CZ2000327A3 - Beta-glukanáza - Google Patents

Beta-glukanáza Download PDF

Info

Publication number
CZ2000327A3
CZ2000327A3 CZ2000327A CZ2000327A CZ2000327A3 CZ 2000327 A3 CZ2000327 A3 CZ 2000327A3 CZ 2000327 A CZ2000327 A CZ 2000327A CZ 2000327 A CZ2000327 A CZ 2000327A CZ 2000327 A3 CZ2000327 A3 CZ 2000327A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
enzyme
seq
amino acid
acid sequence
thr
Prior art date
Application number
CZ2000327A
Other languages
English (en)
Inventor
Wolfgang Hillen
Karl-Heinz Maurer
Original Assignee
Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien filed Critical Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien
Priority to CZ2000327A priority Critical patent/CZ2000327A3/cs
Publication of CZ2000327A3 publication Critical patent/CZ2000327A3/cs

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Rozšířené oblasti použití β-glukanáz, které se obvykle používají ve slabě kyselé až neutrální oblasti pH tak, že jsou stabilní při technických procesech probíhajících v alkalických podmínkách. Podle řešení je možno použít enzymu získaného z Bacillus alkalophilus DSM9956 s glukanolytickou aktivitou.

Description

Beta-glukanáza
Oblast technikv
Předkládaný vynález se týká enzymu který může hydrolyticky štěpit směsné glukany, které jsou svázány střídavě v polohách 1,3- a
1,4-3-glukosidické vazby na oligosacharidy, a mikroorganismu, který tvoří tento enzym.
Dosavadní stav techniky
Tyto enzymy patří do třídy endo-1,3-1,4-p-D-glukan-4glukanohydroláz (EC 3.2.1.73; lichenázy) nebo endo-1,3-p-Dglukosidáz (EC 3.2.1.39; laminarinázy). Ve smyslu předkládaného vynálezu se takový enzym bude označovat jako β-glukanáza nebo beta-glukanáza.
Polymerní směsné glukany výše uvedeného typu se nacházejí v různém množství prakticky ve všech výrobcích z obilí. Enzymy, které tyto látky mohou štěpit, se používají především v potravinářském, nápojovém a krmivářském průmyslu, textilním průmyslu a škrobárenském průmyslu (R.Borris, „β-Glucan-spaltende Enzyme“, v H. Ruttloff, „Industrielle Enzyme“, kapitola 11.5, Behr’s Verlag, Hamburk, 1994). Jedno z nejdůležitějších použití β-gkukanáz je v oblasti průmyslu nápojů a v pivovarství, protože tyto enzymy se používají k odbourávání β-glukanu sladu a ječmene. Enzymy, které pro toto použití přichází v úvahu, se získávají převážně z Bacillus subtilis, jak se například popisuje v německém patentovém spise DD 226 012 A1, nebo Bacillus amyloliquefaciens, ale známé jsou také β-glukanázy z jiných mikroorganismů, například Achromobacter lunatus, Athrobacter Luteus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Disporotrichum dimorphosporum, Humicola insolens, Penicillium • « emersonii, Penicillium funiculosum nebo Trichoderma reesei.
Obchodně dostupný produkt se nabízí například pod označením
Cereflo® (Novo Nordisk A/S) pro použití v pivovarském průmyslu.
Dosud známé β-glukanázy mají optimum pH v slabě kyselé až neutrální oblasti, takže jejich použití je omezeno na způsoby, které je možno provádět při těchto hodnotách pH. Cílem vynálezu je rozšířit oblast použití β-glukanáz a vyvinout β-glukanázu - která s ohledem na použití při technických procesech, které probíhají v alkalickém prostředí, vykazuje dostatečnou stabilitu i za těchto podmínek.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je enzym získatelný z Bacillus alkalophilus DSM 9956, který má výše uvedenou glukanolytickou aktivitu, mikroorganismus Bacillus alkalophilus DSM 9956 produkující β-glukanázu a gen kódující β-glukazánu z Bacillus alkalophilus DSM 9956, který byl v rámci prací, které vedly k předkládanému vynálezu, identifikován a sekvenován (SEQ ID No. 2). Tento gen může být v případě potřeby klonován v podstatě známým způsobem do jiných bakterií, ve kterých může být exprimována β-glukanáza. Dalším předmětem vynálezu jsou tedy také v podstatě mikrobiologickým způsobem získatelné produkční organismy, které obsahují uvedený gen. Aminokyselinová sekvence odvozená ze sekvence β-glukanázového genu z Bacillus alkalophilus DSM 9956 pro β-glukanázu získatelnou z tohoto mikroorganismu (SEQ ID No. 1) je uvedena v jednopísmenkovém kódu v obr. 1. β-glukanáza z Bacillus alkalophilus DSM 9956 včetně signálního peptidů, který je po transportu přes buněčnou stěnu mikroorganismu odštěpen signální peptidázou, a který obsahuje po srovnání s literárními údaji [Μ. E. Louw, S. J. Reid, Watson, Appl. Microbiol. Biotech. 39 (1993), 507 513] pravděpodobně 31 aminokyselin, se skládá z 308 aminokyselin.
