KR19990031277A - 참당귀에서 분리한 신규한 펙틴질 다당류와 그분리정제방법 및그의 면역증강제로서의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 참당귀(Angelica gigas Nakai)로 부터 분리한 펙틴질 다당인 안젤란-I과 안젤란-II 등의 물질, 이들의 순수분리방법 및 이들의 항암제 또는 면역증강제로서의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 참당귀에서 분리한 갈락트론산, 아라비노스, 그리고 갈락토스 등을 함유하는 면역증강제의 조성물 이온교환수지를 사용하는 이들물질의 분리 정제하는 방법, 이들 물질의 암을 포함한 면역관련질환의 예방, 치료, 및 치료후의 면역증강을 위한 약물로서의 이용에 관한 것, 이들물질의 면역학 기초연구를 위한 면역증강 시료로서의 이용에 관한 것이다.

Description

참당귀에서 분리한 신규한 펙틴질 다당류와 그 분리정제방법 및 그의 면역증강제로서의 용도
본 발명은 참당귀(Angelica gigas Nakai)로 부터 분리한 신규한 펙틴질 다당류인 안젤란-I과 안젤란-II 등의 물질, 이들의 분리정제방법 및 이들의 항암제 또는 면역증강제로서의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 참당귀에서 분리한 갈락트론산, 아라비노스, 그리고 갈락토스 등을 함유하는 면역증강제의 조성물, 이온교환수지를 사용하여 이들 물질의 분리 정제하는 방법, 이들 물질의 암을 포함한 모든 질환의 예방, 치료, 및 치료후의 면역증강을 위한 약물로서의 이용에 관한 것, 이들물질의 면역학 기초연구를 위한 면역증강 시료로서의 이용에 관한 것이다.
천연물질로부터 유래된 면역증강제는 면역반응을 강화시키거나 저하된 면역기능을 회복시킴으로써 암 치료, 면역결핍증 치료, 그리고 만성 감염등을 치료하는데 사용될 수 있다. 종래 천연물질에서 면역활성 조절물질을 얻기 위해 담자균류, 진균류, 그리고 약용식물 등에 대한 많은 연구가 이루어져 왔는데, 특히 이들 천연물의 고분자 분획성분으로부터 항암활성, 항보체 활성, 그리고 임파구 분열유도 등의 면역조절 활성이 발견되어 왔다. 지금까지는 주로 버섯류로부터 면역조절 활성이 있는 렌티난 (lentinan), 시조필란 (schzophyllan), 그리고 펩티드피에스케이 (peptide PSK) 등의 글루칸 (glucan) 류의 다당이 항암치료에 사용되고 있다.
한편, 당귀는 보혈강장, 진통 작용을 목적으로 부인과 질환(냉증, 빈혈, 혈행장애, 및 정신증상)에 주로 쓰인다. 당귀는 산형과(Umbelliferae)에 속하는 안젤리카(Angelica) 속 식물로서 한국에서는 주로 참당귀 (Angelica gigas Nakai) 를 사용하고 있다. 지금까지 알려져 있는 참당귀의 성분은 쿠마린 (coumarine)계 물질인 데커신 (decursin), 데커시놀 (decursinol), 노다케네틴 (nodakenetin), 움벨리페론 (umbelliferon), 노다케닌 (nodakenin), 베타-시토스테롤 (β-sitosterol) 등이다. 약리학적 연구로는 참당귀의 에테르 추출물이 토끼의 적출장관 및 자궁에 대하여 흥분작용을 나타내었고, 혈압과 호흡을 항진시켰다고 보고되었다. 한편 단리된 데커신과 데커시놀은 토끼 적출장관을 마비시키는 것으로 밝혀졌고, 개구리 적출심장에 대하여는 억제작용 그리고 토끼의 호흡억제와 혈압강하 작용이 보고되었으며 생쥐의 자발작용을 억제한다는 보고도 있다. 최근에는 데커신이 in vitro 항암활성을 나타낼 뿐 아니라 프로테인키나제 C (protein kinase C)의 활성을 증진시키는 작용이 있음이 밝혀졌다. 본 발명자들은 상기와 같은 사실에 착안하고 신규한 면역증강물질을 분리하기 위하여 탐색하는 과정에서 참당귀 뿌리에서 다당류 성분을 분리하였으며 이들이 항암 면역증강활성이 있음을 규명하여 본 발명을 완성했다.
따라서, 본 발명의 목적은 항암 면역증강활성이 있는 펙틴질 다당류를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 참당귀로부터 상기 다당류를 분리정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 다당류의 암 및 면역과 관련된 질환의 예방, 치료, 및 치료 후의 면역기능복구등에 상기 다당류의 이용을 위한 정보를 제공함에 있다.
이밖에 본 발명의 또 다른 목적은 상기 다당류의 면역학의 기초연구를 위한 면역증강시료로의 이용을 위한 정보를 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적은 참당귀로부터 펙틴질 다당류를 열수 추출한 다음 이온교환수지를 이용하여 다당류를 순수분리한 후 펙틴질 다당류 물질의 항암 면역증강 효과등을 분석하므로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 설명하면 다음과 같다.
