于具有一种或多种事件127大豆植物的栽培区，并从所述大豆植物收获种子。在某些实施方案中，一种或多种大豆植物产量的增加是降低一种或多种大豆植物的局部区域中生长的杂草的结果，所述杂草通常会与一种或多种大豆植物竞争。
通过使用所述方法，与不具有大豆事件127植物的类似地区相比，区域内的大豆产量可提高。与自其中将有效量的抑制AHAS的除草剂施用于不具有事件127大豆植物的区域的类似地区获得的产量相比，大豆产量可提高任何量，包括但不限于：5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％或更多。
X.农用化学组合物
本发明亦提供用于施用于所公开的大豆127植物的农用组合物。所述组合物可包含除草剂、杀真菌剂、杀细菌剂、肥料等。在一个实施方案中，农用组合物为除草剂组合物，其包含一种或多种除草剂，或一种或多种除草剂与另一种农用组合物例如杀真菌剂、杀细菌剂、肥料等的组合。
可将任何除草剂施用于大豆事件127作物、作物部分或含有事件127大豆植物的栽培区。除草剂分类(即将除草剂分类为类及亚类)为本领域熟知，包括HRAC(除草剂抗性作用委员会(Herbicide Resistance Action Committee))和WSSA(美国杂草科学协会)分类。例如，全世界可在网址hracglobal.com/Publications/ClassificationofHerbicideModeofAction/tabid/222/Default.aspx获得HRAC分类。HRAC分类的缩略版(具有关于对应的WSSA类别的注释)。
在某些实施方案中，本发明提供涉及使用选自以下的至少一种抑制AHAS的除草剂的方法：咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑 并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂、磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂及其混合物。在这些方法中，可通过本领域已知的任何方法施用抑制AHAS的除草剂，所述方法包括但不限于：种子处理、土壤处理和叶处理。
在某些实施方案中，可让抑制AHAS的除草剂与一种或多种另外的农用组合物组合，所述农用组合物为例如另外的除草剂、杀真菌剂、杀细菌剂、抗病毒组合物或其组合。用于组合中的另外的除草剂包括任何除草剂，包括磺酰胺除草剂、有机磷除草剂(organophosphate herbicide)和苯并噻二嗪酮(benzothiadiazinone)除草剂。磺酰胺除草剂包括但不限于苯嘧磺草胺(saflufenacil)。有机磷除草剂包括但不限于草甘膦和草铵膦。苯并噻二嗪酮除草剂包括但不限于苯达松。用于所述组合中的杀真菌剂包括但不限于吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)。
可如下进行用抑制AHAS的除草剂组合物的组合和/或用一种或多种抑制AHAS的除草剂组合物及一种或多种其它农用组合物的处理：通过施用所述组合物的混合物、共施用所述组合物、序贯施用所述组合物或其任何组合。
在某些实施方案中，抑制AHAS的除草剂组合物包含至少一种A)抑制AHAS的除草剂和至少一种另外的活性化合物，所述活性化合物选自B)：b1)-b15)类的除草剂：
b1)脂质生物合成抑制剂；
b2)乙酰乳酸合酶抑制剂(AHAS抑制剂)；
b3)光合作用抑制剂；
b4)原卟啉原-IX氧化酶抑制剂；
b5)漂白剂除草剂；
b6)烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶抑制剂(EPSP抑制剂)；
b7)谷氨酰胺合成酶抑制剂；
b8)7，8-二氢蝶呤酯合酶抑制剂(DHP抑制剂)；
b9)有丝分裂抑制剂；
b10)长链脂肪酸合成抑制剂(VLCFA抑制剂)；
b11)纤维素生物合成抑制剂；
b12)去偶除草剂(decouplerherbicide)；
b13)生长素类除草剂；
b14)生长素转运抑制剂；
b15)选自以下的其它除草剂：新燕灵、氟燕灵、麦草伏M(flamprop-M)、溴丁酰草胺、氯甲丹、环庚草醚、苯丙隆(methyldymuron)、乙氧苯草胺(etobenzanid)、膦铵素、威百亩、稗草畏、氯 嗪草、棉隆、三嗪氟草胺(triaziflam)和甲基溴；和
活性化合物B的农业上可接受的盐和活性化合物B的农业上可接受的衍生物，前提是它们具有羧基。
在其它情况中，可让至少一种A)抑制AHAS的除草剂和至少一种除草剂B的这类组合与安全剂C(所述安全剂亦可与至少一种抑制AHAS的除草剂组合使用)联合使用。安全剂C可选自：解草酮、喹氧乙酸、抑害腈、二氯丙烯胺(diclormid)、dicyclonon、dietholate、解草唑(、解草啶、解草安、肟草安、解草呋、isoxadifen、吡咯二酸、mephenate、萘二甲酸酐、2，2，5-三甲基-1-3-(二氯乙酰基)-1，3- 唑烷(R-29148)，4-(二氯乙酰基)-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷(AD-67；MON 4660)和解草腈、活性化合物C的农业上可接受的盐和活性化合物C的农业上可接受的衍生物，前提为它们具有羧基。
可与抑制AHAS的化合物组合使用的除草剂B的实例为：
b1)来自脂质生物合成抑制剂组的成员：炔禾灵、炔草酯、氯丁草、cyhalofop、氯甲草、 唑禾草灵、高 唑禾草灵、噻唑禾草灵、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵、高效吡氟氯禾灵、恶草醚、 唑酰草胺(metamifop)、喔草酯、喹禾灵、精喹禾灵、三氟苯氧乙酸、枯杀达、丁氧环酮、烯草酮、环乙烯草酮、噻草酮、环苯草酮(profoxydim)、稀禾定、吡喃草酮(tepraloxydim)、肟草酮、苏达灭、草灭特、燕麦敌、哌草丹、EPTC、禾草灭、抑草威、氮草、甲硫苯威、草达灭、坪草丹、克草猛、苄草丹、草克死、杀草丹、丁克威、野麦畏、灭草猛、呋草黄、唑啶草和地散磷；
b2)来自AHAS抑制剂组的成员：酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、氯磺隆、醚磺隆、环丙黄隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶黄隆、甲酰胺磺隆、吡氯磺隆、唑吡嘧磺隆、碘磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧黄隆、砜嘧磺隆、嘧磺隆(sulfometuron)、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酯、甲氧咪草烟、甲基咪草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚和嘧草硫醚；
b3)来自光合作用抑制剂组的成员：阿特拉通、阿特拉津、莠灭净、叠氮津、草净津、硫草净津、可乐津、环草津、敌草净、戊草津、杀草净、草止津、草怕津、麦苏百津、醚草通、盖草津、环氰津、丙草止津、扑灭通、扑草净、扑灭津、另丁津、密草通、西玛津、西玛通、西草净、甲氧去草净、特丁津、去草净、草达津、特津酮、特草嗪酮、六嗪同、嗪丁草、苯嗪草、赛克津、除草定、异草定、环草定、特草定、溴杀草敏、杀草敏、敌米达松、异苯敌草、敌克草、苯敌草、苯敌草乙酯、噻草隆、丁噻隆、噻二唑隆、异恶隆、噻唑隆、monoisouron、丁唑隆、赛唑隆、疏草隆、播土隆、氯溴隆、乙氧苯隆、绿麦隆、枯草隆(氯xuron)、枯莠、丁 隆、敌草隆、非草隆、伏草隆、氟苯隆、异丙隆、利谷隆、灭草恒、色满隆、秀谷隆、甲氧隆、绿谷隆、灭草隆、草不隆、对氟隆、稀草隆、环草隆、氟氧隆、噻二唑素、莎草快、二乙除草双、野燕枯、敌草快、伐草快、百草枯、糠草腈、溴苯腈、羟敌草腈、碘草腈、碘苯腈、胺唑草酮(amicarbazone)、杀草全、三氟 嗪、灭草定、噻草平、敌稗、蔬草灭、达草止和pyridafol；
b4)来自原卟啉原-IX氧化酶抑制剂组的成员：氟锁草醚、治草醚、氯硝醚、草枯醚、氟乳醚(ethoxyfen)、消草醚、乙羧氟草醚、氟草醚、氟黄胺草醚、氟呋草醚、氟硝磺酰胺、乳氟禾草灵、除草醚、硝氟草醚、乙氧氟草醚、异丙吡草酯(fluazolate)、pyraflufen、吲哚酮草酯 (cinidon-ethyl)、酰亚胺苯氧乙酸、氟 嗪酮、炔草胺(flumipropyn)、fluthiacet、噻二唑胺、恶草灵、炔丙 唑草、唑啶炔草、三唑酮草酯(carfentrazone)、磺胺草唑、戊唑草、双苯嘧草酮(benzfendizone)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、双唑草腈(pyraclonil)、氟唑草胺(profluazol)、氟哒嗪草酯(flufenpyr)、氟单丙嘧草酯(flupropacil)、吡氯草胺和乙胺草醚；
b5)来自漂白剂除草剂组的成员：氟哒草、达草灭、氟苯啶草、吡氟草胺、氟吡草胺(picolinafen)、氟丁酰草胺(beflubutamid)、氟草同、氟咯草酮(flurochloridone)、呋草酮、甲基磺草酮(mesotrione)、磺草酮、异 氯草酮(isoxachlortole)、异 氟草、吡草酮、吡唑特、苄草唑、苯并双环酮(benzobicyclon)、杀草强、异恶草酮、苯草醚、4-(3-三氟甲基苯氧基)-2-(4-三氟甲基苯基)嘧啶和还有3-杂环基-取代的式I的苯甲酰基衍生物：
其中变量R8-R13如下定义：R8、R10为氢、卤素、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-卤代烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基亚磺酰基或C1-C6-烷基磺酰基；R9为选自以下的杂环基：噻唑-2-基、噻唑-4-基、噻唑-5-基、异 唑-3-基、异 唑-4-基、10异 唑-5-基、4，5-二氢异 唑-3-基、4，5-二氢异 唑-4-基和4，5-二氢异 唑-5-基，其中提及的9个自由基可不被取代，或被以下基团单取代或多取代(例如单取代、二取代、三取代或四取代)：卤素、C1-C4-烷基、C1-C4- 烷氧基、C1-C4-卤代烷基、C1-C4-卤代烷氧基或C1-C4-烷硫基；R11为氢、卤素或C1-C6-烷基；R12为C1-C6-烷基；R13为氢或C1-C6-烷基。
b6)来自EPSP合酶抑制剂组的成员：草甘膦；
b7)来自谷氨酰胺合酶抑制剂组的成员：草铵膦和双丙氨酰膦(bilanaphos)；
b8)来自DHP合酶抑制剂组的成员：黄草灵；
b9)来自有丝分裂抑制剂组的成员：氟草胺(benfluralin)、地乐胺、敌乐胺、丁氟消草、氟消草、异乐灵、氟烯硝草、磺乐灵、黄草消、胺消草、氨基丙氟灵、卡乐施、氟乐灵、甲基胺草磷、草胺磷、氟硫草定、噻氟啶草、拿草特、丙戊草胺、敌草索、长杀草、绿草灵、氯苯胺灵和苯胺灵；
b10)来自VLCFA抑制剂组的成员：乙草胺、甲草胺、丁草胺、丁烯草胺、敌草乐、安塔、克草胺、噻吩草胺、噻吩草胺-P、吡草胺、异丙甲草胺、S-异丙甲草胺(S-metolachlor)、丙草胺、扑草胺、异丙草胺、广草胺、猛杀草、噻醚草胺、二甲苯草胺、草毒死、CDEA、磺唑草、草乃敌、草萘胺、萘丙胺、烯草胺(pethoxamid)、氟噻草胺(flufenacet)、苯噻草胺、四唑酰草胺(fentrazamide)、莎稗磷、哌草磷、唑草胺(cafenstrole)、茚草酮(indanofan)和灭草环；
b11)来自纤维素生物合成抑制剂组的成员：敌草腈、草克乐、异恶草胺和胺草唑；
b12)来自去偶除草剂组的成员：消草酯、硝丙酚、二硝戊酚、地乐酚、地乐消酚、DNOC、硝草酚和丁硝酚；
b13)来自生长素类除草剂组的成员：稗草胺、2，4-D、2，4，5-T、MCPA、硫代乙基MCPA、2，4-滴丙酸、高2，4-滴丙酸、2甲4氯丙酸、高2甲4氯丙酸盐(mecoprop-P)、2，4-DB、MCPB、草灭平、麦草畏、2，3，6-TBA、麦草畏、二氯喹啉酸、喹草酸、二氯皮考啉酸、氟草烟、毒莠定、定草酯和草除灵；
b14)来自生长素转运抑制剂组的成员：抑草生、二氯吡隆；
b15)新燕灵、氟燕灵、麦草伏M、溴丁酰草胺、氯甲丹、环庚草醚、苯丙隆、乙氧苯草胺、膦铵素、威百亩、稗草畏、氯 嗪草、棉隆、三嗪氟草胺和甲基溴。
b1)-b15)组的活性化合物B和活性化合物C为已知除草剂和安全剂，参见例如：TheCompendium of Pesticide Common Names(可在网址hclrss.demon.co.uk/index.html的万维网上获得)；Farm Chemicals Handbook 2000第86卷，Meister Publishing Company，2000；B.Hock，C.Fedtke，R.R.Schmidt，Herbizide，Georg Thieme Verlag，Stuttgart1995；W.H.Ahrens，Herbicide Handbook，第7版，Weed Science Society of America，1994；和K.K.Hatzios，Herbicide Handbook，第7版补遗，Weed Science Society ofAmerica，1998。亦已知以R-29148名称的2，2，5-三甲基-3-(二氯乙酰基)-1，3- 唑烷[CAS号52836-31-4]。亦已知以AD-67和MON 4660名称的4-(二氯乙酰基)-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷[CAS号71526-07-03]。式II漂白剂除草剂公开于WO 96/26202、WO 97/41116、WO97/41117和WO 97/41118中。