- 3 Odpovídající mikroorganismus je grampozitivní, bakterie má tyčinkový tvar (šířka přibližně 0,7 pm až 0,9 pm, délka přibližně 2,5 pm až 4,0 pm); byl uložen přihlašovatelem 13. 4. 1995 ve sbírce DSMDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig pod depozitním číslem DSM 9956.
β-glukanáza podle vynálezu má s výhodou homologii více než 70 %, zvláště 75 % až 99 % vzhledem k β-glukanáze z Bacillus alkalophilus DSM9956. Stejné údaje platí pro příslušný gen pro uvedenou β-glukanázu.
Výhodná oblast použití enzymu podle vynálezu je v potravinářském průmyslu, zvláště v průmyslu nápojů a v pivovarském průmyslu, přičemž enzym se hodí zvláště pro odstraňování glukanu a/nebo lichenanu při čištění membrán a jiných zařízení v tomto průmyslovém odvětví.
Dalším předmětem vynálezu je způsob odstraňování glukanu a/nebo lichenanu při čištění membrán a jiných zařízení v potravinářském průmyslu, zvláště v pivovarském průmyslu, s použitím β-glukanázy podle vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Chromozomální DNA z Bacillus alkalophilus C/M2-3 byla částečně štěpena enzymem Sau3A a frakce o velikosti fragmentů 4 až 8 kb byly elektroforeticky izolovány. Po ligaci do štěpícího místa SamH1 plasmidů pMK4, kyvadlového vektoru E. coli - Bacillus [M. A. Sullivan a další, Gene 29 (1984), 21 - 26], byl plasmid transformován do kompetentních buněk E. coli DH5a. Rekombinantní klony s βglukanázovou aktivitou byly identifikovány barvením kongočervení na plotnách LB s 0,2 % licheninu (pH 8,5).
β-glukanáza byla čištěna ze supernatantu klonu v E. coli DH5a pmK4. Po dialýze bez buněčného supernatantu proti 20 mM pufru fosforečnanu sodného (pH 7,5) byl dialyzát navázán na materiál QSepharose (Pharmacia) a eluován lineárním gradientem 0 - 1 M NaCl ve 25 mM pufru fosforečnanu sodného (pH 7,5 nebo pH 9,0).
Důkaz a určení glukanolytické aktivity je založeno na modifikaci způsobu popsaného v M. Lever v Anal. Biochem. 47 (1972), 273 - 279 a Anal. Biochem. 81 (1977), 21 - 27. K tomu účelu se připraví roztok β-glukanu (Sigma No. G6513) s koncentrací 0,5 % hmotnostních v 50 mM glycinovém pufru (pH 9,0). 250 pl tohoto roztoku se přidá k 250 pl roztoku obsahujícího glukanolytickou aktivitu testovaného prostředku a směs se inkubuje 30 min při 40 °C. Potom se přidá 1,5 ml roztoku hydrazidu kyseliny p-hydroxybenzoové (PAHBAH) s koncentrací 1 % hmotnostní v 0,5 M NaOH, obsahující 1 mM dusičnan vismutitý a 1 mM vínan sodnodraselný a roztok se zahřívá 10 min na 70 °C. Po ochlazení (2 min, 0 °C) se stanoví absorpce při 410 nm (například s použitím fotometru Uvikon® 930) s použitím kalibrační křivky pro glukózu proti slepému pokusu. Jako slepý pokus se použije roztok, který byl připraven stejně jako měřený roztok s tím rozdílem, že se roztok glukanu přidal teprve po přidání roztoku PAHBAH. 1 U odpovídá množství enzymu, které vytvoří za těchto podmínek 1 pmol glukózy za minutu.
Specifická aktivita takto získaného enzymu byla přibližně 4390 mU na mg proteinu, na rozdíl od výchozího roztoku, který měl aktivitu o faktor 152 nižší. Enzym se vybarvil jako homogenní pruh na gelové elektroforéze SDS-polyakrylamid (barvení stříbrem).
Pomocí markerových proteinů (Cytochrom c, koňský myoglobin, chimotrypsinogen, vaječný albumin, hovězí sérový albumin) jako vnitřního standardu byla určena pomocí gelové elektroforézy SDS• · polyakrylamid molekulová hmotnost β-glukanázy z Bacillus alkalophilus DSM 9956 jako přibližně 30 000.
Metodou isoelektrické fokusace (pH 3 až 9) byl určen isoelektrický bod β-glukanázy pomocí aktivitního barvení jako pH 5,2.
Příklad 2: Profil pH
Určení glukanolytické aktivity při různých hodnotách pH se provádělo v Daviesově univerzálním pufru (21,01 g kyseliny citrónové . H2O, 13,61 g KH2PO4i 19,7 g Na2B4O7 . 10 H2O, 12,11 g Tris a 7,46 g
KCI v 1 I destilované vody; 50 ml tohoto zásobního roztoku bylo nastaveno 0,4 N NaOH na požadovanou hodnotu pH a roztok byl doplněn destilovanou vodou na 200 ml) při 40 °C a 30 minutové inkubaci. Jak je vidět z profilu pH znázorněného na obr. 2 (relativní glukanolytické aktivita, rei. A., vynesená proti hodnotě pH), je enzym nejaktivnější v oblasti mezi pH 6 a pH 10,5. Optimum je u pH 9.
Příklad 3: Profil teploty