참당귀에서 분리한 펙틴질 다당류인 안젤란-I 과 안젤란-II 의 분리방법과 이들의 물리화학적 특성을 아래와 같이 비교 검토하였다. 참당귀 뿌리를 잘게 썰어서 열수에서 1 시간 환류추출한 다음 4겹의 거즈와 여과지 (No. 4)에 걸러서 추출여액을 얻었다. 이 추출여액에 에탄올을 3 배량을 첨가하여 섞어준 다음, 4oC에서 3 시간 방치한 후 석출된 침전물을 원심분리하여 갈색의 고분자 분획을 얻었다. 이 고분자분획은 소량의 에탄올에 의한 침전법으로 쉽게 얻을 수 있고 물에 다시 녹인 후 20 분간 끓여도 변성단백질에 의한 침전이 생기지 않는 점을 볼 때 이 분획에는 비 단백질성 고분자물질이 다량 함유되어 있을 것으로 추정되었다. 또한 이 분획은 음이온교환수지인 DEAE-cellulose에 흡착시키게 되면 유색물질은 대부분 수지에 흡착되는 것을 관찰할 수 있었다. DEAE-cellulose 흡착법을 이용하여 산성과 중성의 2 개의 분획을 조제하였고 이들을 각각 안젤란-I과 안젤란-II로 명명하였다. 이들은 모두 소량의 단백질이 함유된 다당으로 밝혀졌으며 두 다당의 분획을 고속액체크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 분석해 본 결과 모두 단일 물질임을 확인하였으며, 안젤란-I의 분자량은 약 1000만달톤 이상이고 안젤란-II의 분자량은 1만달톤 정도로 나타났다.
상기의 다당류물질의 면역활성을 복합면역세포반응(Mixed Lymphocyte Response)을 이용하여 측정했다. 복합면역세포반응은 T 세포의 면역반응을 측정하는 방법으로 널리 사용된다. 최초의 열수 추출액에서는 T 세포의 활성이 약 2 배 증가된 반면, 에탄올 침전물 분획에서는 4 배 이상 활성이 증가되었다. 그러나 산성 분획인 안젤란-I 과 중성 분획인 안젤란-II 에서는 모두 약 20 배 정도의 강력한 활성증가가 나타났다.
참당귀의 열수추출액에 함유되어 있는 면역증강성 분획의 구성성분을 조사하였다. 당의 함량은 85% 내지 90 % (w/w) 정도로 대부분 이었으며, 단백질의 함량은 모든 분획에서 7-8 %로 측정되었고, 유론산의 함량은 15.5 % 내지 68 % 정도로 함유되어 있다. 한편 여러 종류의 무기물이 함유되어 있으며, 칼슘이온 및 마그네슘이온이 비교적 다량 함유되어 있으며, 철, 알루미늄, 망간, 아연, 칼륨, 나트륨, 인, 황등이 함유되어 있다. 상기 결과로부터 참당귀의 면역증강활성을 갖는 주성분은 다당류이며 단백질과 여러 종류의 무기물이 함유되어 있슴을 알 수 있었다. 단백질 가수분해효소인 프로테이나제 케이 (proteinase K) 를 처리하여 단백질을 제거하고 난 후 면역활성을 측정하였는데 안젤란-I 과 안젤란-II 는 모두 전혀 단백질 가수분해효소의 영향을 받지 않는 것을 알 수 있었다. 따라서 이 결과로부터 안젤란-I 과 안젤란-II 의 면역증강활성은 다당 혹은 다당과 결합하고 있는 무기물질에 의한 것임을 알 수 있었다.
안젤란-I 과 안젤란-II 의 당 조성을 조사하기 위하여 각각 정제된 시료를 2 M 트리플루오르아세트산으로 가수분해한 다음 박막액체크로마토그래피 (TLC)와 이온교환고속액체크로마토그래피 (ion exchange HPLC)를 이용하여 구성당을 분석하였다. 갈락트론산 (galacturonic acid), 갈락토스 (galactose), 그리고 아라비노스 (arabinose) 가 다량으로 함유되어 있으며, 만노스 (mannose), 람노스 (rhamnose), 그리고 자일로스 (xylose) 등이 소량 함유되어 있었다. 안젤란-I와 안젤란-II는 모두 다량의 갈락트론산을 함유하고 있으며 또한 아라비노스와 갈락토스가 주요 구성당임을 확인했으며, 이와 같은 당조성은 식물에 광범위하게 존재하는 전형적인 펙틴질의 다당성분이었다. 상기 결과로부터 참당귀의 면역증강성분의 주성분이 펙틴질의 다당이며, 이 다당과 무기물에 의해 면역증강활성이 나타난다는 것을 알 수 있었다. 당귀로부터 분리한 면역 증강성 다당류의 분자량의 측정결과 안젤란-I은 10KD 이하의 비교적 작은 다당인데 반해 안젤란-II는 2,000KD 이상의 고분자로 확인되었다.
상기 당조성과 분자량에 대한 결과는 안젤란-II의 경우 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa)의 항보체활성 (anti-complementary activity)을 갖는 다당의 성분인 아라비노갈락탄 (arabinogalactan) 혹은 펙틴질 (pectic substances) 과 비슷한 종류의 다당으로 사료된다. 그러나 안젤란-I과 비슷한 물성과 생리활성을 가진 다당은 일당귀나 다른 약용식물에서는 전혀 알려진 바 없다.
