KR20010014078A

KR20010014078A - 광학이성질적으로 보강된 ｎ-변형 락탐의 제조 방법

Info

Publication number: KR20010014078A
Application number: KR19997012114A
Authority: KR
Inventors: 마이클 존 도슨; 마흐모우드 마흐모우디안; 크리스토퍼 존 월리스
Original assignee: 그레이엄 브레레톤; 글락소 그룹 리미티드; 레슬리 에드워즈
Priority date: 1997-08-22
Filing date: 1998-08-20
Publication date: 2001-02-26
Also published as: US6340587B1; EE200000075A; BR9810472A; CN1261405A; PL337647A1; KR100479894B1; EE03934B1; JP3565868B2; TW589301B; EA001964B1; SI1003903T1; IS2201B; IN183908B; AU9738698A; HRP990408A2; NO996368L; JP2001504354A; HUP0002661A3; ID25830A; WO1999010519A1

Abstract

본 발명은 바실러스 속으로부터 유래된 아실라제로 에난티오머 혼합물을 처리하여 라세미체로부터 광학이성질적으로 매우 순수한 하기 일반식 (IV)의 중간체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

< 화학식 IV >

상기 식에서, P는 활성 및 보호기임.

Description

광학이성질적으로 보강된 Ｎ-변형 락탐의 제조 방법{Process for Preparing Enantiomerically Enriched N-derivatised Lactams}

EP 0434 450에 공지된 하기 일반식 (I)의 2-아미노퓨린 뉴클레오시드 유사체인 아바카비르(Abacavir)는 인간 면역 결핍증 바이러스(HIV) 및 헤파티티스 B 바이러스 (HIV)에 대하여 상당한 활성을 지닌다.

아바카비르는 임상학적 시도를 위해 대량 합성이 요구된다. 일단 아바카비르가 국립 의약 관리국으로부터 승인받았으므로, 장래에 HIV 감염 치료용 제조 의약으로서의 대량 판매도 필요할 것이다.

아바카비르의 제조에 있어서 중요한 단계는 에난티오머가 순수한 치환된 시클로펜텐 고리를 제조하는 단계이다. 기존의 제조 방법은 하기 일반식 (II)의 락탐을 출발물질로 한다.

EP-A-424,064는 시클로펜타디엔과 토실 시아나이드를 반응시켜 얻은 라세믹 락탐 (II)을 락타마제로 처리하여 하기 일반식 (III)의 개환된 시스형 에난티오머만을 제조하거나, 이 시스형 에난티오머(어느 한 에난티오머가 더 풍부하게 존재함)와 미반응된 락탐(어느 한 에난티오머가 더 풍부함)의 혼합물을 제조하는 방법을 개시하고 있다.

본 발명은 광학이성질적으로 보강된 N-변형 (1R,4S)-2-아자비시클로[2,2,1]헵트-5-엔-3-온의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명 연구자들은 라세미체로부터 고수율, 저비용으로 광학이성질적으로 매우 순수한 하기 일반식 (IV)의 중간체를 제조하는 방법을 개발하였다.

상기 식에서, P는 활성 및 보호기임.

본 발명 연구자들은 상기 일반식 (II)의 화합물 중 락탐 질소 원자를 P 기로 변형시키는 경우[하기 일반식 (V)와 같이], 락탐 결합은 가수분해에 대하여 활성화될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 또한, 놀랍게도 본 발명 연구자들은 정상적인 환경에서는 EP-A-424,064에 기재된 일반식 (II)의 락탐에 대해 활성이 없고, 상기 EP-A-424,064에 기재된 것보다 더 용이하게 얻을 수 있는 효소를 일반식 (IV)의 화합물을 제조하는 데에 사용할 수 있다는 것도 밝혀냈다.

본 발명의 일면은, 하기 일반식 (V)의 N-보호된 (±) 2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온 라세믹 혼합물을 아실라제로 처리함으로써 광학이성질적으로 매우 순수한 상기 일반식 (IV)의 N-보호된 (1R, 4S)-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온을 광학적으로 분리해내는 방법을 제공한다.

상기 식에서, P는 활성 및 보호기임.

본 발명의 다른 일면은, 상기 일반식 (V)의 N-보호된 (±) 2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온 라세믹 혼합물을 아실라제로 처리하고 미반응된 상기 일반식 (IV)의 에난티오머를 통상적인 방법에 의하여 반응 혼합물로부터 분리해냄으로써 광학이성질적으로 매우 순수한 상기 일반식 (IV)의 N-보호된 (1R, 4S)-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온을 광학적으로 분리해내는 방법을 제공한다.

