KR20100101006A

KR20100101006A - 테트라히드로바이오프테린의 합성 방법

Info

Publication number: KR20100101006A
Application number: KR1020107017494A
Authority: KR
Inventors: 마크 헨더슨; 스티븐 정글스; 가브리엘레 로이들; 로버트 배피; 아드리아노 인돌레쎄; 크리스챤 뮐러; 필립 슈미트; 스테판 카이저
Original assignee: 바이오마린 파머수티컬 인크.
Priority date: 2008-01-07
Filing date: 2009-01-06
Publication date: 2010-09-15
Also published as: EP2240484A1; US8178670B2; IL206845A0; MX2010007452A; CL2009000007A1; AR070109A1; CN101959891A; CA2711444A1; WO2009088979A1; AU2009204476A1; PE20091314A1; US20090198055A1; CL2011000166A1; TW200942542A; RU2010133160A; JP2011508781A; CA2711444C; BRPI0907247A2

Abstract

본 개시는 높은 수득률 및 순도로 (6R)-테트라히드로바이오프테린을 효율적으로 생성시키는 제조 방법을 제공한다. 본 방법은 유기상 및 수성상을 포함하는 2상 혼합물에서 염기성 조건하에 디아세틸바이오프테린을 바이오프테린으로 가수분해하는 단계를 포함한다. 디아세틸바이오프테린의 실질적으로 완전한 가수분해 후, 바이오프테린을 함유하는 수성상이 대부분의 유기 불순물을 함유하는 유기상으로부터 분리될 수 있고, 이로 고체로서 바이오프테린을 단리하는, 시간을 많이 소모하는 단계를 피할 수 있다. 바이오프테린을 함유하는 수용액은 염기성 조건 및 높은 수소 압력하에서 금속 촉매 (예를 들어, 백금 촉매)의 존재하에 (6R)-테트라히드로바이오프테린으로 입체선택적으로 수소화된다. (6R)-테트라히드로바이오프테린의 산부가염 (예를 들어, (6R)-테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드)의 정제를 개선시키기 위해, 수소화 반응 후 수용액내 임의의 잔류 염 (예를 들어, 나트륨 염)은 수용액을 이온 (예를 들어, 양이온) 교환 수지 또는 컬럼과 접촉시킴으로써 제거될 수 있다. 별법으로, 수용액으로부터 잔류 염의 제거는 가수분해 및/또는 수소화 반응에서 무기 염기 대신에 유기 아민 (예를 들어, 디에틸아민 또는 트리에틸아민)이 사용되는 경우 생략될 수 있다.

Description

테트라히드로바이오프테린의 합성 방법{METHOD OF SYNTHESIZING TETRAHYDROBIOPTERIN}

본 개시는 일반적으로 사프로프테린(sapropterin)의 생성에 관한 것이다. 또한, 본 개시는 대규모 생성에 적합한 사프로프테린의 생성에 대한 개선된 방법에 관한 것이다.

사프로프테린 (테트라히드로바이오프테린, 또는 "BH4"라고도 불림)은 프테린 계열의 천연 발생 알칼로이드이다. 사프로프테린의 생물학적 활성 입체이성질체는 화학식 I에 나타난 화학 구조를 가진다:

<화학식 I>

사프로프테린은 또한 피리미딘 고리의 다른 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 사프로프테린의 생물활성 입체이성질체의 명명법은 (6R)-2-아미노-6[(lR,2S)-l,2-디히드록시프로필]-5,6,7,8-테트라히드로-4(lH)-프테리디논, 또는 (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린, 또는 6R-BH4이다.

사프로프테린의 화학적 합성은 공지되어 있다. 분자에 대한 접근은 약리 효과를 위해 필요한 특정 측쇄 및 분자의 프테린 고리 구조 부분 모두를 생성하기 위해 상이한 출발 물질을 사용하는, 다양한 방법에 의해 달성되어 왔다. 사프로프테린의 합성 방법은 예를 들어 미국 특허 제2,601,215호; 제3,505,329호; 제4,540,783호; 제4,550,109호; 제4,587,340호; 제4,595,752호; 제4,649,197호; 제4,665,182호; 제4,701,455호; 제4,713,454호; 제4,937,342호; 제5,037,981호; 제5,198,547호; 제5,350,851호; 제5,401,844호; 제5,698,408호; 및 제5,698,408호; 및 공개된 캐나다 특허 제2,420,374호에 개시되어 있다.

프테린은 카르보닐 산소 및 아미노기를 가지는 피리미딘 고리 및 피라진 고리를 포함하는 이고리형 화합물이다. 프테린은 효소 촉매작용에서 보조인자로서 기능한다. 사프로프테린은 페닐알라닌 히드록시라제 (PAH), 티로신 3-히드록시라제, 트립토판 5-히드록시라제, 및 산화질소 신타제 (NOS)의 세 이소형 모두를 포함하여, 다수의 상이한 효소의 보조인자로서 기능한다. 사프로프테린은 또한 크리티디아 파시쿨라타(Crithidia fasciculata)의 성장 인자이고, 혈액형성 세포에서 증식 활성을 가지며, 산화질소 독성에 대한 자가-보호 인자로서 작용한다. 사프로프테린의 이러한 및 다른 보조인자 및 세포 기능, 및 사프로프테린 결핍과 관련된 질병은 문헌 [Thony et ai, Biochem. J., 347:1-16 (2000)]에 개시되어 있다. 사프로프테린 결핍과 관련된 질병은 또한 문헌 [Blau et al, "Disorders of Tetrahydrobiopterin and Related Biogenic Amines," in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8th Ed., pp. 1275- 1776, McGraw-Hill Publishing Co. (New York, NY, 2001)]에 개괄적으로 기술되어 있다.

본 개시는 사프로프테린의 보다 효율적인 합성을 제공한다.

본 개시의 하나의 양상은 유기상 및 수성상을 포함하는 2상 혼합물에서 염기성 조건하 디아세틸바이오프테린을 바이오프테린으로 가수분해하는 단계를 포함하는, 사프로프테린의 합성 방법을 제공한다. 이 방법은 또한 디아세틸바이오프테린의 실질적으로 완전한 가수분해 후, 유기상으로부터 바이오프테린을 함유하는 수성상을 분리하는 단계, 및 그다음 수용액내 바이오프테린을 사프로프테린으로 수소화하는 단계를 포함할 수 있다. 바이오프테린의 수소화 후, 잔류 염 (예를 들어, 나트륨 염과 같은 무기 염)은 수용액을 이온 (예를 들어, 양이온) 교환 수지 또는 컬럼과 접촉시킴으로써 수용액으로부터 제거될 수 있다. 가수분해 및 수소화 반응은 또한 무기 염의 형성을 최소화 또는 방지하여 수용액을 이온 교환 수지 또는 컬럼과 접촉시키는 단계가 생략될 수 있도록 무기 염기의 부재하에서 수행될 수 있다.

본 개시의 다른 양상은 본 명세서에 기술된 방법에 의해 생성된 중간체 및 생성물을 제공한다.

본 개시의 추가적인 양상 및 장점은 다음의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 도면의 검토로부터 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서에 기술된 합성 방법은 각종 형태의 실시양태로 될 수 있으나, 본 명세서에 제공된 방법의 실시양태는 예시적이며 본 개시를 본 명세서에 기술된 특정 실시양태로 제한하려는 의도가 아니다.

본 개시의 이해를 용이하게 하기 위하여, 도면이 여기에 첨부된다.
도 1은 디아세틸바이오프테린 가수분해 반응의 초기 수성상 샘플의 크로마토그램을 나타내고, 이는 디아세틸바이오프테린, 및 바이오프테린 및 두 모노아세틸바이오프테린 종의 존재를 나타낸다.
도 2는 가수분해 반응을 밤새 교반한 후의 수성상의 샘플의 크로마토그램이고, 이는 오직 바이오프테린만이 존재하고, 임의의 유의한 불순물이 존재하지 않음을 나타낸다.
도 3은 디아세틸바이오프테린 가수분해 반응의 초기 유기상 샘플의 크로마토그램을 나타내고, 이는 출발 물질 및 완전 및 부분적 가수분해 생성물과 함께 미확인 유기 불순물의 존재를 나타낸다.
도 4는 가수분해 반응을 밤새 교반한 후의 유기상의 샘플의 크로마토그램이고, 이는 바이오프테린 및 소량의 출발 물질, 그러나 대부분 유기 불순물을 나타낸다.
도 5는 실시예 2에서 바이오프테린 수소화 반응의 조 생성물의 크로마토그램이고, 이는 대부분 (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린 및 소량의 (6S)-부분입체이성질체를 나타낸다.

고체로서, 사프로프테린은 산부가염으로서 단리될 수 있다. 가장 통상적으로, 사프로프테린은 디히드로클로라이드 염으로 단리되고, 이는 약리 제제에서 사프로프테린이 가장 흔히 제공되는 형태이다. 그러나, 사프로프테린은 또한 황산, 브롬화수소산, 또는 유기산의 염을 포함하나 이로 제한되지는 않는, 다른 종류의 산부가염으로 단리될 수 있다.

사카이(Sakai)의 미국 특허 제4,713,454호의 합성 방법이 상업적 목적을 위해 1 kg 내지 6 kg의 규모에서 화학식 I의 화합물을 생성하기 위해 이용되어 왔다.

BH4의 대규모 생성을 가능하게 하기 위해, 미국 특허 제7,361,759호 및 국제 특허 공고 제WO 2006/070902호에 기술된, 시라토리 파마수티컬즈 컴퍼니, 리미티드(Shiratori Pharmaceutical Co., Ltd.)에 따른 공정에 대해 변형이 이루어질 수 있다. 시라토리 공정에 기초한 변형 공정이 반응식 I에 나타난다:

<반응식 I>

그러나 반응식 I의 합성 방법은 사프로프테린 디히드로클로라이드의 공업 규모 생성에 여전히 부적합하고, 이는 상당 부분 이 방법이 긴 처리 시간을 수반하는, 핵심 중간체, L-바이오프테린 (화합물 10)의 단리를 필요로 하기 때문이다. 바이오프테린 약 300 kg을 제조하기 위해, 반응식 I의 공정은 디아세틸바이오프테린을 가수분해하고 바이오프테린을 여과 및 건조하기 위해 평균 265시간 (11일)을 필요로 하고, 이는 부분적으로는 바이오프테린이 용액으로부터 여과하기 어려운 미세립 입자로서 침전하기 때문이다. 반응식 I의 공정에 의한 사프로프테린 디히드로클로라이드의 대규모 생성 (예를 들어, 1 미터톤)에서, 총 처리 시간의 약 1/3이 바이오프테린의 단리를 수행하는데 소비될 것이다. 대조적으로, 실시예 4로 예시된 바와 같이, 본 방법의 특정 실시양태에서의 전체 가수분해 단계는 바이오프테린 약 155 kg을 생성하는데 오직 24시간 (1일)만이 걸리고, 이는 바이오프테린이 고체로 단리되거나 또는 건조되지 않고, 오히려 수성상에서 수집되어 2상 가수분해 혼합물의 유기상에 용해된 유기 불순물로부터 분리되기 때문이다. 더욱이, 고체 단리가 아닌 용액 취급이 본 방법을 간소화시켜 바이오프테린 용액의 여러 배치가 동시에 제조되어 나중의 추가적인 처리 (수소화 포함)를 위해 보유될 수 있다. 그에 반하여, 반응식 I의 공정에서의 가수분해 및 바이오프테린 단리 단계 (단계 8)에 필요한 11일은 가수분해 및 수소화 단계의 간소화를 어렵게 만든다.

본 개시의 방법은 또한 바이오프테린 수소화 반응을 수행하는데 필요한 시간을 상당히 감소시킨다. 본 방법의 수소화 반응은 23시간 미만 (수소 흡수는 반응이 10시간 이내 실질적으로 완료됨을 암시함)이 걸리는 반면, 반응식 I 공정의 수소화 반응은 평균 74시간이 걸린다. 반응식 I 공정의 것과 비교하여 보다 빠른 본 방법의 수소화 반응은 보다 높은 수소 압력 (50 바아 대 5 mPa), 보다 높은 온도 (25 ℃ 대 0 내지 5 ℃), 및 바이오프테린 출발 물질의 보다 높은 순도를 비롯하여 각종 인자의 결과일 수 있다 (하기 참조).