본 발명의 다당류인 안젤란-I 과 안젤란-II의 면역활성을 다음과 같이 자세히 조사했다. 무균실험동물은 생명공학연구소에서 분양받아 사용했으며, 비장세포중의 B 세포 및 T 새포의 면역기능에 대한 영향을 자세히 조사했다. 안젤란-I 과 안젤란-II는 그 자체만 처리하여도 비장세포의 증식을 강하게 증가시키는 물질이었다. B 세포의 증식을 유도하는 표준물질인 리포폴리사카라이드와 동시처리할 경우 상승효과가 있었으며, T 세포의 증식을 유도하는 표준물질인 콘카나발린 에이와 동시처리할 경우에도 상승효과를 나타냈다. 그러나 피토헤마글루티닌은 안젤란-I 과 안젤란-II에 의해 유발된 강한 증식을 억제시켰다. 이와같은 결과는 안젤란-I 과 안젤란-II가 피토헤마글루티닌과 같은 종류의 T 세포에 경쟁적으로 작용함을 증명한다. 안젤란-I 과 안젤란-II는 T 세포의 활성을 강하게 증가시켰으며, 인터루킨 등의 T 세포의 생산물의 생산을 증가시켰다. 안젤란-I은 단독으로 처리할 경우 B세포의 활성을 약하게 증가시켰으며, 표준활성물질인 리포폴리사카라이드와는 상승효과가 없었으며, 안젤란-II는 어느경우에도 B 세포의 활성에 영향이 없었다. 안젤란-I 과 안젤란-II는 T 세포가 관여하는 항체생성반응을 강하게 증가 시켰다. 이상의 결과로 안젤란-I은 B 세포의 활성을 약하게 증가시키며 T 세포의 활성을 강하게 증가시키는 활성이 있음을 증명하며, 안젤란-II는 오직 T 세포의 활성만을 증가시키는 물질임을 증명한다. 특히 T 세포중에서도 피토헤마글루티닌에 작용하는 세포에 경쟁적으로 작용한다. 모든 시험계에서 안젤란-I이 안젤란-II에 비해 활성이 강했다. 상기에서 규명한 안젤란-I 과 안젤란-II의 면역증강효과는안젤란-I 과 안젤란-II의 면역증강 약물 및 시료로서의 이용을 위한 정보를 제공한다.
안젤란-I 과 안젤란-II의 항암 면역증강효과는 다음과 같이 증명했다. 즉, 안젤란-I 과 안젤란-II를 단독으로 처리했으며 암세포를 이식한 마우스의 생존율을 측정했다. 그 결과 안젤란-I 과 안젤란-II를 처리한 마우스의 생존율이 처리하지 않은 마우스에 비해 월등히 증가했다. 이와같은 결과는 안젤란의 면역증강에 의한 항암작용이다. 안젤란-I과 안젤란-II에 의해 마우스의 면역기능이 증가되고, 증가된 면역기능에 의해 암세포가 죽는 것이다. 또한 안젤란-I 과 안젤란-II를 전처리하면 효과가 강하게 나타난다. 일반적으로 암의 화학적인 치료법으로 항암제인 아드리아마이신을 처리하여 암세포의 성장을 억제하는 방법이 사용된다. 높은 농도의 아드리아마이신을 투여하면 독성이 심하며, 낮은 농도의 아드리아마이신을 투여하면 치료효과가 낮아진다. 본 발명에서는 낮은농도의 아드리아마이신과 안젤란-I 과 안젤란-II를 병용투여하여 부작용을 피하고 치료효과를 높이고자 했다. 특히 안젤란-I과 아드리아마이신을 독성이 없는 농도인 0.3 mg/kg의 농도로 처리하여 100%의 암을 치료했다. 이와 같은 항암효과는 암세포에 대한 직접적인 세포독성에서 유래한 것이 아니고 생체의 면역기능을 증가시켜서 오는 효과임을 증명했다.
본 발명의 화합물을 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 통상적인 방법으로 약제로서 제형화시킬 수 있다. 따라서 경구, 직장, 경피, 피하, 정맥내 및 근육내를 포함한 다양한 경로를 통해 투여하기에 적합한 형태, 예를 들어 정제, 경질 및 연질 젤라틴 캡슐, 액제, 에멀젼, 현탁제, 좌제 또한 주사액제의 형태로 제형화하여 투여할 수 있다.
약학 제제의 제조를 위해서, 상기 화합물을 치료학적으로 불활성인 무기 또는 유기 담체와 배합시킬 수 있다. 락토오즈, 옥수수 전분 또는 그의 유도체, 활성, 스테아르산 또는 그의 염을 예를 들어, 정제 및 경제 젤라틴 캡슐에 대한 담체로서 사용할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐에 적합한 담체의 예로는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반-고형 및 액체 폴리올등이 있으나, 경우에 따라 담체를 필요로 하지 않을 수도 있다. 액제 및 시럽의 제조에 적합한 담체의 예로는 물, 폴리올, 사카로즈, 전화당, 글루코스등이 있다. 주사 액제의 제조에 적합한 담체의 예로는 물, 알콜, 폴리올, 글리세린, 식물성 오일등이 있다. 좌제의 제조에 적합한 담체는 천연 및 경화 오일, 왁스, 지방, 반-액체 폴리올등이다. 약학 제제는 또한 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 풍미제, 삼투압 조절용 염, 완충제, 코팅제 또는 산화방지제를 함유할 수 있다.