상기의 활성/보호기로서는 아실기 또는 치환된 옥시카르보닐기가 바람직하다. 아실기로 바람직한 것에는 포르밀기 또는 저급 알카노일기 (예를 들면, 알킬기에 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 것), 특히 아세틸기가 포함된다. 치환된 옥시카르보닐기로 바람직한 것은 일반식 ROC(O)- (여기서, R은 알킬기 또는 아랄킬기일 수 있다)이다. 알킬기로 바람직한 것은 3차(tert) 부틸기이다. 아랄킬기로는 벤질기가 가능하다.

본 발명 연구자들은 상기 아실-보호된 화합물은 수용성 환경에서는 상당히 탈보호된다는 것을 알아냈다. 따라서, 상기의 반응은 유기 용매와 물의 혼합물 내에서 수행되는 것이 바람직하다. 시클릭 에테르(예: 테트라하이드로퓨란 또는 1,4-디옥산)와 같이 물과 혼화 가능한 유기 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 탈보호를 최소화하기 위해서는 (부피비로) 70% 미만, 바람직하게는 약 50% 이하의 물을 사용하는 것이 바람직하다. 약 50 : 50 (부피비)의 테트타하이드로퓨란과 물의 혼합물이 가장 적당하다.

이렇게 할 경우 일반적으로 상기의 반응은 단일상으로 수행된다. 그러나, 이상계를 형성시키는 방향족 탄화수소와 같은 유기 용매를 사용하는 경우 왜 성공적이지 않은가는 알 수 없다.

반응이 완료되면, 용매 추출과 같은 통상적인 방법에 의하여 반응 혼합물로부터 상기 일반식 (V)의 미반응되고 광학적으로 매우 순수한 N-보호된 (1R, 4S)-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온을 분리해 낼 수 있다.

또한 본 발명 연구자들은 락탐 결합을 광학선택적으로 가수분해하여 목적하는 이성질체를 생성시키는 여러 아실라제를 찾아냈다. 본 발명 연구자들은 바실러스 속으로부터 유래된 것으로서 특히 활성 프로파일이 바람직한 아실라제들을 찾아냈다. 예를 들면, 서브틸리신 칼스버그(Subtilicin carlsberg; ALTUS)는 상기 일반식 (V)의 라세믹 혼합물로부터 상기 일반식 (IV)의 N-보호된 (1R, 4S)-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온(단, 일반식에서 P는 3차 부틸 옥시카르보닐기임)을 73% 생성시킨다. 기타, 바실러스 속 프로테아제, 뉴트라제(Neutrase), 노보자임 243, 아칼라제(Acalase) 및 사비나제(Savinase)들이 포함되는데, 이들은 ALTUS 및 NOVO사로부터 입수할 수 있다. 광학선택적 가수분해를 나타내는 다른 효소들도 사용될 수 있다. 예컨대, 돼지 간 에스터라제(ALTUS), 돼지 췌장 리파제(Biocatalysts), 플라보프로-192(펩티다제, Biocatalysts), 플라보프로-373(글루타미나제, Biocatalysts), 프로모드-TP(엔도펩티다제, Biocatalysts), 리파제-CE(휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), Amano), 프로테아제-M(아스퍼질러스 속, Amano), 프로자임-6(아스퍼질러스 속, Amano), 리파제 PGE (송아지 침샘, Amano), 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 아실라제 (Sigma) 등이다.

상업적으로 시판되는 아실라제 사비나제(NOVO)의 경우, N-보호된 (1R, 4S)-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온의 생전환율(bioconversion ratio)은 산업적 규모의 응용에 특히 적합하므로, 이 효소를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 사비나제는 호염성 바실러스를 침지 배양시켜 얻은 단백질 분해 효소로서 세린 형의 엔도프로테아제 중의 하나이다. 본 발명 연구자들의 시험 결과, 이 효소는 정상적인 환경하에서는 상기 일반식 (II)의 아실화되지 않은 락탐의 라세믹 혼합물을 가수분해하는 활성이 없다.

