KR20080064909A

KR20080064909A - ４―옥소퀴놀린 화합물의 안정한 결정체

Info

Publication number: KR20080064909A
Application number: KR1020087014768A
Authority: KR
Inventors: 모토히데 사토; 다카히사 모토무라; 다카시 마츠다; 겐타로 곤도; 고지 안도; 고지 마츠다; 슈지 미야케; 히데토 우에하라
Original assignee: 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤
Priority date: 2004-05-20
Filing date: 2005-05-19
Publication date: 2008-07-09
Also published as: CN1956961A; US20150361044A1; CN1956961B; US20100204271A1; US8981103B2; CA2566922C; HRP20120681T1; AR049280A1; JP3754064B2; TW200600097A; US20220235009A1; AU2005245296A1; EP3281939B1; HRP20231588T3; FI3281939T3; NO20190051A1; ES2960824T3; RS64845B1; ES2388441T3; BRPI0510114B1

Abstract

본 발명은, 분말 X-선 회절분석법에 의해 측정했을 때 회절각 2θ(°)에서 특징적인 회절 피크의 특정 분말 X-선 회절 패턴을 나타내는 6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-1-[(S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필]-7-메톡시-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산의 결정체를 제공한다. 본 발명의 결정체는 물리적 및 화학적 안정성에서 월등하다.

6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-1-[(S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필]-7-메톡시-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산의 결정체

Description

４―옥소퀴놀린 화합물의 안정한 결정체 {STABLE CRYSTAL OF 4-OXOQUINOLINE COMPOUND}

본 발명은 6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-1-[(S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필]-7-메톡시-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 (이하, 화합물 A라고도 함)의 안정한 결정체:

및 그의 혼합 결정체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 결정체 또는 혼합 결정체를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.

본 출원인은, 동일 출원인이 출원한 WO2004/046115(PCT/JP2003/014773) 에서, 상술한 화합물 A가, AIDS (후천성 면역결핍 증후군)의 원인이 되는 바이러스인 HIV (인간 면역결핍 바이러스)의 증식에 필수적인 효소인 인테그라아제에 대해 저 해 작용이 있으며, 항-HIV 효과를 나타냄을 개시하였다 (특히, 실시예 4-32 및 실험예).

일반적으로 화합물이 의약품으로서 사용될 때, 품질을 유지하고/하거나 보존을 용이하게 하기 위해 그 화합물의 화학적 및 물리적 안정성이 필요하다. 최종 의약 조 성물에서뿐만 아니라 합성 출발 물질로서의 화합물도 같은 이유로 화학적 및 물리적으로 안정한 것이 바람직하다.

따라서 이와 같은 화합물은 결정체인 것이 바람직하고, 안정한 결정체인 것이 특히 바람직하다. 화합물이 결정 다형성(crystal polymorphism)인 경우, 일반적으로 가장 안정한 결정체가 선택된다.

상술한 특허출원이 화합물 A에 대해 기재하고 있는 반면, 화합물 A의 결정 형태에 관해서는 확실히 기재되어 있지 않다.

이에 따라, 본 발명자들은 화합물 A의 안정한 결정체를 찾으려는 시도 하에 화합물 A의 다양한 결정 형태를 연구하였다. 그 결과, 화합물 A가 결정 다형성이며, 특정 결정 형태를 갖는 화합물 A의 결정체가 안정한 결정체로서 유용하다는 것을 발견하고, 이러한 발견을 근거로 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 하기를 제공한다.

[1] X-선 분말 회절계로 측정했을 때 6.56, 13.20, 19.86, 20.84, 21.22, 25.22°의 회절각 2θ(°)에서 특징적인 회절 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는 6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-1-[(S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필]-7-메톡시-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산의 결정체 (결정 형태 II);

[2] X-선 분말 회절계로 측정했을 때 8.54, 14.02, 15.68, 17.06, 17.24, 24.16, 25.74°의 회절각 2θ(°)에서 특징적인 회절 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는 6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-1-[(S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필]-7-메톡시-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산의 결정체 (결정 형태 III);

[3] 외삽 개시 온도(extrapolated onset temperature)가 162.1±5.0℃인 6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-1-[(S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필]-7-메톡시-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산의 결정체 (결정 형태 III);

[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 한 항의 결정체로서, 결정체의 순도가 70% 이상인 결정체;

[5] 상기 [1]의 결정체 및 상기 [2] 또는 [3]의 결정체를 포함하는 혼합 결정체;

[6] 상기 [5]의 혼합 결정체로서 결정체의 순도가 70% 이상인 혼합 결정체;

[7] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 결정체 또는 상기 [5] 또는 [6]의 혼합 결정체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 의약 조성물;

[8] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 결정체 또는 상기 [5] 또는 [6]의 혼합 결정체를 활성 성분으로서 포함하는 인테그라아제 저해제;

[9] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 결정체 또는 상기 [5] 또는 [6]의 혼합 결정체를 활성 성분으로서 포함하는 항바이러스제;

[10] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 결정체 또는 상기 [5] 또는 [6]의 혼합 결정체를 활성 성분으로서 포함하는 항-HIV제;

[11] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 결정체 또는 상기 [5] 또는 [6]의 혼합 결정체, 및 한 종류 이상의 기타 항-HIV 활성 물질을 활성 성분으로서 포함하는 항-HIV 조성물; 및

[12] 다른 항-HIV제와 함께 다중약물요법을 위한 항-HIV제로서, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항의 결정체 또는 상기 [5] 또는 [6]의 혼합 결정체를 활성 성분으로서 포함하는 항-HIV제.

본 발명의 화합물 A의 결정체 또는 혼합 결정체는 상술한 특정 결정 형태를 가지며 물리적 및 화학적 안정성이 월등하여, 화합물 A의 품질의 장기간 유지가 가능해져서 보존을 용이하게 하는 장점이 있다. 또한, 다양한 의약 조성물 및 벌크의 제조 중에 취급이 용이하여, 생산비용이 감소된다.

본 발명을 하기에 상세히 설명한다.

본 발명에서 화합물 A의 "결정 형태 II"는, X-선 분말 회절계로 측정했을 때 6.56, 13.20, 19.86, 20.84, 21.22, 25.22°의 회절각 2θ(°)에서 특징적인 회절 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는, 화합물 A의 결정체를 의미한다.

본 발명에서 화합물 A의 "결정 형태 III"은, X-선 분말 회절계로 측정했을 때 8.54, 14.02, 15.68, 17.06, 17.24, 24.16, 25.74°의 회절각 2θ(°)에서 특징적인 회절 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는, 화합물 A의 결정체를 의미한다.

상술한 회절각 2θ(°)에서의 회절 피크 값은 측정기기 또는 측정 조건 등으로 인한 약간의 측정 오차를 나타낼 수도 있다. 구체적으로, 측정 오차는 ±0.2, 바람직하게는 ±0.1, 더욱 바람직하게는 ±0.06의 범위 내일 수 있다.

본 발명의 화합물 A의 결정체는 또한 열분석법에 의해서도 특성화된다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 A의 결정 형태 III을 시차주사열량분석법 (DSC)으로 처리하면, 흡열 피크의 엔탈피가 약 81 J/g이며, 외삽 개시 온도가 162.1±5.0℃, 바람직하게는 162.1±3.0℃, 더욱 바람직하게는 162.1±1.0℃인데, 여기서 "외삽 개시 온도(extrapolated onset temperature)"는 JIS K 7121 (플라스틱의 전이 온도 의 측정 방법)에 정의된 바에 의해, DSC 곡선에서 저온측에서 고온측을 향해 외삽된 기선과, 저온측의 용융 피크의 상승부(leading edge) 상에 가장 큰 기울기를 나타내는 점에 그려진 접선과의 교차점의 온도를 의미한다. 흡열 피크의 엔탈피와 외삽 개시 온도가 상술한 범위 내이면, 화합물 A의 결정체는 안정하다.

본 발명의 화합물 A의 결정체는 결정 형태 II 또는 결정 형태 III이거나, 결정 형태 II 및 결정 형태 III의 혼합 결정체일 수 있다. 화합물 A의 의약품 등에서의 사용에 있어서는, 결정 형태 II 또는 결정 형태 III이 바람직한데, 그 이유는 이들이 안정한 결정체이기 때문이며, 결정 형태 III은 가장 안정한 결정체이므로 더욱 바람직하다. 또한, 결정 형태 II는 의약 조성물로서 투여 시에 생물체에 의한 흡수성의 관점에서 바람직하다.

본 발명에서, "결정체의 순도"는 화합물 A의 결정 형태 II 또는 결정 형태 III의 순도를 의미한다. 결정 형태 II 및 결정 형태 III의 혼합 결정체의 경우에는, 결정 형태 II 및 결정 형태 III의 총 물질량에 대한 결정체의 비율을 의미한다. 본 발명의 결정체의 순도는, 예를 들면 X-선 분말 회절분석법, 열분석법 등과 같은 공지의 방법에 의해 구할 수 있다. 본 발명의 결정체 또는 혼합 결정체의 순도는 100%일 필요는 없고, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상이어도 된다. 이 범위 내의 순도가 품질 보장을 위해 바람직하다.

본 발명의 화합물 A의 결정체 또는 혼합 결정체는, 예를 들어 AIDS의 예방 및/또는 치료에 사용되는 항-HIV제, HIV 인테그라아제 저해제, 항바이러스제 등과 같은 각종 의약 조성물로서 포유류 (인간, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 소, 양, 원숭이 등) 등에 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물 A 의 결정체 또는 혼합 결정체를 의약 조성물로 사용하는 경우에는, 이를 자체로서 일반적으로 공지된 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제, 증량제, 붕괴제, 안정화제, 보존제, 완충제, 유화제, 풍미제, 착색제, 감미제, 증점제, 교정제(corrective), 용해 보조제, 및 기타 첨가제, 예컨대 물, 식물성 오일, 알코올 (예를 들면, 에탄올 또는 벤질 알코올 등), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 트리아세테이트, 젤라틴, 탄수화물 (예를 들면, 락토오스, 전분 등), 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 라놀린, 바셀린 등과 함께 혼합하여, 통상적인 방법에 의해 정제, 환제, 분말제, 과립제, 좌약, 주사제, 점안제, 액제, 캡슐, 트로키(troche), 에어로졸, 엘릭시르(elixir), 현탁액, 에멀젼, 시럽 등으로 형성하고, 전신적으로 또는 국소적으로, 및 경구 또는 비경구 투여한다.

투여량은 연령, 체중, 증상, 치료 효과, 투여 방법 등에 따라 달라지지만, 일반적으로 성인에 있어서는 1회 투여 당 0.01 mg 내지 1 g이며, 하루 한 번 내지 몇 번에 걸쳐 경구 투여 또는, 정맥내 주사 등과 같은 주사 투여형태로 투여한다.

항-HIV제는 일반적으로, 바이러스 증식의 일시적 억제뿐만 아니라 바이러스의 재증식 방지에 효과적일 수 있도록, 그 효과를 장기간 지속시켜야 할 필요가 있다. 이는, 장기 투여가 필요하며, 야간 등의 더 긴 시간 동안 효과를 지속시키기 위해 종종 단일 투여량을 높이는 것이 불가피함을 의미한다. 그러한 장기 및 고용량 투여는 부작용의 위험을 증가시킨다.

이러한 관점에서, 본 발명의 바람직한 측면 중 하나는 상기와 같은 화합물이 경구 투여에 의해 다량 흡수를 가능하게 하고, 상기와 같은 화합물이 연장된 시간 동안 투여된 화합물의 혈중 농도를 유지할 수 있다는 것이다.

"AIDS의 예방"의 의미는, 예를 들어 HIV 양성으로 판정되었으나 질환 상태로 발전하지는 않은 개인에게 의약제를 투여하는 것, 치료 후에 호전된 AIDS 질환 상태를 나타내나 여전히 박멸할 HIV를 보유하고 AIDS의 재발이 염려되는 개인에게 의약제를 투여하는 것, 및 감염 가능성에 대한 두려움으로 인해 의약제를 투여하는 것을 의미한다.

본 발명의 항-HIV 조성물은, 예를 들어 AIDS의 다중 약물 병용요법에 사용된다. 항-HIV 조성물에 사용될 "기타 항-HIV 활성 물질"의 예에는 항-HIV 항체, HIV 백신, 인터페론 등과 같은 면역증강제(immunostimulant), HIV 리보자임, HIV 안티센스 약물, HIV 역전사효소 저해제, HIV 단백질분해효소 저해제, 바이러스에 의해 인식되는 숙주 세포의 결합 수용체 (CD4, CXCR4, CCR5 등)와 바이러스 사이의 결합 저해제 등이 포함된다.

HIV 역전사효소 저해제의 구체적인 예에는 레트로비어(R) (지도부딘), 에피비어(R) (라미부딘), 제리트(R) (사닐부딘), 비덱스(R) (디다노신), 히비드(R) (잘시타빈), 지아겐(R) (아바카비어 설페이트), 비라뮨(R) (네비라핀), 스토크린(R) (에파비렌즈), 레스크립터(R) (델라비르딘 메실레이트), 콤비비어(R) (지도부딘+라미부딘), 트리지비어(R) (아바카비어 설페이트+라미부딘+지도부딘), 코액티논(R) (에미비린), 포스포노비어(R), 코비라실(R), 알로부딘 (3'-플루오로-3'-데옥시타이 미딘), 티오비어 (티오포스포노포름산), 카프라비린 (5-[(3,5-디클로로페닐)티오]-4-이소프로필-1-(4-피리딜메틸)이미다졸-2-메탄올 카밤산), 테노포비어 디소프록실 푸마레이트 ((R)-[[2-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-1-메틸에톡시]메틸]포스폰산 비스(이소프로폭시카보닐옥시메틸)에스테르 푸마레이트), DPC-083 ((4S)-6-클로로-4-[(1E)-시클로프로필에테닐]-3,4-디하이드로-4-트리플루오로메틸-2(1H)-퀴나졸리논), DPC-961 ((4S)-6-클로로-4-(시클로프로필에티닐)-3,4-디하이드로-4-(트리플루오로메틸)-2(1H)-퀴나졸리논), DAPD ((-)-β-D-2,6-디아미노퓨린 디옥솔란), 이뮤노칼, MSK-055, MSA-254, MSH-143, NV-01, TMC-120, DPC-817, GS-7340, TMC-125, SPD-754, D-A4FC, 카프라비린, UC-781, 엠트리시타빈, 알로부딘, 포스파지드, UC-781, BCH-10618, DPC-083, 에트라비린, BCH-13520, MIV-210, 아바카비어 설페이트/라미부딘, GS-7340, GW-5634, GW-695634 등이 포함되며, 여기서 (R)은 등록상표 (이하 동일)를 의미하고, 다른 의약제의 명칭은 일반명이다.

