KR20010022387A - 바실러스로부터의 신규 베타-글루카나아제 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 목적은 일반적으로 약한 산성 내지 중성의 환경에서 사용되는 β-글루카나제의 사용 분야를 확장하여, 이들이 알칼리성 상태에서 수행되는 기술 공정에서 사용되도록 알칼리 상태에서도 충분히 안정하도록 하는 것이다. 본 발명에 따르면, 글루칸분해 작용을 보이는, 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alkalophilus) DSM 9956으로부터 수득된 효소가 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 교대로 1,3- 와 1,4-β-글루코스 결합으로 연결된 혼합글루칸을 올리고사카리드로 가수분해할 수 있는 효소, 및 이 효소를 생성하는 미생물에 관한 것이다.
이같은 효소는 엔도-1,3-1,4-β-D-글루칸-4-글루카노히드로라아제(EC 3.2.1.73; 리케나아제) 또는 엔도-1,3-β-D-글루코시다아제(EC 3.2.1.39; 라미나리나아제)에 속한다. 본 발명을 위해, 이러한 유형의 효소를 본 명세서에서 β-글루카나아제 또는 베타-글루카나아제라고 부른다.
상기 언급된 유형의 중합체성 혼합 글루칸은 사실상 모든 곡물에서 다양한 양으로 존재한다. 이들을 절단할 수 있는 효소가 특히 식품, 음료 및 동물 사료 산업, 섬유산업 및 전분 공정에서 필요하다(R. Borriss "β-Glucan-spaltende Enzyme", in H. Ruttloff: "Industrielle Enzyme", Chapter 11.5, Behr's Verlag, Hamburg (1994). β-글루카나아제의 가장 중요한 용도 중 하나는 이같은 효소들이 맥아 및 아주 가끔 β-글루칸을 분해하기 위해 사용되는 양조 산업 및 음료에서이다. 이러한 목적으로 사용되는 효소들에는, 다른 미생물 예들 들어 아크로모박터 루나투스(Achromobacter lunatus), 아트로박터 루테우스(Athrobacter luteus), 아스페르길러스 아쿠리아투스(Aspergillus aculeatus), 아스페르길러스 니게르(Aspergillus niger), 디스포로트리쿰 디모르포스포룸(Disporotrichum dimorphosporum), 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 페니실리움 에메르소니(Penicillium emersonii), 페니실리움 푸니쿠로숨(Penicillium funiculosum) 또는 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei)로부터의 β-글루카나아제도 알려져 있지만, 일반적으로, 예를 들어 독일 특허 DD 226 012 A1에서 설명된 대로 고초균(Bacillus subtilis), 또는 바실러스 아밀로리퀴에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens)로부터 방출된다. 양조산업에서 사용하기 위한 상업제품이, 예를 들어, Cereflo(제조자; Novo Nordisk A/S)의 명칭으로 판매된다.
지금까지 알려진 β-글루카나아제는 약한 산성 내지 중성의 범위에서 최적의 pH를 가지므로, 이들의 사용은 이러한 pH 범위에서 수행되는 방법에 한정된다. 본 발명에 의해 다뤄지는 과제는 β-글루카나아제의 사용 분야를 확장시키고 알칼리성 상태에서 수행되는 산업 공정에서 사용하기 위해 이러한 상태에서 충분히 안정한 글루카나아제를 개발하는 것이다.
본 발명은 처음에 언급된 글루칸 분해활성을 갖는 바실러스 알칼로필러스 DSM 9956로부터 수득될 수 있는 효소, β-글루카나아제를 생산하는 바실러스 알칼로필러스 DSM 9956, 및 본 발명에서 정점이 되는 작업 도중에 확인되고 서열이 밝혀지는, 바실러스 알칼로필러스 DSM 9956로부터의 β-글루카나아제를 코딩하는 유전자(서열번호 2)에 관한 것이다. 원한다면, 이 유전자는 공지된 방법으로 다른 박테리아에서 클론될 수 있고, β-글루카나아제가 거기서 발현될 수 있다. 따라서 또한 본 발명은 본질적으로 미생물학적 방법을 통해 수득될 수 있는 상기 유전자를 함유하는 숙주 생물에 관한 것이다. 바실러스 알칼로필러스 DSM 9956로부터 수득될 수 있는 본 발명에 따른 β-글루카나아제의 아미노산 서열(서열번호 1)-바실러스 알칼로필러스 DSM 9956으로부터의 β-글루카나아제 유전자의 서열로부터 유래됨-이 단일문자 코드로 도 1에서 나타난다. 미생물의 세포벽을 통과하여 수송된 후에 시그날 펩티다아제에 의해 분리되고, 문헌 [M.E. Louw, S.J. Reid, Waston, Appl. Microbiol. Biotech. 39 (1993), 507-513]으로부터 알려진 데이타와의 비교에 따라, 추측상 31 아미노산으로 이루어진, 시그날 펩티드를 포함하여, 바실러스 알칼로필러스 DSM 9956으로부터의 β-글루카나아제는 308 개의 아미노산으로 구성된다. 상응하는 미생물은 그람-음성이고, 이것의 세포는 로들렛(rodlet)같이 생겼다(너비 약 0.7 ㎛ 내지 0.9 ㎛, 길이 약 2.5 ㎛ 내지 4.0 ㎛); 이것은 출원인에 의해 1995 년 4 월 13 일에 DSM(Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig)에 기탁되어, 번호 DSM 9956 을 부여받았다.