암치료를 위한 투여량은 광범위하게 변화시킬 수 있으며, 물론, 각각의 특별한 경우에 개별적인 필요조건에 따라 조절될 것이다. 일반적으로 성인에게 투여하는 경우, 체중 1kg 당 약 20mg 내지 약 200mg, 바람직하게는 약 30mg 내외의 1일 투여량이 적합하지만 경우에 따라 상한선을 초과할 수도 있다. 상기 1일 투여량은 단일 용량 또는 분할 용량으로 나누어 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예에 의해 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일뿐 본 발명의 권리 범위를 이에 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 참당귀 열수 추출액으로부터 안젤란-I과 안젤란-II의 분리
참당귀 뿌리를 잘게 썰어서 부순 후 300 g을 취하여 6 l의 물을 가하여 100oC 에서 1 시간 동안 환류추출하였다. 추출액은 4 겹의 거즈로 여과한 다음 Whatman 여과지 (No. 2) 를 이용하여 다시 여과하였다. 이 여과액에 3 배량의 에탄올 부가해 섞어준 다음, 4oC에서 3 시간 방치한 후 석출된 침전물을 원심분리하여 얻었다. 에탄올 침전물은 불순물을 제거하기 위해 다시 물에 용해시킨 후 3 배량의 에탄올을 부가해 다시 침전시켜 원심분리를 통해 회수한 후 투석을 행하였다 (투석막 : MWCO 10,000). 투석이 끝난 시료는 동결 건조하여 조다당 (crude polysaccharides) (건조시료 중량의 4.6 %) 을 얻었다. 조다당은 다음과 같은 방법으로 산성과 중성다당의 두 분획으로 나누었다. 조다당 (4.6 g) 을 200 ml 의 증류수에 녹인 용액에 디이에이이-셀룰로오스 담체 (DEAE-cellulose resin) 을 넣어 2 시간 방치하였는데 가끔 천천히 저어 주었다. 이 담체는 사용전에 산 (1몰 HCL) 과 알칼리 (1몰 NaOH) 로 전처리 한 후 증류수로 수 회 세척하고 50 mM 트리스 완충액 (Tris buffer, pH 7.0) 에 30 분 이상 담구어 사용하였다. 2 시간 이상 흡착시킨 후 다당이 흡착된 담체는 상기의 완충액으로 2 회 세척한 다음 10 % 염화나트륨 용액으로 담체로부터 다당을 용출시켰다. 이 용출액에 3 배의 에탄올을 부가하여 다당을 침전시킨 다음 원심분리하여 회수한 후 상기의 방법으로 투석을 행하였으며, 투석이 끝난 시료는 동결건조하여 산성 다당인 안젤란-I 을 얻었다. 한편, 담체에 흡착되지 않고 남은 상등액과 세척액을 합하여 3 배의 에탄올 부가하여 침전시킨 후 상기의 방법으로 투석을 행하고 동결건조하여 중성 다당인 안젤란-II 를 얻었다.
실시예 2: 추출분획의 구성성분
참당귀의 열수추출액에 함유되어 있는 면역증강성 분획의 구성성분을 조사하였다. 페놀-황산법 (phenol-sulfuric acid 방법) 으로 측정한 당의 함량은 에탄올추출분획에서 90 % (w/w), 안젤란-I과 안젤란-II에서는 모두 85 % 정도로 대부분을 차지하였다. Bradford 방법으로 측정한 단백질의 함량은 모든 분획에서 7-8 %로 측정되었고, 시료를 2M 트리플루오르아세트산 (trifluoroacetic acid, TFA) 으로 가수분해한 후 유론산 (uronic acid) 의 함량을 carbazol 방법에 의해 측정한 결과 유론산의 함량은 AG-1에서는 35 % (w/w) 였으며 안젤란-II 에서 15.5 %로 측정된 반면, 안젤란-I 에서는 68 % 정도로 높은 양이 함유되어 있었다. 한편 에탄올추출분획에는 유기물질 이외에도 여러 종류의 무기물이 함유되어 있는 것으로 나타났는데, 그 중에서도 Ca 이온이 4.7 %, Mg 이온이 0.8 %로 비교적 다량 함유되어 있었다. 중금속의 함유량을 살펴본 결과 3 mg/g Fe, 7.6 mg/g Al, 2.3 mg/g Mn, 0.25 mg/g Zn 이온이 함유되어 있었고, 이 외에도 K, Na, P, S, Ti, Ba, Sr 등이 미량 함유되어 있는 것으로 밝혀졌다.