作为活性化合物C，组合物可包含至少一种以下列出的化合物：解草酮、喹氧乙酸、二氯丙烯胺、解草唑、解草啶、肟草安、解草呋、双苯 唑酸、吡咯二酸、2，2，5-三甲基-3-(二氯乙酰基)-1，3- 唑烷、4-(二氯乙酰基)-1-氧杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷和解草腈和/或其农业上可接受的盐，和/或在化合物具有COOH基团情况下的农业上可接受的衍生物。
含有活性成分的组合的组合物可为二元和三元组合物，其包含至少一种抑制AHAS的化合物作为活性化合物A和至少一种选自b1)-b15)类的除草剂且合适时一种或多种安全剂C。
在包含至少一种抑制AHAS的化合物作为组分A和至少一种除草剂B的二元组合物中，活性化合物A∶B的重量比率可介于1∶500-10∶1范围、介于1∶100-10∶1范围、介于1∶50-10∶1范围或介于1∶25-5∶1范围。
在包含至少一种抑制AHAS的化合物和至少一种安全剂C的二元组合物中，活性化合物A∶C的重量比率通常介于1∶100-10∶1、1∶50-10∶1范围或介于1∶25-5∶1范围。
在既包含抑制AHAS的化合物作为组分A又包含至少一种除草剂B和至少一种安全剂C的三元组合物中，组分A∶B∶C的相对重量比率可介于10∶1∶1-1∶500∶10、10∶1∶1-1∶100∶10、10∶1∶1-1∶50∶1或5∶1∶1-1∶25∶5范围内。在一个实施方案中，三元组合物中除草剂B∶安全剂C的重量比率介于50∶1-1∶10范围内。
亦可将美国专利号7,375,058(以其整体在此引作参考)所述的除草剂活性混合物用于大豆事件127植物相关的处理中。
原卟啉原[IX]氧化酶(PPO)抑制性除草剂亦可用于本发明组合物中。PPO抑制性除草剂为本领域已知，包括但不限于：二苯醚除草剂(包括硝基苯基醚除草剂)，例如氟锁草醚(5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基苯甲酸)、治草醚(5-(2，4-二氯苯氧基)-2-硝基苯甲酸甲酯)、DPEI(5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基苯乙酮肟-邻-(乙酸，甲酯))、DPEII(5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-3-甲氧基苯酞)、氟乳醚((1S)-1-羧基乙基2-氯-5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]苯甲酸酯)、氟黄胺草醚(5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-N-(甲基磺酰基)-2-硝基苯甲酰胺)、乳氟禾草灵(O-[5-(2-氯-α，α，α-三氟-对-甲苯氧基)-2-硝基苯甲酰基]-DL-乳酸乙酯)和乙氧氟草醚(2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯氧基)-4-(三氟甲基)苯)。抑制PPO的除草剂亦包括二甲酰亚胺(dicaboximide)除草剂，例如N-苯基-苯邻二甲酰亚胺类酰亚胺苯氧乙酸([2-氯-5-(环己-1-烯-1，2-二甲酰亚胺基)-4-氟苯氧基]乙酸)、氟 嗪酮(N-(7-氟-3，4-二氢-3-氧代-4-丙-2-炔基-2H-1，4-苯并 嗪-6-基)环己-1-烯-1，2-二甲酰胺)。抑制PPO的除草剂进一步包括三唑啉酮除草剂，例如三唑酮草酯(α，2-二氯-5-[4-(二氟甲基)-4，5-二氢-3-甲基-5-氧代-1H-1，2，4-三唑-1-基]-4-氟苯丙酸)和磺胺草唑(N-[2，4-二氯-5-[4-(二氟甲基)-4，5-二氢-3-甲基-5-氧代-1H-1，2，4-三唑-1-基]苯基]甲烷磺酰胺)。抑制PPO的除草剂亦包括苯基吡唑除草剂，其包括但不限于：吡氯草胺(1-[2，6-二氯-4-(三氟甲 基)苯基]-4-硝基-1H-吡唑-5-胺)和pyraflufen(2-氯-5-(4-氯-5-二氟甲氧基-1-甲基吡唑-3-基)-4-氟苯氧基乙酸)。抑制PPO的除草剂亦包括 二唑酮除草剂，例如恶草灵(3-[2，4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯基]-5-(1，1-二甲基乙基)-1，3，4- 二唑-2(3H)-酮)和炔丙 唑草(5-叔丁基-3-[2，4-二氯-5-(丙-2-炔氧基)苯基]-1，3，4- 二唑-2(3H)-酮)。抑制PPO的除草剂进一步包括噻二唑酮除草剂，例如嗪草酸甲酯([[2-氯-4-氟-5-[(四氢-3-氧代-1H，3H-[1，3，4]噻二唑并[3，4-a]亚哒嗪-1-基)氨基]苯基]硫代]乙酸)；以及在Zagar和Sievernich的US2008254985的部分III.4)中描述的那些(以其整体在此引作参考)。
生长素类除草剂亦可用于本发明组合物中。生长素类除草剂包括包含其作用方式是作为生长素模拟物或生长素抑制剂(抗生长素)的除草活性成分的除草剂。生长素类除草剂的实例包括但不限于：毒莠定(4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸)；麦草畏(3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；氯贝酸(clofibric acid)((对-氯苯氧基)异丁酸)；2-(4-氯苯氧基)-2-甲基丙酸)；草除灵(4-氯-2-氧代-3-苯并噻唑乙酸；4-氯-2-氧代苯并噻唑啉-3-基-乙酸)；TIBA(2，3，5-三碘苯甲酸)；2，3，6-TBA(2，3，6-三氯苯甲酸)；定草酯(3，5，6-三氯-2-吡啶基氧基乙酸)；二氯喹啉酸(3，7-二氯喹啉-8-羧酸)；和模拟生长素的或阻断生长素的苯氧基除草剂，例如苯氧基乙酸、苯氧基丙酸和苯氧基丁酸除草剂，包括：2，4-D((2，4-二氯苯氧基)乙酸)、MCPA((4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸)、2，4-DB(4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸)、2，4-DEP(三[2-(2，4-二氯苯氧基)乙基]磷酸酯)、4-CPA(4-氯苯氧基乙酸)、2，4，5-T((2，4，5-三氯苯氧基)乙酸)、2，4-滴丙酸(2-(2，4-二氯苯氧基)丙酸)、2，4，5-滴丙酸(2-(2，4，5-三氯苯氧基)丙酸)和2甲4氯丙酸(2-(2-甲基-4-氯-苯氧基)丙酸)。
本发明农用组合物的组合的实例包括：灭草烟和甲基咪草烟；灭草烟和苯达松；灭草烟、甲基咪草烟和苯达松；灭草烟和吡唑醚菌酯；灭草烟、甲基咪草烟和吡唑醚菌酯；灭草烟和苯嘧磺草胺；灭草烟、甲基咪草烟和苯嘧磺草胺；甲基咪草烟、苯嘧磺草胺和草甘膦；灭草 烟、甲基咪草烟、苯嘧磺草胺和草甘膦；甲基咪草烟和草甘膦；灭草烟和草甘膦；灭草烟、苯嘧磺草胺和草甘膦；和苯嘧磺草胺和草甘膦.
在施用之前，可将诸如抑制AHAS的除草剂等除草剂转变成惯用的制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂(dusts)、散剂、糊剂和颗粒剂。使用形式取决于特定的预期目的；在各种情况下，应当确保本发明的化合物的精细和均匀的分布。
可以以任何已知的方式制备用于本发明方法中的制剂，例如通过用适合于配制农用化学药品的辅助剂(例如溶剂和/或载体)扩充活性化合物，如果需要，可使用乳化剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、防沫剂、防冻剂，对于种子处理制剂，还任选可用着色剂和/或粘合剂和/或胶凝剂。
适用于制剂的溶剂实例包括水、芳族溶剂(例如Solvesso产品、二甲苯)、石蜡(例如矿物油级分)、醇类(例如甲醇、丁醇、戊醇、苯甲醇)、酮类(例如环己酮、γ-丁内酯)、吡咯烷酮(NMP、NOP)、乙酸酯(乙二醇二乙酸酯)、二醇类、脂肪酸二甲基酰胺、脂肪酸和脂肪酸酯。也可使用溶剂混合物。
用于本发明的制剂的载体实例包括磨细的天然矿物(例如高岭土、粘土、滑石、白垩)和磨细的合成矿物(例如高度分散的二氧化硅、硅酸盐)。
适用于本发明的制剂的乳化剂包括非离子型和阴离子型乳化剂(例如聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基磺酸盐和芳基磺酸盐)。
适用于本发明的制剂的分散剂实例包括木素-亚硫酸盐废液和甲基纤维素。
适用于本发明的制剂的表面活性剂包括木素磺酸、萘磺酸、苯酚磺酸、二丁基萘磺酸、烷基芳基磺酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、脂肪醇硫酸盐、脂肪酸和硫酸化脂肪醇二醇醚的碱金属、碱土金属和铵盐，此外还有磺化萘和萘衍生物与甲醛的缩合物、萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基苯酚醚、乙氧基化异辛基苯酚、辛基苯酚、壬基苯酚、烷基苯酚聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、 三硬脂酰苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇环氧乙烷缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚缩醛、山梨糖醇酯、木素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。
适合用于制备可直接喷施的溶液、乳液、糊剂或油分散体的物质是具有中至高沸点的矿物油级分，例如煤油或柴油，此外还有煤焦油和植物或动物来源的油，脂族烃、环烃和芳族烃，例如甲苯、二甲苯、石蜡、四氢萘、烷基化萘或其衍生物，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、环己醇、环己酮、异佛尔酮，高极性溶剂，例如二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮或水。
也可向制剂中加入防冻剂(例如甘油、乙二醇、丙二醇)和杀细菌剂等。
适用于本发明制剂的防沫剂包括例如基于硅或硬脂酸镁的防沫剂。
适用于本发明制剂的防腐剂包括例如二氯苯酚和苯甲醇半甲醛(benzylalcoholhemiformaldehyde)。
本发明的种子处理制剂还可以包含粘合剂和任选着色剂。
可以将粘合剂加入到所公开的种子制剂中，以在处理后促进活性材料在种子上的附着。合适的粘合剂是嵌段共聚物EO/PO表面活性剂，但亦有聚乙烯醇类、聚乙烯吡咯烷酮类、聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、聚丁烯类、聚异丁烯类、聚苯乙烯、聚乙烯胺类、聚乙烯酰胺类、聚乙烯亚胺类(Lupasol Polymin )、聚醚类、聚氨酯类、聚乙酸乙烯酯、甲基纤维素和源自这些聚合物的共聚物。
亦任选制剂中还可包含着色剂。用于种子处理制剂的合适的着色剂或染料是罗丹明B、C.I.颜料红112、C.I.溶剂红1、颜料蓝15:4、颜料蓝15:3、颜料蓝15:2、颜料蓝15:1、颜料蓝80、颜料黄1、颜料黄13、颜料红112、颜料红48:2、颜料红48:1、颜料红57:1、颜料红53:1、颜料橙43、颜料橙34、颜料橙5、颜料绿36、颜料绿7、颜料白6、颜料棕25、碱性紫10、碱性紫49、酸性红51、酸性红52、酸性红14、酸性蓝9、酸性黄23、碱性红10、碱性红108。
合适的胶凝剂的实例是角叉菜(Satiagel)。
可通过将活性物质与固体载体混合或相伴碾磨制备散剂、用于撒播的材料和粉剂产品(dustable products)。
可通过将活性物质结合至固体载体来制备颗粒剂，例如包被的颗粒剂、浸渍的颗粒剂和均质的颗粒剂。固体载体的实例是矿物土，例如硅胶、硅酸盐、滑石、高岭土、镁质粘土(attaclay)、石灰石、石灰、白垩、红玄武土(bole)、黄土、粘土、白云石、硅藻土、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁、磨细的合成材料；肥料，例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素；和植物来源的产物，例如谷类粗粉、树皮粗粉、木材粗粉和坚果壳粗粉、纤维素粉末；和其它固体载体。
一般而言，制剂包含0.01-95％(按重量计算)、优选0.1-90％(按重量计算)的除草剂例如抑制AHAS的除草剂。可以以90％-100％(按重量计算)、优选以95％-100％(按重量计算)的纯度(根据NMR谱)使用除草剂。对于种子处理目的，可将各种制剂稀释2-10倍，从而产生在即时可用的制剂中活性化合物的浓度为0.01-60％(按重量计算)、优选0.1-40％(按重量计算)。
因此，可以其制剂的形式或从中制备的使用形式使用本发明的抑制AHAS的除草剂，例如以可直接喷洒的溶液、散剂、悬浮液或分散体、乳液、油分散体、糊剂、粉剂产品、用于撒播的材料或颗粒剂的形式，通过喷洒、雾化、撒粉、撒播或灌注进行施用。使用形式完全取决于想要的目的；其预期在每种情况下确保本发明的抑制AHAS的除草剂的可能的最佳分布。
可通过加入水而从乳液浓缩物、糊剂或可湿性粉剂(可喷洒的粉末、油分散体)制备水性使用形式。为制备乳剂、糊剂或油分散体，借助于湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂可将这样的或溶解在油或溶剂中的物质在水中进行均质化。然而，也可能制备由活性物质、湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂和如果合适还有溶剂或油组成的浓缩物，所述浓缩物适合于用水进行稀释。
即时可用的制剂中的活性化合物浓度可在相对宽的范围内变化。一般而言，其为0.0001-10％、优选0.01-1％(按重量计算)。
本发明抑制AHAS的除草剂还可成功地用于超低容量过程(ULV)中，有可能施用包含超过95％(按重量计算)的活性化合物的制剂，或甚至施用无添加剂的活性化合物。
以下为用于本发明方法的抑制AHAS的除草剂制剂的实例：
