KR19990022304A - 튜브,건,인대와교정구조를만들기위한기질세포를기초로한3차원배양물시스템 - Google Patents

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KR19990022304A
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stromal cells
tissue
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가일 케이 노우튼
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나우톤 질 케이.
어드밴스드 티슈 사이언스, 인코퍼레이티드
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Abstract

본 발명은 장시간동안 시험관에서 다양한 세포와 조직을 배양하는데 이용할 수 있는 기질세포 기초한 3차원 세포배양 시스템에 관계한다. 기질세포와 기질세포에 의해 자연적으로 분비되는 연결 조직 단백질은 생체 적응성이 있는 살아있지 않은 물질로 이루어진 구조물에 부착되어 이를 에워싸고 이는 기질세포에 의해 연결된 간질 공간을 가지는 3차원 구조물이 형성된다. 형성된 살아있는 기질 조직은 생체에 이식될 배양물에서 장기간동안 활동적인 세포증식을 유지시키기 위해 필수적인 서포트, 성장인자 및 조절인자를 제공한다. 3차원 배양 시스템에서 생장하였을 때, 증식성 세포는 성숙하고 분리되어 생체에 상응하는 성인 조직 성분으로 적절히 형성되고 이는 신체에서 교정조직으로 이용될 수 있다. 예를 들면 3차원 배양물은 위장관, 생뇨기관, 혈관 등의 튜브형 조직 구조를 만드는데 이용되거나; 헤르니아 복구 또는 인대 오는 건을 위한 조직으로도 이용될 수 있다.

Description

튜브, 건, 인대와 교정 구조를 만들기 위한 기질세포를 기초로한 3차원 배양물 시스템
세포 배양 시스템을 이용하여 세포를 연구하고, 추가 연구를 위해 세포 집단을 연장할 수 있다. 그러나, 세포 배양 시스템은 신체에 결함 또는 비정상적인 조직을 복구하는 데에는 이용되지 않았다.
2.1. 장기간 세포배양.
영양배지에서 배취로된 인공 기질에서 시험관 내 척추동물 세포 배양물의 대부분은 단층으로 생장한다. 세포 단층으로 생장하는 기질의 성질은 플라스틱과 같은 고형 또는 콜라겐 또는 한천과 같은 반고형 겔이 될 수 있다. 처리 가능한 플라스틱은 현대 조직 또는 세포 배양물에 이용되는 적절한 기질이다.
기저 막 성분과 연관된 천연 기질을 이용하려는 일부 시도가 있었다. 기저막은 생체에서 대부분의 세포를 에워싸는 단백질, 당단백질 및 프로테오글리칸 혼합물로 구성된다. 예로써, Reid and Rojkund (1979, In, Methods in Enzymology, Vol. 57, Cell Culture, Jakoby Pasten, eds., New York, Acad. Press, pp. 263-278); Vlodavsky et al., (1980, Cell 19:607-617); Yang et al., (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3401)는 간세포, 상피세포 및 내피조직을 배양하는데 콜라겐을 이용하였다. 최종 분화를 촉진시키고자 하는 시도에서는 부유 콜라겐에서 세포를 생장시키고 (Michalopoulos and Pitot, 1975, Fed. Proc. 34:826) 셀룰로오즈 니트레이트 막을 이용하였다(Savage and Bonney, 1978, Exp. Cell Res. 114:307-315). 그러나, 장기간 세포 재생과 이와 같은 시스템에서 이와 같은 조직의 배양은 이루지 못하였다.
쥐 배아 섬유아세포의 배양을 이용하여 특히 저밀도의 세포 생장을 강화시켰다. 이와 같은 효과는 배지보강 뿐만 아니라 세포 생성물에 의해 기질의 조건화 때문인 것으로 보인다. 이와 같은 시스템에서, 다른 세포의 부착에 적합한 표면을 만드는 합류 단층으로 섬유아세포의 공급 층이 생장한다. 예를 들면, 정상적인 태아 내장의 합류 공급 층에 교종의 생장에 대해 보고된 바 있다(Lindsay, 1979, Nature 228:80).
배양물에서 세포를 준비하고, 관찰하고, 고속의 세포증식을 허용하기 위한 통상적인 방법이 2차원에서 세포를 성장시키는 것이나 이는 생체 내 전체 조직의 세포-세포와 세포-매트릭스 상호작용 특징이 결여된다. 이와 같은 기능적 그리고 형태학적 상호작용을 연구하기 위해 몇몇 연구원들은 콜라겐 겔(Douglas et al., 1980, In Vitro 16:306-312; Yang et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76:3401; Yang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. 77:2088-2092; Yang et al., 1981, Cancer Res. 41:1021-1027); 셀룰로오즈 스폰지 단독(Leighton et al., 1951, J. Natl. Cancer Inst. 12:545-561) 또는 피복된 콜라겐(Leighton et al., 1968, Cancer Res. 28:286-296); 겔라틴 스폰지 Gelfoam(Sorour et al., 1975, J. Neurosurg. 43:742-749)와 같은 3차원 기질을 이용하는 것에 대해 조사하였다.
일반적으로, 3차원 기질에 배양시킬 세포를 접종한다. 많은 세포형이 매트릭스를 침투하여 조직-과 유사한 조직을 만든다. 예를 들면, 3차원 콜라겐 겔을 이용하여 유방 상피(Yang et al., 1981, Cancer Res. 41:1021-1027)와 교감 뉴우런(Ebendal, 1976, Exp. Cell Res. 98:159-169)을 배양하였다. 또한 분산된 단층 배양물로부터 조직과 유사한 구조를 재생시키는 여러 시도가 있었다. Kruse and Miedema (1965, J. Cell Biol. 27:273)는 관주된 단층이 10개 이상의 세포로 생장하여 적절한 배지의 공급이 유지된다면 다층을 이룬 배양물로 발전할 수 있다(Schneider et al., 1963, Exp. Cell Res. 30:449-459 and Bell et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1274-1279); Green (1978, Science 200:1385-1388)은 사람 상피 케라틴사포는 이동없이 수주간 유지될 경우 피부모양(마찰 릿지)을 형성할 수 있다고 보고한 바 있고; Folkman and Haudenschild (1980, Nature 288:551-556)는 내피 생장 인자와 종양 세포에 의해 조건화된 배지에서 배양된 맥관 내피 세포 배양물에서 모세 튜브를 형성할 수 있다고 보고하였고; Sirica et al. (1979, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 76:283-287; 1980, Cancer Res. 40:3259-3267)는 콜라겐 박층으로 피복된 나일론 메쉬에서 약 10-13일간 1차 배양물에서 간세포를 유지하였다. 그러나, 이와 같은 시스템에서 세포의 장기 배양과 증식을 시키지는 못하였다.
또한, 골수와 같은 조직의 장기간 배양물을 만드는 시도가 있었다. 그러나 전반적인 결과는 만족스럽지 못하였는데 비록 여러 종류의 세포형태를 포함하는 기질세포가 신속히 형성되더라도 실제 상당한 조혈형성이 유지되지 않았다(Dexter et al., In Long Term Bone Marrow Culture, 1984, Alan R. Liss, Inc., pp. 57-96).
2.2. 신체 결함의 교정.
일반적으로 신체에 결함을 교정시키는 외과적인 방법으로는 결함이 있는 기능을 대체시킬 수 있는 생체 적응성이 있는 비활성물질로 만들어진 구조물을 이식하는 것이다. 생체 비-분해성 물질은 외부 물질로써 신체에 영구적으로 남아있을 수 있다. 재흡수 가능한 물질로 만들어진 삽입 물은 재 흡수된 물질을 대체시키기 위한 치료과정을 허용하는 일시적인 대체물로써 이용된다. 그러나, 이와 같은 방법은 신체 구조의 장기간 교정을 하는데 에는 한계가 있었다. 예를 들면, 미국특허 4,347,847 (F.C. Usher issued Sep. 7, 1982)에서는 외과 교정용 장치로써 튜브형 메쉬를 이용하였다. 이 메쉬는 특정 조직배양물을 재생하거나 또는 튜브 구조를 재구성하는데 이용될 수 없었다. 연결조직에 함께 연결시키기 위해 편평한 모양으로 봉합되었다. 1985년 6월 4일자 특허된 Schmidt의 미국특허 4,520,821 에서는 생뇨기관의 튜브 구조에서 결함을 교정하기 위해 튜브형 메쉬를 이용하였다.
외부 메쉬는 손상된 조직을 완전히 대체시키지 못하였는데 그 이유는 연근이 처리부위에서 생장할 수 없었기 때문이다. Bell은 1985년 10월 15일자 특허된 미국 특허 4,546,500 에서 상술된 혈관을 구성하는데 있어서 연근 세포 층을 포함하였다. 그러나 이 구조는 혈관의 필수 성분인 엘라스틴이 완전히 결핍되었고 이는 생체에서 혈관이 요구하는 탄성과 강도를 제공하기 위해 플라스틱 메쉬 슬리브에 의존하여 실망스러운 결과를 얻었다. 따라서 천연적인 카운터파터의 기능을 수행하는데 요구되는 세포와 세포외 성분을 포함하는 튜브형 조직 구조(또는 구조체)가 필요하다.
3. 발명의 요약.
본 발명은 장기간동안 시험관에서 여러 가지 상이한 세포와 조직을 배양하는데 이용될 수 있는 기질 세포-기초한 3차원 세포 배양 시스템에 관계한다. 3차원 구조에서 기질세포를 배양함으로써 교정구조물로써 신체에 이용될 수 있는 3차원 살아있는 기질 조직을 만들 수 있다. 예를 들면, 3차원 배양물을 이용하여 위장관과 생뇨기관 및 혈관의 것과 유사한 튜브형 구조를 만들 수 있으나 이에 국한시키지 않는다.
본 발명에 따르면, 섬유아세포와 같은 기질세포는 3차원 구조물에 접종하고 생장시킨다. 구조는 원하는 교정구조의 모양으로 만들 수 있다. 기질 세포는 연근세포, 내피세포, 대식세포/단세포, 지방세포, 혈관주위세포, 뼈 골수기질에서 볼 수 있는 세망세포, 연골세포등과 같은 성긴 연조직에서 볼 수 있는 다른 세포를 포함할 수 있다. 시험관에서 성장하는 동안에, 기질세포는 구조물위에 이들의 세포외 매트릭스 단백질을 침착시켜 살아있는 기질 조직을 만드는데; 기질세포에 의해 분비되는 연결 조직 단백질과 기질 세포는 생체 적응성이 있는 살아있지 않은 물질로 이루어진 구조물에 부착하여 이를 에워싸고 기질세포에 의해 연결된 기질간 공간을 가지는 3차원 구조를 만들게 된다. 형성된 살아있는 기질조직은 배양물에서 세포의 장기간 활성적인 증식을 유지하고 적절한 매트릭스 단백질의 침착에 필수적인 서포트, 성장인자와 조절인자를 제공한다. 이와 같은 3차원 시스템에서 생장하였을 때 증식성 세포가 성숙하고 분리되어 생체에서 볼 수 있는 카운터파터에 유사한 성인 조직의 성분을 적절히 형성한다.
본 발명은 단층 시스템이 할 수 있는 것보다 더 오랜 기간 3차원에 있는 기질세포의 생장이 배양물에서 세포의 활동적인 증식을 유지시킬 수 있다는 발견에 기초한다. 이는 3차원 구조의 표면적을 증가시키게 되어 기질세포의 활동적인 증식기간이 상당히 연장하게 된다. 이와 같은 증식성 기질 세포는 기질 매트릭스에서 접종된 기질과 조직 특이적인 세포의 장기간 증식을 지원하기 위한 필수적인 단백질, 성장인자 및 조절인자를 만든다. 또한, 매트릭스의 3차원 성질은 생체에 근접한 환경인 공간적 분포를 허용하여 세포의 성숙과 이동을 유도하는 미소환경의 형성하게 한다. 이와 같은 서포트 존재 하에 세포의 생장은 단백질, 당단백질, 글리코사미노글리칸, 세포 매트릭스, 이를 서포트할 수 있는 다른 물질을 추가하거나 또는 이들 물질로 서포트를 피복시켜 강화시킬 수 있다. 3차원 구조물은 천연 기관과 이의 성분의 모양에 맞도록 형성될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체 예에서 기질 세포는 유전 공학적으로 조작되어 성공적인 또는 개량된 이식을 위한 유용한 유전자 생성물을 만들 수 있다. 맥관 이식물의 경우에 기질세포를 유전 공학적으로 조작하여 항-응집선 유전자 생성물을 발현시킴으로써, 혈전증, 아테롬성동맥경화증, 폐색의 위험을 감소시키거나 감퇴의 위험성을 감소시키기 위한 항-염증성 유전자 생성물을 발현시킨다. 예를 들어, 기질세포를 유전 공학적으로 조절하여, 혈병의 위험을 감소시키기 위해 조직 플라스미노겐 활성물질(TPA), 스트렙토카이나제 또는 유로카이나아제를 발현시킨다. 또한, 기질세포는 유전 공학적으로 조작하여, 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨-2(IL-2) 또는 다른 염증성 사이토킨에 대한 항체를 중화시키는 이디오타입에 상응하는 펩티드 또는 폴리펩티를 발현시킨다. 적절하게는 세포는 유전 공학적으로 조작하여 수술후 회복기간동안에 유도성 콘트롤 제어 하에 일시적으로 이와 같은 유전자 생성물을 발현시키도록 하거나 기질세포에 고정된 키메라 융합 단백질의 유전자 생성물을 만들 수 있는데 예를 들면 키메라분자는 세포외 도메인으로써 유전자 생성물에 수용체 또는 수용체 유사분자의 막통과 도메인 또는 세포 내 도메인이 융합된 것으로 구성된다.
