KR20030020230A - 폴리하이드록시알카노에이트에 의하여 피복된 리포솜 및그 제조방법 - Google Patents

폴리하이드록시알카노에이트에 의하여 피복된 리포솜 및그 제조방법 Download PDF

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Abstract

리포솜의 약제 유지 능력 및 서방성(徐放性, sustained releasability)의 양자와 폴리하이드록시알카노에이트의 기계적인 강도를 가지고, 친유성 약제 및 그 외 소수성 물질 뿐만 아니라 친수성 약제 및 그 외 수용성 물질에 대하여 보유성이 뛰어나고 서방성을 제어할 수 있는, 구조체를 제공하는 데 있다.
리포솜의 외벽의 적어도 일부를 폴리하이드록시알카노에이트에 의하여 피복하는 데 있다.

Description

폴리하이드록시알카노에이트에 의하여 피복된 리포솜 및 그 제조방법{LIPOSOME COATED WITH POLYHYDROXYALKANOATE AND PRODUCTION METHOD THEREOF}
본 발명은 캡슐화된 물질의 서방성(徐放性, sustained releasability)을 제어하여, 고도로 안정한 막을 가지고 생체에 뛰어나게 적합한 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜과 그 제조방법에 관한 것이다.
지질을 수중에 분산시켰을 때에 형성되는 리포솜은, 모델로서 세포막 구조와 매우 가깝게 근접하고 조직 지향성 약제 운반제, 인공 적혈구, 세포 수복제 또는 효소 고정화 기제등의 의약용 재료로서 적극적인 이용이 기대된다. 또한, 의학 및 약학의 분야 뿐만 아니라, 화장품 영역에 있어서도 안정성에 문제가 있는 유효 성분을 환부에 선택적으로 운반하고, 단계적인 방출을 제어하는 물질로서 기대된다. 리포솜은 상기에 언급한 바와 같이 매우 광범위한 응용을 발견하지만, 막 구조에서 그것의 취약성이 지적되었다. 즉, 막을 형성하는 물질인 지질의 화학적 또는 물리적인 변화는 함유된 물질의 점차적인 누출을 유발하여 막을 파괴하고, 목적 세포로의 약제 운반을 충분하게 향상시킬수 없었다. 종래에는, 리포솜 막을 강화하는 방법으로, 막에 스핑고미엘린을 첨가함으로써 수소결합을 가지는 막을 제공하여 막을 강화하는 방법 및 토코페롤 등을 첨가함으로써 불포화 지질의 산화를 방지하는 방법이 알려져 있다.
따라서, 고도로 안정한 리포솜막을 가지는 리포솜과 그 제조방법은 리포솜막을 안정화하고, 내부에서의 뛰어난 약제 보유와 목적 세포로의 약제의 단계적인 방출을 달성하기 위하여 요구된다.
종래에는, 생리적 조건하에서 리포솜의 기계적인 강도를 향상하고, 막이 약제를 단계적으로 방출하는 것을 제어하도록 하기 위하여, 일본국 특개평 06-178930호 공보는 막의 표면이 2-메타아크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 또는 2-메타아크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린의 공중합체 및 단량체로 피복함으로써 형성된 리포솜 막을 제안한다.
또한, 일본국 특개평 06-298638호 공보는 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 또는 브라시카스테롤을 포함하는 스테롤 및/또는 스테롤 글루코사이드로 피복된 리포솜을 제안한다.
한편, 인지질 이외의 생분해성이고 생체적합한 물질로서 폴리하이드록시알카노에이트를 이용하여, 내부에 약제를 함유하는 캡슐의 형성의 일예로서, 미국 특허 제6,146,665호 공보는 폴리하이드록시알카노에이트로 형성된 다공성 과립에 친수성 약제를 포함하는 미립자로 구성된 약제조성, 또는 핵심 물질로서 친유성 약제가 용해된 기름 방울을 폴리하이드록시알카노에이트로 구성된 피막에 담지한 약제조성의 제조방법을 개시한다.
그러나, 일본국 특개평 06-178930호 공보에 개시된 것으로서, 2-메타아크릴로일옥시에틸포스포릴콜린(MPC)의 단독 중합체 또는 2-메타아크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린 및 단량체의 공중합체에 의하여 피복됨으로써 형성된 리포솜은, 기계적 강도에 있어서 각각 향상되었지만, 강도가 반드시 충분하지는 않았을 뿐만 아니라 생체적합성에 있어서 뛰어난 것은 아니다.
또한, 미국 특허 제6,146,665호 공보에 개시된 것으로서, 폴리하이드록시알카노에이트에 의하여 형성된 다공성 과립에 친수성 약제를 포함하는 미립자는 독성이 없고, 생분해성을 가지고, 인 시츄(in situ)에서 약제를 포함할 수 있지만, 그것의 다공성의 구조로 인하여 친수성 약제가 즉시 분산하게 되어, 단계적인 방출의 제어를 곤란하게 한다.
본 발명의 목적은, 상기 언급한 종래의 기술의 문제를 고려하여, 리포솜의 약제 보유 능력 및 약제 서방성(sustained drug releasability) 양자와 폴리하이드록시알카노에이트의 기계적 강도를 가지는, 친수성 약제 및 그 외 수용성 물질과, 친유성 약제 및 그 외 소수성 물질에 대한 보유 특성이 뛰어나고 단계적인 방출을 제어할 수 있는 구조체를 제공하는 데 있다.
도 1a, 1b 및 1c는 본 발명의 PHA 피복 리포솜의 제조방법의 일예의 흐름도.
도 2는 실시예 1에 대한 PHA 피복 리포솜의 외피의 GC-MS분석에 의한 결과를 나타내는 도면.
도 3은 실시예 2에 대한 PHA 피복 리포솜의 외피의 GC-MS분석에 의한 결과를 나타내는 도면.
도 4는 실시예 3에 대한 PHA 피복 리포솜의 외피의 GC-MS분석에 의한 결과를 나타내는 도면.
도 5는 실시예 6에 대한 25℃ 및 42℃에서 PHA 피복 리포솜 및 PHA에 의하여 피복되어 있지 않은 리포솜으로부터 칼세인의 방출 거동을 시간의 함수로서 나타내는 도면.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1: 리포솜2: 리포솜내에 담지된 수용성 물질
3: 리포솜막에 담지된 지용성 물질
4: 리포솜에 고정화된 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소
5: 폴리하이드록시알카노에이트
6: 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜으로부터 칼세인의 방출 거동
7: 폴리하이드록시알카노에이트에 의하여 피복되어 있지 않은 리포솜으로부터 칼세인의 방출 거동
상기 언급한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리하이드록시알카노에이트에 의하여 외벽의 적어도 일부가 피복된 사실을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을 제공한다.
본 발명에 있어서 리포솜은, 지질, 특히 인지질 단독으로 또는 인지질 및 스테롤로 구성된 단층 리포솜 또는 다층 리포솜을 말하고, 그 제조방법으로서는 종래에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
리포솜에 담지되는 물질은 수용성 물질 또는 지용성 물질이어도 된다. 구체적으로 언급하면 수용성 물질은 리포솜의 내부에, 그리고 지용성 물질은 리포솜의 막에 존재한다. 또한, 이들 물질은 리포솜의 막표면에 화학적으로 또는 물리적으로 흡착된다. 본 발명에서 상기 언급한 세가지 경우, 즉, "보유; 내부에의 보존", "보유; 막에의 보존" 및 "보유: 막표면에의 흡수"는 모두 "담지"로 정의한다. 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 불안정한 물질과, 신체에 단계적으로 방출되거나 또는 특정 장기에서 즉시 분포되는 것이 기대되는 약제 이외에 생체내에 주입하였을 때 물질이 효과적일 경우, 본 발명에서 리포솜에 의하여 보유되는 이들 물질은 특히 제한되어 있지 않고 마커, 플라스미드, DNA 및 RNA를 포함한다.
본 발명자들은 리포솜의 막에 폴리하이드록시알카노에이트를 합성하는 효소(이하, "폴리하이드록시알카노에이트 신테아제" 또는 "PHA 신테아제"로 칭함)를 고정하고, 3-하이드록시아실 조효소 A를 첨가하고, 그것을 반응시킴으로써 리포솜을 폴리하이드록시알카노에이트에 의하여 피복할 수 있다는 사실과, 상기 경우에서 리포솜의 외부면을 적당한 종류의 3-하이드록시아실 조효소 A를 선택한 결과로서 독성이 없고 생분해성을 가지는 폴리하이드록시알카노에이트로 피복할 수 있다는 사실과, 또한 폴리하이드록시알카노에이트로 리포솜의 막의 적어도 일부를 피복함으로써 물리적 및 기계적 강도가 증가하는 특성과 담지된 물질의 서방성의 제어능을리포솜에 부여할 수 있다는 사실을 발견하였다. 그것에 의하여 본 발명은 완성되었다.
본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜은 폴리하이드록시알카노에이트로 외벽의 적어도 일부가 피복되는 특징을 가진다. 또한, 본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜은 외벽의 적어도 일부가 폴리하이드록시알카노에이트로 피복된 구조에서 인지질의 지질 이분자 막을 피막으로 가지는 구조를 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 있어서 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜은 리포솜 내부의 지질 이외의 물질들을 둘러싸는 특징을 가진다.
리포솜 외벽의 적어도 일부가 폴리하이드록시알카노에이트로 피복된 본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법은 수성배지에 분산된 리포솜의 표면에 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 고정하고, 기질로서 3-하이드록시아실 CoA를 첨가하고, 폴리하이드록시알카노에이트 합성에 의하여 리포솜 표면의 적어도 일부를 폴리하이드록시알카노에이트로 피복하는 공정을 포함한다.
본 발명에서 리포솜은 리포솜 표면의 적어도 일부에 폴리하이드록시알카노에이트로 피복된 구조를 가지고, 리포솜의 목적으로 하는 특성을 얻는 한, 전체 표면이 피복될 필요는 없다. 본 발명에 관한 구조체에서, 전체 표면의 피복은, 폴리하이드록시알카노에이트의 피복층이 피막을 구성하고 핵심물질로서 액체를 가지는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 마이크로캡슐을 가능하게 한다.
본 발명의 PHA로 피복된 리포솜은 생체적합성이 뛰어나고, 고도로 안정한 막을 가지고, 담지된 물질의 서방성을 제어할 수 있다. 본 발명의 PHA로 피복된 리포솜은 색소 담지 리포솜, 염료 담지 리포솜, 농예 화학제 담지 리포솜, 헤모글로빈 담지 리포솜, 화장품 원료 담지 리포솜, 비료 성분 담지 리포솜 및 의약 성분 담지 리포솜 등의 다양한 응용을 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 및 다른 목적, 효과, 특징 및 이점은 하기의 실시예의 설명과 그 수반하는 도면을 함께 든 것으로부터 보다 명확해 질 것이다.
여기서, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜에 대하여 폴리하이드록시알카노에이트로 피복되기 이전의 리포솜은, 리포솜의 제조방법으로서 일반적으로 알려져 있는 종래의 제조방법에 의하여 제조될 수 있다. 즉, 발명에서 이용되는 인지질로는 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS), 포스파티드산(PA), 포스파티딜이노시톨(PI) 및 스핑고미엘린(SPM)을 들 수 있고; 한 종류 또는 복수 종류의 조합을 사용할 수 있다. 또한, 인지질은 물-첨가 인지질 및 효소-처리 인지질을 포함할 수 있다. 인지질은 합성된 것, 알 및 대두 등의 천연물로부터 얻은 것, 또는 상업적으로 이용되는 것이어도 된다.
콜레스테롤 및 인지질은 리포솜의 지질 이분자 막의 강도 및 투과성을 형성하기 위하여 조합될 수 있다. 사용되는 인지질 대비 콜레스테롤의 비율은 담지된 물질의 지질 친화성에 의존하여 다양할 수 있는 반면에, 콜테스테롤:인지질의 몰비는 1:3 내지 1:1로 예시할 수 있다. 인지질로 형성된 지질 이분자 피막을 가지는 리포솜은 리포솜 제조방법으로서 일반적으로 알려져 있는 종래의 제조방법에 의하여 준비할 수 있다. 즉, 잘 알려진 기술로 뱅험씨 등의 방법(Bangham et al. 문헌「J. Mol. Biol., 13, 238(1965)」), 그 변법(일본국 특개소 52-114O13호 공보, 특개소 59-173133호 공보, 특개평 2-139029호 공보, 특개평 7-241487호 공보), 초음파처리법(문헌「Biochem. Biophys. Res. Commun., 94, 1367(1980)」), 에탄올 주입법(문헌「J. Cell. Biol., 66, 621(1975)」), 프렌치 프레스법(문헌「FEBS Lett., 99, 210(1979)」), 에테르 주입법(문헌「N. Y. Acad. Sci., 308, 250(1978)」), 콜산(계면활성제)법(문헌「Biochim. Biophys. Acta, 455, 322(1976)」), 칼슘 융합법(문헌「Biochim. Biophys. Acta, 394, 483(1978)」), 동결 융해법(문헌「Arch. Biochem. Biophys., 212, 186(1981)」), 역상 증발법(문헌「Pro. N. A. S. USA, 75, 4194(1978)」), 유리 필터에 의한 방법(문헌「Third US-Japan Symposium on Drug Delivery System(1995)」) 및 코트솜 등의 시판하는 킷을 이용한 방법 등을 들 수 있다. 이들의 잘 알려진 방법에 의하여 제조된 리포솜은 모두 본 발명에 제공될 수 있다.
뱅험씨 등(Bangham et al.)에 의하여 보고된 리포솜 제조방법은 클로로포름 등의 유기용매에 인지질을 용해하고; 가지형 플라스크에 결과 용액을 넣고; 로타리 증발기를 사용하여 진공하에서 용매를 제거함으로써, 플라스크의 바닥 유리벽의 표면에 인지질의 얇은 막을 형성하는 것을 포함한다. 담지되기 위한 물질을 함유하는 완충제 수용액을 결과물에 교반하면서 첨가하여, 막을 팽윤시키고; 그 후, 다층막 리포솜을 얻기 위하여 볼텍스 등의 수단에 의해 얇은 막을 기계적으로 벗겨낸다. 팽윤은 인지질의 상전이 온도 보다 1O℃만큼 높은 온도에서 시행하여야 한다. 이러한 방법에 의하여 제조된 다층막 리포솜은 0.2㎛ 내지 5㎛의 크기 분포를 가진다. 분포를 가능한 한 작게 하는 것이 요구될 경우, 교반을 격렬하게 오랜시간 수행하거나 또는 리포솜에 5 내지 10W의 저출력을 가지는 초음파로 단시간 방사해도 된다.
초음파처리법에 의하여 리포솜을 제조하는 방법으로, 뱅험씨 등의 방법에 의하여 제조된 다층막 리포솜의 현탁액에 고출력 초음파를 부가하여 방사하는 것을 들 수 있다. 초음파 방사는 단계적으로 크기를 축소시키고 최종적으로 20 내지 30nm의 지름을 가지는 작은 단층막 리포솜을 얻는다. 초음파 방사는 인지질 분자의 화학적인 분해나 용해된 산소에 의한 지질의 산화를 유발하는 경향이 있기 때문에, 질소, 아르곤 등의 불활성 가스 기류내에서 조작하고, 과다하게 온도를 높이지 말아야 한다.
에탄올 주입법에 의하여 리포솜을 제조하는 방법으로, 지질을 에탄올에 용해하고, 상전이 온도 혹은 그 이상에서 마이크로시린지를 사용하여 담지되기 위한 물질을 함유하는 완충제 수용액에 결과 용액을 주입하는 것을 들 수 있다. 제조된 리포솜은 작은 단층막 리포솜이다. 그것의 크기는 지질의 농도에 의존하여 다양하다. 약 30㎚의 지름을 가지는 리포솜은 저지질 농도(3mM)에서 얻어지고, 고지질 농도(36mM)에서는 약 110nm의 리포솜이 얻어진다. 이 방법은 초음파처리를 수반하지 않기 때문에, 불안정한 물질을 담지하는데 적합하다. 그러나, 리포솜이 희석되므로, 어떤 경우에 있어서는 초여과법 등에 의한 농축 조작이 요구된다. 또한, 리포솜으로부터 에탄올을 완벽하게 제거하지 못한다는 단점도 있다.
프렌치 프레스법에 의하여 리포솜을 제조하는 방법은, 뱅험씨 등의 방법에 의하여 제조한 다층막 리포솜을 프렌치 프레스 셀에 넣고, 단층막 리포솜을 형성하기 위하여 약 20,000psi의 압력에서 리포솜을 압축하고 이 조작을 반복함으로써, 약 30 내지 50nm의 지름을 가지는 작은 단층막 리포솜을 얻는 것으로 구성된다. 이 방법은 초음파 처리를 포함하지 않기 때문에, 불안정한 물질을 담지하는데 적합하다. 또한, 낮은 압력의 적용이 약 50 내지 150nm의 지름을 가지는 단층막 리포솜을 형성한다.
에테르 주입법에 의하여 리포솜을 제조하는 방법으로, 인지질을 디에틸 에테르 또는 디에틸 에테르와 메탄올의 혼합 용매에 용해하고, 결과 용액을 담지되기 위한 물질을 함유하는 완충제 수용액에 주입하고, 용매를 제거하는 것을 포함한다. 유기 용매는 수용액을 55℃ 내지 65℃에서 가열함으로써 또는 그것을 감압하에서 30℃로 유지함으로써 제거한다. 에테르 주입법은 큰 단층막 리포솜을 형성할 수 있다.
콜산(계면활성제)법에 의하여 리포솜을 제조하는 방법으로, 뱅험씨 등의 방법에 의하여 제조된 지질막이나 다층막 리포솜 또는 다른 방법에 의하여 제조된 작은 단층막 리포솜을 콜산 또는 디옥시콜산 등의 계면활성제와 혼합하고, 혼합액로부터 계면활성제를 제거함으로써, 비교적 큰 사이즈의 단층막 리포솜(30 내지 180nm)을 제조하는 것을 들 수 있다. 계면활성제를 제거하기 위하여 투석이나 겔여과법이 사용될 수 있다. 형성된 리포솜의 크기는 지질과 계면활성제의 비, 콜레스테롤의 함유량, 투석 속도 등에 의존한다. 이 방법에서는, 리포솜의 이중층에서 계면활성제의 제거율을 어떻게 낮추는지가 중요하다. 그러므로 장시간의 투석 또는 여러번의 반복적인 겔 여과가 요구된다.
칼슘 융합법에 의하여 리포솜을 제조하는 방법으로, 막의 융합을 야기하기 위하여 다른 방법에 의하여 제조된 산성 인지질을 함유하는 리포솜에 칼슘 이온을 첨가하고, 이어서 칼슘을 제거하기 위하여 EDTA 등의 킬레이트제를 첨가함으로써, 큰 단층막 리포솜(200 내지 1000nm)을 제조하는 것을 들 수 있다. 이 방법은 포스파티딜세린(PS) 및 포스파티드산(PA) 등의 산성 인지질 및 그 혼합된 리포솜에 한정된다.
동결 융해법에 의하여 리포솜을 제조하는 방법은, 초음파에 의하여 처리된 리포솜 용액을 액체 질소로 동결하고, 약 실온 정도에 방치해둠으로써 용액을 해동하고, 이어서 얻어진 유백색의 현탁액을 단시간 초음파로 처리하는 것을 포함한다. 50 내지 500nm의 지름을 가지는 큰 단층막 리포솜이 제조된다. 이 방법은 동결하는 동안의 농축 효과때문에 유지 효율이 향상된다는 이점이 있다.