본 발명에 따른 β-글루카나아제는 바실러스 알칼로필러스 DSM 9956의 β-글루카나아제와 바람직하게는 70 % 초과, 더욱 특별하게는 75 % 내지 99 %의 상동성을 갖는다. 기본적인 유전자에도 동일하게 적용된다.
본 발명에 따른 효소는 바람직하게는 식품 산업, 더욱 구체적으로는 음료 및 양조 산업에서, 더욱 특별하게는 이러한 산업들에서의 막 및 기타 장비들을 깨끗이 할 때 글루칸 및/또는 리케난을 제거하기 위해 사용된다.
본 발명은 또한 식품 산업, 더욱 특별하게는 양조 산업에서, 본 발명에 따른 β-글루카나아네를 사용하여, 막 및 기타 장비들을 깨끗이 할 때 글루칸 및/또는 리케난을 제거하기 위한 방법에도 관련된다.
실시예 1
바실러스 알칼로필러스 C/M2-3으로부터의 염색체 DNA를 Sau3A 로 부분적으로 절단하고, 4 내지 8 kb 크기의 단편들을 겔 전기영동으로 분리하였다. E. coli-바실러스 셔틀 벡터인 플라스미드 pMK4의 BamH1-사이트로 결찰시킨 후에, 이것을 컴피턴트 E. coli DH5α세포 내로 형질전환시켰다. β-글루카나아제 활성을 갖는 재조합 클론을 0.2 % 리케닌을 함유하는 LB 배지(pH 8.5) 상에서 콩고 레드로 염색하여 확인하였다.
β-글루카나아제를 E. coli DH5αpmK4 내의 클론의 세포 상층액으로부터 정제하였다. 세포가 없는 상층액을 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.5)에 대해 투석시킨 후, 투석물을 Q-세파로스(Pharmacia)에 고정시키고, 25 mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.5 내지 pH 9.0) 내 0 - 1 M NaCl의 직선 농도구배로 용출하였다,
글루칸 분해 활성의 검출 및 측정은 M. Lever가 Anal. Biochem. 47 (1972), 273-279 및 Anal. Biochem. 81 (1977), 21-27에서 설명한 방법의 변형을 기초로 하였다. 50 mM 글리신 완충액(pH 9.0) 내의 β-글루칸(Sigma No. G6513)의 0.5 중량% 용액을 이러한 목적으로 사용하였다. 250 ㎕의 이 용액을 글루칸 분해 활성을 위해 테스트될 약물을 함유하는 용액 250 ㎕에 첨가하고 40 ℃에서 30 분동안 항온배양하였다. 이어서, 1 mM 비스무스 니트레이트 및 1 mM 칼륨 나트륨 타르트레이트을 함유하는, 0.5 M NaOH 내의 p-히드록시벤조산 히드라지드 (PAHBAH)의 1 중량% 용액 1.5 ㎖을 첨가한 후에, 용액을 70 ℃에서 10 분동안 가열한다. 냉각(2 분/0 ℃) 후에, 글루코스 교정 곡선을 사용하여 실온에서 블랭크 값에 대해 410 nm에서의 흡수를 측정한다(예를 들어 Uvikon930으로). 블랭크 값은 글루칸 용액이 PAHBAH 용액 후에 첨가되는 것을 제외하고는 측정 용액과 동일한 방식으로 제조된 용액이다. 1 U는 이러한 상태에서 1 분동안 1 μmole의 글루코스를 생산하는 효소의 양에 해당된다.
이렇게 수득된 효소의 특이적 활성은 단백질 1 mg 당 4390 mU에 이르는 반면, 출발 용액의 활성은 152의 인자로 더 낮다. 효소는 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에서 균일한 밴드로 착색되었다(은색).
내부 기준으로서 마커 단백질(시토크롬 c, 에퀴인 미오글로빈, 키모트립시노겐, 오발알부민, 소 혈청 알부민)의 도움으로, 바실러스 알칼로필러스 DSM 9956으로부터의 β-글루카나아제의 분자량은 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의해 약 30,000으로 추정되었다.
등전집중(isoelectronic focusing)(pH 3 내지 9)에서, β-글루카나아제의 등전위점은 활성 착색에 의해 pH 5.2에서 발견되었다.