N-보호된 (1R, 4S)-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온의 생전환은 pH가 6 내지 11, 바람직하게는 7 내지 9의 범위에서 수행할 때 바람직하다. 온도는 20 내지 50 ℃의 범위일 때 바람직하다. 가장 바람직하기로는 pH는 약 8, 온도는 약 30 ℃에서 반응을 수행하는 것이다. 사비나제 대 기질의 비율을 중량비로 1 : 1 내지 10 : 1 (예를 들면 2 : 1 내지 5 : 1)로 할 때 신속하게 반응이 수행된다. 효소의 최적 비율은 간단한 실험을 통하여 쉽게 알아 낼 수 있다.

P가 3차 부틸옥시카르보닐기인 일반식 (V)의 출발 화합물은 Tet. Asymmetry, 4, p, 1117 (1993)에 기재된 테일러 등의 방법과 유사한 방법을 사용하여 그에 상응하는 일반식 (II)의 비보호된 라세믹 락탐으로부터 제조할 수 있다. P가 포르밀기 또는 저급 알카노일기인 일반식 (V)의 화합물은 윌리사, 뉴욕, 1981, pp. 218 - 287, "유기합성에 있어서의 보호기"에 기재된 티. 더블유. 그린의 방법 및 플레남 프레스사, 뉴욕, 1973, pp. 43-93, "유기화학에서의 보호기"에 기재된 J.F.W. 맥오미의 방법, 또는 이와 유사한 방법을 사용하여 그에 상응하는 일반식 (II)의 비보호된 라세믹 락탐으로부터 제조할 수 있다.

일반식 (IV)의 화합물은 가수분해에 의해 그에 상응하는 N-보호된 아미노산으로 쉽게 전환될 수 있다. 이 N-보호된 아미노산은 카르복실산을 알콜로 전환시킬 수 있는 시약(예: 리튬 알루미늄 하이드라이드 또는 보란)으로 처리하여 그에 상응하는 하기 일반식 (VI)의 아미노 알콜로 쉽게 전환될 수 있다.

또는, 상기 일반식 (IV)의 화합물은 Tet. Asymm, 4, p. 1117 (1993)에 기재된 방법 등에서와 같이 소듐 보로하이드라이드를 사용하여 그에 상응하는 상기 일반식 (VI)의 개환된 아미노 알콜로 직접 전환될 수도 있다.

다음은 본 발명의 실시예들이다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것에 불과할 뿐이고, 이에 의해서 본 발명의 범위가 제한되는 것은 전혀 아니다.

<실시예 1>

P가 3차 부틸 옥시카르보닐기인 일반식 (V)의 (±) 3차 부틸 3-옥소-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-2-카르복실레이트의 락탐 결합을 가수분해할 수 있는 여러 가수분해 효소들을 선별하였다. 반응은 부피비로 50 : 50의 테트라하이드로퓨란 : 포스페이트 완충액(50mM, pH 7)내에 농도 1 mg/ml의 상기 라세믹 화합물이 들어 있는 (부피가 4 ml이고 자석으로 교반되는) 유리병내에서 실온으로 수행시켰다. 각 효소들을 첨가하여 최종 농도가 25 mg/ml가 되도록 하였다. 이는 선별 목적을 위한 효소 : 기질의 비율이 (중량비로) 25 : 1이라는 것을 의미한다. 효소가 들어 있지 않은 플라스크를 대조용으로 사용하였다. 주기적으로 샘플을 취하고, 물로 1 : 2로 희석한 다음 HPLC 분석을 하였다.

HPLC의 조건

컬럼 : Spherisorb C6 (15 x 0.46 cm)

1 ml/분, 실온, 등용매

이동상 : 0.1%(v/v)의 포름산을 함유하는 30 %(v/v)의 아세토니트릴

측정 파장 : 200 nm

상기 조건하에서 (±) 3차 부틸-3-옥소-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-2-카르복실레이트를 화학적으로 가수분해되는 것은 무시될 정도였다. 키랄분석기 (HPLC 광학 회전 검측기)에 의한 분석 결과, 일부 효소들은 상기 라세믹 화합물을 광학선택적으로 가수분해시켜 (-) (1R, 4S) 3차 부틸 3-옥소-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-2-카르복실레이트를 제공하는 것으로 나타났다. 사비나제에 대하여 추가적으로 실험하였다. 약 50 %의 출발 물질을 함유하고 있는 반응 혼합물을 키랄 HPLC로 분석한 결과, 잔여 락탐에는 96.3 %의 에난티오머가 있었다. 또한 잔여 기질은 아바카비르의 생산을 위하여 정확한 절대 배열을 하고 있었다.