안젤란-I 과 안젤란-II 의 당 조성을 조사하기 위하여 각각 정제된 시료를 2M 트리플루오르아세트산으로 가수분해한 다음 박막액체크로마토그래피 (TLC)와 이온교환고속액체크로마토그래피 (ion exchange HPLC) 를 이용하여 구성당을 분석하였다. 에탄올추출분획을 가수분해 한 후 60 % 아세토니트릴 (acetonitrile) 용매를 이용한 박막액체크로마토그래피 결과 AG-1 분획에는 갈락트론산 (galacturonic acid), 갈락토스 (galactose), 그리고 아라비노스 (arabinose) 가 다량으로 함유되어 있음을 알 수 있었으며 그 외에도 만노스 (mannose), 람노스 (rhamnose), 그리고 자일로스 (xylose) 등이 소량 함유되어 있는 것으로 추정되었다. 구성 당의 정량적인 분석을 위해 이온교환컬럼 (ion exchange column) 을 이용한 고속액체크로마토그래피를 행하였는 바 조다당인 에탄올추출분획과 안젤란-I 그리고 안젤란-II의 조성은 표 3과 같다. 안젤란-I와 안젤란-II는 모두 다량의 갈락트론산을 함유하고 있으며 또한 아라비노스와 갈락토스가 주요 구성당임을 확인할 수 있었는데 이와 같은 당조성은 식물에 광범위하게 존재하는 전형적인 펙틴질의 다당성분과 유사한 것으로 판단된다. 상기 결과로부터 참당귀의 주성분은 펙틴질의 다당임을 알 수 있었다. 당귀로부터 분리한 다당류의 분자량을 측정하기 위해 겔투과고속액체크로마토그래피 (gel permeation HPLC)를 수행하였다. 분자량을 측정하기 위한 표품으로는 분자량이 각각 10KD, 40KD, 70KD, 500KD, 그리고 2,000KD의 덱스트란을 사용하여 검량선을 작성하였다 실험 결과 안젤란-I은 10KD 이하의 비교적 작은 다당인데 반해, 안젤란-II는 2,000KD 이상의 고분자로 확인되었다.
안젤란-I 과 안젤란-II 의 주요 구성당
안젤란-I 안젤란-II
다당류성분(몰비율) 아라비노스갈락토스갈락트론산자일로스람노스만노스 38.314미량미량미량 5.72.811.5미량미량미량
유기물(%) 헥소스유로닉 산단백질 37.556.57.5 80.027.27.3
무기물(미량) 철, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄, 망간, 아연, 칼륨, 나트륨, 인, 황
실시예 3: 추출물들의 T 세포 활성에 대한 영향
상기 실시예에서 분리된 다당류들중 중간 및 최종 분리물질인 안젤란 등의 면역증강효과를 측정했다. T 세포의 활성은 복합면역세포반응법을 이용했으며, 본 방법은 조직적합성항원이 서로 다른 두종류의 마우스에서 비장세포를 분리한 후 혼합하여 T 세포의 활성증가를 유도하는 것으로 T 세포의 활성을 측정하기 위하여 널리 쓰이고 있다. 두 종류의 비장세포를 혼합하였으며 시료는 처음부터 처리했다. 3 일 후 T 세포의 증식을 측정하기 위하여 DNA 합성량을 방사선 측정법으로 측정했으며 결과는 세포 250,000개당 CPM으로 표현했다. 그 결과를 하기 표 1에 나타냈으며, 표 1에서 볼 수 있는 것과 같이 모든 다당류 물질들이 T 세포의 활성을 증가 시켰다.
다당류 분획들의 T 세포에 대한 영향
실험군 T 세포의 증식도(CPM/250,000 세포)
시료 미처리군열수 추출물 (25 ㎍/ml)에탄올 추출물 (25 ㎍/ml)(2.5 ㎍/ml)(0.25 ㎍/ml)안젤란-I (25 ㎍/ml)(2.5 ㎍/ml)(0.25 ㎍/ml)안젤란-II (25 ㎍/ml)(2.5 ㎍/ml)(0.25 ㎍/ml) 67521770528087121347854226329622784028426130799389
실시예 4: 다당류물질에 대한 단백질 가수분해 효소의 처리결과
상기 실시예에서 분리한 다당류 물질의 면역증강물질이 단백질인지 또는 다당류인지를 증명하기 위하여 단백질 가수분해효소를 처리하여 측정했다. 표 2의 결과에 나타난 바와같이 프로테아제 케이의 처리에 의해 면역증강효과가 감소하지 않았다. 실시예 3의 결과는 본 발명의 면역증강물질은 단백질이 아님을 증명하며, 면역증강물질은 다당류 등의 다른 물질임을 증명한다.
다당류물질에 대한 단백질 가수분해 효소의 처리결과
실험군 T 세포의 증식도(CPM/250,000 세포)
시료 미처리군에탄올 추출물에탄올 추출물 + 프로테아제 케이 처리안젤란-I안젤란-I + 프로테아제 케이 처리안젤란-II안젤란-II + 프로테아제 케이 처리 3424644726333957929586647035769780
상기 실험에서 안젤란-I 과 안젤란-II의 분리 및 이들 물질의 성질 등을 확인했으며 T 세포의 활성증가에 대해 증명했다. 다음으로는 안젤란-I 과 안젤란-II의 면역활성을 자세히 검증했다.
실시예 5: 안젤란-I 과 안젤란-II의 비장세포증식에 대한 효과
마우스의 비장세포를 분리한 후 3일 동안 배양했으며 안젤란-I과 안젤란-II를 처음부터 처리하였다. 안젤란-I과 안젤란-II의 농도는 1 ㎍/ml 부터 100 ㎍/ml이었다. 3일 후 면역세포의 증식도를 측정하기 위하여 DNA 합성량을 방사선측정법으로 측정했다. 그 결과는 표 4에 나타냈으며, 안젤란-I과 안젤란-II는 비장세포의 증식을 증가시켰으며, 안젤란-I이 안젤란-II 보다 강한 활성을 나타냈다. 실시예 5의 결과는 안젤란-I과 안젤란-II이 면역세포에 대한 증식물질로 작용함을 증명한다.