가수분해 및 수소화 단계의 처리 시간을 크게 감소시키는 것 외에, 본 방법은 양쪽 단계의 생성물의 수득률 및 순도를 상당히 개선한다. 본 방법의 가수분해 반응은 바이오프테린을 평균 수득률 82 % 및 평균 순도 92 %로 생성하는 반면, 반응식 I 공정의 가수분해 반응 (단계 8)은 바이오프테린을 평균 수득률 60 % 및 평균 순도 83 %로 생산한다 (동일한 분석 기술로 구함). 반응식 I의 가수분해 반응에서 바이오프테린의 보다 상당히 낮은 수득률은 일부, 60 ℃에서 산성 반응 조건하, 프로페닐 측쇄를 형성하기 위한 BH4 측쇄로부터의 두 히드록실기의 제거, 또는 측쇄의 완전한 제거 때문일 수 있다. 본 방법의 바이오프테린 생성물은 2상 반응 혼합물의 수성상이 임의의 유의한 불순물 없이 바이오프테린을 함유하는 반면 (도 2), 가수분해 반응의 대부분의 유기 부산물 및 불순물은 유기상으로 제거 (도 4)된다는 사실 때문에 높은 순도를 가진다.

또한, 본 방법의 수소화 단계 후의 "조(crude)" (6R)-BH4 디히드로클로라이드의 평균 수득률 64 %는 반응식 I의 수소화 단계 (단계 9) 후의 조 (6R)-BH4 디히드로클로라이드 (화합물 11)의 평균 수득률 54 %보다 상당히 높다. 본 방법의 것에 비교하여 보다 낮은 반응식 I 공정에서의 화합물 11의 수득률은 부분적으로는, 보다 불완전한 수소화 (반응식 I의 공정에 따른 수소화의 종료 후 7,8-디히드로바이오프테린 평균량 18 % 대 본 방법의 2 %) 및 보다 낮은 (6R)-BH4:(6S)-BH4 비율 (반응식 I의 공정에 따른 평균 8.5 대 본 방법의 10.5) 때문이다. 본 방법은 또한 반응식 I 공정의 단계 10 (86 %)보다 최종 산성화/재결정화 단계 후 약간 높은 평균 수득률 (90 %)로 순수한 (6R)-BH4 디히드로클로라이드를 제공한다. 전체적으로, 본 방법의 가수분해 및 수소화 단계는 반응식 I 공정의 단계 8 및 9 (32 %)보다 상당히 높은 평균 수득률 (53 %)로 "조" (6R)-BH4 디히드로클로라이드를 생성하고, 본 방법의 최종 세 단계는 반응식 I의 단계 8, 9, 및 10 (28 %)보다 상당히 높은 평균 수득률 (48 %)로 순수한 (6R)-BH4 디히드로클로라이드를 제공한다.

본 개시의 하나의 양상은 BH4 디히드로클로라이드 (화합물 12)의 합성이 고체 바이오프테린 (화합물 10)의 별도의 단리 또는 건조 없이 달성되는, 합성 방법 (경우에 따라 디아세틸바이오프테린을 수득하기 위한, 반응식 I의 단계 1 내지 7과 같은 단계를 포함)이다. 본 개시의 다른 양상은 디아세틸바이오프테린 (화합물 9)의 가수분해로부터 생성된 물질이 힘든 후처리 절차 없이 수소화되는 방법이다. 추가의 실시양태에서, 디아세틸바이오프테린상의 임의의 미가수분해된 아실기는 수소화의 조건하에서 가수분해된다. 다른 실시양태에서, BH4의 (6R) 입체화학은 바이오프테린의 수소화를 통해 입체선택적으로 얻어진다.

본 개시는 상업적 규모의 디아세틸바이오프테린의 가수분해 및 바이오프테린의 수소화를 포함하는, 사프로프테린 (사프로프테린 디히드로클로라이드 포함)의 개선된 합성 방법을 제공한다. 이 방법은 유기상 및 수성상을 포함하는 2상 혼합물에서 염기성 조건하 디아세틸바이오프테린을 바이오프테린으로 가수분해하는 단계를 포함한다. 디아세틸바이오프테린의 실질적으로 완전한 가수분해 후, 방법은 유기상으로부터 바이오프테린을 함유하는 수성상을 분리하는 단계, 및 그다음 분리된 수성상내 바이오프테린을 사프로프테린으로 수소화하는 단계를 포함할 수 있다. (6R)-사프로프테린은 당업계에 공지된 방법에 의해 수용액으로부터 정제될 수 있다 (문헌 [Matsuura et al, Chem. Lett., 735 (1984)] 및 미국 특허 제4,595,752호 및 제4,713,454호 참조).

본 명세서에 기술된 합성 방법, 및 본 방법에 의해 생성된 화합물은 본 명세서에 기술된 하나 이상의 단계, 요소, 특징, 및/또는 성분 (반응식 I에 나타난 것들 포함)을 포함할 수 있는, 또는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 단계, 요소, 특징, 및/또는 성분이 당업계에 공지된 실질적으로 유사한 단계, 요소, 특징, 및/또는 성분으로 대체될 수 있는 실시양태를 포괄한다. 예를 들어, 디아세틸바이오프테린 (화합물 9)은 반응식 I에 따라 합성될 수 있다. 다른 예로, LiCl은 반응식 I의 단계 6에서 LiClO₄으로 대체될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 디아세틸바이오프테린 가수분해 반응의 수성상의 pH는 알칼리성이다. 하나의 실시양태에서, 수성상의 pH는 알칼리성이고 약 12.2 이하, 또는 약 12 이하이다. 특정 실시양태에서, 가수분해 반응의 수성상의 pH는 약 10 내지 약 12.2, 또는 약 10.5 내지 약 12.2, 또는 약 11 내지 약 12.2, 또는 약 11.5 내지 약 12.2, 또는 약 11.8 내지 약 12의 범위에 있다. 구체적인 실시양태에서, 가수분해 반응의 수성상의 pH는 무기 염기 (예를 들어, 수산화나트륨) 및/또는 유기 염기 (예를 들어, 디에틸아민 또는 트리에틸아민)의 첨가에 의해 약 11.5 내지 약 11.8의 pH로 조정된다. 수성상의 pH가 약 12 초과로 증가하면, 전환율이 감소되기 시작할 수 있다 (한 연구에서 약 12.1 또는 12.2의 pH 초과에서 감소되기 시작했음). 더욱이, 가수분해 반응의 수성상의 pH가 약 12.2 초과로 증가하면, 불순물의 양이 증가할 수 있다. 예를 들어, 한 연구의 경우 약 pH 12.2에서 바이오프테린의 수득률이 80 % 미만으로 떨어졌다.

디아세틸바이오프테린의 에스테르 부분은 포스페이트 (예를 들어, 트리나트륨 포스페이트, 디나트륨 수소 포스페이트, 나트륨 이수소 포스페이트, 트리칼륨 포스페이트, 디칼륨 수소 포스페이트, 칼륨 이수소 포스페이트, 및 이들의 수화물, 및 이들의 조합물); 카르보네이트 (예를 들어, 나트륨 카르보네이트, 나트륨 바이카르보네이트, 칼륨 카르보네이트, 칼륨 바이카르보네이트, 및 이들의 수화물, 및 이들의 조합물); 수산화물 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화리튬, 및 이들의 수화물, 및 이들의 조합물); 아민 (예를 들어, 암모니아, 메틸아민, 에틸아민, 디메틸아민, 디에틸아민, 디이소프로필아민, 디에탄올아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 디이소프로필에틸아민, 시클로헥실아민, 피롤리딘, 피페리딘, 모르폴린, 피페라진, 이미다졸, 아닐린, 및 인다졸, 및 이들의 조합물); 암모늄 수산화물 (예를 들어, 암모늄 수산화물, 테트라메틸암모늄 수산화물, 테트라에틸암모늄 수산화물, 테트라부틸암모늄 수산화물, 벤질트리메틸암모늄 수산화물, 및 이들의 수화물, 및 이들의 조합물); 및 이들의 조합물을 포함하나 이로 제한되지는 않는 임의의 다양한 염기성 시약을 사용하여, 수성, 염기성 조건하에서 가수분해될 수 있다. 사용된 염기성 시약(들)의 양은 반응 혼합물에 존재하는 잔류 염의 양을 제한하면서, 가수분해 반응의 수성상의 알칼리성 pH를 얻기 위해 최적화된다. 수성상의 알칼리성 pH는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 수산화물(들), 카르보네이트(들), 포스페이트(들), 아민(들), 암모늄 수산화물(들), 및 이들의 조합물을 포함하나 이로 제한되지는 않는 염기성 시약(들)을 사용 및/또는 첨가함으로써 얻어질 수 있다.

하나의 실시양태에서, 디아세틸바이오프테린 가수분해 반응의 수성상은 pH 완충된다. 가수분해는 아세트산을 생성하기 때문에, pH 완충제는 급속한 가수분해를 위해 충분히 알칼리성인 pH를 유지하는데 보조한다. 완충제 없이는, 무기 염기가 묽은 농도에서 사용된다면, 더많은 염기가 첨가될 때까지 혼합물의 pH가 상당히 감소할 수 있고 가수분해가 상당히 느려질 수 있다. 이러한 잠재적 문제는 초기에 매우 과량의 염기를 이용함으로써 방지할 수 있다. 완충제의 사용은 또한 수소화 혼합물의 pH를 설정하고 생성물, 테트라히드로바이오프테린이 출발물질, 바이오프테린보다 더욱 염기성이기 때문에 반응 혼합물의 pH가 상승하는 경향이 있는바 반응 동안 이를 안정하게 유지하는 것을 용이하게 만들 수 있다. 특정 실시양태에서, 디아세틸바이오프테린 가수분해 반응의 수성상의 pH, 및/또는 바이오프테린 수소화 반응의 수성 혼합물의 pH는 포스페이트 시약(들) (예를 들어, 나트륨 이수소 포스페이트, 디나트륨 수소 포스페이트, 트리나트륨 포스페이트, 칼륨 이수소 포스페이트, 디칼륨 수소 포스페이트, 및 트리칼륨 포스페이트, 및 이들의 조합물), 수산화물(들) (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 및 수산화리튬, 및 이들의 조합물), 카르보네이트(들) (예를 들어, 나트륨 카르보네이트, 나트륨 바이카르보네이트, 칼륨 카르보네이트, 및 칼륨 바이카르보네이트, 및 이들의 조합물), 또는 이들의 조합물의 사용 및/또는 첨가를 통하여 완충된다.

추가의 실시양태에서, 에스테르 가수분해는 바이오프테린의 제거 부산물의 형성을 최소화 또는 방지하기 위해, 약 60 ℃ 이하, 또는 약 50 ℃ 이하, 또는 약 40 ℃ 이하의 온도에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 가수분해 반응의 온도는 비교적 짧은 시간 기간 (예를 들어, 약 40 ℃에서 약 16시간 이하 또는 약 30 ℃에서 약 12시간 이하)내 실질적으로 완전한 가수분해를 달성하기 위해, 약 20 ℃ 내지 약 60 ℃, 또는 약 20 ℃ 내지 약 50 ℃, 또는 약 20 ℃ 내지 약 40 ℃, 또는 약 25 ℃ 내지 약 40 ℃, 또는 약 30 ℃ 내지 약 40 ℃, 또는 약 30 ℃ 내지 약 35 ℃, 또는 약 35 ℃ 내지 약 40 ℃, 또는 약 40 ℃ 내지 약 50 ℃, 또는 약 50 ℃ 내지 약 60 ℃의 범위에 있다.

다른 실시양태에서, 디아세틸바이오프테린 가수분해 반응은 비교적 짧은 시간 기간, 예를 들어 약 12시간 이하 동안 수행된다. 또다른 실시양태에서, 가수분해 반응은 밤새 수행되고, 이는 총 약 15시간 이하, 또는 약 18시간 이하, 또는 약 21시간 이하, 또는 약 24시간 이하가 될 수 있다. 비교적 짧은 반응 시간은 총 처리 시간 및 제조 캠페인 수행 시 식물 자원의 효율적인 사용을 위해 유리하다.