1.用于叶施用的用水稀释的产品。对于种子处理目的，可将这样的产品以稀释或未稀释的形式施用于种子。
A)水溶性浓缩物(SL、LS)
将10重量份的抑制AHAS的除草剂溶解在90重量份的水或水溶性溶剂中。作为备选，加入湿润剂或其它辅助剂。在用水稀释时，抑制AHAS的除草剂溶解，由此获得具有10％(w/w)的抑制AHAS的除草剂的制剂。
B)可分散的浓缩物(DC)
将20重量份的抑制AHAS的除草剂溶解在添加了10重量份的分散剂例如聚乙烯吡咯烷酮的70重量份的环己酮中。用水稀释产生分散体，由此获得具有20％(w/w)的抑制AHAS的除草剂的制剂。
C)可乳化浓缩物(EC)
将15重量份的抑制AHAS的除草剂溶解在添加了十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物(在每种情况下为5重量份)的7重量份的二甲苯中。用水稀释产生乳剂，由此获得具有15％(w/w)的抑制AHAS的除草剂的制剂。
D)乳剂(EW、EO、ES)
将25重量份的抑制AHAS的除草剂溶解在添加了十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物(在每种情况下为5重量份)的35重量份的二甲苯中。借助于乳化器(例如Ultraturrax)将该混合物引入30重量份的水中，并制备成均一的乳剂。用水稀释产生乳剂，由此获得具有25％(w/w)的抑制AHAS的除草剂的制剂。
E)混悬剂(SC、OD、FS)
在搅动式球磨机中，将20重量份的抑制AHAS的除草剂在加入了10重量份的分散剂、湿润剂和70重量份的水或有机溶剂的情况下粉碎成粉末，以产生精细的抑制AHAS的除草剂悬浮液。用水稀释产生抑制AHAS的除草剂的稳定的悬浮液，由此获得具有20％(w/w)的抑制AHAS的除草剂的制剂。
F)水分散性颗粒剂和水溶性颗粒剂(WG、SG)
将50重量份的抑制AHAS的除草剂在加入了50重量份的分散剂和湿润剂的情况下精细地碾磨，并借助于技术器具(例如挤出、喷雾塔、流化床)制备为水分散性或水溶性的颗粒。用水稀释产生抑制AHAS的除草剂的稳定的分散体或溶液，由此获得具有50％(w/w)的抑制AHAS的除草剂的制剂。
G)水分散性散剂和水溶性散剂(WP、SP、SS、WS)
将75重量份的抑制AHAS的除草剂在加入了25重量份的分散剂、湿润剂和硅胶的情况下在转子-定子研磨机中进行碾磨。用水稀释产生抑制AHAS的除草剂的稳定的分散体或溶液，由此获得具有75％(w/w)的抑制AHAS的除草剂的制剂。
H)凝胶制剂(GF)
在搅动式球磨机中，将20重量份的抑制AHAS的除草剂在加入了10重量份的分散剂、1重量份的凝胶剂湿润剂和70重量份的水或有机溶剂的情况下粉碎成粉末，以产生精细的抑制AHAS的除草剂悬浮液。用水稀释产生抑制AHAS的除草剂的稳定的悬浮液，由此获得具有20％(w/w)的抑制AHAS的除草剂的制剂。该凝胶制剂适合用于种子处理。
2.用于叶施用的待非稀释地施用的产品。对于种子处理目的，可将所述产品以稀释的形式施用于种子。
A)粉剂(Dustable powder)(DP、DS)
将5重量份的抑制AHAS的除草剂精细地碾磨，并紧密地与 95重量份的精细粉碎的高岭土混合。这产生了具有5％(w/w)的抑制AHAS的除草剂的粉剂产品。
B)颗粒剂(GR、FG、GG、MG)
将0.5重量份的抑制AHAS的除草剂精细地碾磨，并将其与95.5重量份的载体缔合，由此获得具有0.5％(w/w)的抑制AHAS的除草剂的制剂。现有的方法是挤出、喷雾干燥或流化床。这产生了用于叶使用的待非稀释地施用的颗粒剂。
常规的种子处理制剂包括例如可流动性浓缩物FS、溶液剂LS、用于干处理的散剂DS、用于浆处理的水分散性散剂WS、水溶性散剂SS和乳剂ES和EC以及凝胶制剂GF。这些制剂可经稀释或未经稀释施用于种子。在播种前施用于种子，或直接施用在种子上。
在一个实施方案中，使用FS制剂进行种子处理。FS制剂通常可包含1-800g/L的活性成分、1-200g/L的表面活性剂、0-200g/L的防冻剂、0-400g/L的粘合剂、0-200g/L的颜料和最高1升的溶剂优选水。
对于种子处理，用除草剂处理本发明事件127大豆植物的种子，所述除草剂为例如选自抑制AHAS的除草剂的除草剂，例如：酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、氯磺隆、醚磺隆、环丙黄隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶黄隆、甲酰胺磺隆、吡氯磺隆、唑吡嘧磺隆、碘磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧黄隆、砜嘧磺隆、嘧磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酯、甲氧咪草烟、甲基咪草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚、嘧草硫醚及其混合物；或用包含抑制AHAS的除草剂的制剂处理所述种子。
术语“种子处理”包括本领域已知的所有合适的种子处理技术，例如拌种(seeddressing)、种子包衣(seed coating)、种子涂粉(seed dusting)、浸种(seed soaking)和种子丸粒化(seed pelleting)。
根据本发明的一个变体，本发明的另一个主题是处理土壤的方法，其通过施用作为组合物/制剂的包含抑制AHAS的除草剂的颗粒制剂(例如任选具有一种或多种固态或液态农业上可接受的载体和/或任选具有一种或多种农业上可接受的表面活性剂的颗粒制剂)来进行，特别是施用到条播机中。该方法有利地用于例如谷类、玉米、棉花和向日葵的苗床中。
本发明还包括用包含至少一种抑制AHAS的除草剂的种子处理制剂包被种子，或包括含有所述种子处理制剂的种子，所述抑制AHAS的除草剂选自：酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、氯磺隆、醚磺隆、环丙黄隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶黄隆、甲酰胺磺隆、吡氯磺隆、唑吡嘧磺隆、碘磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧黄隆、砜嘧磺隆、嘧磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酯、甲氧咪草烟、甲基咪草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚和嘧草硫醚。
术语“种子”包括所有种类的种子和植物繁殖体，其包括但不限于真正的种子、插条、吸根、球茎(corm)、鳞茎(bulb)、果实、块茎、插条(cuttings)、伐条(cut shoot)等。在优选的实施方案中，使用真正的种子。“真正的种子”是指含有胚胎并包裹在种皮或外种皮的成熟植物胚珠，以及可含有包裹在果皮或果壳中的那些例如如颖果或瘦果的种子样生殖结构。
术语“用…包被和/或含有”通常表示，活性成分在施用时绝大部分存在于繁殖产品的表面上，但视施用方法而定或多或少的成分可能渗 透入繁殖产品中。当(重新)种植所述繁殖产品时，其可能吸收活性成分。
在植物播种前和植物出苗前，通过对种子进行喷洒或撒粉，用抑制AHAS的除草剂或用包含抑制AHAS的除草剂的制剂来施行种子处理应用。
在种子的处理中，通过用有效量的抑制AHAS的除草剂或包含抑制AHAS的除草剂的制剂处理种子来施用对应的制剂。本文中施用比例通常是0.1g-10kg a.i.(或a.i.混合物或制剂)/100kg种子，优选地1g-5kg/100kg种子，特别地1g-2.5kg/100kg种子。对于特定的作物例如莴苣，比例可更高。
可以将施用于事件127大豆植物上的任意除草剂制剂制备成“罐-混合”组合物。在所述实施方案中，每种成分或成分的组合可以彼此分开储存。然后在施用前，可将成分彼此混合。通常，这样的混合可以发生在施用前不久。在罐-混合过程中，每种成分在混合之前通常存在于水或合适的有机溶剂中。用于制备所述制剂的方法和指导为本领域中已知。
所述方法进一步允许开发与事件127大豆植物一起使用的除草剂组合。在所述方法中，评价栽培区域的环境条件。可以评价的环境条件包括但不限于：地下水和地表水污染问题、作物的预期用途、作物耐受性、土壤残留物、在栽培区域中存在的杂草、土壤质地、土壤pH、土壤中有机物质的量、施用设备和耕耘实践。在评价环境条件后，可以将有效量的除草剂的组合施用于作物、作物部分、作物种子或栽培区域。
在某些实施方案中，施用于事件127大豆植物的除草剂用于防止易感的杂草或不希望的植物开始生长，和/或用于造成对在目标区域中生长的杂草或不希望的植物的破坏。在有些实施方案中，除草剂或除草剂混合物对影响随后种植在目标区域(即栽培场地或区域)中的作物的杂草或不希望的植物发挥这些作用。在所述方法中，除草剂组合的施用不需要同时发生。只要种植作物的场地含有可检测量的第一种 除草剂，且在作物处于栽培区域期间的某时施用第二种除草剂，就认为作物已经经过本发明的除草剂混合物处理。因而，提供的方法包括作为“萌前”、“萌后”、“植前掺入”和/或涉及在种植之前的种子处理的除草剂施用。
另外，提供了用于包被事件127大豆植物种子的方法。所述方法包括用有效量的除草剂或除草剂组合(如本文别处所公开的)包被种子。然后所述种子可以种植在栽培区域中。另外提供了具有包衣的事件127植物的种子，所述包衣含有有效量的除草剂或除草剂组合(如本文别处所公开的)。
“萌前”是指在植物可见地从土壤中显现出来之前和/或种子发芽之前施用于目标区域(例如栽培场地或区域)的除草剂。“萌后”是指在植物可见地从土壤中显现出来之后施用于区域的除草剂。在某些情况下，针对目标区域中的杂草或不希望的植物来使用术语“萌前”和“萌后”，且在某些情况下，针对目标区域中的作物植物使用这些术语。当针对杂草或不希望的植物使用时，这些术语可以仅适用于存在于或被认为存在于目标区域中的杂草的特定类型或者杂草或不希望的植物的种类。尽管任意除草剂可以施用于萌前和/或萌后处理中，已知当萌前或萌后施用时，有些除草剂可以更有效地控制一种或多种杂草或不希望的植物。例如，砜嘧磺隆具有萌前和萌后活性，而其它除草剂主要具有萌前(异丙甲草胺)或萌后(草甘膦)活性。特定除草剂的这些性质在本领域中是已知的，且可以由本领域技术人员容易地确定。另外，本领域技术人员能够容易地选择对用于本发明的转基因植物和/或待种植本发明的转基因植物的区域而言合适的除草剂和施用次数。“植前掺入”包括在种植之前将化合物掺入土壤中。
因而，提供了栽培作物和/或控制杂草或不希望的植物的改良方法，例如，“植前烧毁(pre-planting burn down)”，其中在种植目标作物之前，用一种或多种除草剂处理区域，以便更好地控制杂草或不希望的植物。另外提供了栽培作物和/或控制杂草或不希望的植物的方法，所述方法是“无耕作”或“低耕作”(也称作“减少的耕作”)。在所述方法 中，不耕作土壤，或在栽培周期中以与传统方法相比更低的频率耕作土壤；这些方法可以节省成本，这些成本否则会由于额外的耕作而发生，包括劳动力和燃料成本。
所述方法包括同时和/或相继施用多种除草剂。在有些实施方案中，所述方法包括，仅用一种除草剂或其它化学药品(例如咪唑啉酮除草剂)处理本发明的植物和/或目标区域(例如栽培场地或区域)和/或杂草和/或不希望的植物。
在优化控制杂草或不希望的植物的过程中，向目标区域(和其中的任意植物)施用除草剂的时间可能是重要的。施用除草剂的时间，可以根据目标区域中植物(例如在该区域中生长的作物植物或杂草或不希望的植物)的大小和/或植物的生长和/或发育阶段来确定。植物的生长和/或发育阶段在本领域中是已知的。例如，大豆植物通常通过称为VE(出苗)、Vc(具小叶)、V1(首次三小叶)和V2-VN的营养生长阶段来进行。然后大豆因响应光周期信号转向生殖生长期；生殖阶段包括R1(开始开花)、R2(盛开)、R3(开始接荚)、R4(完全接荚)、R5(开始结籽)、R6(完全结籽)、R7(开始成熟)和R8(完全成熟)。因此，例如，将除草剂或其它化学药品施用于植物在其中生长的目的区域的时间，可为特定区域的某些或所有植物都达到至少特定大小和/或生长阶段和/或发育阶段时的时间，或特定区域的某些或所有植物都未达到特定大小和/或生长阶段和/或发育阶段时的时间。
在有些实施方案中，事件127大豆植物表现出提高的对萌后除草剂处理的耐受性。例如，事件127植物与适当对照植物相比，可以耐受更高剂量的除草剂，耐受更宽范围的除草剂(即耐受更多AHAS抑制剂化学试剂)，和/或可以耐受在发育的更早或更晚时间时施用的除草剂剂量。
不同的化学药品(例如除草剂)具有不同的“残余”作用，即不同的时间量，在该时间量中用化学药品或除草剂的处理对生长在处理过的区域中的植物继续具有作用。这样的作用可以是希望的或不希望的，取决于处理过的区域(例如栽培场地或区域)的预期的将来目的。因而， 可以基于将要用于每种作物的处理的残余作用和它们对以后将要生长在同一区域中的作物的作用，选择作物轮作方案。本领域技术人员熟知可以用于评价除草剂的残余作用的技术；例如，起抑制AHAS作用的除草剂在它们的残余活性水平方面存在差异。不同除草剂的残余活性在本领域中是已知的，且亦已知随不同的环境因素而变化，所述因素为例如土壤湿度水平、温度、pH和土壤组成(质地和有机物质)。事件127大豆植物尤其可用于其中提高的对除草剂残余活性的耐受性是有益的作物栽培方法中。
另外，本发明事件127大豆植物提供提高的对其它化学药品处理的耐受性，所述其它化学药品与除草剂处理联合用于作物，其为例如有安全剂，诸如磺酸铵等佐剂和作物油浓缩物等。