안젤란-I과 안젤란-II의 비장세포증식에 대한 영향
실험군 비장세포의 증식도(CPM/200,000 세포)
시료미처리군안젤란-I 처리군 (1 ㎍/ml)(3 ㎍/ml)(10 ㎍/ml)(30 ㎍/ml)(100 ㎍/ml)안젤란-II 처리군 (1 ㎍/ml)(3 ㎍/ml)(10 ㎍/ml)(30 ㎍/ml)(100 ㎍/ml) 6665311027328912137525024368641055361612071
실시예 6: 안젤란-I과 안젤란-II의 표준증식유도물질과의 병용처리
상기 실시예 5에서 안젤란-I과 안젤란-II의 단독처리에 의한 비장세포증식의 증가를 증명했으나 본 실시예에서는 표준증식유도물질과의 병용처리시의 효과를 측정했다. B 세포의 증식을 선택적으로 유도하기 위하여 리포폴리사카라이드를 사용했으며, T 세포의 증식을 선택적으로 유도하기위하여 콘카나발린 에이 및 피토헤마글루티닌을 사용했다. 표준물질은 1 ㎍/ml의 농도로 처리했으며, 안젤란-I 및 안젤란-II는 100 ㎍/ml의 농도로 처리했다. 3일 동안 배양한 후 DNA 합성량을 측정했다. 실험 결과는 표 5에 나타냈으며, 표 5에서 보는 바와같이 리포폴리사카라이드 및 콘카나발린 에이와의 병용처리시에는 상승효과가 있었다. 그러나 피토헤마글루티닌과의 병용처리시에는 억제효과가 있었다. 실시예 6의 실험 결과로써 안젤란-I과 안젤란-II는 피토헤마글루티닌과 같은 세포에 경쟁적으로 작용함을 증명한다. 즉, 안젤란-I과 안젤란-II는 피토헤마글루티닌에 민감하게 작용하는 T 세포에 작용함을 증명한다.
안젤란-I과 안젤란-II의 표준증식유도물질과의 병용처리
CPM/200,000세포 안젤란-I의 단독처리 (52502) 안젤란-II의 단독처리 (12071)
표준물질 단독처리리포폴리사카라이드 (46530)콘카나발린 에이 (35387)피토헤마글루티닌 (3182) 안젤란-I과의 병용처리1236887982624764 안젤란-II와의 병용처리105939562576204
실시예 7: 안젤란-I 및 안젤란-II의 T 세포 활성에 대한 영향
상기 실시예 5 및 실시예 6에서는 안젤란-I 및 안젤란-II의 비장세포증식에 대한 영향을 실험 했으나, 본 실시예 7에서는 안젤란-I 및 안젤란-II의 T 세포의 활성에 대한 영향을 복합면역세포반응법을 이용하여 측정했다. 실시예 3과 동일한 방법을 사용했으며 그 결과는 표 6에 나타냈다. 실험결과, 안젤란-I 및 안젤란-II는 T 세포의 활성을 증가시켰다.
안젤란-I 및 안젤란-II의 T 세포 활성에 대한 영향
실험군 T 세포의 활성도(CPM/250,000 세포)
시료미처리군안젤란-I 1 ㎍/ml3 ㎍/ml10 ㎍/ml30 ㎍/ml100 ㎍/ml안젤란-II 1 ㎍/ml3 ㎍/ml10 ㎍/ml30 ㎍/ml100 ㎍/ml 1127255453991238126766577071757278167971971347787
실시예 8: 안젤란-I 및 안젤란-II의 B 세포의 항체생성에 대한 영향
안젤란-I 및 안젤란-II의 B 세포의 항체생성에 대한 영향을 다음과 같이 증명했다. 비장에서 분리한 면역세포를 표준자극물질인 리포폴리사카라이드(25 ㎍/ml)를 이용하여 자극하였으며, 3일 동안 배양한 후 B 세포의 항체생성을 측정했다. B 세포에 의해 생성된 항체가 표적세포인 면양적혈구를 파괴하고, 시험법은 이것의 흡광도를 측정하는 것으로 생성된 항체의 양이 많을수록 흡광도수치가 높게 나타난다. 이와같은 시험법은 B 세포의 단독기능을 측정하는 방법으로 T 세포등의 다른세포의 도움이 필요없는 반응이다. 안젤란-I 및 안젤란-II를 표준자극물질과 병용처리하여 상승효과를 측정했으며, 안젤란-I 및 안젤란-II를 단독으로 처리하여 B 세포의 항체생성에 대한 효과를 측정했다. 안젤란-I 및 안젤란-II의 농도는 1 ㎍/ml 에서 100 ㎍/ml이었다. 실험 결과는 표 7에 나타냈다. 안젤란-I 및 안젤란-II를 표준자극물질과 병용처리할 경우, 안젤란-I 및 안젤란-II에 의한 항체생성의 증가는 없었다. 높은농도의 안젤란-I를 단독으로 처리하면 B 세포의 항체생성이 증가했으나, 안젤란-II를 단독으로 처리할 경우에는 증가하지 않았다. 이와같은 결과는 안젤란-I 및 안젤란-II가 B 세포의 항체생성에는 강한 활성이 없음을 증명한다.