키랄 HPLC의 조건

컬럼 : Chiralcel OD-H (25 x 0.46 cm)

0.5 ml/분, 5 ℃, 등용매

이동상 : 2 %(v/v) 이소프로필 알콜/헵탄

측정 파장 : 205 nm

<비교예 1>

일반식 (II)의 라세믹 락탐 (±) 2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온을 함유하는 농도 1 mg/ml의 용액을, 50 % 테트라하이드로퓨란 : 50 % 포스페이트 완충액 (50mM, pH 7) 내에 25 mg/ml로 존재하는 사비나제 (NOVO)로 (4 ml의 부피의 시험관 내에서) 처리하였다. 효소가 들어 있지 않은 플라스크를 대조용으로 사용하였다. 주기적으로 샘플을 취하고, 물로 1 : 2로 희석한 다음 HPLC 분석을 하였다.

HPLC의 조건

컬럼 : Spherisorb C6 (15 x 0.46 cm)

1 ml/분, 실온, 등용매

이동상 : 0.1%(v/v)의 포름산을 함유하는 4 %(v/v)의 아세토니트릴

측정 파장 : 200 nm

실온에서 4일간 인큐베이션한 후에도 반응은 일어나지 않았다.

<실시예 2>

부피비가 50 : 50인 테트라하이드로퓨란/포스페이트 (50mM, pH 8.0, 30℃) 내에 라세믹 화합물 (±) 3차 부틸 3-옥소-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-2-카르복실레이트 10g을 함유한 용액에 사비나제 (30g, NOVO)를 첨가하였다. 키랄 HPLC로 2일까지 반응을 모니터링하였다.

반응이 완료되자마자(약 51%의 전환율, 에난티오머 (-) (1R, 4S) 3차 부틸 3-옥소-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-2-카르복실레이트 >> 99.8%), 효소를 여과하고, 소듐 비카보네이트 용액을 사용하여 여과된 용액의 pH를 9로 올렸다. 그 다음 200ml의 시클로헥산으로 3회 추출하였다. 수득된 유기상을 다시 100 ml의 소듐 비카보네이트 용액으로 추출하고 이어서 100 ml의 염분수(brine)로 세척하였다. 이 세척물을 증발 건조시켜서 자유롭게 떠다니는 백색 고체(4.2g, 84%의 이론적인 분리 수율)를 얻었다. NMR 분석 결과, 이 고체는 (-) (1R, 4S) 3차 부틸 3-옥소-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-2-카르복실레이트로 확인되었고, 키랄 NHPC의 결과, 에난티오머가 >> 99.8%임이 확인되었다.

키랄 HPLC의 조건

컬럼 : Chiralcel OD-H (25 x 0.46 cm)

0.5 ml/분, 5℃, 등용매

이동상 : 2 %(v/v) 이소프로필 알콜/헵탄

측정 파장 : 205 nm

<실시예 3>

테트라하이드로퓨란 (10 ml) 내에 (-) (1R, 4S) 3차 부틸 3-옥소-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-2-카르복실레이트 (3.5 g)가 들어 있는 상기 용액을 메탄올 (10 ml)내에 소듐 보로하이드라이드 (1.27 g)이 들어 있는 현탁액에 첨가하였다. 이 혼합물을 약 20℃에서 약 18 시간 동안 교반하였다. 테트라하이드로퓨란 (10 ml)와 소듐 보로하이드라이드 (1.27 g)을 추가적으로 첨가하고 약 2 시간 동안 더 교반하였다. 2 M의 염산 (30 ml)을 조심스럽게 첨가하고, 이어서 톨루엔 (20 ml)를 첨가하였다. 이 두 층을 분리하고, 수용성 층을 톨루엔(25 ml, 2회)으로 추가적으로 추출하였다. 수득된 유기 추출물을 염분수(20 ml)로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조 증발시켰다. 그 결과 에난티오머가 99.2%인 (1R, 4S) (4-하이드록시메틸)-시클로펜트-2-엔-1-일 카르밤산 3차 부틸 에스테르 (3.23 g)가 옅은 노란 검의 형태로 얻어졌다. 이 생성물은 분광학적 분석으로는 물론 크로마토그래피 분석으로도 원래의 샘플과 동일하였다.