또다른 예로는 기질세포를 유전 공학적으로 조작하여 혈병 또는 거부를 촉진하는 인자 또는 표면항원의 발현을 제거하도록 한다. 예를 들면, 혈소판 α2Bβ-3 수용체에 결합하는 피브리노겐, Von Willebrands 인자는 기질세포에 의해 제거되어 혈병의 형성위험을 감소시킨다. 유사하게, MHC-II 분자의 발현을 제거하여 이식물의 이식 거부위험을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 또다른 구체 예에서, 본 발명의 3차 배양 시스템은 유전자 요법에 이용할 수 있는 또는 이식의 결과를 개선시키거나 이를 돕기 위해 유전자와 유전자 생성물을 생체에 도입시키기 위한 운반체를 제공한다. 예를 들면, 혈전 형성, 아테롬성동맥경화증, 염증반응, 섬유증 및 석회화와 같은 혈관질병의 증상을 막거나 감소시키는 유전자는 질병 상태에서 과소 또는 과대 발현된다. 따라서, 환자에서 유전자의 활성수준은 유전 공학적으로 조작된 기질세포에 의해 활성 유전자 생성물의 수준을 조절함으로써 유전자 대체 요법에 의해 증가되거나 또는 감소될 수 있다.
또다른 구체 예에서, 기질세포는 유전 공학적으로 조작되어 연조직 세포의 증식, 이동에 필요하고 과형성을 유도하는 유전자 발현을 차단시키는데 이를 들면, 세포 분열 과정 2 카이나제의 발현을 차단하는 안티센스 올리고 데옥시뉴클레오티드와 증식성 세포 핵 항원에 의해 이루어진다(Mann, M.J., et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4502-4506).
본 발명은 위장관, 생뇨기관, 동맥 및 정맥과 같은 혈관, 헤르니아 치료용 조직, 및 인대를 포함하나 이에 국한되지 않은 신체의 결함을 치료하고, 재구성하거나 대체시킬 수 있는 방법과 생물학적 조직, 튜브부분 또는 구조체에 관계한다.
3.1. 정의와 약어.
여기에서 사용되는 다음의 용어는 지적한 것과 같은 의미를 가진다.
흡착 층 : 매트릭스에 직접적으로 부착할 수 있는 세포의 부착에 의해 간접적으로 연결된 또는 3차원 구조에 직접적으로 부착된 세포들.
기질 세포 : 성긴 연조직에서 발견되는 원소 및 세포 있는/또는 없는 섬유아세포, 내피세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단세포, 혈장세포, 비만 세포, 지방세포, 연골세포등.
조직 특이적 또는 실질 세포 : 서포트 구조물과는 구분되는 기관의 필수적인 별도의 조직을 만드는 세포.
3차원 구조물 : 임의의 물질 또는 모양으로 구성된 3차원 서포트로써 (a) 세포가 이에 부착할 수 있거나(세포가 부착할 수 있도록 변형될 수 있고); 그리고 (b) 세포가 한층 이상으로 자라게 할 수 있다. 기질 세포를 서포트에 접종시켜 살아있는 기질 매트릭스를 만들 수 있다.
3차원 기질 조직 : 서포트에서 생장할 수 있는 기질세포에 의해 접종된 3차원 구조물. 기질 세포에 의해 만들어지는 세포외 매트릭스 단백질이 구조물에 침착되어 살아있는 기질조직을 만든다. 살아있는 기질 조직은 3차원 세포 배양물을 만들기 위해 후에 접종되는 조직-특이적 세포의 생장을 지원한다.
3차원 세포 배양물 : 조직특이적 세포로 접종되고 배양된 3차원 살아있는 기질조직. 일반적으로 3차원 기질 매트릭스에 접종하는데 이용되는 조직 특이적 세포는 조직을 위해 간세포(또는 준비 세포)를 포함하는데 새로운 세포를 만드는 이와 같은 세포는 조직의 실질을 형성하는 특정화된 세포로 성숙한다.
다음의 약어는 지시한 의미를 가진다.
BFU-E : 적혈구의 파열 - 형성 단위
CFU-C : 배양물의 콜로니 형성 단위
CFU-GMMM : 적혈구, 단세포, 메가적아구의 콜로니 형성 단위
EDTA : 에틸렌 디아민 테트라아세트산.
FBS : 태아 소 혈청
HBSS : Hank's 균등 염 용액
HS : 말 혈청
LTBMC : 장기 골수 배양물
MEM : 최소 필수 배지
PBL : 말초 혈액 백혈구세포
PBS : 인산 완충 염
RPMI 1640 : Roswell Park Memorial Institute medium number 1640 (GIBCO, Inc., Grand Island, N.Y.)
SEM : 스케닝 전자 현미경.
본 발명은 기질세포 기초한 3차원 세포와 조직 배양 시스템과 생체에서 이식하고 이용할 수 있는 교정구조를 만드는데 이를 사용하는 것에 관계한다. 이와 같은 배양시스템을 이용하여 생체에서 볼 수 있는 것에 상당히 근접한 환경으로 시험관내에서 세포와 조직을 장기간 증식시킬 수 있다. 여기에서 상술하고 있는 배양물 시스템은 생체에서 조직 카운터 파트에 유사한 구조를 만들기 위해 증식과 적절한 세포 성숙을 제공한다. 특히, 본 발명은 섬유아세포-기초한 3차원 세포 배양 시스템을 이용하여 위장관의 튜브 부분과 성뇨기관, 혈관, 헤르니아 복구를 위한 조직, 건과 인대를 포함하나 이에 국한되지 않은 복합구조를 만들 수 있다. 3차원 배양물은 신체의 결함을 교정하기 위해 생체에 이식될 수 있다.
도 1 은 메쉬 구멍을 가로질러 세포의 연장과 3차 구조물에 부착된 섬유아세포를 나타낸 스케닝 전자현미경 사진이다. 섬유아세포는 활동적으로 분비되는 매트릭스 단백질이고 조직-특이적 세포를 접종하기 전에 수득될 수 있는 준합류 단계이다.
5. 3차원 세포 배양 시스템.
본 발명은 혈관 위장관 또는 생뇨기관을 대체시키거나, 복구하기 위한 튜브형 구조; 건 또는 인대를 대체시키거나 복구하는데 이용되는 필라멘트성 또는 튜브형 구조; 헤르니스와 같은 결함을 복구하는데 이용될 수 있는 튜브 또는 편평한 구조를 포함하나 이에 국한되지 않은 신체의 교정구조로써 이용될 수 있는 3차원 살아있는 기질 조직에 관계한다. 본 발명의 살아있는 기질 조직은 3차원 구조, 매트릭스 또는 네트워크에서 생장할 수 있는 기질 세포로 구성된다. 3차원 구조물은 임의의 원하는 모양이 될 수 있는데; 튜브형 구조를 만드는데 이용될 수 있는 메쉬형 구조; 건 또는 인대를 생장시키는 구조물로 이용될 수 있는 필라멘트 또는 튜브가 되거나 로프형 구조로 만들어질 수도 있다.
통상적인 조직 배양 시스템에서는 세포는 단층으로 생장한다. 본 발명에 따르면, 3차원 구조물에 있어서 생장한 세포는 다층으로 생장하여 세포 매트릭스를 만든다. 이와 같은 매트릭스 시스템은 기존의 단층 조직 배양 시스템보다 생체에서 만날 수 있는 생리적 조건에 한층 더 근접한 것이다. 3차원 세포 배양 시스템은 여러 가지 형태의 세포의 증식과 피부, 간, 췌장, 신장, 부신과 신경조직 및 위장관, 생뇨기관, 순환계를 포함하나 이에 한정되지 않은 여러 가지 상이한 기질 조직을 만드는데 이용할 수 있다. 미국 특허 4,721,096; 4,963,489; 5,032,508; 5,266,480; 5,160,490 참조.
3차원 배양물에 이용된 기질세포는 여기에서 충분히 설명하는 것과 같은 추가 세포 또는 원소 유무에 관계없이 섬유아세포로 구성된다. 기질을 구성하는 섬유아세포 및 다른 세포/또는 원소는 태아 또는 성인의 것일 수도 있고 피부, 간, 췌장, 동맥, 정맥, 탯줄, 태반조직과 같은 통상적인 원에서 유도될 수 있다. 조직과 기관은 적절한 생검 또는 부검에 의해 얻을 수 있다. 사실 사체 기관을 이용하면 기질세포와 원소를 일반적으로 공급할 수 있다.
태아 섬유아세포는 3차원 배양 시스템에서 다양한 세포와 조직의 생장을 서포트할 수 있기 때문에, 다양한 세포와 조직의 배양을 위한 일반적인 살아있는 간조직을 형성하기 위해 매트릭스에 접종될 수 있다. 그러나, 특정 경우에 있어서, 일반 기질 시스템보다는 특정 시스템을 사용하는 것이 적절한데 이때 기질 세포와 요소들은 특정 조직 기관 또는 개체에서 얻을 수 있다. 예로써, 3차원 배양물은 생체에서 이식을 목적으로 사용될 수 있는데 이는 이식을 받게될 개인으로부터 기질 세포를 얻는 것이 적절하다. 이와 같은 접근 방식은 숙주 질환에 대한 이식체의 면역학적 거부가 있을 때 특별히 유익하다. 또한, 섬유아세포와 다른 기질세포 또는 원소는 3차원 배양 시스템에서 배양된 동일 형태의 조직에서 유도될 수 있다. 이는 특정화된 기질세포가 특별한 구조적/기능적 역할을 할 때 유익한데; 예로써, 동맥의 연근 세포, 신경조직의 신경과 세포간의 Kupffer 세포 등이 된다.
3차 매트릭스에 접종한 뒤, 기질 세포는 구조에서 증식하고 기질세포에 의해 분비될 연결조직 단백질을 침착시킨다. 기질 세포와 이에 의해 자연적으로 분비되는 연결 조직 단백질은 실제 구조물을 에워싸고 따라서, 본 발명의 3차원 배양물 시스템에 접종될 조직-특이적인 세포의 생장을 서포트한다. 사실 조직-특이적인 세포로 접종하는 경우에, 3차원 기질조직은 장기간동안 배양물의 활동적인 증식을 유지시킨다. 중요한 것은 메쉬에 있는 입구가 배양물에서 기질 세포의 유출을 허용하기 때문에 합류 기질 배양물은 접촉 저해성을 나타내지 않고 기질 세포는 성장과 분화를 지속하여 기능적으로 활성을 유지한다.
성장 및 조절인자들은 기질 지지매트릭스에 의해 만들어지기 때문에 배양물에 반드시 첨가할 필요는 없다. 본 발명에 절대적으로 필수적인 것은 아니지만, 성장인자(αFGF, βFGF, 인슐린 성장인자 또는 TGF-β) 또는 천연 또는 수정된 또는 다른 생물학적 활성분자(예를 들면 히알루론산 또는 호르몬과 같은 그러나 이에 국한되지 않는)를 이용하여 3차원 구조 또는 스카폴딩의 콜리니형성을 강화시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 특정조직을 위해 생체에서 볼 수 있는 세포 미소환경을 배양물에서 재창조하는 것이 중요하기 때문에 생체에서 배양물을 이용하기 전에 어느 정도 생장된 기질 세포는 3차 조직 배양물에서 생장한 조직 형태에 따라 달라진다. 살아있는 기질조직은 생체 내 이식을 위해 교정 구조로 이용될 수 있다. 또는 살아있는 기질 조직은 다른 세포형으로 접종하여 시험관에서 선 배양하여 또는 하지 않고 생체 내에서 이식될 수 있다. 또한 시스템에서 생장한 기질세포는 이식에 유익한 유전자 생성물을 생산하기 위해 유전 공학적으로 조작될 수 있는데, 예를 들면 항-GM-CSF, 항-TNF, 항-IL-1, 항-IL-2 등과 같은 항-염증성 인자 등을 발현한다. 또는 기질 세포는 GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2와 같은 염증을 촉진시키는 고유 유전자 생성물의 발현을 중지시키거나 또는 거부 위험을 낮추기 위한 MHC의 중지 발현을 하도록 조작될 수 있다. 또한, 기질 세포는 튜브 조직 이식의 결과를 돕거나 또는 개선시키기 위해 환자에서 유전자 활성 수준을 조정하기 위해 유전자 요법에 이용할 수 있도록 유전학적으로 조작될 수 있다.