HIV 단백질분해효소 저해제의 구체적인 예에는 크릭시반(R) (인디나비어 설페이트 에탄올레이트), 사퀴나비어, 인비레이즈(R) (사퀴나비어 메실레이트), 노르비어(R) (리토나비어), 비라셉트(R) (넬피나비어 메실레이트), 로피나비어, 프로제이(R) (암프레나비어), 칼레트라(R) (리토나비어+로피나비어), 모제나비어 디메실레이트 ([4R-(4α,5α,6β)]-1,3-비스[(3-아미노페닐)메틸]헥사하이드로-5,6-디하이드록시-4,7-비스(페닐메틸)-2H-1,3-디아제핀-2-온 디메탄설포네이트), 티프라나비어 (3'-[(1R)-1-[(6R)-5,6-디하이드로-4-하이드록시-2-옥소-6-페닐에틸-6-프로필-2H-피란-3-일]프로필]-5-(트리플루오로메틸)-2-피리딘설폰아미드), 라시나비어 (N-[5(S)-(tert-부톡시카보닐아미노)-4(S)-하이드록시-6-페닐-2(R)-(2,3,4-트리메톡시벤질)헥사노일]-L-발린 2-메톡시에틸렌아미드), KNI-272 ((R)-N-tert-부틸-3-[(2S,3S)-2-하이드록시-3-N-[(R)-2-N-(이소퀴놀린-5-일옥시아세틸)아미노-3-메틸티오프로파노일]아미노-4-페닐부타노일]-5,5-디메틸-1,3-티아졸리딘-4-카복스아미드), GW-433908, TMC-126, DPC-681, 버크민스터풀러렌, MK-944A (MK944 (N-(2(R)-하이드록시-1(S)-인다닐)-2(R)-페닐메틸-4(S)-하이드록시-5-[4-(2-벤조[b]푸라닐메틸)-2(S)-(tert-부틸카바모일)피페라진-1-일]펜탄아미드)+인디나비어 설페이트), JE-2147 ([2(S)-옥소-4-페닐메틸-3(S)-[(2-메틸-3-옥시)페닐카보닐아미노]-1-옥사부틸]-4-[(2-메틸페닐)메틸아미노]카보닐-4(R)-5,5-디메틸-1,3-티아졸), BMS-232632 ((3S,8S,9S,12S)-3,12-비스(1,1-디메틸에틸)-8-하이드록시-4,11-디옥소-9-(페닐메틸)-6-[[4-(2-피리디닐)페닐]메틸]-2,5,6,10,13-펜타아자테트라데칸디카복실산 디메틸 에스테르), DMP-850 ((4R,5S,6S,7R)-1-(3-아미노-1H-인다졸-5-일메틸)-4,7-디벤질-3-부틸-5,6-디하이드록시퍼하이드로-1,3-디아제핀-2-온), DMP-851, RO-0334649, Nar-DG-35, R-944, VX-385, TMC-114, 티프라나비어, 포스암프레나비어 나트륨, 포스암프레나비어 칼슘, 다루나비어, GW-0385, R-944, RO-033-4649, AG-1859 등이 포함된다.

HIV 인테그라아제 저해제는 S-1360, L-870810 등으로 예시되며, DNA 폴리머라아제 저해제 또는 DNA 합성 저해제는 포스카비어(R), ACH-126443 (L-2',3'-디데하이드로-디데옥시-5-플루오로사이티딘), 엔테카비어 ((1S,3S,4S)-9-[4-하이드록시-3-(하이드록시메틸)-2-메틸렌시클로펜틸]구아니딘), 칼라놀라이드 A ([10R-(10 α,11β,12α)]-11,12-디하이드로-12-하이드록시-6,6,10,11-테트라메틸-4-프로필-2H,6H,10H-벤조[1,2-b: 3,4-b': 5,6-b"]트리피란-2-온), 칼라놀라이드 B, NSC-674447 (1,1'-아조비스포름아미드), 이스카도르 (비스쿰 알붐(viscum album) 추출물), 루비테칸 등으로 예시되고, HIV 안티센스 약물은 HGTV-43, GEM-92 등으로 예시되고, 항-HIV 항체 또는 기타 항체는 NM-01, PRO-367, KD-247, 사이톨린(R), TNX-355 (CD4 항체), AGT-1, PRO-140 (CCR5 항체), 항-CTLA-4MAb 등으로 예시되고, HIV 백신 또는 기타 백신은 ALVAC(R), AIDSVAX(R), 레뮨(R), HIVgp41 백신, HIVgp120 백신, HIVgp140 백신, HIVgp160 백신, HIVp17 백신, HIVp24 백신, HIVp55 백신, 알파백스 벡터 시스템, 카나리폭스 gp160 백신, 안티태트, MVA-F6 Nef 백신, HIVrev 백신, C4-V3 펩타이드, p2249f, VIR-201, HGP-30W, TBC-3B, PARTICLE-3B 등으로 예시되고, 안티페론 (인터페론-α 백신) 등, 인터페론 또는 인터페론 효능제는 수미페론(R), 멀티페론(R), 인터페론-τ, 레티큘로오스, 인간 류코사이트 인터페론 α 등으로 예시되고, CCR5 길항제는 SCH-351125 등으로 예시되고, HIV p24에 대해 작용하는 의약제는 GPG-NH2 (글리실-프롤릴-글리신아미드) 등으로 예시되며, HIV 융합 저해제는 FP-21399 (1,4-비스[3-[(2,4-디클로로페닐)카보닐아미노]-2-옥소-5,8-디나트륨 설포닐]나프틸-2,5-디메톡시페닐-1,4-디하이드라존), T-1249, 합성 고분자 구조물 No.3, 펜타퓨사이드, FP-21399, PRO-542, 엔푸비르타이드 등으로 예시되고, IL-2 효능제 또는 길항제는 인터류킨-2, 이뮤네이스(R), 프로류킨(R), 멀티카인(R), 온탁(R) 등으로 예시되며, TNF-α 길항제는 탈로미드(R) (탈리도미드), 레미케이드(R) (인플릭시마브), 커들란 설페이트로 예시되고, α-글루코시다 아제 저해제는 부카스트(R) 등으로 예시되며, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제 저해제는 펠데신 (2-아미노-4-옥소-3H,5H-7-[(3-피리딜)메틸]피롤로[3,2-d]피리미딘) 등으로 예시되고, 세포자연사(apoptosis) 효능제 또는 저해제는 아르킨 Z(R), 파나비어(R), 보조효소 Q10 (2-데카(3-메틸-2-부테닐렌)-5,6-디메톡시-3-메틸-p-벤조퀴논) 등으로 예시되며, 콜린에스터라아제 저해제는 코그넥스(R) 등으로 예시되고, 면역조절제는 이뮤녹스(R), 프로카인(R), Met-엔케팔린 (6-데-L-아르기닌-7-데-L-아르기닌-8-데-L-발린아미드-아드레노르핀), WF-10 (10-배 희석된 테트라클로로데카옥사이드 용액), 페르톤, PRO-542, SCH-D, UK-427857, AMD-070, AK-602 등으로 예시된다.

또한, 뉴로트로핀(R), 리다콜(R), 앤서 20(R), 앰플리겐(R), 앤티코트(R), 인액티빈(R) 등, PRO-2000, Rev M10 유전자, HIV 특이적 세포독성 T 세포 (CTL 면역요법, ACTG 프로토콜 080 요법, CD4-ζ 유전자 요법), SCA 결합 단백질, RBC-CD4 복합체, 모텍사핀 가돌리늄, GEM-92, CNI-1493, (±)-FTC, 어셔셀(Ushercell), D2S, 버퍼젤(R), 비바젤(R), 글리미녹스 질용 젤, 나트륨 라우릴 설페이트, 2F5, 2F5/2G12, VRX-496, Ad5gag2, BG-777, IGIV-C, BILR-255 등이 예시된다.

다중 약물 병용요법에서 본 발명의 항-HIV조성물에 사용될 "기타 항-HIV 활성 물질"로서는, HIV 역전사효소 저해제 및 HIV 단백질분해효소 저해제가 바람직하다. 둘 또는 세 가지, 또는 더 많은 수의 의약제가 병용될 수 있는데, 상이한 작용기전을 갖는 의약제의 조합이 바람직한 구현예의 하나이다. 또한, 부작용 중복이 없는 의약제의 선택이 바람직하다.

의약제 조합의 구체적 예에는 에파비렌즈, 테노포비어, 엠트리시타빈, 인디나비어, 넬피나비어, 아타자나비어, 리토나비어+인디나비어, 리토나비어+로피나비어 및 리토나비어+사퀴나비어, 디다노신+라미부딘, 지도부딘+디다노신, 스타부딘+디다노신, 지도부딘+라미부딘, 스타부딘+라미부딘 및 엠트리바, 및 본 발명의 결정체 또는 혼합 결정체로 이루어진 군의 조합이 포함된다 (HIV-감염된 성인 및 유소년에 대한 항-레트로바이러스제의 사용을 위한 지침서. 2001년 8월 13일). 특히 바람직한 것은 본 발명의 결정체 또는 혼합 결정체와 에파비렌즈, 인디나비어, 넬피나비어, 테노포비어, 엠트리시타빈, 지도부딘 또는 라미부딘의 두 가지 약제의 병용, 및 본 발명의 결정체 또는 혼합 결정체와 지도부딘+라미부딘, 테노포비어+라미부딘, 테노포비어+지도부딘, 테노포비어+에파비렌즈, 테노포비어+넬피나비어, 테노포비어+인디나비어, 테노포비어+엠트리시타빈, 엠트리시타빈+라미부딘, 엠트리시타빈+지도부딘, 엠트리시타빈+에파비렌즈, 엠트리시타빈+넬피나비어, 엠트리시타빈+인디나비어, 넬피나비어+라미부딘, 넬피나비어+지도부딘, 넬피나비어+에파비렌즈, 넬피나비어+인디나비어, 에파비렌즈+라미부딘, 에파비렌즈+지도부딘 또는 에파비렌즈+인디나비어의 세 가지 약제의 병용이 포함된다.

본 발명의 화합물 A의 결정체 또는 혼합 결정체의 제조 방법은 특별히 한정되지는 않으며, 결정체는 자체로 공지된 방법 또는 하기 실시예에 나타난 방법 등에 의해 제조될 수 있다.

실시예

본 발명의 화합물 A의 결정체의 제조 방법을 하기에서 실시예를 참조하여 설명하나, 실시예는 단지 예시적일 뿐이며 본 발명을 제한하려는 의도는 없다.

참조예 1: 화합물 A의 결정 형태 I의 제조

단계 1

2,4-디플루오로벤조산 (50 g, 316 mmol)을 진한 황산 (200 ml)에 용해시키고, N-요오도석신이미드 (68 g, 300 mmol)를 5℃ 이하에서 분할 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 혼합물을 동일 온도에서 4.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수 (약 600 ml)에 부은 후, 10% 아황산나트륨 수용액을 첨가하고, 혼합물을 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세정하고, 진공 건조하여 미정제 결정 (85 g)을 수득하였다. 동일한 방식으로 수득한 미정제 결정을 합하여 (총량 205 g), 50% 에탄올 수용액 (820 ml)으로부터 재결정화하여 2,4-디플루오로-5-요오도벤조산 (148 g, 수율 73%)을 백색 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃ 300 MHz) (σ) ppm: 6.94 (1H, dd, J=10.3, 10.3Hz), 8.46 (1H, d, J=7.5Hz)

단계 2

단계 1에서 수득한 화합물 (148 g, 521 mmol)을 톨루엔 (750 ml)에 용해시키고, 염화티오닐 (76 ml, 1.04 몰) 및 디메틸포름아미드 (촉매량)을 첨가하고, 혼합물을 2 시간 동안 가열 환류하였다. 불용성 물질을 60℃에서 여과제거하고, 여액을 감압 하에 농축하고, 톨루엔 (330 ml)과 공비하였다. 잔류물을 테트라하이드로푸란 (400 ml)에 용해시키고, 이 용액을 테트라하이드로푸란 (400 ml) 중 에틸 3,3-디메틸아미노아크릴레이트 (82 g, 573 mmol) 및 트리에틸아민 (87 ml, 625 mmol)의 용액에 적가하고, 그 혼합물을 7 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 감압 하에서 농축하였다. 물 (700 ml) 및 에틸 아세테이트 (800 ml)을 첨가하고 분배하였다. 유기층을 포화 수성 탄산수소나트륨 (250 ml, X2), 물 (300 ml) 및 포화 염수 (300 ml)로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 불용성 물질을 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하여, 2-(2,4-디플루오로-5-요오도벤조일)-3-디메틸아미노아크릴산 에틸 에스테르의 조 생성물 (210 g)을 갈색 고체로서 수득하였다.