另外，公开的方法可以包括使用抑制AHAS的除草剂或除草剂混合物、以及一种或多种其它的杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学绝育剂、化学信息素、驱避剂、引诱剂、信息素、进食刺激剂或其它生物活性化合物或昆虫致病性的细菌、病毒或真菌，以形成多组分混合物，产生甚至更广谱的农业保护。可以用于方法中的这样的农业保护剂的实例包括：杀虫剂，例如阿维菌素、高灭磷、吡虫清、amidoflumet(S-1955)、齐墩螨素、艾扎丁、保棉磷(azinphos-methyl)、氟氯菊酯、联苯肼酯、噻嗪酮、克百威、杀螟丹、溴虫腈、氟啶脲、毒死蜱、甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)、环虫酰肼、可尼丁、丁氟螨酯、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、灭蝇胺、溴氰菊酯、丁醚脲、二嗪农、狄氏剂、氟脲杀、四氟甲醚菊酯(dimefluthrin)、乐果、呋虫胺(dinotefuran)、 茂醚、埃玛菌素、硫丹、高氰戊菊酯、乙虫腈、苯硫威、双氧威、甲氰菊酯、杀灭菊酯、锐劲特、氟啶虫酰胺、氟虫酰胺(flubendiamide)、氟氰戊菊酯(flucythrinate)、氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)、嘧虫胺(UR-50701)、氟虫脲、fonophos、特丁苯酰肼、氟铃脲、伏蚁腙、吡虫啉、 二唑虫、丙胺磷(isofenphos)、氟丙氧脲、马拉硫磷、氰氟虫腙(metaflumizone)、蜗牛敌、甲胺磷、杀扑磷、灭 多虫、蒙五一五(methoprene)、甲氧滴滴涕、甲氧苄氟菊酯(metofluthrin)、久效磷(monocrotophos)、甲氧苯酰肼(methoxyfenozide)、硝胺烯啶(nitenpyram)、硝虫噻嗪(nithiazine)、双苯氟脲(novaluron)、多氟脲(noviflumuron)(XDE-007)、甲氨叉威、对硫磷(parathion)、甲基对硫磷(parathion-methyl)、氯菊酯(permethrin)、甲拌磷(phorate)、伏杀磷(phosalone)、亚胺硫磷(phosmet)、磷胺(phosphamidon)、抗蚜威、丙溴磷、丙氟菊酯(profluthrin)、拒嗪酮、pyrafluprole、除虫菊酯、啶虫丙醚(pyridalyl)、pyriprole、蚊蝇醚、鱼藤酮、鱼尼汀、多杀菌素(spinosad)、螺螨酯(spirodiclofen)、螺甲螨酯(spiromesifen)(BSN 2060)、螺虫乙酯(spirotetramat)、乙丙硫磷(sulprofos)、双苯酰肼、伏虫隆、七氟菊酯、特丁磷、杀虫威、噻虫啉(thiacloprid)、噻虫嗪(thiamethoxam)、硫双威、杀虫双、四溴菊酯、唑蚜威、敌百虫和杀虫隆；杀真菌剂，例如噻二唑素、aldimorph、吲唑磺菌胺(amisulbrom)、戊环唑、腈嘧菌酯、苯霜灵、苯菌灵、苯噻菌胺(benthiavalicarb)、苯噻菌胺异丙酯(benthiavalicarb-isopropyl)、binomial、联苯、双苯三唑醇、灭瘟素-S(blasticidin-S)、波尔多液(三碱基硫酸铜)、啶酰菌胺(boscalid)/nicobifen、糠菌唑、磺嘧菌灵、粉病定、萎锈灵、氯环丙酰胺、敌菌丹、克菌丹、多菌灵、地茂散、百菌清、乙菌利、克霉唑(clotrimazole)、碱式氯化铜、铜盐例如硫酸铜和氢氧化铜、氰霜唑(cyazofamid)、cyflunamid、消菌脲、环唑醇、环丙嘧啶、抑菌灵、双氯氰菌胺(diclocymet)、哒菌清、氯硝胺、乙霉威、 醚唑、烯酰吗啉)、醚菌胺(dimoxystrobin)、烯唑醇、烯唑醇-M(diniconazole-M)、消螨普、discostrobin、二噻农、吗菌灵、多果定、益康唑(econazole)、乙环唑、克瘟散、氧唑菌(epoxiconazole)、噻唑菌胺(ethaboxam)、乙菌定、ethridiazole、 唑菌酮、咪唑菌酮、异嘧菌醇、腈苯唑、丙森锌(fencaramid)、呋菌胺、环酰菌胺(fenhexamide)、氰菌胺(fenoxanil)、拌种咯、苯锈啶、丁苯吗啉、薯瘟锡、毒菌锡、福美铁、ferfurazoate、嘧菌腙、氟啶胺、氟 菌、氟联苯菌、氟啶酰菌胺(fluopicolide)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、喹唑菌酮、喹唑菌酮、氟硅唑、磺菌胺、氟酰 胺、粉唑醇、灭菌丹、乙膦铝、麦穗宁、呋氨丙灵、呋吡唑灵、己唑醇、土菌消、双胍辛醋酸盐(guazatine)、烯菌灵、酰胺唑、双胍辛醋酸盐(iminoctadine)、iodicarb、环戊唑醇、异稻瘟净、异丙定、丙森锌(iprovalicarb)、异康唑(isoconazole)、稻瘟灵、春雷霉素、亚胺菌(kresoxim-methyl)、代森锰锌、双炔酰菌胺(mandipropamid)、代森锰、mapanipyrin、精甲霜灵(mefenoxam)、丙氧灭锈胺、甲霜灵、环戊唑菌、磺菌威、代森联、叉氨苯酰胺(metominostrobin)/叉氨苯酰胺(fenominostrobin)、嘧菌胺、苯菌酮(metrafenone)、咪康唑(miconazole)、腈菌唑、甲胂铁胺(甲基胂酸铁)、氟苯嘧啶醇、异噻菌酮、甲呋酰胺、肟醚菌胺(orysastrobin)、 霜灵、喹菌酮、oxpoconazole、氧化萎锈灵、多效唑、戊菌唑、戊菌隆、吡噻菌胺(penthiopyrad)、perfurazoate、膦酸、苯酞、picobenzamid、啶氧菌酯(picoxystrobin)、多氧霉素、噻菌灵、咪鲜安、腐霉利、百维灵、百维灵单盐酸盐、丙环唑、甲基代森锌、丙氧喹啉(proquinazid)、丙硫菌唑(prothioconazole)、吡唑醚菌酯、pryazophos、啶斑肟、二甲嘧菌胺、啶斑肟、pyrolnitrine、咯喹酮、唑喹菌酮、喹氧灵、五氯硝基苯、硅噻菌胺、硅氟唑、螺 茂胺、链霉素、硫、戊唑醇、techrazene、叶枯酞、四氯硝基苯、氟醚唑、涕必灵、溴氟唑菌、硫菌灵、甲基硫菌灵、福美双、噻酰菌胺、甲基立枯磷、双用抑菌灵、三唑酮、唑菌醇、嘧菌醇、唑菌嗪、克啉菌、trimoprhamide三环唑、肟菌酯、嗪氨灵、戊叉唑菌、烯效唑、有效霉素、烯菌酮、代森锌、福美锌和苯酰菌胺；杀线虫剂，例如涕灭威、甲氨叉威和克线磷；杀细菌剂，例如链霉素；杀螨剂，例如虫螨脒、灭螨猛、乙酯杀螨醇、三环锡、三氯杀螨醇、除螨灵、特苯 唑、喹螨醚、杀螨锡、甲氰菊酯、唑螨酯、噻螨酮、克螨特、哒螨酮和吡螨胺；和生物制剂，包括昆虫致病性细菌，例如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)鲇泽(Aizawai)亚种、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克(Kurstaki)亚种和包囊化的苏云金芽孢杆菌的δ内毒素(例如，Cellcap、MPV、MPVII)；昆虫致病性真菌，例如绿僵病真菌；和昆虫致病性病毒，包括杆状病毒、核型多角体病毒(NPV)例如HzNPV、AfNPV； 和颗粒体病毒(GV)，例如CpGV。这些不同的混合配偶体与在所述方法中使用的其它组合物(例如杀虫剂)的重量比通常是在100∶1至1∶100之间，或在30∶1至1∶30之间、在10∶1至1∶10之间或在4∶1至1∶4之间。
另外提供了组合物，其包含生物学有效量的抑制AHAS的目标除草剂或除草剂的混合物和有效量的至少一种其它生物活性化合物或作用剂，且还可以包含表面活性剂、固体稀释剂或液体稀释剂中的至少一种。所述生物活性化合物或作用剂的实例是：杀虫剂，例如阿维菌素、高灭磷、吡虫清、amidoflumet(S-1955)、齐墩螨素、艾扎丁、保棉磷、氟氯菊酯、binfenazate、噻嗪酮、克百威、溴虫腈、氟啶脲、毒死蜱、甲基毒死蜱、环虫酰肼、可尼丁、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、灭蝇胺、溴氰菊酯、丁醚脲、二嗪农、氟脲杀、乐果、 茂醚、埃玛菌素、硫丹、高氰戊菊酯、乙虫腈、fenothicarb、双氧威、甲氰菊酯、杀灭菊酯、锐劲特、氟啶虫酰胺、氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、嘧虫胺(UR-50701)、氟虫脲、fonophos、特丁苯酰肼、氟铃脲、吡虫啉、 二唑虫、丙胺磷、氟丙氧脲、马拉硫磷、蜗牛敌、甲胺磷、杀扑磷、灭多虫、蒙五一五、甲氧滴滴涕、久效磷、甲氧苯酰肼、nithiazin、双苯氟脲、多氟脲(XDE-007)、甲氨叉威、对硫磷、甲基对硫磷、氯菊酯、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷胺、抗蚜威、丙溴磷、拒嗪酮、啶虫丙醚、蚊蝇醚、鱼藤酮、多杀菌素、spiromesifin(BSN 2060)、乙丙硫磷、双苯酰肼、伏虫隆、七氟菊酯、特丁磷、杀虫威、噻虫啉、噻虫嗪、硫双威、杀虫双、四溴菊酯、敌百虫和杀虫隆；杀真菌剂，例如噻二唑素、腈嘧菌酯、苯菌灵、灭瘟素-S、波尔多液(三碱基硫酸铜)、糠菌唑、氯环丙酰胺、敌菌丹、克菌丹、多菌灵、地茂散、百菌清、碱式氯化铜、铜盐、cyflufenamid、消菌脲、环唑醇、环丙嘧啶、(S)-3，5-二氯-N-(3-氯-1-乙基-1-甲基-2-氧代丙基)-4-甲基苯甲酰胺(RH7281)、双氯氰菌胺(S-2900)、哒菌清、氯硝胺、 醚唑、(S)-3，5-二氢-5-甲基-2-(甲硫基)-5-苯基-3-(苯基氨基)-4H-咪唑-4-酮(RP407213)、烯酰吗啉、醚菌胺、烯 唑醇、烯唑醇-M、多果定、克瘟散、氧唑菌、 唑菌酮、咪唑菌酮、异嘧菌醇、腈苯唑、丙森锌(SZX0722)、拌种咯、苯锈啶、丁苯吗啉、薯瘟锡、毒菌锡、氟啶胺、氟 菌、氟联苯菌(RPA403397)、flumorf/flumorlin(SYP-L190)、氟嘧菌酯(HEC5725)、喹唑菌酮、氟硅唑、氟酰胺、粉唑醇、灭菌丹、乙膦铝、呋氨丙灵、呋吡唑灵(S-82658)、己唑醇、环戊唑醇、异稻瘟净、异丙定、稻瘟灵、春雷霉素、亚胺菌、代森锰锌、代森锰、精甲霜灵、丙氧灭锈胺、甲霜灵、环戊唑菌、叉氨苯酰胺/叉氨苯酰胺(SSF-126)、苯菌酮(AC375839)、腈菌唑、甲胂铁胺(甲基胂酸铁)、nicobifen(BAS510)、肟醚菌胺、霜灵、戊菌唑、戊菌隆、噻菌灵、咪鲜安、百维灵、丙环唑、丙氧喹啉(DPX-KQ926)、丙硫菌唑(JAU6476)、啶斑肟、吡唑醚菌酯、二甲嘧菌胺、咯喹酮、喹氧灵、螺 茂胺、硫、戊唑醇、氟醚唑、涕必灵、溴氟唑菌、甲基硫菌灵、福美双、噻酰菌胺、三唑酮、唑菌醇、三环唑、肟菌酯、戊叉唑菌、有效霉素和烯菌酮；杀线虫剂，例如涕灭威、甲氨叉威和克线磷；杀细菌剂，例如链霉素；杀螨剂，例如虫螨脒、灭螨猛、乙酯杀螨醇、三环锡、三氯杀螨醇、除螨灵、特苯 唑、喹螨醚、杀螨锡、甲氰菊酯、唑螨酯、噻螨酮、克螨特、哒螨酮和吡螨胺；和生物制剂，包括昆虫致病性细菌，例如苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和包囊化的苏云金芽孢杆菌的δ内毒素(例如，Cellcap、MPV、MPVII)；昆虫致病性真菌，例如绿僵病真菌；和昆虫致病性病毒，包括杆状病毒、核型多角体病毒(NPV)例如HzNPV、AfNPV；和颗粒体病毒(GV)，例如CpGV。方法亦可包括使用遗传转化以表达对无脊椎害虫具有毒性的蛋白(例如苏云金芽孢杆菌δ内毒素)的植物。在所述实施方案中，外源施用的无脊椎害虫控制化合物的作用可与表达的毒素蛋白协同。
因此，所述方法可以采用抑制AHAS的除草剂或抑制AHAS的除草剂组合，且可以另外包含杀昆虫剂和/或杀真菌剂和/或其它农业化学药品(例如肥料)的应用。所述组合处理的应用，可以拓宽针对其它杂草物种的活性范围，并抑制任意抗性生物型的增殖。
在以下实施例中进一步阐述实施方案。应该理解，提供这些实施例仅为了阐明。根据以上论述及这些实施例，本领域技术人员可确定基本特性，并且在不背离其精神和范围的情况下可对本发明实施方案进行各种改变和修改，以使其适合各种用途和条件。因此，除了本文所示及所述实施方案外，根据前述说明，本发明实施方案的各种修改对本领域技术人员是显而易见的。所述修改亦意欲落入随附权利要求范围内。
实施例
实施例1：转基因植物的制备
用来自质粒pAC321的DNA的线性片段(PvuII)开发转基因大豆(Glycine max L.)植物，所述质粒含有提供咪唑啉酮除草剂抗性的突变体乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)编码序列。pAC321质粒含有具有对应于653位位置的天冬酰胺而不是天然丝氨酸(S653N)的突变的拟南芥AHASL基因(csr1-2)编码序列。AHAS(S653N)编码序列处于天然拟南芥AHAS启动子序列和转录终止序列的控制下。参见例如美国专利公开号2005/0034187，其整体在此引作参考。PvuII片段包括拟南芥AHASL启动子、耐受除草剂的拟南芥AHASLl(csr1-2)编码序列和拟南芥AHASL终止子。所述启动子、编码序列和终止子盒在本文中被称为csr1-2盒。
将源自市售品种“Conquista”的单个大豆种子顶端分生组织的胚胎发生轴组织用于基因枪转化。用基因枪转化(微粒或粒子轰击)( F.J.L.等，Theor.Appl.Genet.1996；93：142-150)来产生含有csr1-2基因的大豆转化事件。在轰击前让含有csr1-2基因片段的DNA沉淀到微观金粒上。然后将沉淀的DNA和颗粒置于塑料大载体上并以高速加速，以便让阻止屏留下大载体。让含DNA的颗粒继续其飞行并最终穿透纳入到大豆植物细胞中。将被轰击的细胞转移到含有50g ai/ha当量灭草烟(咪唑啉酮除草 剂)的选择培养基中，只有用csr1-2基因转化的细胞继续生长。从该过程鉴定了耐受性的T0植株，命名为大豆事件127(表1)。
实施例2：种系发育
通过自交(“自体受精”)将大豆事件127的初始转化株保持到T4代，如下表1中所提供。
表1：大豆事件127的早期世代发育
来自9株T3植物(E01、E02、E03、E04、E05、E06、E07、E09和E10)的种子的遗传分析显示，转基因分离并不总是遵照简单的孟德尔模式，这提示有不止一个活性基因座。让来自对于耐受灭草烟表现出孟德尔分离并具有正常表型的T3植物(E09、E10和E05)的T4后代，与非转基因品种(BRS137、Conquista和BR97-7066)杂交，培育出4个群(表2、图2)。