또다른 구체 예에서, 기질 세포는 유전 공학적으로 조작되어 연근 세포가 증식하고, 이동하고 이로 인하여 과형성을 유도하는데 필수적인 유전자 발현을 차단시킬 수 있는데 이를 들면, 세포 분열 과정 2 카이나아제의 발현과 증식성 세포 핵 항원을 차단하는 안티센스 올리고데옥시 뉴클레오티드를 이용한다.
본 발명은 단층 시스템에서보다도 더 긴 시간동안 3차 배양물에서 생장한 기질 세포가 배양물에서 기질과 조직-특이적인 세포의 활동적인 증식을 유지시킨다는 발현에 기초한다. 또한, 3차원 시스템은 생체에서 볼 수 있는 카운터 파터에 유사한 성인 조직의 성분을 만들기 위해 시험관 내 배양물에서 세포의 성숙, 분화, 분리를 지원한다.
또다른 응용에서는 3차원 튜브형 조직 또는 구조물은 살아있는 사람세포로 접종된 이식물을 만들기 위해 바이오리엑터에서 생장시킬 수 있다. 예를 들면 3차 구조 내에서 어셈블리되고 바이오리엑터의 처리실에 내장된 맥관 이식물이 되나 이에 한정하지는 않는다. 접종 또는 배양동안에 처리실에 있는 맥관 이식물에 방사 스트레스를 제공하면 사람에서 볼 수 있는 생리적인 조건에 더 잘 견딜 수 있도록 하기 위해 맥관 이식물에 세포와 이들의 섬유가 방향을 잡고 있다. 이와 같은 방식으로, 바이오리엑터는 동적 환경을 창조하는데 이는 조직-으로 만들어진 맥관 또는 다른 생물학적 이식물 또는 다른 이식 가능한 구조물을 접종하고 배양시킬 수 있게 된다.
출원인이 발명이 실행되는 기작을 설명할 의무는 없으나, 3차구조 배양물 시스템에 있는 다수의 인자가 이의 성공에 기헌하게 된다:
(a) 3차원 매트릭스는 단백질 흡착과 결과적으로 기질세포의 흡착을 위한 더 큰 표면적을 제공한다.
(b) 매트릭스의 3차원성 때문에, 기질세포는 단층 배양물에 있는 세포와는 대조적으로 활기 있게 성장을 계속하고, 합체를 이루고 접촉저해를 나타내고 성장과 분할이 중단된다. 기질 세포의 복제에 의한 성장과 조절인자의 노력은 배양물에서 증식을 촉진시키고 세포 분화를 조절하는데 부분적 역할을 할 수 있다.
(c) 3차원 매트릭스가 생체내 반대부분 조직에서 발견되는 것과 유사한 세포요소의 공간 분포를 허락한다.
(d) 3차원 시스템에서 세포 성장에 대한 상당량의 증가는 세포 성숙을 촉진하는 지역 화된 미세환경의 정립을 허용한다.
(e) 3차원 매트릭스는 흡착 층에 거대세포, 단세포와 가능한 임파세포와 같은 이주 세포의 움직임에 대해 더 큰 전위를 허용함으로써 세포-세포 상호작용을 최대화시킨다.
(f) 분화된 세포 표현형의 유지는 성장/분화 인자뿐만 아니라 적절한 세포 상호 작용을 요구하는 것으로 보인다. 본 발명은 효과적으로 조직의 미세환경을 재창조한다.
3차원 기질서포트, 배양시스템 자체, 이의 유지 그리고 3차 배양물의 다양한 용도에 대해 아래에서 상술한다.
5.1. 3차 기질 조직의 정립
3차 구조는 a) 여기에 세포의 부착을 허용하고(또는 여기에 세포의 부착을 허용하기 위해 수정될 수 있는); 그리고 b)한층 이상으로 세포가 성장할 수 있게 하는 임의의 재료 그리고/또는 모양일 수 있다. 상당수의 상이한 물질이 매트릭스를 만드는데 사용될 수 있는데 여기에는 나일론(폴리아미드), 다크론(폴리에스테르), 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐화합물(예로써 폴리비닐클로라이드), 폴리카르보네이트(PVC), 폴리테트라플로로에틸렌(PTFE, 테플론), 테르마녹스(TPX),니트로셀룰로오즈, 면과 같은 생체 비-분해성 물질; 폴리글리콜산(PGA), 콜라겐(스폰지, 끈, 또는 짜여진 실 등의 형태), 고양이 내장 봉합사, 셀룰로오즈, 젤라틴 덱스트란, 알카노에이츠를 포함하는 생체 분해 가능한 물질 등을 포함하나 이에 국한하지는 않는다. 이들 물질은 3차 구조를 형성하기 위해 예로써 메쉬로 짜여질 수 있다. 구조물은 튜브, 로프, 필라멘트등과 같은 임의 모양이 될 수 있다. 나일론, 폴리스티렌등과 같은 특정 물질은 세포 부착에는 부적합한 기질이다. 이들 물질이 3차 구조로 이용될 때, 매트릭스에 기질세포의 흡착을 강화시키기 위해 기질 세포의 접종 전에 매트릭스를 선 처리하는 것이 바람직하다. 예로써, 기질 세포와 접종 전에 나일론 매트릭스는 0.1M아세트산으로 처리하고 나일론에 피복 시키기 위해 폴리리신, PBS 그리고/또는 콜라겐에 배양한다. 폴리스티렌은 황산을 이용하여 비슷하게 처리할 수 있다.
3차원 배양물을 생체에 이식시키기 위해서는, 글리콜린산, 콜라겐, 콜라겐 스폰지, 직조된 콜라겐, 고양이 내장 봉합사 물질 젤라틴, 폴리라틱산, 또는 폴리글리콜 산과 이의 공고분자와 같은 생분해 가능한 매트릭스를 이용하는 것이 바람직하다. 배양물은 상당시간 동안 유지시킬 때, 나일론, 다크론, 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 테플론, 면과 같은 분해되지 않는 물질이 적절하다. 본 발명에 따라 사용된 통상의 나일론 메쉬는 Nitex로 평균 다공 크기가 210㎛이고 평균 나일론 섬유 직경이 90㎛인 나일론 필터메쉬이다(#3-210/36 Tetko, Inc., N.Y.).
아래에서 상술하는 것과 같은 다른 세포 또는 원소가 포함된 또는 없는 것으로 구성된 기질세포를 구조물에 접종한다.
이와 같은 기질 세포는 생검 또는 부검에 의해 피부, 간, 췌장 등의 기관에서 수득할 수 있다. 섬유아세포는 사체 기관에서 적정 량은 편리하게 얻을 수 있다. 전술한 것과 같이 이와 같은 태아 기질 세포는 일반적 기질 또는 연골 형성 조직을 준비하는데 사용된다. 그러나 특정 기질 조직은 본 발명의 3차 시스템에 따라 배양물에서 생장한 세포와 조직을 수용하기 위해 특정 개인에서 받은 섬유아세포 또는 배양한 동일세포에서 유도한 섬유아세포를 3차 매트릭스를 접종하여 준비할 수 있다.
섬유 아세포는 섬유 아세포의 원료로 사용될 수 있는 적절한 기관 또는 조직을 해리 시킴으로써 분리될 수 있다. 이는 본 기술에 공지된 기술을 이용하여 실행할 수 있다. 예로써 조직 또는 기관은 기계적으로 분리시키거나 그리고/또는 적절한 세포 파괴 없이 개별 세포의 현탁액 내에 조직을 분산시킬 수 있는 주변 세포 사이에 연결을 약화시키는 분해효소 그리고/또는 킬레이트제로 처리할 수 있다. 효소적 분해는 조직을 절단하고 절단된 조직은 상당수의 소화효소 단독 또는 복합으로 처리하여 이루어질 수 있다. 이들 효소에는 트립신, 키모트립신, 코라게나제, 엘라스타제 그리고/또는 히알루노니다제, DNase, 프로테아제 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 기계적인 파괴는 연마기, 분쇄기, 체, 균질화기, 압력세포 또는 초음파 분쇄기를 포함하는 다양한 방법에 의해 이루어질 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 조직 분해 기술은 Freshney, Culture of Animal Cells. A New York, 1987, Ch. 9, pp. 107-126를 참조한다.
일단 조직이 개별 세포의 현탁액으로 환원될 때, 현탁액은 섬유아세포 그리고/또는 다른 기질세포 그리고/또는 요소들이 수득되는 소집단으로 분류한다. 이는 또한 특정 세포형의 클로닝과 선택, 원치 않은 세포의 선택적 파괴(네가티브 선택), 혼합된 집단에서 분화된 세포 응집성에 기초한 분리, 해동-냉동 과정, 혼합 집단에서 세포의 차등 흡착성과 여과, 통상 지역적 원심분리, 원심분리 유리(카운터-스트림 원심분리), 단위중력 분리, 카운터-커런트 분포, 전기영동 그리고 형광 활성화된 세포 분류 클론 선택과 세포 분리 기술에 대한 것은 Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2d Ed., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 11 and 12, pp. 137-168을 참고한다.
섬유아세포의 분리는 다음과 같이 실시한다: 새로운 조직 샘플을 완전하게 세척하고 혈청을 제거하기 위해 Hanks 균형염용액(HBSS)으로 절단한다. 조각난 조직은 트립신과 같은 분리효소의 새로 준비된 용액에서 1-12시간 동안 배양시킨다. 배양 후에, 분리된 세포는 현탁되고 원심분리에 의해 펠렛으로 만들고 배양접시에 도말한다. 섬유아세포는 다른 세포보다 먼저 흡착하고 따라서 적절한 기질 세포가 선택적으로 분리되고 생장된다. 그 다음 분리된 기질 세포는 합체가 되도록 성장시키고 합체 배양물로부터 들어올려 3차 서포트위에 접종시킨다(Naughton et al., 1987, J. Med. 18(3 4):219-250). 고농도 기질 세포 예로써 106내지 5x107세포/㎖을 3차 매트릭스에 접종시키면 짧은 기간에 3차원 기질 서포트를 만들 수 있다.
섬유아세포외에 3차 기질 조직을 형성하기 위해 다른 세포가 첨가될 수 있다. 예로써, 성긴 연결 조직에서 볼 수 있는 다른 세포는 섬유아세포와 함께 3차 서포트에 접종시킬 수 있다. 이와 같은 세포에는 연근세포, 내피세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단세포, 혈장세포, 비만세포, 지방세포 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 이들 기질세포는 전술한 본 기술에 공지된 방법을 사용하여 동맥, 피부, 간 등과 같은 적절한 기관으로부터 유도할 수 있다.
본 발명의 한 구체 예에서, 배양될 특정 조직에 특징화된 기질 조직을 섬유아세포 기질에 추가하여 조직형에 특이적인 세포외 매트릭스를 만들 수 있다. 예를 들면 또는 섬유아세포 내피 세포, 대식세포/단세포, 지방세포와 망상 세포와 같은 조혈성 조직의 기질세포를 이용하여 시험관에서 골수-특이적인 세포외 매트릭스의 생산을 위한 3차원 준-합류 기질을 만든다. 조혈성 기질 세포는 3000xg 와 같은 저속에서 원심분리에 의해 골수 현탁액에 있는 연막에서 바로 얻을 수 있다. 동맥의 내층을 이루는 기질 층에서 상당부분의 미분화된 연근세포를 추가하여 단백질 엘라스틴을 제공한다. 간 기질세포는 섬유아세포, kupffer 세포와 맥관 및 담즙관 내피세포를 포함한다. 유사하게 신경교 세포를 이용하여 신경 조직과 세포의 증식을 지원할 수 있다. 배 또는 성인 뇌를 트립신 또는 콜라게나제 처리하여 이 목적을 위해 신경교 세포를 얻을 수 있다(Ponten and Westermark, 1980, in Federof, S. Hertz, L., eds, Advances in Cellular Neurobiology, Vol. 1, New York, Academic Press, pp. 209-227). 다시, 배양된 세포가 생체 내에서 이식을 위해 사용되었을 때 환자 고유 조직으로부터 기질세포를 얻는 것이 적절하다. 3차원 기질세포 배양물에서 세포 성장은 단백질(예로써, 콜라겐, 탄성섬유, 망상섬유), 당단백질, 글리코사미노글리칸(헤파린 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 덜마탄 설페이트, 케라틴 설페이트등), 세포 매트릭스 그리고/또는 다른 물질을 구조에 피복시키거나 첨가시켜 강화될 수 있다.