키랄 HPLC의 조건

컬럼 : Chiralcel OD (25 x 0.46 cm)

흐름 : 1.0 ml/분, 35℃

이동상 : 3 %(v/v) 이소프로필 알콜/헵탄

측정 파장 : 205 nm

<실시예 4>

사비나제가 라세믹 화합물 cis-2-아세틸-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온의 락탐 결합을 광학선택적으로 가수분해하는 능력을 측정하였다. 반응은 부피비로 테트라하이드로퓨란 : 포스페이트 완충액(50mM, pH 7)내에 농도 1 mg/ml의 기질이 들어 있는 (부피가 4 ml이고 자석으로 교반되는) 유리병내에서 실온으로 수행시켰다. 최종 농도가 25 mg/ml가 되도록 사비나제를 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 효소가 들어 있지 않은 플라스크를 대조용으로 사용하였다. 주기적으로 샘플을 취하고, 물로 1 : 2로 희석한 다음 HPLC 분석을 하였다.

HPLC의 조건

컬럼 : Spherisorb C6 (15 x 0.46 cm)

1 ml/분, 20℃, 등용매

이동상 : 0.1%(v/v)의 포름산을 함유하는 5 %(v/v)의 아세토니트릴

측정 파장 : 210 nm

키랄 HPLC의 조건

컬럼 : Chiralpak AD (25 x 0.46 cm)

흐름 : 1.0 ml/분, 20℃, 등용매

이동상 : 2 %(v/v) 에탄올/헵탄

측정 파장 : 215 nm

효소가 없는 경우, 상기 반응 조건하에서는 기질의 화학적 가수분해는 무시될 정도였다. 그러나, 반응 혼합물로부터 테트라하이드로퓨란이 빠지는 경우에는, 기질이 상당히 비효소적으로 가수분해되었다. 키랄분석기 및 키랄 HPLC 분석 결과, 사비나제는 라세믹 cis-2-아세틸-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온을 광학선택적으로 가수분해시켜 (-) (1R, 4S) 2-아세틸-2-아자-비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온을 제공하는 것으로 나타났다. 약 50%의 출발 물질을 함유한 반응 혼합물을 2일 후 키랄 HPLC로 분석하였다. 원래의 샘플과는 대조적으로, 잔여 락탐은 아바카비르의 합성을 위하여 정확한 절대 배열을 갖는 >> 99.8%의 에난티오머를 가지는 것으로 확인되었다.

Claims

하기 일반식 (V)의 N-보호된 (±) 2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온 라세믹 혼합물을 아실라제로 처리하고 미반응된 하기 일반식 (IV)의 에난티오머를 통상적인 방법에 의하여 반응 혼합물로부터 분리해냄으로써 광학이성질적으로 매우 순수한 하기 일반식 (IV)의 N-보호된 (1R, 4S)-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온을 광학 분리하는 방법.

< 화학식 IV >

< 화학식 V >

상기 식에서, P는 활성 및 보호기임.
상기 일반식 (V)의 N-보호된 (±) 2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온 라세믹 혼합물을 아실라제로 처리함으로써 광학이성질적으로 매우 순수한 상기 일반식 (IV)의 N-보호된 (1R, 4S)-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온을 광학 분리하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 P가 아실기 또는 옥시카르보닐기인 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 P가 포르밀기 또는 탄소 원자가 1 내지 4개인 알카노일기인 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 P가 알킬옥시카르보닐기 또는 아랄킬옥시카르보닐기인 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 P가 3차 부틸옥시카르보닐기 또는 벤질옥시카르보닐기인 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아실라제가 바실러스 속으로부터 유래된 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 아실라제가 사비나제인 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응이 유기 용매와 물의 혼합물내에서 수행되는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 유기 용매가 물과 혼화 가능한 유기 용매이고 부피비로 70% 미만의 물을 사용하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 물과 혼화 가능한 유기 용매가 테트라하이드로퓨란 또는 1,4-디옥산인 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응이 pH 범위 6 내지 11, 온도 범위 20 내지 50℃에서 수행되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 반응이 pH 약 8, 온도 약 30℃에서 수행되는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미반응된 일반식 (IV)의 N-보호된 (1R, 4S)-2-아자비시클로 [2,2,1] 헵트-5-엔-3-온을 용매 추출에 의하여 분리하는 것인 방법.