表2：含有事件127的大豆群的培育及鉴定
在F2和F3代中，在温室中选择具有正常表型并耐受灭草烟的世系及单个植株。在转基因Conquista(T4-E10)x非转基因Conquista之间的杂交F2群中耐受灭草烟(100g ai/ha)的分离模式(38株耐受∶13株不耐受)表明，含有事件127的转基因系V03-603(CV-603)中的单个显性基因控制对灭草烟的耐受性。
用来自4种杂种(表2)中的每一种的F4和/或F5系进行的随后的田间试验，支持选择含有事件127的种系V03-603为用于随后分析及培育的优良大豆系。用随机完全区组设计在四个地区(其中3个重复，1个裂区处理设计)种植进行田间试验。参与者(entries)是全部样地，灭草烟应用比例(0、70、240或280g ai/ha)为亚样地。种植后向植物喷洒18-21天，施用后14天评估。评估植物的损伤百分比(0＝样地中无死亡植物到100＝样地中所有植物死亡)。采集的另外的数据包括植物高度、种子产量、种子大小、至开花的天数和到成熟的天数。
实施例3：分子特征
A：DNA和RNA分离和定量方法
经由改良溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)法(Carlson等，1991)从大豆叶组织分离DNA。用液氮冷冻硅胶-脱水的叶组织，用自动磨碎机(Autogen；Holliston，MA)磨碎。用预热的由2％(w/v)CTAB、100mM Tris-HCl、1.4M NaCl、1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、20mM乙二胺四乙酸(EDTA)、pH 9.5(5ml/60mg干叶组织)和β-巯基乙醇(10μl/ml缓冲液)组成的提取缓冲液在74℃孵育磨碎的组织20分钟。以2440xg离心10分钟后，用等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)提取上清液2次。用0.7体积的异丙醇沉淀DNA，并溶解于TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 8.0)中，加入0.5mg/ml RNA酶A(Invitrogen；Carlsbad，CA)到终浓度约500ng/μl。用Hoechst 33258染料(Invitrogen)在Packard FluoroCountTM BF10000微板荧光计(Packard Instrument Company；Meriden，CT)上按照荧光计用户手册定量测定分离的DNA，且用小牛胸腺DNA(Invitrogen)作为DNA标准品。
从源自事件127的F7和F8代植物的硅胶-脱水的新叶和非转基因亲本大豆品种Conquista的叶，用Qiagen Rneasy微型试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)提取总RNA。用液氮冷冻约25mg硅胶-脱水的叶组织并用自动磨碎机磨碎。按照厂商指导实施总RNA分离程序。按照RNeasy微型试剂盒用户手册的建议，用无RNA酶的DNA酶(Qiagen)实施柱上DNA酶消化，以除掉总RNA制品中的任何大豆基因组DNA。通过用BioMateTM 3分光光度计(Thermo ElectronCorporation；Waltham，MA)测量260nm处的吸光率，来定量测量分离的RNA。
B：探针分离和标记方法
用作转基因探针的DNA片段的位置示于图1B中。载体主链探针示于图5C中。用于产生经鉴定的转基因和载体探针的PCR引物在下表3中提供。这5种重叠的探针一起跨越整个质粒。具体地，探针1跨越AHASL启动子区，探针2跨越csr1-2编码序列，探针3跨越AHASL 终止子区，探针4和5一起覆盖完整载体主链(VB)。通过PCR扩增用质粒pAC321作为模板产生探针DNA片段。利用RediprimeTM II DNA标记系统(Amersham；Piscataway，NJ)按照厂商说明书，用50μCi的(α-32P)-dCTP(3000Ci/毫摩尔)(MP Biomedicals；Irvine，CA)对探针(每一种25-50ng)进行放射标记。用Spin-X离心管过滤器(Corning Costar Corporation；Acton，MA)纯化标记的探针。
表6：用于产生用于DNA印迹分析的探针的引物
C：拷贝数、插入物完整性和稳定性.
用DNA印迹分析来测定csr1-2表达盒的拷贝数和完整性，以及确证事件127中缺乏质粒主链。用限制性酶NcoI、SpeI和XbaI来消化自事件127植物和非转基因对照Conquista获得的基因组DNA。在图3用大豆事件127插入物比对pAC321 PvuII转化片段。用于转化大豆的来自质粒pAC321的PvuII片段示于图3上部分。未包含在大豆事件127的转基因插入物中的该片段的部分由带斜纹的方框表示。大豆事件127中的转基因插入物和侧翼基因组大豆DNA的表征示于该图下部。在PvuII转化片段和转基因插入区图谱之间所画的垂直点线之间的DNA，是两个DNA片段共有的DNA。标明了关于DNA印迹分析的限制性位点。PvuII转化片段的编号系统对应于图1中的 pAC321质粒图谱的编号系统。大豆事件127插入物的编号系统对应于图8中的编号系统，其中#1为大豆基因组侧翼序列5’端的第一个核苷酸(侧翼序列由灰框标出)。csr1-2盒中单一的NcoI限制性位点位于csr1-2编码序列的5’端，预测用NcoI消化事件127基因组DNA产生含有来自csr1-2盒的DNA的两个片段。两个片段由csr1-2盒中的NcoI位点和侧翼大豆基因组序列最靠近NcoI的位点确定。在5’侧翼大豆基因组序列中有一个SpeI限制性位点，在事件127的AHASL 3’UTR下游有两个SpeI限制性位点。XbaI限制性位点在完整csr1-2表达盒的侧翼。预期由DNA杂交检测的DNA片段的数量和大小列于下表7中。
表7：预期由DNA杂交检测的DNA片段的数量和大小
a基于事件127中被克隆的插入物和侧翼序列估测预测的片段大小。
b5’UTR探针和3’UTR探针各自重叠XbaI位点，因此与质粒的两个XbaI片段都杂交。
c事件127插入物的序列分析表明，csr1-2编码区的小部分在紧接3’转基因整合位点上游重复，这确认在这些DNA印迹中观察到的800bp带的身份。
基于事件127植物中被克隆的插入物和侧翼序列来估测预测的片段大小。5’UTR探针和3’UTR探针各自重叠XbaI位点，因此与质粒pAC321的两个XbaI片段都杂交(在图4A和4C的11道中用点作标记)。事件127区的序列分析表明，csr1-2编码区的小部分在紧接3’转基因整合位点上游重复，这确认在DNA印迹结果中鉴定的800bp带的身份。
用以上列出的限制性酶(8单位/μg DNA)在酶厂商(New England Biolabs；Ipswich，MA；或Amersham)所规定条件下，于40μl体积中过夜消化来自事件127的F8代和来自非转基因对照Conquista的基因组DNA(7μg)。通过在10cm长的0.8％琼脂糖凝胶中电泳来分离限制性消化物。通过将凝胶在0.25N HCl中浸泡约20分钟进一步使DNA片段化，用0.4NNaOH变性约30分钟。用2X NaCl/柠檬酸钠溶液(SSC)漂洗凝胶，用0.4N NaOH作为转移缓冲液将变性DNA转移到Hybond N+尼龙膜(Amersham)上。按照Sambrook等(1989)进行DNA杂交。在65℃让膜预杂交2-4小时，在Hybaid MAXI 14杂交炉(Thermo Electron Corporation)中于20-30ml(约0.2ml/cm2)的杂交缓冲液(2x SSC、0.6％SDS、50mM Na2HPO4、1xDenhardt氏溶液、2.5mM EDTA、5％硫酸右旋糖酐、pH 7.2)中在65℃过夜杂交。杂交后，用2x SSC、0.5％SDS(1ml/cm2)于室温洗涤膜15分钟，用2x SSC、0.1％SDS(4ml/cm2)于65℃洗涤30分钟，最后用0.1x SSC、0.1％SDS(4ml/cm2)于65℃洗涤15分钟。洗涤后，将膜卷在塑料包装上，在具有增感屏的盒中于-80℃与HyperfilmTM MP膜(Amersham)接触2-5天，时间视放射性信号强度而定。
亦如上所述进行DNA印迹分析，以监测插入物在多个世代之间的稳定性。自T4、F4、F8和F9代获得植物材料(图2)。用NcoI和SpeI(如上所述)消化来自这些样品的基因组DNA，如上所述进行DNA印迹分析。
通过DNA印迹分析来自事件127F8代植物的基因组DNA(利用NcoI、SpeI和XbaI限制性酶用上述方法消化)，来评估事件127中插入物的拷贝数。
DNA印迹分析的结果提供在图4A、4B和4C中。用NcoI(1-4)、SpeI(5-8)和XbaI(9-12)限制性酶如所述消化以下DNA：非转基因大豆品种Conquista的基因组DNA(第1、5和9道)；掺有1个基因组拷贝当量(第2、6和10道)或2个基因组拷贝当量(第3、7和11道)的pAC321的Conquista；和来自F8代的大豆事件127的基因组DNA(第4、8和12)。印迹与探针5’UTR(图4A)、探针AHAS(图4B)和探针3’UTR(图4C)杂交。第1道和最后1道(标记M)含有λ/HindIII梯度带(ladder)；带大小用千碱基标明。图4D表明DNA杂交探针和事件127插入物之间同源的区域。图4B的箭头表明大约885bp的SpeI片段，其在3’侧翼序列连接处含有存在于事件127中的csr1-2的另外376bp片段。
用所有3种限制性酶消化并与3种探针杂交的非转基因Conquista DNA，未显示任何信号，这表明在所用的DNA印迹严格条件下，既未能检测到内源性大豆AHASL基因，也未能检测到内源性大豆Sec61γ亚基基因(图4，第1、5和9道)。用不同酶和探针组合处理的来自事件127F8代的DNA样品都获得单条带(图4A、B和C，第4、8和12道)，但与AHASL编码序列探针杂交的SpeI消化物除外，其有约800bp的另外的小带(图4B，第8道，箭头)。该AHASL-杂交800bp SpeI片段与在事件127中在3’侧翼序列连接处重复的AHASL编码序列小片段(参见完整序列章节；实施例3E)这一观察一致。所有大带具有的信号强度大体上与一个基因组拷贝当量的pAC321类似。
用NcoI消化并用At AHASL 5’UTR探测的来自事件127的基因组DNA产生大约4.5kb大小的杂交带。该带大小与由插入物内的NcoI位点(nt 2761，图4D)和5’基因组大豆侧翼序列上游大约4.5kb的NcoI位点确定的单一DNA片段产物一致。用AtAHASL编码序列或AtAHASL3’UTR来探测同一消化物，产生大约9.0kb大小的杂交带。该带的大小与由插入物中的NcoI位点(nt 2761，图4D)和3’大豆基因组侧翼序列下游大约9.0kb的NcoI位点确定的单一DNA片段一致。
用SpeI消化并用At AHASL 5’UTR探测事件127基因组DNA，产生大约4.4kb大小的杂交带。这与由插入物中的SpeI位点(nt 5620，图4D)和大豆基因组5’DNA侧翼序列上游大约4.4kb的SpeI限制性位点(nt 1268，图4D)产生的单一DNA片段一致。在事件127的5’侧翼序列分析中确认了该上游SpeI位点的存在(参见侧翼序列章节；实施例3D)。用At AHASL编码序列或At AHASL 3’UTR来探测同一消化物，亦产生4.4kb对应于上述同一片段的杂交带。另外，当用At AHASL编码序列探测SpeI消化物时，检测到大约0.8kb大小的杂交带，这与在3’侧翼DNA序列连接处含有csr1-2基因的376bp区段的单一SpeI DNA片段一致。从DNA插入物中的SpeI位点和大豆基因组下游0.8kb的SpeI位点(nt 5620-6505，图4D)产生该杂交片段。通过At AHASL 3’UTR探针未检测到0.8kb杂交带，这表明At AHASL 3’UTR DNA未包括在0.8kb片段中，插入物中的SpeI nt 5620位点与csr1-2基因的376bp区段邻接。因此，用于转化的质粒pAC321的线性PvuII片段的5622和5719核苷酸处的SpeI限制性酶位点(示于图1B中)，未包括在事件127基因组的DNA插入物中。这通过DNA插入物的DNA序列分析来确证(参见完增序列章节；实施例3E)。掺有pAC321的对照中的280和97bp的较小预测SpeI片段将产生低于用该方法检测的检测水平的信号。
用XbaI消化并用At AHASL 5’UTR探测时，事件127基因组DNA显示大约10kb大小的单一杂交带。基于用于转化的线性DNA中的 XbaI限制性位点的位置(图1B)，预期大约5.7kb杂交带，其从事件127基因组中的DNA插入物内产生。然而，事件127中的DNA插入物的DNA序列分析显示，线性转化DNA的任一个XbaI限制性位点都未包括在DNA插入物中(参见完整序列章节；实施例3E)。因此，从插入物侧翼的5’和3’DNA序列内的XbaI限制性位点(nt 410和10652，图4D)产生10kb杂交带。因此，用At AHASL编码序列或At AHASL 3’UTR来探测同一消化物，产生对应于上述同一DNA片段的同样10kb的杂交带。
图4中所示的DNA印迹上的所有杂交带的数量及大小的分析，与事件127大豆基因组中的单一DNA插入物的整合一致，所述事件127大豆基因组含有csr1-2基因的单一功能拷贝以及csr1-2基因5’端的蛋白SEC61γ的编码序列，并在插入物3’端含有具有csr1-2基因的376bp区段的单一DNA片段。