기질 세포는 튜브, 로프, 섬유와 같은 이식에 필요한 모양을 이루기 전에 구조물에 접종될 수 있다. 기질 세포의 접종 후에, 3차 매트릭스는 적절한 영양 배지에 접종될 수 있다. RPMI 1640 Fisher's, Iscove's, McCoy's 그리고 이와 유사한 것이 이용하기에 적합하다. 증식 활성을 최대화시키기 위해 배양 기간동안에 배지에 3차 기질 세포 배양물을 현탁시키는 것이 중요하다. 또한, 배양물은 사용된 배지를 제거하고, 방출된 세포를 분산시키고 새로운 배지를 보충시키기 위해 주기적으로 공급된다.
배양기간동안에, 기질 세포는 매트릭스의 개구부내로 성장을 시작하기 전에 3차 매트릭스를 따라 성장하고, 이를 덮게 된다. 조직-특이적 세포를 기질 조직에 접종 전에 생체조직에 있는 기질세포의 양을 반영하도록 적정 수준으로 성장시키는 것이 중요하다.
구조의 개구부는 기질 세포가 구멍을 가로질러 뻗을 수 있도록 적절한 크기이어야 된다. 구조물을 가로질러 이어지는 기질 세포의 성장 활성 유지는 기질세포에 의해 이루어지는 성장인자의 생산을 강화시키고 따라서 장기간 배양을 지지한다. 예로써, 구멍이 너무 작은 경우, 기질세포는 신속히 합체를 이루나 메쉬로부터 용이하게 빠져나올수 없고; 붙잡힌 세포는 접촉성 저해를 나타내어 증식을 지지하고 상당 기간 배양을 유지시키는데 필수적인 적절한 인자들의 생산을 중단하게 된다. 구멍이 너무 큰 경우 기질 세포는 구멍을 가로질러 이어질 수가 없고; 이는 증식을 지지하고 장기간 배양물을 유지시키는데 필수적인 적절한 인자의 기질 세포 생산을 감소시킬 수 있다. 메쉬 형태의 매트릭스를 이용할 때 여기에서 예시한 바와 같이, 150㎛ 내지 220㎛ 범위의 구멍이 작업에 만족도가 있음을 알 수 있다. 그러나, 3차 구조와 구조물의 복잡성에 따라 다른 크기도 될 수 있다. 사실, 본 발명에 따르면, 기질 세포가 상당시간 동안 복제와 성장을 지속하기 위해 임의 모양 또는 구조가 될 수 있다.
구조물에 침착된 다양한 콜로겐의 상이한 비율이 나중에 접종된 조직-특이적 실질세포의 성장에 영향을 줄 수 있는데 이들이 기질조직에 접종되거나 생체 구조에서 생장하게 된다. 예를 들면, 조혈세포의 경우에, 매트릭스는 초기 매트릭스에서 콜라겐 III, IV, I이 6:3:1의 비율로 포함된다. 피부 배양 시스템의 경우에 콜라겐 I와 II이 초기 매트릭스에 침착된다. 침착된 콜라겐 형의 비율은 적절한 세포외 매트릭스 단백질을 만드는 섬유아세포를 선택함으로써 조절되거나 강화될 수 있다. 예를 들면 상보활성을 가지는 적절한 이소타입 또는 아류의 단클론 항체를 이용하여 섬유아세포를 선택할 수 있다. 상보체와 복합된 이와 같은 항체를 이용하여 바람직한 콜라겐 형을 발현시키는 섬유아세포를 음성적으로 선택할 수 있다. 또는 구조물에 접종하는데 이용되는 기질은 소요의 적절한 콜라겐 형태를 합성하는 세포 혼합물이 될 수 있다. 다섯 종류 콜라겐의 분포와 기원은 표 1 에 나타내었다.
다섯종류의 콜라겐 형태의 분포와 기원.
콜 라 겐 원칙적으로 조직 분포 세포기원
I 연결조직;콜라겐 섬유섬유 연골뼈덴틴 망상세포;연근세포조골세포조치세포
Ⅱ 히알린과 탄성 연골안구의 초자체 연골세포망막세포
Ⅲ 느슨한 연결조직;망상섬유피부의 유두층혈관 섬유아세포와망상세포연근세포;내피세포
Ⅳ 기저막눈의 렌즈 상피와 내피세포렌즈 섬유
Ⅴ 태아 막: 태반기저막뼈연근 섬유아세포연근세포
따라서, 배양된 조직과 바람직한 콜라겐 형태에 따라, 적절한 기질 세포는 3차원 매트릭스에 접종시키기 위해 선택될 수 있다.
유사하게, 기질 층에 있는 콜라겐성 그리고 탄성 섬유의 상대적인 양은 초기 접종물에서 콜라겐 생성세포에 대해 엘라스틴 생성 세포의 비율을 조절하면 된다.
3차 기질 서포트의 배양동안에 증식 세포는 매트릭스로 부터 방출된다. 이들 방출된 세포는 배양 용기 벽에 달라붙고 여기에서 증식을 계속하고 합체된 단층을 형성한다. 이는 공급 동안에 방출세포의 제거에 의해 또는 새로운 배양 용기에 3차 기질 매트릭스를 옮겨 예방하거나 최소화할 수 있다. 용기에서 합체 단층의 존재는 3차 매트릭스와 배양물에서 세포의 성장을 막는다. 새로운 용기에 있는 새로운 배지에 매트릭스의 전달 또는 합체 단층을 제거하여 3차 배양 시스템의 증식성 활성을 복원시킨다. 이와 같은 제거 또는 이동은 25% 합체를 초과하는 기질 단층을 가지는 임의 배양 용기에서 실시될 수 있다. 또는 배양 시스템은 방출된 세포가 달라붙는 것을 막기 위해 교반시키거나 또는 배양물에 주기적으로 공급하는 대신에 배양시스템을 대류에 의해 시스템을 통해 새로운 배지가 지속적으로 흐르도록 한다. 류속은 3차 배양물 내에 증식을 최대화하고 매트릭스로 부터 방출된 세포를 씻어 내고 제거한다. 이로써 용기 벽에 달라붙지 않고 합체를 형성하면서 성장하지 않는다. 어떤 경우에, 방출된 기질 세포가 수득되고 추가 사용을 위해 냉동 보관한다.
형성된 살아있는 기질 조직은 생체에서 교정구조로 이용될 수 있다. 또는, 실질세포와 같은 다른 세포는 생체 내 이식하기 전에 3차원 살아있는 기질조직에서 접종시키고 생장시킬 수 있다.
5.2. 3차 기질 매트릭스에 조직-특이적인 세포의 접종과 배양물의 유지.
일단 3차 기질 세포 배양물이 적정 수준의 성장에 도달하면, 조직-특이적 세포(실질 세포) 또는 배양되기를 원하는 표면층 세포와 같은 추가 세포를 살아있는 기질 조직에 접종시킬 수 있다. 살아있는 기질조직에 접종된 이와 같은 세포를 배양하여 세포가 기질조직에 접착되고, 지속적인 성장이 일어날 수 있도록 생체에 이식한다. 또는, 세포를 살아있는 기질조직에 시험관 생장시켜, 조직에 이식하기 전에 고유 조직의 배양된 카운터파트를 형성한다. 접종물에 세포의 농도가 높을 경우에 농도가 낮은 경우보다도 더 빨리 배양물에서 증식이 증가되게 된다. 접종을 위해 선택된 세포는 배양될 조직에 따라 달라지는데 여기에는 골수, 피부, 간, 췌장, 신장, 신경조직, 부신 신경교, 점막 상피, 내피, 연근 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
예를 들면 3차 살아있는 기질조직에는 다양한 상피세포가 배양도리 수 있으나 이에 국한시키지 않는다. 상피세포의 예로는 구강 점막, 위장(GI)관 세포 등을 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 이와 같은 상피세포는 공지의 방법에 따라 조직을 효소로 처리하고, 배양물에서 이들 세포를 연장하고 3차 기질 서포트 세포 매트릭스에 상피세포(신-부점막)를 적용시켜 분리할 수 있다. 부점막이 존재함으로써 G.I관 라이닝의 세포와 점막 세포의 정상적인 분열과 분화를 촉진시키는 성장인자와 다른 단백질을 제공한다. 이와 같은 방법을 이용하여, 비강 상피세포, 호흡기관 상피, 질 상피 및 각막 상피를 포함한 다른 상피세포를 성공적으로 배양시킬 수 있다.
일반적으로, 이와 같은 접종 물은 조직에 대한 간 세포(저장 세포)를 포함하는데; 새로운 세포를 만들어 내는 이와 같은 세포는 조직의 다양한 성분을 만드는 특정화된 세포로 성숙된다.
접종에 이용된 실질 또는 다른 표면층 세포는 5.1에서 상술하고 있는 기질 세포를 수득하기 위해 소요의 조직을 해리 시킴으로써 준비된 세포 현탁액에서 수득할 수 있다. 전체적인 배양물 현탁액을 이용하여 3차원 살아있는 기질조직을 접종한다. 그 결과로써, 균질화물내에 포함된 재생성 세포는 매트릭스에서 적절하게 증식하고, 성숙하고, 분화하는 반면에, 비-증식성 세포는 그렇게 할 수 없다. 또는 특정 세포형을 5.1에서 상술하고 있는 기질세포를 분별시키기 위한 상술된 표준 기술을 이용하여 세포 현탁액의 적정 부분에서 분리해 낼 수 있다. 간 세포 또는 저장 세포를 용이하게 분리할 수 있는 곳에서는 이를 이용하여 3차원 기질 서포트에 적절하게 접종시킬 수 있다. 예를 들면, 골수를 배양할 때 3차원 기질에 새로운 샘플 또는 냉동 보관된 샘플에서의 골수 세포를 접종시킨다. 피부를 배양하는 경우에, 3차원 기질에는 흑혈구와 케라틴세포를 접종시킨다. 간을 배양하는 경우에 3차원 기질에는 간세포를 접종시킨다. 췌장을 배양하는 경우에는 췌장 엔도크린 세포를 3차원 기질에 접종시킨다. 다양한 조직에서 실질 세포를 얻기 위해 이용되는 방법은 Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 20, pp. 257-288 에 상술하고 있다.
배양동안에, 3차원 세포 배양 시스템은 영양배지에 현탁시키거나 부유시킨다. 배양물에는 주기적으로 새로운 배지를 공급한다. 다시 세포가 증식되어 합류 단층을 형성하는 용기의 벽에 부착된 배양물에서 세포가 방출되지 않도록 주의해야 한다. 3차원 배양물에서 세포가 방출되는 것은 구조를 이룬 조직과는 반대로 확산된 조직을 배양할 때 더 잘 일어나는 것을 볼 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 3차원 피부 배양물은 조직적으로 형태학적으로 정상이고; 별개의 피부와 상피층은 주변 매체로 세포를 방출하지 않는다. 대조적으로, 본 발명의 3차원 골수 배양물은 생체에서 비-흡착 세포가 방출되는 것과 같이 배지로 이와 같은 성숙한 세포를 방출한다. 이미 설명한 것과 같이, 방출된 세포는 배양관에 부착하여 합류 단층을 형성하고 3차원 배양물의 증식은 중단된다. 이는 공급동안에 방출된 세포를 제거하고, 새로운 용기에 3차 배양물을 옮기거나, 용기 벽에 방출되는 세포가 흡착되는 것을 방지하기 위해 교반시키거나 또는 배양물에서 영양소를 보충하고 방출된 세포를 제거할 수 있을 정도로 충분한 속도에서 새로운 배지를 지속적으로 흐르게 하여 이를 방지할 수 있다. 어떤 경우이건 성숙한 방출된 세포를 수집하여 추가 사용을 위해 냉동 보관한다.
성장인자와 조절인자는 3차원 기질세포에 의해 이와 같은 인자들이 만들어지기 때문에 배지에 첨가할 필요는 없다. 그러나 이와 같은 인자를 첨가하거나 특정 세포를 접종하여 배양물에서 세포의 성숙, 증식을 강화, 변경 또는 조절할 수 있다. 배양물에서 세포의 성장과 활성은 인슐린, 성장 호르몬, 소마토메딘, 콜로니 자극 인자, 에리트로포에틴, 상피 성장인자, 간-적혈구 조혈 인자(헤마토포에틴) 및 간-세포 성장인자와 같은 다양한 성장인자에 의해 영향을 받을 수 있다. 증식과 분화를 조절할 수 있는 다른 인자에는 프로스타글란딘, 인터루킨과 자연발생 칼론을 포함한다.