디아세틸바이오프테린, 두 모노아세틸바이오프테린 및 바이오프테린의 혼합물을 함유하는, 산화 단계 (반응식 I의 단계 7에 상응함)의 조 생성물은 가수분해 반응에서 출발 물질로서 이용될 수 있다. 가수분해 반응의 조 출발 물질은 예를 들어, 약 55% 1',2'-디-O-Ac-바이오프테린, 약 25% 1'-O-Ac-바이오프테린, 약 15% 2'-O-Ac-바이오프테린, 및 약 5% 바이오프테린을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 가수분해 반응의 수성상에서 디아세틸바이오프테린 "동등물"의 농도 (모든 모노아세틸바이오프테린 및 모든 바이오프테린을 디아세틸바이오프테린으로 계산함)는 최대 약 300 mg/mL, 또는 최대 약 290 mg/mL, 또는 최대 약 280 mg/mL, 또는 최대 270 mg/mL, 또는 최대 260 mg/mL, 또는 최대 약 250 mg/mL, 또는 최대 약 240 mg/mL, 또는 최대 약 230 mg/mL, 또는 최대 약 220 mg/mL, 또는 최대 약 210 mg/mL, 또는 최대 약 200 mg/mL, 또는 최대 약 190 mg/mL, 또는 최대 약 180 mg/mL, 또는 최대 약 170 mg/mL, 또는 최대 약 160 mg/mL, 또는 최대 약 150 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 가수분해 반응의 완료는 최대 약 220 mg/mL, 또는 최대 약 210 mg/mL, 또는 최대 약 200 mg/mL, 또는 최대 약 190 mg/mL, 또는 최대 약 180 mg/mL, 또는 최대 약 170 mg/mL, 또는 최대 약 160 mg/mL, 또는 최대 약 150 mg/mL, 또는 최대 약 140 mg/mL, 또는 최대 약 130 mg/mL, 또는 최대 약 120 mg/mL, 또는 최대 약 110 mg/mL, 또는 최대 약 100 mg/mL, 또는 최대 약 90 mg/mL, 또는 최대 약 80 mg/mL의, 수성상에서의 바이오프테린 (수득률 100% 가정)의 농도를 야기한다.

특정 실시양태에서, 가수분해 반응의 수성상에서 디아세틸바이오프테린 동등물의 농도는 약 150 mg/mL 내지 약 250 mg/mL (바이오프테린 수득률 100 % 가정하에, 약 110 mg/mL 내지 약 185 mg/mL의 수성상에서의 바이오프테린 농도에 상응), 또는 약 160 mg/mL 내지 약 240 mg/mL (바이오프테린 약 120 mg/mL 내지 약 180 mg/mL에 상응), 또는 약 170 mg/mL 내지 약 230 mg/mL (바이오프테린 약 125 mg/mL 내지 약 170 mg/mL에 상응), 또는 약 180 mg/mL 내지 약 220 mg/mL (바이오프테린 약 130 mg/mL 내지 약 160 mg/mL에 상응), 또는 약 190 mg/mL 내지 약 210 mg/mL (바이오프테린 약 140 mg/mL 내지 약 155 mg/mL에 상응)의 범위에 있다.

다른 실시양태에서, 가수분해 반응의 수성상에서 디아세틸바이오프테린 동등물의 농도는 약 150 mg/mL 내지 약 300 mg/mL, 또는 약 200 mg/mL 내지 약 300 mg/mL의 범위에 있다. 디아세틸바이오프테린 동등물 260 mg/mL은 바이오프테린 수득률 100 % 가정하에 약 190 mg/mL의 수성상에서의 바이오프테린 농도에 상응하고, 디아세틸바이오프테린 270 mg/mL은 바이오프테린 약 200 mg/mL에 상응하고, 디아세틸바이오프테린 280 mg/mL은 바이오프테린 약 205 mg/mL에 상응하고, 디아세틸바이오프테린 290 mg/mL은 바이오프테린 약 215 mg/mL에 상응하고, 디아세틸바이오프테린 300 mg/mL은 바이오프테린 약 220 mg/mL에 상응한다.

디아세틸바이오프테린 가수분해 반응의 유기-가용성 부산물 또는 불순물은 가수분해 반응에서 물 및 수불혼화성 유기 용매의 사용 및 반응 후 유기상으로부터 수성상의 분리에 의해 바이오프테린의 수소화에 앞서 쉽게 제거될 수 있다. 수성상이 높은 순도 (예를 들어, 평균 순도 약 87 % 내지 92 %)의 조 바이오프테린을 함유하는 반면, 대부분의 유기 불순물은 유기상에서의 용해를 통해 제거된다. 가수분해 반응에서 유기 용매의 사용에 대한 다른 장점은 반응에서 염기로서 유기 아민 (예를 들어, 메틸아민, 에틸아민, 디메틸아민, 디에틸아민, 디이소프로필아민, 디에탄올아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 디이소프로필에틸아민, 시클로헥실아민, 피페리딘, 모르폴린, 및 피페라진, 및 이들의 조합물)의 선택적 사용을 가능하게 한다는 것이다. 수불혼화성 유기 용매는 물보다 밀도가 높거나 또는 낮을 수 있다.

비제한적으로 알콜, 에테르, 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 할로겐화 탄화수소, 및 이들의 조합물을 포함하는, 각종 수불혼화성 유기 용매가 디아세틸바이오프테린 가수분해 반응에서 이용될 수 있다. 수불혼화성 유기 용매의 비제한적 예는 알콜 (예를 들어, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 및 이들의 이성질체, 및 이들의 조합물); 에테르 (예를 들어, 디에틸에테르, 1,4-디옥산, 및 1,3-디옥산, 및 이들의 조합물); 지방족 탄화수소 (예를 들어, 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸, 및 이들의 이성질체, 및 이들의 조합물); 방향족 탄화수소 (예를 들어, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 및 이들의 이성질체, 및 이들의 조합물); 및 할로겐화 탄화수소 (예를 들어, 디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄, 트리클로로에탄, 및 이들의 이성질체, 및 이들의 조합물)를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 가수분해 반응의 2상 혼합물은 n-부탄올 (1-부탄올)을 포함한다.

도 1 내지 4는 시간이 지남에 따른 디아세틸바이오프테린의 가수분해, 및 유기상에서의 용해에 의한, 요망되는 생성물, 바이오프테린으로부터의 유기 불순물의 분리를 나타낸다. 유기상에 용해된 바이오프테린은 전체 바이오프테린의 2 % 미만을 구성한다. 도 1은 디아세틸바이오프테린 가수분해 반응의 수성상의 초기 샘플의 크로마토그램을 도시하고, 이는 디아세틸바이오프테린, 바이오프테린 및 두 모노아세틸바이오프테린 종의 존재를 나타낸다. 도 2는 가수분해 반응물을 밤새 교반한 후의 수성상의 샘플의 크로마토그램이고, 이는 오직 바이오프테린만이 존재하고, 임의의 유의한 불순물이 존재하지 않음을 나타낸다. 도 3은 가수분해 반응의 유기상의 초기 샘플의 크로마토그램을 나타내고, 이는 출발 물질 및 완전 및 부분적 가수분해 생성물과 함께 미확인 유기 불순물의 존재를 나타낸다. 도 4는 가수분해 반응물을 밤새 교반한 후의 유기상의 샘플의 크로마토그램이고, 이는 바이오프테린 및 소량의 디아세틸바이오프테린, 그러나 대부분 유기상의 미확인된 유기 불순물을 나타낸다.

특정 실시양태에서, 바이오프테린을 형성하기 위한 디아세틸바이오프테린의 가수분해는 본 명세서에 기술된 임의의 무기 염기, 유기 염기, 및/또는 pH 완충제 를 사용하여, 염기성 조건하 혼합물에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 혼합물은 단일상이다. 특정 실시양태에서, 혼합물은 단일상 수성 혼합물이다. 특정 실시양태에서, 단일상 수성 혼합물에서 가수분해의 실질적인 완료 후, 수불혼화성 유기 용매 (예를 들어, n-부탄올)가 임의의 불순물, 부산물 및/또는 미반응 출발 물질을 생성된 바이오프테린을 함유하는 수성 혼합물로부터 유기층으로 추출하기 위해 첨가된다. 특정 실시양태에서, 가수분해 반응 혼합물은 수불혼화성 유기 용매 (예를 들어, n-부탄올)를 함유하고, 경우에 따라 출발 물질의 가수분해 및/또는 용해를 용이하게 하기에 충분한 양의 물을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 경우에 따라 충분한 양의 물을 함유할 수 있는 유기 혼합물에서 가수분해의 실질적인 완료 후, 물을 유기 혼합물에 첨가하여 바이오프테린을 수성층으로 회수하고, 임의의 불순물, 부산물 및/또는 미반응 출발 물질을 유기층에 남겨둔다.

바이오프테린의 수소화는 적합한 금속 촉매, 예를 들어, 백금, 팔라듐, 또는 로듐 촉매를 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 수소화는 백금 촉매로 수행된다. 하나의 실시양태에서, 백금 촉매는 백금흑(platinum black), 백금 산화물 (PtO₂ 및 이들의 수화물 포함), 탄소상 백금 (10% Pt/C, 5% Pt/C, 3% Pt/C, 1% Pt/C, 및 0.5% Pt/C 포함), 및 알루미나상 백금 (5% Pt/알루미나, 1% Pt/알루미나, 및 0.5% Pt/알루미나 포함)으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에서, 수소화 촉매는 백금흑 또는 백금 산화물이다. 백금흑과 백금 산화물은 모두 높은 백분율의 전환을 제공하나, Pt 흑으로의 수소화가 보다 높은 비율의 (6R)-사프로프테린 대 (6S)-사프로프테린을 야기할 수 있다. PtO₂ (아담(Adam) 촉매)가 이용된다면, 촉매의 수소화에 의해 이를 미세 입도의 Pt 흑으로 전환시킨다.

하나의 실시양태에서, 수소화 반응에서 사용되는 금속 촉매의 양 (본 명세서에서 촉매 첨가량이라고도 지칭됨)은 가수분해 반응에 앞선 디아세틸바이오프테린 동등물의 양 또는 수소화 반응에 앞선 바이오프테린 동등물의 양을 기준으로 약 10 몰% 이하이다. 바이오프테린의 효율적인 수소화는 약 10 몰% 이하의 수소화 촉매의 사용으로 달성된다. 특정 실시양태에서, 사용되는 수소화 촉매의 양은 디아세틸바이오프테린 동등물 또는 바이오프테린 동등물의 양을 기준으로 약 8 몰% 이하, 또는 약 7 몰% 이하, 또는 약 6 몰% 이하. 또는 약 5 몰% 이하, 또는 약 4 몰% 이하이다. 특정 실시양태에서, 사용되는 수소화 촉매의 양은 디아세틸바이오프테린 동등물 또는 바이오프테린 동등물의 양을 기준으로 약 2 내지 약 8 몰%, 또는 약 2 내지 약 7 몰%, 또는 약 2 내지 약 6 몰%, 또는 약 2 내지 약 5 몰%, 또는 약 2 내지 약 4 몰%, 또는 약 2 내지 약 3 몰%, 또는 약 2.2 내지 약 2.8 몰%, 또는 약 2.1 내지 약 2.6 몰%의 범위에 있다.

추가의 실시양태에서, 바이오프테린의 수소화는 약 14 바아 내지 약 100 바아, 또는 약 14 바아 내지 약 50 바아, 또는 약 50 바아 내지 약 100 바아 (1 바아는 1기압의 압력과 등가) 범위의 수소 압력하 압력 용기에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 수소 압력은 약 14 내지 약 28 바아, 또는 약 20 내지 약 50 바아, 또는 약 25 내지 약 50 바아, 또는 약 30 내지 약 50 바아, 또는 약 35 내지 약 50 바아, 또는 약 40 내지 약 50 바아의 범위에 있다. 특정 실시양태에서, 수소 압력은 약 100 바아, 또는 약 50 바아, 또는 약 35 바아, 또는 약 28 바아, 또는 약 21 바아, 또는 약 14 바아이다. 바이오프테린의 수소화는 부분입체선택적이고, 보다 높은 수소 압력에서 보다 높은 6R:6S 부분입체이성질체 비율 및 전환이 얻어질 수 있다. 예를 들어, 약 20:1의 6R:6S 부분입체이성질체 비율이 약 100 바아의 수소 압력하에서 바이오프테린을 수소화함으로써 얻어질 수 있으나, 약 50 바아를 초과하는 수소 압력하에서의 상업적 규모 수소화는 비싸고, 특수한 수소화 반응기를 필요로 한다.

다른 실시양태에서, 바이오프테린의 수소화는 약 0 ℃ 내지 약 40 ℃ 또는 약 50 ℃ 범위의 온도에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 수소화는 약 0 ℃ 내지 약 20 ℃, 또는 약 0 ℃ 내지 약 10 ℃, 또는 약 0 ℃ 내지 약 5 ℃ 범위의 온도에서 이루어진다. 다른 실시양태에서, 수소화 반응은 약 20 ℃ 내지 약 50 ℃, 또는 약 20 ℃ 내지 약 40 ℃, 또는 약 25 ℃ 내지 약 40 ℃, 또는 약 30 ℃ 내지 약 40 ℃, 또는 약 20 ℃ 내지 약 30 ℃, 또는 약 25 ℃ 내지 약 35 ℃, 또는 약 25 ℃ 내지 약 30 ℃, 또는 약 30 ℃ 내지 약 35 ℃, 또는 약 35 ℃ 내지 약 40 ℃, 또는 약 40 ℃ 내지 약 50 ℃ 범위의 온도에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 수소화는 약 25 ℃ 또는 약 30 ℃에서 수행된다. 보다 낮은 온도 (약 0 ℃까지)에서 보다 높은 6R:6S 부분입체이성질체 비율이 얻어질 수 있으나, 보다 낮은 온도에서의 수소화는 반응 속도 및 전환을 감소시킬 수 있고 특수 수소화 용기를 필요로 할 수 있다. 보다 높은 온도, 최대 약 40 ℃ (또는 잠재적으로 최대 약 50 ℃)에서의 수소화는 보다 빠른 속도에서 진행되고 6R:6S 부분입체선택성에서 상당한 감소없이 보다 높은 전환을 제공한다.

또다른 실시양태에서, 수소화 반응에서 수성 혼합물의 pH (수성상이 가수분해 반응 후 유기상으로부터 분리되어 수집된다면), 또는 2상 혼합물의 수성상의 pH는 알칼리성이다. 특정 실시양태에서, 수소화 반응의 바이오프테린-함유 수성 혼합물 또는 수성상의 pH는 약 10 내지 약 12.5, 또는 약 10 내지 약 12, 또는 약 10.5 내지 약 12.5, 또는 약 10.5 내지 약 12, 또는 약 11 내지 약 12.5, 또는 약 11 내지 약 12, 또는 약 11.5 내지 약 12.5, 또는 약 11.5 내지 약 12의 범위에 있다. 수성 혼합물 또는 수성상내 바이오프테린의 용해도를 촉진시키는 것 외에, 비교적 높은 pH는 6R:6S 부분입체선택성을 개선시키고 임의의 잔류 디아세틸바이오프테린 또는 모노아세틸바이오프테린의 가수분해를 촉진시킨다.

수소화 반응의 수성 혼합물 또는 수성상의 pH는 염기성 무기 시약 및/또는 염기성 유기 시약의 사용을 통해 알칼리성으로 만들어질 수 있다. 수소화 반응의 수성 혼합물 또는 수성상의 알칼리성 pH를 얻기 위해 이용될 수 있는 염기성 시약의 비제한적인 예는 포스페이트 (예를 들어, 트리나트륨 포스페이트, 디나트륨 수소 포스페이트, 나트륨 이수소 포스페이트, 트리칼륨 포스페이트, 디칼륨 수소 포스페이트, 칼륨 이수소 포스페이트, 및 이들의 수화물, 및 이들의 조합물); 카르보네이트 (예를 들어, 나트륨 카르보네이트, 나트륨 바이카르보네이트, 칼륨 카르보네이트, 칼륨 바이카르보네이트, 및 이들의 수화물, 및 이들의 조합물); 수산화물 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화리튬, 및 이들의 수화물, 및 이들의 조합물); 아민 (예를 들어, 암모니아, 메틸아민, 에틸아민, 디메틸아민, 디에틸아민, 디이소프로필아민, 디에탄올아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 디이소프로필에틸아민, 피롤리딘, 시클로헥실아민, 피페리딘, 모르폴린, 피페라진, 이미다졸, 아닐린, 및 인다졸, 및 이들의 조합물); 암모늄 수산화물 (예를 들어, 암모늄 수산화물, 테트라메틸암모늄 수산화물, 테트라에틸암모늄 수산화물, 테트라부틸암모늄 수산화물, 벤질트리메틸암모늄 수산화물, 및 이들의 수화물, 및 이들의 조합물)을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 수소화 반응의 수성 혼합물 또는 수성상의 pH는 유기 아민 (예를 들어, 디에틸아민 또는 트리에틸아민)의 사용 및/또는 첨가에 의해 약 10 또는 11 이상의 pH로 상승 및/또는 유지된다.

특정 실시양태에서, 수소화 반응의 수성 혼합물 또는 수성상에서의 바이오프테린 "동등물"의 농도 (모든 디아세틸바이오프테린 및 모든 모노아세틸바이오프테린을 바이오프테린으로 계산함)는 최대 약 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 또는 최대 약 15 % w/w이다. 추가의 실시양태에서, 수소화 반응의 수성 혼합물 또는 수성상에서의 바이오프테린 동등물의 농도는 약 1 % 내지 약 15 % w/w, 또는 약 1 % 내지 약 10 % w/w, 또는 약 2 % 내지 약 10 % w/w, 또는 약 2 % 내지 약 8 % w/w, 또는 약 2 % 내지 약 7 % w/w, 또는 약 3 % 내지 약 7 % w/w, 또는 약 4 % 내지 약 6 % w/w의 범위에 있다.

다른 실시양태에서, 별도의 디아세틸바이오프테린 가수분해 단계가 생략되고, 에스테르기의 가수분해 및 피라진 고리의 수소화가 본 명세서에 기술된 수소화 반응의 임의의 조건하 하나의 단계에서 수행된다. 아세테이트 에스테르기는 수소화 반응을 위해 알칼리성 조건 (예를 들어, 약 10 내지 약 12.5 범위의 pH)하에서 가수분해된다. 산화 단계 (반응식 I의 단계 7에 상응)의 조 생성물은 원-팟(one-pot) 가수분해/수소화 반응에서 출발 물질로 사용될 수 있다. 원-팟 반응은 알칼리성 수성상 및 유기상을 포함하는 2상 혼합물에서 수행될 수 있다. 별법으로, 원-팟 반응은 단일상 알칼리성 수성 혼합물에서 수행될 수 있고, 가수분해 및 수소화 모두의 실질적인 완료 후, 수불혼화성 유기 용매가 혼합물로 첨가되어 임의의 유기 부산물, 불순물 및/또는 미반응 출발 물질을 유기층으로 추출하고 요망되는 생성물, 테트라히드로바이오프테린을 수성층에 남겨둘 수 있으며, 이는 유기층으로부터 분리되고 수집될 수 있다. 단일- 또는 2-상 알칼리성 수성 혼합물에서 수행되든지 아니든지, 본 명세서에 기술된 임의의 무기 염기, 유기 염기, 및/또는 pH 완충제가 원-팟 가수분해/수소화 반응에서 이용될 수 있고, 반응은 본 명세서에 기술된 바와 같이 임의의 방식으로 후처리될 수 있다. 원-팟 가수분해/수소화 반응은 높은 수득률 (예를 들어, 80 % 초과) 및 높은 6R:6S 부분입체선택성 (예를 들어, 8:1 초과)으로 테트라히드로바이오프테린을 제공할 수 있다.

본 명세서에 기술된 합성 방법은 높은 6R:6S 부분입체선택성으로 사프로프테린, 및/또는 사프로프테린의 산성화 후의 사프로프테린의 산부가염 (예를 들어, 사프로프테린 디히드로클로라이드)을 생성한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 약 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5 이상, 또는 약 15 이상의 6R:6S 부분입체선택성을 가지는, 사프로프테린 또는 이들의 산부가염을 생성한다. 더욱이, 본 명세서에 기술된 방법은 높은 수득률로 (6R)-사프로프테린을 생성한다. 특정 실시양태에서, 본 방법의 수소화 반응은 약 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % 이상 또는 약 90 % 이상의 수득률로 (6R)-사프로프테린을 생성한다.

특정 실시양태에서, 디아세틸바이오프테린 (화합물 9)은 하나 이상의 염기성 시약 (예를 들어, 염기성 무기 시약 및/또는 염기성 유기 시약)의 존재하에서, pH가 약 11 내지 약 12.2 또는 약 11.5 내지 약 12.2로 유지되는 선택적으로 완충된 수성상에서 용해되고; 수불혼화성 유기 용매가 또한 사용되어 2상 혼합물을 형성한다. 혼합물은 TLC, LC-MS 또는 HPLC와 같은 임의의 각종 분석 기술에 따라, 두 아세테이트 에스테르의 가수분해가 실질적으로 완료 (예를 들어, 모든 디아세틸바이오프테린 및 모든 모노아세틸바이오프테린의 양이 총 약 5 % 또는 약 10 % 이하)될 때까지 약 20 ℃ 내지 약 40 ℃ 범위의 온도에서 교반된다. 선택적 여과 (예를 들어, 셀라이트(celite)를 통함) 후, 백금 촉매 (예를 들어, 백금흑 또는 백금 산화물)를 사용한, 약 14 바아 내지 약 50 바아 범위의 수소 압력하 및 약 0 ℃ 내지 약 40 ℃ 범위의 온도에서의 생성 혼합물의 수소화, 및 그에 뒤따른 유기상으로부터 수성상의 분리, 적합한 매체 (예를 들어, 셀라이트 및/또는 이온 교환 수지)를 통한 수성상의 여과로의 임의의 잔류 백금 촉매 및/또는 임의의 잔류 염의 제거, 및 HCl로의 수성 여액의 산성화 (별법으로, 분리, 여과 및 산성화는 임의의 순서로 수행될 수 있음)는 높은 6R:6S 부분입체선택성 (예를 들어, 약 8:1 또는 9:1 이상) 및 높은 수득률 (예를 들어, 약 65 % 내지 약 80 %)로 사프로프테린 디히드로클로라이드를 생성한다. 별도의 실시양태에서, 가수분해 반응의 유기 및 수성상은 침강되게 되고, 바이오프테린을 함유하는 수성상은 유기 불순물을 함유하는 유기상으로부터 분리되며, 수성상은 경우에 따라 여과되고 (예를 들어, 셀라이트 패드 또는 여과 보조제, 예를 들어 비타셀(Vitacel) FAC 200을 통함) (별법으로, 2상 혼합물이 수성상의 분리에 앞서 여과될 수 있음), 수소화를 겪게 되며 후처리 되어 (상기 기술된 바와 같음) 높은 부분입체선택성 및 높은 수득률로 (6R)-사프로프테린 디히드로클로라이드를 제공한다.

최종 산성화 및 정제 단계 (반응식 I의 단계 10에 상응)에 앞선 수용액으로부터 임의의 잔류 염 (예를 들어, 무기 염)의 제거는 예를 들어 최종 결정화 혼합물에서의 염 함량을 감소 또는 최소화시킴으로써 BH4 산부가염 (예를 들어, (6R)-BH4 디히드로클로라이드) 최종 생성물의 순도를 상당히 개선시킬 수 있다. 염 (무기 염 포함)의 양은 각종 수단, 예를 들어 pH 완충제의 부재하에서의 가수분해, 수소화에 앞선 염의 침전, 수소화 후 이온 교환 수지 또는 컬럼과의 접촉, 및 무기 염기의 부재하에서의 가수분해 및/또는 수소화에 의해 감소될 수 있거나, 또는 이들의 형성이 방지될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 생산된 무기 염의 양이 무기 염기 (예를 들어, 수산화나트륨)의 부재 및/또는 무기 pH 완충제 (예를 들어, 포스페이트 완충제)의 부재하에서 디아세틸바이오프테린 가수분해 반응을 수행함으로써 감소되거나, 또는 이들의 생산이 방지된다. 가수분해 반응의 수성상의 pH는 무기 염기 및/또는 무기 pH 완충제 대신에 유기 염기 (예를 들어, 디에틸아민 또는 트리에틸아민과 같은 유기 아민)를 사용함으로써 알칼리성으로 만들어질 수 있다.

다른 실시양태에서, 바이오프테린-함유 수성상 또는 수용액내 무기 염의 양은 수소화 전에 염을 침전시킴으로써 감소된다. 하나의 실시양태에서, 가수분해 후 및 상 분리에 앞서, 2상 혼합물이 보다 낮은 온도 (예를 들어, 약 0 ℃ 내지 약 5 ℃)로 냉각되어 무기 염의 침전이 유도된다. 냉각된 혼합물은 여과되어 침전된 염을 제거할 수 있다. 다른 실시양태에서, 가수분해 후 수성상이 유기상으로부터 분리되고, 수집된 수성상은 보다 낮은 온도 (예를 들어, 약 0 ℃ 내지 약 5 ℃)로 냉각되고, 냉각된 혼합물은 여과되어 침전된 염을 제거한다. 그러나, 무기 염 외에, 수성 혼합물의 냉각시 바이오프테린이 또한 침전할 수 있고, 이로 바이오프테린의 수득률이 감소할 수 있다.

추가의 실시양태에서, 수소화 및 후처리 후 수용액내 임의의 잔류 염 (무기 염 포함)은 용액을 이온 교환 수지 또는 컬럼과 접촉시킴으로써 제거된다. 가수분해, 수소화 및 후처리 (금속 촉매의 제거를 위한 여과 및 상들이 수소화에 앞서 분리되지 않은 경우 유기상으로부터 수성상의 분리를 포함) 후, 수용액으로부터의 잔류 염의 제거의 준비로, 생성된 수용액의 pH가 약 10 또는 11 이상의 pH로 상승 및/또는 유지된다. 특정 실시양태에서, 수용액의 pH는 약 10 내지 약 12, 또는 약 10.5 내지 약 12, 또는 약 11 내지 약 12, 또는 약 11.5 내지 약 12, 또는 약 11.8 내지 약 12의 범위로 상승 및/또는 유지된다. 알칼리성 pH는 무기 (예를 들어, 나트륨) 염의 형성을 최소화하는 방식으로 염기성 무기 시약 (예를 들어, 무기 포스페이트, 카르보네이트 및/또는 수산화물, 예를 들어, 수산화나트륨) 및/또는 염기성 유기 시약 (예를 들어 유기 아민 및/또는 유기 암모늄 수산화물, 예를 들어 트리에틸아민)을 첨가함으로써 얻어질 수 있다. 하나의 실시양태에서, 수용액의 pH는 유기 아민 (예를 들어, 디에틸아민 또는 트리에틸아민)의 첨가에 의해 약 10 또는 11 이상의 pH로 상승 및/또는 유지된다.

하나의 실시양태에서, 임의의 잔류 염 (예를 들어, 나트륨 염)은 수용액을 이온 교환 수지 (예를 들어, 양이온 교환 수지)와 접촉시킴으로써 예를 들어, 양이온 교환 수지의 배치 (예를 들어, 순차적) 첨가에 의해, 또는 양이온 교환 수지 위로 수용액을 통과시킴으로써 약 10 또 11 이상의 pH를 가지는 수용액으로부터 제거된다. 별법으로, 임의의 잔류 염은 알칼리성 수용액을 이온 (예를 들어, 양이온) 교환 컬럼을 통하여 유동시킴으로써 이로부터 제거될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 수용액이 이온 (예를 들어, 양이온) 교환 수지 또는 컬럼과 접촉되는 동안, 수지 또는 컬럼의 잔류 염 (예를 들어, Na⁺) 흡수를 용이하게 하기 위해 필요한 경우 적합한 염기 (예를 들어, 유기 아민, 예를 들어 디에틸아민 또는 트리에틸아민)를 첨가함으로써 용액의 pH가 약 10 또는 11 이상의 pH로 유지된다.

이온 (예를 들어, 양이온) 교환 수지 또는 컬럼은 유기 아민 (예를 들어, 디에틸아민 또는 트리에틸아민)을 함유하는 수용액으로 세척하여, 수지 또는 컬럼상에 남아있는 임의의 사프로프테린을 회수할 수 있다. 이온 교환 수지 또는 컬럼을 탈이온수로 세척하는 대신에 물 및 유기 아민의 혼합물 (예를 들어, 약 3:1 내지 약 5:1 비율의 물 및 트리에틸아민이 그 예임)로 세척함에 대한 장점은 수지 또는 컬럼으로부터의 나트륨 추출의 방지이다. 사프로프테린-함유 수용액으로부터 임의의 잔류 염 제거 후, 생성된 여액을 산성화하여 사프로프테린의 산부가 (예를 들어, 히드로클로라이드) 염을 생성할 수 있다. 수용액의 알칼리성의 유지 및/또는 이온 교환 수지 또는 컬럼으로부터 임의의 나머지 BH4의 회수를 위해 트리에틸아민을 사용함에 대한 다른 장점은 BH4가 HCl로 산성화되고 BH4 디히드로클로라이드가 에탄올로부터 재결정화되면, 트리에틸아민 히드로클로라이드가 BH4 디히드로클로라이드보다 에탄올에서 훨씬 더 가용성이고, 따라서 여과에 의해 BH4 디히드로클로라이드로부터 용이하게 분리된다는 것이다.

또다른 실시양태에서, (6R)-BH4 또는 이들의 산부가염의 가수분해, 수소화, 및 정제의 최종 세 단계 중 임의의 단계에서 무기 염기가 사용되지 않는다. 가수분해 및/또는 수소화 반응에서 무기 염기 대신에 암모니아 또는 유기 염기 (예를 들어, 유기 아민)를 이용함으로써, 무기 염의 양이 최소화되거나, 또는 이들의 형성이 방지되어 바이오프테린- 또는 BH4-함유 수용액으로부터의 임의의 무기 염의 제거 (예를 들어, 수소화 후 수용액을 이온 교환 수지 또는 컬럼과 접촉시킴으로써)가 방지될 수 있다 (다음의 실시양태 세트에서 나타난 바와 같음).

(6R)-BH4-디히드로클로라이드의 제조 방법에 대한 하나의 실시양태 세트에서, 디아세틸바이오프테린 가수분해 반응은 물 및 수불혼화성 유기 용매 (예를 들어, n-부탄올)의 2상 혼합물 (여기서 수성상의 pH는 약 10 또는 11 이상)에서 유기 아민 (예를 들어, 디에틸아민)을 사용하여 수행된다. 혼합물은 가수분해 반응이 실질적으로 완료 (예를 들어, 디아세틸바이오프테린 및 모노아세틸바이오프테린의 양이 총 약 5 % 또는 10 % 이하)될 때까지 약 20 ℃ 내지 약 40 ℃ 범위의 온도에서 교반된다. 수성상 및 유기상은 분리되게 되고, 수성상은 수집되며, 유기상은 경우에 따라 추가 물과 혼합되어 유기상에 남아있는 임의의 바이오프테린 종을 수성상으로 전달한다. 수성상은 경우에 따라 예를 들어, 셀라이트 패드 또는 여과 보조제 (예를 들어 비타셀 FAC 200)를 통해 여과된다. 수용액내 바이오프테린의 농도는 필요한 경우 물을 첨가함으로써 약 15 % w/w 이하, 또는 약 10 % w/w 이하, 또는 약 5 % w/w 이하로 조정되고, 용액의 pH는 필요한 경우 유기 아민 (예를 들어, 트리에틸아민)을 첨가함으로써 약 10 또는 11 이상으로 상승된다. 혼합물은 약 20 ℃ 내지 약 40 ℃ 범위의 온도에서 및 약 20 바아 내지 약 50 바아 범위의 수소 압력하에서, 수소화 반응이 실질적으로 완료 (예를 들어 바이오프테린 및 7,8-디히드로바이오프테린의 양이 총 약 5 % 또는 10 % 이하)될 때까지 백금 촉매 (예를 들어, 백금흑 또는 백금 산화물)의 존재하에 교반된다. 혼합물은 적합한 매체 (예를 들어, 셀라이트)를 통해 여과되고, 백금 촉매는 경우에 따라 재활용을 위해 회수되며, 여액은 HCl를 첨가함으로써 약 4, 3, 2, 또는 1 이하의 pH로 산성화된다. 용액은 감압 (예를 들어, 약 200 내지 500 밀리바아 이하)하 및 약 40 ℃ 내지 약 70 ℃ 범위의 승온에서 농축된다. HCl이 경우에 따라 농축된 용액으로 첨가되고, (6R)-BH4-디히드로클로라이드의 결정핵이 경우에 따라 첨가되어 결정화를 유도한다. (6R)-BH4-디히드로클로라이드의 임의적 결정화 후, 혼합물은 경우에 따라 감압 (예를 들어, 약 200 내지 500 밀리바아 이하)하 및 약 40 ℃ 내지 약 70 ℃ 범위의 승온에서 농축된다. 농축된 혼합물로 경우에 따라 유기 용매 (예를 들어, 에탄올 또는 n-부탄올, 또는 이들의 조합물)가 첨가되고, 생성된 혼합물은 약 40 ℃ 내지 약 70 ℃ 범위의 승온에서 경우에 따라 교반되고, 그다음 약 0 ℃ 내지 약 40 ℃ 범위의 온도로 경우에 따라 냉각되어 결정화를 촉진하며, 생성된 고체는 경우에 따라 여과된다. 여과된 고체는 경우에 따라 물에서 용해되고, 생성된 혼합물은 약 20 ℃ 내지 약 40 ℃ 범위의 온도에서 경우에 따라 활성 목탄과 함께 교반되어 착색을 감소시킨다. 혼합물은 경우에 따라 여과되고, HCl이 경우에 따라 여액으로 첨가된다. (6R)-BH4-디히드로클로라이드의 최종 정제에 대해, HCl의 첨가로 산성화된 BH4-함유 용액이 감압 (예를 들어, 약 200 내지 500 밀리바아 이하)하 및 약 30 ℃ 내지 약 70 ℃ 범위의 승온에서 농축된다. 유기 용매 (예를 들어, n-부탄올)가 경우에 따라 농축된 용액으로 첨가되고, 생성된 혼합물이 감압 (예를 들어, 약 200 내지 500 밀리바아 이하)하 및 약 30 ℃ 내지 약 70 ℃ 범위의 승온에서 농축되어 혼합물로부터 잔류 물을 공비적으로 제거한다. (6R)-BH4-디히드로클로라이드의 결정화에 적합한 유기 용매 (예를 들어, 에탄올)가 농축된 혼합물로 첨가된다. 생성된 혼합물은 약 40 ℃ 내지 약 70 ℃ 범위의 승온에서 교반되고 그다음 경우에 따라 교반과 함께 약 0 ℃ 내지 약 40 ℃ 범위의 온도로 냉각되고, 경우에 따라 (6R)-BH4-디히드로클로라이드의 결정핵으로 접종되어 결정화를 용이하게 한다. 결정화된 생성물은 여과되고 경우에 따라 따뜻한 유기 용매 (예를 들어, 에탄올)로 경우에 따라 세척된다. 경우에 따라 감압 (예를 들어, 약 200 내지 500 밀리바아 이하)하 및 경우에 따라 승온 (예를 들어, 약 40 ℃ 내지 약 70 ℃)에서의 여과된 결정의 건조는 순수한 (6R)-BH4-디히드로클로라이드를 제공한다.

특정 실시양태에서, 약 10 이상의 pH를 가지는 수성상 및 수불혼화성 유기 용매를 함유하는 유기상을 포함하는 2상 혼합물에서 염기의 존재하에 디아세틸바이오프테린을 바이오프테린으로 가수분해하는 단계를 포함하는, 바이오프테린의 제조 방법이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 수성상은 약 11 이상의 pH를 가진다. 특정 실시양태에서, 염기는 아민이다. 특정 실시양태에서 염기는 디에틸아민이다. 특정 실시양태에서, 수불혼화성 유기 용매는 알콜이다. 특정 실시양태에서, 수불혼화성 유기 용매는 n-부탄올이다. 특정 실시양태에서, 가수분해는 약 20 ℃ 내지 약 50 ℃의 온도에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 가수분해 반응은 약 40 ℃에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 수성상의 디아세틸바이오프테린의 농도는 약 150 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다.

특정 실시양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 추가로 디아세틸바이오프테린의 가수분해가 실질적으로 완료된 후 수성상 및 유기상을 분리시키는 단계, 및 수성상을 수집하는 단계를 포함하는, 가수분해 반응 혼합물로부터 바이오프테린을 회수하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 경우에 따라 유기상을 소정의 부피의 물과 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계, 혼합물의 수성상 및 유기상을 분리시키는 단계, 및 수성상을 수집하는 단계를 포함하는, 물로 유기상을 1회 이상 추출하여 유기상에 남아있는 임의의 바이오프테린을 회수하는 단계를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 추가로 수집된 수성상에 염기를 첨가하여 생성된 수성 혼합물의 pH를 약 10 이상으로 상승시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 수성 혼합물의 pH는 약 11 이상으로 상승된다. 특정 실시양태에서, 수집된 수성상의 pH를 조정하기 위해 사용되는 염기는 아민이다. 특정 실시양태에서, 수집된 수성상의 pH를 조정하기 위해 사용되는 염기는 트리에틸아민이다.

특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 약 14 바아 내지 약 100 바아 범위의 수소 압력하에서, 금속 촉매의 존재하에 수성 혼합물의 바이오프테린을 테트라히드로바이오프테린으로 수소화하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 수소화 반응은 약 20 바아 내지 약 50 바아의 수소 압력에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 수소화 반응은 약 50 바아의 수소 압력에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 금속 촉매는 백금 촉매이다. 특정 실시양태에서, 금속 촉매는 백금흑이다. 특정 실시양태에서, 금속 촉매의 양은 디아세틸바이오프테린의 가수분해 전의 디아세틸바이오프테린의 양을 기준으로 또는 바이오프테린의 수소화 전의 바이오프테린의 양을 기준으로 약 2 몰% 내지 약 8 몰%의 범위에 있다. 특정 실시양태에서, 수소화는 약 0 ℃ 내지 약 40 ℃의 온도에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 수소화는 약 20 ℃ 내지 약 30 ℃의 온도에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 수소화 반응의 수성 혼합물내 바이오프테린의 농도는 약 2 % w/w 내지 약 8 % w/w이다. 특정 실시양태에서, 테트라히드로바이오프테린은 약 7:1 이상의 6R:6S 부분입체이성질체 비율로 형성된다. 특정 실시양태에서, 테트라히드로바이오프테린은 약 10:1 이상의 6R:6S 부분입체이성질체 비율로 형성된다.

특정 실시양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 추가로 바이오프테린의 수소화가 실질적으로 완료된 후 수성 혼합물을 여과하여 금속 촉매를 제거하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 추가로 여과된 수성 혼합물에 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 약 3 이하로 낮추는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 수성 혼합물의 pH는 약 1 이하로 낮춰진다.

특정 실시양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 추가로 감압하에서 수성 혼합물을 농축하여 물을 제거하고 첫번째 농축된 혼합물을 형성하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 수성 혼합물은 약 30 ℃ 내지 약 70 ℃의 온도에서 농축된다.

특정 실시양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 추가로 첫번째 농축된 혼합물에 유기 용매를 첨가하여 감압하에 생성된 혼합물을 농축하고 잔류 물을 제거하여 두번째 농축된 혼합물을 형성하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 유기 용매는 1-부탄올이다. 특정 실시양태에서, 혼합물은 약 30 ℃ 내지 약 70 ℃의 온도에서 농축된다.

특정 실시양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 추가로 첫번째 농축된 혼합물 또는 두번째 농축된 혼합물에 유기 용매를 첨가하고, 생성된 혼합물을 약 40 ℃ 내지 약 70 ℃의 온도로 가열하고, 혼합물을 약 0 ℃ 내지 약 40 ℃의 온도로 냉각하고, 경우에 따라 혼합물에 (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드의 결정핵을 첨가하여 결정화를 용이하게 하고, 혼합물을 여과하여 (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드를 단리하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 유기 용매는 에탄올이다. 특정 실시양태에서, 단리된 (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드는 다형체 B로 표시되는 결정질 형태이다.

특정 실시양태에서,

약 10 이상의 pH를 가지고 물을 함유하는 수성상 및 수불혼화성 유기 용매를 함유하는 유기상을 포함하는 2상 혼합물에서 염기의 존재하에 디아세틸바이오프테린을 바이오프테린으로 가수분해하는 단계;

경우에 따라 디아세틸바이오프테린의 가수분해가 실질적으로 완료된 후 수성상 및 유기상을 분리시키는 단계, 및 경우에 따라 수성 혼합물로서 수성상을 수집하는 단계; 및

약 10 이상의 pH를 가지는, 수성 혼합물 또는 2상 혼합물의 수성상내 바이오프테린을 약 14 바아 내지 약 100 바아의 수소 압력하에서 금속 촉매의 존재하에 테트라히드로바이오프테린으로 수소화하는 단계

를 포함하는, 테트라히드로바이오프테린의 제조 방법이 본 명세서에서 제공된다.

하나의 실시양태에서, 본 방법은 추가로 디아세틸바이오프테린의 가수분해가 실질적으로 완료된 후 반응 혼합물의 유기상 및 수성상을 분리시키는 단계, 및 수성상을 수집하는 단계를 포함하는, 가수분해 반응의 실질적인 완료 후 반응 혼합물로부터 바이오프테린을 회수하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 방법은 경우에 따라 유기상을 소정의 부피의 물과 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계, 혼합물의 수성상 및 유기상을 분리시키는 단계, 및 수성상을 수집하는 단계를 포함하는, 분리된 유기상을 물로 1회 이상 추출하여 유기상에 남아있는 임의의 바이오프테린을 회수하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 방법은 추가로 수소화에 앞서 수집된 수성상에 염기를 첨가하여 수성 혼합물의 pH를 약 10 이상으로 상승시키는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 방법은 추가로 바이오프테린의 수소화가 실질적으로 완료된 후 반응 혼합물을 여과하여 금속 촉매를 제거하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 방법은 추가로 여과된 수성 혼합물에 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 약 3 이하로 낮추는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 방법은 추가로 감압하에서 수성 혼합물을 농축하여 물을 제거하고 첫번째 농축된 혼합물을 형성하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 방법은 추가로 첫번째 농축된 혼합물에 유기 용매를 첨가하여 감압하에 생성된 혼합물을 농축하고 잔류 물을 제거하여 두번째 농축된 혼합물을 형성하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 방법은 추가로 첫번째 농축된 혼합물 또는 두번째 농축된 혼합물에 유기 용매를 첨가하고, 생성된 혼합물을 약 40 ℃ 내지 약 70 ℃의 온도로 가열하고, 혼합물을 약 0 ℃ 내지 약 40 ℃의 온도로 냉각하고, 경우에 따라 혼합물에 (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드의 결정핵을 첨가하여 결정화를 용이하게 하고, 혼합물을 여과하여 (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드를 단리하는 단계를 포함한다.

테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드의 결정화에 사용되는 조건에 따라, 당업계에 공지된 테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드의 임의의 각종 다형체 형태를 제조하기 위해 본 개시의 방법이 사용될 수 있고 변형될 수 있다. 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 도입된, 미국 출원 공개 제2006/0035900호는 테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드의 각종 다형체 형태 및 이러한 다형체 형태의 제조 절차를 기술한다. 하나의 실시양태에서, 본 방법은 (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드의 다형체 B를 생성한다. (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드의 다형체 B는 d-값 (Å)으로 표시된, 8.7 (vs), 6.9 (w), 5.90 (vw), 5.63 (m), 5.07 (m), 4.76 (m), 4.40 (m), 4.15 (w), 4.00 (s), 3.95 (m), 3.52 (m), 3.44 (w), 3.32 (m), 3.23 (s), 3.17 (w), 3.11 (vs), 3.06 (w), 2.99 (w), 2.96 (w), 2.94 (m), 2.87 (w), 2.84 (s), 2.82 (m), 2.69 (w), 2.59 (w), 및 2.44 (w)에서 피크를 가지는 X선 분말 회절 (XRPD) 패턴을 보인다. XRPD 피크에 부속하는 괄호내의 약어는 다음의 의미를 가진다: (vs) = 매우 강한 강도, (s) = 강한 강도, (m) = 중간 강도, (w) = 약한 강도, 및 (vw) = 매우 약한 강도.

< 실시예 >

다음의 실시예들은 단지 예시를 위해 제공되고 본 개시의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.

< 실시예 1>

포스페이트 완충제를 사용한 디아세틸바이오프테린의 가수분해

디아세틸바이오프테린 (화합물 9)의 두 아세테이트 에스테르의 가수분해를 8회의 별도의 운행에서 완충된 물 (pH 약 11.8) 및 n-BuOH의 2상 혼합물에서 수행하였다. 8회 실험 모두에서 동일한 상대적 양의 디아세틸바이오프테린, Na₂HPO₄, 물, 및 n-BuOH를 사용하였다. 수성상의 pH를 약 11.8로 유지하기 위해 염기 (수성 NaOH 용액)를 첨가하였다. 가수분해 반응의 진행을 당업계에 공지된 임의의 각종 분석 기술 (예를 들어, TLC, LC-MS, 또는 HPLC)에 의해 모니터링하였다. 계속되는 모니터링 및 염기의 첨가로 반응 혼합물이 약 35 ℃로 가온되고 수성상의 pH가 약 11.8로 유지된 경우, 가수분해 반응은 약 6시간 이하로 완료될 수 있었다. 디아세틸바이오프테린의 실질적으로 완료된 가수분해는 또한 약 2시간 동안 약 매 30분 수성상의 pH를 조정하고, 그다음 반응 혼합물을 상온 (약 25 ℃)에서 밤새 교반함으로써 달성되었다. 요망되는 생성물, 바이오프테린이 수성상에 용해되었고, 50 g의 디아세틸바이오프테린으로 시작했을 때 전형적으로 0.5 g 미만의 바이오프테린이 유기상으로 손실되었다.

디아세틸바이오프테린의 실질적으로 완료된 가수분해 후, 반응 혼합물을 셀라이트 플러그를 통해 여과하였고 물 및 n-BuOH 층을 침강시키고 분리하였다. 수성층은 투명한 적갈색이었는 반면, 유기층은 그안에 용해된 어두운 색의 유기 불순물로 인하여 흑색이었다. 수성층 및 폐기된 유기층내 바이오프테린의 양을 HPLC로 측정하였고, 이는 표 1에서 제공된다.

각각의 8회 가수분해 실험에서의 총 바이오프테린 수득률은 높았고 (86 % 이상), 매우 소량의 바이오프테린이 폐기된 유기층으로 손실되었으며 (약 1.3 % 미만), 이는 가수분해 반응에 대한 절차의 재현성을 증명한다. 바이오프테린을 함유하는 수성층을 희석시켜 적절 농도의 바이오프테린을 제공하였으며, 바이오프테린의 수소화에서 직접 사용하였다.