尽管用不包括载体主链DNA的pAC321的PvuII限制性片段进行转化，但实施了DNA印迹研究以确证在事件127基因组中缺乏质粒pAC321载体DNA。为了测定是否有任何载体主链整合到事件127中，让上述用于DNA杂交分析的同一套印迹(图4)与两个载体主链-特异性探针杂交(图5)。如所预期的一样，在含有非转基因Conquista基因组DNA的泳道中未检测到杂交带。掺有一个或两个基因组拷贝当量的转化质粒pAC321的非转基因Conquista基因组DNA，显示预期大小的杂交带(表7)。让印迹与探针VP1(图5A)和探针VP2(图5B)杂交。在事件127F8代DNA中未检测到杂交带，这表明没有载体主链DNA整合到该事件的大豆基因组中。图5C表明探针VP1和VP2相对于pAC321组分的位置。
为了测定事件127中的插入物的稳定性，对来自四个不同世代T4、F4、F8和F9(图2)的DNA样品进行DNA印迹分析。用NcoI和SpeI消化基因组DNA样品，并用跨越用于转化的整个DNA片段的AtAHASL 5’UTR、At AHASL编码序列或At AHASL 3’UTR探针来 探测(图1B)。这些限制性酶和探针的组合提供事件127中DNA插入物的独特指纹(图4)。将非转基因Conquista基因组DNA用作阴性对照，将掺有一个和两个基因组拷贝当量的pAC321的Conquista用作阳性对照(图6)。用所有三种探针检测了来自用NcoI或SpeI消化的事件127T4代DNA的多条带，表明T4代含有csr1-2盒的多个拷贝。然而，来自F4、F8和F9代的DNA都显示先前在插入物和拷贝数分析(图4)中观察到的同样的Southern模式(图6)。该结果表明T4代中的插入物的多个拷贝在T4和Conquista之间的杂交后代中分离了，只有单个拷贝保留在所选择的分离株中。此外，该单一拷贝在随后的世代中稳定地遗传。
D：插入DNA的5’和3’端侧翼的基因组序列
用反向PCR来获得插入的csr1-2盒侧翼的大豆基因组DNA序列(Triglia等，1988)。用15单位的XbaI、SpeI、HindIII、NcoI、EcoRI、BamHI或BglII在20μl反应体积中将来自事件127F7代的基因组DNA(1μg)消化3小时。让XbaI、HindIII、NcoI和EcoRI消化物在65℃孵育20分钟，以使酶失活，而对BamHI和BglII消化物进行异丙醇沉淀。将T4 DNA连接酶(800单位，New England Biolabs)直接加入到每一个消化反应中。亦加入水使反应体积到200μl。让反应物在16℃孵育过夜，将环化的DNA直接用作反向PCR的模板。用GeneAmp XL PCR试剂盒(Applied Biosystems；Foster City，CA)扩增转基因侧翼序列。100μl的初始PCR含有1x厂商提供的PCR缓冲液、各种dNTP 200μM、25ng环化的基因组DNA片段、1.2mM乙酸镁、2单位的rTth DNA聚合酶XL和0.2μM各种初始PCR引物。100μl嵌套式PCR含有与初始PCR相同的组分，但将10μl的初始PCR的1∶50稀释液用作模板。在GeneAmp PCR系统9700(AppliedBiosystems)中进行初始及嵌套式PCR。初始及嵌套引物序列提供在下表4中。在94℃1分钟的初始变性步骤后，进行以下30个循环：94℃达15秒、60℃达8分钟和72℃达2分钟，接着最后72℃延伸10分钟的步骤。
表8：用于获得侧翼DNA序列数据的引物
在完成PCR反应后，用Zymo DNA Clean & ConcentratorTM-5(Zymo Research；Orange，CA)纯化产物。对PCR产物进行直接测序或在克隆后测序。当PCR产物或克隆的片段长于1kb时，用引物步移(walking)来获得全长序列。对两条DNA链都进行测序，以获得每一碱基大于Phred 40的序列质量。用来自Applied Biosystems的BigDyeTM Terminator v3.1Ready Reaction Cycle Sequencing试剂盒和ABI 3730 DNA分析仪进行序列测定。
从XbaI消化物扩增的3’侧翼PCR产物约6kb，扩增太弱而不能获得用于直接序列测定的足够的DNA。因此，用SpeI消化PCR产物，用DNA聚合酶I大(Klenow)片段(New EnglandBiolabs)处理得到的限制性片段，一个为约800bp，另一个为约5.2kb，以产生平端，并将其克隆到pCR-Blunt II-TOPO克隆载体(Zero BluntTOPOPCR克隆试剂盒；Invitrogen)中。通过限制性消化验证了每一片段的10个克隆，通过引物步移测定序列。通过PCR扩增和跨越连接测序确证限制性片段的连接。
通过反向PCR从事件127F7代基因组DNA的分子内成环的NcoI消化物扩增3kb的DNA片段。对该片段两端的序列测定表明，其被从转基因插入物的5’侧特异性扩增。进一步测定片段序列，以获得1.3 kb的5’大豆侧翼基因组序列。通过反向PCR从事件127F7代基因组DNA的XbaI消化物扩增6kb的DNA片段，亚克隆后进行彻底序列测定。获得的序列表明其在3’侧位于插入物侧翼。用来自5’和3’侧翼区的引物进行非转基因品种Conquista DNA的PCR分析，以确证侧翼序列对植物基因组为天然序列(数据未显示)。
含5’和3’侧翼序列的整个大豆事件127转基因插入物序列示于图8中(SEQ ID NO：1)。针对可获得的公开DNA数据库(所有GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列)和BASF植物科学专有DNA数据库查询的5’侧翼序列的BLAST分析，显示与专有大豆表达序列标签(EST)具有序列同一性的区域，这确证鉴定的侧翼序列的来源为天然大豆DNA。进一步针对预测的开放阅读框分析序列。结果表明在插入物的5’端的上游有315bp ORF，从侧翼序列的核苷酸941至1255。5’侧翼序列与转化序列的比对显示，整合点在核苷酸1312处(图8；SEQ ID NO：1)，其位于预测的ORF的终止密码子下游60bp处。
3’侧翼序列分析显示，在3’整合点之前有仅以单一核苷酸而不同于csr1-2编码序列的部分的376bp的序列区段(图8中的核苷酸3768-4143；SEQ ID NO：1)。该376bp序列在3’侧翼序列连接处的插入创建了501bp的ORF，其从转基因插入物延伸到3’侧翼序列。通过RT-PCR研究了该ORF的可能的转录。针对可获得的公开DNA数据库(所有GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列)和BASF植物科学专有DNA数据库查询的3’侧翼序列的BLAST分析显示，在近侧3’侧翼序列中与大豆过氧化氢酶基因(登录号Z12021)的序列相似性区域。然而，整合点位于可能的基因同源物的上游约500bp处，推定的编码序列为整合点下游的约2.4kb。因此，即使可能的催化酶同源物为活性基因，其也不可能受到插入的影响。另外，远侧3’侧翼序列的区域与专有的大豆EST享有序列同一性。
进行了对来自非转基因Conquista基因组的事件127整合位点的PCR-扩增研究。包括一个5’侧翼区引物和第二个3’侧翼区引物以扩增 插入位点的PCR引物组A和B，使用来自非转基因品种Conquista的基因组DNA作为模板时并不产生扩增的DNA产物。含对3’侧翼序列特异的引物的PCR引物组C不产生来自非转基因品种Conquista DNA的扩增产物，而用来自事件127的基因组DNA产生了预期的扩增子(数据未显示)。这证明在事件127中存在通过引物组C扩增的DNA片段，而在同样情况下在Conquista基因组中不存在，这表明在事件127中发生了在插入位点处的DNA重排。这与来自靠近插入的DNA和基因组大豆DNA连接的csr1-2编码区的重复序列的376bp区段的鉴定一致。
E.插入DNA的完整序列
设计了6个PCR产生的扩增子，以涵盖整个插入物以及具有邻近大豆基因组序列的连接(图7)。通过PCR扩增这6个重叠片段，接着DNA序列分析，来获得插入的DNA的完整序列。表5中提供用于PCR扩增的引物序列。用rTth DNA聚合酶XL再扩增含有相对于转化片段序列不同的序列的PCR扩增子。用Zymo DNA Clean & ConcentratorTM-5纯化PCR产物，通过直接序列测定和引物步移测定两条链的序列到Phred 40的质量水平。如上所述实施DNA序列测定。
表9：用于事件127DNA插入物扩增的引物
尽管DNA印迹分析表明，转基因插入物含有完整csr1-2表达盒，但对插入物进行克隆及序列测定以确证插入物的完整性。通过用Taq DNA聚合酶PCR扩增6个重叠扩增子获得了插入DNA的完整序列(图7)。完整大豆事件127插入物序列为4758bp长，并且除在3’整合点来自csr1-2的376bp片段插入物之外，所述序列除了3个点突变外与转化片段的序列相同(图8；SEQ ID NO：1)。点突变之一是在AHASL编码序列的G到A的突变，其导致氨基酸从R272变为K272。这是保守氨基酸取代，对除草剂耐受性或对At AHAS蛋白的酶特性没有影响。其它两个突变包括G到A的突变和G到C的突变，二者都位于csr1-2基因3’UTR的下游，因此为遗传上沉默的。
进行实验以测定AHASL编码序列的G到A突变发生在大豆事件127的产生及育种发育的哪个时间点。起初，用来自事件127T4和F8代二者的基因组DNA作为模板开始用于插入物测序的PCR4反应(图7)，测定PCR产物的序列。来自事件127 T4代的序列并非不同于预期(pAC321)序列。考虑到T4代含有插入物的多个拷贝，PCR4产物可能是来自插入物的不同拷贝的序列混合物，用5’侧翼序列中的正向引物(5’-GCCCTCCTTATTTATCCCCTTA-3’；SEQ IDNO：35)和csr1-2编码序列中的反向引物(5’-ACAAACCTACCCAATTCATCGC-3’；SEQ ID NO：36)，设计2.5kb的事件127基因座-特异性PCR扩增子。直接测定PCR产物的序列。序列比较显示，G到A的突变亦存在于事件127T4代中，这表明突变有时发生在T4代之前(数据未显示)，并一直保留在随后的8代中。
初始转化序列含有原来注释为AHASL启动子和5’UTR的2.5kb区段。最近的序列分析显示，该序列区段亦含有先前未注释的编码SEC61γ亚基(多聚转运蛋白)的拟南芥基因。事件127插入物序列含有包括全部编码序列在内的大部分AtSec61γ亚基基因。AtSec61γ5’ UTR如拟南芥信息资源(Arabidopsis Information Resource)所注释，从5’转基因整合位点下游的18个核苷酸开始。因此，插入物不可能含有AtSec61γ基因的完整天然启动子。
用RT-PCR评估在大豆事件127插入物中发现的拟南芥AtSEC61γ亚基基因的可能转录。用从事件127的F7代提取的DNA酶处理的总RNA作为模板，进行RT-PCR。将对两个内源性大豆基因Iota和GmSec61γ特异的引物用作阳性对照，以证实模板RNA的质量。亦将来自拟南芥叶和根组织未经DNA酶处理的总RNA用作阳性对照。结果显示两个内源性大豆阳性对照Iota和GmSec61γ在大豆嫩叶组织中强转录，而事件127 F7代的AtSec61γ亚基基因只是弱转录。图9的箭头表明，从事件127扩增了对应于AtSec61γ亚基的弱RT-PCR产物。扩增的来自事件127 F7代的393bp AtSec61γ亚基DNA带，与扩增的来自拟南芥叶和根的带大小一样(图9)。同样的引物对亦扩增来自拟南芥叶和根样品中污染的基因组DNA的预期965bp大小的带。为了确证事件127RT-PCR产物的同一性，对其进行序列测定，并与AtSec61γ亚基的预测的mRNA序列进行比较(数据未列出)。两个序列匹配，这表明AtSec61γ亚基在事件127叶中弱转录。
靠近3’侧翼序列连接的csr1-2编码序列的376bp部分的插入(图7)创建了501bpORF。通过RT-PCR分析研究该ORF可能的转录。用500ng和125ng的两种不同RNA模板量进行RT-PCR。在用ORF-特异性引物的阳性对照反应中亦使用事件127 F8代基因组DNA。将对大豆Iota基因特异的引物用于阳性对照反应，以确证模板RNA的质量。ORF特异性引物扩增来自事件127基因组DNA的435bp片段。然而，使用作为模板的来自嫩叶组织的总RNA未观察到可检测的RT-PCR产物，这表明ORF在事件127中不表达(图10)。
F.用于事件特异性检测的定性PCR测定
用自DNA侧翼序列和插入物序列二者获得的信息发展事件特异性PCR。设计了4对引物，每一对中的一个引物在5’大豆侧翼序列中， 另一个在csr1-2盒中。将用于事件特异性PCR的引物序列提供在下表10中。
表10：用于事件特异性PCR的引物
设计引物以便扩增约200-约400bp长的PCR产物。将来自事件127和非转基因品种Conquista二者的基因组DNA用作模板。在25μl总体积中实施PCR，每次反应含有25ng的模板DNA、200μM的各种dNTP、0.4μM的各种引物和1单位Taq DNA聚合酶。在94℃初始变性4分钟后，进行以下30个循环：94℃达30秒、60℃(事件PCR1和3)或66℃(事件PCR2和4)达30秒和72℃达45秒，接着最后在72℃延伸10分钟。用“事件PCR3”引物组通过定性PCR分析了来自6个不同种植区的大豆事件127和非转基因品种Conquista每一种的4株植株。
4个PCR全部产生预期特定大小的来自大豆事件127的产物(图11A)，这表明4种引物组中的任何一种皆可用于检测样品中的事件127核酸分子。用采集自6个不同种植区的事件127大豆植物和非转基因品种Conquista的样品进一步验证事件特异性PCR产物3。结果显示在事件127大豆的全部24个样品中特异性扩增PCR产物3，但在非转基因对照品种Conquista中不扩增(图11B和C)。
G.用于事件特异性检测的定量PCR测定
业已设计了事件特异性定量PCR以检测并准确及精确地定量测定混合种子批中的事件127核酸，如果事件127核酸大豆在样品中以样品中存在的核酸总量的0.08％-5％存在。在该方法中，使用两对引物连同间插探针。下表11提供用于事件特异性PCR的引物序列。
表11：用于Q-PCR分析的引物
在基于Taq-Man的本测定中，将事件特异性PCR产物水平与在两种不同反应混合物中的每一个循环期间的内源性对照进行比较。