5.3. 3차 배양시스템에서 이식 가능한 조직 이식편의 용도.
본 발명의 3차 배양 시스템은 다양하게 이용될 수 있다. 여기에는 매트릭스에서 수득한 배양된 세포 또는 생체에서 배양된 매트릭스의 이식을 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 본 발명에 따른 3차원 조직 배양 이식물은 기존 조직을 대체시키거나 증식시킬 때, 새로운 또는 변형된 조직을 도입시킬 때, 인공 보철을 변형시킬 때, 또는 생물학적 조직 또는 구조를 함께 결합시키는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 특정 구체 예에서는 i) 구강 점막의 3차 배양물에 결합된 치과용 보철; ii) 튜브형 3차원 조직 이식물(위장관, 생뇨기관과 혈관); iii) 건 또는 인대 이식물; iv) 헤르니아 복구를 위한 이식물; 그리고 v) 재조합 유전자 생성물을 발현시킬 수 있는 3차원 배양물에서 생장된 유전 공학적으로 변형된 세포를 포함하나 이에 국한하지 않는다.
5.3.1. 생체에서 이식.
3차원 배양물은 결함을 교정시키기 위해; 외과적으로 제거된 조직을 대체시키기 위해; 관절을 복구시키기 위해; 문합을 이식시키기 위해; 헤르니아를 복구시키기 위해 생체에 이식될 수 있다. 이를 위해, 살아있는 기질조직은 생체 내에 이식될 수 있다. 이용하는 것에 따라서, 이식물은 이식하기 전에 배양물에 있는 세포를 죽이기 위해 우선 처리한다. 예를 들면, 성장 인자가 이미 존재하는 질환 예로써 류마티스 관절염에서 응집하는 질환을 치료하고자 할 때 배양물에서 성장인자를 만드는 세포를 적절히 죽인다. 기질 세포를 시험관에서 만들고 생체 내에 이식하기 전에 방사 또는 배양물을 냉동-해동시키고 용혈된 세포의 성분을 씻어내어 이를 실행할 수 있다. 또는, 상처치유를 강화하고자 하는 경우에, 배양물은 살아있는 상태에서 이식하여 성장인자를 이식부위에서 생산하게 된다. 또다른 예로써 실질세포와 같은 다른 세포는 생체에 이식하기 전에 살아있는 기질조직에 접종시킨다. 이와 같은 배양물은 생체에서 이식하기 전에 시험관에서 생장시킬 수 있다.
탈출(헤르니아)의 기본적인 것은 근막에에 결함부위에 복부 내용물이 돌출 되는 것이다. 헤르니아의 치료를 위한 외과적인 방법은 복강으로 헤르니아 내용물을 감소시키고 보철, 이형 또는 자가형성 물질을 이용하여 근막 결합의 폐쇄를 하는 것에 관계한다. 이와 같은 폐쇄를 만드는데 이용되는 여러 가지 기술이 있는데 자가형성 조직의 이동과 합성 메쉬 생성물의 이용을 포함한다. 현행 생성물과 과정에 대한 단점은 폐쇄가 약화되어 복부 내용물이 다시 결합부위에 되돌아오는 헤르니아의 재발을 포함한다.
헤르니아 복구 시에 본 발명의 삽입물은 헤르니아 봉합술은 개복에서 내시경 과정으로 서서히 이동하는 최소 침투성 외과 술을 지향하는 경향에도 불구하고 개복 과정을 통하여 이루어진다.
또다른 예에서, 인대와 건은 나이가 들면서 약화가 증가되는 점탄성 구조로 이는 인대가 찢어지게 된다. 이와 같은 구조는 복잡하고 상대적으로 정적인 콜라겐성 구조로 골, 근육, 메니사이(menisci)와 인접한 건과 인대에 기능적으로 연결되어 있다. 이와 같은 구조의 외과적인 복구는 개복과정 또는 관절경 과정에 의해 실행할 수 있다. 자가이식은 일반적으로 무릎에서 다른 부위에 이용된다. 그러나 자가이식은 기증자 부위의 사망률의 원인이 된다. 이인자형이식과 같은 자가 이식부위에는 이용되는 다른 물질에는 소 건, 폴리에스테르, 탄소 보강 섬유 고분자를 포함하나 이는 물리적으로 실패할 수 있고 이는 면역원성 복합의 원인이 된다.
5.3.3. 유전자 요법
3차 구조 배양물은 제약학적 물질, 성장/조절인자, 천연 및 변형된 혈액생성물, 항응집제, 혈병제 또는 항석회화제의 효과와 세포 독성에 대한 다양한 화합물을 스크린하기 위해 시험관에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 맥관이식의 경우에, 기질세포는 유전 공학적으로 조작되어 혈전증의 위험을 감소시키기 위해 항응집 유전자 생성물을 발현되도록 또는 염증반응으로 인한 실패 위험을 감소시키기 위해 항-염증성 유전자 생성물이 발현되도록 한다. 이에 대해 기질세포는 유전 공학적으로 조작되어 혈병의 위험을 감소시키기 위해 TPA, 스트렙토키나제 또는 유로키나아제를 발현시킨다. 또는 맥관 또는 다른 조직 이식 편에 대해서는 기질세포는 TNF, IL-2에 대한 중화항체의 이디오타입에 상응하는 펩티드 또는 폴리펩티드와 같은 항-염증성 유전자 생성물 또는 다른 염증성 사이토킨을 발현시킨다. 적절하게는, 세포는 수술후 회복 기간 동안에 유도성 컨트롤 제어 하에 또는 일시적으로 이와 같은 유전자 생성물을 발현시키거나 세포기질에 고정된 키메라 융합 단백질로써 발현되도록 하는데 융합단백질은 예를 들면, 세포외 도메인으로써 유전자 생성물에 융합된 수용체 또는 수용체-유사한 분자의 막통과 도메인 또는 세포 내 도메인으로 구성된 키메라 분자이다. 또다른 구체 예에서, 기질세포는 유전 공학적으로 조작하여 환자에게 결핍된 또는 HDL, 아포리포 프로테인 E와 같은 치료요법적 효과를 나타내는 유전자를 발현시킨다. 기질세포내에서 조작되는 소요의 유전자는 치료될 질병과 연관되어야 한다. 예를 들면, 맥관질병의 경우에, 기질세포는 혈액에 의해 운반되는 세레브레다제, 아데노신 디아미나제, α-1-아티트립신과 같은 유전자 생성물을 발현하도록 조작될 수 있다. 특정 구체 예에서, 정맥 또는 동맥의 일부를 대체하기 위해 이식된 유전 공학적으로 조작된 맥관 이식편 배양물은 폐에 α-1-안티트립신과 같은 유전자 생성물을 이동시키는데 이용된다; 이와 같은 방법에서, 유전자 생성물의 구조적 발현이 적절하다.
기질 세포는 클론된 숙주세포에 형질 도입시키기 위해 사용된 유전자를 포함하는 재조합 DNA구조를 이용하여 조작될 수 있고 따라서 3차 배양 시스템에서 확장된다. 활성 유전자 생성물을 발현시키는 3차 배양물은 이와 같은 생성물이 부족한 개인으로 이식될 수 있다. 예로써, 맥관, 생뇨기관, 헤르니아 또는 위장관 질병의 증상을 막거나 약화시키는 유전자는 질병 조건하에 발현이 적게 되거나 또는 적게 조절될 수 있다. 특별하게는, 혈전형성, 염증반응, 섬유증 및 밸브의 석회 화와 같은 질환을 예방하는데 관련된 유전자 발현이 하향 조절될 수 있다. 또는, 유전자 생성물의 활성은 감소되고 이는 일부 또는 전부의 병리학적 조건의 명료성과 류마티스 또는 관절 질병의 증상에 궁극적인 발생을 유도한다. 따라서, 유전자 활성 수준은 존재하는 유전자 생성물의 수준을 증가시키거나 또는 3차 배양 시스템에 있는 활성 유전자 생성물의 증가에 의해 증가될 수 있다. 활성 표적 유전자 생성물을 발현하는 3차 배양물은 이들 생성물이 부족한 심장판막 질환자에 이식될 수 있다. 여기에서 표적 유전자는 맥관, 생뇨기관, 헤르니아 또는 위장관 질병에 관계하는 유전자를 말하는데 표적 유전자 발현 수준의 조절 또는 표적 유전자 생성물의 활성 조절이 심장판막 질환의 증상을 개선하도록 작용한다.
또한, 연골 이식후 수술 회복 기간 동안에 유전자 대체 요법에 의해 처리될 수 있다. 조직 구조 또는 쉬트는 개별 환자의 요구에 특별히 상응하도록 고안되고 예로써, 기질 세포는 하나 이상의 유전자를 조절하도록 유전 공학적으로 조작될 수 있고; 또는 유전자 발현의 조절은 일시적이거나 또는 장기간이 될 수 있고; 또는 유전자 활성은 유도성일 수 있거나 비유도성일 수 있다. 예로써 정상 표적 유전자의 하나 이상의 복사체 또는 표적 유전자 기능이 있는 보통 표적 유전자 단백질 생산물의 생산에 관계하는 유전자의 일부는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스와 레트로바이러스 벡터를 포함하나 이에 한정하지 않는 비-유도성 백터 또는 메탈로티오닌을 포함하는 유도성 프로모터 또는 열 쇼크 단백질과 리포좀과 같이 세포에 DNA를 주입할 수 있는 다른 입자 또는 DNA직접 주사 등을 이용하여 3차 구조에 있는 숙주 세포 내로 삽입할 수 있다. 예로써, 숙주에 의해 이식 편 거부를 막는 사람 상보적 조절 단백질을 인코드하는 유전자는 사람 섬유아세포내로 삽입될 수 있다.(Nature 375:89 (May 1995)).
각 유전 공학적으로 조작된 기질 세포 예로써 상이한 바람직한 유전자 생성물을 발현하는 기질 세포 혼합물 또는 몇 개 특정 유전자를 발현하도록 조작된 기질 세포 등을 포함하는 3차 배양물이 환자에 이식되어 맥관, 생뇨기관, 헤르니아 또는 위장관 질병을 완화시키도록 한다. 유전자 발현은 비-유도성(구성) 또는 유도성 프로모터의 조절 하에 있다. 유전자 발현 수준과 조절된 유전자 형태는 개별 환자에 따른 치료 정도에 따라 조절될 수 있다.
유전자 요법에서 3차 배양물의 이용은 상당한 장점을 가진다. 첫째 배양물이 진핵 세포로 구성되기 때문에, 유전자 생성물은 활성 생성물을 형성하기 위해 적절히 발현되고 진행된다. 둘째, 유전자 요법 기술은 감염된 세포가 임상적 가치, 관련성 그리고 유용성에 대해 강화시킬 수 있고; 본 발명의 3차 배양물은 감염된 세포수의 확장과 감염된 세포의 증폭(세포분할을 통해)을 하게 된다.
기질 세포 내로 조작된 유전자 생성물의 일시적인 발현을 얻기 위해서는 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예로써, Seldon al., 1987, Science 236:714-718에 상술된 트랜스카로틱 이식 기술이 이용될 수 있다. 여기에서 사용된 트랜스카로틱(Transkaryotic)은 이식된 세포의 핵은 안정한 또는 일시적 형질전이에 의해 DNA서열의 추가를 함으로써 변경될 수 있다. 세포들은 통합형 바이러스 벡터 예로써 레트로바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 비-통합형 복제 벡터 예로써 파필로마 바이러스 벡터, SV40벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 복제-결합 바이러스 벡터를 포함하나 이에 한정하지 않는 다양한 벡터를 이용하여 작제될 수 있다. 일시적 발현이 필요할 때, 비-통합형 벡터와 복제-결합 바이러스 벡터가 적절한데 이는 유도성 또는 구성 프로모터가 관심이 있는 유전자의 발현을 제어하기 위해 이 시스템에 이용될 수 있기 때문이다. 또는 통합형 벡터는 소요의 유전자가 유도성 프로모터에 의해 제어되는 경우에 일시적 발현을 얻기 위해 사용된다.