역상 증발법에 의하여 리포솜을 제조하는 방법은 인지질의 에테르 용액에 물을 첨가하고, w/o형 에멀젼을 형성하기 위하여 초음파에 의한 처리를 하고, 에테르를 제거하고, 볼텍스에 의하여 에멀젼을 교반하여 상의 역전을 야기하고, 또한 감압하에서 에테르를 제거함으로써 큰 단층막 리포솜(200 내지 1000nm)을 제조하는 것을 포함한다. 리포솜의 크기는 지질의 조성 및 수용액의 이온 강도에 의하여 영향을 받는다; 콜레스테롤의 첨가는 크기를 확대하고, 이온 강도의 증가는 크기를 축소시킨다. 상기 언급한 리포솜에 담지되는 물질은 본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 용도에 의존하여 적절하게 선택된다.
본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜은 지질을 제외한 물질을 리포솜 내부에 바람직하게 둘러싼다.
본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을, 예를 들면, 농예 화학제용 리포솜으로서 이용하는 경우에, 문헌「Agricultural Chemicals Handbook(일본국 식물 방역 협회 발행)」에 기재되어 있는 것이면 어떤 물질이든 리포솜내에 담지되는 물질로서 사용할 수 있다. 일예로 카바메이트계 살충제, 유기 인계 살충제, 피레스테로이드계 살충제, 우레아계 살충제, 아닐리드계 살충제, 아졸계 살충제 및 디카르복실이미드계 살충제를 들 수 있다. 이들 화학물은 필요에 따라서 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 농예 화학 활성 성분을 담지한 리포솜은 초음파 처리법, 에탄올 주입법, 프렌치 프레스법, 에테르 주입법, 콜산(계면활성제)법, 칼슘 융합법, 동결 융해법, 역상 증발법, 유리 필터를 사용하는 방법 및 코트솜 등의 시판하는 킷을 이용하는 방법 등 상기 언급한 방법에 의하여 제조될 수 있다.
본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을, 예를 들면, 비료 조성물용 리포솜으로서 이용하는 경우에 리포솜 내에 담지되는 물질로, 황산 암모늄, 염화 암모늄, 질산 암모늄, 요소, 아세트알데히드 암모늄 축합 요소 또는 이소부틸알데하이드 축합 요소 등의 질소비료 수용액과; 과인산 석회, 중과인산 석회 또는 용해된 인산 비료 등의 인산비료 수용액과; 황산 칼륨 또는 염화 칼륨 등의 칼륨계 비료 수용액과; 생선찌꺼기, 뼈가루, 대두과자 또는 평지씨 깻묵 등의 유기비료 수성 현탁액과; 인산 암모늄 또는 인산 칼륨 등의 삼요소계 복합비료 수용액과; 미량 요소 복합비료 수용액을 들 수 있다. 이들 화학물은 필요에 따라서 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 비료 성분을 담지하는 그러한 리포솜은 초음파 처리법, 에탄올 주입법, 프렌치 프레스법, 에테르 주입법, 콜산(계면활성제)법, 칼슘 융합법, 동결 융해법, 역상 증발법, 유리 필터를 사용하는 방법 및 코트솜 등의 시판하는 킷을 이용하는 방법 등 상기 언급한 방법에 의하여 제조될 수 있다.
본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을, 예를 들면, 화장료용 리포솜으로서 이용하는 경우에 리포솜 내에 담지되는 물질로, 보습 유지 성분과; 원료 약제 추출물과; 티로시나제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 리파아제 등의 효소와; 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 피리독살 및 리보플라빈 등의 비타민과; β-카로틴 빛 클로로필 등의 유기 색소와; 글리세린, 솔비톨, 요소, 유산, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 그것의 공중합체 및 글리콜 유도체 등의 보습 성분과; 파라핀, 스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 스쿠알렌, 실리콘 오일 및 스테아린 등의 피부 연화성분과; 트리트먼트 성분과; 비듬 억제 성분과; 양모제와; 발모 성분과; 자외선 흡수제와; 산화 방지제와; 향료를 들 수 있다. 이들 화학물은 필요에 따라서 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 화장료 성분을 담지하는 리포솜은 초음파 처리법, 에탄올 주입법, 프렌치 프레스법, 에테르 주입법, 콜산(계면활성제)법, 칼슘 융합법, 동결 융해법, 역상 증발법, 유리 필터를 사용하는 방법 및 코트솜 등의 시판하는 킷을 이용하는 방법 등 상기 언급한 방법에 의하여 제조될 수 있다.
본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을, 예를 들면, 인공 적혈구용 리포솜으로서 이용하는 경우에 리포솜 내에 담지되는 물질로, 헤모글로빈 및 헤모시아닌을 들 수 있다. 이들 화학물은 필요에 따라서 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 헤모글로빈을 담지하는 리포솜은 초음파 처리법, 에탄올 주입법, 프렌치 프레스법, 에테르 주입법, 콜산(계면활성제)법, 칼슘 융합법, 동결 융해법, 역상 증발법, 유리 필터를 사용하는 방법 및 코트솜 등의 시판하는 킷을 이용하는 방법 등 상기 언급한 방법에 의하여 제조될 수 있다.
본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을, 예를 들면, 잉크 또는 페인트용 리포솜으로서 이용하는 경우에 리포솜 내에 담지되는 물질로 염료 수용액 및 안료 분산액을 들 수 있고, 보다 구체적으로 C. I. 산성 레드 52, C. I. 산성 블루 1, C. I. 산성 블랙 2 및 C. I. 산성 블랙 123 등의 산성염료와; C. I. 염기성 블루 7 및 C. I. 염기성 레드 1 등의 염기성 염료와; C. I. 다이렉트 블랙 19 및 C. I. 다이렉트 블루 86 등의 다이렉트 염료와; C. I. 용매 블랙 7, C. I. 용매 블랙 123, C. I. 용매 레드 8, C. I. 용매 레드 49, C. I. 용매 레드 100, C. I. 용매 블루 2, C. I. 용매 블루 55, C. I. 용매 블루 70, C. I. 용매 그린 3, C. I. 용매 옐로우 21, C. I. 용매 옐로우 61, C. I. 용매 오렌지 37, C. I. 용매 바이올렛 8, 용매 바이올렛 21 등의 유용성 염료와; C. I. 반응성 옐로우 15, C. I. 반응성 옐로우 42, C. I. 반응성 레드 24, C. I. 반응성 레드 218, C. I. 반응성 블루 38 및 C. I. 반응성 블루 220 등의 반응성 염료와; 탄소 블랙, 산화구리, 이산화 망간, 아닐린 블랙, 활성탄소, 비자기 페라이트 및 마그네타이트 등의 검은색안료와; 크롬 옐로우, 아연 옐로우, 산화 옐로우, 카드뮴 옐로우, 미네랄 패스트 옐로우, 니켈 티탄 옐로우, 네벌스 옐로우, 나프톨 옐로우 S, 한자 옐로우 G, 한자 옐로우 10G, 벤지딘 옐로우 G, 벤지딘 옐로우 GR, 퀴놀린 옐로우 레이크, 퍼머넌트 옐로우 NCG 및 털트라딘 레이크 등의 황색 안료와; 레드 크롬, 몰리브덴 오렌지, 퍼머넌트 오렌지 GTR, 피라졸론오렌지, 벌칸 오렌지, 벤지딘 오렌지 G, 인단스렌 브릴리언트 오렌지 RK 및 인단스렌 브릴리언트 오렌지 GK 등의 오렌지색 안료와; 레드 산화철, 카드뮴 레드 납, 머큐리 설페이트, 카드뮴, 퍼머넌트 레드 4R, 리톨 레드, 피라졸론 레드, 와칭 레드, 칼슘염, 레이크 레드 C, 레이크 레드 D, 브릴리언트 카민 6B, 브릴리언트카민 3B, 에옥신 레이크, 로다민 레이크 B 및 아리잘린 레이크 등의 적색 안료와; 밀로리 블루, 코발트 블루, 알칼리 블루 레이크, 빅토리아 블루 레이크, 프탈로시아닌 블루, 비금속 프탈로시아닌 블루, 부분적 염화 프탈로시아닌 블루, 패스트 스카이 블루 및 인단트렌 블루 BC 등의 청색 안료와; 망간 바이올렛, 패스트 바이올렛 B 및 메틸 바이올렛 레이크 등의 보라색 안료와; 산화 크로뮴, 크롬 그린, 색소 그린 B, 말라카이트 그린 레이크 및 파이날 옐로우 그린 G 등의 녹색 안료와; 징크 화이트, 산화 티타늄, 안티몬니 화이트 및 황화 아연 등의 백색 안료와; 바리타 파우더, 탄산바륨, 진흙, 실리카, 화이트 탄소, 탈크 및 알루미나 화이트 등의 체질 안료 등을 들 수 있다. 물론, 리포솜에 담지되는 물질이 이러한 것들로 한정되는 것은 아니다. 이들 물질은 필요에 따라 두가지 물질 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 잉크 성분을 담지하는 리포솜은 초음파 처리법, 에탄올 주입법, 프렌치 프레스법, 에테르 주입법, 콜산(계면활성제)법, 칼슘융합법, 동결 융해법, 역상 증발법, 유리 필터를 사용하는 방법 및 코트솜 등의 시판하는 킷을 이용하는 방법 등 상기 언급한 방법에 의하여 제조될 수 있다.
본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을, 예를 들면, 약제의 서방(sustained release)용 캡슐로서 이용하는 경우에, 리포솜 내에 담지되는 의약용 약제로 물에 쉽게 용해되는 약제 및 물에 천천히 용해되는(지용성) 약제을 들 수 있다. 이러한 약제들로는, 예를 들면, 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤 및 시토스테롤), 에스트로겐(예를 들어, 에스트론, 에스트라디올과 그 에스테르 및 에티닐 에스트라디올), 콜티코이드류 및 그 에스테르류, 칼시토닌 등의 펩티드 호르몬, 항생물질류(예를 들어, 겐타마이신, 반코마이신, 아미카신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 미노사이크린 및 테트라사이클린), 클로람페니콜, 마크로라이드 항생물질류(예를 들어, 에리트로마이신과 그 유도체, 특히 그 팔미테이트 또는 그 스테아레이드, 또는 스피라마이신), 항 기생균제류 및 피부용 약제류(예를 들어, 크로트리마졸, 미코나졸 및 디트라놀), 소염 진통제류(예를 들어, 인도메타신, 디크로페낙, 프럴비프로펜, 케토프로펜, 4-비페닐아세트산 및 그 에틸레이트), 시아노코발라민 등의 비타민류, 유로키나아제 등의 효소류 및 플루오루라실과 알라시티딘 등의 항암 약제류를 들 수 있다. 이들 화학물은 필요에 따라 두가지 물질 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 약제를 담지하는 리포솜은 초음파 처리법, 에탄올 주입법, 프렌치 프레스법, 에테르 주입법, 콜산(계면활성제)법, 칼슘 융합법, 동결 융해법, 역상 증발법, 유리 필터를 사용하는 방법 및 코트솜 등의 시판하는 킷을 이용하는 방법 등 상기 언급한 방법에 의하여 제조될 수 있다.
상기 언급한 방법에 의하여 제조된 리포솜은 폴리하이드록시알카노에이트에 의해 외벽의 적어도 일부를 피복함으로써 물리적, 기계적 강도를 증가시킬수 있고, 생체적합성 및 생분해성이 부여된다. 리포솜이 서방(sustained release) 특성을 가지는 경우, 그것은 서방성(sustained releasability)을 제어할 수 있다. 상기 언급한 리포솜을 폴리하이드록시알카노에이트로 피복하기 위한 방법을 하기에서 설명한다.
<PHA>
본 발명에서 이용 가능한 PHA는, PHA의 생합성 반응에 포함되는 PHA 합성 효소에 의하여 합성 될 수 있는 PHA이면 특별히 제한되어 있지 않다.
여기에서, PHA의 생합성은 기질인 알칸산으로부터 생체내에서 여러가지 대사 경로(예를 들면, β산화계 및 지방산 합성 경로)를 거치면서 생성된 (R)-3-하이드록시아실 CoA를 기질로서 사용하여 효소에 의한 중합 반응을 통하여 실행된다. 이 중합반응을 촉매하는 것이 PHA 합성 효소(또한, PHA 폴리머라제, PHA 신테아제와 같이 칭함)이다. 용어 "CoA"는 조효소 A (coenzyme A)의 약칭이고, 그 화학구조는 아래와 같다.
β산화계 및 PHA 합성 효소에 의한 중합 반응을 거쳐서 알칸산으로부터 PHA를 생산하는 반응을 하기에 도시한다.
한편, 반응이 지방산 합성 경로를 거쳐서 시행되는 경우, 경로내에서 생성된 (R)-3-하이드록시아실-ACP(ACP는 아실 커리어 단백질을 뜻한다)이 (R)-3-하이드록시아실 CoA로 변환된 것을 기질로서 사용하여 PHA 합성 효소에 의해 마찬가지로 PHA가 합성된다고 생각할 수 있다.
또한, 무세포계(in vitro)에서 PHA를 합성하기 위하여 상기에 설명한 PHB 합성 효소와 PHA 합성 효소를 세포 외부로 뽑아낼 수 있다는 것이 알려져 있고, 그 구체적인 일예를 하기에서 설명한다.
예를 들면, 문헌「Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6279-6283 (1995)」에는, 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus) 로부터 유래된 PHB 합성 효소에 3-하이드록시부티릴 CoA를 작용시킴으로써 3-하이드록시-n-부탄산 유닛을 포함하는 PHB를 성공적으로 합성하였다는 것이 보고되었다. 또한, 문헌「Int. J. Bio1. Macromo1., 25, 55-60 (1999)」에는, 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus) 로부터 유래된 PHB 합성 효소에 3-하이드록시부티릴 CoA과 3-하이드록시발레릴 CoA를 작용시킴으로써 3-하이드록시-n-부티르산 유닛 또는 3-하이드록시-n-발레르산 유닛을 포함하는 PHA를 성공적으로 합성하였다는 것이 보고되었다. 또한, 본 보고에 의하면, 라세믹 3-하이드록시부티릴 CoA를 효소에 작용시키는 경우, 효소의 입체 선택성에 의하여 단지 R 배열의 3-하이드록시-n-부티르산 유닛만을 포함하는 PHB가 합성되었다. 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus)로부터 유래된 PHB 합성 효소를 사용하여 세포 밖에서 PHB를 합성한 것이 또한 문헌「Macromo1. Rapid Commun., 21, 77-84 (2000)」에 보고되어있다. 또한, 문헌 「FEMS Microbio1. Lett., 168, 319-324(1998)」에는 크로마티움 비노섬(Chromatium vinosum)으로부터 유래된 PHB 합성 효소에 3-하이드록시부티릴 CoA를 작용시킴으로써 3-하이드록시-n-부티르산 유닛을 포함하는 PHB를 성공적으로 합성하였다는 것이 보고되었다. 문헌 「App1. Microbio1. Biotechno1., 54, 37-43(2000)」에는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonds aeruginosa)로부터 유래된 PHA 합성 효소에 3-하이드록시데카노일 CoA를 작용시킴으로써 3-하이드록시데칸산 유닛을 포함하는 PHA를 합성하였다는 것이 보고되었다.
이와 같이, PHA 합성 효소는 생물체 내의 PHA 합성 반응계에 있어서 최종 단계를 촉매하는 효소이고, 생물체 내에서 합성될 수 있는 것으로 알려진 어떤 PHA도 효소에 의한 촉매작용 하에서 합성된다. 따라서, 소망하는 PHA에 대응하는 3-하이드록시아실 CoA를 본 발명의 배지에 고정시킨 효소에 작용시킴으로써 생물체 내에서 합성될 수 있는 것으로 알려진 어떤 종류의 PHA를 가지고 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을 제조할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 PHA의 일예로서,
의 화학식[1]
(식중, 단량체 유닛은 하기 R1 및 a의 조합의 어느 것을 가지는 단량체 유닛,
R1이 수소원자(H)를 나타내고, a는 0 내지 10의 정수를 나타내는 단량체 유닛과;
R1이 할로겐 원자를 나타내고, a는 1 내지 10의 정수를 나타내는 단량체 유닛과;
R1이 발색단을 나타내고, a는 1 내지 10의 정수를 나타내는 단량체 유닛과;
R1이 카르복실기 또는 그 염을 나타내고, a는 1 내지 10의 정수를 나타내는 단량체 유닛과;
R1이
을 나타내고, a는 1 내지 7의 정수를 나타내는 단량체 유닛
으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나임)
의 화학식[2]
(식중, b는 0 내지 7의 정수를 나타내고, R2는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타냄),
의 화학식[3](식중, c는 1 내지 8의 정수를 나타내고, R3는 수소 원자(H),할로겐 원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타냄),
의 화학식[4](식중, d는 0 내지 7의 정수를 나타내고, R4는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타냄),
의 화학식[5](식중, e는 1 내지 8의 정수를 나타내고, R5는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5,-C3F7,-CH3, -C2H5및 -C3H7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타냄),
의 화학식[6](식중, f는 0 내지 7의 정수를 나타냄),
의 화학식[7](식중, g는 1 내지 8의 정수를 나타냄)
의 화학식[8](식중 h는 1 내지 7의 정수를 나타내고, R6는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -COOR', -SO2R'', -CH3, -C2H5,-C3H7,-CH(CH3)2및 -C(CH3)3로 구성된 군으로부터 선택되고, R'은 수소 원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5의 어느 것을나타내고, R''는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐 원자, -OCH3및 -OC2H5의 어느 것을 나타냄)
의 화학식[9](식중, i는 1 내지 7의 정수를 나타내고, R7은 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -COOR' 및 -SO2R''로 구성된 군으로부터 선택되고, R'은 수소 원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5의 어느 것을 나타내고, R''는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐 원자, -OCH3및 -OC2H5의 어느 것을 나타냄)
의 화학식[10](식중, j는 1 내지 9의 정수를 나타냄)
으로 표시되는 적어도 하나의 단량체 유닛을 포함하는 PHA를 구체적으로 도시할 수 있다.
또한, 상기 설명한 할로겐 원자의 일예로 플루오린, 클로린 및 브로민을 들 수 있다.
상기 PHA를 합성하기 위한 기질로서 사용하기 위하여 3-하이드록시아실 CoA의 구체적인 일예는,
의 화학식[12](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, R1과 a의 조합은 상기 설명한 식[1]으로 표시되는 단량체 유닛에서 R1과 a의 조합과 동일한 것으로서 정의됨)
의 화학식[13](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, b와 R2는 상기 설명한 화학식[2]로 표시되는 단량체 유닛에서 b와 R2와 동일한 것으로 각각 정의됨)
의 화학식[14](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, c와 R3은 상기 설명한 화학식[3]으로 표시되는 단량체 유닛에서 c와 R3과 동일한 것으로 각각정의됨)
의 화학식[15](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, d와 R4는 상기 설명한 화학식[4]로 표시되는 단량체 유닛에서 d와 R4와 동일한 것으로 각각 정의됨),
의 화학식[16](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, e와 R5는 상기 설명한 화학식[5]로 표시되는 단량체 유닛에서 e와 R5와 동일한 것으로 각각 정의됨)
의 화학식[17](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, f는 상기 설명한 화학식[6]으로 표시되는 단량체 유닛에서 f와 동일한 것으로 정의됨)
의 화학식[18](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, g는 상기 설명한 화학식[7]로 표시되는 단량체 유닛에서 g와 동일한 것으로 정의됨)
의 화학식[19](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, h와 R6은 상기 설명한 화학식[8]로 표시되는 단량체 유닛에서 h와 R6과 동일한 것으로 각각 정의됨)
의 화학식[20](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, i와 R7는 상기 설명한 화학식[9]로 표시되는 단량체 유닛에서 i와 R7과 동일한 것으로 각각 정의됨)
의 화학식[21](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, j는 상기 설명한 화학식[10]으로 표시되는 단량체 유닛에서 j와 동일한 것으로 정의됨)
으로 표시되는 3-하이드록시아실 CoA이어도 된다.