< 실시예 2>

무기 염기 및 완충제를 사용한 사프로프테린의 실험실규모 합성

완충된 수성상에서의 디아세틸바이오프테린 가수분해 및 그에 뒤따른 상 분리

다음의 가수분해는 표 1내 3번 실험에 상응한다. 디아세틸바이오프테린 (디아세틸바이오프테린 동등물 약 50 g, 155 mmol (순도를 위해 수정된 149 mmol)) 및 디나트륨 수소 포스페이트 (11.0 g, 77.5 mmol)를 1-부탄올 (125 mL) 및 물 (200 mL)의 혼합물에서 슬러리화하였다. 혼합물을 40 ℃로 가온하였고, 수성상의 pH가 약 11.8일 때까지 수산화나트륨 수용액 (50 중량%)을 첨가하였다. 수성상의 pH를 약 2시간 동안 약 매 30분 검사하였고 약 11.8의 pH로 조정하였고, 그다음 반응 혼합물을 상온 (약 25 ℃)에서 밤새 교반하였다. 그다음 반응 혼합물을 다시 40 ℃로 가온하고 수성상의 pH를 약 1시간 동안 약 매 30분 약 11.8로 조정하였다. 혼합물을 소결-유리 깔때기에서 짧은 셀라이트 패드 (0.5 cm)를 통해 여과하였다. 셀라이트 패드를 물 (2 x 5 mL)로 세척하였고, 여액을 분별 깔때기내로 부었다. 약 15분의 기간에 걸쳐 수성층 및 유기층을 침강 및 분리한 후, 바이오프테린을 함유하는 수성층을 수집하였다.

수성층 및 유기층내 바이오프테린의 농도를 HPLC로 측정하였다. 수성층은 109.7 mg/mL의 바이오프테린 농도 (30.7 g 바이오프테린, 87 % 수득률)를 가지는 것으로 밝혀진 반면, 유기층은 3.7 mg/mL의 바이오프테린 (0.46 g, 1.3 %)을 함유하였다.

(6 R )- BH4 디히드로클로라이드를 형성하기 위한 완충된 용액내 바이오프테린의 수소화

PtO₂ (0.76 g, 3.3 mmol)를 50 mL 뷔히(Buechi) 수소화 용기내로 칭량하고, 물 (25 mL)을 첨가하였다. 용기를 밀봉하고 질소로 4회 퍼징하였다 (0.5 바아). 용기를 수소로 가압하여 (3.5 바아) 촉매를 예비수소화하였다. 압력을 2분 후에 해제하였고 수소로 용기를 3.5 바아로 재가압하였다. 수소 압력을 3.5 바아로 유지하면서, 슬러리를 5시간 동안 상온에서 자석 교반기로 교반하였다. 압력을 해제하였고 용기를 질소로 4회 퍼징하였다 (0.5 바아).

활성 백금 촉매를 1 L 파르(Parr) 용기내로 슬러리화하였고, 수소화 용기내 슬러리를 추가 물 (20 mL)과 함께 파르 용기내로 헹구었다. 상기 가수분해 반응의 조 바이오프테린 수용액 (283 mL 물 내에서 30.7 g, 130 mmol)을 파르 용기로 첨가하였고 물을 첨가함으로써 반응 체적을 450 mL로 증가시켰다. 혼합물의 pH를 NaOH 수용액 (50 중량%) 또는 인산 수용액 (10 %)을 첨가함으로써 11.9로 조정하였다. 용액을 밀봉하고 질소로 퍼징하였고 (6 x 7 바아), 혼합물을 400 rpm에서 기계적으로 교반 (프로펠러 샤프트)하였다. 반응 혼합물의 온도를 내부 가열 코일 및 물 가열기/순환기를 사용하여 30 ℃에서 안정화시켰다. 최종 질소 퍼지가 배기된 후, 용기를 수소로 2회 퍼징하였고 (7 바아로), 그다음 600 rpm에서의 교반과 함께 21 바아 수소로 가압하였다. 5분 후, 교반을 정지시켰고, 추가 수소를 첨가하여 압력을 21 바아로 복귀시켰으며, 교반을 다시 시작하였다. 이 과정을 2시간 후, 반응 압력이 수소의 첨가 없이 유지되는 시점까지 수소 흡수가 느려질 때까지 매 15분 반복하였다. 혼합물을 10시간 동안 30 ℃에서 교반하였다. 압력을 해제하였고 용기를 즉시 질소로 6회 퍼징하였다 (7 바아). 최종 퍼징 후, 용기를 배기시켰고, 혼합물을 용기 밖으로 전달하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하여 백금 촉매를 제거하였고 이를 회수하고, 셀라이트 패드를 물로 세척하였다. 합쳐진 여액을 농축 염산으로 산성화시켜 조 사프로프테린 디히드로클로라이드 (HPLC에 의할 때 약 80 % 수득률, 약 7.6 내지 8.1의 6R:6S 비율)를 제공하였다.

도 5는 수소화 반응의 조 생성물의 크로마토그램이고, 크로마토그램내 피크는 표 2에서 제공된다. 도 5 및 표 2는 요망되는 생성물, 6R-BH4 (5번 피크)가 높은 수득률 (약 80 %)로 얻어진 주요 생성물이었고, 이의 부분입체이성질체, 6S-BH4 (6번 피크)가 유일한 의미있는 불순물이었음을 보여준다.

< 실시예 3>

유기 아민을 사용한 사프로프테린의 실험실규모 합성

A. 디아세틸바이오프테린의 가수분해

상온 (20 내지 25 ℃)에서의 1-부탄올 (128 mL)내 디아세틸바이오프테린 (디아세틸바이오프테린 동등물 약 50 g, 155 mmol)의 혼합물로 증류수 (200 mL) 및 디에틸아민 (26 g, 355 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 40 ℃에서 교반하였고, 이 때 혼합물이 HPLC에 의할때 5 % 이하의 디아세틸바이오프테린 a/a (크로마토그램 곡선하 면적)를 함유하였다. 수성상 및 유기상을 교반 없이 침강 및 분리시켰고, 유기층을 수집하였다. 유기층을 1시간 동안 60 ℃에서 증류수 (160 mL)와 혼합하였고, 이 두 상을 분리시키고, 수성층을 수집하였다. 합쳐진 수성층을 비타셀 (2 g)을 통해 여과하였고, 필터 케이크를 증류수 (2 x 36 mL)로 세척하였다.

B. 바이오프테린의 수소화

상기의 바이오프테린을 함유하는 합쳐진 수용액을 25 ℃에서 트리에틸아민 (136 mL)으로 처리하여 이의 pH를 11.2로 조정하였다. 혼합물을 가압증기멸균기(autoclave)로 전달하였고, 여기서 증류수 (20 mL)내 백금흑 (1.2 g, 6 mmol)의 슬러리를 혼합물로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 질소 및 수소로 퍼징한 후 (3 x 2 바아 질소, 3 x 35 바아 수소), 23시간 동안 35 바아 수소하 25 ℃에서 1,000 rpm으로 혼합물을 교반하였고, 이 때 혼합물이 HPLC에 의할때 1 % 이하의 바이오프테린 a/a 및 8 % 이하의 7,8-디히드로바이오프테린 a/a를 함유하였다. 혼합물을 질소로 퍼징하였고 그다음 여과하여 백금 촉매를 제거하였다. 용액내 테트라히드로바이오프테린의 안정성을 증가시키기 위해, 25 ℃에서 33 % HCl (120 g, 약 100 mL)을 천천히 첨가함으로써 여액 용액의 pH를 1.0 미만의 pH로 낮췄다.

C. "조" (6 R )- 사프로프테린 디히드로클로라이드의 단리

조 (6R)-사프로프테린 디히드로클로라이드를 함유하는 상기 산성화된 수용액을 감압 (50 내지 200 밀리바아)하 및 40 내지 60 ℃에서 증류를 통해 농축하여 물 약 375 g (375 mL)을 제거하였다 (물의 증류가 디아세틸바이오프테린의 가수분해 및 뒤이은 산성화로부터 생산된 아세트산을 공비(azeotrope away)시켰음). 에탄올 (58 mL)을 농축된 혼합물로 첨가하였고, 혼합물의 물 함량은 칼-피셔(Karl-Fischer)법에 의해 23 % w/w 이하인 것으로 측정되었다. 60 ℃에서 혼합물로 추가 에탄올 (200 mL)을 첨가하였고 뒤이어 1-부탄올 (58 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 60 ℃에서 교반하고, 35 ℃로 냉각시키고, 6시간 동안 35 ℃에서 교반하여 "조" (6R)-사프로프테린 디히드로클로라이드의 결정화를 촉진시켰다. 결정화된 생성물을 여과하고 에탄올 (2 x 25 mL)로 세척하였다.

< 실시예 4>

유기 아민을 사용한 사프로프테린의 공업적 규모 합성

A. 디아세틸바이오프테린의 가수분해

디아세틸바이오프테린 (화합물 9) (디아세틸바이오프테린 동등물 약 300 kg, 930 mol)을 물 (1320 kg, 1320 L) 및 1-부탄올 (624 kg, 770 L)에 현탁하였다. 디에틸아민 (156 kg, 2133 mol)을 첨가하여 11.5 이상의 pH를 가지는 혼합물을 생성하고, 바이오프테린 (화합물 10)으로의 전환이 95 % 이상 (즉, 모노아세틸바이오프테린 및 디아세틸바이오프테린의 양이 총 5 % 이하)일 때까지 반응 혼합물을 40 ℃에서 (약 16시간 동안) 교반하였다. 물 (240 kg, 240 L)을 그다음 첨가하였고, 30분 이상의 기간에 걸쳐 25 ℃에서 수성상 및 유기상을 분리시켰고, 두 상이 나누어졌다. 정제수 (480 kg, 480 L)를 1-부탄올층으로 첨가하였고, 혼합물을 잘 교반하였으며, 60분 이상의 기간에 걸쳐 25 ℃에서 수성상 및 유기상을 분리시켰고, 두 상이 나누어졌다.

합쳐진 수성층을 비타셀 FAC 200 (36 kg) (또는 유사한 여과 보조제)로 교반하였고, 혼합물을 여과하였고, 필터 케이크를 정제수 (120 kg, 120 L)로 세척하였다. 여액내 바이오프테린의 농도를 HPLC로 측정하였고, 정제수로 5.3 % w/w로 조정하였다. 백금흑 (7.2 kg, 37 mol)을 슬러리화하고 라인을 헹구는데 사용된 정제수의 잔류양을 트리에틸아민의 첨가 직전, 4.8 % w/w의 바이오프테린 농도를 내도록 계산하였다.

B. 바이오프테린의 수소화

트리에틸아민 (447 kg, 4417 mol)을 0 내지 5 ℃에서 바이오프테린 4.8 % w/w 및 백금흑 (7.2 kg, 37 mol)을 함유하는 상기 수용액으로 첨가하여, 11.5 이상의 pH를 초래하였다. 바이오프테린의 양이 1 % a/a (크로마토그램 곡선하 면적) 이하가 되고 7,8-디히드로바이오프테린의 양이 8 % a/a 이하일 때까지 혼합물을 50 바아 H₂ (g)하 25 ℃에서 교반하였다 (혼합물을 약 23시간 동안 교반하였으나, 수소 흡수의 분석은 수소화가 10시간이내 실질적으로 완료되었음을 나타냈다). 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하여 백금 촉매를 제거하였고, 필터 케이크를 정제수 (100 kg, 100 L)로 세척하였고, 백금 촉매를 재활용을 위해 회수하였다. 여액을 15 ℃ 이하로 냉각시켰고, 32 % 염산 (1646 kg, 약 1371 L)을 첨가하여 테트라히드로바이오프테린을 저 pH 용액에서 이의 보다 안정한 디히드로클로라이드 염으로 전환하였다. 수용액의 pH를 검사하여 2.5 ℃ ± 2.5에서 1 미만의 pH 값을 확인하였다.

조 (6R)-사프로프테린 디히드로클로라이드를 함유하는 상기 수용액을 칼-피셔법에 의한 혼합물의 물 함량이 30 % 내지 36 % w/w일 때까지 감압 (200 밀리바아 이하)하 및 60 ℃ 이하의 T₁ (용액의 내부 온도)에서 증류를 통해 농축하였다 (물의 증류가 디아세틸바이오프테린의 가수분해 및 뒤이은 산성화로부터 생산된 아세트산을 공비시켰음). 염산 (32 %, 약 160 kg, 약 133 L)을 첨가하였고, 용액을 55 ℃로 가열하고, 그다음 35 ℃로 냉각시켰고, 1시간 동안 35 ℃에서 교반하였다. BH4 디히드로클로라이드는 약 45 ℃에서 결정화되기 시작하였으나, 용액에 (6R)-BH4 디히드로클로라이드의 결정핵을 접종하여 결정화를 유도할 수 있다. 생성된 혼합물을 칼-피셔법에 의한 이의 물 함량이 22 % 내지 28 % w/w일 때까지 감압 (200 밀리바아 이하)하 및 60 ℃ 이하의 T₁에서 증류하였다. 에탄올 (750 kg, 949 L) 및 1-부탄올 (165 kg, 204 L)을 첨가하였고, 혼합물을 1시간 동안 55 ℃에서 교반하였다. 혼합물을 35 ℃로 냉각시켜 결정화를 용이하게 하였고, 생성된 결정화된 생성물을 여과하였고, 필터 케이크를 에탄올 (72 kg 이상, 91 L)로 세척하였다.