적절하게는 생산물은 생체 내에서 필요할 때만 합성될 수 있도록 사용된 발현제어 요소가 유전자의 발현을 조절한다. 선택된 프로모터는 조직 형태와 배양된 세포에 따라 부분적으로 달라진다. 단백질을 분비할 수 있는 세포와 조직(예로써 풍부한 내지세망, 골지체)이 적절하다. 숙주세포는 적절한 발현 제어 요소(예로써 프로모터, 인헨서, 서열, 전사종료체, 폴리아데닐화 부위등)와 선택성 표식에 의해 제어된 DNA로 형질 변환될 수 있다. 외부 DNA의 도입 후에 작제된 세포는 풍부한 배지에서 성장시키고 그 다음 선택성 배지로 옮긴다. 재조합 플라스미드에서 선택성 표식은 선택에 대해 저항성을 제공하여 세포가 이의 염색체내로 플라스미드가 안정하게 통합되도록 하고 병소를 형성하게 되고 클론되어 세포주내에서 확장된다. 이 방법은 유전자 단백질 생성물을 발현시키는 세포 주를 작제하는데 유익하게 이용될 수 있다.
삽입된 유전자의 발현을 유도하는데 임의 프로모터가 사용될 수 있다. 예로써 바이러스 프로모터에는 CMV 프로모터/인헨서, SV40, 파필로마바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 엘라스틴 유전자 프로모터와 β-글로빈을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 일시적 발현이 적절한 경우, 이와 같은 구성 프로모터는 비-통합 그리고/또는 복제 결함 벡터에서 적절히 사용된다. 또한, 유도성 프로모터는 필요할 때 삽입된 유전자의 발현을 유도하는데 사용된다. 예로써 유도성 프로모터는 메탈로티오닌과 열 쇼크 단백질을 포함하나 이에 한정하지는 않는다.
설명되고 이용된 연 조직에 대한 조직 특이성을 나타내는 전사 제어 부위의 예로는 췌장 선방세포에서 활성을 가지는 엘라스타제Ⅰ 유전자 제어 부분(Swit et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515)을 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 엘라스틴 침착은 맥관이식편을 포함한 여러 조직에서 특이적인 생리학적 그리고 발생과정과 연관된다. 예를 들면, 동맥발생에서, 엘라스틴 침착은 동맥 압력과 기계적인 활성의 변화와 공조하는 것으로 나타난다. 엘라스틴 발현에 기계적인 활성을 연결시키는 것은 세포-표면 수용체와 연관된다. 엘라스틴-합성 세포는 세포-표면 수용체를 통하여 엘라스틴에 부착되면, 추가 엘라스틴과 다른 매트릭스 단백질의 합성은 조직에 스트레스 또는 기계적 힘에 노출시켜 영향을 받을 수 있는데 (예로써 바이오리엑터에서 구조물의 일정한 움직임) 또는 세포모양에 영향을 줄 수 있는 다른 인자에 노출시킨다.
일단 유전 공학적으로 작제된 세포가 개체내로 이식되면 TPA, 스트렙토키나제 또는 유로키나제 활성의 존재로 인하여 혈소판 응집, 혈액응고 또는 혈전증의 감소를 유발한다. 이와 같은 활성은 혈소판 응집, 혈액 혈병, 응집 또는 혈전증과 같은 심장 이식 후에 초기 단계에서 일반적으로 발생되는 가능성이 있는 복합 상태를 예방하여 유지될 수 있다. 또는 일단 유전 공학적으로 조작된 세포가 개체에 이식되면, 항-염증성 유전자 생성물의 존재, 예로써, TNF, IL-2 또는 염증성 사이토킨에 대한 항체를 중화시키는 이디오타입에 상응하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 맥관, 위장관, 헤르니아 또는 생뇨기관 질병과 같은 연관된 염증반응을 감소시키게 된다.
본 발명의 3차 배양 시스템에 이용된 기질 세포는 이식 부위에서 염증 또는 거부를 촉진시키는 인자의 발현을 감소 시키도록 유전학적으로 작제된다. 표적 유전자 발현 수준 또는 표적 유전자 생성물 활성 수준의 감소에 대한 네가티브 조절 기술은 아래에서 논의한다. 여기에서 사용한 네가티브 조절은 변조처리 없이 표적 유전자 생성물의 활성 그리고 또는 수준과 관계한 표적 유전자 생성물의 활성 그리고/또는 수준의 감소를 말한다. 기질세포에 원래 있는 유전자 발현은 상당수 기술을 이용하여 감소되는데 예로써 발현은 동종 재조합 기술을 이용하여 유전자를 완전히 비활성화시킴으로써 (통상 Knockout)저해될 수 있다. 보통, 단백질의 중요한 부위를 인코드하는 엑손(또는 이 부위에 대한 엑손 5')은 양성 선택성 표식(예로써 neo)에 의해 방해되어 표적 유전자로부터 정상 mRNA의 생산이 방해하고 그 결과로 유전자의 비활성화가 된다. 유전자는 유전자의 일부를 결손 시키거나 또는 전체 유전자를 결손 시킴으로써 비활성될 수 있다. 게놈에 있는 것과는 별도로 표적 유전자에 동총인 두 부분이 있는 구조체를 이용하여 두부분사이에 있는 서열이 결실된다(Mombaerts et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:3084-3087).
표적 유전자의 발현을 저해하는 안티센스와 리보자임 분자는 표적 유전자 활성 수준을 감소시키기 위해 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 예로써 주요 조직 적합성 복합체(HLA)의 발현을 저해하는 안티센스 RNA는 면역 반응에 대해 상당히 다양한 것으로 보인다. 또한, 3차 나선분자가 표적 유전자 활성 수준을 감소시키는데 이용될 수 있다. 이들 기술은 L.G. Davis et al., eds, Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed., Appleton Lange, Norwalk, Conn. 1994.에 상술하고 있다.
또다른 구체 예에서, 기질세포는 유전 공학적으로 조작하여 연근세포가 증식하고, 이주하여 새로운 과형성의 개발을 유도하는데 필수적인 유전자 발현을 차단하도록 하는데 예를 들면, 세포 분열 과정 2 카이나제와 세포 핵 항원의 증식을 차단하는 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드가 된다.(Mann, M.J., et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4502-4506)
전술한 임의 기술을 이용하면, 혈소판 α2Bβ-3 수용체에 결합할 수 있는 피브리노겐, von Willebrands인자, 인자 V 또는 임의 세포분자의 발현은 기질세포에서 제거되어 맥관 또는 다른 생물학적 조직 이식 편에서 혈전 형성위험을 감소시킨다. 유사하게 MHC II 분자의 발현은 이식편의 이식거부 위험을 제거하기 위해 제거한다.
발명의 또다른 구체 예에서, 3차원 배양 시스템을 시험관에서 이용하여 다량의 생물학적 생성물을 만들 수 있다. 예로써, 특정 생물학적 생성물 (예로써, 성장인자, 조절인자, 펩티드 호르몬, 항체등) 등을 생산하는 세포 또는 외부 유전자 생성물을 생산할 수 있도록 유전 공학적으로 조작된 숙주 세포는 시험관에서 3차원 배양물 시스템을 이용하여 클론에 의해 확장 될 수 있다. 형질 전환된 세포가 영양배지로 유전자 생성물을 분비하는 경우에, 생성물은 포준 분리기술(예를 들어 HPLC, 컬럼 크로마토그래피, 전기영동 기술등)을 이용하여 소모된 또는 조건화된 배지로부터 용이하게 분리할 수 있다. 시험관에서 3차원 배양물을 공급하기 위해 흐름 방법을 이용하는 바이오리엑터를 고안하였다. 근본적으로 새로운 배지는 3차원 배양물을 통과하기 때문에, 유전자 생성물은 배양물에서 방출된 세포와 함께 배양물에서 씻겨나간다. 소비된 또는 조건화된 배지로부터 흘러나오는 유출물에서 유전자 생성물(HPLC 컬럼 크로마토그래피; 전기영동등)을 분리해낼 수 있다.
본 발명의 3차원 배양 시스템은 이식부위에서 치료를 보강하거나 유전자 요법에서 이용하기 위해 생체에서 유전자와 유전자 생성물을 도입시키기 위한 담체를 제공한다. 예를 들면, 재조합 DNA기술을 이용하면, 환자에 부족한 유전자는 바이러스 또는 조직-특이적인 프로모터의 제어하에 두어야 한다. 또한, 상처 치유를 강화할 수 있는 유전자 생성물을 인코드하는 DNA는 3차원 배양 시스템에서 생장한 세포내에 유전자 조작에 의해 도입될 수 있다. 이와 같은 유전자를 포함하는 재조합 DNA 구조는 클론될 숙주 세포를 형질 도입시키거나 또는 감염시켜 3차원 배양 시스템에서 확장된다. 활성 유전자 생성물을 발현하는 3차원 배양물은 생성물이 결핍된 개체에 이식될 수 있다.
유전자 요법에서 이와 같은 3차원 배양물을 이용하는데 에는 여러 가지 장점이 있다. 우선 배양물이 진핵 세포로 구성되기 때문에 유전자 생성물이 배양물에서 적절히 발현되고 처리되어 활성 생성물을 만들 수 있다. 둘째는 다수의 트랜스펙트된 세포가 임상적 가치, 유관성, 이용성에 대해 강화되는 경우에만 유전자 요법기술이 유용하다; 본 발명의 3차원 배양물은 다수의 형질 감염된 세포의 확장과 형질 감염된 세포의 증식(세포 분열을 통하여)을 할 수 있다. 예를 들면 유전자 생성물을 발현시킬 수 있는 유전 공학적으로 조작된 세포는 혈관으로 이용될 수 있는 살아있는 기질조직에 결합될 수 있고; 이 경우 유전자 생성물은 순환하게 될 혈류로 수송된다. 또는 상처 치유 인자를 발현시킬 수 있는 유전 공학적으로 조작된 세포는 이식부위에 상처치유를 강화시키기 위해 건과 인대를 만드는데 이용되는 살아있는 기질 배양물에 결합될 수 있다.
적절하게는, 사용된 발현 조절 원소는 생체에서 필요할 때에만 생성물이 합성될 수 있도록 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 선택된 프로모터는 배양된 조직과 세포형에 따라 달라질 수 있다. 단백질을 분리할 수 있는 세포와 조직(풍부한 세망 내피와 골지체)이 적절하다. 이를 위한 간과 다른 입상 조직이 선택될 수 있다. 간세포를 이용하는 경우 헤피타이티스 B바이러스 원소와 같은 간 특이적 바이러스 프로모터는 간세포에 외부 유전자를 도입하고 이와 같은 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 이들 세포는 본 발명의 3차원 배양 시스템에서 배양될 수 있다. 또는 알부민 프로모터와 같은 간-특이적 프로모터가 이용될 수 있다.
여기에서 상술하고 설명하고 있는 조직 특이성을 나타내는 전사 조절 부분의 예로는 췌장 아시나르 세포에 활성이 있는 엘라스타제 I 유전자 조절 부분 (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-51S); 췌장 베타 세포에서 활성이 있는 인슐린 유전자 조절 부분(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); 임파 세포에서 활성이 있는 이뮤노글로블린 유전자 조절 부분(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adams et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); 간에서 활성이 있는 알부민 유전자 조절 부분(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); 간에서 활성이 있는 알파-페토단백질 유전자 조절 부분(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); 간에서 활성이 있는 알파-1-안티트립신 유전자 조절 부분(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); 골수 세포에서 활성이 있는 베타-글로빈 유전자 조절 부분(Magram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 뇌에 있는 올리고 덴드로사이트세포에서 활성이 있는 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 부분(Readhead et al., 19987, Cell 48:703-712); 골 근육에서 활성이 있는 미오신 경사슬-2 유전자 조절 부분(Shani, 1985, Nature 314:283-286)과 시상하부에서 활성이 있는 고나도트로핀 방출 호르몬 유전자 조절부분(Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378)을 포함하나 이에 국한시키지 않는다.
본 발명의 구체 예에서, 3차원 배양물은 유전자 형질도입을 이행하는데 이용된다. 예를 들면, 재조합 바이러스 발현 벡터로 구성된 섬유아세포 기질의 3차 배양물은 재조합 바이러스를 기질 매트릭스와 접촉하는 세포에 전달하는데 이용되어 생체에서 바이러스 전달을 강화한다. 3차원 배양 시스템은 DNA 트랜스펙션을 위한 현행 기술보다도 유전자 형질 도입시키는데 더 효과적인 방법이다.
본 발명의 또다른 구체 예에서, 3차원 배양물은 생리적인 또는 명리학적인 조건의 연구와 약물 및 치료의 효과를 연구하는 모델 시스템으로 이용할 수 있다. 예를 들면, 3차원 배양 시스템은 혈액-뇌 장애물에 대한 모델로 이용될 수 있고; 이와 같은 모델 시스템을 이용하여 혈액-뇌 장벽, 사구체 장치와 비인두 통로 라이닝의 점막과 같은 장벽을 통한 물질의 침투에 대해 연구할 수 있다.