안젤란-I 및 안젤란-II의 B 세포의 항체생성에 대한 영향
실험군 단독처리군 리포폴리사카라이드와의 병용처리
시료미처리군리포폴리사카라이드 단독처리안젤란-I 처리군 (1 ㎍/ml)(3 ㎍/ml)(10 ㎍/ml)(30 ㎍/ml)(100 ㎍/ml)안젤란-II 처리군 (1 ㎍/ml)(3 ㎍/ml)(10 ㎍/ml)(30 ㎍/ml)(100 ㎍/ml) 0.277-0.2650.2760.2960.4270.5150.2560.2460.2440.2460.246 -0.7600.7050.7500.6460.6420.6430.7710.7190.7690.7690.765
실시예 9: 안젤란-I 및 안젤란-II의 T 세포 의존성 항체생성반응에 대한 영향
상기 실시예 8에서는 T 세포의 도움이 필요없는 반응에서의 B 세포의 항체생성에 대한 영향을 증명했다. 다음으로 T 세포의 도움이 필요한 반응에서의 B 세포의 항체생성에 대한 영향을 측정했다. 비장세포를 면양적혈구를 이용하여 면역화 시켰으며, 5일 후 항체생성량을 측정했다. 이와같은 반응은 B 세포가 항체를 생성하기 위해서는 T 세포 등의 도움이 필요한 반응이다. 실험법은 실시예 8과 동일하다. 결과를 표 8에 나타냈다. 안젤란-I 및 안젤란-II가 항체생성을 증가시켰으며, 특히 안젤란-I이 강한 증가를 나타냈다. 실시예 8 및 실시예 9의 결과를 종합하면, 안젤란-I은 B 세포를 약하게 활성화 시키고 T 세포 등을 강하게 활성화 시킴을 알 수 있다. 자세히 설명하면, 실시예 9의 결과와 같은 T 세포 의존성 항체생성반응의 강한 증가는 B 세포 활성의 증가 보다도 T 세포의 강한 활성증가에서 기인함을 증명한다. 안젤란-II의 경우에는 B 세포의 활성증가는 전혀없고 오직 T 세포의 활성증가만이 관찰된다.
안젤란-I 및 안젤란-II의 T 세포 의존성 항체생성반응에 대한 영향
실험군 항체생성량 (흡광도)
시료미처리군면양적혈구 단독처리면양적혈구와 병용처리군안젤란-I 처리군 (1 ㎍/ml)(3 ㎍/ml)(10 ㎍/ml)(30 ㎍/ml)(100 ㎍/ml)안젤란-II 처리군 (1 ㎍/ml)(3 ㎍/ml)(10 ㎍/ml)(30 ㎍/ml)(100 ㎍/ml) 0.2850.6290.6150.9621.2231.5531.2260.2060.2460.6180.6490.565
실시예 10. 안젤란-I 및 안젤란-II의 생체 내에서의 면역증강효과
마우스에 면양적혈구를 복강으로 이식하여 면역화시켰으며, 안제란-I 및 안젤란-II를 복강으로 주사하여 면역기능을 증가시켰다. 시험계는 상기 실시예 9와 동일하며, 다른점은 생체 내에서의 효과인 점이다. 최종 실험결과는 백만개의 비장세포중에서 항체를 생산하는 세포의 수로 표현했다. 결과는 표 9에 나타냈으며, 안젤란-I 및 안젤란-II 모두 생체 내에서 항체생성을 증가시켰다. 이와같은 결과는 안젤란-I 및 안젤란-II가 생체내에도 면역기능을 증가시킴을 증명한다.
안젤란-I 및 안젤란-II의 생체 내에서의 면역증강효과
실험군 항체생성세포수 (비장세포 백만개 당)
미처리군면양적혈구 처리군면양적혈구 + 안젤란-I면양적혈구 + 안젤란-II 6098131262020
실시예 11: 안젤란-I 및 안젤란-II의 항암효과
항암제를 이용한 암치료는 부작용이 심하여 최근에는 면역증강제를 이용한 암치료법이 많이 이용되고 있으며 지속적으로 개발되고 있다. 면역증강제의 이용은 항암제의 부작용을 감소시키며, 또한 항암치료 효과를 증가 시킬 수 있다. 상기의 실시예에서 안젤란-I과 안젤란-II가 생체내 및 생체외에서 면역증강효과가 있음을 증명했다. 본 실시예에서는 안젤란-I 및 안젤란-II에 의한 면역증강이 항암효과로 나타나는지를 검증했다. B16F10 암세포를 마우스 복강에 이식하여 암을 유발했다. 아드리아마이신은 0.1 mg/kg 내지 0.3 mg/kg의 농도로 처리했으며, 안젤란-I 및 안젤란-II는 100 mg/kg의 농도로 처리했다. 안젤란-I 및 안젤란-II를 단독으로 처리하여 면역을 매개하는 암치료효과를 증명했으며, 독성이 낮은 항암제와 병용처리하여 부작용이 없이 암치료효과를 증가 시킴을 증명했다. 실험 결과는 표 10에 나타냈으며, 안젤란-I 및 안젤란-II의 단독처리 및 항암제와의 병용처리에 의해 암치료효과가 상승했다. 아드리아 마이신 0.3 mg/kg와 안젤란-I의 병용처리에 의해 처리에 의해 암이 완치되었다. 각각의 시험군들의 독성을 알아보기 위하여 항암제 및 면역증강제를 처리하는 동안에 마우스의 몸무게를 측정했으며, 몸무게의 감소가 관찰되지 않았다. 이는 모든 시험군에서 독성이 없음을 증명한다. 특히 아드리아마이신 등의 항암제를 독성이 낮은 농도로 처리하고, 면역증강제를 병용처리하여 치료효과를 증대시킨 것은 암치료에 있어서 매우 중요한 진보이다. 실험결과는 마우스의 생존율을 구한 후, 약물을 처리하지 않은 마우스의 생존율에 대한 비율로 측정했다. 또한 암세포 이식 후 60째에 살아있는 동물의 수를 표현했다.