测定形式可利用两种PCR系统中每一种的标准曲线；每一标准曲线由4个标准点组成，每一点源自一式三份的测量。通过制备含有10％事件127大豆DNA的20ng/μl总基因组DNA溶液(标准品1)，并随后用稀释缓冲液进行1∶5系列稀释(标准品2-4)，来制备标准品。每一系统中用3个无模板对照(NTC)来验证试剂的纯度。以每一反应100ng基因组DNA分析每一个样品(未知)。
让事件和内源性PCR探针与FAM(激发495nm；发射520nm)缀合。设计引物以产生小于100bp长的短扩增子。将来自事件127大豆(10％)和Conquista(非GM)(90％)的基因组DNA混合物稀释到20ng/μl。然后对于标准曲线，用10ng/μl鲑鱼精子DNA将其稀释到20、4和0.8ng大豆DNA(反应体积为5μl)。在96-孔板的25μl体积中用所有标准组分(含尿嘧啶-N-糖基化酶的TaqMan通用PCR主混合物 (master mix)(AmpErase UNG，ABI))实施PCR反应；对于事件PCR，加入400nM浓度的引物和100nM的探针；对于内源性PCR，加入150nM浓度的引物和50nM的探针。在Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统中进行测定。在50℃2分钟和95℃10分钟的初次单循环后，进行以下45个循环：95℃达15秒和60℃达60秒。通过定量PCR分析事件127大豆和非转基因品种Conquista各自的3个样品和混合物。
H.重复和SEC61γ基因的分析
进行RT-PCR以测定存在于大豆事件127中的csr1-2编码序列部分的376bp重复或AtSec61γ基因是否转录。用Qiagen OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen)将总RNA用作模板用于RT-PCR。关于RT-PCR分析AtSec61γ编码序列，将来自叶和根的拟南芥总RNA样品亦用作阳性对照。用TRIzol试剂(Invitrogen)在无DNA酶处理的情况下制备拟南芥总RNA样品。50μl总体积中的RT-PCR反应含有1x Qiagen OneStep RT-PCR缓冲液、400μM各种dNTP、0.6μM各种引物、2μl的Qiagen OneStep RT-PCR酶混合物和500ng或125ng的总RNA。用GeneAmp PCR系统9700实施RT-PCR。在50℃30分钟的逆转录步骤后，在以下条件下进行PCR扩增：一个在95℃下15分钟的变性步骤；30个以下循环：94℃达30秒、64℃达30秒和72℃达1分钟；和1个在72℃下10分钟的延伸。将用于RT-PCR分析的引物序列提供在表12中。
将内源性大豆Sec61γ亚基和Iota基因用作阳性对照。大豆Iota亚基基因在大豆中组成型遍在表达(Yamamoto和Knap，2001)。
表12：用于RT-PCR分析的引物
*N/A-不适用。这是阳性对照；引物组预期扩增源自与事件127插入物无关的内源性大豆转录物cDNA。
I.整合位点的PCR分析
进行3种PCR反应以表征非转基因大豆品种Conquista的插入位点。用于本研究的PCR引物源自以下DNA序列，其经确定用于事件127基因组中新型表达盒侧翼的5’和3’基因组区。
设计了用于PCRA的PCR引物(参见下表13)，使得正向引物将结合5’侧翼序列，反向引物将结合紧接3’整合点后的3’侧翼序列。设计了用于PCRB的引物，使得正向引物结合5’侧翼序列，而反向引物将紧密结合3’侧翼序列远端。设计了用于PCRC的两种引物以在3’侧翼序列内结合。
表13：用于分析整合位点的引物
用Qiagen Taq DNA聚合酶实施PCRA和PCRC，用GeneAmp XL PCR试剂盒实施PCR2。在所有PCR扩增中使用25ng的事件127或Conquista DNA。对于用Qiagen Taq DNA聚合酶的PCR，在25μl 总体积的反应物中含有1x Qiagen PCR缓冲液、200μM的各种dNTP、0.4μM的各种引物和1单位Taq DNA聚合酶。在94℃初始变性4分钟步骤后，进行30个以下循环：94℃达30秒、66℃达45秒和72℃达2分钟，接着最后72℃延伸10分钟的步骤。
对于用GeneAmp XL PCR试剂盒的PCR，反应物含有除模板DNA外与用于克隆侧翼序列一样的组分。在初始94℃变性1分钟步骤后，进行30个以下循环：94℃达1分钟和66℃达10分钟，接着最后72℃延伸10分钟。
J.生物信息学分析
用Staden Pregap4和Gap4(Staden，1996)进行DNA序列组装。用LI-COR AlignIR软件(Licor Biotechnology；Lincoln，NE)进行克隆的和预期的插入序列的比对。针对可获得的公开DNA数据库(所有GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列)和BASF植物科学专有DNA数据库经由BLAST分析(Altschul等，1997)查询侧翼序列。用Vector NTI v9.0(Invitrogen)的ORF分析功能鉴定30或更多个密码子的开放阅读框。
基于这些实验结果，大豆事件127含有4758bp的单拷贝插入物，所述插入物包括完整csr1-2表达盒以及AtSec61γ亚基基因的5’UTR、整个编码序列和3’UTR。来自csr1-2基因的376bp的编码序列重复亦在3’连接处与侧翼序列整合。未发现载体主链序列整合到大豆基因组中。插入物在8个育种世代中稳定遗传，这证明插入物稳定整合到大豆基因组中。在csr1-2表达盒中有3个点突变：AHASL编码序列中的一个保守突变，其不影响突变体AHASL蛋白的除草剂耐受性或酶特性；和3’UTR下游的两个突变。似乎大豆基因组DNA的重排发生在插入物3’端的侧翼DNA中，这最有可能在DNA整合过程中发生。插入物含有AtSec61γ亚基基因的编码序列，其包括在用于转化的DNA片段中。该基因仅弱转录。csr1-2编码序列的376bp片段创立了新的501bp的ORF。RT-PCR实验表明该ORF没有可检测的转录。
实施例4：杂草控制
A.实施例4A：萌后施用
在巴西中部地区的以下3个不同区域建立了3个田间实验：圣保罗(Santo Antoniode Posse)的农业研究站(ARS)、戈亚斯(Santo Antonio de Goiás)，GO的Embrapa水稻及豆类(CNPAF)和Uberaba，MG的Embrapa-Epamig(CTTP)。表13中提出了在每一位置肆虐的杂草。
表13.萌后早期施用除草剂时每一位置肆虐的杂草
地区 杂草(肆虐-pl/平方米)
ARS CYPRO(25)、RCHBR(12)和IPOGR(14)
CNPAF COMBE(18)和BOILF(22)
CTTP EPHHL(21)和SIDRH(17)
CYPRO＝香附子(Cyperus rotundus)；BOILF＝阔叶丰花草；COMBE＝火柴头(Commelina benghalensis)；EPHHL＝猩猩草；SIDRH＝白背黄花稔(Sida rombifolia)；RCHBR＝巴西墨苜蓿；IPOGR＝Ipomoea grandifolia。
所有三个区域从种植到收获的所有程序都相同。在萌后早期当杂草具2-4片叶和大豆作物的第一片三叶完全打开时施用除草剂。用有3个重复的完全随机区组设计。主要处理呈提于表15中。
表15.在杂草萌后早期时施用的主要处理
处理 比例(gai/ha) 制剂
1.灭草烟 72 480g/l-AS
2.灭草烟+甲基咪草烟(Kifix) 70 525+175g/kg-WG
3.草甘膦 540 360g/l-AS
将咪唑啉酮除草剂施用于耐受咪唑啉酮的大豆(源自事件127)，草甘膦施用于Roundup Ready大豆(Valiosa RR)，在每一地区并排种植。咪唑啉酮除草剂(灭草烟和Kifix)与非离子辅助剂Dash以0.25％v/v施用。所有除草剂施用都用在190kpa时递送170l/ha的具80015低压喷 嘴的CO2背包式喷雾器来进行。所有大豆种子都以50cm一排的间隔和380,000粒种子/ha的密度种植5cm深。
在施用后(DAA)15和30天基于0-100级评估作物损伤，其中0级为无损伤，100级为作物死亡。在DAA 15、30和60天基于0-100级评估除草剂功效，其中0级为无控制，100级为完全控制。
下表16显示这些主要处理对施用除草剂时区域内存在的杂草的功效。根据这些结果，灭草烟和灭草烟+甲基咪草烟组合具有相似的功效。在DAA 30天，两种产品都对这7种重要的巴西杂草极为有效：CYPRO(87％)、COMBE(87-90％)、EPHHL(85-87％)、IPOGR(90-91％)、BOILF(82-83％)、SIDRH(86-87％)和RCHBR(83％)。在DAA 60天时，萌后施用时，咪唑啉酮除草剂比草甘膦对CYPRO、COMBE、RCHBR和IPOGR的效果较好。
表16.大豆(事件127和RR)萌后施用灭草烟、灭草烟+甲基咪草烟组合和草甘膦的功效
实施例4B：烧毁施用
在巴西中部地区的以下3个不同区域建立了3个田间实验：圣保罗的农业研究站(ARS)、戈亚斯，GO的Embrapa水稻及豆类(CNPAF)和乌贝拉巴(Uberaba)，MG的Embrapa-Epamig(CTTP)。表17中提出了在每一个这些区域中肆虐的杂草。
表17.烧毁施用除草剂时每一位置的杂草肆虐
区域 杂草(肆虐-pl/平方米)
ARS CYPRO(23)、EPHHL(15)和GASPA(32)
CNPAF DIGHO(24)、COMBE(15)和IPOGR(11)
CTTP BRAPL(41)和BIDPI(25)
BRAPL＝车前状臂形草(Brachiaria plantaginea)；DIGHO＝Digitariahorizontalis；CYPRO＝香附子；COMBE＝火柴头；EPHHL＝猩猩草；IPOGR＝Ipomoeagrandifolia；GASPA＝辣子草(Galinsoga parviflora)；BIDPI＝三叶针草(Bidenspilosa)。
所有三个区域从种植到收获的所有程序都相同。在大豆种植前5天烧毁时施用除草剂。
用有3个重复的完全随机区组设计。主要处理列于表18中。
表18.在种植前5天烧毁时施用的主要处理
处理 比例(g.a.i./ha) 制剂
1.草甘膦 1080 360g/l-AS
2.甲基咪草烟 70 700g/kg-WG
3.甲基咪草烟+灭草烟 70 525+175g/kg-WG
将源自事件127的耐受咪唑啉酮的大豆以50cm一排的间隔以380,000粒种子/ha的密度种植5cm深。咪唑啉酮除草剂与非离子辅助剂Dash以0.25％v/v施用。所有除草剂施用都用在190kpa时以170l/ha递送的具80015低压喷嘴的CO2背包式喷雾器(表18)。
在种植后(DAP)15和30天基于0-100级评估作物损伤，其中0级为无损伤，100级为作物死亡。在DAP 15、30和60天基于0-100级评估除草剂功效，其中0级为无控制，100级为完全控制。
表19显示这些主要处理对区域内烧毁施用时存在的杂草的功效。DAA 30和60天的结果显示咪唑啉酮除草剂与草甘膦相比的残留效果。在DAA 30天时，灭草烟+甲基咪草烟组合稍优于甲基咪草烟，但二者都对BRAPL(85％)、DIGHO(95％)、CYPRO(88％)、COMBE(75-94％)、EPHHL(95％)、IPOGR(75％)、GASPA(84-95％)和BIDPI(79-93％)有效。草甘膦无残余活性，其在DAA 30和60天时对这8种杂草无效。
表19.烧毁时施用的甲基咪草烟、灭草烟+甲基咪草烟组合和草甘膦对主要巴西杂草的功效(％)
实施例4C：对耐受草甘膦的植物的控制
进行温室研究以测定咪唑啉酮除草剂是否能用于控制在栽培区生长的不想要的耐受草甘膦的杂草及作物。将耐受草甘膦的植物的种子种植在4.5英寸的盆中，对于萌后施用用大都市混合物(metro mix)， 对于萌前施用用北卡罗来纳的土壤，且肥料在土壤表面缓慢释放。用空中浇水让植物保持在温室中。
让耐受草甘膦的大豆、玉米和加拿大莴苣中每一种的5株单独植株经受在萌后或萌前施用的草甘膦、灭草烟或甲基咪草烟的喷洒处理。对于玉米和大豆，在2-真叶阶段进行萌后喷洒，对于加拿大莴苣，在9-真叶阶段喷洒。以774g ae/ha的比例施用草甘膦，而灭草烟和甲基咪草烟除草剂则以以下比例施用：20g ai/ha、40g ai/ha、80g ai/ha、160g ai/ha和240g ai/ha。在处理后(DAT)14天和处理后(DAT)25天目测总损伤率百分比。在任何研究中未处理的对照植物都未表现可见损伤。萌后测试结果概述于表20中，萌前研究结果概述于表21中。结果提供为5株单独植株的平均值。
表20：萌后施用草甘膦和咪唑啉酮除草剂的损伤率
表21：萌前施用草甘膦和咪唑啉酮除草剂的损伤率
这些结果表明，咪唑啉酮除草剂可在萌前或萌后用于控制耐受草甘膦的杂草和作物。一个优点是能够将咪唑啉酮除草剂和事件127植物用于控制草甘膦不再有效控制的耐受性杂草和不想要的植物。
实施例4D：用大豆事件127提高大豆产量
进行田间试验以评估转基因大豆系的农艺学特点、表型特点及物候特点，所述转基因大豆系(事件127)相对于非转基因同基因对照(零)和其它非转基因(传统)大豆品种(对照)耐受咪唑啉酮除草剂。为此目的，在巴西田间区域进行了研究，该田间区域为商业大豆生产的代表性区域并适合所有基因型。
在所有田间区域以完全随机区组设计重复4次5种处理(表22)。每一样地由8m长的6排组成，同一样地的排间距为0.5m，相邻样地的排间距为1.0m。测定第3和第4排内的植物的表型及农艺学测量。
5种处理包括在这些评估中，其代表产生满足这些研究目的的合适数据所需要的特定大豆基因型和除草剂制剂(咪唑啉酮和非咪唑啉酮除草剂)的组合。
在这些评估中使用两种除草剂处理：1)灭草烟，以70g ai/ha的比例喷洒；和2)Volt，苯达松(400g ai/ha)和氟锁草醚(170g ai/ha)的组合，以570g ai/ha的比例喷洒。组合不同的大豆基因型和除草剂制剂以形成5种处理(表22)。这5种处理(T1、T2、T3、T4、T5)在实验设计中构成了完全重复。