또한, 본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을 수성 배지에서 어느 정도 현탁되도록 사용하는 경우에, 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을 구성하는 PHA로서 친수성 작용기를 가지는 PHA를 이용한다. 친수성 작용기는 어떤 친수성 작용기이어도 되지만, 음이온성 작용기를 사용할 수 있고, 음이온성 작용기는 어떤 음이온성 작용기이어도 되지만, 특히 카르복실기를 사용할 수 있다. 카르복실기를 가지는 PHA의 일예는,
의 화학식[11](식중, k는 1 내지 10의 정수의 어느 하나를 나타냄)으로 표시되는 단량체 유닛으로 구성된 군으로부터 선택한 적어도 하나를 포함하는 PHA이어도 된다.
또한, 상기 PHA의 구체적인 일예로,
의 화학식[23]으로 표시되는 3-하이드록시피멜산을 포함하는 PHA이어도 된다.
또한, 상기 식[11]로 표시되는 PHA를 합성하기 위하여 기질로서 사용하기 위한 3-하이드록시아실 CoA의 일예는,
의 화학식[22](식중, SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, k는 하기 수치로 구성된 군으로부터 선택한 적어도 하나를 나타내고, 상기 설명한 식[11]으로 표시되는 단량체 유닛에서 k와 대응하고, k는 1 내지 10의 정수의 어느 하나를 표시함)
으로 표시되는 3-하이드록시아실 CoA이어도 된다.
또한, 상기 식[23]으로 표시되는 3-하이드록시피멜산을 포함하는 PHA를 합성하기 위한 기질로서 사용하기 위하여 3-하이드록시아실 CoA는
의 식[24]으로 표시되는 3-하이드록시피메릴 CoA이어도 된다.
또한, 상기 설명한 할로겐 원자의 구체적인 일예로 플루오린, 크로린 및 브로민을 들 수 있다. 또한, 상기 설명한 발색단은 그것의 3-하이드록시아실 CoA체가 PHA 합성효소의 촉매작용을 받을 수 있는 한 특별히 제한되어 있지는 않지만, 고분자를 합성하는 동안 일어날 수 있는 입체 장애를 고려할 경우, 3-하이드록시아실 CoA 분자에서 발색단과 CoA기가 그것에 결합한 카르복실기 사이에 탄소 원자를 1 내지 5개 가지는 메틸렌사슬인 것이 보다 바람직하다. 또한, 발색단의 광흡수파장이 가시역일 경우, 착색한 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을 얻을 수 있다. 그러한 발색단의 일예로, 니트로소, 니트로, 아조, 디아릴메탄, 트리아릴메탄, 크산텐, 아크리딘, 퀴놀린, 메틴, 다이아졸, 인다민, 인도페놀, 락톤, 아미노케톤, 하이드록시케톤, 스틸벤, 아진, 옥사진, 티아진, 안트라퀴논, 프탈로시아닌 및 인디고이드를 들 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 PHA로, 상기 설명한 단량체 유닛의 복수개를 각각 포함한 랜덤 공중합체 및 블록 공중합체가 또한, 각각의 단량체 유닛 및 포함하는 작용기의 특성을 사용하여 PHA의 특성을 제어하거나 복수의 기능을 부여하는 것을 가능하게 하므로, 작용기 간의 상호작용을 이용하여 새로운 기능 등을 실현할 수 있다. 또한, 기질로서 3-하이드록시아실 CoA을 첨가하는 데 있어서 적절한 첨가량 및 첨가순서를 선택함으로써 리포솜의 표면에 임의의 순서 및 조성의 블록 공중합체를 또한 합성할 수 있다. 또한 필요에 따라서, PHA를 합성하는 동안 또는 그 이후에, 화학적 수정 등을 형성해도 된다.
예를 들면, 기질로서 3-하이드록시아실 CoA의 종류나 농도 등의 조성을 시간의 흐름에 따라 변화시킴으로써, 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 안쪽에서 외측으로 내미는 방향으로 PHA의 단량체 유닛의 조성을 변화시킬수 있다. 그것에 의하여, 예를 들면, 리포솜에 대하여 낮은 친화성을 가지는 PHA로 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을 형성해야 하는 경우에, 먼저 리포솜에 대하여 높은 친화력을 가지는 PHA로 리포솜을 피복하고, 리포솜에 대하여 높은 친화력을 가지는 PHA의 단량체 유닛의 조성이, 예를 들면, 다층 구조 또는 그라디언트 구조를 형성하기 위하여 적층된 방향에서 원하는 PHA의 단량체 유닛의 조성으로 변화됨으로써, 리포솜과의 결합이 향상된 PHA피막을 형성할 수 있다.
또한, 다양한 특성을 개선한 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜에 PHA의 화학적인 수정을 제공할 수 있다. 예를 들면, PHA에 그라프트사슬의 도입은, 그라프트사슬에 부여된 다양한 특성을 가지는 PHA에 의하여 적어도 일부가 피복된 PHA-피복 리포솜 등의 폴리하이드록시알카노에이트를 포함하는 유기적인 구조체를 제공할 수 있다. 또한, PHA를 가교화 하는 것은, 다양한 물리화학적 성질(예를 들면, 기계적 강도, 화학물에 대한 내성 및 내열성)을 가지는 PHA에 의하여 적어도 일부가 피복된 PHA-피복 리포솜 등의 폴리하이드록시알카노에이트를 포함하는 유기적인 구조체를 제공할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 단어, "화학적인 수정(chemocal modification)"은, 고분자 기질의 분자 구조가, 고분자 기질의 분자내 또는 분자간의 화학적인 반응, 또는 고분자 기질과 다른 화학적 기질간의 화학적인 반응이 일어남으로써 변화되는 것을 의미한다. "가교화(crosslinking)"라는 단어는, 고분자 기질이 네트워크 구조를 형성하기 위하여 분자내 또는 분자간에 화학적으로 또는 물리적으로 결합되는 것을 의미한다. 또한, 가교제(crosslinking agent)는, 상기 가교화 반응을 실시하기 위하여 첨가되는 상기 언급한 고분자 기질과의 특정한 반응성을 가지는 물질을 말한다.
또한, 본 발명의 구조체로 이용되는, PHA 합성 효소에 의하여 합성되는 PHA는, 일반적으로 R-배열만을 포함하는 이소택틱 폴리머이다.
PHA에 대한 합성 기질로서 3-하이드록시아실 CoA는, 효소를 이용한in vitro합성법, 미생물 및 식물 등의 생물체를 이용한in vivo합성법, 화학 합성법 등으로부터 적절하게 선택한 방법에 의하여 사용을 위한 합성을 할 수 있다. 특히, 효소 합성법은 기질의 합성을 위하여 일반적으로 사용되는 방법이고, 알려진 효소 합성법으로, 시판하는 아실 CoA 신테타제(아실 CoA 리가제, E.C. 6.2.1.3)을 이용하여,
아실 CoA 신테타제
3-하이드록시알칸산 + CoA → 3-하이드록시아실 CoA
의 반응을 사용하는 방법을 들 수 있다.(문헌「Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997), Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 37-43 (2000), etc.」)
효소 및 생물체를 이용한 합성 공정에는, 배치식 합성 방법을 사용해도 되고, 또는 고정화 효소 및 고정화 세포를 이용하여 연속 생산을 실시하여도 된다.
<PHA 합성 효소 및 효소를 생산하기 위한 미생물>
본 발명에서 사용되는 PHA 합성 효소는, 효소를 생산하는 능력을 지닌 미생물로부터 적절하게 선택한 미생물에 의하여 생산되는 효소, 또는 숙주에 PHA 합성 효소의 유전자를 주입한 형질전환체를 사용하여도 된다.
PHA 합성 효소를 생산하는 미생물은, PHB 또는 PHB/V를 생산하는 미생물을 사용하여도 되고, 이러한 미생물로서, 아에로모나스 속(Aeromonas sp.), 알칼리게네스 속(Alcaligenes sp.), 크로마티움 속(Chromatium sp.), 코마모나스 속(Comamonas sp.), 메틸로박테리움 속(Methylobacterium sp.), 파라코커스 속(Paracoccus sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 등에 부가하여 발명자들에의하여 분리된 벌크홀데리아 세파시아 KKO1(Burkholderia cepacia KK01), 랄스토니아 유트로파 TB64(Ralstonia eutropha TB64), 알칼리게네스 속 TL2(Alcaligenes sp. TL2)을 사용하여도 된다. 또한, KK01, TB64 및 Tl2는 경제 산업성 생명공학 공업 기술 국내 연구소, 국제 특허 미생물 기탁 센터에 각각 FERM BP-4235, FERM BP-6933 및 FERM BP-6913으로서 기탁되어 있다.
또한, PHA 합성 효소를 생산하는 미생물로서, mcl-PHA 및 이상-PHA(unusual-PHA)를 생산하는 미생물을 사용하여도 되고, 이러한 미생물로서 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleoborans), 슈도모나스 레지노보란스(Pseudomonas resinoborans), 슈도모나스 속 61-3(Pseudomonas sp. 61-3), 슈도모나스 푸티다 KT2442(Pseudomonas putida KT2442), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 등에 부가하여, 발명자들에 의하여 분리된, 슈도모나스 푸티다 P91(Pseudomonas putida P91), 슈도모나스 치코리이 H45(Pseudomonas cichorii H45), 슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2), 슈도모나스 제세니이 P161(Pseudomonas jessenii P161) 등의 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 미생물과, 일본국 특허 공개 제2001-78753호 공보에 기재된 벌크홀데리아 속 OK3(Burkholderia sp. OK3, FERM P-17370) 및 일본국 특허 공개 제2001-69968호 공보에 기재된 벌크홀데리아 속 OK4(Burkholderia sp. OK4, FERM P-17371) 등의 벌크홀데리아 속(Burkholderia sp.) 미생물을 이용하여도 된다. 또한, 이들 미생물에 부가하여, 아에로모나스 속(Aeromonas sp.), 코마모나스 속(Comamonas sp.) 등에 속하고, mc1-PHA와 이상-PHA(unusual-PHA)를 생산하는 미생물도 이용할 수 있다.
또한, P91, H45, YN2 및 P161는 특허 과정에 의하여 미생물 기탁의 국제적 승인에 부다페스트 조약하에서, 경제 산업성 생명공학 공업 기술 국내 연구소, 국제 특허 미생물 기탁 센터에 각각 FERM BP-7373, FERM BP-7374, FERM BP-7375 및 FERM BP-7376으로서 국제 기탁되어 있다.
본 발명에 있어서 PHA 합성 효소의 생산에 이용하는 미생물의 정상적인 배양을 위하여, 예를 들면, 저장 균주의 제조, PHA 합성 효소의 생산에 요구되는 세포의 수와 그것의 활성 상태를 보존하기 위한 증식, 이용되는 미생물의 성장에 필요한 성분을 함유하는 배지를 적절하게 선택하고 사용한다. 예를 들면, 미생물의 성장 및 생존에 악영향을 미치는 것이 아닌 한, 일반적인 천연 배지(육즙 배지, 효모 추출물 등) 및 영양원을 첨가한 합성 배지 등의 어떠한 종류의 배지를 이용하여도 된다.
배양은 액체 배양 및 고체 배양 등의 미생물이 증식할 수 있는 방법이면 어떠한 방법을 이용하여도 된다. 또한, 배치 배양, 페드 배치 배양, 반연속 배양 및 연속 배양을 포함하는 어떠한 종류의 배양을 사용하여도 된다. 액체 배치 배양의 형성에 관한 한은, 진탕 플라스크에 의하여 진탕함으로써 산소를 공급하는 방법, 쟈 발효기에 의하여 교반환기계를 사용하여 산소를 공급하는 방법이 시행된다. 또한, 이러한 공정을 복수 단계와 연결한 다단계 방법을 시행하여도 된다.
상기 설명한 바와 같이 PHA를 생산하는 미생물을 이용하여 PHA 합성 효소를 생산하는 경우에, 예를 들면, 옥탄산 및 노난산 등의 알칸산을 함유하는 무기 배지에서 미생물을 성장시키고, 대수 증식기에서 정상기의 초기까지의 미생물의 세포를원심분리 등으로 회수하여 원하는 효소를 추출하는 방법 등을 이용하여도 된다. 또한, 상기 설명한 바와 같은 조건을 사용하여 미생물을 배양하는 경우, 첨가한 알칸산으로부터 유래하는 mc1-PHA가 미생물의 세포내에서 합성되지만, 이러한 경우, 일반적으로 PHA 합성 효소는 세포내에서 형성되는 PHA의 미립자에 결합하는 방식으로 존재한다고 알려져 있다. 그러나, 발명자에 의하여 수행된 연구의 결과, 상기에 설명한 방법의 어느 것에 의하여 배양된 세포의 파쇄액으로부터 액체의 원심분리를 시행한 후의 상층액에서 조차도 거의 등가인 효소의 활성이 존재한다는 것을 발견하였다. 이것은, 효소가 세포내에서 계속적으로 활발하게 생산되어, 상기에 설명한 바와 같이 대수 증식기로부터 정상기의 초기까지의 비교적 초기 단계의 배양에서 자유 상태로 PHA 합성 효소의 거의 등가인 양이 존재하기 때문인 것으로 추정된다.
상기의 배양 방법에서 이용되는 무기배지는, 인산염 등의 인원, 암모늄염, 질산염 등의 질소원과 같은 미생물이 성장할 수 있는 성분을 함유하는 어떤 배지를 사용하여도 되고, 무기 배지로는, 예를 들면, MSB 배지, E 배지(문헌「J. Bio1. Chem., 218, 97-106 (1956)」) 및 M9배지를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예에서 사용되는 M9배지의 조성은,
Na2HP04: 6.2 g
KH2P04: 3.0 g
NaC1 : 0.5 g
NH4C1 : 1.0 g
(배지 1리터 당, pH 7.0)
이다.
또한, 미생물의 양호한 증식 및 PHA 합성 효소의 생산을 보존하기 위한 상기 무기 배지에 이하에 표시한 미량 성분을 함유하는 용액의 약 0.3%(v/v) 첨가하는 것이 바람직하다.
(미량 성분을 함유하는 용액)
니트릴로3아세트산 : 1.5g
MgS04: 3.0 g
MnS04: 0.5 g
NaC1 : 1.0 g
FeS04: 0.1 g
CaC12: 0.1 g
CoC12: 0.1 g
ZnS04: 0.1 g
CUS04: 0.1 g
AlK(SO4)2: 0.1 g
H3B03: 0.l g
Na2Mo04: 0.1 g
NiC12: 0.1 g
(1리터 당)
배양 온도는 상기 미생물이 양호하게 성장할 수 있는, 예를 들면, 14 내지 40℃, 바람직하게는 20 내지 35℃의 어떤 온도이어도 된다.
또한, 원하는 PHA 합성 효소는 상기 언급한 PHA를 생산하는 미생물의 PHA 합성 효소 유전자를 가지는 형질전환체를 사용하여 생산될 수 있다. PHA 합성 효소 유전자의 클로닝, 발현 벡터의 제조 및 형질전환체의 제조는 수립된 방법을 따라서 시행하여도 된다. 숙주로서 대장균 등의 미생물에 의하여 얻어진 형질전환체에서, 배양에 사용되는 배지는 천연 배지 또는 예를 들면, LB배지, M9배지 등의 합성 배지이다. 배양 온도는 25 내지 37℃의 범위이다. 또한, 미생물의 성장의 향상을 위하여 에어로빅(aerobic) 배양을 8 내지 27시간 동안 시행한다. 그 후, 세포내에 축적된 PHA 합성 효소를 회수하기 위하여 세포를 회수할 수 있다. 필요에 따라서 카나마이신, 앰피실린, 테트라싸이클린, 클로람페니콜 및 스트렙토마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다. 또한, 발현 벡터에서 유도 프로모터를 사용하는 경우에, 형질전환체를 배양할 때 프로모터의 발현을 위하여 프로모터에 대응하는 유도물질을 배지에 첨가하여도 된다. 그러한 유도물질로, 예를 들면, 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토시다제(IPTG), 테트라사이클린 및인돌아크릴산(IAA)을 들 수 있다.
PHA 합성 효소로는, 미생물의 세포를 파쇄한 것으로부터의 액체와, 황산암모늄 등에 의한 단백질 성분의 침전 및 회수에 의하여 얻어진 염화된 황산암모늄 등의 원료 효소류를 이용하여도 되고 또는, 다양한 종류의 방법에 의하여 정제된 효소를 사용하여도 된다. 필요에 따라서 금속 염, 글리세린, 디티오트레이톨, EDTA 및 소 혈청 알부민(BSA) 등의 안정제류를 효소에 첨가하여도 된다.
PHA 합성 효소의 분리 및 정제를 위하여, PHA 합성 효소의 효소 활성이 유지되는 어떠한 방법을 사용하여도 된다. 예를 들면, 미생물의 얻어진 세포는 프렌치 프레스, 초음파 파쇄기, 라이소자임, 다양한 종류의 계면활성제 등에 의하여 파쇄되고, 그 후, 원심분리에 의하여 얻어진 원료 효소 용액 또는 그것으로부터 제조된 염화된 황산 암모늄에 대하여 어피니티 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 등의 수단을 단독으로 또는 조합하여 적용함으로써 정제된 효소를 얻을 수 있다. 특히, 유전자 재조합 단백질은, N말단 및 C말단에 결합된 히스티딘 잔기 등의 "태그"를 가지는 융합 단백질의 형태로 단백질을 발현시키고, 어피니티 수지에 결합한 단백질을 이러한 태그에 통과시킴으로써, 보다 편리하게 정제할 수 있다. 융합 단백질로부터 원하는 단백질을 분리하기 위하여, 트롬빈 및 혈액 응고 인자 Xa 등의 프로테아제에 의해 연결을 절단하고, pH를 저하시키고, 경쟁적 결합제로서 고농도의 이미다졸을 첨가하는 등의 방법을 사용하여도 된다. 또한, 발현 벡터로서 pTYB1 (New EnglanBiolab 사 제품)을 이용하였을 때와 같이 태그가 인테인을 포함하는 경우, 디티오트레이톨 등에 의하여 얻어진 환원조건이 연결을 절단한다. 어피니티 크로마토 그래피에 의하여 정제 할 수 있는 융합된 단백질로는, 히스티딘 태그 외에 글루타티온-S-트렌스퍼라제(GST), 키틴 결합 도메인(CBD), 말토스 결합 단백질(MBP) 및 티오레독신(Tn)이 잘 알려져 있다. GST 융합 단백질은 GST 친화성 수지에 의하여 정제할 수 있다.
PHA 합성 효소의 활성 측정은, 공지된 다양한 종류의 방법을 사용하여도 되고, 예를 들면, 3-하이드록시아실 CoA가 PHA 합성 효소의 촉매 작용하에서 중합되어 PHA가 되는 과정을 통하여 방출되는 CoA를, 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)으로 발색시켜 측정을 실시하는 것을 측정 원리로서하는 이하의 방법에 의하여 측정하여도 된다. 시약 1: 소 혈청알부민(Sigma사 제품)을 0.lM 트리스 염소산 버퍼(pH 8.0)에 3.0mg/mL의 농도로 용해시키고, 시약 2: 3-하이드록시옥타노일 CoA를 0.lM 트리스 염소산 버퍼(pH 8.0)에 3.0mM의 농도로 용해시키고, 시약 3: 삼클로로아세트산을 0.1M 트리스 염소산 버퍼(pH 8.0)에 10mg/mL의 농도로 용해시키고, 시약 4: 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)을 0.1M 트리스 염소산 버퍼(pH 8.0)에 2.0 mM의 농도로 용해시킨다. 제 1반응(PHA 합성 반응): 시료(효소) 용액 100㎕에 시약 1의 100㎕ 첨가하고, 혼합하고, 30℃에서 1분 동안 미리 배양한다. 이것에 시약 2의 10O㎕를 첨가하고, 혼합하고, 1 내지 30분 동안 30℃에서 배양한 후, 그것에 시약 3을 첨가함으로써 반응을 중지시킨다. 제 2반응(착색한 유리 CoA의 반응) : 반응이 중지된 제 1반응 용액을 원심분리(15,000×g, 10분)하고, 이 용액의 상층액의 500㎕에 시약 4의 500㎕를 첨가하고, 30℃에서 10분 동안 배양한 후, 412nm에서 흡광도를 측정한다. 효소 활성의 산출: 1분당 CoA의 1μmo1을 방출하기 위한 효소의 양을 1단위(U)로서 정의한다.
<PHA-피복 리포솜을 생산하기 위한 제조방법>
도 1a 내지 도 1c에서 도시한 바와 같이, 본 발명의 PHA-피복 리포솜을 생산하기 위한 제조방법의 일예는, (1) 상기 언급한 방법으로 제조한 리포솜을 수성배지에 분산하는 공정과(도 1a), (2) PHA 합성 효소를 분산된 리포솜에 고정하는 공정과(도 1b), (3) 기질로서 3-하이드록시아실 CoA를 첨가하는 공정과, (4) PHA 합성 반응을 실시하는 공정(도 1c) 및 (5) PHA-피복 리포솜을 회수하고, 필요에 따라서 결과물을 건조하고, 용도에 따라서 적절하게 선택한 배지에 결과물을 분산하여 분산계로서 결과물을 제조하는 공정을 적어도 포함하는 제조방법이어도 된다. 도 1a 내지 도 1c에서, 숫자 1은 리포솜을; 2는 리포솜 내부에 봉입된 수용성 물질을; 4는 리포솜에 고정된 폴리하이드록시알카노에이트 신테아제를; 그리고 5는 폴리하이드록시알카노에이트를 나타낸다.
수성배지에 리포솜을 분산시키는 공정은, 수성배지에 한 개 이상의 선택된 리포솜을 첨가하고, 분산가공을 실시한 후, 필요에 따라서 원하는 입자크기의 범위에서 리포솜을 분류함으로써 시행된다.
리포솜은 단독으로 분산된 상태에서 분산된 리포솜의 입자크기가 100㎚ 내지 100㎛의 범위에서 분산되는 것이 바람직하지만, 그러한 조건은 용도에 의존한다. 분산된 리포솜의 입자크기가 바람직한 범위내에 존재하지 않을 경우, 조정을 위하여 여과 및 침강공정에 의한 분류를 실시할 수 있다.
분산된 리포솜의 입자크기는, 흡광법, 정적광산란법, 동적광산란법 및 원심침강법 등의 알려진 방법에 의하여 측정할 수 있고, 예를 들면, 코울터 카운터 멀티-사이저 등의 입자크기를 측정하기 위한 장치를 사용하여도 된다.
이 공정에서 PHA를 합성하기 위한 수성배지의 조성은 리포솜을 바람직한 상태로 분산시킬수 있고, 리포솜에 효소를 고정하고 PHA 합성 반응을 수행하는 후속 공정을 방해하지 않는 어떤 조성이어도 되지만, 후속 공정을 단순화하기 위하여 PHA 합성 효소의 활성을 발휘시킬수 있는 조성으로 그 조성을 조정하여도 된다. PHA 효소의 활성을 발휘시키는 조성으로서, 예를 들면, 완충액을 이용하여도 된다. 완충액으로는, 생화학적 반응에서 이용하기 위한 일반적인 완충액, 예를 들면, 아세트산 버퍼, 인산 버퍼, 인산 칼륨 버퍼, 3-(N-모르폴리노) 프로판 술폰산 (MOPS) 버퍼, N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판 술폰산 (TAPS) 버퍼, 트리스클로라이드버퍼, 글리신 버퍼 및 2-(사이클로헥실아미노)에탄술폰산 (CHES) 버퍼가 적합하게 사용된다. PHA 합성 효소의 활성을 발휘시키는 완충액의 농도는 일반적인 농도, 즉 5mM 내지 1.0M의 범위이어도 되지만, 10 내지 200mM의 범위가 바람직하다. 또한, pH를 5.5 내지 9.0, 바람직하게는 7.0 내지 8.5의 범위로 하기 위하여 조정이 행해지지만, 사용되는 PHA 합성 효소의 가장 적합한 pH 및 pH안정성에 의존하는 상기 설명한 범위 이외의 범위로 pH조건을 설정하는 가능성을 제외하지는 않는다.
또한, 수성배지에서 리포솜의 분산 상태를 유지하기 위하여, 계면활성제가 후속 공정을 방해하지 않는 종류 및 농도를 가지고, 본 발명의 PHA-피복 리포솜의 목적을 방해하지 않는 종류 및 농도를 가지는 한, 적절한 계면활성제를 첨가하여도된다. 계면활성제의 일예로, 예를 들면, 올레인산 나트륨, 도데실설폰산 나트륨, 도데실황산 나트륨, 도데실-N-살코신산 나트륨, 콜산나트륨, 데옥시콜산 나트륨 및 타우로데옥시콜산 나트륨 등의 음이온 계면활성제류와; 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 및 도데실피리디니움 크로라이드 등의 양이온 계면활성제류와; 3-[(콜아미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설폰산(CHAPS), 3-[(3-콜아미드프로필)디메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설폰산(CHAPSO), 팔미토일리솔레시틴 및 도데실-β-알라닌 등의 양성 이온 계면활성제류와; 옥틸글루코사이드, 옥틸티오글루코사이드, 헵틸티오글루코사이드, 데카노일-N-메틸글루카미드(MEGA-10), 폴리옥시에틸렌도데실에테르(Brij, Lubro1), 폴리옥시에틸렌-i-옥틸페닐에테르(Triton X), 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르(Nonidet P-40, Triton N), 폴리옥시에틸렌 지방 산 에스테르(Span) 및 폴리옥시에틸렌솔비톨 에스테르(Tween) 등의 비이온 계면활성제류 등을 들 수 있다.
또한, 수성배지에서 리포솜의 분산을 유지하기 위하여, 후속 공정을 방해하지 않는 종류 및 농도와, 본 발명의 PHA-피복 리포솜의 용도에 필요한 특성을 방해하지 않는 종류 및 농도를 가지는 한, 적절한 보조 용매를 첨가하여도 된다. 보조 용매로는, 예를 들면, 헥산 등의 직쇄 지방족 탄화수소류와, 메탄올 및 에탄올 등의 1가 알코올류, 글리세롤 등의 다가 알코올류, 지방산 에테르류 및 카르복실레이트류 등의 유도체로부터 선택된 한 종 또는 두 종의 물질을 선택하고 사용하여도 된다.
PHA 합성 효소를 리포솜에 고정하는 공정은 상기 언급한 리포솜 분산액에PHA 합성 효소를 첨가하고, 고정화 처리와 같은 처리를 행함으로써 실시할 수 있다. 고정화 처리는, 효소의 활성을 유지시키고, 원하는 리포솜에 적용할 수 있는 방법인 한, 일반적으로 사용되는 효소 고정화 방법으로부터 선택한 어떤 방법이어도 된다. 예를 들면, 이러한 방법들로, 공유결합법, 이온 흡착법, 소수성 흡착법, 물리적 흡착법, 어피니티 흡착법, 가교법 및 격자형 포괄법을 들 수 있지만, 이온 흡착과 소수 흡착을 이용한 고정화 방법이 특히 편리하다.
PHA 합성 효소 등의 효소 단백질은, 다수의 아미노산이 결합된 폴리펩티드이고, 리신, 히스티딘, 알지닌, 아스파라긴산 및 글루탐산 등의 유리 이온기를 가지는 아미노산에 의하여 이온 흡착체로서의 특성을 나타내고, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 트립토판, 페닐알라닌 및 프롤린 등의 유리 소수성기를 가지는 유기 고분자의 아미노산에 의하여 소수성 흡착체로서의 특성을 가진다. 따라서, 효소 단백질은 이온성 이나 소수성, 또는 이온성 및 소수성 양자를 가지는 리포솜에 다소간 흡착될 수 있다.
주로 이온 흡착법에 의하여 PHA 합성 효소를 고정하는 방법으로 작용기를 그 표면에 발현하는 리포솜을 이용하여도 되고, 예를 들면, 포스파티딜세린이나 포스파티딜산, 디세틸 포스포르산, 포스파디딜이노시톨 등의 음이온 전하를 제공하는 지질 또는 스테아릴 아민 등의 공존하는 양이온 전하를 제공하는 지질을 이용함으로써 리포솜을 제조한다.
이온 흡착법 또는 소수 흡착법에 의하여 PHA 합성 효소를 리포솜에 고정하는 것은, 미리 정해둔 농도를 얻기 위하여 리포솜과 PHA 합성 효소를 미리 정해둔 수성배지에서 혼합함으로써 달성된다. 이 때, 효소가 리포솜의 표면에 균등하게 흡착될 수 있도록, 반응 용기를 미리 정해둔 강도로 진탕 또는 교배하는 것이 바람직하다.
상기 설명한 고정화 처리에서, 리포솜과 효소가 서로 혼합된 수성배지의 조성은, 수성배지의 pH 및 염 농도에 의하여 리포솜과 PHA 합성 효소의 전하량과 소수성, 양 및 음의 표면 전하가 변화하는 것을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 리포솜이 이온-흡착성인 경우, 염 농도를 감소시킴으로써 리포솜과 PHA 합성 효소간의 흡착에 기여하는 전하량을 높일수 있다. 또한, 리포솜과 PHA 합성 효소의 반대 전하는 pH를 변화시킴으로써 증가될 수 있다. 또한, 조성을 결정하기 위하여 리포솜과 PHA 합성 효소간의 흡착량을 직접적으로 측정할 수 있다. 흡착량의 측정은, 예를 들면, 분산된 리포솜을 가지는 용액에 알고있는 농도의 PHA 합성 효소 용액을 첨가하여 흡착 처리를 실시한 후에, 용액내의 PHA 합성 효소 농도를 측정하고, 차감법에 의하여 흡착된 효소의 양을 측정하는 방법을 이용하여도 된다.
이온 흡착법 및 소수 흡착법으로 효소를 고정하기 곤란한 리포솜의 경우에, 조작의 번잡함 및 효소 활성이 감소될 가능성을 배제하는, 필요에 따라서 어떠한 처리의 도움으로 효소의 고정을 위한 공유결합을 이용하여도 된다. 예를 들면, 그러한 경우는, thiol 반응성기(디티오피리딜기 및 말레이미드기 등의 티올기와 반응할 수 있는 반응성기)를 가지는 리포솜과 효소의 thiol기 사이에 교환 반응을 시행하는 공정을 포함한다. 또한, N-하이드록시숙신산, 크로로포름산 에틸, 디사이클로헥실칼보디이미드(DCC), Woodward 시약 K, 시아눌산 및 트리플루오로메탄 술파닐크로라이드 등의 단독 작용기 활성화 시약의 사용에 의하여 효소의 하이드록실기, 아민기 또는 카르복실기를 활성화함으로써 또는, 어떤 디-이소시아네이트류 등의 다른 반응성을 가지는 기를 포함하는 다양한 종류의 2-작용기 가교화 시약의 사용에 의하여 효소를 활성화함으로써, 포스파티딜에탄올 아민 등의 아미노기를 가지는 인지질을 포함하는 리포솜과 효소를 연결하는 방법을 사용할 수 있다.
또한, 어피니티 흡착에 의하여 내부에 주입된 리간드에 의해 효소를 리포솜에 고정하여도 된다. 이 경우에, PHA 합성 효소의 활성을 유지하면서 어피니티 흡착을 할 수 있는 것이면 리간드로서 어느 물질을 선택하여도 된다. 또한, PHA 합성 효소에 단백질 등의 다른 생체고분자를 결합하고, 결합한 생체고분자를 어피니티 흡착함으로써 효소를 고정하여도 된다. 유전자 재조합 등에 의하여 또는, 화학적 처리에 의하여 생체고분자를 PHA 합성 효소에 결합하여도 된다.
또한, 리포솜에 대하여 결합능을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소에 융합시킬수 있고, 리포솜에 대하여 결합능을 가지는 아미노산 서열에 대응하는 펩티드의 일부와 리포솜 사이에의 결합에 의거하여 리포솜의 표면에 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소를 고정할 수 있다.
리포솜에 대하여 결합능을 가지는 아미노산 서열은, 예를 들면, 랜덤 펩티드 라이브러리의 스크리닝에 의하여 결정할 수 있다. 특히, 예를 들면, 유전자 Ⅲ 단백질 등의 M13계 파지의 표면 단백질의 N-말단 유전자에 랜덤 합성 유전자를 연결시킴으로써 준비된 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리을 적절하게 사용할 수 있지만, 이러한 경우, 리포솜에 대한 결합능을 가지는 아미노산 서열의 측정이, 이하의 순서를 따라 시행된다. 구체적으로, 리포솜 또는 리포솜을 구성하는 인지질에 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리를 첨가하여 파지를 인지질에 접촉시킨후, 용출에 의하여 결합된 파지와 결합되지 않은 파지를 분리한다. 리포솜-결합 파지는 산 등에 의하여 세정하고, 완충액에 의하여 중화하고, 그 후 파지를 증폭시키기 위하여 대장균을 파지로 감염시킨다. 이러한 스크리닝 과정을 여러번 반복하는 경우, 원하는 리포솜에 대한 결합능을 가지는 수많은 클론이 축적된다. 여기서, 단일의 클론을 얻기 위하여, 대장균에 다시 감염시킨 파지를 가지고 배지 플레이트 위에 콜로니를 형성한다. 각각의 단일 콜로니를 액체배지에서 배양한 후, 배지의 상층액에 존재하는 파지를 폴리에틸렌 글리콜 등에 의하여 침전 및 정제하고, 염기 서열을 분석함으로써 펩티드의 구조를 알 수 있다.
상기 설명한 방법에 의하여 얻어진 리포솜에 대하여 결합능을 가지는 펩티드의 아미노산 서열은, 일반적인 유전자 공학적 수법을 이용하여 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소에 융합하여 사용된다. 리포솜에 대하여 결합능을 가지는 펩티드는 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소의 N-말단 또는 C-말단에 연결되어 발현할 수 있다. 펩티드는 적절한 스페이서 서열이 삽입되어 발현할 수 있다. 스페이서 서열은 약 3 내지 400아미노산을 바람직하게 가지고, 그것은 어떠한 아미노산을 포함하여도 된다. 가장 바람직하게는, 스페이서 서열이 PHA 합성 효소가 기능하는 것을 방해하지 않거나 또는, PHA 합성 효소가 리포솜에 결합하는 것을 방해하지 않는다.
상기 설명한 방법에 의하여 제조된, 리포솜에 고정된 효소를 가지는 리포솜은 직접적으로 사용하여도 되고, 또한 동결 건조 등을 행한 후에 사용하여도 된다.
리포솜에 고정된 인지질의 양을 10유닛(U) 내지 1,000유닛(U)의 범위로 설정하고, 인지질의 1g당 50유닛(U) 내지 500유닛(U)인 것이 바람직하고, 여기서 단일의 유닛(U)은, 3-하이드록시아실 CoA의 중합반응에 의하여 합성된 PHA의 반응에서 방출된 CoA의 양이 분당 1μmo1과 같을 경우, PHA 합성 효소의 양으로서 정의된다.
효소의 고정화를 실시하는데 걸리는 시간은 1분 내지 24시간이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10분 내지 1시간이다. 시료를 방치하거나 과도한 시간동안 놓아두는 것은 리포솜의 응집 및 효소 활성의 저하를 야기하기 때문에 바람직하지 않다.
또한, 수성배지에 리포솜을 분산하는 전 공정을 시행하지 않은 효소용액에 리포솜을 직접적으로 첨가한 후, 효소용액에 리포솜을 분산시킴으로써 효소를 리포솜에 고정하여도 된다. 이 경우, 리포솜에 고정된 효소가 보유하는 이온성 작용기와 관련된 전기적 반발 및 입체 장애가, 수성배지에서의 리포솜의 분산을 용이하게 하고, 수성배지에 계면활성제를 첨가할 필요성을 제거하거나, 계면활성제의 양을 줄일 수 있다.
기질로서 3-하이드록시아실 CoA를 첨가하는 공정은, 전 공정에서 효소가 고정된 리포솜의 수성 분산액에 대하여 별도로 준비된 3-하이드록시아실 CoA의 보존액을 원하는 농도에 도달하도록 첨가함으로써 달성된다. 기질로서 3-하이드록시아실 CoA는, 일반적으로 0.1mM 내지 1.0M, 바람직하게는 0.2mM 내지 0.2M, 보다 바람직하게는 0.2mM 내지 1.0mM의 최종 농도에 첨가된다.
또한, 상기 설명한 공정에서, 수성 반응액 내의 3-하이드록시아실 CoA의 종류나 농도 등의 조성은 시간에 따라 변화됨으로써, 리포솜의 안쪽으로부터 외측을 향하는 방향으로 리포솜을 피복하는 PHA의 단량체 유닛의 조성을 변화시킬 수 있다.
변화되는 단량체 유닛의 조성을 가지는 이러한 리포솜의 형태는, 예를 들면, PHA 피막의 조성의 변화가 연속적이고, 리포솜이 안쪽으로부터 외측을 향하는 방향으로 형성된 조성의 그라디언트를 가지는 PHA의 단층으로 피복된 형태이어도 된다. 제조방법은, 예를 들면, PHA를 합성하는 동안 반응액에 다른 조성의 3-하이드록시아실 CoA를 첨가하는 방법이어도 된다.
또한 다른 형태로서, PHA 피막의 조성이 단계적으로 변화되고, 다른 조성의 PHA가 다층으로 리포솜을 피복하는 형태이어도 된다. 이러한 형태의 제조방법은, 3-하이드록시아실 CoA의 특정 조성으로 PHA를 합성한 후, 원심분리, 겔 여과 등을 사용하여 리포솜을 반응액으로부터 잠정적으로 회수하고, 이것에 다른3-히드록시 아실 CoA의 조성 로 이루어진 반응액을 재차 첨가하는 등 방법에 의하면 좋다.
PHA 합성 반응을 실시하는 공정은, 합성된 PHA에 의하여 원하는 형상을 가진 PHA-피복 리포솜을 얻을 수 있기 위하여, 반응 용액의 조성이 전 공정까지 제조되지 않는 경우 PHA 합성 효소의 활성을 발휘시키는 조성을 얻을 수 있기 위하여 반응 용액의 조성을 제조하고, 반응 온도 및 반응 시간을 조정함으로써 시행된다.
PHA 합성 효소의 활성을 발휘시키는 반응 용액을 위한 완충액의 농도는 일반적인 농도, 즉, 5mM 내지 1.0M 범위의 농도 이어도 되지만, 10 내지 200mM 범위의 농도가 바람직하다. pH는, 5.5 내지 9.0의 범위, 바람직하게는 7.0 내지 8.5의 범위로 하기 위하여 조정을 행하지만, 사용되는 PHA 합성 효소의 가장 적합한 pH와 pH 안정성에 의존하여 상기 설명한 범위 이외의 범위로 pH 조건을 설정하는 가능성을 배제하지 않는다.
반응 온도는, 사용되는 PHA 합성 효소의 특성에 의존하여 적절하게 설정하지만, 일반적으로 4 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃이어도 된다. 그러나, 사용되는 PHA 합성 효소의 가장 적합한 온도와 내열성에 의존하여 상기 설명한 범위 이외의 범위로 온도 조건을 설정하는 가능성을 배제하지 않는다.