안젤란-I 및 안젤란-II의 항암효과
실험군 생존율(%) 생존동물수 (전체 10마리)
미처리군안젤란-I 단독처리군안젤란-II 단독처리군아드리아마이신 0.1 ( mg/kg)아드리아마이신 0.1 + 안젤란-I아드리아마이신 0.1 + 안젤란-II아드리아마이신 0.3 (mg/kg)아드리아마이신 0.3 + 안젤란-I아드리아마이신 0.3 + 안젤란-II 100>220151195>274182>240>330>265 0300602104
실시예 12: 안젤란-I 및 안젤란-II의 암세포에 대한 직접독성
실시예 11에서 증명한 항암효과가 면역을 매개했는지 또는 암세포에 대한 직접독성을 매개했는지를 다음과 같이 증명했다. 즉, B16F10암세포에 안젤란-I, 안젤란-II, 또는 아드리아마이신을 처리했다. 처리농도는 0.3 ㎍/ml에서 30 ㎍/ml이었으며 2 일동안 배양한 후 살아있는 암세포의 양을 측정했다. 약물을 처리하지 않은 실험군의 세포수를 100%로 표현했으며, 약물처리군의 세포수를 미율로 표현했다. 실험 결과를 표 11에 나타냈다. 아드리아마이신은 암세포에 대해 세포독성을 나타냈으며, 이는 아드리아마이신이 세포독성을 매개하는 항암제임을 증명한다. 안젤란-I 및 안젤란-II는 암세포에 대해 세포독성을 나타내지 않았으며, 이는 안젤란-I 및 안젤란-II가 세포독성이 아닌 생체의 면역을 증가시켜 항암효과를 나타내는 항암면역증강제임을 증명한다.
안젤란-I 및 안젤란-II의 암세포에 대한 직접독성
실험군 아드리아마이신 안젤란-I 안젤란-II
미처리군0.3 ㎍/ml1 ㎍/ml3 ㎍/ml10 ㎍/ml30 ㎍/ml 1005629900 10010098979695 1009695878481
이상 실시예와 실험예에서 확인되는 바와같이 본 발명은 참당귀(Angelica gigas Nakai)로 부터 펙틴질 다당인 안젤란-I과 안젤란-II 등의 물질을 분리정제방법과 이들의 항암제 또는 면역증강제로서의 용도를 제공하는 효과가 있다. 더우기 참당귀에서 분리한 갈락트론산, 아라비노스, 그리고 갈락토스 등을 함유하는 면역증강제의 조성물은 암을 포함한 면역관련질환의 예방, 치료, 및 치료후의 면역증강을 위한 약물로서의 용도와 더 나아가 이들물질의 면역학 기초연구를 위한 면역증강 시료로서의 용도를 제공하므로서 면역학 및 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (7)

  1. 참당귀(Angelica gigas Nakai)로 부터 분리된 식물성 다당으로서 갈락트론산, 아라비노스, 그리고 갈락토스로 구성되고 신규 펙틴질 다당으로서 안젤란-I과 안젤란-II를 유효성분으로 포함하는 항암면역증강제.
  2. 참당귀(Angelica gigas Nakai)를 열수추출후 이온교환수지를 이용한 펙틴질 다당의 분리 정제 방법.
  3. 펙틴질 다당류의 면역증강을 필요로하는 질환의 치료 및 질환의 기초기전연구를 위한 면역증강약물로서의 용도.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 펙틴질 다당류 물질의 암 및 면역관련질환 등의 예방을 위한 질환예방 약물로서의 용도.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 펙틴질 다당류 물질의 암 및 면역관련질환 등을 치료하기 위한 항암면역증강약물로서의 용도.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 펙틴질 다당류 물질의 암 및 면역관련질환 등의 치료 후의 면역증강을제로서의 용도.
  7. 제 3 항에 있어서, 상기 펙틴질 다당류 물질의 면역학의 기초연구에서의 면역기능조절시료로서의 용도.
KR1019970051930A 1997-10-10 1997-10-10 참당귀에서분리한신규한펙틴질다당류와그분리정제방법및그의면역증강제로서의용도 KR100252194B1 (ko)

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