表22.包括在每一大豆田间试验中的实验处理(项目)
处理 基因型 除草剂
处理1(T1) 事件127 灭草烟(70g ai/ha)
处理2(T2) 事件127 Volt(570g ai/ha)
处理3(T3) 同基因对照 Volt(570g ai/ha)
处理4(T4) Monsoy 8001 Volt(570g ai/ha)
处理5(T5) Coodetec 217(CD 217) Volt(570g ai/ha)
在巴西的7个实验站种植实验植物(表23)。实验站位于这样的地区，其代表大豆生产的区域和其中适合大豆基因型的区域。所有位置都有生物安全品质证书(CQB)、完备的基础设施、实验设备和田间用具及农业研究经验丰富并在生物安全性方面训练有素的工作人员。
表23.实验站位置以及位置、实验和CQB编码
城市，州 位置(实验)编码
圣保罗，SP EEA(011)
巴拉纳(Ponta Grossa)，PR SNT(008)
隆德里纳(Londrina)，PR CNPSO(010)
乌贝拉巴，MG CTTP(012)
巴西利亚(Brasília)，DF CNPH(016)
戈亚斯，GO CNPAF(014)
米纳斯吉拉斯(Sete Lagoas)，MG CNPMS(013)
通过定期记录用于阐述大豆基因型的表型和行为的各种特性，来测定事件127、同基因对照和对照品种的表型相似性、物候相似性及农艺相似性。记录所有地区的所有样地的特性(除非另外指出不是这样)。用Tukey检验来比较由ANOVA测定的对特定特性有显著作用的变化源的平均值。
作为不同地区间的平均值，用灭草烟(T1)或用Volt(T2)处理的事件127性能和用灭草烟(T3)处理的同基因对照的性能，在萌芽、最终直立(Final Stand)、绿茎、倒伏、到开花的天数、到成熟的天数或产量(表24)方面没有显著不同。只有T1的植物高度和种子大小显著不同于T3，只有T2的种子大小显著不同于T3。另外，对于T1和T2没有一种性状的位置间的平均值差异显著不同(表24)。
表24.每一评估的性状的位置间的处理平均值
G＝初始萌芽(％)；FS＝植物最后直立；PH＝植物高度(cm)；GS＝绿茎(％)；L＝倒伏程度；DF＝到完全开花的天数(生长周期)；DM＝到完全成熟的天数(总周期)；100SW＝种子大小(100粒种子的重量(g))；和产量＝谷物产量(kg/ha)。
T1＝用灭草烟处理的BPS-CV-127-9；T2＝用Volt处理的BPS-CV-127-9；T3＝用Volt处理的同系对照；T4＝用Volt处理的Monsoy 8001；T5＝用Volt处理的Coodetec 217。
§意指后接同样的字母的通过以5％概率的Tukey检验无显著不同。
本研究的结果表明，可将含有事件127的大豆系用于在施用具有残余活性的咪唑啉酮除草剂后保持产量水平，所述产量水平等于其它商业品种在不施用所述除草剂情况下的水平。
实施例5：用于事件特异性检测的基于凝胶的定性PCR测定
开发了基于凝胶的定性PCR测定方法用于检测种子和谷物样品中的事件-127核酸。所述方法能够检测非转基因大豆DNA混合物中的0.05％事件-127大豆DNA。
用混合磨MM 400(Retsch；Haan，Germany)在25ml碾磨杯中以30Hz将谷物和种子样品碾磨30秒，产生均一粉末。用CTAB(溴化十六烷基三甲铵)缓冲液从0.1-1g磨碎的谷物样品中提取基因组DNA，接着氯仿∶辛醇提取和醇沉淀。溶解得到的沉淀，通过阴离子交换色谱法用Genomic-tip 20/G引力流柱(Qiagen；Hilden，Germany)除去残留的抑制剂。
用分光光度计Nanodrop ND-1000(Peqlab Biotechnologie；Erlangen，Germany)通过测量260和280nm(A260/280)及260和230nm(A260/230)波长处的样品光吸收率的比率，来测定DNA的浓度和纯度。 选择具有A260/280比率接近1.8及A260/230高于1.8的DNA用于随后的PCR。
开发了另一引物组来扩增事件127特异区，将大豆特异性基因用作内源性对照。事件特异性PCR测定靶向对事件127独特的转基因插入物与天然大豆基因组DNA的连接。所有PCR扩增都在T1热循环仪(Biometra； Germany)中进行。在每一个PCR反应中用100纳克的基因组DNA作为模板。
用检测大豆(Glycine max)凝集素基因(Le1)(GenBank登记号K00821)的大豆特异性PCR系统作为参考系统。根据Hird等(J.AOAC Int.，86：66-71(2003))修改引物序列和PCR循环条件用于凝集素基因PCR。引物序列为SoyLec-F(5′-TGGTCGCGCCCTCTACTC)(SEQ IDNO：65)和SoyLec-R(5′-GGCGAAGCTGGCAACG)(SEQ ID NO：66)。将引物设计为扩增对大豆特异性的70个碱基对(bp)的片段。
在20μl总体积中进行内源性对照PCR，每一反应含100ng基因组DNA、200μM的dNTP、2mM MgCl2、500nM的各种引物和1单位Taq DNA聚合酶。在94℃初始变性2分钟后，进行以下32个循环：94℃达30秒、60℃达30秒和72℃达30秒，接着最后在72℃延伸1分钟。
用以上引物和条件进行反应并在琼脂糖凝胶上泳动，其中单独的DNA样品自以下物种获得：水稻(Oryza sativa)、油菜(Brassica napus)、棉花(Gossypium hirsutum，2种不同品系)、玉米(Zea Mays)、大豆Conquista、大豆事件127和无DNA模板(作为对照)。在来自大豆植物(Conquista和事件127)的DNA样品中获得70-碱基对的产物，而在其它样品中未获得扩增产物。因此，内源性对照引物能够特异性检测来自大豆的基因组DNA。
在5′插入物与基因组大豆DNA连接处建立了事件127大豆的事件特异性测定。正向引物结合位点位于天然基因组大豆DNA(127-61F：5′-GGGCAAACTAGT CTCGTAATATAT)(SEQID NO：67)内，反向 引物的结合位点位于127插入物(127-176R：5′-CGGAATTGGTAATCGAAATT)(SEQ ID NO：68)内。所述反应扩增116个碱基对(bp)的片段。
用100ng基因组DNA(来自水稻(Oryza sativa)、油菜(Brassica napus)、棉花(Gossypium hirsutum)、玉米(Zea Mays)、大豆GTS 40-3-2、大豆305423、大豆356043、大豆A2704-12、大豆Conquista、大豆事件127和无模板对照)测定事件特异性引物(127-61F和127-176R)的特异性。在20μl总体积中进行用于事件特异性反应的PCR，每反应含100ng模板DNA、200μM的dNTP、2mM MgCl2、500nM各种引物和1单位Taq DNA聚合酶。在94℃初始变性2分钟后，进行以下32个循环：94℃达30秒、56℃达30秒和72℃达30秒，接着最后在72℃延伸1分钟。
通过在溴化乙锭染色的4％琼脂糖凝胶中分离扩增的事件127-特异性116bp PCR片段，来测定样品中大豆事件127的存在情况。
在对应于大豆事件127样品的所有反应中获得事件127-特异性116bp PCR片段，同时在任何其它样品中未获得127-特异性PCR片段。因此，事件特异性引物127-61F和127-176R能够特异性检测来自事件127大豆植物的DNA。利用DNA-DNA基本局部比对搜寻工具(BLASTN)分析，使用扩增的事件特异性扩增子序列的核苷酸序列搜寻，未鉴别到任何100％同一性的匹配。
为了测定用127-61F和127-176R引物的反应的检测限度，通过随后用ConquistaDNA稀释事件127DNA，来制备含有确定的事件127DNA含量(100％、1％、0.5％、0.1％、0.05％和0％)的标准品。对于每一个稀释度，用上述条件进行22个重复的PCR扩增。每个系统用一个无DNA模板的对照(NTC)来验证试剂的纯度。
在0.05％-100％事件127DNA范围内所测的全部稀释度中检测到事件127-特异性PCR产物(116bp片段)。如所预期的一样，在非转基因大豆样品或无模板对照(NTC)中未检测到事件127-特异性带，虽然 所有非转基因大豆样品都显示，在预期扩增子存在下，大豆特异性PCR扩增中具有可扩增的DNA。样品中可用127-61F和127-176R引物可靠地检测的事件127DNA的最低量为0.05％。
用127-61F和127-176R引物的事件特异性PCR证明，95％置信度的相对LOD＜0.1％。另外，在0％事件127参考(100％非转基因大豆)或无模板对照反应中，127-61F和127-176R引物不扩增任何可检测的PCR产物。
为了评估PCR反应中不同退火温度的影响，在54℃和58℃的退火温度下一式三份实验分析了四个样品(0％、0.05％、1％和100％的用非转基因Conquista大豆DNA本底稀释的事件127大豆DNA)。结果表明，偏离最佳退火温度±2℃的退火温度产生100％正确检测事件127-特异性DNA。
为了评估不同PCR平台的影响，用ABI 7500快速实时PCR系统(AppliedBiosystems；Darmstadt，Germany)一式三份分析了3个样品(0.05％、1％和100％的用非转基因Conquista大豆DNA本底稀释的事件127大豆DNA)。包括0％事件127样品(100％Conquista DNA)和无DNA模板的样品作为对照。
结果证明用127-61F和127-176R引物在不同PCR仪器中进行的事件127-特异性PCR测定具有良好性能。在全部3个反应中的相对检测限度都为0.05％。如所预期，在非转基因大豆DNA本底中含有0％事件127DNA的样品或无模板对照中未检测到PCR产物。
为了评估实验室之间测定的可再现性(实验室之间的可转移性)，在单独的实验室中进行了两个独立实验。在两个独立实验中一式两份分析了在非转基因大豆DNA本底中含有0.05％-100％事件127DNA含量的不同样品，所述分析在DNA Engine Dyad热循环仪(BioRad；München，Germany)中进行，每一反应用100ng基因组DNA。结果表明实验室之间测定的良好可再现性(实验室之间的可转移性)。结果显示对于100％、1％和0.5％事件127DNA样品为100％阳性结果。另外， 对于0.1％和0.05％事件127DNA样品获得至少95％阳性结果(假定相对LOD≤0.05％)，在0％事件127DNA样品或无模板对照中未获得阳性结果。
用127-61F和127-176R引物的事件特异性的基于凝胶的定性PCR检测方法，在非转基因大豆DNA本底中含0.05％事件127DNA的混合物中能够检测事件127-特异性靶标序列。仅含有非转基因大豆DNA或其它转基因事件的样品未产生可检测的事件127-特异性PCR产物，由此实验性证明了该方法的特异性。
实施例6：用大豆事件127及咪唑啉酮和嗜球果伞素类(strobilurins)的组合提高 植物的健康状况
用以下物质处理大豆事件127植物：(1)咪唑啉酮除草剂或多种除草剂；(2)嗜球果伞素类杀真菌剂；和(3)咪唑啉酮除草剂或多种除草剂连同嗜球果伞素类杀真菌剂的组合。
将大豆事件127植物栽培在25cm直径的盆中，5株植株/盆。对于处理1-16，在播种后23天进行一种或多种除草剂和/或杀真菌剂(在下表X中阐述)的各种施用，对于处理17-32这在在播种后24天进行。
表25
在施用后(DAA)的1、7和14天，关于以下几个方面来评估植物：植物毒性、活力、植物高度、相对光合作用、相对SPAD(即叶的叶绿素/绿色的相对测量)和气孔导度。
如下表26所示，将吡唑醚菌酯加入到用甲基咪草烟或用甲基咪草烟加灭草烟的处理中，相对于无吡唑醚菌酯的某些处理，在某些时间点显著提高净光合作用、增加植物的整体绿色(相对SPAD)和提高气孔导度。
表26
这表明吡唑醚菌酯与抑制AHAS的除草剂(或多种除草剂)的组合为事件127大豆植物提供令人意想不到程度的益处。

Claims (9)

1.一种用于选择性控制栽培区中的杂草的方法，所述方法包括：
将有效量的包括抑制AHAS的咪唑啉酮除草剂的除草剂组合物施用于具有包含以下核酸分子的大豆植物的栽培大豆区，所述核酸分子包含SEQ ID NO：1的1302-6079位的核酸序列，其中所述核酸序列允许区别地鉴定所述大豆植物，其中所述核酸分子能够向其中表达所述核酸分子的大豆植物提供对100g AI/ha(克活性成分/公顷)灭草烟的耐受性，并且其中所述有效量会抑制野生型大豆植物和栽培大豆区的杂草的生长。
2.权利要求1的方法，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO：1的核酸序列。
3.权利要求1的方法，其中所述除草剂组合物进一步包括以下中的一种或多种：其它咪唑啉酮除草剂、其它抑制AHAS的除草剂、抑制EPSPS的除草剂、抑制GS的除草剂、抑制PPO的除草剂、生长素类除草剂及其组合。
4.权利要求3的方法，其中所述抑制AHAS的咪唑啉酮除草剂选自灭草烟、甲基咪草烟或其组合。
5.权利要求1的方法，其中所述杂草耐受草甘膦。
6.一种编码包含在653位的丝氨酸至天冬酰胺取代(S653N)的AHAS蛋白的修饰形式的分离或重组的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO：1的1302-6079位的核酸序列，其中所述核酸序列允许区别地鉴定所述核酸分子，并且其中所述核酸分子能够向其中表达所述核酸分子的大豆植物提供对100g AI/ha(克活性成分/公顷)灭草烟的耐受性。
7.权利要求6的分离或重组的核酸分子，其中所述核酸分子在重组核酸构建体中。
8.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括将嗜球果伞素施用于所述栽培区。
9.权利要求8的方法，其中所述嗜球果伞素包括吡唑醚菌酯。
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