D. 순수한 (6 R )- 사프로프테린 디히드로클로라이드의 단리

상기의 비교적 "조" (6R)-사프로프테린 디히드로클로라이드 (습윤 생성물 약 320 kg, 건조 생성물 약 264 kg에 상응)를 물 (923 kg, 923 L)에 용해하였다. 물 (170 kg, 170 L)내 활성 목탄 L2S (17 kg)의 슬러리를 첨가하고 뒤이어 비타셀 FAC 200 (40 kg) (또는 유사한 여과 보조제)을 첨가하고, 혼합물을 15분 이상 동안 25 ℃ ± 5에서 교반하였고, 그다음 습윤된 비타셀 FAC 200 (40 kg)로 코팅된 넛치 (흡입 필터)를 통해 여과하였다. 필터 케이크를 정제수 (264 kg, 264 L)로 세척하였다. 염산 (32%, 384 kg, 약 320 L)을 투명한 황색을 띈 여액으로 첨가하였고, 물의 처음 부분 (510 kg, 510 L)을 감압 (200 밀리바아 이하)하 30 내지 60 ℃에서 증류시켜 버렸다. 1-부탄올을 첨가하였고 (538 kg, 664 L), 혼합물을 추가의 양의 물이 딘-스타크(Dean-Stark) 트랩에 축적되지 않을 때까지 (약 838 kg, 838 L) 감압 (50 내지 200 밀리바아)하 30 내지 60 ℃에서 증류하여 물을 공비하였다. 혼합물의 물 함량을 칼-피셔법에 의해 측정하여 11 % w/w 이하의 값을 보장하였다.

(6R)-사프로프테린 디히드로클로라이드를 결정화하기 위해, 무수 에탄올 (1767 kg, 2237 L)을 상기 혼합물로 첨가하였고, 이를 그다음 55 ℃로 가열하였다. 현탁액을 1시간 이상의 기간에 걸쳐 35 ℃로 냉각시키고, 추가로 3시간 동안 35 ℃에서 교반하였다. 혼합물을 여과하였고, 필터 케이크를 따뜻한 에탄올 (35 ℃, 총 340 kg (430 L))로 2회 세척하였다. 여과된 고체를 건조시 손실이 0.1 % w/w 이하일 때까지 3 내지 48시간 동안 60 ℃ 이하에서 건조하여, 순도 99.8 %의 (6R)-L-에리트로-사프로프테린 디히드로클로라이드 (약 232 kg)를 제공하였다.

본 명세서에 기술된 본 개시의 모든 실시양태 또는 양상이 본 명세서에 기술된 임의의 하나 이상의 다른 실시양태 또는 양상과 경우에 따라 병용될 수 있다는 것이 이해된다.

본 개시의 앞선 설명은 단지 이의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이 범위내의 본 개시에 대한 변형이 당업자에게 명백할 것이다.

본 명세서에 개시된 방법 및 이들의 개개의 단계의 실시는 수동으로 및/또는 전자 장비의 도움으로 수행될 수 있다. 본 방법이 특정 실시양태와 관련하여 기술되었으나, 당업자는 본 방법과 관련된 행위 및 단계의 다른 수행 방법이 사용될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 달리 기술되지 않는 한, 각종 단계의 순서는 본 방법의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 바뀔 수 있다. 추가로, 일부 개개의 단계가 병용되거나, 생략되거나, 또는 추가의 단계로 더욱 세분화될 수 있다.

본 명세서에서 인용된 모든 특허, 공보 및 참조 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 도입된다. 본 개시와 도입된 특허, 공보, 및 참조 문헌 간에 모순되는 경우, 본 개시가 우선되어야 한다.

Claims

약 10의 pH를 가지고 물을 함유하는 수성상 및 수불혼화성 유기 용매를 함유하는 유기상을 포함하는 2상 혼합물에서 염기의 존재하에 디아세틸바이오프테린을 바이오프테린으로 가수분해하는 단계를 포함하는, 바이오프테린의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 수성상이 약 11 이상의 pH를 가지는 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 염기가 아민인 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기가 디에틸아민인 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수불혼화성 유기 용매가 알콜인 제조 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수불혼화성 유기 용매가 1-부탄올인 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가수분해 반응이 약 20 ℃ 내지 약 50 ℃의 온도에서 수행되는 제조 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가수분해 반응이 약 40 ℃에서 수행되는 제조 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수성상내 디아세틸바이오프테린의 농도가 약 150 mg/mL 내지 약 300 mg/mL인 제조 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 디아세틸바이오프테린의 가수분해가 실질적으로 완료된 후 반응 혼합물의 수성상 및 유기상을 분리시키는 단계, 및 수성상을 수집하는 단계를 포함하는, 반응 혼합물로부터 바이오프테린을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제10항에 있어서, 유기상을 소정의 부피의 물과 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계, 혼합물의 수성상 및 유기상을 분리시키는 단계, 및 수성상을 수집하는 단계를 포함하는, 분리된 유기상을 물로 1회 이상 추출하여 유기상에 남아있는 임의의 바이오프테린을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 수집된 수성상에 염기를 첨가하여 생성된 수성 혼합물의 pH를 약 10 이상으로 상승시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제12항에 있어서, 상기 수성 혼합물의 pH를 약 11 이상으로 상승시키는 제조 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 염기가 아민인 제조 방법.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기가 트리에틸아민인 제조 방법.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 약 14 바아 내지 약 100 바아의 수소 압력하에서, 금속 촉매의 존재하에 수성 혼합물의 바이오프테린을 테트라히드로바이오프테린으로 수소화하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제16항에 있어서, 상기 수소 압력이 약 20 바아 내지 약 50 바아인 제조 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 수소 압력이 약 50 바아인 제조 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 촉매가 백금 촉매인 제조 방법.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 촉매가 백금흑인 제조 방법.
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 촉매의 양이 디아세틸바이오프테린의 가수분해 전의 디아세틸바이오프테린의 양을 기준으로 또는 바이오프테린의 수소화 전의 바이오프테린의 양을 기준으로 약 2 몰% 내지 약 8 몰%인 제조 방법.
제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수소화가 약 0 ℃ 내지 약 40 ℃의 온도에서 수행되는 제조 방법.
제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수소화가 약 20 ℃ 내지 약 30 ℃의 온도에서 수행되는 제조 방법.
제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 혼합물내 바이오프테린의 농도가 약 2 % w/w 내지 약 8 % w/w인 제조 방법.
제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 테트라히드로바이오프테린이 약 7:1 이상의 6R:6S 부분입체이성질체 비율로 형성되는 제조 방법.
제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 테트라히드로바이오프테린이 약 10:1 이상의 6R:6S 부분입체이성질체 비율로 형성되는 제조 방법.
제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오프테린의 수소화가 실질적으로 완료된 후, 수성 혼합물을 여과하여 금속 촉매를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제27항에 있어서, 여과된 수성 혼합물에 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 약 3 이하로 낮추는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제28항에 있어서, 상기 수성 혼합물의 pH를 약 1 이하로 낮추는 제조 방법.
제28항 또는 제29항에 있어서, 감압하에서 수성 혼합물을 농축하여 물을 제거하고 첫번째 농축된 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제30항에 있어서, 상기 수성 혼합물을 약 30 ℃ 내지 약 70 ℃의 온도에서 농축하는 제조 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 첫번째 농축된 혼합물에 유기 용매를 첨가하는 단계 및 감압하에 생성된 혼합물을 농축하고 잔류 물을 제거하여 두번째 농축된 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제32항에 있어서, 상기 유기 용매가 1-부탄올인 제조 방법.
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
첫번째 농축된 혼합물 또는 두번째 농축된 혼합물에 유기 용매를 첨가하는 단계,
생성된 혼합물을 약 40 ℃ 내지 약 70 ℃의 온도로 가열하는 단계,
혼합물을 약 0 ℃ 내지 약 40 ℃의 온도로 냉각하는 단계,
경우에 따라 혼합물에 (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드의 결정핵을 첨가하여 결정화를 용이하게 하는 단계, 및
혼합물을 여과하여 (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드를 단리하는 단계
를 추가로 포함하는 제조 방법.
제34항에 이어서, 상기 유기 용매가 에탄올인 제조 방법.
제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 단리된 (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드가 다형체 B로 표시되는 결정질 형태인 제조 방법.
약 10의 pH를 가지고 물을 함유하는 수성상 및 수불혼화성 유기 용매를 함유하는 유기상을 포함하는 2상 혼합물에서 염기의 존재하에 디아세틸바이오프테린을 바이오프테린으로 가수분해하는 단계;
경우에 따라, 디아세틸바이오프테린의 가수분해가 실질적으로 완료된 후 수성상 및 유기상을 분리시키는 단계, 및 경우에 따라, 수성 혼합물로서 수성상을 수집하는 단계; 및
약 10 이상의 pH를 가지는, 수성 혼합물 또는 2상 혼합물의 수성상내 바이오프테린을 약 14 바아 내지 약 100 바아의 수소 압력하에서 금속 촉매의 존재하에 테트라히드로바이오프테린으로 수소화하는 단계
를 포함하는 테트라히드로바이오프테린의 제조 방법.
제37항에 있어서, 디아세틸바이오프테린의 가수분해가 실질적으로 완료된 후 반응 혼합물의 수성상 및 유기상을 분리시키는 단계, 및 수성상을 수집하는 단계를 포함하는, 가수분해 반응이 실질적으로 완료된 후 반응 혼합물로부터 바이오프테린을 회수하는 단계를 포함하는 제조 방법.
제38항에 있어서, 유기상을 소정의 부피의 물과 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계, 혼합물의 수성상 및 유기상을 분리시키는 단계, 및 수성상을 수집하는 단계를 포함하는, 분리된 유기상을 물로 1회 이상 추출하여 유기상에 남아있는 임의의 바이오프테린을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제38항 또는 제39항에서, 수소화에 앞서 수집된 수성상에 염기를 첨가하여 생성된 수성 혼합물의 pH를 약 10 이상으로 상승시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오프테린의 수소화가 실질적으로 완료된 후,
수성 혼합물 또는 2상 혼합물을 여과하여 금속 촉매를 제거하는 단계, 및
2상 혼합물인 경우, 수성상 및 유기상을 분리시키고 수성 혼합물로서 수성상을 수집하는 단계
를 추가로 포함하는 제조 방법.
제41항에 있어서, 수성 혼합물에 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 약 3 이하로 낮추는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제42항에 있어서, 감압하에서 수성 혼합물을 농축하여 물을 제거하고 첫번째 농축된 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제43항에 있어서, 첫번째 농축된 혼합물에 유기 용매를 첨가하는 단계 및 감압하에 생성된 혼합물을 농축하고 잔류 물을 제거하여 두번째 농축된 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제43항 또는 제44항에 있어서,
첫번째 농축된 혼합물 또는 두번째 농축된 혼합물에 유기 용매를 첨가하는 단계,
생성된 혼합물을 약 40 ℃ 내지 약 70 ℃의 온도로 가열하는 단계,
혼합물을 약 0 ℃ 내지 약 40 ℃의 온도로 냉각하는 단계,
경우에 따라 혼합물에 (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드의 결정핵을 첨가하여 결정화를 용이하게 하는 단계, 및
혼합물을 여과하여 (6R)-L-에리트로-테트라히드로바이오프테린 디히드로클로라이드를 단리하는 단계
를 추가로 포함하는 제조 방법.