반응 시간은, 적절하게 선택되고, 사용되는 PHA 합성 효소의 안정성 등에 의존하여, 일반적으로 1분 내지 24시간, 바람직하게는 30분 내지 3시간의 범위내로 설정한다.
이러한 공정에 의하여 PHA-피복 리포솜이 얻어지나, 리포솜을 구성하는 PHA의 단량체 유닛의 구조는, PHA-피복 리포솜으로부터 크로모포름에 의하여 PHA를 추출한 후, 가스 크로마토그래피 등에 의하여, 또는 이동 시보 2차 이온 질량 분광계(TOF-SIMS) 및 이온 스퍼터링 기술을 사용하여 조성 분석을 시행함으로써 판정될 수 있다.
PHA의 분자량은 특별히 제한되어 있지는 않지만, PHA-피복 리포솜의 강도를 유지하고, 안정한 전하량을 제공하기 위하여 수평균 분자량이 1,000 내지10,000,000, 보다 바람직하게는, 3,00O 내지 1,OOO,OOO의 범위인 것이 바람직하다. PHA의 분자량은, PHA-피복 리포솜으로부터 클로로포름에 의하여 PHA를 추출한 후, GPC (겔 퍼미에이션 크로마토그래피)에 의해 측정하여도 된다.
PHA로 피복되는 양은 PHA-피복 리포솜의 용도에 의존하지만, 예를 들면, 리포솜의 건조 질량에 의거하여 1 내지 30% 중량비의 범위, 바람직하게는 1 내지 20%중량비, 보다 바람직하게는 1 내지 15% 중량비의 범위이다.
상기 공정에 의하여 얻어지는 PHA-피복 리포솜의 입자 크기는 PHA-피복 리포솜의 용도에 의존하지만, 일반적으로 50μm이하, 바람직하게는 10μm이하, 보다 바람직하게는 O.O1 내지 1Oμm이다. PHA-피복 리포솜의 입자 크기는 흡광법, 정적광산란법, 동적광산란법 및 원심 침강법 등의 기존의 방법에 의하여 측정할 수 있고, 예를 들면, 코울터 카운터 멀티-사이저 등의 입자 크기를 측정하기 위한 장치를 이용하여도 된다.
또한, 이러한 공정에 의하여 얻어진 PHA-피복 리포솜에 이미 사용한 다양한 종류의 2차 처리 및 화학적인 수정 등의 가공을 행하여도 된다.
예를 들면, PHA-피복 리포솜 표면 위의 PHA에 화학적인 수정을 행함으로써 보다 유용한 기능과 특성을 가지는 PHA-피복 리포솜을 얻을수 있다. 예를 들면, 그라프트사슬을 도입함으로써, 그라프트사슬로부터 유래된 다양한 종류의 특성을 가지는 PHA-피복 리포솜을 얻을수 있다. 예를 들면, 하기에 설명하는 폴리실록산을 그라프트사슬로서 도입하는 경우, 보다 향상된 기계적 강도, 분산성, 내후성, 내수성, 내열성 등을 가지는 PHA-피복 리포솜을 얻을 수 있다. 또한, PHA-피복리포솜 위에 가교화된 PHA를 가짐으로써, PHA-피복 리포솜의 기계적 강도, 내약품성, 내열성이 보다 향상될 수 있다.
화학적인 수정을 위한 방법은, 원하는 기능 및 구조를 얻는 목적이 달성되는 방법이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 반응성 작용기를 곁사슬에 가지는 PHA를 합성하고, 작용기의 화학 반응을 사용하여 화학적인 수정을 행하는 방법을 적절한 방법으로서 사용하여도 된다.
상기 설명한 반응성 작용기의 종류는, 원하는 기능 및 구조를 얻는 목적에 공헌하는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 이전에 설명한 바와 같이 에폭시기이어도 된다. 곁사슬에 에폭시기를 가지는 PHA는, 에폭시기를 가지는 일반적인 고분자의 경우와 같이 화학적으로 변환될 수 있다. 구체적으로, 예를 들면, 하이드록실기로의 전환 및 술폰기의 도입이 가능하다. 또한, 티올 및 아민을 가지는 화합물을 부가할 수 있고, 예를 들면, 말단에 반응성 작용기를 가지는 화합물, 구체적으로는, 에폭시기와 높은 반응성을 가지는 아미노기를 가지는 화합물을 첨가하고 반응시킴으로써, 고분자의 그라프트사슬이 형성된다.
말단에 아미노기를 가지는 화합물로는, 폴리비닐 아민, 폴리에틸렌 이민 및 아미노 수정 폴리실록산(아미노 수정 실리콘 오일) 등의 아미노 수정 고분자를 들 수 있다. 이들 중, 아미노 수정 폴리실록산은, 시판하는 수정 실리콘 오일 또는, 문헌 「J. Amer. Chem. Soc., 78, 2278 (1956)」 등에 기재된 방법에 의하여 합성된 아미노 수정 폴리실록산을 사용하여도 되고, 고분자의 그라프트사슬의 도입에 의하여 기계적 강도, 분산성, 내광성, 내후성, 내수성 및 내열성 등이 향상되는 효과를 기대할 수 있다.
또한, 에폭시기를 가지는 폴리머의 화학적인 변환의 또다른 일예는 헥사메틸렌디아민 등의 디아민 화합물, 무수 숙신산, 2-에틸-4-메틸이미다졸 등에 의한 가교 반응이고, 물리화학적 변환의 일예는 전자선 방사 등에 의한 가교 반응이다. 이들 중, 곁사슬에 에폭시기를 가지는 PHA와 헥사메틸렌디아민 간의 반응은 가교화된 고분자를 생산하기 위하여 하기 설명하는 바와 같은 전개도를 따라 진행한다.
본 발명의 PHA에 의하여 피복된 리포솜을 회수하고, 필요에 따라서 건조하거나 또는, 분산계로서 그것을 배지에 분산하고, 가공하는 공정은, PHA-피복 리포솜의 응용에 따라 적절하게 분산 배지로 옮김으로써 달성할 수 있다.
본 발명의 PHA-피복 리포솜을 사용하는 경우, 예를 들면, 농예 화학제용 리포솜으로서, 전 공정에서 얻어지는 슬러리를 그대로 농예 화학제로서 사용할 수 있다. 그러나, 유용성을 위하여 수성 현탁, 수화제, 분말 및 과립 등의 보다 용이하게 사용할 수 있는 형태, 특히 수성 현탁의 형태로 성형하기 위하여 슬러리를 가공하는 것이 바람직하다. 수성 현탁은 상기 설명한 바와 같이 얻어진 슬러리에 증점제, 동결 방지제, 특별한 비중 조절제 및 방부제 등의 안정제를 첨가함으로써 제조된다. 이용되는 증점제의 일예로, 카르복실메틸 셀룰로오스, 잔탄검, 람잔검, 로커스트 빈 검, 카라기난 및 웨란검 등의 다당류와; 폴리아크릴산 나트륨 등의 합성 고분자류와; 알루미늄 마그네슘 실리케이트, 스메크타이트, 벤토나이트, 헤크토라이트 및 드라이 프로세스 실리카 등의 광물질 미세분말류; 및 알루미나 용액을 들 수 있다. 동결 방지제의 일예로, 프로필렌 글리콜 등의 알코올류를 들 수 있다. 비중 조절제의 일예로, 황산나트륨 등의 수용성 염 및 요소를 들 수 있다.
본 발명의 PHA-피복 리포솜을 사용하는 경우, 예를 들면, 비료 조성물용 리포솜으로서, 전 공정에서 얻어지는 슬러리를 그대로 비료 조성물로서 사용할 수 있다. 그러나, 유용성을 위하여 수성 현탁, 수화제, 분말 및 과립 등의 보다 용이하게 사용할 수 있는 형태, 특히 수성 현탁의 형태로 성형하기 위하여 슬러리를 가공하는 것이 바람직하다. 수성 현탁은 상기 설명한 바와 같이 얻어진 슬러리에 증점제, 동결 방지제, 특별한 비중 조절제 및 방부제 등의 안정제를 첨가함으로써 제조된다. 이용되는 증점제의 일예로, 카르복실메틸 셀룰로오스, 잔탄검, 람잔검, 로커스트 빈 검, 카라기난 및 웨란검 등의 다당류와; 폴리아크릴산 나트륨 등의 합성 고분자류와; 알루미늄 마그네슘 실리케이트, 스메크타이트, 벤토나이트, 헤크토라이트 및 드라이 프로세스 실리카 등의 광물질 미세분말류; 및 알루미나 용액을 들 수 있다. 동결 방지제의 일예로, 프로필렌 글리콜 등의 알코올류를 들 수 있다. 비중 조절제의 일예로, 황산나트륨 등의 수용성 염 및 요소를 들 수 있다.
본 발명의 PHA-피복 리포솜을 사용하는 경우, 예를 들면, 비료 조성물용 리포솜으로서, 하기와 같이 증폭되는, 고체상 또는 액상 파라핀, 크리스탈 오일, 세레신, 오조케라이트 및 몬탄 왁스 등의 탄화수소류와; 올리브, 얼스 왁스, 카르나우바 왁스, 라놀린 및 스퍼마세티 왁스 등의 식물 및 동물성 지방과; 스테아르산, 팔미트산, 올레인산, 글리세롤 모노스테아린산, 글리세롤 디스테아린산, 글리세롤 모노올레인산, 이소프로필 미리스트산, 이소프로필 스테아르산 및 부틸 스테아르산 등의 지방산 및 그 유도체; 메틸폴리실록산류, 메틸폴리사이클로실록산류, 메틸페닐폴리실록산류 및 실리콘폴리에테르 공중합체 등의 실리콘류와; 에탄올, 이소프로필 알코올, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 팔미틸 알코올 및 헥실도데실 알코올 등의 알코올류; 및 글리콜류, 글리세린 및 소르비톨 등의 보습 작용을 가지는 다가 알코올류의 잘 알려진 화장품 주성분으로부터 분산매를 선택하여도 된다.
본 발명의 PHA-피복 리포솜을 사용하는 경우, 예를 들면, 인공 적혈수용 리포솜으로서, 전 공정에서 얻은 슬러리를 생리 식염수에 현탁하고, 겔 여과법 및 원심 분리법 등의 잘 알려진 수단에 의하여 현탁액 내의 큰 입자를 제거한다.
본 발명의 PHA-피복 리포솜을 사용하는 경우, 예를 들면, 잉크용 리포솜으로서, 그것은 수성배지에 현탁된다. 물에서 덩어리진 분산을 보조하는 목적으로, 계면활성제, 보호 콜로이드 및 수용성 유기 용매를 피막의 내성을 현저하게 저하시키지 않는 범위내에서 첨가하여도 된다. 또한, 방부제, 점도 조정제, pH 조정제, 킬레이트화제 등을 첨가하여도 된다.
구체적으로, 잉크용 리포솜에 첨가하여도 되는 보호 콜로이드로는 글루, 젤라틴, 카세인, 알부민, 아카시아 검 및 피시 글루 등의 천연 단백질류와, 알긴산과, 메틸셀룰로오스, 카르복실메틸셀룰로오스, 폴리에틸렌 옥사이드, 하이드록시에틸셀룰로오스, 폴리비닐 알코올, 폴리아크릴 아미드, 방향족 아미드, 폴리아크릴산, 폴리비닐에테르, 폴리비닐피롤리돈, 아크릴 및 폴리에스테르 등의 합성 고분자류를 들 수 있다. 보호 콜로이드는 고정성, 점도 변경 및 건조 특성의 목적으로 사용되고, 잉크 내의 보호 콜로이드의 함유 비율은, 30질량% 이하가 바람직하고, 20질량% 이하가 보다 바람직하다.
잉크용 리포솜에 첨가하여도 되는 계면활성제로는 음이온성, 양이온성, 양성 이온성 및 비이온성의 어떤 것이어도 된다. 음이온성 계면활성제의 일예로, 스테아린산나트륨, 올레인산 칼륨 및 반경화 탈로우 지방산 나트륨 등의 지방산 에스테르와; 도데실 황산 나트륨, 도데실 황산 3(2-하이드록시에틸)암모늄 및 옥타데실 황산 나트륨 등의 알킬 황산류와; 노닐 벤젠술폰산 나트륨, 도데실 벤젠술폰산 나트륨, 옥타데실 벤젠술폰산 나트륨 및 도데실 디페닐에틸 디술폰산 나트륨 등의 벤젠술폰산류와; 도데실 나프탈렌술폰산 나트륨 및 나프탈렌술폰산 포르말린 축합물 등의 나프타렌 술폰산류와; 디도데실 술포숙신산 나트륨 및 디옥타데실 술포숙신산 나트륨 등의 술포숙신산류와; 폴리옥시에틸렌도데실에테르 황산 나트륨, 폴리옥시에틸렌도데실에테르 황산 3(2-하이드록시에틸)암모늄, 폴리옥시에틸렌옥타데실에테르 황산 나트륨 및 폴리옥시에틸렌도데실페닐에테르 황산 나트륨 등의 폴리옥시에틸렌 황산류; 및 도데실 인산 칼륨 및 옥타데실 인산 나트륨 등의 인산류를 들 수 있다.
양이온성 계면활성제의 일예로, 옥타데실 암모늄 아세테이트 및 코코넛 오일아민 아세테이드 등의 알킬 아민 염류와; 도데실 트리메틸 암모늄 클로라이드, 옥타데실 트리메틸 암모늄 클로라이드, 디옥타데실 디메틸 암모늄 클로라이드 및 도데실 벤조일 디메틸 암모늄 클로라이드 등의 4급 암모늄 염류를 들 수 있다. 양성 이온성 계면활성제의 일예로, 도데실 베타인 및 옥타도데실 베타인 등의 알킬 베타인류와; 도데실 디메틸 아민 옥사이드 등의 아민 옥사이드류를 들 수 있다. 비이온성 계면활성제의 일예로, 폴리옥시에틸렌 도데실 에테르, 폴리옥시에틸렌 헥사데실 에테르, 폴리옥시에틸렌 옥타데실 에테르 및 폴리옥시에틸렌(9-옥타데실)에테르 등의 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르류와; 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐 에테르 및 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르 등의 폴리옥시에틸렌 페닐 에테르류와; 폴리에틸렌 옥사이드 및 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 공중합체 등의 옥시란 고분자류와; 솔비탄 도데칸산 에스테르, 솔비탄 헥사데칸산 에스테르, 솔비탄 옥타데칸산 에스테르, 솔비탄(9-옥타데켄산)에스테르, 솔비탄(9-옥타데켄산)트리에스테르, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 도데칸산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 헥사데칸산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 옥타데칸산에스테르, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 옥타데칸산 트리에스테르, 폴리옥시에틸렌 솔비탄(9-옥타데켄산)에스테르 및 폴리옥시에틸렌 솔비탄(9-옥타데켄산)트리에스테르 등의 솔비탄 지방 에스테르류; 및 글리세린 옥타데칸산 에스테르 및 글리세린(9-옥타데켄산)에스테르 등의 글리세린 지방 에스테르류를 들 수 있다. 이러한 계면활성제에서 14이상의 HLB를 가지는 것이 특히 바람직하다. 본 발명에 사용하기 위한 상기 계면활성제의 양은, 단일 종류의 계면활성제를 사용하거나 또는 두종 이상의 계면활성제를 조합하여 사용하는것에 의존하여 다양하지만, 수성 잉크 조성물의 전체 함량에 의거하여 0 내지 10%, 바람직하게는 0 내지 5% 이다.
본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜은 조성물의 전체 함량에 의거하여 물의 20 내지 95%질량비, 리포솜의 1 내지 60% 부피비를 바람직하게 함유한다.
[실시예]
본 발명을 하기 실시예를 사용하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 설명하는 각각의 실시예는 본 발명의 가장 바람직한 실시예의 한 예를 나타내지만, 본 발명의 기술적 범위는 이러한 실시예로 한정되는 것은 아니다.
(참고예 1)
PHA 합성 효소를 생산할 수 있는 형질전환체의 제조 및 PHA 합성 효소의 생산
PHA 합성 효소를 생산할 수 있는 형질전환체를 이하의 방법으로 제조하였다.
YN2주를 10OmL의 LB배지(1% 폴리펩톤, O.5% 효모 추출물, 0.5% 염화 나트륨, pH 7.4)에서 30℃로 하룻밤 배양한 후, 마머(Marmer) 등의 방법을 사용하여 염색체 DNA를 분리하고 회수하였다. 얻어진 염색체 DNA를 제한 효소 Hind Ⅲ에 의하여 완전하게 분해하였다. 벡터로서 pUC18을 사용하고, 제한 효소 Hind Ⅲ에 의하여 절단하였다. 말단의 디포스포릴레이션(문헌「Molecular C1oning, 1, 572, (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press」)을 시행한 후, DNA 라이게이션 Kit Ver. Ⅱ(Takara Shuzo사 제품)를 이용하여 벡터의 절단된 부위(클로닝 사이트)와 Hind Ⅲ로 완전하게 분해된 염색체 DNA의 단편을 연결하였다. 삽입된 이 염색체 DNA 단편을 가지는 플라스미드 백터는 대장균(Escherichia coli) HB101주를 형질전환하는데 사용되어, YN2주의 DNA라이브러리를 제조하였다.
다음에, YN2 주의 PHA 합성 효소 유전자를 포함하는 DNA 단편을 선택하기위하여, 콜로니 하이브리다이제이션용의 프로브를 제조하였다. 배열 번호: 5(SEQ ID No: 5) 및 배열 번호: 6(SEQ ID No: 6)의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오타이드를 합성하고(Amasham Pharmacia·Biotech), 이러한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 템플레이트로서의 염색체 DNA와 PCR을 시행하였다. PCR로 증폭된 DNA 단편을 프로브로서 사용하였다. 프로브의 표지화는 시판되는 표지 효소 알크포스다이렉트(AlkPhosDirect, Amasham Pharmacia·Biotech)를 사용하여 시행하였다. 콜로니하이브리다이제이션 방법에 의하여 YN2 주의 염색체 DNA 라이브러리로부터 PHA 합성 효소 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 가지는 대장균 균주를 선택하기 위하여 얻어진 표지된 프로브를 사용하였다. 선택된 균주로부터 알칼리 방법에 의하여 플라스미드를 회수함으로써, PHA 합성 효소 유전자를 포함하는 DNA 단편을 얻을 수 있었다.
여기서 얻어진 유전자 DNA 단편을, 부적합군을 구성하는 IncP, IncQ 및 IncW의 어느 것에도 속하지 않는 넓은-숙주-범위 복제 영역을 포함하는 벡터 pBBR 122(Mo Bi Tec)에 재조합하였다. 엘렉트로포레이션 방법에 의하여 슈도모나스 치코리이 YN2ml 주(PHA를 합성하는 능력이 결손된 주)를 이 재조합 플라스미드로 형질전환 시키는 경우, YN2m1 주의 PHA를 합성할 수 있는 능력이 회복되었고, 또한보완 특성을 나타내었다. 따라서, 선택된 유전자 DNA 단편은 슈도모나스 치코리이 YN2m1 주 내에서 PHA 합성 효소로 해독할 수 있는 PHA 합성 효소 유전자 영역을 포함한다는 것이 확신된다.
이 PHA 합성 효소 유전자를 포함하는 DNA 단편에서, 생거(Sanger)법에 의하여 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 결정된 염기서열 내에서, 각각 펩티드를 암호화하는, 배열 번호: 2(SEQ ID No: 2) 및 배열 번호: 4(SEQ ID No: 4)로 표시되는 염기서열이 존재한다는 것이 발견되었다. 하기 설명하는 바와 같이, 각각의 펩티드사슬을 포함하는 단백질은 모두 효소 활성을 가지고, 배열 번호: 2(SEQ ID No: 2) 및 배열 번호: 4(SEQ ID No: 4)로 표시되는 염기서열은 PHA 합성 효소인 것을 확신할 수 있었다. 구체적으로, 배열 번호: 2(SEQ ID No: 2)의 염기서열은 배열 번호: 1(SEQ ID No: 1)로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하고, 배열 번호: 4(SEQ ID No: 4)의 염기서열은 배열 번호: 3(SEQ ID No: 3)으로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하고, 이러한 아미노산 서열의 어느 하나만을 가지는 단백질에 의하여 PHA 합성 능력을 나타낼 수 있다.