전술한 목적을 위해 본 발명의 구체 예를 설명하나 이와 같은 목적에 제한하지는 않는다. 전술한 목적을 위해 튜브에서 3차원 배양물의 형성은 다양한 시스템에서 이용된 조직과 세포형에 따라 달라진다. 특별히 위장관, 생뇨기관 및 혈관의 튜브형 부분을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 3차원 배양물은 튜브형 조직의 다른 형태를 만들기 위해 다른 형태의 세포를 이용할 수 있다.
6. 튜브형 생물학적 조직
3차원 배양 시스템은 시험관에서 단일 및 다층 튜브형 조직을 만드는데 이용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 이와 같은 튜브형 구조는 신체 내에 혈관, 위장된 및 생뇨기관을 포함하나 이에 국한되지 않은 신체의 튜브형 조직과 기관을 모방한다.
하기에서, 상술하고 있는 상이한 생물학적 구조에는 공통되는 몇가지 특징이 있다. 이들 모두 상피(위장과 생뇨기관) 또는 내피(혈관)의 내측 라이닝과 기질조직층으로 구성되어 있다. 이와 같은 연결조직은 또한 다양한 정도의 탄성 섬유가 있는 연근 층을 포함하는데 이들 모두 동맥에서 주로 볼 수 있다. 본 발명에 따른 3차원 배양물에서 이들 성분을 포함하고 유지함으로써, 이를 구성하는 조직은 생체에서 적절한 생리학적 기능을 요구하는 특정 구조적 그리고 기능적 성질을 가진다. 그 다음 살아있는 신체에서 손상된 또는 병이든 튜브조직의 대체용으로 이용된다.
6.1. 단일 메쉬층 튜브
다음의 부단락은 신체에 이식될 수 있는 튜브를 만들기 위해 이용한 살아있는 기질 조직의 성장을 서포트하기 위한 메쉬 구조를 이용하는 것에 대해 상술하고 있다.
6.1.1. 편평한 메쉬 시작 물질
메쉬는 최종적으로 삽입된 튜브형 기관의 내측 원주에 거의 동일한 폭을 가지는 직사각 스트립으로 절단한다. 세포를 이와 같은 메쉬에 접종시키고, 액상 배지에 부유 또는 현탁시켜 배양한다. 적정 합류 단계에서 메쉬는 길다란 모서리를 서로 연결시켜 튜브로 만다. 적정 직경을 가지는 적정 물질로 된 섬유를 이용하여 두 개 모서리를 함께 봉함으로써 솔기를 봉할 수 있다.
6.1.2. 튜브형 메쉬 시작 물질
본 발명에 따라서, 메쉬는 튜브형태로 직조되어, 기질세포를 접종시켜 배양 실에서 배지에 현탁시킨다. 세포가 관강을 차단하는 것을 방지하기 위해 튜브형 메쉬의 개방 단부중 하나에 노즐을 고정시킨다. 튜브형 메쉬의 내부를 통하여 흐름이 있도록 배양 실에 연결된 재조실로부터 이 노즐을 통하여 액체 배지가 공급된다. 또 다른 개방 단부는 외부로 나가는 구멍에 고정되어 이는 수집 실에 연결되게 되고, 배지는 수집 실로부터 재료 실로 순환 할 수 있게 된다. 배양이 완전히 종료되었을 때 튜브를 노즐에서 떼어 내어 외부로 흐르는 구멍에서도 떼어 낸다. 이 방법은 Ballermann, B.J., et al., Int. Application No. WO 94/25584 and in a pending application entitled, APPARATUS AND METHOD FOR STERILIZING, SEEDING, CULTURING, STORING, SHIPPING AND TESTING TISSUE, SYNTHETIC, OR NATIVE VASCULAR GRAFTS, filed April 27, 1995 by Peterson, A., et al., (Advanced Tissue Sciences, Inc.), Serial No. 08/430,768에 상술하고 있다.
6.2. 다층 메쉬층 튜브
일반적으로, 2개 3차원 배양물은 다음의 방법중 하나를 이용하여 본 발명에 따라 튜브에 복합시킬 수 있다.
6.2.1. 다층 편평한 플레이트
하나의 편평한 직사각 배양물은 다른 배양물위에 얹고 함께 봉한다. 이와 같은 2층 쉬트를 6.1.1.에서 상술한 것과 같이 긴 모서리를 서로 연결 봉합하여 만다.
6.2.2. 튜브형 메쉬 주변을 싸고 있는 편평한 메쉬
내부 층으로 작용할 수 있는 한 개 튜브형 메쉬에 접종하고 배양할 수 있다. 제 2 메쉬는 편평하게 생장시키고 이의 직사각 스트립은 튜브형 메쉬의 외측 원주보다 약간 큰 폭을 가진다. 적정 성장 수준에 도달하면, 직사각 메쉬는 튜브형 메쉬의 외측에 대해 감싸게 된다. 외측 스트립의 솔기를 달고, 이를 내측 튜브에 고정시키는 것을 단일 봉합 단계에서 이루어질 수 있다.
6.2.3. 다층 튜브형 메쉬
직경의 약간 상이한 두 개의 튜브형 메쉬를 별도를 생장시킨다. 더 적은 직경을 가지는 배양물을 더 큰 직경을 가진 배양물 안으로 삽입하고 이를 봉하여 고정시킨다. 이 방법은 튜브의 직경이 매우 작을 경우에는 적절하지 못한다.
각 방법에 있어서, 이중 층으로 된 튜브에 이 방법을 반복 적용하여 층을 추가할 수 있다. 메쉬에 포함된 배양물의 임의 성장단계에서 메쉬를 복합시킬 수 있고, 필요에 따라서는 복합된 메쉬를 지속적으로 배양시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 모방할 천연 기관 또는 조직에 모양에 상응하는 3차원 배양물의 모양을 만들기 위해 적정 방법을 이용할 수 있다.
다음의 설명은 시험관에서 모델 튜브형 조직과 기관을 어떻게 만드는지에 대해 상술한다. 각 경우에 있어서 5.1 에서 설명하는 것과 같이 하나 이상의 기질 층이 만들어 질 수 있다. 3차원 배양물에 이들 천연 조직에 고유적인 물질을 포함시키고 유지시킴으로써 특이적인 천연 연결 조직의 특정화된 성질을 만드는 것에 특별히 주의를 기울이게 된다. 다소 균질한 세포조성물(내피세포, 상피세포 또는 연근)의 하나 이상의 표면 층은 5.2 에서 상술한 것과 같이 기질 층에서 배양시킨다. 이 단락에서 상기 지적한 방법은 이용하면, 이와 같은 3차원 배양물은 천연 기관 또는 조직의 모양에 따르는 튜브의 모양에 맞게 모양이 지어질 수 있다. 이와 같은 기초 방법을 다양하게 하여 교정되어야 할 천연 기관과 조직에 더 잘 모방하도록 할 수 있다.
이와 같은 튜브형 구조는 생체에서 생물학적 구조를 모방하게되고, 손상된 또는 질병을 가지는 조직을 대체시키기 위해 바로 이식될 수 있다. 그러나 본 발명은 가능한 형태의 모든 3차원 배양물을 포함하고, 이와 같은 배양물이 튜브형이 되어야 한다고 요구하지는 않는다. 예를 들면 요구되는 이식정도에 따라 튜브 구조의 원주 전부 또는 일부를 대체시키기 위해 신체에 직접적으로 편평한 3차원 배양물이 이식될 수 있다.
7. 혈관
동맥과 정맥에 대해 시험관에서 혈관 요소의 복제에 대해서 하기에서 상술한다.
7.1 동맥
동맥은 박층의 내피세포로 라인된 튜브이고; 3층의 연결조직으로 구성되는데 내측에서 외측 순으로 동맥내맥 (많은 근육 동맥 특히 작은 동맹에는 없음), 중맥 및 외막으로 구성된다.
내층 두 층의 주요 세포 성분은 세포의 단백질 엘라스틱을 생산하는 미분화된 연근 세포이다. 중맥 바로 안쪽에 있는 내측 탄성 층을 엘라스틴의 균질층이다. 이들 벽에 엘라스틴 성분이 풍부하기 때문에 동맥이 심장의 매 수축 시마다 확장될 수 있게 된다. 내맥과 중맥에는 약간의 섬유아세포, 단세포, 대식세포와 일부 콜라겐을 포함한다.
외막은 엘라스틴 섬유와 콜라겐 섬유가 있는 일상의 연결조직으로 구성된다. 이층에 있는 콜라겐은 과다한 스트레칭을 방지하는데 중요하다.
동맥벽의 모든 층이 연결조직이고, 외막과 내측 두 개층, 내맥과 중맥사이에 성분상 그리고 기능적 차이가 있다. 결과적으로 별도의 메쉬에 이와 같은 상이한 층을 배양시키는 것이다. 내맥과 중맥이 별도의 메쉬에서 생장시키느냐 복합된 매쉬에서 생장시키느냐는 3차원 배양물이 이식될 특정 동맥에 있는 이들 층이 얼마나 다르냐에 따라 달라진다.
예를 들면, 본 발명에 따른 섬유아세포는 환자의 동맥 외막에서 분리하여 6.1 에서 상술한 것과 같이 3차원 매트릭스에 접종하고 준 합류가 일어날 때까지 생장시킨다. 미분화된 연근 세포를 만드는 엘라스틴이 풍부한 조직에서 세포를 분리할 수 있고 동일 동맥의 내맥과 중맥으로부터 섬유아세포를 포함하는 조직으로부터 분리해 낼 수 있다. 이들 세포를 이용하여 별도의 메쉬에 접종하고 준합류가 일어날 때까지 생장시킨다. 일든 엘라스틴을 생산하는 세포가 적정 수준으로 증식되면 이들 메쉬는 6.2에서 상술한 방법중 하나를 이용하여 복합시킬 수 있다. 이와 같은 방식으로, 연근 세포는 증식되고 3차원 환경에서 천연 동맥벽과 유사한 엘라스틴을 생산할 수 있다.
동일 환자에서 내피 세포를 분리해 낼 수 있다. 두 개 배양물이 적정수준으로 합류되면, 내피 세포는 상측 엘라스틴이 풍부한 층의 위에 접종시키고 합류 층이 형성될 때까지 배양한다.
조직의 모든 다양한 층으로 모든 기능을 대체시킬 필요가 없는 경우에 간단한 균질한 3차원 엘라스틴이 풍부한 기질 배양물이 이용될 수 있다. 또는 기질 배양물에 내층을 댈 수도 있다. 이와 같은 균질성 기질 매트릭스 여러 층을 복합시켜 보철용으로 적절한 두께를 제공할 수 있다.
7.2 정맥
정맥 벽으로 구성된 연결조직층은 동맥에서보다는 잘 떼어지지 않고 콜라겐은 더 많고 엘라스틴은 더 적게 포함한다. 결과적으로 단층 접종된 세포로부터 단일 3층 배양물이 생장될 수 있다. 일부 연근 세포와 함께 대부분 섬유아세포를 포함하고 있는 이와 같은 세포는 환자의 정맥 벽으로부터 떼어낼수 있다. 어느 정도의 합류수준에 다다르면, 예를 들어 동일 환자로부터 분리한 내피세포는 기질층위에 접종시키고 합류될 때까지 생장시킨다.
8. 위장관
본 발명의 또다른 구체 예에서는 생리적 조건에 필적하는 시험관에 시스템에서 위장관 요소를 복제할 수 있다. 위장관은 몇 가지 상이한 기관으로 구성되나 이들 모두 동일한 조직을 가진다.
1. 점막: 위장관의 가장 내층인 점막은 세 가지 하위 층으로 구성된다. 특히 흡수성이 있는 층은 표면적을 증가시키기 위해 상당히 많이 접혀 있을 수 있다. 관강은 박층의 상피가 안에 있고 이는 고유 박층과 섬유아세포, 일부 연근, 모세관 및 콜라겐성 섬유, 망상 섬유와 일부 탄성 섬유를 포함하는 연결조직으로 에워싸여 있다. 상피 층이 얇은 흡수면에서 침입에 대해 보호를 하기 위한 임파세포를 볼 수 있다. 세 번째 하위 층은 구성 점막으로 다양한 양의 탄성 섬유가 있는 두 개의 얇은 연근 층으로 구성된다. 내층의 연근 섬유는 원형으로 배열되어 있고 외층은 종축 방향으로 배열되어 있다.
2. 부점막: 이층은 탄성 섬유와 큰 혈관과 신경섬유를 포함하는 성긴 연결조직이다.
3. 외부 근성층: 이층은 두 개의 두꺼운 연근으로 구성되는데 이는 위장관을 통하여 물질이 진행되도록 움직임을 제공한다. 내층의 근섬유는 원형으로 배열되어 있고 외층은 종축으로 배열되어 있다. 식도의 최상 세 번째는 예외가 되는데 여기에는 삼키는 것과 연관하여 자발적인 수축을 할 수 있도록 홈이 있는 근육을 포함한다.
4. 장막 (또는 외막)
이는 최위층막으로 성긴 연결조직과 기관이 자유롭게 현탁되는 인 중피에 의해 덮혀있다.
본 발명에 따라 상이한 3차원 튜브형 조직 배양물을 만들어 이와 같은 4개층을 만들 수 있다. 예를 들면 점막을 만들기 위해 생체 흡수 가능한 물질로 구성된 메쉬에 이식물을 수용하는 화자의 대체된 부분 주변 도는 기관부분에서 분리한 섬유아세포, 연근세포와 다른 세포를 접종한다.
이식부위가 흡수성 표면인 경우에 메쉬는 관강에 마주하는 표면에 맞도록 한다.
동시에, 제 1 메쉬의 외측 원주보다 약간 큰 내측 원주를 가지는 제 2 메쉬에 환자의 부점막층의 섬유아세포와 다른 세포로 접종시킨다. 유사하게 제 3 메쉬에는 장막에서 취한 세포를 접종시킨다. 이와 같은 메쉬는 7.1에서 지시한 것과 같이 만들어지고 배양된다.
각 기질층은 적정수준으로 배양시키고 각 표면 층을 배양시킨다. 예를 들면, 상피세포가 근성 점막을 만들기 위해 라미나 메쉬의 상부(또는 튜브의 경우 내부)에 접종하고 연근 세포는 동일 메쉬의 하부(튜브의 경우에 외부)에 접종한다.
나란하게, 근성 외층에서 분리한 세포는 장막의 표면 또는 부점막의 표면에 접종한다. 또는, 근성 외층의 내층은 부점막 기질 메쉬에서 생장시키고, 외층은 장막 기질 메쉬에서 생장시킨다.
적정 생장 수준에서, 이와 같은 메쉬는 7.2에서 상술하고 있는 방법중 하나를 이용하여 복합시킨다. 배얄물은 표면층이 완성 될 때까지 배양시킨다.
상이한 3차원 배양물을 어셈블리하는 동안에, 맥관 조직(동맥, 정맥)을 튜브 구조에 추가한다. 예를 들면, 8에서 상술하는 것과 같이 시험관에서 혈관을 만들 수 있다. 부점막 메쉬와 장막 메쉬를 복합하기 전에, 이와 같은 혈관은 부점막 기질 배양물의 한쪽면 또는 양쪽면을 따라 종축으로 있게 된다. 이식할 때, 위장관의 적정 혈관의 결합 단편으로 절단될 수 있다.
이들 층을 별도로 생장시켜, 이를 복합시키고, 추가 생장시켜, 별도 조직층을 만들고 이는 자연 상태와 동일한 환경에서 성숙하게 된다.
이들 층중에서 하나만이 손상된 환자의 경우에, 3차 배양물은 하나로 충분하고 이는 대체할 층에 선택적으로 이식될 수 있다.
조직의 모든 다양한 층으로 완전히 기능적으로 대체할 필요가 없는 경우에 간단한 상피가 있는 3차 배양 기질 배양물을 이용할 수 있다. 이와 같은 균질 기질 매트릭스의 하나이상 층을 복합하여 보철에 적합한 두께를 제공할 수 있다.
9. 생뇨기관
본 발명의 구체예에서는 생리학적인 조건에 필적하는 시험관 내 시스템에서 생뇨기관 요소를 복제할 수 있다. 생뇨기관은 조직적인 면에 있어서 소화기관과 상당히 유사하다. 주된 차이는 직경이 더 작고 생뇨기관의 흡수성 표면이 부족하다는 것이다.
9.1. 뇨관
위장관과 유사하게, 뇨관 또는 내층으로써 점막을 가진다. 흡수성 펴면은 없으나, 뇨관의 내층은 단면이 성상형을 미루도록 상당히 접혀져 있다. 그러나 상피 라이닝은 4-5개 세포 두께이다. 상피아래의 라미나는 풍부한 콜라겐, 일부 엘라스틴과 임파노들을 포함한다.
점막 주변에는 근육층이 있는데 이의 내층에는 종축으로 배열된 연근 섬유를 포함하고 외층은 원형으로 배열되어 있다. 최외층은 탄성섬유 연결 조직으로 구성된다.
본 발명에 따른 뇨관을 만들기 위해서는, 기질 세포는 뇨관에 연합된 두 개 연결 조직으로 부터 분리하고, 6.1에서 상술한 것과 같이 두 개의 별도 3차원 배양물을 만드는데 이용한다. 기질층의 적절한 성장후에 상피세포는 배양물에서 유도된 라미나의 내층에 접종하고 연근세포는 반대 표면에 접종한다. 병행하여, 연근세포는 외층에서 유도된 배양물의 표면에 접종한다. 2개 3차 배양물을 복합하여 6.2에서 상술하고 있는 것과 같은 하나의 튜브형 구조를 만들기 위해 복합한 다음 표면층이 완성될 때까지 배양한다.
기질조직의 모든 다양한 층으로 완전한 기능적 치환이 요구되지 않는 경우에, 상피가 있는 단순한 균질성 3차 기질 배양물을 이용한다. 이와 같은 균질성 3차 기질 배양물을 이용한다. 이와 같은 균질성 기질 매트릭스를 한 층이상 복합하여 보철에 적합한 두께를 제공할 수 있다.
9.2. 요도.
요도는 상피가 대어진 간단한 라미나 구조로 연근 섬유층 2개가 이를 에워싸고 있다. 내층에는 섬유가 종축으로 배열되어 있고, 외층에는 섬유가 원형으로 배열되어 있다. 라미나의 연결조직에는 탄성 섬유가 풍부하고, 많은 세정맥을 포함한다.
요도는 하나의 기질층을 가지기 때문에, 본 발명에 따르면 시험관에서 이의 제작을 위해서 3차 배양물 하나로 중분하다. 예를 들어 7.1에서 상술하고 있는 것과 같이 환자의 뇨도 라미나에서 분리한 세포물질을 메쉬에 접종한다. 적절한 합류단계에서, 상피세포는 한 표면(내측)에 접종하고 연근은 반대 표면(외층)에 접종한다. 3차 배양물은 표면층이 성숙될 때까지 배양시킨다.
10. 탈출(헤르니아) 복구.
헤르니아 봉합술에서 섬유아세포가 접종된 교정 생체 재흡수할 수 있는 3차원 메쉬를 이용한다. 또는 세포는 더 강한 근성 봉합성을 가지는 합성 매쉬 기질에 접종할 수 있다.
11. 건과 인대형성.
건과 인대는 섬유아세포와 이를 콜라겐 I, II섬유와 주로 글리코사미노글리칸 더르마탄 설페이트 섬유에 의해 에워싸여 있다. 본 발명의 구체예에서는 피부에서 흔히 볼 수 있는 것보다는 더 조밀하고 나란히 배열된 덩어리로 콜라겐 섬유의 형성과 배열을 변경시키기 위해 기계적인 또는 타력하에 기질조직을 배치시킨다. 고분자에 피부 섬유아세포를 배치시키고, 순간적인 기계적 힘을 증가시키면서 조직을 생장시켜 최종 구조는 정상적인 건의 인장 강도(33 MPa)를 가진다. 인대 또는 건의 구조는 형성된 인대 또는 건의 단부에 조직을 만들 뼈를 선택적으로 이용하여 부착부위를 제공할 수 있다.
본 발명은 특정 구체예를 이용하여 설명하고 있으나 이는 설명을 위함이며 이에 한정 시키고자 하는 의도는 아니다. 기능적으로 등가의 방법 및 성분도 본 발명의 영역에 속한다. 또한 여기에서 상술하고 있는 것에 추가하여 다양한 변화도 첨부도 설명과 도면에 의해 본 기술에 숙지의 지식을 가진 자는 인지할 것이다. 이와 같은 변형도 첨부된 청구범위 범위내에 속한다.

Claims (25)

  1. 시험관에서 준비된 살아있는 기질 세포가 콜로니를 형성한 3차원 튜브형 조직 구조물에 있어서, 3차원 구조에 접종된 기질 세포에 의해 자연적으로 분비된 기질세포와 연결조직 단백질로 구성되고 3차원 구조물은 살아있는 세포로 집단을 이루어 기질 세포에 의해 연결된 간질성 공간을 가지는 3차원 튜브형 조직 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물.
  2. 제 1 항에 있어서, 기질 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물.
  3. 제 1 항에 있어서, 기질세포는 사람 피부 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물.
  4. 제 1 항에 있어서, 기질세포는 탯줄 세포, 탯줄 혈액에서의 골수 세포, 생뇨기관의 점막세포, 비인두 라이닝에서의 점성 세포 또는 내피세포인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물.
  5. 제 1 항에 있어서, 구조물은 생체 분해 가능한 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물.
  6. 제 5 항에 있어서 생체 분해 가능한 물질은 폴리글리콜산, 면, 원숭이 내장 봉합사, 셀룰로오즈, 젤라틴, 콜라겐 또는 폴리하이드록시 알카노에이트인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물.
  7. 제 1 항에 있어서 구조물은 생체 비-분해성 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물.
  8. 제 7 항에 있어서, 생체 비-분해성 물질은 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리카보네이트, 폴리테트라플로로에틸렌 또는 니트로셀룰로오즈 화합물인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물.
  9. 제 1 항에 있어서, 구조물은 메쉬인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물.
  10. 제 4 항에 있어서 기질세포는 섬유와 세포, 연근세포, 생뇨기관에서 점성세포, 비인두 라이닝의 점막세포, 내피세포, 탯줄세포 또는 탯줄 혈액에서의 골수 세포인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물.
  11. 시험관에서 준비된 살아있는 기질세포가 콜로니를 형성한 3차원 튜브형 조직 구조물을 만드는 방법에 있어서, 배양물에 기질세포가 접종된 구조물을 배양하여 기질세포와 기질세포에 의해 분비되는 기질세포와 연결조직 단백질이 생체 적응성이 있는 살아있지 않은 물질로된 구조물에 부착되고 이를 에워싸서 기질세포에 의해 연결된 간질성 공간을 가지는 3차원 구조물이 3차원 튜브형 조직구조로 형성하는 것을 특징으로 하는 살아있는 기질세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 기질 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 기질세포는 사람 피부 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법
  14. 제 11 항에 있어서, 기질세포는 탯줄 세포, 탯줄 혈액에서의 골수 세포, 생뇨기관의 점막세포, 비인두 라이닝에서의 점성 세포 또는 내피세포인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법
  15. 제 11 항에 있어서 기질세포는 내피세포, 혈관주위 세포, 대식세포, 단세포, 백혈구 세포, 혈장세포, 비만세포, 지방세포, 탯줄세포, 탯줄 혈액에서의 골수 세포, 위장관에서 점막세포, 생뇨기관에서의 세포, 비인두 라이닝에서의 점막세포 또는 내피세포의 복합인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법
  16. 제 11 항에 있어서 구조물은 생체 분해 가능한 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법
  17. 제 16 항에 있어서 생체 분해 가능한 물질은 폴리글리콜산, 면, 원숭이 내장 봉합사, 셀룰로오즈, 젤라틴, 콜라겐 또는 폴리하이드록시 알카노에이트인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법
  18. 제 11 항에 있어서 구조물은 생체 비-분해성 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법
  19. 제 18 항에 있어서, 생체 비-분해성 물질은 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리카보네이트, 폴리테트라플로로에틸렌 또는 니트로셀룰로오즈 화합물인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법
  20. 제 11 항에 있어서, 구조물은 메쉬인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법
  21. 제 11 항에 있어서, 살아있는 기질조직에 접종된 실질세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법
  22. 제 21 항에 있어서 실질세포는 섬유와 세포, 연근세포, 생뇨기관에서 점성세포, 비인두 라이닝의 점막세포, 내피세포, 탯줄세포 또는 탯줄 혈액에서의 골수 세포인 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법
  23. 제 11 항에 있어서 배양배지는 정적조건에서 유지되는 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법
  24. 제 11 항에 있어서 배양물은 배양배지를 재순환시키거나 또는 방사 스트레스를 적용시켜 동적 상태에서 유지시키는 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법
  25. 살아있는 기질조직 구성물의 이식방법에 있어서,
    a) 3차 구조물에 기질세포를 접종하고;,
    b) 시험관에서 기질세포를 배양하여 이를 증식시키고, 그리고
    c) 생체에 튜브형 조직 구조물을 이식시키는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 살아있는 기질 세포가 콜로니를 이룬 3차원 조직 구조물의 제조방법
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