단계 3

단계 2에서 수득한 조 생성물 (210 g)을 테트라하이드로푸란 (500 ml)에 용해시키고, (S)-(+)-발리놀 (54 g, 521 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 30 분간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하고, 잔류물을 디메틸포름아미드 (600 ml)에 용해시켰다. 탄산칼륨 (144 g, 1.04 몰)을 첨가하고, 혼합물을 70℃에서 가열하며 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 물 (1500 ml)에 첨가하고 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 수득한 고체를 30% 수성 에탄올 (500 ml), 및 디에틸 에테르 (150 ml)와 헥산 (150 ml)의 혼합 용매로 차례로 세정하고, 진공 건조하여 7-플루오로-1-((S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필)-6-요오도-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (178 g, 수율 76%)를 베이지색 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (DMSO-d₆ 300MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.6Hz), 1.10 (3H, d, J=6.6Hz), 1.28 (3H, t, J=7.0Hz), 2.27 (1H, br), 3.77 (1H, br), 3.86 (1H, br), 4.23 (2H, q, J=7.0Hz), 4.56 (1H, br), 5.12 (1H, t, J=4.9Hz), 8.09 (1H, d, J=11.1Hz), 8.62 (1H, d, J=7.5Hz), 8.68 (1H, s)

MS(ESI): M+ 448

단계 4

여기서, TBDMS는 tert-부틸디메틸실릴기를 의미한다.

단계 3에서 수득한 화합물 (80 g, 179 mmol)을 디메틸포름아미드 (320 ml)에 용해시키고, 이미다졸 (16 g, 233 mmol) 및 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (30 g, 197 mmol)를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 물을 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염화암모늄 포화 수용액 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 유기층을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 수득한 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (에틸 아세테이트:헥산 = 1:3 내지 1:2)로 정제하여, 1-((S)-1-tert-부틸디메틸실릴옥시메틸-2-메틸프로필)-7-플루오로-6-요오도-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (77 g, 수율 77%)를 무색 무정형 형태로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃ 400 MHz) (δ) ppm: -0.07 (3H, s), -0.05 (3H, s), 0.77 (9H, s), 0.84 (3H,d, J=6.5Hz), 1.18 (3H, d, J=6.5Hz), 1.40 (3H, t, J=7.2Hz), 2.35-2.50 (1H, m), 3.85-3.95 (1H, m), 3.98-4.10 (2H, m), 4.30-4.40 (2H, m), 7.26 (1H,s), 8.64 (1H, s), 8.94 (1H, d, J=7.2Hz)

MS(ESI): M+ 562

단계 5

(테트라하이드로푸란 중 3-클로로-2-플루오로벤질아연 브로마이드 용액의 제조)

아르곤 기류 하에서, 아연 분말 (11 g, 267 mmol)을 테트라하이드로푸란 (30 ml) 중에 현탁시키고, 1,2-디브로모에탄 (0.15 ml, 1.8 mmol) 및 트리메틸실릴 클로라이드 (0.45 ml, 3.6 mmol)를 65℃에서 첨가하고, 그 혼합물을 가열하며 30 분간 교반하였다. 테트라하이드로푸란 (100 ml) 중의 3-클로로-2-플루오로벤질 브로마이드 (41 g, 178 mmol)의 용액을 65℃에서 적가하고, 혼합물을 2 시간 동안 가열 교반하고, 실온으로 냉각시켜서 테트라하이드로푸란 중 1M 3-클로로-2-플루오로벤질아연 브로마이드 용액을 수득하였다. 이를 다음의 주요 단계에서 사용하였다.

(주요 단계)

단계 4에서 수득한 화합물 (76 g, 136 mmol)을 테트라하이드로푸란 (600 ml)에 용해시키고, 아르곤 기류 하에서 디벤질리덴아세톤팔라듐(II) (3.2 g, 5.5 mmol) 및 트리푸릴포스핀 (2.6 g, 11.0 mmol)을 첨가하고, 상술한 테트라하이드로 푸란 중 1M 3-클로로-2-플루오로벤질아연 브로마이드 용액 (178 ml, 178 mmol)을 60℃에서 적가하였다. 적가를 완료한 후, 혼합물을 동일 온도에서 가열하며 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 염화암모늄 포화 수용액을 첨가하고, 그 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하였다. 여액을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기층을 물 (두 번) 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조하였다. 유기층을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (클로로폼:아세톤 = 40:1)로 정제하여, 1-((S)-1-tert-부틸디메틸실릴옥시메틸-2-메틸프로필)-6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-7-플루오로-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (68 g, 수율 84%)를 무색 무정형 형태로 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃ 400 MHz) (δ) ppm: -0.09 (3H, s), -0.05 (3H, s), 0.75 (9H, s), 0.85 (3H,d, J=6.7Hz), 1.18 (3H, d, 6.7Hz), 1.39 (3H, t, J=7.1Hz), 2.45 (1H, br), 3.89-3.92 (1H, m), 3.98-4.02 (1H, m), 4.07-4.12 (1H, m), 4.12 (2H, s), 4.34-4.41 (2H, m), 6.96-7.00 (1H, m), 7.03-7.05 (1H, m), 7.21-7.24 (1H, m), 7.26-7.29 (1H, m), 8.39 (1H, d, J=8.8Hz), 8.63 (1H, s)

단계 6

단계 5에서 수득한 화합물 (48 g, 86 mmol)을 메탄올 (300 ml)에 용해시키고, 물 (5 ml) 및 28% 나트륨 메톡사이드 메탄올 용액 (176 ml, 862 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 24 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 6N 염산을 첨가하여 상기 혼합물을 중화시켰다. 메탄올을 감압 하에서 증발시켰다. 물을 수득한 용액에 첨가하고, 그 혼합물을 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 수득한 고체를 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 혼합물을 물로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 용액을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 수득한 잔류물을 에틸 아세테이트-헥산으로부터 재결정화시켜, 화합물 (32 g, 수율 86%)을 백색 고체로서 수득하였다. 수득한 화합물 (32 g)을 부틸 아세테이트 (160 ml)에 가열 환류하여 용해시키고, 결정 형태 II의 종자결정을 75℃에서 투입하였다. 혼합물을 그대로 냉각시키면서, 3.5 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 부틸 아세테이트 (25 ml)로 세정하고, 진공 건조하여 화합물 (25 g, 수율 77%)을 백색 고체로서 수득하였다. 수득한 화합물 (4.0 g)을 50℃에서 가열 환류하면서 메탄올 (40 ml)에 용해시키고, 실온에서 물 (40 ml)에 적가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하고, 여과하고, 잔존하는 고체를 66% 수성 메탄올으로 세정하고, 진공 건조하여 화합물 A의 결정체 (결정 형태 I) (3.9 g, 수율 97%)를 백색 고체로서 수득하였다.

용융점 151 ~ 152℃

¹H NMR (DMSO-d₆300 MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.5Hz), 1.16 (3H, d, J=6.5Hz), 2.30-2.50 (1H, m), 3.70-3.90 (1H, m), 3.90-4.00 (1H, m), 4.03 (3H, s), 4.12 (2H,s), 4.80-4.90 (1H, m), 5.19 (1H, t), 7.19-7.25 (2H, m), 7.46-7.51 (2H, m), 8.04 (1H, s), 8.88 (1H, s), 15.44 (1H, s)

MS (ESI) : M+ 448

실시예 1: 화합물 A의 결정 형태 II의 제조

단계 1

2,4-디플루오로벤조산 (50 g, 316 mmol)을 진한 황산 (200 ml)에 용해시키고, N-요오도석신이미드 (68 g, 300 mmol)를 5℃ 이하에서 분할 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 혼합물을 동일 온도에서 4.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수 (약 600 ml)에 부은 후, 10% 아황산나트륨 수용액을 첨가하고, 그 혼합물을 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세정하고, 진공 건조하여 미정제 결정 (85 g)을 수득하였다. 동일한 방식으로 수득한 미정제 결정을 합하고 (총량 205 g), 50% 수성 에탄올 (820 ml)로부터 재결정화하여, 2,4-디플루오로-5-요오도벤조산 (148 g, 수율 73%)을 백색 고체로서 수득하였다.

단계 2

단계 1에서 수득한 화합물 (148 g, 521 mmol)을 톨루엔 (750 ml)에 용해시키고, 염화티오닐 (76 ml, 1.04 몰) 및 디메틸포름아미드 (촉매량)을 첨가하고, 혼합물을 2 시간 동안 가열 환류하였다. 불용성 물질을 60℃에서 여과제거하고, 여액을 감압 하에서 농축하고, 톨루엔 (330 ml)과 함께 공비하였다. 잔류물을 테트라하이드로푸란 (400 ml)에 용해시키고, 이 용액을 테트라하이드로푸란 (400 ml) 중 에틸 3,3-디메틸아미노아크릴레이트 (82 g, 573 mmol) 및 트리에틸아민 (87 ml, 625 mmol)의 용액에 적가하고, 그 혼합물을 7 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 감압 하에서 농축하였다. 물 (700 ml) 및 에틸 아세테이트 (800 ml)를 첨가하여 분배시켰다. 유기층을 탄산수소나트륨 포화 수용액 (250 ml)으로 2회, 물 (300 ml) 및 포화 염수 (300 ml)로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하여, 2-(2,4-디플루오로-5-요오도벤조일)-3-디메틸아미노아크릴산 에틸 에스테르의 조 생성물 (210 g)을 갈색 고체로서 수득하였다.

단계 3

단계 2에서 수득한 조 생성물 (210 g)을 테트라하이드로푸란 (500 ml)에 용해시키고, (S)-(+)-발리놀 (54 g, 521 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 30 분간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하고, 잔류물을 디메틸포름아미드 (600 ml)에 용해시켰다. 탄산칼륨 (144 g, 1.04 몰)을 첨가하고, 혼합물을 70℃에서 가열하며 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (1500 ml)에 첨가하고, 그 혼합물을 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하였다. 수득한 고체를 30% 수성 에탄올 (500 ml), 및 디에틸 에테르 (150 ml)와 헥산 (150 ml)의 혼합 용매로 차례로 세정하고, 진공 건조하여 7-플루오로-1-((S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필)-6-요오도-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (178 g, 수율 76% (단계 2에 대해 상대적임))를 베이지색 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (DMSO-d₆ 300 MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.6Hz), 1.10 (3H, d, J=6.6Hz), 1.28 (3H, t, J=7.0Hz), 2.27 (1H, br), 3.77 (1H, br), 3.86 (1H, br), 4.23 (2H, q, J=7.0Hz), 4.56 (1H, br), 5.12 (1H, t, J=4.9Hz), 8.09 (1H, d, J=11.1Hz), 8.62 (1H, d, J=7.5Hz), 8.68 (1H, s)

MS(ESI): M+ 448

단계 4

단계 3에서 수득한 화합물 (150 g, 335 mmol)을 디메틸포름아미드 (500 ml)에 용해시키고, 이미다졸 (30 g, 436 mmol) 및 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (56 g, 369 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 물을 반응 혼합물에 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염화암모늄 포화 수용액 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 유기층을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (에틸 아세테이트:헥산 = 1:3 내지 1:2)로 정제하여, 1-((S)-1-tert-부틸디메틸실릴옥시메틸-2-메틸프로필)-7-플루오로-6-요오도-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (173 g, 수율 92%)를 무색 무정형 형태로 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃ 400 MHz) (δ) ppm: -0.07 (3H, s), -0.05 (3H, s), 0.77 (9H, s), 0.84 (3H,d, J=6.5Hz), 1.18 (3H, d, J=6.5Hz), 1.40 (3H, t, J=7.2Hz), 2.35-2.50 (1H, m), 3.85-3.95 (1H, m), 3.98-4.10 (2H, m), 4.30-4.40 (2H, m), 7.26 (1H,s), 8.64 (1H, s), 8.94 (1H, d, J=7.2Hz)

MS(ESI): M+ 562

단계 5

아르곤 기류 하에서, 아연 분말 (11 g, 175 mmol)을 테트라하이드로푸란 (30 ml) 중에 현탁시키고, 1,2-디브로모에탄 (0.1 ml, 1.20 mmol) 및 트리메틸실릴 클로라이드 (0.29 ml, 2.4 mmol)를 60℃에서 첨가하고, 그 혼합물을 가열하며 30 분간 교반하였다. 테트라하이드로푸란 (60 ml) 중의 3-클로로-2-플루오로벤질 브로마이드 (27 g, 119 mmol)의 용액을 60℃에서 적가하였다. 혼합물을 가열하며 1 시간 동안 교반하고, 실온으로 냉각시켜서 테트라하이드로푸란 중 1M 3-클로로-2-플루오로벤질아연 브로마이드 용액을 수득하였다. 이를 다음의 주요 단계에 서 사용하였다.

(주요 단계)

단계 4에서 수득한 화합물 (50 g, 189 mmol)을 테트라하이드로푸란 (400 ml)에 용해시키고, 아르곤 기류 하에서 디클로로비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) (2.1 g, 3.6 mmol)을 첨가하고, 상술한 테트라하이드로푸란 중 1M 3-클로로-2-플루오로벤질아연 브로마이드 용액을 60℃에서 적가하였다. 적가를 완료한 후, 혼합물을 동일 온도에서 가열하며 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 1N 염산을 첨가하고, 그 혼합물을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조하였다. 유기층을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하고, 수득한 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (에틸 아세테이트:헥산 = 1:2 내지 1:1)로 정제하여, 1-((S)-1-tert-부틸디메틸실릴옥시메틸-2-메틸프로필)-6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-7-플루오로-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (43 g, 수율 83%)를 갈색 무정형 형태로 수득하였다.

단계 6

단계 5에서 수득한 화합물 (43 g, 74 mmol)을 메탄올 (280 ml)에 용해시키고, 28% 나트륨 메톡사이드 메탄올 용액 (151 ml, 742 mmol) 및 물 (4.3 ml)을 첨가하고, 그 혼합물을 20 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하였다. 여액을 감압 하에서 농축하였다. 물 (400 ml)을 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 헥산 (100 ml)으로 세정하였다. 진한 염산 (65 ml)을 첨가하여 수성층을 산성화시키고, 그 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 용액을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 수득한 조 생성물 (35 g, 갈색 오일)을 가열 환류함으로써 에틸 아세테이트 (49 ml)에 용해시키고, 냉각시키면서 헥산 (30 ml)을 첨가하고, 그 혼합물을 18.5 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 에틸 아세테이트와 헥산 (1:1)의 혼합 용매로 세정하고, 진공 건조하여 화합물 A의 결정체 (결정 형태 II) (27 g, 수율 82%)를 백색 고체로서 수득하였다.

용융점 153.7 ~ 153.9℃

MS (ESI) : M+ 448

실시예 2: 화합물 A의 결정 형태 II의 제조

실시예 2-1: 화합물 A의 결정 형태 II의 제조

단계 1

2,4-디플루오로벤조산 (100 g, 633 mmol)을 진한 황산 (400 ml)에 용해시키고, N-요오도석신이미드 (142 g, 601 몰)를 5℃ 이하에서 분할 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 혼합물을 동일 온도에서 6 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수 (약 2400 ml)에 부은 후, 포화 아황산나트륨 수용액을 첨가하고, 그 혼합물을 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세정하고, 진공 건조하여 미정제 결정 (188 g)을 수득하였다. 동일한 방식으로 수득한 미정제 결정을 합하고 (총량 568 g), 50% 수성 에탄올 (2600 ml)로부터 재결정화하여, 2,4-디플루오로-5-요오도벤조산 (388 g, 수율 68%)을 백색 고체로서 수득하였다.

단계 2

단계 1에서 수득한 화합물 (200 g, 704 mmol)을 톨루엔 (1000 ml)에 용해시키고, 염화티오닐 (103 ml, 408 mmol) 및 디메틸포름아미드 (촉매량)을 첨가하고, 혼합물을 2 시간 동안 가열 환류하였다. 불용성 물질을 여과제거하고, 여액을 감압 하에서 농축하고, 톨루엔과 함께 공비하였다. 잔류물을 테트라하이드로푸란 (500 ml)에 용해시키고, 이 용액을 테트라하이드로푸란 (500 ml) 중 에틸 3,3-디메틸아미노아크릴레이트 (111 g, 775 mmol) 및 트리에틸아민 (118 ml, 845 mmol)의 용액에 적가하고, 그 혼합물을 3 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 물 (500 ml) 및 에틸 아세테이트 (800 ml)를 첨가하여 분배시켰다. 유기층을 탄산수소나트륨 포화 수용액 (200 ml), 물 (200 ml) 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 유기층을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하여, 2-(2,4-디플루오로-5-요오도벤조일)-3-디메틸아미노아크릴산 에틸 에스테르의 조 생 성물 (273 g)을 갈색 고체로서 수득하였다.

단계 3

단계 2에서 수득한 조 생성물 (273 g)을 테트라하이드로푸란 (650 ml)에 용해시키고, (S)-(+)-발리놀 (73 g, 708 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하고, 잔류물을 디메틸포름아미드 (800 ml)에 용해시켰다. 탄산칼륨 (195 g, 1.41 몰)을 첨가하고, 혼합물을 70℃에서 가열하며 2.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (2000 ml)에 첨가하고, 그 혼합물을 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하였다. 수득한 고체를 물 및 30% 수성 에탄올 (650 ml)로 차례로 슬러리 세정 처리하고, 진공 건조하여 조 생성물 (217 g)을 수득하였다. 수득한 조 생성물 (217 g)을 가열 환류하면서 에틸 아세테이트 (650 ml)과 헥산 (440 ml)의 혼합 용매로 슬러리 세정 처리하였다. 혼합물을 여과하고, 잔존하는 고체를 진공 건조하여 7-플루오로-1-((S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필)-6-요오도-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (207 g, 수율 66% (단계 2에 대해 상대적임))를 담갈색 고체로서 수득하였다.

MS(ESI): M+ 448

단계 4

단계 3에서 수득한 화합물 (150 g, 335 mmol)을 디메틸포름아미드 (450 ml)에 용해시키고, 이미다졸 (27 g, 397 mmol) 및 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (58 g, 385 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물 (900 ml)을 반응 혼합물에 첨가하고, 그 혼합물을 에틸 아세테이트 (680 ml)로 추출하였다. 유기층을 물 (450 ml, 3회) 및 포화 염수 (200 ml)로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 유기층을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하여, 1-((S)-1-tert-부틸디메틸실릴옥시메틸-2-메틸프로필)-7-플루오로-6-요오도-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르의 조 생성물 (192 g)을 담황색 무정형 형태로 수득하였다.

단계 5

단계 4에서 수득한 조 생성물 (162 g)을 테트라하이드로푸란 (160 ml)에 용해시키고, 아르곤 기류 하에서 디벤질리덴아세톤 팔라듐(II) (1.7 g, 2.9 mmol) 및 트리푸릴포스핀 (1.3 g, 5.8 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에, 테트라하이드로푸란 중 1M 3-클로로-2-플루오로벤질아연 브로마이드 용액 (375 ml, 375 mmol)을 실시예 1, 단계 5에서와 동일한 방식으로 60℃에서 적가하고, 적가를 완료한 후, 혼합물을 동일 온도에서 가열하며 3.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트 (640 ml) 및 10% 시트르산 수용액 (400 ml)을 첨가하고, 그 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여액을 분배하였다. 유기층을 물 (200 ml), 포화 수성 탄산수소나트륨 (400 ml) 및 포화 염수 (200 ml)로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 유기층을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하여, 1-((S)-1-tert-부틸디메틸실릴옥시메틸-2-메틸프로필)-6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-7-플루오로-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르의 조 생성물 (186 g)을 갈색 오일로서 수득하였다.

단계 6

단계 5에서 수득한 조 생성물 (193 g)을 이소프로판올 (650 ml)에 용해시키고, 1N 수산화나트륨 수용액 (1290 ml, 1.29 몰)을 첨가하고, 그 혼합물을 2 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 진한 염산을 첨가하여 여액을 산성화시키고, 그 혼합물을 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여 조 생성물 (132 g)을 담황색 고체로서 수득하였다. 동일한 방식으로 수득한 조 생성물을 합하고 (총량 143 g), 부틸 아세테이트 (430 ml)에 현탁시키고, 1 시간 동안 가열 환류하면서 슬러리 교반 처리하였다. 현탁액을 실온으로 냉각시키고, 여과하고, 진공 건조하여 6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-7-플루오로-1-((S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필)-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 (99 g, 수율 74% (단계 3에 대해 상대적임))을 회색 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (DMSO-d₆ 400 MHz) (δ) ppm: 0.71 (3H, d, J=6.5Hz), 1.13 (3H, d, J=6.5Hz), 2.36 (1H, br), 3.77 (1H, br), 3.94 (1H, br), 4.25 (2H, s), 4.77 (1H, br), 5.16 (1H, t, J=2.4Hz), 7.19-7.23 (1H, m), 7.32-7.35 (1H, m), 7.48-7.52 (1H, m), 8.24-8.28 (2H, m), 9.00 (1H, s), 15.00 (1H, s)

MS(ESI): M+ 436

단계 7

단계 6에서 수득한 화합물 (99 g, 227 mmol)을 메탄올 (530 ml)에 용해시키고, 28% 나트륨 메톡사이드 메탄올 용액 (465 ml, 2.28 몰)을 첨가하고, 그 혼합물을 20 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 여액을 감압 하에서 농축하였다. 물 (200 ml) 및 진한 염산 (190 ml)을 첨가함으로써 잔류물을 산성화시키고, 에틸 아세테이트 (500 ml)로 추출하였다. 유기층을 물 (200 ml)로 2회 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하여 조 생성물 (108 g)을 수득하였다. 수득한 조 생성물 (108 g)을 가열하면서 이소부틸 아세테이트 (330 ml)에 용해시키고, 혼합물을 냉각시키면서 24 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여 화합물 A (71 g, 수율 69%)을 백색 고체로서 수득하였다. 동일한 방식으로 수득한 미정제 결정을 합하고 (총량 233 g), 가열 환류하면서 이소부틸 아세테이트 (470 ml)에 용해시키고, 그 혼합물을 냉각시키면서 밤새 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여 화합물 A의 결정 (결정 형태 II) (206 g, 수율 88%)을 백색 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (DMSO-d₆300 MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.5Hz), 1.16 (3H, d, J=6.5Hz), 2.30-2.50 (1H, m), 3.70-3.90 (1H, m), 3.90-4.00 (1H, m), 4.03 (3H, s), 4.12 (2H, s), 4.80-4.90 (1H, m), 5.19 (1H, t), 7.19-7.25 (2H, m), 7.46-7.51 (2H, m), 8.04 (1H, s), 8.88 (1H, s), 15.44 (1H, s)

MS (ESI) : M+ 448

실시예 2-2: 화합물 A의 결정 형태 II의 제조

단계 1

5-브로모-2,4-디플루오로벤조산 (82.7 kg, 349 몰)을 톨루엔 (420 L)에 용해시키고, 염화티오닐 (62.3 kg, 523 몰) 및 디메틸포름아미드 (촉매량)을 첨가하고, 그 혼합물을 70℃에서 6 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 감압 하에서 농축하고, 톨루엔 (420 L)과 함께 다시 공비하였다. 잔류물을 톨루엔 (220 L)에 용해시키고, 이 용액을 톨루엔 (220 L) 중 에틸 3,3-디메틸아미노아크릴레이트 (55.0 kg, 384 몰) 및 디이소프로필에틸아민 (58.6 kg, 523 몰)의 용액에 적가하고, 그 혼합물을 70℃에서 가열하면서 21 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, (S)-(+)-발리놀 (36.0 kg, 349 몰)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 물 (420 L)을 반응 혼합물에 첨가하여 분배하고, 유기층을 1N 염산 (250 L, 2회), 물 (420 L), 5% 수성 탄산수소나트륨 (250 L, 2회), 물 (420 L) 및 10% 염수 (250 L)로 차례로 세정하였다. 추출물을 감압 하에서 농축하고, 디메틸포름아미드 (420 L)와 함께 공비하여, 2-(5-브로모-2,4-디플루오로벤조일)-3-((S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필메틸아미노)아크릴산 에틸 에스테르의 조 생성물을 함유하는 농축 잔류물 (330 L)을 수득하였다.

단계 2

디메틸포름아미드 중 단계 1에서 수득한 조 생성물의 용액 (330 L)에, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데칸 (105 kg, 349 몰)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 23 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물에 디메틸포름아미드 (330 L), 이어서 물 (170 L)을 첨가하고, 2 시간 동안 교반한 후, 물 (170 L)을 적가하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 디메틸포름아미드 (170 L)-물 (170 L) 혼합물, 이어서 에탄올 (460 L)-물 (200 L) 혼합 용액으로 세정하였다. 수득한 고체를 진공 건조하고, 에틸 아세테이트 (330 L)-n-헵탄 (330 L) 혼합물에 현탁시키고, 슬러리 세정 처리하였다. 현탁액을 여과하고, 잔존하는 고체를 진공 건 조하여 6-브로모-7-플루오로-1-((S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필)-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (102 kg, 수율 73%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 이 화합물은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의해 화합물의 표준 생성물에 대등한 것으로 확인되었다.

단계 3

단계 2에서 수득한 화합물 (45.0 kg, 112 몰) 및 이미다졸 (9.95 kg, 146 몰)을 톨루엔 (180 L)에 현탁시키고, 톨루엔 (45 L) 중 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (17.8 kg, 118 몰)의 용액을 50℃에서 첨가하고, 그 혼합물을 동일 온도에서 3 시간 동안 교반하였다. 톨루엔 (230 L)을 반응 혼합물에 첨가하고, 물 (450 L, 2회) 및 20% 염수 (450 L)로 차례로 세정하였다. 추출물을 감압 하에서 농축하고, 테트라하이드로푸란 (320 L)과 함께 공비하여, 6-브로모-1-((S)-1-tert-부틸디메틸실릴옥시메틸-2-메틸프로필)-7-플루오로-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르의 조 생성물을 함유하는 농축 잔류물 (390 L)을 수득하였다.

단계 4

질소 기류 하에서, 아연 분말 (18.8 kg, 287 몰)을 테트라하이드로푸란 (130 L)에 현탁시키고, 1,2-디브로모에탄 (470 g, 2.50 몰)을 60℃에서 첨가하고, 그 혼합물을 동일 온도에서 30 분간 교반하였다. 트리메틸실릴 클로라이드 (560 g, 3.10 몰)을 실온에서 이 현탁액에 첨가하고, 그 혼합물을 가열하면서 30 분간 교반하였다. 테트라하이드로푸란 (65 L) 중 3-클로로-2-플루오로벤질 브로마이드 (54.0 kg, 242 몰)의 용액을 0℃에서 적가하고, 그 혼합물을 20℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 잔존하는 아연을 여과제거하여, 테트라하이드로푸란 중 1M 3-클로로-2-플루오로벤질아연 브로마이드의 용액을 수득하였다. 이를 다음의 주요 단계에서 사용하였다.

(주요 단계)

질소 기류 하에서, 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0) (1.96 kg, 3.36 몰) 및 트리페닐포스핀 (1.77 kg, 6.72 몰)을 테트라하이드로푸란 (180 L)에 용해시키고, 그 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 테트라하이드로푸란 중 단계 3에서 수득한 조 생성물의 용액 (390 L)을 실온에서 적가하고, 테트라하이드로푸란 (45 L)으로 세정하였다. 미리 제조한 테트라하이드로푸란 중 상술한 1M 3-클로로-2-플루오로벤질아연 브로마이드 용액 (164 kg, 157 몰)을 실온에서 적가하고, 그 혼합물을 55℃에서 가열하면서 5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 톨루엔 (230 L) 및 25% 염화암모늄 수용액 (230 L)을 첨가하고, 그 혼합물을 교반하였다. 여과 후, 혼합물을 분배하였다. 유기층을 25% 염화암모늄 수용액 (230 L), 물 (230 L), 5% 수성 탄산수소나트륨 (230 L, 3회) 및 10% 염수 (230 L)로 차례로 세정하였다. 추출물을 감압 하에서 농축하여, 6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-7-플루오로-1-((S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필)-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산의 조 생성물 (80 L)을 갈색 오일로서 수득하였다.

단계 5

단계 4에서 수득한 조 생성물 (80 L)을 이소프로판올 (180 L)에 용해시키고, 1N 수산화나트륨 수용액 (180 L, 180 몰)을 첨가하고, 그 혼합물을 50℃에서 가열하면서 9 시간 동안 교반하였다. 활성 탄소 (4.5 kg)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 30 분간 교반하고, 셀룰로오스 분말을 통해 여과하고, 이소프로판올 (45 L)-물 (45 L) 혼합물로 철저히 세정하였다. 물 (180 L) 및 n-헵탄 (230 L)을 여액에 첨가하고, 교반 후, 혼합물을 분배하였다. 수성층을 다시 n-헵탄 (230 L)으로 세정하였다. 4N 염산 (45 L, 180 몰) 및 메틸 이소프로필 케톤 (450 L)을 유기층에 첨가하고, 교반 후, 혼합물을 분배하였다. 유기층을 10% 염수 (230 L), 8.5% 수성 탄산수소나트륨 (230 L)으로 2회, 0.5N 염산 (230 L) 및 물 (230 L)로 차례로 세정하였다. 추출물을 감압 하에서 농축하고, 톨루엔 (230 L)과 함께 3회 공비하였다. 잔류물을 100℃에서 1.5 시간 동안 교반하고, 실온으로 냉각시키고, 3 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 수득한 고체를 톨루엔 (45 L)으로 세정하고, 진공 건조하여 6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-7-플루오로-1-[(S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필]-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 (42.5 kg, 수율 87%)을 담황색 고체로서 수득하였다. 이 화합물은 HPLC 분석에 의해 표준 생성물에 대등한 것으로 확인되었다.

단계 6

단계 5에서 수득한 화합물 (39.2 kg, 89.9 몰)을 메탄올 (240 L)에 용해시키고, 28% 나트륨 메톡사이드 메탄올 용액 (173 kg, 899 몰)을 10℃에서 적가하고, 그 혼합물을 70℃에서 가열하면서 21 시간 동안 교반하였다. 활성 탄소 (3.9 kg)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고, 셀룰로오스 분말을 통해 여과하고, 메탄올 (80 L)로 철저히 세정하였다. 물 (29 kg, 1620 몰)을 여액에 첨가하고, 혼합물을 감압 하에서 농축하였다. 잔류 물을 이소프로판올 (240 L, 120 L)로 2회 공비하였다. 잔류물에 15% 염수 (200 L) 및 톨루엔 (200 L)을 첨가하고, 교반 후, 혼합물을 분배하였다. 유기층을 20% 염수 (200 L, 3회), 염화나트륨 (10 kg)을 함유하는 0.5N 염산 (200 L), 및 20% 염수 (200 L)로 차례로 세정하였다. 유기층을 감압 하에서 농축하고, 에틸 아세테이트 (200 L)와 함께 공비하였다. 에틸 아세테이트 (320 L) 및 물 (200 L)을 잔류물에 첨가하고, 교반 후, 혼합물을 분배하였다. 유기층을 감압 하에서 농축하고, 이소부틸 아세테이트 (200 L)과 함께 2회 공비하였다. 잔류물을 가열함으로써 용해시키고, 뜨거울 때 여과하고, 이소부틸 아세테이트 (20 L)로 철저히 세정하였다. 종자결정 (화합물 A의 결정 형태 II, 39 g)을 60℃의 여액에 첨가하고, 그 혼합물을 동일 온도에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 80℃에서 가열하면서 2 시간 동안 교반하고, 실온으로 냉각시키고, 6 시간 동안 추가 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하였다. 수득한 고체를 이소부틸 아세테이트 (40 L)로 세정하고, 진공 건조하여 화합물 A의 결정 (결정 형태 II) (29.0 kg, 수율 72%)을 백색 고체로서 수득하였다. 이 결정은 HPLC 및 X-선 분말 회절 (XRPD) 분석에 의해 결정의 표준 생성물 (실시예 2-1에서 수득한 화합물 A의 결정 형태 II)에 대등한 것으로 확인되었다.

실시예 2-3: 화합물 A의 결정 형태 II의 제조

결정 형태 II를 또한 실시예 2-3-1 내지 2-3-26에 기재된 방법에 따라 결정화에 의해 제조하였다.

실시예 2-3-1

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)을 가열 환류하면서 1-부탄올 (2 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 냉각시키면서 17 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (125 mg, 수율 63%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-2

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 부틸 아세테이트 (2 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 냉각시키면서 17 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (102 mg, 수율 51%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-3

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 메틸 이소부틸 케톤 (2 ml)에 용해시켰다. 헵탄 (2 ml)을 적가하고, 그 혼합물을 냉각시키면서 6 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (168 mg, 수율 84%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-4

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 에탄올 (2 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 냉각시키면서 17 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (56 mg, 수율 28%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-5

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 에틸 아세테이트 (2 ml)에 용해시켰다. 헵탄 (1.6 ml)을 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 6 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (166 mg, 수율 83%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-6

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 메틸 에틸 케톤 (2 ml)에 용해시켰다. 헵탄 (4 ml)을 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 6 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (123 mg, 수율 62%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-7

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 1-프로판올 (2 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 냉각시키면서 17 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (91 mg, 수율 46%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-8

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 이소프로판올 (2 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 냉각시키면서 17 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (88 mg, 수율 44%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-9

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 큐멘 (2 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 냉각시키면서 17 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (188 mg, 수율 94%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-10

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 아니솔 (2 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 냉각시키면서 17 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (107 mg, 수율 54%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-11

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 아세톤 (2 ml)에 용해시켰다. 헵탄 (2 ml)을 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 16.5 시간 동안 교반하였다. 헵탄 (4 ml)을 추가 첨가하고, 혼합물을 24 시간 동안 추가 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (134 mg, 수율 67%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-12

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 에탄올 (2 ml)에 용해시켰다. 헵탄 (4 ml)을 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 19 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (129 mg, 수율 65%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-13

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 이소프로판올 (2 ml)에 용해시켰다. 헵탄 (4 ml)을 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 19 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (166 mg, 수율 83%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-14

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 1-프로판올 (2 ml)에 용해시켰다. 헵탄 (4 ml)을 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 19 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (158 mg, 수율 79%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-15

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 이소부탄올 (2 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 냉각시키면서 21 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (131 mg, 수율 66%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-16

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 100℃에서 가열하면서 톨루엔 (2 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 냉각시키면서 37 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (190 mg, 수율 95%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-17

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 60℃에서 가열하면서 메틸 부틸 케톤 (2 ml)에 용해시켰다. 헵탄 (1.8 ml)을 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 37 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (191 mg, 수율 96%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-18

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 60℃에서 가열하면서 클로로폼 (1 ml)에 용해시켰다. 이소프로필 에테르 (1.8 ml)를 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 37 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (184 mg, 수율 92%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-19

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 60℃에서 가열하면서 테트라하이드로푸란 (1 ml)에 용해시켰다. 이소프로필 에테르 (2 ml)를 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 41 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (144 mg, 수율 72%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-20

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 이소부탄올 (2 ml)에 용해시켰다. 헵탄 (2 ml)을 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 21 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (160 mg, 수율 80%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-21

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 부탄올 (2 ml)에 용해시켰다. 헵탄 (2 ml)을 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 21 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (152 mg, 수율 76%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-22

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 이소부틸 아세테이트 (2 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 냉각시키면서 21 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (140 mg, 수율 70%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-23

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 이소부틸 아세테이트 (2 ml)에 용해시켰다. 헵탄 (2 ml)을 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 21 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (178 mg, 수율 89%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-24

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 부틸 아세테이트 (2 ml)에 용해시켰다. 헵탄 (1.5 ml)을 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 21 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (158 mg, 수율 78%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-25

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 110℃에서 가열하면서 아니솔 (2 ml)에 용해시켰다. 헵탄 (2 ml)을 적가하고, 혼합물을 냉각시키면서 21 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (187 mg, 수율 89%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-3-26

실시예 1에서 수득한 화합물 A (200 mg)를 가열 환류하면서 부틸 아세테이트 (2 ml)에 용해시켰다. 신속한 냉각 후에, 혼합물을 2 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여, 화합물 A의 결정 형태 II (131 mg, 수율 66%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-4: 화합물 A의 결정 형태 II의 제조

단계 1

실시예 1, 단계 5에서 수득한 1-((S)-1-tert-부틸디메틸실릴옥시메틸-2-메틸프로필)-6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-7-플루오로-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (48 g, 86 mmol)을 메탄올 (300 ml)에 용해시키고, 물 (5 ml) 및 28% 나트륨 메톡사이드 메탄올 용액 (176 ml, 862 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 24 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 6N 염산으로 중화시키고, 메탄올을 감압 하에서 증발시켰다. 물을 수득한 용액 에 첨가하고, 교반 후, 침전된 고체를 여과에 의해 수집하였다. 수득한 고체를 에틸 아세테이트에 용해시키고, 물로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 감압 하에 농축하였다. 수득한 잔류물을 에틸 아세테이트-헥산으로부터 재결정화하여, 화합물 A (일차 결정 29.5 g, 이차 결정 2.8 g, 총 32.3 g, 수율 86%)를 백색 고체로서 수득하였다.

용융점 151 ~ 152℃

MS (ESI) : M+ 448

단계 2

단계 1에서 수득한 화합물 A (32.3 g)을 가열 환류하면서 부틸 아세테이트 (160 ml)에 용해시켰다. 실시예 2의 결정 형태 II의 종자결정을 63℃에서 투입하고, 혼합물을 냉각시키면서 3 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여 화합물 A의 결정 (결정 형태 II) (24.79 g, 수율 77%)을 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-5: 화합물 A의 결정 형태 II의 제조

단계 1

실시예 1, 단계 5에서 수득한 1-((S)-1-tert-부틸디메틸실릴옥시메틸-2-메틸프로필)-6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-7-플루오로-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (19 g, 33 mmol)를 이소프로판올 (100 ml)에 용해시키고, 1N 수산화나트륨 수용액 (200 ml, 200 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 2.5 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하였다. 진한 염산을 첨가하여 여액을 산성화시키고, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여 6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-7-플루오로-1-((S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필)-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 (12 g, 수율 82%)을 담황색 고체로서 수득하였다.

단계 2

단계 1에서 수득한 화합물 (12 g, 27 mmol)을 메탄올 (64 ml)에 용해시키고, 28% 나트륨 메톡사이드 메탄올 용액 (52 ml, 256 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 24 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 여액을 감압 하에서 농축하였다. 물 (360 ml) 및 진한 염산을 첨가하여 잔류물을 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하여 조 생성물 (13 g)을 갈색 오일로서 수득하였다. 수득한 조 생성물 (13 g)을 가열함으로써 이소부틸 아세테이트 (60 ml)에 용해시키고, 종자결정 투입 후, 혼합물을 냉각시키면서 23 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여 화합물 A (9.2 g, 수율 75%)를 백색 고체로서 수득하였다.

MS (ESI): M+ 448

단계 3

실시예 1, 단계 2에서 수득한 2-(2,4-디플루오로-5-요오도벤조일)-3-디메틸아미노아크릴산 에틸 에스테르 (20 g)를 에틸 아세테이트 (60 ml)와 헥산 (40 ml)의 혼합 용매로 슬러리 세정 처리하고, 가열 환류하였다. 혼합물을 여과하고, 잔존하는 고체를 진공 건조하여 7-플루오로-1-((S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필)-6-요오도-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (18 g, 수율 94%)를 베이지색 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (DMSO-d₆ 300 MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.6Hz), 1.10 (3H, d, J=6.6Hz), 1.28 (3H, t, J=7.0Hz), 2.27 (1H, br), 3.77 (1H, br), 3.86 (1H, br), 4.23 (2H, q, J=7.0Hz), 4.56(1H, br), 5.12 (1H, t, J=4.9Hz), 8.09 (1H, d, J=11.1Hz), 8.62 (1H, d, J=7.5Hz), 8.68 (1H, s)

MS(ESI): M+ 448

단계 4

단계 3에서 수득한 화합물 (19 g, 42 mmol)을 디메틸포름아미드 (65 ml)에 용해시키고, 이미다졸 (3.4 g, 49.9 mmol) 및 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (7.2 g, 47.8 mmol)를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 물을 반응 혼합물에 첨가하고, 그 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 물, 염화암모늄 포화 수용액 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 유기층을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하여 1-((S)-1-tert-부틸디메틸실릴옥시메틸-2-메틸프로필)-7-플루오로-6-요오도-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르의 조 생성물 (24 g)을 베이지색 비정질 형태로 수득하였다.

MS(ESI): M+ 562

단계 5

단계 4에서 수득한 조 생성물 (24 g)을 테트라하이드로푸란 (200 ml)에 용해시키고, 아르곤 기류 하에서 디벤질리덴아세톤팔라듐(II) (984 mg, 1.7 mmol) 및 트리푸릴포스핀 (795 mg, 3.4 mmol)을 첨가하고, 테트라하이드로푸란 중 실시예 1, 단계 5에서와 동일한 방식으로 수득한 1M 3-클로로-2-플루오로벤질아연 브로마이드의 용액 (56 ml, 56 mmol)을 60℃에서 적가하였다. 적가를 완료한 후, 혼합물을 동일 온도에서 가열하면서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 염화암모늄 포화 수용액을 첨가하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 여액을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기층을 물 (2회) 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조하였다. 유기층을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하여 1-((S)-1-tert-부틸디메틸실릴옥시메틸-2-메틸프로필)-6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-7-플루오로-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르의 조 생성물 (30 g)을 갈색 페이스트로서 수득하였다.

단계 6

단계 5에서 수득한 조 생성물 (30 g)을 이소프로판올 (150 ml)에 용해시키고, 1N 수산화나트륨 수용액 (300 ml, 300 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 2.5 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하였다. 진한 염산을 첨가하여 여액을 산성화시키고, 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여 조 생성물 (18 g)을 베이지색 고체로서 수득하였다. 수득한 조 생성물 (18 g)을 부틸 아세테이트 (90 ml)에 현탁시키고, 가열 환류하면서 1 시간 동안 슬러리 교반 처리하였다. 현탁액을 실온으로 냉각시키고, 여과 및 진공 건조하여 6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-7-플루오로-1-((S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필)-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 (11 g, 수율 62% (단계 3에 대해 상대적임))을 백색 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (DMSO-d₆ 400 MHz) (δ) ppm: 0.71 (3H, d, J=6.5Hz), 1.13 (3H, d, J=6.5Hz), 2.36 (1H, br), 3.77(1H, br), 3.94 (1H, br), 4.25 (2H, s), 4.77 (1H, br), 5.16 (1H,t, J=2.4Hz), 7.19-7.23 (1H, m), 7.32-7.35 (1H, m), 7.48-7.52 (1H, m), 8.24-8.28 (2H, m), 9.00 (1H, s), 15.00 (1H, s)

MS(ESI): M+ 436

단계 7

단계 6에서 수득한 화합물 (11 g, 26 mmol)을 메탄올 (60 ml)에 용해시키고, 28% 나트륨 메톡사이드 메탄올 용액 (52 ml, 256 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 24 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트를 통해 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 물 (330 ml) 및 진한 염산을 첨가하여 잔류물을 산성화시키고, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하여 조 생성물 (12 g)을 갈색 오일로서 수득하였다. 수득한 조 생성물 (12 g)을 가열 환류함으로써 이소부틸 아세테이트 (60 ml)에 용해시켰다. 종자결정 (화합물 A의 결정 형태 II)을 투입하고, 혼합물을 냉각시키면서 23 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여 화합물 A (8.2 g, 수율 71%)를 백색 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (DMSO-d₆300MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.5Hz), 1.16 (3H, d, J=6.5Hz), 2.30-2.50 (1H, m), 3.70-3.90 (1H, m), 3.90-4.00 (1H, m), 4.03 (3H, s), 4.12 (2H,s), 4.80-4.90 (1H, m), 5.19 (1H, t), 7.19-7.25 (2H, m), 7.46-7.51 (2H, m), 8.04 (1H, s), 8.88 (1H, s), 15.44 (1H, s)

MS (ESI) : M+ 448

단계 8

단계 7에서 수득한 화합물 A (7.66 g) 및 단계 2에서 수득한 화합물 A (9.17 g)를 가열 환류함으로써 이소부틸 아세테이트 (84 ml)에 용해시키고, 혼합물을 냉각시키면서 16 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 건조하여 화합물 A의 결정 형태 II (14.73 g, 수율 88%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 2-6: 화합물 A의 결정 형태 II의 제조

단계 1

2,4-디플루오로벤조산 (100 g, 633 mmol)을 트리플루오로메탄설폰산 (400 ml)에 용해시키고, N-요오도석신이미드 (157 g, 696 mmol)을 5℃ 이하에서 분할 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 혼합물을 50℃에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수에 붓고, 그 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물 및 헥산으로 차례로 세정하고, 진공 건조하여 2,4-디플루오로-5-요오도벤조산 (179 g, 수율은 정량적)을 백색 고체로서 수득하였 다.

단계 2

단계 1에서 수득한 화합물 (28 g, 100 mmol)을 에틸 아세테이트 (300 ml)에 용해시키고, 옥살릴 클로라이드 (11 ml, 122 mmol) 및 디메틸포름아미드 (촉매량)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 여액을 감압 하에서 농축하고, 톨루엔과 함께 공비하였다. 잔류물을 테트라하이드로푸란 (100 ml)에 용해시키고, 이 용액을 테트라하이드로푸란 (100 ml) 중 에틸 3,3-디메틸아미노아크릴레이트 (17 g, 120 mmol) 및 트리에틸아민 (21 ml, 150 mmol)의 용액에 적가하고, 그 혼합물을 3 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 에틸 아세테이트 (200 ml)을 첨가하였다. 혼합물을 물 (2회) 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 수득한 잔류물을 디에틸 에테르 (50 ml) 및 헥산 (50 ml)의 혼합 용매로 슬러리 교반 처리하였다. 혼합물을 여과하고, 잔존하는 고체를 진공 건조하여 2-(2,4-디플루오로-5-요오도벤조일)-3-디메틸아미노아크릴산 에틸 에스테르의 조 생성물 (26 g, 수율 63%)을 황색 고체로서 수득하였다.

단계 3

단계 2에서 수득한 조 생성물 (22 g, 55 mmol)을 테트라하이드로푸란 (110 ml)에 용해시키고, (S)-(+)-발리놀 (6.8 g, 65.8 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 50℃에서 가열하면서 30 분간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하고, 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 ml)에 용해시키고, 물 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 수득한 잔류물을 디메틸포름아미드 (80 ml)에 용해시키고, 탄산칼륨 (19 g, 137 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 60℃에서 가열하며 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 감압 하에서 농축하였다. 물 (250 ml)을 수득한 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30 분간 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하였다. 수득한 고체를 물 (100 ml), 에틸 아세테이트 (10 ml) 및 헥산 (40 ml)의 혼합 용매로 차례로 세정하고, 진공 건조하여 7-플루오로-1-((S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필)-6-요오도-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (22 g, 수율 88%)를 담황색 고체로서 수득하였다.

MS(ESI): M+ 448

단계 4

단계 3에서 수득한 화합물 (22 g, 48 mmol)을 디메틸포름아미드 (60 ml)에 용해시키고, 이미다졸 (3.9 g, 57.7 mmol) 및 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (8.0 g, 53.0 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하고, 수득한 잔류물을 에틸 아세테이트 (200 ml)에 용해시키고, 물 (2회) 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 수득한 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (에틸 아세테이트:헥산 = 3:7 내지 4:6)로 정제하여 1-((S)-1-tert-부틸디메틸실릴옥시메틸-2-메틸프로필)-7-플루오로-6-요오도-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (25 g, 수율 92%)를 백색 왁스로서 수득하였다.

MS(ESI): M+ 562

단계 5

단계 4에서 수득한 화합물 (25 g, 44 mmol)을 테트라하이드로푸란 (200 ml)에 용해시키고, 아르곤 기류 하에서 디벤질리덴아세톤팔라듐(II) (1.0 g, 1.8 mmol) 및 트리푸릴포스핀 (824 mg, 3.5 mmol)을 첨가하였다. 테트라하이드로푸란 중 실시예 1, 단계 5와 동일한 방식으로 수득한 1M 3-클로로-2-플루오로벤질아연 브로마이드의 용액 (58 ml, 58 mmol)을 60℃에서 적가하였다. 적가를 완료한 후, 혼합물을 3 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트 (200 ml)를 첨가하고, 1N 염산, 물, 탄산수소나트륨 포화 수용액, 물 및 포화 염수로 차례로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 수득한 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (에틸 아세테이트:헥산 = 4:6 내지 1:1)로 정제하여, 1-((S)-1- tert-부틸디메틸실릴옥시메틸-2-메틸프로필)-6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-7-플루오로-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산 에틸 에스테르 (17 g, 수율 68%)를 담황색 오일로서 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃ 400 MHz) (δ) ppm: -0.09 (3H, s), -0.05 (3H, s), 0.75 (9H, s), 0.85 (3H,d, J=6.7Hz), 1.18 (3H, d, 6.7Hz), 1.39 (3H, t, J=7.1Hz), 2.45 (1H, br), 3.89-3.92(1H, m), 3.98-4.02 (1H, m), 4.07-4.12 (1H, m), 4.12 (2H, s), 4.34-4.41 (2H, m), 6.96-7.00 (1H, m), 7.03-7.05 (1H, m), 7.21-7.24 (1H, m), 7.26-7.29 (1H, m), 8.39 (1H, d, J=8.8Hz), 8.63 (1H, s)

단계 6

단계 5에서 수득한 화합물 (17 g, 30 mmol)을 메탄올 (120 ml)에 용해시키고, 28% 나트륨 메톡사이드 메탄올 용액 (62 ml, 304 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 19 시간 동안 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (200 ml)을 첨가하고, 메탄올을 감압 하에서 증발시켰다. 진한 염산을 첨가하여 잔류물을 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 감압 하에서 농축하여, 화합물 A의 조 생성물 (14 g)을 담황색 오일로서 수득하였다.

단계 7

단계 6에서 수득한 화합물 A (14.11 g)을 실온에서 에틸 아세테이트 (20 ml) 및 헥산 (20 ml)의 혼합 용매에 현탁시키고, 종자결정 (화합물 A의 결정 형태 II)을 투입하고, 그 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 현탁액을 여과하고, 잔존하는 고체를 진공 건조하여 화합물 A (결정 형태 II, 10.40 g, 수율 77%)를 백색 고체로서 수득하였다.

실시예 3: 화합물 A의 결정 형태 III의 제조

실시예 3-1: 화합물 A의 결정 형태 III의 제조

실시예 2-2에서 수득한 화합물 A (10.0 g, 22.3 mmol)의 결정 형태 II를 이소부틸 아세테이트 (30 ml)에 첨가하고, 상기 결정을 가열 환류하여 용해시켰다. 용액을 90℃로 냉각시키고, 5 시간 동안 교반하여 결정이 침전하도록 하였다. 이 용액을 실온으로 추가 냉각시키고, 12 시간 동안 추가 교반하였다. 침전된 결정을 여과에 의해 수집하였다. 수득한 결정을 이소부틸 아세테이트 (10 ml)로 세정하고, 진공 건조하여 백색 결정 (9.85 g, 수율 98.5%)을 수득하였다. 이 결정체는 XRPD 분석으로 결정 형태 II와는 상이한 것으로 확인되었으므로, 이 결정체와 동일한 XRPD 차트 (도 1)를 나타내는 결정체는 결정 형태 III으로 하였다.

실시예 3-2: 화합물 A의 결정 형태 III의 제조

실시예 2-2에서 수득한 화합물 A (250 g, 558 mmol)의 결정 형태 II를 이소부틸 아세테이트 (750 ml)에 첨가하였다. 실시예 3에서 수득한 화합물 A의 결 정 형태 III의 종자결정 (12.5 g)을 실온에서 첨가하고, 그 혼합물을 17 시간 동안 교반하였다. 침전된 결정을 여과에 의해 수집하였다. 수득한 결정을 이소부틸 아세테이트 (250 ml)로 세정하고, 진공 건조하여 목적 생성물 (결정 형태 III, 259 g, 수율 98.6%)을 백색 결정으로서 수득하였다. 이 결정체는 XRPD분석에 의해, 결정체 (실시예 3-1에서 수득한 화합물 A의 결정 형태 III)의 표준 생성물에 대등한 것으로 확인되었다.

실시예 3-3: 화합물 A의 결정 형태 III의 제조

실시예 2-2에서 수득한 화합물 A (결정 형태 II, 10.0 g, 22.3 mmol)를 이소프로판올 (30 ml)에 첨가하고, 그 혼합물을 가열 환류하여 결정을 용해시켰다. 용액을 70℃로 냉각시키고, 실시예 3-1에서 수득한 화합물 A의 결정 형태 III의 종자결정 (10 mg)을 첨가하고, 그 혼합물을 5 시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 실온으로 추가 냉각시키고, 12 시간 동안 교반하고, 결정을 여과에 의해 수집하였다. 수득한 결정을 이소프로판올 (10 ml)로 세정하고, 진공 건조하여 목적 생성물 (결정 형태 III, 9.72 g, 수율 97.2%)을 백색 결정으로서 수득하였다. 이 결정체는 XRPD 분석에 의해 결정체의 표준 생성물 (실시예 3-1에서 수득한 화합물 A의 결정 형태 III)에 대등한 것으로 확인되었다.

실시예 3-4: 화합물 A의 결정 형태 III의 제조

실시예 2-2에서 수득한 화합물 A (7.00 g, 15.6 mmol)의 결정 형태 II를 에탄올 (52.5 ml)과 물 (7 ml)의 혼합 용액에 첨가하고, 가열하여 용해시켰다. 물 (28 ml)을 첨가하고, 목적 생성물의 종자결정 (10 mg)을 70℃에서 첨가하고, 그 혼합물을 4 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 빙냉시키고, 2 시간 동안 추가 교반하고, 결정을 여과에 의해 수집하였다. 수득한 결정을 냉에탄올 (8.4 ml) 및 물 (5.6 ml)의 혼합 용액으로 세정하고, 진공 건조하여 목적 생성물을 백색 결정 (결정 형태 III, 6.77 g, 수율 96.8%)으로서 수득하였다. 이 결정체는 XRPD에 의해 표준 생성물 (실시예 3-1)에 대등한 것으로 확인되었다.

실험예

각 결정 형태의 특성치를 하기 분석 시험에 의해 구하고, 이들을 지표로 사용하여 각 결정 형태의 안정성 시험을 수행하였다.

시료

달리 명시되지 않는 한, 상술한 참조예 1에서 수득한 결정체 (결정 형태 I), 실시예 1에서 수득한 결정체 (결정 형태 II) 및 실시예 3-1에서 수득한 결정체 (결정 형태 III)를 시료로 사용하였다.

분석 시험

1. X-선 분말 회절분석

이 시험은 참조예 1, 실시예 1 및 실시예 3-1에서 수득한 결정체들의 결정 형태를 명시하기 위한 X-선 분말 회절 패턴을 수득하는 것을 목적으로 한다. 회절 패턴은 결정 형태를 명시하고, 안정성을 평가하고, 순도를 구하는 등의 목적으로 이용된다.

시료를 알루미늄 셀에 고정하고, X-선 분말 회절계 (RINT 2000/PC Ultima⁺, Rigaku 사 제조, X-선 광원: Cu-Κα1 선, 튜브 전압: 40 kV, 튜브 전류: 40 mA, 스캔 속도: 분 당 5°, 단계 폭: 0.02°, 회절각: 5-40°)를 사용하여 측정을 수행하고, 이를 기준으로 회절 패턴을 수득하였다. 수득한 회절 패턴을 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 각 시료로부터 수득한 X-선 분말 회절 패턴은 상이하였다.

따라서 참조예 1, 실시예 1 및 실시예 3-1에서 수득한 결정체는 서로 구분되고, X-선 분말 회절 패턴에 나타난 바와 같은 특징적인 회절 패턴을 나타냄이 확인되었다. 따라서 본 명세서에서는, 이러한 X-선 분말 회절 패턴에 근거하여 이들을 결정 형태 I, 결정 형태 II 및 결정 형태 III으로 명명하였다.