배열 번호: 2(SEQ ID No: 2)로 표시되는 염기서열의 PHA 합성 효소 유전자에 대하여, PHA 합성 효소의 완전한 길이를 다시 제조하기 위하여 템플레이트로서 염색체 DNA와 PCR을 시행하였다.
배열 번호: 2(SEQ ID No: 2)로 표시되는 염기서열에 대하여, 상류 프라이머로서 기능하는, 개시코돈(SEQ ID No: 7)보다 상류의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드와, 하류 프라이머로서 기능하는, 정지코돈(SEQ ID No: 8)보다 하류의염기서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드를 각각 디자인하고 합성하였다(Amasham Pharmacia·Biotech). PHA 합성 효소 유전자의 완전한 길이를 증폭하기 위하여, 프라이머로서 이러한 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 템플레이트로서 염색체 DNA와 PCR(LA-PCR Kit; Takara Shuzo Co., Ltd.)을 실시하였다.
마찬가지의 방법으로, 배열 번호: 4(SEQ ID No: 4)로 표시되는 염기서열의 PHA 합성 효소 유전자에 대하여, PHA 합성 효소의 완전한 길이의 효소를 다시 제조하기 위하여 템플레이트로서 염색체 DNA와 PCR을 시행하였다. 배열 번호: 4(SEQ ID No: 4)로 표시되는 염기서열에 대하여, 상류 프라이머로서 기능하는, 개시코돈(SEQ ID No: 9)보다 상류의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드와, 하류 프라이머로서 기능하는, 정지코돈(SEQ ID No: 10)보다 하류의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드를 각각 디자인하고 합성하였다(Amasham Pharmacia·Biotech). PHA 합성 효소의 완전한 길이의 유전자를 증폭하기 위하여, 프라이머로서 이러한 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCR(LA-PCR Kit; Takara Shuzo Co., Ltd.)을 실시하였다.
다음에, 얻어진 PHA 합성 효소의 완전한 길이의 유전자를 포함하는, PCR로 증폭된 단편을, 제한 효소 HindⅢ를 이용하여 각각 완벽하게 분해하였다. 또한, 발현 벡터 pTrc99A도 제한 효소 HindⅢ에 의하여 절단하고, 디포스포릴레이션 가공(문헌「Molecular C1oning, vol. 1, p. 572, 1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press」)하였다. DNA 라이게이션 킷트 Ver.Ⅱ(Takara Shuzo Co., Ltd)를 이용하여, 이 발현 벡터 pTrc99A의 절단된 부위와, 양 말단에 필요없는 염기서열을 제거한 PHA 합성 효소 유전자의 완전한 길이의 유전자를 포함하는 DNA 단편을 연결하였다.
대장균(Escherichia coli HB101: Takara Shuzo Co., Ltd)을 얻어진 재조합 플라스미드를 사용하여 염화 칼륨법에 의하여 형질전환하였다. 얻어진 재조합체를 배양하고, 재조합 플라스미드의 증폭을 시행하고, 재조합 플라스미드를 각각의 종류로 회수하였다. 배열 번호: 2(SEQ ID No: 2)의 유전자 DNA를 보유하는 재조합 플라스미드를 pYN2-C1(배열 번호: 2로부터 유래)로서 정의하였고, 배열 번호: 4(SEQ ID No: 4)의 유전자 DNA를 보유하는 재조합 플라스미드를 pYN2-C2(배열 번호: 4로부터 유래)로서 정의하였다.
각각 고유의 재조합 플라스미드를 가지는 재조합 대장균주, pYN2-C1 재조합 주 및 pYN2-C2 재조합 주를 얻기 위하여 pYN2-C1와 pYN2-C2를 사용하여 염화 칼륨법에 의해 대장균(Escherichia coli HBl01fB주, fadB 결손변이)을 형질전환하였다.
pYN2-C1 재조합 주 및 pYN2-C2 재조합 주를 각각 효모 추출물 0.5%와 옥탄산 0.1%를 함유하는 M9 배지의 200ml에 깔고, 37℃에서 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 24시간 후에, 원심분리에 의하여 균체를 회수하고, 일반적인 방법을 사용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다.
pYN2-C1에 대하여, 상류 프라이머로서 기능하는 올리고뉴클레오타이드(배열 번호: 11) 및 하류 프라이머로서 기능하는 올리고뉴클레오타이드(배열 번호: 12)를 각각 디자인하고 합성하였다(Amasham Pharmacia·Biotech). 상류에 BamHⅠ 제한부위를 가지고, 하류에 XhoⅠ 제한 부위를 가지는 PHA 합성 효소의 완전한 길이의 유전자를 증폭하기 위하여, 이러한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 템플레이트로서 pYN2-C1와 PCR(LA-PCR Kit; Takara Shuzo Co., Ltd.)을 시행하였다.
마찬가지의 방법으로, pYN2-C2에 대하여, 상류 프라이머(SEQ ID No: 13)로서 기능하는 올리고뉴클레오타이드와 하류 프라이머(SEQ ID No: 14)로서 기능하는 올리고뉴클레오타이드를 각각 디자인하고 합성하였다(Amasham Pharmacia·Biotech). 상류에 BamHⅠ 제한 부위를 가지고, 하류에 XhoⅠ 제한 부위를 가지는 PHA 합성 효소의 완전한 길이의 유전자를 증폭하기 위하여, 이러한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 템플레이트로서 pYN2-C2와 PCR(LA-PCR Kit; Takara Shuzo Co., Ltd.)을 시행하였다.
PCR로 증폭된 산물의 정제된 각각을 BamHI 및 XhoI에 의하여 절단하고, 플라스미드 pGEX-6P-1(Amasham Pharmacia·Biotech사 제품)의 대응하는 부위에 삽입하였다. 이러한 벡터는 대장균(JM109)을 형질전환 하는데 사용되고 발현을 위한 균주를 얻었다. 미니프레프(Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PR0MEGA사 제품)를 이용하여 대량으로 제조된 플라스미드 DNA에 BamHI 및 XhoI을 처리함으로써 얻은 DNA 단편으로 균주를 확인하였다. 얻어진 균주를 LB-Amp 배지의 10 mL에서 하룻밤 동안 미리 배양하고, LB-Amp 배지의 10 mL에 균주의 0.1mL를 첨가한 후, 37℃에서 3시간 동안 170rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후에, IPTG를 첨가(1mM의 최종 농도)하고, 37℃에서 4 내지 12시간 동안 배양을 계속하여 시행하였다.
IPTG로 유도된 대장균을 회수(8000×g, 2분, 4℃)하고, 4℃에서 PBS의 1㎖에 현탁하였다. 동결 융해 및 소니케이션에 의하여 세포를 파쇄하고, 세포 파편을 제거하기 위하여 원심분리(8000×g, 10분, 4℃)하였다. 상층액 내에 원하는 발현 단백질의 존재는 SDS-PAGE에 의하여 확인하고, 유도되고 발현된 GST 융합 단백질을 글루타티온 세파로스 4B 비즈(Glutathion Sepharose 4B beads: Amasham Pharmacia·Biotech사 제품)에 의하여 정제하였다.
정제에 사용하기 위한 글루타티온 세파로스에, 먼저 비특이적인 흡착을 억제하기 위한 처리를 가한다. 구체적으로, 글루타티온 세파로스를 PBS의 같은 양으로 3회 세정한 후(8000×g, 1분, 4℃), 4% BSA를 함유하는 PBS의 같은 양을 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 글루타티온 세파로스를 처리하였다. 처리 후에, PBS의 같은 양으로 글루타티온 세파로스를 2회 세정하고, PBS 양의 1/2에 재현탁하였다. 사전 처리된 글루타티온 세파로스의 4O㎕를 무세포 추출액의 1㎖에 첨가하고, 4℃에서 부드럽게 교반하였다. 이렇게 함으로써, 융합 단백질 GST-YN2-C1 및 GST-YN2-C2를 글루타티온 세파로스에 흡착시켰다.
흡착된 후, 원심분리(8000×g, 1분, 4℃)에 의하여 글루타티온 세파로스를 회수하고, PBS의 400㎕로 3회 세정하였다. 그 후, 감소된 글루타티온의 10mM의 40㎕를 첨가하고, 흡착된 융합 단백질을 용출하기 위하여 4℃에서 1시간동안 교반하였다. 원심분리(8000×g, 2분, 4℃)한 후 상층액을 회수하고, GST 융합 단백질을 정제하기 위하여 PBS에 대한 투석을 실시하였다. 단백질이 단일 밴드를 표시하는 것은 SDS-PAGE에 의하여 확인한다.
각각의 GST 융합 단백질 500μg을 프리시션 프로테아제(PreScission protease, Amasham Pharmacia·Biotech, 5U)에 의하여 절단한 후, 프로테아제와 GST를 제거하기 위하여 글루타티온 세파로스를 통과시켰다. 최종적으로 정제된 발현 단백질 YN2-C1 및 YN2-C2를 얻기 위하여 PBS에 의해 평형화된 세파덱스 G200컬럼으로 병류부분 분리법(flow-through fraction)을 부가하여 가공하였다. SDS-PAGE에 의하여 각각 60.8kDa 및 61.5kDa의 단일 밴드를 나타내는 것을 확인하였다.
정제된 효소 용액 10U/㎖를 얻기 위하여 각각의 정제된 효소용액을 생물학적 용액 시료 농축제(Mizubutorikun AB-1100, Ato Co., Ltd. 제품)를 사용하여 농축하였다.
각각의 정제된 효소의 활성은 상기 언급한 방법에 의하여 측정하였다. 또한, 시료내 단백질의 농도는 마이크로 BCA 단백질 정량 시약 키트(Pierce Chemical Co., Ltd.)에 의하여 측정하였다. 각각의 정제된 효소의 활성 측정결과를 표 1에 나타낸다.
활성 특이활성
YN2-C1YN2-C2 2.1 U/mL1.5 U/mL 4.1 U/㎎ 단백질3.6 U/㎎ 단백질
(참고예 2) PHA 합성 효소의 생산 2
P91, H45, YN2 또는 P161주를, 효모 추출물(Difco사 제품)의 0.5%와 옥탄산의 0.1%를 포함하는 M9배지의 200m1에 깔고, 30℃에서 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 24시간 후에, 세포를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의하여 회수하고, 트리스 염산 버퍼(pH 8.0)의 0.1M의 200m1에 재현탁하고, 다시 원심분리함으로써 세포를 세정하였다. 세포를 트리스 염산 버퍼(pH 8.0)의 0.1M의 2.0m1에 재현탁하고, 초음파 파쇄기에 의하여 파쇄한 후, 원료 효소를 얻기 위하여 원심분리(12,000×g, 4℃, 10분)하고 상층액을 회수하였다. 각각의 원료 효소의 활성 측정의 결과를 표 2에 나타내었다.
활성
P91 균주H45 균주YN2 균주P161 균주 0.1 U/mL0.2 U/mL0.4 U/mL0.2 U/mL
정제된 효소 용액의 10U/㎖를 얻기 위하여 각각의 효소를 생물학적 용액 시료 농축제(Mizubutorikun AB-1100, Ato Co., Ltd. 제품)를 사용하여 농축하였다.
(참고예 3)
3-하디록시아실 CoA의 합성
(R)-3-하이드록시옥타노일-CoA를 문헌「Rehm BHA, Kruger N, Steinbuchel A (1998) Journal of Bio1ogical Chemistry 273 pp 24044-24051」의 방법에 의거하여, 약간 수정한 방법으로 하기 과정을 따라 합성하였다. 농도가 마이크로리터당 0.1밀리유닛이기 위하여 아실-CoA 신테타제(Sigma사 제품)를 2mM ATP, 5mM MgC12, 2mM CoA 및 2mM (R)-3-하이드록시옥타노에이트를 포함하는 트리스 염산 완충 용액(50mM, pH 7.5)에 용해하였다. 그 용액을 37℃의 더운물에 저장하고, HPLC에의하여 반응의 진행을 분석하기 위하여 적시에 시료화 하였다. 농도를 0.02N로 만들기 위하여 황산을 시료화한 반응 용액에 첨가하고 효소 반응을 멈춘 후에, n-heptane에 의하여 미반응 기질인 (R)-3-hydroxyoctanoate를 추출하고 제거하였다. HPLC에 의한 분석에는, RP18컬럼(nucleosil C18, 7㎛, Knauser)을 이용하여, 이동상으로서 25mM 인산 완충 용액(pH 5.3)을 사용하여 아세트니트릴의 직선 농도 그라디언트를 통하여 용출하고, 다이오드 어래이 검출기에 의해 200 내지 500nm의 흡광 스펙트럼을 모니터함으로써, 효소 반응을 통하여 생산되는 티오에스테르 화합물을 발견하였다. 마찬가지의 방법으로, (R)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA 및 (R)-3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐)발레릴 CoA를 제조하였다.
(실시예 1)
잉크를 담지하는 PHA-피복 리포솜
클로로포름과 이소프로필 에테르가 1 대 1 비율의 혼합 용액으로 70㎖를 함유하는 1ℓ비커에, 디팔미토일포스파티딜콜린의 159.7㎎, 디스테아릴포스파티딜콜린의 172.0㎎ 및 콜레스테롤의 168.3㎎(1:1:2의 몰비, 총 500㎎)을 용해시켰다. 이 용액에 수용성 염료 다이렉트 스페셜 블랙 AXN (Nihon Kayaku사 제품)의 용액의 10mL를 첨가하고, 결과 용액을 30초 동안 초음파의 50와트에 의해 방사함으로써 유화하고, w/o 유화액을 제조하기 위하여 이 시행을 프로브계 초음파 발진기(Ohtake)를 사용하여 11번 반복하였다. 유기용매를 제거하기 위하여 이렇게 제조된 유화액을 감압하 60℃에서 로터리 증발기를 통과시킴으로써, 염료가 담지된 리포솜을 얻었다. 증발기의 진공도는 초기 단계에서는 높았고, 유기용매의 증발이 진행되는 것에 따라 튀는 것을 막기 위하여 진공도를 낮춤으로써 조절하였다. 그 후, 염료가 담지된 리포솜내에 잔류하는 유기 용매의 소량을 질소가스를 내뿜으로써 보다 제거하였다. 결과물인 염료를 담지한 리포솜에 10mM 인산 완충 용액(pH 7.0)의 적절한 양을 첨가하여 30㎖로 하고, 1.2㎛의 필터(Acrodisc, Gelman)에 의하여 여과한 후, 외부의 염료를 제거하기 위하여 24시간 동안 1OmM 인산 완충 용액중에서 투석막(Spectrapor, Spectrum Medical)을 이용하여 투석함으로써 염료가 담지된 리포솜을 얻었다. 리포솜의 평균적인 입자의 지름은 동적광산란법에 의하여 650nm인 것으로 측정하였다.
염료가 담지된 리포솜에 참고예 1에서 제조된 슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2)로부터 유래된 PHA 합성 효소 YN2-C1를 첨가하고(100 U), 20℃에서 30분 동안 결과 물질을 유지시켰다. 그 후, 최종 농도가 5mM이 되기 위하여 생산물에 참고예 3에서 제조된 (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA를 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 배양함으로써 합성 반응을 실시하였다.
PHA로 피복된 리포솜을 얻기 위하여 반응 용액을 겔 여과법(Sephadex G-50 컬럼)에 의하여 크기를 분획하였다. 동적광산란법에 의하여 PHA로 피복된 리포솜을 측정하고, 750nm의 평균적인 입자 지름을 가지는 단분산계인 것을 발견하였다.
제조된 PHA로 피복된 리포솜의 일부를 진공 건조하고, 결과물을 클로로포름의 20㎖에 현탁한 후, 외막을 구성하는 PHA를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출액을 0.45㎛의 구멍 지름을 가지는 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 감압하에서 로터리 증발기에 의하여 농축하고, 일반적인 방법에 의거하여 메탄올라이시스하고, 가스 크로마토그래피 및 질량 분광계(GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI 모드)에 의하여 분석하고, 이어서 PHA 모노머 유닛의 메틸 에스테르화된 화합물을 확인하였다. 그 결과, 도 2에 도시한 바와 같이, PHA는 모노머 유닛으로서 3-하이드록시옥탄산을 가지는 PHA인 것이 확인되었다. 또한, PHA의 분자량을 겔 파미에이션 크로마토그래피(GPC; 토소 HLC-8020, 컬럼; 폴리머 레버러터리 PLgel MIXED-C(5㎛), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리에틸렌 환산)에 의하여 Mn=16,000, Mw=36,000인 것으로 측정하였다.
(실시예 2)
항생제가 담지된 PHA-피복 리포솜
항생제로서 밴코마이신을 담지하는 리포솜을 하기와 같이 제조하였다. 가지형 플라스크 내 클로로포름의 20㎖에 정제 노른자 레시틴의 2.1g과 콜레스테롤의 0.9g을 용해하였다. 그 후, 로터리 증발기를 사용하여 클로로포름을 제거하고, 완전하게 건조된 막 성분 혼합물을 얻기 위하여 진공건조기를 사용하였다. 이 혼합물에 5% 글루코스 수용액의 20㎖ 및 밴코마이신의 0.4 g을 첨가하고 결과물인 혼합물을 초음파처리에 의하여 현탁한 후, 밴코마이신을 포함하는 다박막 운반구를 얻기 위하여 동결 용융하였다. 리포솜 내에 담지되지 않은 밴코마이신을 제거하기 위하여 그 용액을 세파덱스 G-50 컬럼 위에서 겔 여과하고 크기가 분획된 리포솜 단편을 얻었다. 동적광산란법에 의하여 평균적인 입자 지름이 750nm인 것으로 측정하였다.
참고예 1에서 제조된 슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2)로부터 유래된 PHA 합성 효소 YN2-C2를 물질에 첨가하고(100 U), 20℃에서 30분 동안 결과 물질을 유지시켰다. 그 후, 최종 농도가 5mM이 되기 위하여 생산물에 참고예 3에서 제조된 (R)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA를 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 배양함으로써 합성 반응을 실시하였다.
PHA로 피복된 리포솜을 얻기 위하여 반응 용액을 겔 여과법(Sephadex G-50 컬럼)에 의하여 크기를 분획하였다. 동적광산란법에 의하여 PHA로 피복된 리포솜을 측정하고, 820nm의 평균적인 입자 지름을 가지는 단분산계인 것을 발견하였다.
제조된 PHA로 피복된 리포솜의 일부를 진공 건조하고, 결과 물질을 클로로포름의 20㎖에 현탁한 후, 외막을 구성하는 PHA를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출액을 0.45㎛의 구멍 지름을 가지는 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 감압하에서 로터리 증발기에 의하여 농축하고, 일반적인 방법에 의거하여 메탄올라이시스하고, 가스 크로마토그래피 및 질량 분광계(GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI 모드)에 의하여 분석하고, 이어서 PHA 모노머 유닛의 메틸 에스테르화된 화합물을 확인하였다. 그 결과, 도 3에 도시한 바와 같이, PHA는 모노머 유닛으로서 3-하이드록시-5-페닐발레르산을 가지는 PHA인 것이 확인되었다. 또한, PHA의 분자량을 겔 파미에이션 크로마토그래피(GPC; 토소 HLC-8020, 컬럼; 폴리머 레버러터리 PLgel MIXED-C(5㎛), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리에틸렌 환산)에 의하여 Mn=18,000, Mw=38,000인 것으로 측정하였다.
(실시예 3)
농예 화학제가 담지된 PHA-피복 리포솜
농예 화학 활성 성분 화합물로서 o,o-디메틸 o-(3-메틸-4-니트로페닐)포스포로티오에이트를 담지하는 리포솜을 하기와 같이 제조하였다. 가지형 플라스크 내 클로로포름의 20㎖에 정제 노른자 레시틴의 2.1g과 콜레스테롤의 0.9g을 용해하였다. 그 후, 로터리 증발기를 사용하여 클로로포름을 제거하고, 완전하게 건조된 막 성분 혼합물을 얻기 위하여 진공건조기를 사용하였다. 이 혼합물에 5% o-(3-메틸-4-니트로페닐)포스포로티오에이트 수용액의 20㎖를 첨가하고 결과물인 혼합물을 초음파처리에 의하여 현탁한 후, o-(3-메틸-4-니트로페닐)포스포로티오에이트를 포함하는 다박막 운반구를 얻기 위하여 동결 용융하였다. 리포솜 내에 담지되지 않은 o-(3-메틸-4-니트로페닐)포스포로티오에이트를 제거하기 위하여 그 용액을 세파덱스 G-50 컬럼 위에서 겔 여과하고, 크기가 분획된 리포솜 단편을 부여하였다. 동적광산란법에 의하여 평균적인 입자 지름이 730nm인 것으로 측정하였다.
참고예 2에서 제조된 P161 균주로부터 유래된 PHA 신테아제를 물질에 첨가하고(100 U), 20℃에서 30분 동안 결과 물질을 유지시켰다. 그 후, 최종 농도가 5mM이 되기 위하여 생산물에 참고예 3에서 제조된 (R)-3-하이드록시-5-(4??플루오로페닐)발레릴 CoA를 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 배양함으로써 합성 반응을 실시하였다.
PHA로 피복된 리포솜을 얻기 위하여 반응 용액을 겔 여과법(Sephadex G-50 컬럼)에 의하여 크기를 분획하였다. 동적광산란법에 의하여 PHA로 피복된 리포솜을 측정하고, 790nm의 평균적인 입자 지름을 가지는 단분산계인 것을 발견하였다.
제조된 PHA로 피복된 리포솜의 일부를 진공 건조하고, 결과 물질을 클로로포름의 20㎖에 현탁한 후, 외막을 구성하는 PHA를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출액을 0.45㎛의 구멍 지름을 가지는 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 감압하에서 로터리 증발기에 의하여 농축하고, 일반적인 방법에 의거하여 메탄올라이시스하고, 가스 크로마토그래피 및 질량 분광계(GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI 모드)에 의하여 분석하고, 이어서 PHA 모노머 유닛의 메틸 에스테르화된 화합물을 확인하였다. 그 결과, 도 4에 도시한 바와 같이, PHA는 모노머 유닛으로서 (R)-3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐)발레르산을 가지는 PHA인 것이 확인되었다. 또한, PHA의 분자량을 겔 파미에이션 크로마토그래피(GPC; 토소 HLC-8020, 컬럼; 폴리머 레버러터리 PLgel MIXED-C(5㎛), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리에틸렌 환산)에 의하여 Mn=18,000, Mw=38,000인 것으로 측정하였다.
(실시예 4)
화장료가 담지된 PHA 피복 리포솜
화장료로서 자외선 흡수제의 일례인, 2,4-디하이드록시벤조페논을 담지하는 리포솜을 하기와 같이 제조하였다. 클로로포름과 이소프로필 에테르가 1 대 1 비율의 혼합 용액으로 70㎖를 함유하는 1ℓ비커에, 디팔미토일포스파티딜콜린의 159.7㎎, 디스테아릴포스파티딜콜린의 172.0㎎ 및 콜레스테롤의 168.3㎎(1:1:2의 몰비, 총 500㎎)을 용해시켰다. 이 용액에 2,4-디하이드록시벤조페논의 5% 중량비 용액의 10㎖를 첨가하고, w/o 유화액을 제조하기 위하여 프로브계 초음파 발진기(Ohtake)를 사용하여 30초 동안 11번 초음파의 50와트를 방사함으로써 결과 용액을 유화하였다. 유기용매를 제거하기 위하여 이렇게 제조된 유화액을 감압하 60℃에서 로터리 증발기를 통과시킴으로써, 2,4-디하이드록시벤조페논을 담지한 리포솜을 얻었다. 증발기의 진공도는 초기 단계에서는 높았고, 유기용매의 증발이 진행되는 것에 따라 충돌(bumping)을 막기 위하여 진공도를 낮춤으로써 조절하였다. 그 후, 2,4-디하이드록시벤조페논을 담지한 리포솜내에 잔류하는 유기 용매의 소량을 질소가스를 내뿜으로써 보다 제거하였다. 결과물인 2,4-디하이드록시벤조페논을 담지한 리포솜에 10mM 인산 완충 용액(pH 7.0)의 적절한 양을 첨가하여 30㎖로 하고, 1.2㎛의 필터(Acrodisc, Gelman)에 의하여 여과한 후, 외부의 2,4-디하이드록시벤조페논을 제거하기 위하여 24시간 동안 1OmM 인산 완충 용액중에서 투석막(Spectrapor, Spectrum Medical)을 이용하여 투석함으로써 2,4-디하이드록시벤조페논이 담지된 리포솜을 얻었다. 리포솜의 평균적인 입자의 지름은 동적광산란법에 의하여 660nm인 것으로 측정하였다.
2,4-디하이드록시벤조페논이 담지된 리포솜에 참고예 2에서 제조된 H45 균주로부터 유래된 PHA 신테아제를 첨가하고(100 U), 20℃에서 30분 동안 결과 물질을 유지시켰다. 그 후, 최종 농도가 5mM이 되기 위하여 생산물에 참고예 3에서 제조된 (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA를 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 배양함으로써 합성 반응을 실시하였다.
PHA로 피복된 리포솜을 얻기 위하여 반응 용액을 겔 여과법(Sephadex G-50 컬럼)에 의하여 크기를 분획하였다. 동적광산란법에 의하여 PHA로 피복된 리포솜을 측정하고, 730nm의 평균적인 입자 지름을 가지는 단분산계인 것을 발견하였다.
제조된 PHA로 피복된 리포솜의 일부를 진공 건조하고, 결과물을 클로로포름의 20㎖에 현탁한 후, 외막을 구성하는 PHA를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출액을 0.45㎛의 구멍 지름을 가지는 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 감압하에서 로터리 증발기에 의하여 농축하고, 일반적인 방법에 의거하여 메탄올라이시스하고, 가스 크로마토그래피 및 질량 분광계(GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI 모드)에 의하여 분석하고, 이어서 PHA 모노머 유닛의 메틸 에스테르화된 화합물을 확인하였다. 그 결과, PHA는 모노머 유닛으로서 3-하이드록시옥탄산을 가지는 PHA인 것이 확인되었다. 또한, PHA의 분자량을 겔 파미에이션 크로마토그래피(GPC; 토소 HLC-8020, 컬럼; 폴리머 레버러터리 PLgel MIXED-C(5㎛), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리에틸렌 환산)에 의하여 Mn=17,000, Mw=37,000인 것으로 측정하였다.
(실시예 5)
인공 적혈구용 리포솜
항응고제를 포함하는 채혈 백을 이용하여 소의 정맥으로부터 1.5ℓ의 피를 채취하였다. 채취된 혈액을 무균적으로 운반하고, 밀봉된 용기내 4℃에서 보관하였다. 이하의 공정은 모두 4℃의 저온에서 무균적으로 시행하였다. 혈액으로부터의 혈소판, 백혈구 및 플라스마를 제거한 결과물로서 거칠게 세정한 적혈수의 500㎖를 얻기 위하여 생리 식염수를 사용한 연속 원심분리기에 의하여 원심 세정을 시행하였다. 생리 식염수를 사용하여 0.45㎛의 구멍 지름을 가지는 플라스마 분리기에 의하여 적혈구를 보다 세정하였다. 세정된 적혈구의 5OO㎖에 대하여 발열성 물질이 없는 증류수의 1ℓ를 첨가함으로써 용혈시켰다. 0.45㎛의 구멍 지름을 가지는 플라스마 분리기와 0.1㎛의 구멍 지름을 가지는 플라스마 성분 분리기를 사용하여 적혈구에서 적혈구 막의 제거 및 여과 무균화를 시행하였다. 8%(w/w)의 헤모글로빈 농도의 적혈구 막 제거 헤모글로빈 약 1.2ℓ를 얻었다. 투석기 TAF1OW (Terumo 사의 셀룰로오스계 오목한 투석기)를 이용하여 초여과에 의해 물질을 농축하고, 50%(w/w)의 헤모글로빈 농도의 적혈구 막 제거 헤모글로빈 약 180㎖를 투석하여 얻었다.
수소처리 비율 80%의 정제된 포스파티딜콜린의 27.76g과, 콜레스테롤의 6.96g과, 수소처리 비율 80%의 정제된 포스파티드산의 3.75 g을 클로로포름에 용해하였다. 가지형 플라스크 내에 존재하는 지질 용액을 증발기에 의하여 클로로포름을 제거함으로써, 가지형 플라스크의 바닥에서 지질 막을 형성시켰다. 16시간 동안 보다 진공 건조하여 클로로포름을 완벽하게 제거하였다.
폴텍스 혼합기(Poltex mixer)에 의하여 유화액을 얻기위해, 리포솜을 형성하는 지질의 준비에서 제조된 지질 막에 적혈구 막 제거 헤모글로빈의 180㎖를 첨가함으로써 원료 물질 용액을 제조하였다. 원료 물질을 세극 노즐을 가지는 가압 용기와 펄 세포 비커(Parr cell beaker, Parr사 제품)에 넣고; 그것에 질소 가스를 주입하고 압력을 130Kg/cm2가하였다. 질소 가스가 원료 물질 용액에 충분하게 침투되도록 30분 동안 방치하였다. 그 후, 원료 물질을 분출하기 위하여 압력을 130Kg/cm2로 유지하면서 노즐의 밸브를 서서히 개방하였다.
리포솜 내에 담지되지 않은 헤모글로빈을 제거하기 위하여 가압 분출에 이어서 액체를 겔 여과법(Sephadex G-50 컬럼)에 의하여 분획함으로써, 헤모글로빈을 담지하는 리포솜을 얻었다.
헤모글로빈이 담지된 리포솜에 참고예 1에서 제조된 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii)로부터 유래된 PHA 신테아제 YN2-C1를 첨가하고(100 U), 20℃에서 30분 동안 결과 물질을 유지시켰다. 그 후, 최종 농도가 5mM이 되기 위하여 생산물에 참고예 3에서 제조된 (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA를 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 배양함으로써 합성 반응을 실시하였다.
PHA로 피복된 리포솜을 얻기 위하여 반응 용액을 겔 여과법(Sephadex G-50 컬럼)에 의하여 크기를 분획하였다. 동적광산란법에 의하여 PHA로 피복된 리포솜을 측정하고, 720nm의 평균적인 입자 지름을 가지는 단분산계인 것을 발견하였다.
제조된 PHA로 피복된 리포솜의 일부를 진공 건조하고, 결과물을 클로로포름의 20㎖에 현탁한 후, 외막을 구성하는 PHA를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출액을 0.45㎛의 구멍 지름을 가지는 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 감압하에서 로터리 증발기에 의하여 농축하고, 일반적인 방법에 의거하여 메탄올라이시스하고, 가스 크로마토그래피 및 질량 분광계(GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI 모드)에 의하여 분석하고, 이어서 PHA 모노머 유닛의 메틸 에스테르화된 화합물을 확인하였다. 그 결과, PHA는 모노머 유닛으로서 3-하이드록시옥탄산을 가지는 PHA인 것이 확인되었다. 또한, PHA의 분자량을 겔 파미에이션 크로마토그래피(GPC; 토소 HLC-8020, 컬럼; 폴리머 레버러터리 PLgel MIXED-C(5㎛), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리에틸렌 환산)에 의하여 Mn=17,000, Mw=37,000인 것으로 측정하였다.
(실시예 6)
칼세인이 담지된 PHA-피복 리포솜의 서방성(controlled releasability)
클로로포름과 이소프로필 에테르가 1 대 1 비율의 혼합 용액으로 70㎖를 함유하는 1ℓ비커에, 디팔미토일포스파티딜콜린의 500㎎을 용해시켰다. 이 용액에 형광색소 수화합물 칼세인의 수용액 10㎖를 첨가하고, w/o 유화액을 제조하기 위하여 프로브계 초음파 발진기(Ohtake)를 사용하여 30초 동안 11번 초음파의 50와트를 방사함으로써 결과 용액을 유화하였다. 유기용매를 제거하기 위하여 이렇게 제조된 유화액을 감압하 60℃에서 로터리 증발기를 통과시킴으로써, 칼세인이 담지된 리포솜을 얻었다. 증발기의 진공도는 초기 단계에서는 높았고, 유기용매의 증발이 진행되는 것에 따라 튀는 것을 막기 위하여 진공도를 낮춤으로써 조절하였다. 그 후, 칼세인이 담지된 리포솜 내에 잔류하는 유기 용매의 소량을 질소가스를 내뿜으로써 보다 제거하였다. 결과물인 칼세인이 담지된 리포솜에 10mM 인산 완충 용액(pH 7.0)의 적절한 양을 첨가하여 30㎖로 하고, 1.2㎛의 필터(Acrodisc, Gelman)에 의하여 여과함으로써, 리포솜과 그 내부에 담지한 칼세인을 얻었다.
칼세인이 담지된 리포솜의 일부에 참고예 1에서 제조된 슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2)로부터 유래된 PHA 신테아제 YN2-C1를 첨가하고(100 U), 20℃에서 30분 동안 결과 물질을 유지시켰다. 그 후, 최종 농도가 5mM이 되기 위하여 생산물에 참고예 3에서 제조된 (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA를 첨가하였다. 20℃에서 90분 동안 배양함으로써 합성 반응을 실시하였다.
PHA로 피복된 리포솜을 얻기 위하여 반응 용액을 겔 여과법(Sephadex G-50 컬럼)에 의하여 크기를 분획하였다.
PHA로 피복된 리포솜으로부터의 칼세인의 방출 및 PHA에 의하여 피복되지 않은 리포솜은 칼세인에 대한 형광의 강도를 측정함으로써 결정하였다. 그 결과를 도 5에 도시한다. 도 5에서, 숫자 6은 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜으로부터 방출하는 칼세인의 거동을 나타내고; 숫자 7은 폴리하이드록시알카노에이트에 의하여 피복되지 않은 리포솜으로부터 방출되는 칼세인의 거동을 나타낸다.
상 전이 온도 이하의 온도(25℃)에서 인지질 막의 서방성에 대하여, PHA로 피복된 리포솜(6)은 PHA(7)에 의하여 피복되지 않은 리포솜과 비교하여 유지능력이 뛰어났다. 상 전이 온도(약 42℃)에서 인지질 막의 서방성은, PHA로 피복된 리포솜(6)이 PHA(7)에 의하여 피복되지 않은 리포솜과 비교하여 조속한 방출 특성을 나타내었다. 온도를 다시 25℃로 되돌릴 경우, PHA로 피복된 리포솜의 방출 특성은 억제되었다.
따라서, 본 실시예의 PHA로 피복된 리포솜은, PHA에 의하여 피복되지 않은 리포솜과 비교하여 서방성의 온도 감수성에서 향상되었음을 나타낸다. 실온(25℃)에서 유지 능력의 향상은, 피복하는 PHA의 큰 기계적 강도 때문에 리포솜의 외측과 내측 간의 삼투압 차이에 기인하여, 리포솜으로부터의 내용물의 누출의 억제 때문인 것으로 보여진다. 한편, 상전이 온도에서 방출 능력의 향상의 이유는, PHA로 피복되지 않은 리포솜과 비교하여 PHA로 피복된 리포솜에서 삼투압 차이가크게 유지되고 있고, 이 삼투압 차이가 내용물의 누출을 가속화하고, 또한 PHA의 외피가 다공성이기 때문에 내용물의 빠른 통과의 결과 때문인 것으로 보여진다.
(실시예 7)
그라디언트 구조를 가지는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜
클로로포름과 이소프로필 에테르가 1 대 1 비율의 혼합 용액으로 70㎖를 함유하는 1ℓ비커에, 디팔미토일포스파티딜콜린의 500㎎을 용해시켰다. 이 용액에 형광색소 화합물 칼세인의 수용액 10㎖를 첨가하고, w/o 유화액을 제조하기 위하여 프로브계 초음파 발진기(Ohtake)를 사용하여 30초 동안 11번 초음파의 50와트를 방사함으로써 결과 용액을 유화하였다. 유기용매를 제거하기 위하여 이렇게 제조된 유화액을 감압하 60℃에서 로터리 증발기를 통과시킴으로써, 칼세인이 담지된 리포솜을 얻었다. 증발기의 진공도는 초기 단계에서는 높았고, 유기용매의 증발이 진행되는 것에 따라 튀는 것을 막기 위하여 진공도를 낮춤으로써 조절하였다. 그 후, 칼세인이 담지된 리포솜 내에 잔류하는 유기 용매의 소량을 질소가스를 내뿜으로써 보다 제거하였다. 결과물인 칼세인이 담지된 리포솜에 10mM 인산 완충 용액(pH 7.0)의 적절한 양을 첨가하여 30㎖로 하고, 1.2㎛의 필터(Acrodisc, Gelman)에 의하여 여과함으로써, 리포솜과 그 내부에 담지한 칼세인을 얻었다.
칼세인이 담지된 리포솜의 일부에 참고예 1에서 제조된 슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2)로부터 유래된 PHA 신테아제 YN2-C1를 첨가하고(100 U), 리포솜의 표면에 PHA 합성 효소를 고정하기 위하여 20℃에서 30분 동안 결과 물질을 부드럽게 교반하였다.
합성 효소가 고정된 리포솜 단편을 얻기 위하여 결과 물질을 겔 여과법(Sephadex G-50 컬럼)에 의하여 크기를 분획하였다. 상기 언급한 합성 효소가 고정된 리포솜에 30mM (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA (Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997)에 기재된 방법에 의하여 제조)과 0.1% 소 혈청 알부민(Sigma Chemical사 제품)을 포함하는 0.1M 인산 버퍼(pH 7.0)의 100중량부를 첨가하였다. 그 후, 용액을 30℃에서 부드러운 교반을 유지하면서, 이 반응 용액에 30mM (R)-3-하이드록시피메릴 CoA (J. Bacterio1., 182, 2753-2760 (2000)에 기재된 방법에 의하여 제조)과 0.1% 소 혈청 알부민(Sigma사 제품)을 포함하는 0.lM 인산 버퍼(pH 7.0)를 마이크로튜브 펌프(Tokyo Rikakikai사 제품 MP-3N)를 이용하여 분당 25중량부의 비율로 첨가하였다.
30분 진탕 후, 미반응된 재료 등을 제거하기 위하여 결과 용액을 0.1M 인산 버퍼(pH 7.0)에 의하여 세정하고, 공기 건조함으로써, 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을 얻었다.
이 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을 동결건조한 후, 그 표면에 형성된 고분자의 분자량을 이동 시보 2차 이온 질량 분광계(TOF-SIMS IV, CAMECA사 제품)에 의하여 측정하였다. 얻어진 질량 스펙트럼은 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 표면이 3-하이드록시피멜산 및 3-하이드록시옥탄산의 공중합체(17:1의 몰비)로 구성된 것을 나타내었다. 또한, 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 표면을 조금씩 깎고, 마찬가지로 TOF-SIMS에 의하여 질량 스펙트럼을 측정함에 따라, 상기 언급한 공중합체의 3-하이드록시피멜산의 구성비가점차적으로 감소하고, 3-하이드록시옥탄산의 구성비가 증가하였다. 이것은 실시예의 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 표면이 친수성 작용기를 가지는 폴리하이드록시피멜레이트에 의하여 피복되고, 그 표면 바로 아래의 막이 친수성 작용기를 가지는 3-하이드록시피멜산 및 소수성 작용기를 가지는 3-하이드록시옥탄산의 공중합체에 의하여 피복되고, 막이 하층이 됨으로써 3-하이드록시옥탄산의 구성비가 증가하는 그라디언트 구조로 구성된 리포솜인 것을 나타낸다.
또한, PHA의 분자량을 겔 파미에이션 크로마토그래피(GPC; 토소 HLC-8020, 컬럼; 폴리머 레버러터리 PLgel MIXED-C(5㎛), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리에틸렌 환산)에 의하여 Mn=21,000, Mw=40,000인 것으로 측정하였다.
(실시예 8)
폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조(화학적인 수정)
실시예 7과 같이, 효소가 고정된 리포솜은 칼세인을 그 내부에 담지하고 참고예 1에서 제조된 슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2)로부터 유래된 PHA 신테아제를 그 표면에 고정함으로써 제조된다.
상기 언급한 효소가 고정된 리포솜의 1중량부를 0.1M 인산 버퍼(pH 7.0)의 48중량부에 현탁하고, 이 현탁액에, 3-하이드록시-5-페녹시발레르산을 얻기 위하여 문헌「Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997)」에 설명된 과정을 따라, 3-페녹시프로판올과 브로모에세테이트의 리포마츠키(Reformatsky) 반응으로부터 얻어진 3-하이드록시-5-페녹시발레레이트를 가수분해함으로써 제조된 (R,S)-3-하이드록시-5-페녹시발레릴 CoA의 0.8중량부와, 문헌「Int. J. Bio1. Macromo1., 12, 85-91(1990)」에 설명된 과정을 따라 합성된 3-하이드록시-7-옥텐산의 불포화된 부분을 문헌「Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997)」에 설명된 과정을 따라 제조한 3-클로로벤조산에 의하여 에폭시화 함으로써 제조된 (R,S)-3-하이드록시-7,8-에폭시옥타노일 CoA의 0.2 중량부와, 소 혈청 알부민(Sigma사 제품)의 0.1중량부를 첨가한 후, 시료(1)을 얻기 위하여 결과 용액을 30℃에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다.
비교 참조로서, (R,S)-3-하이드록시-7,8-에폭시옥타노일 CoA를 3-하이드록시옥타노일 CoA로 변경하는 것을 제외하고, 상기 설명한 동일한 방법에 의하여 시료(2)를 얻었다.
상기 시료의 10㎕을 슬라이드 글라스 위에 놓고, 이것에 1% Nile 블루 A 수용액의 10㎕를 첨가하였다. 결과 용액을 슬라이드 글라스 위에서 혼합하고, 그 위에 커버 글라스를 덮고 이어서 형광 현미경(330 내지 380nm 여기(勵起) 필터, 420nm 롱 패스 흡수 필터; Nikon사 제품) 관찰하였다. 그 결과, 모든 시료가 리포솜의 표면으로부터 형광의 방사를 나타내었다. 따라서, 리포솜은 그 표면이 PHA에 의하여 피복되어 있음을 보여준다.
대조부로서, 0.1M 인산 버퍼(pH 7.0)의 49중량부에 폴리하이드록시알카노에이트에 의하여 피복되지 않은 리포솜의 1중량부를 첨가하고, 30℃에서 2.5시간 동안 이 용액을 부드럽게 교반한 후, 마찬가지로 형광 현미경 관찰하였다. 그 결과, 어떤 리포솜의 표면으로부터도 형광의 방사는 없었다.
또한, 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분 동안)하고, 물질을 진공 건조하고, 그것을 클로로포름에 현탁하고, 현탁액을 60℃에서 20분 동안 교반하고, 이어서 그것을 추출함으로써 시료의 일부를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의하여 외막에 존재하는 PHA를 얻었다. 이 추출물을1H-NMR(사용된 장치: FT-NMR, Bruker DPX400, 측정 핵종:1H, 사용된 용매: 중수소화 클로로포름(TMS함유))에 의하여 분석하였다. 결과물로부터 계산된 곁사슬의 백분율을 표 3에 표시한다.
단량체 유닛 시료 1 시료 2
3-하이드록시-5-페녹시발레르산 84% 76%
3-하이드록시-7,8-에폭시옥탄산 16% -
3-하이드록시옥탄산 - 24%
폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜을 회수하기 위하여 상기 설명한 시료(1)의 50중량부를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분 동안)하였다. 결과물인 리포솜을 정제된 물의 50중량부에 현탁하고 이 조작을 3번 반복하였다. 이 현탁액에 가교제로서 헥사메틸렌디아민의 0.5중량부를 용해하였다. 용해를 확인한 후, 동결건조에 의하여 물을 제거하였다(시료3). 또한, 시료(3)을 70℃에서 12시간 동안 반응시켰다(시료4).
상기 언급한 시료(3) 및 시료(4)를 클로로포름에 현탁하고, 결과물인 현탁액을 60℃에서 20시간 동안 교반한 후, 외피에 존재하는 PHA를 추출하였다. 진공 건조에 의하여 클로로포름을 제거한 후, 시차 주사 열량계(DSC: Perkin Elmer; pyris 1, 상승한 온도의 비율: 1O℃/분)에 의하여 PHA를 측정하였다. 그 결과는, 고분자간의 가교화를 진행시키기 위하여 고분자 내의 에폭시기가 헥사메틸렌디아민과 반응하는 것을 나타내면서, 시료(3)이 90℃ 부근에서 명확한 발열 피크를 나타내는 것을 보여준다. 한편, 시료(4)는 가교화 반응이 거의 완료되었음을 나타내는 명확한 열 흐름을 보이지 않는다.
또한, 동일한 시료에 대하여, 적외 흡수(FT-IR: Perkin Elmer 1720X)를 측정하였다. 그 결과, 시료(3)에서 보여진 아민(3340cm-1부근) 및 에폭시기(822cm-1부근)에 기인한 피크가 시료(4)에서는 보여지지 않았다.
결과적으로, 가교화된 고분자를 얻기 위하여 곁사슬에 에폭시 유닛을 가지는 PHA와 헥사메틸렌디아민이 반응하는 것을 보여준다.
한편, 비교 참조로서 시료(2)를 마찬가지로 측정하였다; 그러나, 상기 결과와 같이 고분자간의 가교롸를 명확하게 나타내는 결과는 얻지 못했다.
본 발명을 바람직한 실시예와 관련하여 상세하게 설명하였고, 본 발명의 넓은 측면에서 본 발명으로부터 일탈함이 없이 변경과 변형할 수 있으므로, 본 발명의 진실한 정신에 포함되는 모든 그러한 변경과 변형을 포함하도록 첨부된 청구항에 의도되어 있다.

Claims (51)

  1. 리포솜의 외벽의 적어도 일부가 폴리하이드록시알카노에이트에 의하여 피복된 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는,
    의 화학식[1]
    (식중, 기호 "a"는 정수를 나타내고, R1과 "a"의 조합은,
    수소원자와 0 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합과;
    할로겐 원자와 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합과;
    발색단과 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합과;
    카르복실 군 또는 그 염과 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합과;
    과 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합으로 구성된 군으로부터 선택됨)과,
    의 화학식[2](식중, b는 0 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R2는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 구성된 군으로부터 선택됨)과,
    의 화학식[3](식중, c는 1 내지 8로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의정수를 나타내고, R3는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 구성된 군으로부터 선택됨)과,
    의 화학식[4](식중, d는 0 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R4는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 구성된 군으로부터 선택됨)과,
    의 화학식[5](식중, e는 1 내지 8로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R5는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5,-C3F7,-CH3, -C2H5및 -C3H7로 구성된 군으로부터 선택됨)과,
    의 화학식[6](식중, f는 0 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타냄)과,
    의 화학식[7](식중, g는 1 내지 8로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타냄)과,
    의 화학식[8](식중 h는 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의정수를 나타내고, R6는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -COOR', -SO2R'', -CH3, -C2H5,-C3H7,-CH(CH3)2및 -C(CH3)3로 구성된 군으로부터 선택되고, R'은 수소 원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5로 구성된 군으로부터 선택되고, R''는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐 원자, -OCH3및 -OC2H5로 구성된 군으로부터 선택됨)과,
    의 화학식[9](식중, i는 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R7은 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -COOR' 및 -SO2R''로 구성된 군으로부터 선택되고, R'은 수소 원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5로 구성된 군으로부터 선택되고, R''는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐 원자, -OCH3및 -OC2H5로 구성된 군으로부터 선택됨) 및
    의 화학식[10](식중, j는 1 내지 9로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타냄)
    으로 표시되는 단량체 유닛으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나로 구성된 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  3. 제 1항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트가 친수성 작용기를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  4. 제 3항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트가 음이온성 작용기를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  5. 제 4항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트가 카르복실기를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  6. 제 5항에 있어서, 카르복실기를 가지는 단량체 유닛이,
    의 화학식[11](식중, k는 1 내지 10의 어느 하나의 정수임)
    으로 표시되는 단량체 유닛을 구성하는 군으로부터 선택된 적어도 한 개인것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 단량체 유닛 조성이 상기 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 안쪽에서 그 외측의 방향으로 변화되는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 적어도 일부가 화학적으로 수정된 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  9. 제 8항에 있어서, 화학적으로 수정된 상기 폴리하이드록시알카노에이트가 적어도 그라프트사슬을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 그라프트사슬이, 에폭시기를 가지는 적어도 하나의 단량체 유닛을 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트의 화학적인 수정에 의하여 형성된 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 그라프트사슬이 각각 아미노기를 가지는 화합물의 그라프트사슬인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 아미노기를 가지는 화합물이 아미노-말단-수정 화합물인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 아미노-말단-수정 화합물의 각각이 폴리비닐 아민, 폴리에틸렌 이민, 아미노-말단-수정 폴리실록산으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  14. 제 8항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 적어도 일부가 가교화된 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 가교화된 폴리하이드록시알카노에이트는, 에폭시기를 가지는 단량체 유닛을 적어도 하나 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트가 가교화된 폴리하이드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 가교화된 폴리하이드록시알카노에이트는 디아민 화합물, 무수 숙신산, 2-에틸-4-메틸이미다졸 및 전자선 방사로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 한 개에 의하여 가교화된 폴리하이드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 디아민 화합물이 헥사메틸렌디아민 인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  18. 제 1항에 있어서, 리포솜에 지질 이외의 물질이 포함된 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  19. 제 18항에 있어서, 물질이 안료 현택액, 염료, 농예 화학적 성분, 헤모글로빈, 화장료 성분, 비료 성분 또는 의약 유효 성분인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  20. 제 1항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트의 분자량이 1,000 내지 10,000,000의 범위인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  21. 제 20항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트의 분자량이 3,000 내지 1,000,000의 범위인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜.
  22. 리포솜의 외벽의 적어도 일부를 폴리하이드록시알카노에이트에 의하여 피복하여, 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법으로서,
    수성배지에서 분산되는 리포솜의 표면에 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 고정하는 공정과;
    기질로서 3-하이드록시아실 CoA를 첨가하는 공정과;
    폴리하이드록시알카노에이트 합성 반응을 실시함으로써 리포솜의 표면의 적어도 일부를 폴리하이드록시알카노에이트로 피복 하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  23. 제 22항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트는,
    의 화학식[1]
    (식중, 기호 "a"는 정수를 나타내고, R1과 "a"의 조합은,
    수소원자와 0 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합과;
    할로겐 원자와 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합과;
    발색단과 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합과;
    카르복실 군 또는 그 염과 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합과;
    과 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합으로 구성된 군으로부터 선택됨)과,
    의 화학식[2](식중, b는 0 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R2는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 구성된 군으로부터 선택됨)과,
    의 화학식[3](식중, c는 1 내지 8로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의정수를 나타내고, R3는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 구성된 군으로부터 선택됨)과,
    의 화학식[4](식중, d는 0 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R4는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 구성된 군으로부터 선택됨)과,
    의 화학시식[5](식중, e는 1 내지 8로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R5는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5,-C3F7,-CH3, -C2H5및 -C3H7로 구성된 군으로부터 선택됨)과,
    의 화학식[6](식중, f는 0 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타냄)과,
    의 화학식[7](식중, g는 1 내지 8로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타냄)과,
    의 화학식[8](식중 h는 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의정수를 나타내고, R6는 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -COOR', -SO2R'', -CH3, -C2H5,-C3H7,-CH(CH3)2및 -C(CH3)3로 구성된 군으로부터 선택되고, R'은 수소 원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5로 구성된 군으로부터 선택되고, R''는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐 원자, -OCH3및 -OC2H5로 구성된 군으로부터 선택됨)과,
    의 화학식[9](식중, i는 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R7은 수소 원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -COOR' 및 -SO2R''로 구성된 군으로부터 선택되고, R'은 수소 원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5로 구성된 군으로부터 선택되고, R''는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐 원자, -OCH3및 -OC2H5로 구성된 군으로부터 선택됨) 및
    의 화학식[10](식중, j는 1 내지 9로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타냄)
    으로 표시되는 단량체 유닛으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나로 구성되고,
    각각 대응하는 3-하이드록시아실 CoA는
    의 화학식[12](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, 기호 "a"는 정수를 나타내고, R1과 a의 조합은 상기 설명한 화학식[1]로 표시되는 단량체 유닛에서 R1과 a의 조합과 동일한 것으로서 정의됨)과,
    의 화학식[13](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, b와 R2는 상기 설명한 화학식[2]로 표시되는 단량체 유닛에서 b와 R2와 동일한 것으로 각각 정의됨)과,
    의 화학식[14](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, c와 R3은 상기 설명한 화학식[3]으로 표시되는 단량체 유닛에서 c와 R3과 동일한 것으로 각각정의됨)과,
    의 화학식[15](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, d와 R4는 상기 설명한 화학식[4]로 표시되는 단량체 유닛에서 d와 R4와 동일한 것으로 각각 정의됨)과,
    의 화학식[16](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, e와 R5는 상기 설명한 화학식[5]로 표시되는 단량체 유닛에서 e와 R5와 동일한 것으로 각각 정의됨)과,
    의 화학식[17](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, f는 상기 설명한 화학식[6]으로 표시되는 단량체 유닛에서 f와 동일한 것으로 정의됨)과,
    의 화학식[18](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, g는 상기 설명한 화학식[7]로 표시되는 단량체 유닛에서 g와 동일한 것으로 정의됨)과,
    의 화학식[19](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, h와 R6은 상기 설명한 화학식[8]로 표시되는 단량체 유닛에서 h와 R6과 동일한 것으로 각각 정의됨)과,
    의 화학식[20](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, i와 R7는 상기 설명한 화학식[9]로 표시되는 단량체 유닛에서 i와 R7과 동일한 것으로 각각 정의됨) 및
    의 화학식[21](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, j는 상기 설명한 화학식[10]으로 표시되는 단량체 유닛에서 j와 동일한 것으로 정의됨)
    으로 표시되는 3-하이드록시아실 CoA로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  24. 제 22항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트가 친수성 작용기를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  25. 제 24항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트가 음이온성 작용기를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  26. 제 25항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트가 카르복실기를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 카르복실기를 가지는 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 단량체 유닛은,
    의 화학식[11](식중, k는 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타냄)으로 표시되는 단량체 유닛으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나이고,
    단량체 유닛의 각각에 대응하는 3-하이드록시아실 CoA는,
    의 화학식[22](식중, -SCoA는 알칸산과 결합한 CoA를 나타내고, k는 언급한 식[11]로 표시되는 단량체 유닛에서 k와 동일한 것으로 정의됨)으로 표시되는 3-하이드록시아실 CoA로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  28. 제 22항에 있어서, 상기 3-하이드록시아실 CoA의 조성은 시간이 흐름에 따라 변화함으로써, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 3-하이드록시알칸산 유닛의 조성이 상기 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 안쪽에서 그 외측의 방향으로 변화하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  29. 제 22항에 있어서, 상기 리포솜의 제조방법은, 상기 리포솜을 피복하는 폴리하이드록시알카노에이트의 적어도 일부를 화학적으로 수정하는 공정을 부가하여 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  30. 제 29항에 있어서, 화학적으로 수정하는 상기 공정이 폴리하이드록시알카노에이트의 적어도 일부에 그라프트사슬을 부가하는 공정인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 그라프트사슬을 부가하는 공정이 폴리하이드록시알카노에이트의 적어도 일부와 말단에 반응성 작용기를 가지는 화합물을 반응시키는 공정인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  32. 제 30항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트가 에폭시기를 가지는 단량체 유닛을 적어도 한 개 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  33. 제 31항에 있어서 말단에 반응성 작용기를 가지는 상기 화합물이 아미노기를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  34. 제 33항에 있어서, 아미노기를 가지는 상기 화합물이 아미노-말단-수정 화합물인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 아미노-말단-수정 화합물이 폴리비닐 아민, 폴리에틸렌 이민 및 아미노-말단-수정 폴리실록산으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  36. 제 29항에 있어서, 상기 화학적으로 수정하는 공정이 폴리하이드록시알카노에이트의 적어도 일부를 가교화하는 공정인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 가교화하는 공정이 폴리하이드록시알카노에이트의 적어도 일부와 가교제를 반응시키는 공정인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  38. 제 36항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트가 에폭시기를 가지는 단량체 유닛을 적어도 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  39. 제 37항에 있어서, 상기 가교제가 디아민 화합물, 무수 숙신산, 2-메틸-4-메틸이미다졸로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 디아민 화합물이 헥사메틸렌 디아민인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  41. 제 36항에 있어서, 상기 가교화하는 공정이 폴리하이드록시알카노에이트를 전자선으로 방사하는 공정인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  42. 제 22항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트를 합성하는 효소가 효소를 생산할 수 있는 능력을 가진 미생물 또는 숙주에 주입된 생산 능력에 관여하는 유전자를 가진 형질전환체에 의하여 생산되는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  43. 제 42항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소를 생산하는 능력을 가지는 미생물이 슈도모나스 속(Pseudomonas Sp.)에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  44. 제 43항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소를 생산하는 능력을 가지는 미생물이 슈도모나스 푸티다 P91(Pseudomonas putida P91, FERM BP-7373), 슈도모나스 치코리이 H45(Pseudomonas cichorii H45, FERM BP-7374), 슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2, FERM BP-7375) 및 슈드모나스 제세니이 P161(Pseudomonas jessenii P161, FERM BP-7376)으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 한 개의 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  45. 제 42항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소를 생산하는 능력을 가지는 미생물이 벌크홀데리아 속(Burkholderia sp.)에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  46. 제 45항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소를 생산하는 능력을 가지는 미생물이 벌크홀데리아 세파시아 KK01(Burkholderia cepacia KK01, FERM BP-4235), 벌크홀데리아 속 OK3(Burkholderia sp. OK3, FERM P-17370) 및 벌크홀데리아 속 OK4(Burkholderia sp. OK4, FERM P-17371)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 한 개의 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  47. 제 42항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소를 생산하는 능력을 가지는 미생물이 알칼리게네스 속(Alcaligenes sp.)에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  48. 제 47항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소를 생산하는 능력을 가지는 미생물이 알칼리게네스 속 TL2(Alcaligenes sp. TL2, FERM BP-6913)인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  49. 제 42항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소를 생산하는 능력을 가지는 미생물이 랄스토니아 속(Ralstonia sp.)에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  50. 제 49항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소를 생산하는 능력을 가지는 미생물이 랄스토니아 유트로파 TB64(Ralstonia eutropha TB64, FERM BP-6933)인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
  51. 제 42항에 있어서, 상기 숙주 미생물이 대장균(Escheichia coli)인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 피복 리포솜의 제조방법.
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