Teplotní závislost glukanolytické aktivity β-glukanázy získané z Bacillus alkalophilus DSM 9956 byl měřen v pufru glycin/NaOH při pH 9 s 15 minutovou inkubací. Hodnota pH testovacího roztoku byla upravována, protože pufr měl teplotní závislost pH přibližně 0,033 jednotek pH na °C. Maximum glukanolytické aktivity je u 60 °C, jak je zřejmé z obr. 3, ve kterém je relativní glukanolytické aktivita (rei. A.) enzymu vynesena v závislosti na teplotě (T).
- 6 • · · ·
VÝPIS SEKVENCÍ
Obecné informace:
Žadatel:
Jméno: Cognis Gesellschaft fur Biotechnologie mbH
Ulice: Henkelstrasse 67, Gebáude Y 20
Město: Dusseldorf
Země: Nordrhein-Westfalen
PSČ: 40589
Telefon: 0211 - 7976763
Telefax: 0211 - 7987607
Název vynálezu: Nová β-glukanáza z Bacillus Počet sekvencí: 2 Adresa pro korespondenci:
Jméno: Cognis Gesellschaft fur Biotechnologie mbH
Ulice: Henkelstrasse 67, Gebáude Y 20
Město: Dusseldorf
Země: Nordrhein-Westfalen
PSČ: 40589
Počítačová forma:
Typ media: disketa Počítač: IBM PC kompatibilní Operační systém: MS-WINDOWS Software: MS WORD 97
INFORMACE PRO SEQ ID NO:1:
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
DÉLKA: 308 aminokyselin TYP: aminokyselina TOPOLOGIE: neznámá
TYP MOLEKULY: protein HYPOTETICKÁ: ne • ·
POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:
Met Lys Arg Lys Thr Phe Val Leu Phe Ser Leu Phe Thr Leu Leu Ile
1 5 10 15
Gly Met Phe Ser Thr Gly Phe Ala Asn Thr Gly Val Val Gin Ala Glu
20 25 30
Asp Gly Arg Pro Met Gly Ser Thr Phe His Glu Thr Phe Asp Thr Phe
35 40 4.5
Asn Thr Asp Arg Trp Ser Thr Ala Gly Val Trp Thr Asn Gly Ala Met
50 55 60
Phe Asn Ala Thr Trp Tyr Pro Glu Gin Val Thr Ile Ser Asp Gly Lys
65 70 75 80
Met Lys Leu Gin Ile Asp Lys Glu Asp Asp Glu Asp Ala Thr Pro Glu
85 90* 95
Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Arg Thr Asn Gin Phe Tyr Gin Tyr Glv Leu
100 105 110
Phe Glu Val Asn Met Lys Pro Ala Lys Ser Thr Gly Thr Val Ser Ser
115 120 125
Leu Phe Thr Tyr Thr Gly Pro Trp Asp Trp Asp Asn Asp Pro Trp Asp
130 135 140
Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly Lys Asp Thr Thr Arg Val Gin Phe
145 150 155 160
Asn Tyr Phe Thr Asn Gly Val Gly Asn Asn Glu His Tyr His Glu Leu
165 i 170 175
Gly Phe Asp Ala Ser Glu Ser Phe Asn Thr Tyr Ala Phe Glu Trp Arg
180 185 190
Pro Glu Ser Ile Ser Trp Tyr Val Asn Gly Glu Leu Val Tyr Thr Ala
195 200 205
Thr Glu Asn Ile Pro Gin Thr Pro Gin Lys Ile Met Met Asn Leu Trp
210 215 220
Pro Gly Ile Gly Val Asp Gly Trp Thr Gly Val Phe Asp Gly Glu Asp
225 230 235 240
Thr Pro Val Val Thr Glu Tyr Asp Trp Val Arg Tyr Thr Pro Leu Glu
245 250 255
Glu Leu Asp Asn Asn Gly Glu Gin Pro Lys Pro Val Val Pro Gly Lys
260 265 270
Pro Glu Lys Pro Gly Lys Pro Gly Lys Asn Gin Lys Asn Gin Glu Asn
275 280 285
Gin Glu Asn Gin Lys Asn Gin Glu Asn Gin Lys Asn Gin Lys Ile Arg
290 295 300
Lys Thr Ser Ser
305 308
INFORMACE PRO SEQ ID NO:2:
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
DÉLKA: 927 párů basí TYP: nukleová kyselina TOPOLOGIE: dvojřetězcová
TYP MOLEKULY: genomová DNA • ·
HYPOTETICKÁ: ne
ANTI-SENSE: ne PŮVOD:
KMEN: Bacillus alkalophilus DSM 9956
POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:
ATG AAA AGG AAG ACA TTT GTA TTA TTT TCT TTT ACG TTG TTA 45
ATT GGT ATG TTC TCA ACA GGG TTT GCA AAT ACA GGT GTG GTT CAG 90
GCA GAA GAT GGG AGA CCA ATG GGG TCG ACG TTT CAT GAA ACG TTT 135
GAT ACC TTT AAT ACG GAC CGC TGG TCA ACA GCT GGG GTA TGG ACA 180
AAT GGA GCA ATG TTT AAT GCG ACA TGG TAT CCA GAA CAG GTG ACC 225
ATT TCA GAT GGG AAA ATG AAG TTG CAA ATT GAC AAG GAA GAT GAT 270
GAA GAT GCA ACC CCA GAA TAT AAG GCT GGG GAA TTA AGA ACG AAT 315
CAG TTT TAT CAA TAC GGG TTG TTT GAA GTC AAT ATG AAG CCA GCG 360
AAA TCA ACA GGA ACC GTC TCT TCA CTC TTT ACA TAT ACG GGT CCA 405
TGG GAT TGG GAT AAT GAT CCT TGG GAT GAA ATC GAT ATT GAG TTC 450
CTT GGA AAG GAT ACA ACA AGA GTC CAA TTT AAC TAT TTT ACT AAC 495
GGA C-TA GGA AAC AAT GAA CAT TAC CAC GAA TTA GGG TTC GAT GCA 540
TCA C-AA TCT TTT AAT ACG TAT GCT TTT GAA TGG AGA CCA GAA TCA 585
ATT AGT TGG TAC GTA AAC GGA GAA TTA GTA TAT ACA GCA ACA GAA 630
AAT ATC CCG CAA ACA CCA CAA AAA ATT ATG ATG AAC TTA TGG CCT 675
GGA ATT GGA GTG GAT GGA TGG ACA GGC GTT TTT GAC GGA GAA GAC 720
ACT CCA GTT GTA ACG GAG TAT' GAT TGG GTA AGG TAC ACT CCA CTA 765
GAG GAA TTA GAT AAT AAC GGA GAA CAA CCG AAA CCT GTA GTG CCA 810
GGA AAA CCA GAA AAA CCA GGA AAA CCA GGG AAA AAC CAG AAA AAC 855
CAG GAA AAC CAG GAA AAC CAG AAA AAC CAG GAA AAC CAG AAA AAC 900
CAA AAA ATC AGA AAA ACC AGT AGT TGA 927
Zastupuje:

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Mikroorganismus Bacillus alkalophilus DSM 9956 produkující β5 glukanázu.
  2. 2. Enzym vykazující β-giukanolytickou aktivitu, vyznačující se tím, že má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1.
  3. 3. Enzym vykazující β-glukanolytickou aktivitu, vyznačující se tím, že má homologii více než 70 % s aminokyselinovou sekvencí enzymu uvedenou jako SEQ ID No. 1.
  4. 4. Enzym podle nároku 3, vyznačující se tím, že má homologii 75 % až 99 % s aminokyselinovou sekvencí enzymu uvedenou jako SEQ ID No. 1.
    20
  5. 5. Gen kódující enzym podle některého z nároků 2 až 4.
  6. 6. Gen podle nároku 5, vyznačující se tím, že má sekvenci uvedenou jako SEQ ID No. 2 nebo je s touto sekvencí z více než 70 % homologní.
  7. 7. Gen podle nároku 6, vyznačující se tím, že má se sekvencí uvedenou jako SEQ ID No. 2 homologii od 75 % do 99 %.
    - 10 • ·
  8. 8. Průmyslový produkční organismus získaný v podstatě mikrobiologickým způsobem obsahující gen podle některého z nároků 5 až 7.
  9. 9. Použití enzymu s β-glukanolytickou aktivitou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v obr. 1 pro odstranění glukanu a/nebo lichenanu při čištění membrán a zařízení v potravinářském průmyslu, zvláště pivovarském průmyslu.
  10. 10. Použití enzymu s β-glukanolytickou aktivitou, který je homologní z více než 70 %, zvláště ze 75 až 99 % s aminokyselinovou sekvencí enzymu uvedenou jako SEQ ID No. 1, pro odstranění glukanu a/nebo lichenanu při čištění
    15 membrán a zařízení v potravinářském průmyslu, zvláště pivovarském průmyslu.
  11. 11. Způsob odstraňování glukanu a/nebo lichenanu při čištění membrán a zařízení v potravinářském průmyslu, zvláště
    20 v pivovarském průmyslu, vyznačující se tím, že se použije enzym s β-glukanolytickou aktivitou, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1, nebo je homologní z více než 70 % s enzymem s aminokyselinovou sekvencí uvedenou jako SEQ ID No. 1.
CZ2000327A 1998-07-21 1998-07-21 Beta-glukanáza CZ2000327A3 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2000327A CZ2000327A3 (cs) 1998-07-21 1998-07-21 Beta-glukanáza