실시예 2: pH 프로파일
다양한 pH 값에서의 글루칸 분해활성을, 다비에스 유니버설 완충액(1 ℓ의 증류수 내의 21.01 g 시트르산H2O, 13.61 g KH2PO4, 19.07 g Na2B4O7 10 H2O, 12.11 g 트리스 및 7.46 g KCl; 50 ㎖의 이 모액을 0.4 N NaOH로 원하는 pH로 조절하고 증류수로 200 ㎖로 만들었다)에서 30 분동안 항온배양 후에 40 ℃에서 측정하였다. 도 2 에 나타난 pH 프로파일(상대적 글루칸 분해활성(rel. A.), pH 에 대해 도시됨)로부터 명백히 볼 수 있듯이, pH 6 내지 pH 10.5 사이에서 효소가 가장 활성이었다. pH 9에서 최적이다.
실시예 3 : 온도 프로파일
바실러스 알칼로필러스 DSM 9956으로부터 수득된 β-글루카나아제의 글루칸 분해활성의 온도 의존성을 글리신/NaOH 내에서 pH 9에서 15 분동안 항온배양 후에 측정하였다. 완충액이 1 ℃ 당 약 pH 0.033의 온도 의존성을 가지므로, 테스트 용액의 pH 값을 조절하였다. 효소의 상대적 글루칸 분해활성(rel. A.)이 온도(T)에 대해 도시된, 도 3에서 보이듯이, 최대의 글루칸 분해활성은 60 ℃에서이다.
서열 프로토콜
일반적인 정보
출원인:
이름: Cognis Gesellschaft fur Biotechnologie mbH
거리: HenkelstraBe 67, Building Y 20
도시: Dusseldorf
주: Nordrhein-Westfalen
우편번호: 40589
전화번호: 0211 - 7976763
팩스번호: 0211 - 7987607
발명의 명칭: 바실러스로부터의 신규 베타-글루카나아제
서열의 수: 2
우송 주소
수취인: Cognis Gesellschaft fur Biotechnologie mbH
거리: HenkelstraBe 67, Building Y 20
도시: Dusseldorf
주: Nordrhein-Westfalen
우편번호: 40589
컴퓨터-읽을 수 있는 판:
데이타 운반체: 플로피 디스크
컴퓨터: IBM PC-호환성
작동 시스템: MS 윈도우
소프트웨어: MS 워드 97
서열번호 1 번의 특성:
서열 특징
길이: 308 아미노산
유형: 아미노산
토폴로지: 미지
분자의 유형 : 단백질
추정서열: 없음
서열의 기재: 서열번호 1
서열번호 2의 특성:
서열 특징:
길이: 927 염기 쌍
유형: 핵산
가닥 형태: 이중
토폴로지: 선형
분자의 유형: 게놈-DNA
추정서열: 없음
안티-센스: 없음
기원: 바실러스 알칼로필러스 DSM 9956
서열의 기재: 서열번호 2
Claims (11)
- β-글루카나아제를 생산하는 미생물 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alkalophilus) DSM 9956.
- 바실러스 알칼로필러스 DSM 9956으로부터 수득될 수 있는, β-글루칸 분해 활성을 갖는 효소.
- 제 2 항에 있어서, 도 1에 나타난 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 1에서 재현된 아미노산 서열을 갖는 효소의 아미노산 서열과 70 % 초과의 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 효소.
- 제 3 항에 있어서, 서열번호 1 에서 재현된 아미노산 서열을 갖는 효소의 아미노산 서열과 75 % 내지 99 %의 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는, β-글루칸 분해 활성을 갖는 효소.
- 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 효소를 코딩하는 유전자.
- 제 5 항에 있어서, 서열번호 2에서 재현된 서열을 갖거나, 그 서열과 70 % 초과의 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
- 제 6 항에 있어서, 서열번호 2에서 재현된 서열과 75 % 내지 99 %의 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
- 본질적으로 미생물학적 방법에 의해 수득될 수 있는 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 하나의 유전자를 함유하는 숙주 생물.
- 바실러스 알칼로필러스 DSM 9956으로부터 수득될 수 있는 β-글루칸 분해 활성을 갖는 효소의, 식품 산업, 더욱 특별하게는 양조 산업에서 설비 및 막을 깨끗이 할 때 글루칸 및/또는 리케난을 제거하기 위한 용도.
- 제 9 항에 있어서, 효소가 도 1에 나타난 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 1에서 재현된 아미노산 서열을 갖는 효소의 아미노산 서열과 70 % 초과, 더욱 특별하게는 75 % 내지 99 %의 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
- 바실러스 알칼로필러스 DSM 9956으로부터 수득될 수 있는 β-글루칸 분해 활성을 갖는 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는, 식품 산업, 더욱 특별하게는 양조 산업에서 설비 및 막을 깨끗이 할 때 글루칸 및/또는 리케난을 제거하는 방법.
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