결정 형태의 명시를 위해, 각 결정체에 특징적인 회절 피크를 도 1의 회절 차트에 근거하여 종합적인 방식으로 평가할 수 있다.

도 1의 회절 패턴으로부터 명시된 주요 회절 피크 및 특징적인 회절 피크를 하기에 나타낸다.

[결정 형태 I]

주요 회절 피크: 2θ = 6.58, 14.40, 14.64, 15.24, 16.48, 19.16, 20.90, 21.14, 22.24, 24.74, 25.64, 26.12, 27.20°;

특징적인 회절 피크: 2θ = 6.58, 14.40, 19.16, 20.90, 21.14°.

[결정 형태 II]

주요 회절 피크: 2θ = 6.56, 9.04, 13.20, 14.62, 15.24, 16.48, 19.86, 20.84, 21.22, 22.24, 25.22, 25.96, 26.12, 27.34°;

특징적인 회절 피크: 2θ = 6.56, 13.20, 19.86, 20.84, 21.22, 25.22°.

[결정 형태 III]

주요 회절 피크: 2θ = 8.54, 14.02, 15.68, 15.90, 16.00, 17.06, 17.24, 17.84, 18.12, 19.50, 19.90, 22.26, 22.68, 23.02, 24.16, 24.76, 25.18, 25.74, 25.98, 27.50, 28.80, 30.38, 30.72, 32.54°;

특징적인 회절 피크: 2θ = 8.54, 14.02, 15.68, 17.06, 17.24, 24.16, 25.74°.

2. 열분석

이 시험은 시차주사열량측정법 (DSC) 측정 곡선상의 한 흡열 피크에서의 엔탈피 및 외삽 개시 온도 (extrapolated onset temperature)의 측정을 목적으로 한다. 이 값들은 상술한 결정 형태 I, 결정 형태 II 및 결정 형태 III의 안정성 지표에 해당하며, 결정 형태를 명시하는 지표로서 사용될 수 있다.

2.1 결정 형태 I 및 결정 형태 II의 엔탈피 및 외삽 개시 온도

결정 형태 I 및 결정 형태 II를 시차주사열량측정법 (DSC) 측정 장치 (DSC8240, Rigaku 사 제조)를 사용하여, 대기 중에서 측정 시료 5±1 mg, 승온 속도: 10℃/분, 열린 알루미늄 팬에서 산화알루미나를 기준으로 하여 측정하였다. 수득한 DSC 곡선상의 한 흡열 피크에서의 엔탈피 및 외삽 개시 온도를 구하였다.

2.2 결정 형태 III의 엔탈피 및 외삽 개시 온도

결정 형태 III을 DSC 측정 장치 (DSC8240, Rigaku 사 제조)를 사용하여, 대기 중에서 측정 시료 5.0±0.5 mg, 승온 속도: 5℃/분, 닫힌 알루미늄 팬에서 산화알루미나를 기준으로 하여 측정하였다. 수득한 DSC 곡선상의 한 흡열 피크에서의 엔탈피 및 외삽 개시 온도를 구하였다.

결과를 표 1에 나타낸다.

엔탈피 및 외삽 개시 온도에 대한 흡열 피크에서의 DSC 곡선
결정 형태	흡열 피크
결정 형태	엔탈피 (J/g)	외삽 개시 온도 (℃)
결정 형태 I	51.080	150.3
결정 형태 II	53.542	151.2
결정 형태 III	81.404	162.1

표 1에 나타난 바와 같이, 결정 형태 III이 세 가지 결정 형태 중에서 가장 큰 엔탈피 및 가장 높은 외삽 개시 온도를 나타낸다. 따라서 결정 형태 III이 가장 안정한 형태인 것으로 확인되었다.

3. 순도 시험

이 시험은 화합물 A의 순도 측정을 목적으로 한다. 순도는 화학적 안정성의 지표로서 사용될 수 있다.

3.1 결정 형태 I 및 결정 형태 II의 화합물의 순도

각 시료 (결정 형태 I 및 결정 형태 II, 약 10 mg)를 아세토나이트릴에 용해시켜 10 ml의 양으로 만들고 시료 용액으로 사용하였다. 이 용액 (10 ㎕)을 하기 조건 하에서 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 적용하였다. 각 시료 용액의 피크 면적은 자동 적분에 의해 측정하였고, 순도는 하기 식에 의해 구하였다. 순도를 하기 표 5 및 6에 나타낸다.

순도 (%) = 100 - (A_sum/A_s)×100

A_s:시료 용액으로부터 수득한 피크의 총 피크 면적

A_sum:시료 용액으로부터 수득한 주요 피크 이외의 피크의 총 피크 면적

시험 조건

검출기: UV 흡광계 (파장: 259 nm)

칼럼: CAPCELL PAK MG (내경 4.6 cm, 길이 15 cm, 입자직경 5 ㎛, Shiseido 사 제조

칼럼 온도: 40℃ 근처에서 일정 온도

이동상 A: 트리플루오로아세트산 용액 (1: 1000)

이동상 B: 아세토나이트릴 중 트리플루오로아세트산의 용액 (1: 1000)

기울기 프로그램: 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 이동상 A와 이동상 B의 혼합비를 변화시켜 농도 기울기를 조절한다.

주입 후의 시간 (분)	이동상 A (%)	이동상 B (%)
0	55	45
0-5	55 → 52	45 → 48
5-15	52	48
15-25	52 → 20	48 → 80
25-35	20	80
35-36	20 → 55	80 → 45
36-45	55	45
유속: 1 ml/분

3.2 결정 형태 III의 화합물의 순도

시료 (결정 형태 III, 약 50 mg)를 이동상 B와 이동상 A의 혼합물 (4:1)에 용해시켜 50 ml의 양으로 만들고, 이를 시료 용액으로 사용하였다. 이 용액 (1 ml)을 정확히 측정하고, 이동상 B와 이동상 A의 혼합물 (4:1)을 첨가하여 정확히 100 ml의 양으로 만들어서, 이를 표준 용액으로 사용하였다. 시료 용액 및 표준 용액 (15 ㎕)을 하기 조건 하에 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 적용하였다. 각 용액의 피크 면적을 자동 적분에 의해 측정하고, 순도를 하기 식에 의해 구하였다. 순도를 하기 표 7에 나타내었다.

순도 (%) = 100 - (A_sum/A_r)

A_r:표준 시료 용액으로부터 수득한 주요 피크의 피크 면적

시험 조건

검출기: UV 흡광계 (파장: 259 nm)

칼럼: Waters XTerra MC C18 (내경 4.6 cm, 길이 5 cm, 입자직경 2.5 ㎛, Waters 사 제조)

칼럼 온도: 40℃ 근처에서 일정 온도

이동상 A: 인산을 인산수소이칼륨 용액 (1→1149)에 첨가하고 pH를 7.0으로 조정함

이동상 B: 아세토나이트릴

기울기 프로그램: 하기 표 3에서 나타난 바와 같이, 이동상 A와 이동상 B의 혼합비를 변화시켜 농도 기울기를 조절한다.

주입 후의 시간 (분)	이동상 A (%)	이동상 B (%)
0-15	58	42
15-35	58 → 20	42 → 80
35-45	20	80
45-46	20 → 58	80 → 42
46-55	58	42
유속: 0.9 ml/분

4. 용해도 시험

이 시험은 각종 시험 용액 및 각종 pH 하에서 결정체의 용해도 측정을 목적으로 한다. 용해도는 상술한 결정 형태 I, 결정 형태 II 및 결정 형태 III의 안정성의 지표 중 하나이며, 생물체에 의한 결정 형태의 흡수성의 기준 지표로서도 사용될 수 있다.

각 시료 (결정 형태 I 타입 I, 결정 형태 II 및 결정 형태 III, 약 10 mg)를 10 ml 원심분리관 내에 하기 시험 용액 (5 ml)과 함께 넣고, 진탕기 (SR-1M; Tietech 사 제조)로 14 시간 동안 진탕하였다. 진탕 후, 혼합물을 원심분리 (3000 rpm, 20 분)하고, 상층액을 0.2 ㎛ 공극 크기-13 mm 직경의 폴리테트라플루오로에틸렌 디스크 필터 (Millex-LG; Millipore 사 제조)를 통해 여과하였다. 측정은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 수행하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.

용해도 시험
시험 용액	pH	용해도 (㎍/ml)
시험 용액	pH	결정 형태 II	결정 형태 III
정제수	-	0.5	< 0.1
일본 약국방 제1액체¹⁾	1.2	0.9	< 0.1
일본 약국방 제2액체²⁾	6.8	5.8	2.4
McIlvaine³⁾	2.2	1.9	< 0.1
	4	0.8	< 0.1
	5	0.4	< 0.1
	6	1.0	0.7
	6.8	6.3	0.7
	8	84	23
¹⁾ 일본 약국방, 일반 시험 방법, 붕괴 시험 방법, 제 1 액체. 염산 (7.0 ml) 및 물을 염화나트륨 (2.0 g)에 첨가하여 1000 ml의 양으로 만든다. 이 용액은 투명하고 무색이며 pH는 약 1.2이다. ²⁾ 일본 약국방, 일반 시험 방법, 붕괴 시험 방법, 제 2 액체. 0.2 몰/L 수산화나트륨 시료 (118 ml) 및 물을 0.2 몰/L 인산칼륨이나트륨 시료 (250 ml)에 첨가하여 1000 ml의 양으로 만든다. 이 용액은 투명하고 무색이며 pH는 약 6.8이다. ³⁾ 인산수소이나트륨과 시트르산을 주어진 비율로 혼합하고 주어진 pH로 조정하여 수득한 McIlvaine 완충액.

상술한 결과로부터, 결정 형태 II가 결정 형태 III보다 용해도가 더 높다는 것이 확인되었다.

5. 안정성 시험

각 시료의 안정성 시험을 하기 보존 조건 하에서 수행하였다. 결정 형태 I의 결과를 표 5에 나타내고, 결정 형태 II의 결과를 표 6에 나타내고, 결정 형태 III의 결과를 표 7에 나타내었다.

표 6 및 표 7에 나타난 바와 같이, 결정 형태 II 및 결정 형태 III은 초기 시료에 비해 모든 보존 조건 하에서 시험 결과에 아무런 차이를 나타내지 않았다. 반면, 표 5에 나타난 바와 같이, 결정 형태 I은 보존 조건 #3 (80℃, 열린 용기 내에서 3 일간 보존) 및 보존 조건 #5 (60℃, 열린 용기 내에서 3 주간 보존) 하에서 보존한 후의 시료로부터 수득한 X-선 분말 회절 패턴에 변화를 나타내었고, 결정 형태 I의 X-선 분말 회절 패턴은 결정 형태 II로부터 유래한 X-선 분말 회절 패턴과 겹치는 것으로 관찰되었다. 따라서 시료의 일부가 보존 중에 결정 형태 II로 결정 전이를 나타낸 것으로 평가되었다. 결정 형태 I의 보존 조건 #1-6 하의 시료 보존 시료의 X-선 분말 회절 패턴을 도 2에 나타내었다.

결정 형태 I의 안정성 시험 결과
보존 조건		외관	순도	XRD	열분석
1	초기	-	99.1%	결정 형태 I의 회절 패턴	흡열 피크 (외삽 개시 온도 150.3℃)
2	80℃ 닫힌 용기 3일간 보존	외관에 변화 없음	99.1%	회절 패턴에 변화 없음	DSC 곡선에 변화 없음
3	80℃ 열린 용기 3일간 보존	외관에 변화 없음	99.1%	결정 형태 I과 결정 형태 II의 회절 패턴 중복	DSC 곡선에 변화 없음
4	60℃ 닫힌 용기 3주간 보존	외관에 변화 없음	99.1%	회절 패턴에 변화 없음	DSC 곡선에 변화 없음
5	60℃ 열린 용기 3주간 보존	외관에 변화 없음	99.1%	결정 형태 I과 결정 형태 II의 회절 패턴 중복	DSC 곡선에 변화 없음
6	60℃/75% R. H. 열린 용기 3주간 보존	외관에 변화 없음	99.1%	회절 패턴에 변화 없음	DSC 곡선에 변화 없음
R. H. : 상대 습도 XRD: X-선 분말 회절분석법

결정 형태 II의 안정성 시험 결과
보존 조건		외관	순도	XRD	열분석
1	초기	-	98.9%	결정 형태 II의 회절 패턴	흡열 피크 (외삽 개시 온도 151.2℃)
2	80℃ 닫힌 용기 3일간 보존	외관에 변화 없음	98.9%	회절 패턴에 변화 없음	DSC 곡선에 변화 없음
3	80℃ 열린 용기 3일간 보존	외관에 변화 없음	98.8%	회절 패턴에 변화 없음	DSC 곡선에 변화 없음
4	60℃ 닫힌 용기 3주간 보존	외관에 변화 없음	98.9%	회절 패턴에 변화 없음	DSC 곡선에 변화 없음
5	60℃ 열린 용기 3주간 보존	외관에 변화 없음	98.8%	회절 패턴에 변화 없음	DSC 곡선에 변화 없음
6	60℃/75% R. H. 열린 용기 3주간 보존	외관에 변화 없음	98.9%	회절 패턴에 변화 없음	DSC 곡선에 변화 없음
R. H. : 상대 습도 XRD: X-선 분말 회절분석법

결정 형태 III의 안정성 시험 결과
보존 조건		외관	순도	XRD	열분석
1	초기	-	98.71%	결정 형태 III의 회절 패턴	흡열 피크 (외삽 개시 온도 162.1℃)
2	80℃ 닫힌 용기 3일간 보존	외관에 변화 없음	98.68%	회절 패턴에 변화 없음	DSC 곡선에 변화 없음
3	80℃ 열린 용기 3일간 보존	외관에 변화 없음	98.69%	회절 패턴에 변화 없음	DSC 곡선에 변화 없음
4	60℃ 닫힌 용기 3주간 보존	외관에 변화 없음	98.67%	회절 패턴에 변화 없음	DSC 곡선에 변화 없음
5	60℃ 열린 용기 3주간 보존	외관에 변화 없음	98.66%	회절 패턴에 변화 없음	DSC 곡선에 변화 없음
6	60℃/75% R. H. 열린 용기 3주간 보존	외관에 변화 없음	98.65%	회절 패턴에 변화 없음	DSC 곡선에 변화 없음
R. H. : 상대 습도 XRD: X-선 분말 회절분석법

상술한 안정성 시험의 결과로부터, 각종 보존 조건 하에서 결정 형태 I은 불안정하나 결정 형태 II 및 결정 형태 III은 극히 안정하다는 것이 관찰되었다. 따라서 결정 형태 II 및 결정 형태 III이 의약품 등으로서의 용도에 바람직한 것이 입증되었다.

생물체에 의한 흡수성에 대해서는 결정 형태 II가 더 바람직하고, 결정 형태 III은 가장 안정한 결정체라는 이유로 더 바람직하다.

결정 형태 II 및 결정 형태 III은 둘 다 안정하므로, 이들의 혼합 결정체가 본 발명에 사용될 수 있다.

실험예

하기는 본 발명의 화합물 A의 결정체 또는 혼합 결정체의 HIV 인테그라아제저해 활성의 평가 방법을 설명한다.

(i) 재조합 인테그라아제 유전자 발현 시스템의 구축

HIV 인테그라아제 전장 유전자 (J. Virol., 67, 425-437 (1993))의 185번째 페닐알라닌을 히스티딘으로 치환하고, 플라스미드 pET21a(+) (Novagen 사 제조)의 제한효소 NdeI 및 XhoI 부위에 삽입함으로써, 인테그라아제 발현 벡터 pET21a-IN-F185H를 구축하였다.

(ii) 인테그라아제 단백질의 제조 및 정제

(i)에서 수득한 플라스미드 pET21a-IN-F185H로 형질변환된 대장균(Escherichia coli) 재조합 BL21 (DE3)을, 앰피실린을 함유하는 액체 배지 내에서 30℃에서 진탕 배양하였다. 배양이 대수증식기에 도달했을 때, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드를 첨가하여 인테그라아제 유전자의 발현을 촉진하였다. 배양을 3 시간 동안 계속하여 인테그라아제 단백질의 축적을 촉진하였다. 재조합 대장균을 원심분리에 의해 펠릿으로 수집하여 -80℃에서 보존하였다.

상기 대장균을 1M 염화나트륨 함유 분해완충액 (lysis buffer; 20 mM HEPES (pH 7.5), 5 mM DTT, 10 mM CHAPS, 10% 글리세롤)에 현탁시키고, 가압 및 감압을 반복하여 파열시키고, 4℃에서 40,000×g, 60 분으로 원심분리하여 수용성 분획 (상층액)을 회수하였다. 이를 염화나트륨이 없는 분해완충액으로 10 배 희석하고, SP-세파로오스 (Pharmacia 사 제조)와 혼합하고, 4℃에서 60 분간 교반하여 인테그라아제 단백질이 수지내로 흡수되게 하였다. 수지를 100 mM 염화나트륨 함유 분해완충액으로 세정하고, 1M 염화나트륨 함유 분해완충액으로 인테그라아제 단백질을 용출시켰다.

용출된 인테그라아제 단백질 용액을 겔 여과를 위해 Superdex 75 (Pharmacia 사) 칼럼에 적용하였다. 상기 단백질을 1M 염화나트륨 함유 분해완충액으로 용출시켰다.

수득한 인테그라아제 단백질 분획을 수집하고 -80℃에서 보존하였다.

(iii) DNA 용액의 제조

Greiner에 의해 합성된 하기 DNA를 TE 완충액 (10 mM Tris-염산 (pH 8.0), 1 mM EDTA)에 용해시키고, 공여자 DNA, 표적 DNA 및 각 상보성 가닥 (+ 및 - 가닥)과 혼합하여 1 μM가 되게 하였다. 상기 혼합물을 95℃에서 5 분간, 80℃에서 10 분간, 70℃에서 10 분간, 60℃에서 10 분간, 50℃에서 10 분간 및 40℃에서 10 분간 가열하고, 25℃에서 보존하여 이중가닥 DNA를 수득하고, 이를 시험에 사용하였다.

공여자 DNA (5' 말단에 비오틴이 붙은 - 가닥)

공여자 + 가닥: 5'-비오틴-ACC CTT TTA GTC AGT GTG GAA AAT CTC TAG CA-3' (서열번호 1)

공여자 - 가닥: 5'-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAC TGA CTA AAA G-3' (서열번호 2)

표적 DNA (3' 말단에 디곡시제닌이 부가된 +, - 가닥)

표적 + 가닥: 5'-TGA CCA AGG GCT AAT TCA CT-Dig-3' (서열번호 3)

표적 - 가닥: 5'-AGT GAA TTA GCC CTT GGT CA-Dig-3' (서열번호 4)

(iv) 효소 (HIV 인테그라아제) 저해 활성의 판단

공여자 DNA를 TE 완충액으로 10 nM로 희석하고, 이 중 50 ㎕를 스트렙타비딘 코팅된 마이크로타이터(microtiter) 플레이트 (Roche 사 제조)의 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 60 분 동안 흡착시켰다. 이어서 DNA를 0.1% Tween 20 함유 인산염 완충액 (Dulbecco PBS, Sanko Junyaku 사) 및 인산염 완충액으로 세정하였다. 이어서, 반응 혼합물 (70 ㎕, 조성에 대해서는 하기 * 참조), 반응 혼합물로 희석된 시험 물질 (10 ㎕), 및 100 ㎍/ml 인테그라아제 단백질 (10 ㎕)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 60 분간 반응시켰다.

이어서, 50 nM 표적 DNA (10 ㎕)를 첨가하고, 37℃에서 10 분간 반응시키고, 0.1% Tween 20 함유 인산염 완충액으로 세정하여 반응을 정지시켰다.

이어서, 100 mU/ml 퍼옥시다아제 표지된 항-디곡시제닌 항체 용액 (Roche 사 제조, 100 ㎕)을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 60 분간 반응시킨 후, 0.1% Tween 20 함유 인산염 완충액으로 세정하였다.

퍼옥시다아제 착색 용액 (BioRad 사 제조, 100 ㎕)을 첨가하고 실온에서 4 분간 반응시켰다. 1N 황산 (100 ㎕)을 첨가하여 상기 착색 반응을 정지시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

본 발명의 화합물 A의 HIV 인테그라아제 저해 활성 (IC₅₀)을 하기 식에 따른 저해율로부터 계산하였다. 결과를 표 8에 나타내었다.

저해율 (%) = [1-(대상 - 블랭크)/(대조 - 블랭크)]×100

대상: 시험 화합물의 존재 하에서의 웰의 흡광도

대조: 시험 화합물의 부재 하에서의 웰의 흡광도

블랭크: 인테그라아제 단백질의 부재 하, 시험 화합물의 부재 하에서의 웰의 흡광도

* 반응 혼합물의 조성: 30 mM 모르폴리노프로판설폰산 (MOPS), 5 mM MgCl₂, 3 mM 디티오트레이톨 (DTT), 0.1 mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA), 5% 글리세롤, 10% 디메틸 설폭사이드 (DMSO), 0.01% Tween 20

화합물 번호	효소 활성 IC₅₀ (μM)
화합물 A	0.0029

항바이러스 활성의 평가

본 발명의 화합물 A의 결정체 또는 혼합 결정체와 기존의 항-HIV제의 병용 효과를 하기 방식으로 구하였다.

예를 들면, 기존의 뉴클레오사이드 역전사효소 저해제 (지도부딘, 라미부딘, 테노포비어), 비-뉴클레오사이드 역전사효소 저해제 (에파비렌즈) 또는 단백질분해효소 저해제 (인디나비어, 넬피나비어)와 화합물 A의 결정체 또는 혼합 결정체 등의 두 가지 약제의 병용 효과를, HIV-1 IIIB로 감염된 CEM-SS 세포를 사용하여 XTT 방법으로 평가하였다.

또한, 화합물 A의 결정체 또는 혼합 결정체 , 지도부딘 및 라미부딘, 또는 화합물 A의 결정체 또는 혼합 결정체, 테노포비어 및 라미부딘 등의 세 가지 약제의 병용 효과를 평가하였다.

병용 시험 전에, 각 의약제 단독의 IC₅₀ 및 CC₅₀을 측정하였다. 이들 결과를 근거로 결정한 의약제 a의 농도 5 점, 및 의약제 b의 농도 9 점을 조합하여, 두 가지 약제의 병용 효과를 평가하였다. 세 가지 약제의 병용에 대해서는, 고농도 의약제 b 및 의약제 c를 혼합하고, 의약제 a와 상기 농도를 조합하여 평가하였다.

화합물 A의 결정체 또는 혼합 결정체 및 병용약물 단독의, 또는 그의 조합의 시험 결과를 Prichard 및 Shipman의 MacSynergy II 버전 2.01 및 Deltagraph 버전 1.5d의 프로그램에 의거하여 분석하였다.

3회 시험에서 수득한, 각 조합된 의약제의 농도에서의 % 저해율로부터, 95% (또는 68%, 99%) 신뢰성 한계로 3차원 플롯을 그리고, 그로부터 계산한 μM²% 수치를 근거로 병용 효과를 평가하였다. 평가 기준을 하기에 나타낸다.

상호작용의 정의 μM²%

강한 공동상승 작용 > 100

약간의 공동상승 작용 +51 - +100

부가적 작용 +50 - -50

약간의 길항 작용 -51 - -100

강한 길항 작용 < -100

상술한 특정 결정 형태를 갖는 본 발명의 화합물 A의 결정체는 항-HIV 효과를 비롯하여 월등한 결정 안정성을 나타낸다. 따라서 의약 조성물, 특히 AIDS의 예방 및/또는 치료를 위한 각종 의약 조성물의 출발 물질로서 유용하다.

본 출원은, 그 내용이 본원에 참조로서 인용된, 일본에서 출원된 특허출원 제 2004-150979 호를 기초로 한다. 특허, 특허출원 및 문헌을 포함한 본원에 언급된 모든 참고문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 인용되었다.

도 1 은 X-선 분말 회절 패턴의 복수 기록을 나타내는데, 상부 선은 결정 형태 III의 회절 패턴을 나타내고, 중간 선은 결정 형태 I의 회절 패턴을 나태내고, 하부 선은 결정 형태 II의 회절 패턴을 나타내며, 세로축은 회절 강도 (cps: 초당 횟수: 스케일 간격은 2500 cps임)를, 가로축은 회절각 2θ(°)을 나타낸다.

도 2 는 결정 형태 I의 안정성 시험에서 3일간의 보존 후에 샘플로부터 수득한 X-선 분말 회절 패턴의 복수 기록을 나타낸다. 비교를 위해, 최상부 선은 결정 형태 II의 회절 패턴 (초기 조건)을 나타내고, 최하부 선은 결정 형태 I의 회절 패턴 (초기 조건)을 나타낸다. 두 번째 선은 보존 조건 #6 (60℃/75% 상대습도, 열린 용기, 3 주간 보존), 보존 조건 #4 (60℃, 마개가 닫힌 용기, 3 주간 보존), 보존 조건 #5 (60℃, 열린 용기, 3 주간 보존), 보존 조건 #3 (80℃, 열린 용기, 3 일간 보존) 및 보존 조건 #2 (80℃, 마개가 닫힌 용기, 3일간 보존)하에서 회절 패턴을 나타낸다. 세로축은 회절 강도 (cps: 초당 횟수: 스케일의 간격은 2500 cps 임)를, 가로축은 회절각 2θ(°)를 나타낸다.

<110> Japan Tobacco Inc. <120> Stable Crystal of 4-Oxoquinoline Compound <130> 09765 <150> JP2004-150979 <151> 2004-05-20 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Donor plus strand for activity determination of HIV integrase. <400> 1 acccttttag tcagtgtgga aaatctctag ca 32 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Donor minus strand for activity determination of HIV integrase. <400> 2 actgctagag attttccaca ctgactaaaa g 31 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target plus strand for activity determination of HIV integrase. <400> 3 tgaccaaggg ctaattcact 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target minus strand for activity determination of HIV integrase. <400> 4 agtgaattag cccttggtca 20

Claims

X-선 분말 회절계로 측정했을 때 6.56, 13.20, 19.86, 20.84, 21.22, 25.22°의 회절각 2θ(°)에서 특징적인 회절 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는 6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-1-[(S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필]-7-메톡시-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산의 결정체 (결정 형태 II).
X-선 분말 회절계로 측정했을 때 8.54, 14.02, 15.68, 17.06, 17.24, 24.16, 25.74°의 회절각 2θ(°)에서 특징적인 회절 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는 6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-1-[(S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필]-7-메톡시-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산의 결정체 (결정 형태 III).
외삽 개시 온도(extrapolated onset temperature)가 162.1±5.0℃인 6-(3-클로로-2-플루오로벤질)-1-[(S)-1-하이드록시메틸-2-메틸프로필]-7-메톡시-4-옥소-1,4-디하이드로퀴놀린-3-카복실산의 결정체 (결정 형태 III).
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 결정체의 순도가 70% 이상인 결정체.
제 1 항의 결정체 및 제 2 항 또는 제 3 항의 결정체를 포함하는 혼합 결정 체.
제 5 항에 있어서, 결정체의 순도가 70% 이상인 혼합 결정체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 결정체 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 혼합 결정체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 의약 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 결정체 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 혼합 결정체를 활성 성분으로서 포함하는 인테그라아제 저해제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 결정체 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 혼합 결정체를 활성 성분으로서 포함하는 항바이러스제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 결정체 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 혼합 결정체를 활성 성분으로서 포함하는 항-HIV제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 결정체 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 혼합 결정체, 및 한 종류 이상의 기타 항-HIV 활성 물질을 활성 성분으로서 포함하는 항-HIV 조성물.
다른 항-HIV제와 함께 다중약물요법을 위한 항-HIV제로서, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 결정체 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 혼합 결정체를 활성 성분으로서 포함하는 항-HIV제.