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2000327A CZ2000327A3 (cs) 1998-07-21 1998-07-21 Beta-glukanáza

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2000327A3 true CZ2000327A3 (cs) 2000-07-12

Family

ID=5469427

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2000327A CZ2000327A3 (cs) 1998-07-21 1998-07-21 Beta-glukanáza

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ2000327A3 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4222723B2 (ja) バシラス由来の新規なβ−グルカナーゼ
FI106315B (fi) Menetelmä entsyymien stabiilisuuden parantamiseksi sekä stabiloidut entsyymit
JP4571604B2 (ja) トリペプチジルアミノペプチダーゼ
Saul et al. celB, a gene coding for a bifunctional cellulase from the extreme thermophile" Caldocellum saccharolyticum"
Ganter et al. Production of thermostable, recombinant α-galactosidase suitable for raffinose elimination from sugar beet syrup
JP2000210081A (ja) 耐熱性アルカリセルラ―ゼ遺伝子
PEREZ‐PONS et al. A β‐glucosidase gene (bgl3) from Streptomyces sp. strain QM‐B814: Molecular cloning, nucleotide sequence, purification and characterization of the encoded enzyme, a new member of family 1 glycosyl hydrolases
Lee et al. Cloning, nucleotide sequence, and hyperexpression of α-amylase gene from an archaeon, Thermococcus profundus
Morales et al. Purification and characterization of alkaline xylanases from Bacillus polymyxa
NZ240305A (en) Protease derived from bacillus licheniformis
Montiel et al. Evaluation of an endo-β-mannanase produced by Streptomyces ipomoea CECT 3341 for the biobleaching of pine kraft pulps
US5705379A (en) Nucleotide sequences encoding a thermostable alkaline protease
AU754791B2 (en) Phenolic acid esterases, coding sequences and methods
JP3081434B2 (ja) アルカリセルラーゼ
CZ2000327A3 (cs) Beta-glukanáza
EP1498476B1 (en) Mutated alkaline cellulase
EP0302838B1 (en) Cloning of the gene coding the isoamylase enzyme and its use in the production of said enzyme
HENNINGSEN et al. Cloning, sequencing and expression of the sialidase gene from Actinomyces viscosus DSM 43798
Yosida et al. Purification, Properties, and N-Terminal Amino Acid Sequences of Guar Gum-degrading Enzyme from Bacillus circulans Kl
JP4380874B2 (ja) アルカリセルラーゼ遺伝子
US6280984B1 (en) DNA constructs and methods of producing cellulytic enzymes
JP4358984B2 (ja) アルカリセルラーゼ遺伝子
JP2002085078A (ja) アルカリセルラーゼ遺伝子
JP2000262292A (ja) プロトペクチナーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する形質転換体、及び該形質転換体を用いる繊維の精練方法
Kim et al. Characterization of the arfA Gene from Bacillus stearothermophilus No. 236 and Its Protein Product, $\alpha $-L-Arabinofuranosidase

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic