KR102034619B1 - 피부 t 세포 림프종(ctcl) 치료용 mir-155 억제제 - Google Patents

피부 t 세포 림프종(ctcl) 치료용 mir-155 억제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제 및 이의 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 대상에게 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여함으로써 대상의 T 세포 림프종과 같은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여함으로써 악성 T 세포의 증식을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.

Description

피부 T 세포 림프종(CTCL) 치료용 MIR-155 억제제
본 발명은 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제 및 이의 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여함으로써 이를 필요로하는 대상에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. miR-155의 활성 또는 기능은 올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여 후 대상의 암 세포에서 감소된다.
마이크로RNA(miRNA)는 유전자 발현의 전사 후 억제 인자로서 작용하는 작고, 내인성이며, 비 코딩 RNA이다. MiRNA는 서열이 완벽하게 상보적인 경우 분해를 촉진함으로써 또는 서열이 불일치를 포함하는 경우 번역을 억제함으로써 표적 mRNA의 억제제로서 역할을 한다.
MiRNA는 RNA 중합 효소 II(pol II) 또는 RNA 중합 효소 III(pol III; Qi et al. (2006) Cellular & Molecular Immunology, Vol. 3:411-419 참조)에 의해 전사되고, 일반적으로 수천 개의 염기 길이인 1차 miRNA 전사체(pri-miRNA)로 불리는 초기 전사체로부터 발생된다. Pri-miRNA는 RNase 드로샤(Drosha)에 의해 핵에서 약 70- 내지 약 100-뉴클레오타이드의 헤어핀 모양의 전구체(pre-miRNA)로 처리된다. 세포질로의 운반 이후에, 헤어핀 pre-miRNA는 다이서(Dicer)에 의해 추가 처리되어 이중 가닥 miRNA를 생성한다. 그런 후에 성숙한 miRNA 가닥은 RNA-유도 사일런싱 복합체(RISC)에 통합되며, 여기서 염기쌍 상보성에 의해 표적 mRNA와 결합한다. miRNA 염기쌍이 mRNA 표적과 완벽하게 쌍을 이루는 비교적 드문 경우에, mRNA 분해를 촉진한다. 보다 일반적으로, miRNA는 표적 mRNA와 불완전한 이종이중체를 형성하여 mRNA 안정성에 영향을 미치거나 mRNA 번역을 억제한다.
마이크로RNA는 암을 포함하는 여러 질병에 관여되어 있다. 예를 들어, 인간 miRNA 유전자 miR15a와 miR16-1은 B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL) 환자의 약 60%에서 결실되거나 하향조절된다(Calin et al., Proc Natl Acad Sci, 2002; 99 : 15524-15529). 유사하게, miR-155-5p의 조절장애는 피부 T 세포 림프종(CTCL)의 발병기전에 관여하는 시그널링 사건과 관련이 있다. 악성 T 세포가 전사의 신호 전달자 및 활성자(STAT) 단백질을 통해 전사를 활성화시키는 IL-2 수용체 복합체 및 관련 자누스 키나아제(JAKs)를 구조적으로 발현한다는 것이 밝혀졌다. 염색질 면역 침전 실험은 STAT-5가 miR-155-5p에 대한 숙주 유전자, MIR155HG의 프로모터와 관련이 있음을 보여주었다. 이것은 miR-155-5p가 CTCL 악성 T 세포에서 STAT-5 신호 전달 경로를 조절할 수 있음을 시사한다. JAK/STAT 경로의 억제는 miR-155-5p 발현의 하향 조절을 초래하는 반면 STAT-5를 활성화시키는 사이토카인에 의한 세포의 처리는 miR-155-5p 수준의 증가를 초래하였다(Kopp et al., 2013). 이러한 결과는 miR-155-5p가 CTCL의 발병기전에 역할을 할 수 있음을 시사한다.
현재, 말기 CTCL 환자를 치료하거나 생존을 연장시키는 치료법은 없다 (Prince et al., 2009). 질병의 조기 단계에서 CTCL 환자를 위한 치료는 조심스러운 의사 모니터링과 함께 완화적이고 비 공격적이다. 더 진행된 단계의 CTCL 환자는 전형적으로 레티노이드(벡사로틴) 또는 히스톤 데아세틸라아제 억제제(보리노 스탯)와 같은 전신 약물로 치료된다. 방사선요법은 전형적으로 최후 방어선이며 부분적 질병 퇴행을 초래할 수는 있지만 완전히 박멸할 수는 없다. 많은 치료법은 심각한 부작용을 나타내거나 시간이 지남에 따라 저항을 유발한다. 따라서, 피부 T 세포 림프종을 치료하기 위한 새로운 치료법에 대한 의학적 필요가 충족되지 못하고 있다.
본 발명은 대상의 세포에서 miR-155의 활성 또는 기능을 조절하기 위한 올리고뉴클레오타이드 억제제를 제공한다. 한 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여는 투여 후 대상의 암 세포에서 miR-155의 활성 또는 기능을 하향 조절한다. 특정 실시태양에서, 암세포는 피부 T 세포 림프종(CTCL) 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, αβT 세포, γδT 세포 및 기억 T 세포를 포함하는 악성 T 세포이다.
한 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 11 내지 16개 뉴클레오타이드의 서열을 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 갖는다; 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 네 번째 뉴클레오타이드는 또한 잠금 뉴클레오타이드이다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고 뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터의 첫 번째 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이다.
다른 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 갖는다; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다. 이런 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 적어도 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고 뉴클레오타이드 억제제는 7, 8, 9, 또는 10개의 변형 뉴클레오타이드를 함유한다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제에 존재하는 7, 8, 9, 또는 10개의 변형 뉴클레오타이드는 모두 잠금 뉴클레오타이드이다. 또 다른 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제에 존재하는 7, 8, 9 또는 10개의 변형 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드 및 에틸렌-가교 뉴클레오타이드, 2'-C-가교 바이사이클릭 뉴클레오타이드와 2'-치환 뉴클레오타이드와 같은 당 변형과 같은 다른 변형의 조합이다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터의 두 번째 DNA 뉴클레오타이드는 비 변형 DNA 뉴클레오타이드일 수 있다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터의 첫 번째 3개의 변형 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이다.
또 다른 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 갖는다; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 적어도 7개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다. 이런 실시태양에서, 올리고 뉴클레오타이드 억제제는 7, 8, 9, 또는 10개의 변형 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제에 존재하는 7, 8, 9, 또는 10개의 변형 뉴클레오타이드는 모두 잠금 뉴클레오타이드이다. 또 다른 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제에 존재하는 7, 8, 9 또는 10개의 변형 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드 및 에틸렌-가교 뉴클레오타이드, 2'-C-가교 바이사이클릭 뉴클레오타이드와 2'-치환 뉴클레오타이드와 같은 당 변형과 같은 다른 변형의 조합이다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터의 첫 번째 3개의 변형 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 두 번째 또는 세 번째 뉴클레오타이드는 DNA 뉴클레오타이드이다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터의 두 번째 DNA 뉴클레오타이드는 비 변형 DNA 뉴클레오타이드일 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 또 다른 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 갖는다; 상기 올리고 뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단의 적어도 네 번째 및 다섯 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다. 이런 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 적어도 7, 8, 9 또는 10개의 변형 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제에 존재하는 7, 8, 9, 또는 10개의 변형 뉴클레오타이드는 모두 잠금 뉴클레오타이드이다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터의 첫 번째 3개의 변형 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터의 네 번째 및/또는 다섯 번째 DNA 뉴클레오타이드는 비 변형 DNA 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제에 존재할 수 있는 변형 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드, 에틸렌 가교 뉴클레오타이드, 2'-C-가교 바이사이 클릭 뉴클레오타이드, 2'-치환 뉴클레오타이드 및 본 발명에 기술된 다른 당 및/또는 염기 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제에 존재하는 모든 변형 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이다. 일부 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제에 존재하는 변형 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드 및 에틸렌 변형 뉴클레오타이드, 2'-C-가교 바이사이클릭 뉴클레오타이드 및 2'-치환 뉴클레오타이드와 같은 다른 변형 및 본 발명에 기술된 다른 당 및/또는 염기 변형의 조합이다.
한 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 12 내지 14개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 적어도 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 잠금 뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 DNA 뉴클레오타이드를 함유한다. 특정 실시태양에서, 올리고 뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 DNA 뉴클레오타이드이다. 특정의 추가의 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터의 적어도 두 번째 및 네 번째 뉴클레오타이드는 DNA 뉴클레오타이드이다. 추가의 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 여섯 번째 및/또는 여덟 번째 뉴클레오타이드는 DNA 뉴클레오타이드이다. 또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 5' 말단으로부터 두 번째, 여섯 번째 및 여덟 번째 위치에 DNA 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 SEQ ID NOs: 3-27 및 29-120으로부터 선택된 서열을 갖는다. 예시적인 실시태양에서, miR-155의 올리고 뉴클레오타이드 억제제는 서열 번호 25의 서열을 갖는다. 또 다른 예시적인 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 SEQ ID NO: 22 또는 23의 서열을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, miR-155의 올리고 뉴클레오타이드 억제제는 SEQ ID NO: 33, 39, 43, 44, 47, 58, 84, 99, 111, 115, 및 120으로부터 선택된 서열을 갖는다.
한 실시태양에서, 본 발명에 따른 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 암세포의 증식을 감소 또는 억제 및/또는 암세포의 세포사멸을 유도한다. 또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 암 세포에서 miR-155의 하나 이상의 표적 유전자를 상향 조절한다.
본 발명은 또한 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 포함하는 조성물 및 이의 용도를 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 치료적 유효량의 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 이를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. miR-155의 활성 또는 기능은 올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여 후 암세포에서 감소된다. 한 실시태양에서, 암은 피부 T 세포 림프종(CTCL)이다. 일부 실시태양에서, 암을 치료하기 위한 방법은 본 발명의 치료적 유효량의 miR-155 올리고뉴클레오타이드 억제제 및 치료적 유효량의 제 2 치료제, 예컨대 레티노이드 또는 히스톤데아세틸라제(HDAC) 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함하여, 악성 T 세포의 증식을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. miR-155의 활성 또는 기능은 올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여 후 악성 T 세포에서 감소된다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 정량적 실시간 PCR에 의해 측정된 정상 주변 CD4+ T 헬퍼 세포와 비교한 다양한 CTCL 세포주에서의 miR-155-5p의 절대 발현을 도시한다.
도 2는 72시간 동안 4개의 항-miR-155 화합물 중 하나의 10μM에 의한 치료에 반응하여 다양한 CTCL 세포에서 miR-155의 9개의 표적 유전자에서의 유전자 발현 변화의 "히트 맵 (heat map)" 묘사를 도시한다.
도 3a는 HuT102 세포에서 72시간 동안 2μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 3b는 HuT102 세포에서 72시간 동안 10μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 3c는 HuT102 세포에서 72시간 동안 50μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 3d는 HuT102 세포에서 96시간 동안 2μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 3e는 HuT102 세포에서 96시간 동안 10μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 3f는 HuT102 세포에서 96시간 동안 50μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. *P 값 <0.0001은 비모수적인 만-휘트니(Mann-Whitney) 테스트에 의해 치료되지 않은 것과 비교된다.
도 4a는 MJ 세포에서 72시간 동안 2μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 4b는 MJ 세포에서 72시간 동안 10μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 4c는 MJ 세포에서 72시간 동안 50μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 4d는 MJ 세포에서 96시간 동안 2μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 4e는 MJ 세포에서 96시간 동안 10μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 4f는 MJ 세포에서 96시간 동안 2μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. *P 값 <0.0001은 비모수적인 만-휘트니(Mann-Whitney) 테스트에 의해 치료되지 않은 것과 비교된다.
도 5a는 HH 세포에서 72시간 동안 2μM의 antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 5b는 HH 세포에서 72시간 동안 10μM의 antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 5c는 HH 세포에서 72시간 동안 50μM의 antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 5d는 HH 세포에서 96시간 동안 2μM의 antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 5e는 HH 세포에서 96시간 동안 10μM의 antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 5f는 HH 세포에서 96시간 동안 50μM의 antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. *P 값 <0.0001은 비모수적인 만-휘트니(Mann-Whitney) 테스트에 의해 치료되지 않은 것과 비교된다.
도 6a는 My-LA 세포에서 72시간 동안 2, 10 및 50μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 6b는 My-LA 세포에서 96시간 동안 2, 10 및 50μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. *P 값 <0.0001은 비모수적인 만-휘트니(Mann-Whitney) 테스트에 의해 치료되지 않은 것과 비교된다.
도 7a는 HuT78 세포에서 72시간 동안 2μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 7b는 HuT78 세포에서 72시간 동안 10μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 7c는 HuT78 세포에서 72시간 동안 50μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 7d는 HuT78 세포에서 96시간 동안 2μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 7e는 HuT78 세포에서 96시간 동안 10μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 7f는 HuT78 세포에서 96시간 동안 50μM antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다.
도 8a는 HuT102 세포에서 10μM antimiR-155 화합물 또는 대조군 올리고에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. 도 8b는 MJ 세포에서 10μM antimiR-155 화합물 또는 대조군 올리고에 의한 치료에 반응하여 4개의 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다. *P 값 <0.0001은 비모수적인 만-휘트니(Mann-Whitney) 테스트에 의해 치료되지 않은 것과 비교된다.
도 9는 4일 또는 8일 동안 antimiR-155 화합물로 치료된 MJ 세포에서의 차등 발현 신호의 히트 맵을 도시한다. antimiR-155로 치료한 MJ 세포는 전체 게놈 발현 프로파일링을 받았다. 차등 발현 신호는 0.05≤의 거짓 발견율 보정된 p 값으로 현저하게 변화된 유전자에 대해 필터링되었다.
도 10은 4일 또는 8일 동안 antimiR-155 화합물로 치료된 HuT102 세포에서 차등 발현 신호의 히트 맵을 도시한다. antimiR-155로 치료된 HuT102 세포는 전체 게놈 발현 프로파일링을 받았다. 차등 발현 신호는 0.05≤의 거짓 발견율 보정된 p 값으로 현저하게 변화된 유전자에 대해 필터링되었다.
도 11a는 MJ 및 HuT102 세포 모두에서 antimiR-155에 반응하여 상향 조절된 유전자의 유전자 발현 프로파일의 주석을 도시한다. 유전자 시그니처는 1.6e-25의 농축에 대해 고지학적 p 값을 갖는 miR-155 종자-매치 직접 표적에 대해 농축된다. 여기에서 확인된 유전자는 0.05≤의 거짓 발견율 보정된 p 값으로 antimiR-155 치료로 치료되지 않은 그룹에 비해 유의하게 변화되었다. 도 11b는 비-종자 함유 전사 물과 비교하여, 8-, 7- 또는 6-뉴클레오타이드 종자 서열을 함유하는 miR-155 직접 표적 유전자의 차등 발현의 누적 분포 함수 그래프를 도시한다. 도시된 p 값은 두 데이터 집합 간의 유의미한 차이를 결정하는 콜모고로프-시미노프(Kolmogorov-Smirnov 테스트의 결과이다.
도 12는 MJ 및 HuT102 세포 모두에서 8일 동안 antimiR-155 화합물에 의한 치료에 반응하여 상향 조절되거나 하향 조절된 유전자의 주석된 유전자 발현 프로파일을 도시한다.
도 13은 CTCL 세포에서 SEQ ID NO: 25의 서열을 갖는 antiimR-155의 8일 치료에 반응하여 상향 조절되거나 하향 조절된 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다.
도 14a는 HuT102 세포의 증식에 대한 antimiR-155 화합물의 효과를 도시한다. 도 14b는 HuT102 세포에서 카스파제 3/7 활성에 대한 antimiR-155 화합물의 효과를 도시한다.
도 15a는 치료 8일째에 다양한 농도의 antimiR-155 화합물에 반응하여 HuT102 세포의 증식을 도시한다. 도 15b는 치료 8일째에 다양한 농도의 antimiR--155 화합물에 반응하여 HuT102 세포에서 카스파제 3/7 활성을 도시한다.
도 16a는 HuT102 세포의 증식에 대한 antimiR-155 화합물의 효과를 도시한다. 도 16b는 HuT102 세포에서 카스파제 3/7 활성에 대한 antimiR-155 화합물의 효과를 도시한다.
도 17a는 My-La 세포의 증식에 대한 antimiR-155 화합물의 효과를 도시한다. 도 17b는 My-La 세포에서 카스파제 3/7 활성에 대한 antimiR-155 화합물의 효과를 도시한다.
도 18a는 치료 8일째에 다양한 농도의 antimiR-155 화합물에 반응하여 My-La 세포의 증식을 도시한다. 도 18b는 치료 8일째에 다양한 농도의 antimiR-155 화합물에 반응하여 My-La 세포에서 카스파제 3/7 활성을 도시한다.
도 19a는 HuT102 세포의 증식에 대한 10μM antimiR-155 화합물 및 0.25μM HDAC 억제제의 효과를 도시한다. 도 19b는 HuT102 세포의 증식에 대한 10μM antimiR-155 화합물 및 0.50μM HDAC 억제제의 효과를 도시한다.
도 20a는 HuT102 세포에서 카스파제 3/7 활성에 대한 10μM의 antimiR-155 화합물 및 0.25μM의 HDAC 억제제의 효과를 도시한다. 도 20b는 HuT102 세포에서 카스파제 3/7 활성에 대한 10μM antimiR-155 화합물 및 0.50 μM HDAC 억제제의 효과를 도시한다.
도 21은 화합물 4(SEQ ID NO: 25)에 반응하여 4일 또는 8일째에 3개의 균상 식육종 세포주 모두에서 상향 조절되거나 하향 조절된 587개 유전자의 발현 변화의 히트 맵을 도시한다.
도 22는 miR-155 결합 부위를 함유하는 이중 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 사용하여 측정된 상이한 길이의 올리고 뉴클레오타이드 억제제의 antimiR-155 활성을 도시한다.
도 23a, 도 23b, 도 23c 및 도 23d는 miR-155 결합 부위를 함유하는 이중 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 사용하여 측정된 다양한 수의 잠금 뉴클레오타이드 변형을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 억제제의 antimiR-155 활성을 도시한다.
도 24a, 도 24b, 도 24c 및 도 24d는 miR-155 결합 부위를 함유하는 이중 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 사용하여 측정된 다양한 위치에 잠금 뉴클레오타이드 변형을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 억제제의 antimiR-155 활성을 도시한다.
도 25는 miR-155 결합 부위를 함유하는 이중 루시퍼 라제 리포터 플라스미드를 사용하여 측정된, 다양한 뉴클레오타이드 변형을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 억제제의 antimiR-155 활성을 도시한다.
도 26은 miR-155 결합 부위를 함유하는 이중 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 사용하여 측정된, 다양한 14-뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 antimiR-155 활성을 도시한다.
도 27은 miR-155 결합 부위를 함유하는 이중 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 사용하여 측정된 SEQ ID NOs: 25 및 23의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 antimiR-155 활성을 도시한다.
도 28은 SEQ ID NOs: 25 및 120의 올리고뉴클레오타이드 억제제에 의한 치료에 반응하여 miR-155 표적 유전자의 발현에 배수 변화를 도시한다.
본 발명 전체에서 언급된 모든 특허 및 비 특허 문헌은 그 전체가 본 발명에 참고로 포함된다.
본 발명은 암 세포에서 miR-155의 활성 또는 기능을 억제하는 올리고뉴클레오타이드 억제제를 제공한다. 인간에서, miR-155는 MIR155 숙주 유전자 또는 MIR155HG에 의해 코딩되며 인간 21번 염색체에 위치한다. pre-miR-155의 두 암은 성숙한 miRNA를 생성할 수 있기 때문에, pre-miR-155의 처리 생성물은 miR-155-5p(5' 암(arm)으로부터) 및 miR-155-3p(3' 암(arm)으로부터)으로 지정된다. 인간 miR-155-5p 및 miR-155-3p에 대한 성숙한 서열은 아래에 제공된다:
인간 성숙 miR-155-5p(SEQ ID NO: 1)
5'-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3'
인간 성숙 miR-155-3p(SEQ ID NO: 2)
5'-CUCCUACAUAUUAGCAUUAACA-3'
miR-155-5p는 B 세포, T 세포, 단핵구 및 과립구를 포함하는 조혈 세포에서 발현된다(Landgraf et al, 2007). miR-155-5p는 골수 형성과 적혈구 생성의 조절에 필수적인 분자이다. 이 miRNA는 초기 줄기-전구체 단계에서 조혈 줄기-전구 세포에서 고도로 발현되며, 보다 성숙한 조혈 세포(예를 들어, 림프구, 적혈구)로의 분화를 차단한다. miR-155-5p 발현은 세포가 이 계통을 따라 성숙함에 따라 점진적으로 감소하고 성숙한 조혈 세포에서 약 200배 더 낮다(Masaki et al., 2007; Gerloff et al., 2015).
miR-155-5p는 염증 및 면역 반응을 매개하는데 중요한 역할을 한다. miR-155-5p가 결핍된 생쥐는 T- 및 B- 림프구 하위 집단의 정상적인 수 및 분포를 나타내지만, 특히 T 헬퍼 세포 분화를 조절하는데 부족합 결핍 반응을 나타내고 최적의 T- 세포 의존 항체 반응을 생산하는 종자 중심 반응을 억제하는 면역 반응을 나타낸다(Rodriguez et al., 2007; Thai et al., 2007). miR-155-5p는 CD4+ T 세포의 T 헬퍼 세포의 T 헬퍼 타입 1(Th1), Th2 및 Th17 서브세트로의 분화를 제어하고 조절 T 세포(Treg)의 발달에 영향을 미친다(Baumjohann and Ansel 2013). miR-155-5p는 정상적인 B 세포 분화 및 항체 생산뿐만 아니라 바이러스 감염(Dudda et al., 2013; Gracias et al. 2013)에 대한 작용기 및 기억 CD8+ T 세포 반응을 조절한다. 인간에서, miR-155-5p 발현은 비림프선성 장기뿐만 아니라 쉬고있는 순수한 CD4+ T 세포에서 낮다. miR-155-5p 발현은 B 세포와 T 세포의 항원 수용체 자극(Tam 2001; Haasch et al., 2002; van den Berg et al., Rodriguez et al. Vigorito et al., 2007; Banerjee et al., 2010) 및 대식세포와 수지상 세포의 톨 유사 수용체 효현제 자극(Taganov et al., 2006; O'Connell et al., 2007; Ceppi et al. 2011)에 의해 크게 증가된다. MIR155HG 활성화는 AP1- 및 NF-κB- 매개 기작을 모두 포함한다.
CTCL의 균상 식육종(MF) 아형으로 진단된 환자의 피부 플라크 또는 종양은 miR-155-5p의 수치를 상승시켰다. 대조군 피부 생검과 비교된 MF 환자 피부 생검에서 증가된 miR-155-5p는 여러 그룹에 의해 보고되었다(van Kester et al., 2011; Maj et al., Kopp et al., 2013b; Moyal et al. 2013). 한 연구에서, miR-155-5p 수준은 초기 MF 생검과 비교하여 종양 단계 생검에서 4.16 배 더 높았으며(Moyal et al., 2013), miR-155-5p 수준이 질병 진행과 상관관계가 있을 수 있음을 나타낸다. miR-155-5p를 발현하는 특정 세포 유형을 확인하는 두 번째 연구에서, miRNA는 CTCL 병변에서 악성 및 비 악성 T 세포 모두에서 발현된다는 것이 밝혀졌다(Kopp 등, 2013b).
균상 식육종(MF)은 모든 원발성 피부 림프종의 50-70%를 차지하는 CTCL의 가장 일반적인 아형이다. 두 번째로 흔한 아형은 CTCL 케이스의 15%를 차지하는 세자리(Sezary) 증후군(SS)이다. MF는 표피에서 패치, 플라크 또는 결절 종양을 형성하는 대뇌 핵을 갖는 비 전형적인의 중소형 T 림프구의 증식을 특징으로 한다. MF는 전형적으로 고령자에게 영향을 미치며(진단의 중간 연령: 55-60) 패치와 플라크가 종양 형성에 앞선다거나 동시에 나타나는 진부한 임상 경과를 갖는다. 일부 후기 종양 단계 경우에, 림프절과 내장 기관 이환이 관찰된다. 종양 단계 MF 동안, 진피 침투물이 보다 확산되고 비 전형적인 T 세포의 표피 분열이 소실될 수 있다. 반대로, SS는 피부의 광범위한 발적 및 스케일링(적혈구 증가증), 확대된 림프절 및 말초 혈액 순환에서 악성 세포를 특징으로 하는 보다 적극적인 백혈병 형태의 CTCL이다(Yamashita et al., 2012; Jawed et al. 2014).
유전자 발현에 이런 차이는 유전적 또는 후성적 기원은 알려져 있지 않지만, 종양 단계 MF의 분자 분석은 정상적인 피부, 염증 피부 및 정상 T-세포(van Kester et al., 2012)와 비교하여 유전자 발현에서 현저한 변화를 나타내었다. 초기 피부 병변은 비정상적인 형태와 악성 표현형을 가진 T 세포의 작은 개체군뿐만 아니라 정상적인 표현형을 가진 T 세포를 포함하는 여러 염증 세포를 포함한다. 침투물은 주로 비 악성 Th1 세포, 조절 T 세포 및 세포 독성 CD8+ T 세포로 구성된다. 악성 T 세포는 전형적으로 클론성 기원의 CD4+ 기억 T 세포이다. 질병이 진행되는 동안, 표피 분열이 점차 상실되고, 악성 CD4+ T 세포의 증가와 비 악성 CD8+ T 세포의 감소가 동반된다.
CTCL은 전사 인자 및 신호 전달의 조절자의 비정상적인 발현 및 기능을 특징으로 한다. 신호 분자와 사이토카인의 기능장애 조절이 CTCL의 악성 형질 전환 및 발병기전에 중요한 역할을 한다고 가정되었다(Girardi et al., 2004; Zhang et al, 2006; van Doorn et al, 2009; Kadin and Vonderheid , 2010). MF와 SS 세포의 유전자 발현 프로파일에서 현저한 차이가 관찰되었으며, CTCL의 이러한 변이종에 대한 독특한 발병기전과 일치한다(van Doorn et al., 2009; Campbell et al., 2010). 최근에, microRNA(miRNA)가 차별적으로 발현되고 CTCL의 발병기전에 잠재적으로 관여하는 것으로 보고되었다. miR-155-5p는 균상 식육종에서 가장 많이 발현되는 miRNA 중 하나인 반면(Kopp et al, 2013, Kopp et al., 2013b), 조절이상 miRNA의 뚜렷한 하위 집합이 세자리 증후군을 구별하며 miR 155-5p는 CTCL의 아형에서 상향 조절되지 않는다(ballabio et al., 2010).
본 발명은 인간 miR-155의 활성 또는 기능을 감소 또는 억제하는 올리고뉴클레오타이드 억제제를 제공한다. 본 발명의 내용에서, 용어 "올리고뉴클레오타이드 억제제", "antimiR"(예를 들어, antimiR-155), "길항제", "안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 ASO", "올리고머", "anti-microRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 AMO" 또는 "믹스머(mixer)"는 광범위하게 사용되며, miRNA에 완전 또는 부분적으로 혼성화함으로써 표적 microRNA(miRNA)의 활성 또는 기능을 억제하여 표적 miRNA의 기능 또는 활성을 저해하는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 변형 리보 뉴클레오타이드, 변형 리보뉴클레오타이드 또는 이의 조합을 포함하는 올리고머를 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "miR-155"는 pri-miR-155, pre-miR-155, miR-155-5p 및 hsa-miR-155-5p를 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 11 내지 16개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 miR-155 올리고뉴클레오타이드 억제제를 제공한다. 일부 다른 실시태양에서, 본 발명은 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 miR-155 올리고뉴클레오타이드 억제제를 제공한다. 다양한 실시태양에서, miR-155를 표적으로하는 올리고뉴클레오타이드 억제제는 길이가 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 뉴클레오타이드이다. 한 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 12개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 다른 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 14개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
본 발명에 따른 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 서열은 생리학적 조건 하에서 miR-155-5p에 혼성화하고 대상의 세포에서 miR-155-5p의 활성 또는 기능을 억제하기 위해 miR-155-5p의 성숙한 서열에 충분하게 상보적이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155-5p의 성숙한 서열에 적어도 부분적으로 상보적인, 예를 들어, miR-155-5p의 성숙한 서열에 상보적인 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155-15p의 성숙한 서열에 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상보적인 miR-155-5p의 성숙한 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155-5p의 성숙한 서열에 100% 또는 완전히 상보적인 서열을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드 억제제의 서열은 올리고뉴클레오타이드 서열이 자연 발생 뉴클레오타이드 대신에 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 경우에도 miR-155에 상보적인 것으로 여겨진다. 예를 들어, miR-155의 성숙한 서열이 특정 위치에서 구아노신 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 상응하는 위치에서 잠금 시티딘 뉴클레오타이드 또는 2'-플루오로-시티딘과 같은 변형된 시티딘 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "약"은 +/- 10%, 보다 바람직하게는 +/- 5%의 변화를 포함하는데 이는 이런 변화가 본 발명을 실시하기에 적합하기 때문이다.
일부 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 전체 서열은 인간 miR-155-5p의 성숙한 서열에 완전히 상보적이다. 다양한 실시태양에서, 본 발명의 올리고 뉴클레오타이드 억제제의 서열이 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적인 인간 miR-155-5p의 성숙한 서열은 SEQ ID NO: 1의 5' 말단으로부터의 뉴클레오타이드 1-17, 또는 뉴클레오타이드 2-17 또는 뉴클레오타이드 2-16 또는 뉴클레오타이드 2-15, 또는 뉴클레오타이드 2-14, 또는 뉴클레오타이드 2-13 또는 뉴클레오타이드 2-12를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 서열이 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적인 인간 miR-155-5p의 성숙한 서열은 SEQ ID NO: 1의 5' 말단으로부터의 뉴클레오타이드 2-15를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 서열이 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적인 인간 miR-155-5p의 성숙한 서열은 SEQ ID NO: 1의 5' 말단으로부터의 뉴클레오타이드 2-13을 포함한다.
한 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트, 모르폴리노 또는 포스포노카복실레이트 인터뉴클레오타이드 결합과 같은 적어도 하나의 백본 변형을 함유한다(예를 들어, 그 전문이 참조로 본 발명에 포함되는 미국 특허 제6,693,187호 및 제7,067,641호 참조). 특정 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 완전히 포스포로티오에이트-연결이다.
한 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 함유한다. 본 발명에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 당, 염기 및/또는 백본 변형을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다. 변형된 뉴클레오타이드의 예는 잠금 뉴클레오타이드(LNA), 에틸렌 가교 뉴클레오타이드(ENA), 2'-C 가교 바이사이클릭 뉴클레오타이드(CBBN), S-cEt 또는 cEt로 불리는 2',4'-제한된 에틸 핵산 , 2'-4'-카복사이클릭 LNA 및 2' 치환된 뉴클레오타이드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
용어 "잠금 뉴클레오타이드", "잠금 핵산 유닛", "잠금 핵산 잔기"또는 "LNA 유닛"은 본 발명 전체에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있으며, 바이사이클릭 뉴 클레오시드 유사체를 의미한다. 예를 들어, 적합한 올리고뉴클레오타이드 억제제는 BSN을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 상보적인 표적 가닥 사이에 형성된 복합체에 강화된 열 안정성을 부여하는 하나 이상의 "입체 구조적으로 제한된"또는 바이사이클릭 뉴클레오시드 변형(BSN)으로 이루어질 수 있다. 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 리보스 당 모이어티가 "잠금" 형태인 2'-O, 4'-C-메틸렌 리보뉴클레오시드(구조 A)를 함유하는 잠금 뉴클레오타이드 또는 LNA를 함유한다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 적어도 하나의 2'-C, 4'-C-가교 2' 데옥시리보뉴클레오시드(구조 B)를 함유한다. 예를 들어, 전문이 참조로 본 발명에 포함되는 미국 특허 제6,403,566호 및 Wang et al. (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 9: 1147-1150 참조. 또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 구조 C로 도시된 구조를 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드를 함유한다. miR-155를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드 억제제는 BSN(LNA, 2'-C, 4'-C-가교 2' 데옥시리보뉴클레오시드 등) 또는 다른 변형된 뉴클레오타이드, 및 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
Figure 112018001323169-pct00001
본 발명에 사용된 용어 "비-LNA 뉴클레오타이드" 및 "비-LNA 변형"은 LNA 뉴클레오타이드와 다른 뉴클레오타이드를 의미하는데, 즉 이 용어는 DNA 뉴클레오타이드, RNA 뉴클레오타이드 및 변형이 LNA 변형이 아닌 것을 제외하고 염기 및/또는 당이 변형되는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시태양에서, miR-155의 올리고 뉴클레오타이드 억제제는 비-LNA 변형을 함유하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 함유한다. 예를 들어, 한 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 전문이 참조로 본 발명에 포함된 미국 예비 등록 공개공보 제2016/0010090A1호("'090 공보")에 기술된 바와 같이 적어도 하나의 2'C-가교 바이사이클릭 뉴클레오타이드(CBBN)를 함유한다. '090 공보는 2'-CBBN, 옥소CBBN, 아미노CBBN, 티오CBBN 등과 같은 다양한 CBBN 변형을 기술한다. '090 공보에 기술된 모든 CBBN 변형은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제에서 사용될 수 있다. 다른 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제에 존재하는 비-LNA 변형은 에틸렌-가교 핵산(ENA) 변형일 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 본 발명에서 에틸렌 가교 뉴클레오타이드라고도 하는 적어도 하나의 에틸렌 가교 핵산(ENA)을 함유한다. 다른 가교 결합 변형은 S-cEt 또는 cEt 및 2'-4'-카보사이클릭 LNA(카바-LNA)로 불리는 2', 4'-제한된 에틸 핵산을 포함한다.
Figure 112018001323169-pct00002
에틸렌 핵산(ENA) (S)-cEt 가교 핵산(cEt) 카바-LNA
본 발명의 내용에서 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드를 이의 상응하는 잠금 뉴클레오타이드로 치환하는 것을 언급할 때, "상응하는 잠금 뉴클레오타이드"라는 용어는 DNA/RNA 뉴클레오타이드가 그것이 대체된 DNA/RNA 뉴클레오타이드와 동일한 천연 발생 질소성 염기 또는 화학적으로 변형된 동일한 질소성 염기를 함유하는 잠금 뉴클레오타이드에 의해 대체되었다는 것을 의미한다. 예를 들어, 질소성 염기 C를 함유하는 DNA 뉴클레오타이드의 상응하는 잠금 뉴클레오타이드는 동일한 질소성 염기 C 또는 5-메틸시토신과 같은 화학적으로 변형된 동일한 질소성 염기 C를 함유할 수 있다.
특정 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 잠금 뉴클레오타이드를 함유한다. 한 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 적어도 7, 8, 9 또는 10개의 잠금 뉴클레오타이드를 함유한다. 하나의 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이다. 또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터의 첫 번째 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이다.
특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 DNA 뉴클레오타이드를 함유한다. 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 DNA 뉴클레오타이드이다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 및 네 번째 뉴클레오타이드는 DNA 뉴클레오타이드이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 염기 변형 또는 치환을 갖는 변형 된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. RNA에서 천연 또는 비 변형 염기는 푸린 염기 아데닌(A)과 구아닌(G), 피리미딘 염기 시토신(C)과 우라실(U)(DNA은 티민(T)을 가진다)이다. 헤테로사이클릭 염기 모이어티로도 불리는 변형 염기는 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로파인일 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알카인일 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(pseudouracil), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로 (5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신 포함), 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌과 같은 다른 합성 및 천연 핵산염기를 포함한다. 특정 실시태양에서, miR-155를 표적으로하는 올리고뉴클레오타이드 억제제는 염기 변형(예를 들어, 5-메틸사이토신)과 함께 하나 이상의 BSN 변형을 포함한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 변형 당 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 대표적인 변형 당은 카보사이클릭 또는 비사이클릭 당, 2', 3' 또는 4' 위치 중 하나 이상에 치환기를 갖는 당 및 당의 하나 이상의 수소 원자 대신 치환체를 갖는 당을 포함한다. 특정 실시태양에서, 당은 2' 위치에 치환기를 가짐으로써 변형된다. 추가의 실시태양에서, 당은 3' 위치에 치환기를 가짐으로써 변형된다. 다른 실시태양에서, 당은 4' 위치에 치환기를 가짐으로써 변형된다. 당이 이런 위치 중 하나 이상에서 변형을 가질 수 있거나 또는 올리고뉴클레오타이드 억제제가 하나의 위치에서 당 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드 및 상이한 위치에서 당 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다는 것도 또한 고려된다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제에서 고려되는 당 변형은 OH; F; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알켄일; O-, S- 또는 N-알카인일; 또는 O-알킬-O- 알킬로부터 선택된 치환기를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 알킬, 알켄일 및 알카인일은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알켄일 및 알카인일로 치환되거나 비치 환될 수 있다. 한 실시태양에서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O- (2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 알려짐), 즉 알콕시알콕시기를 포함한다. 다른 변형은 2'-다이메틸아미노옥시에톡시, 즉 2'-DMAOE 및 2'-다이메틸아미노에톡시에톡시(이 기술 분야에서 2'-O-다이메틸-아미노-에톡시-에틸 또는 2'-DMAEOE로 공지됨)로도 공지된 O(CH2)2ON(CH3)2기, 즉 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2를 포함한다.
추가의 당 치환기는 알릴(-CH2-CH=CH2), -O-알릴, 메톡시(-O-CH3), 아미노프로폭시(-OCH2CH2CH2NH2) 및 플루오로(F)를 포함한다. 2 '위치(2'-) 상의 당 치환기는 아라비노(위) 또는 리보(아래) 위치에 있을수 있다. 하나의 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 다른 유사한 변형이 당 모이어티 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오시드 또는 2'-5' 연결 올리고뉴클레오타이드에서 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. 특정 실시태양에서, 당 변형은 2'-O-알킬 (예를 들어, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸), 2'-할로(예를 들어, 2'-플루오로, 2'-클로로, 2'-브로모) 및 4' 티오 변형이다.
전문이 참조로 본 발명에 포함된 미국 특허 제6,838,283호에 기술된 바와 같이, 안정성을 향상시키고 효능을 향상시키는 올리고뉴클레오타이드 억제제의 다른 변형은 당해 기술분야에 공지되어 있으며 본 방법에서의 사용에 적합하다. 예를 들어, 생체 내 전달 및 안정성을 촉진하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 이의 3' 말단에서 콜레스테롤 모이어티, 비타민, 지방산, 탄수화물 또는 글리코시드, 펩타이드 또는 다른 소분자 리간드와 같은 스테로이드와 연결될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 스테로이드 (콜레스테롤)와 같은 담체 분자에 접합될 수 있다. 담체 분자는 직접 또는 링커 또는 스페이서 그룹을 통해 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 또는 5' 말단에 부착된다. 다양한 실시태양에서, 담체 분자는 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체, 콜산 또는 콜산 유도체이다. 미국 특허 제7,202,227호에 개시된 담체 분자의 사용이 또한 전문이 본 발명에 참조로 포함된다. 특정 실시태양에서, 담체 분자는 콜레스테롤이고 적어도 6개의 탄소 링커를 통해 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3'또는 5' 말단에 부착된다. 일부 실시태양에서, 담체 분자는 6개 또는 9개의 탄소 링커를 통해 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 또는 5' 말단에 부착된다. 일부 실시태양에서, 링커는 절단 가능한 링커이다. 다양한 실시태양에서, 링커는 실질적으로 선형인 탄화수소 모이어티를 포함한다. 탄화수소 모이어티는 약 3 내지 약 15개의 탄소 원자를 포함할 수 있고 에터 또는 티오에터 결합과 같은 상대적으로 비극성 그룹을 통해 콜레스테롤에 접합될 수 있다. 특정 실시태양에서, 탄화수소 링커/스페이서는 임의로 치환된 C2 내지 C15 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬(예를 들어, 알킬렌 또는 알켄일렌)을 포함한다. 전문이 본 발명에 참조로 포함된 미국 예비 등록 공개공보 제2012/0128761호에 기술된 다양한 링커/스페이서 그룹이 본 발명에 사용될 수 있다.
한 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 11 내지 16개 뉴클레오타이드의 서열을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 네 번째 뉴클레오타이드는 또한 잠금 뉴클레오타이드이다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터의 적어도 두 번째 및 네 번째 뉴클레오타이드는 DNA 뉴클레오타이드이다. 특정 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 12 또는 14개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 적어도 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 잠금 뉴클레오타이드를 함유한다. 추가의 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 여섯 번째 및/또는 여덟 번째 뉴클레오타이드는 DNA 뉴클레오타이드이다. 또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 5' 말단으로부터 두 번째, 여섯 번째 및 여덟 번째 위치에 DNA 뉴클레오타이드를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 변형 또는 비변형 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
또 다른 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 적어도 7개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 변형 또는 비변형 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
또 다른 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터의 처음 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 네 번째 및 다섯 번째 뉴클레오타이드는 변형 또는 비변형 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터의 네 번째 및/또는 다섯 번째 DNA 뉴클레오타이드는 비변형 DNA 뉴클레오타이드이다.
올리고뉴클레오타이드 억제제가 11 내지 14개 뉴클레오타이드 길이인 일부 실시태양에서, 상기 억제제는 적어도 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형 뉴클레오타이드를 함유한다. 이런 실시태양의 일부에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 7, 8, 9 또는 10개의 변형 뉴클레오타이드를 함유한다. 올리고뉴클레오타이드 억제제가 11 내지 14개 뉴클레오타이드 길이인 일부 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이다. 일부 실시태양에서, 모든 변형 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제에 존재하는 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드와 비-LNA 변형체, 예컨대 에틸렌 가교 뉴클레오타이드, 2'-C-가교 바이사이클릭 뉴클레오타이드, 2'- 치환 뉴클레오타이드 및 본 발명에 기술된 다른 당 및/또는 염기 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터의 두번째 뉴클레오타이드는 비변형 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
한 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 SEQ ID NO: 25의 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 SEQ ID NO: 22의 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함한다.
일부 다른 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 SEQ ID NOs: 33, 39, 43, 44, 47, 58, 84, 99, 111, 115 및 120으로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 포함한다 .
다양한 실시태양에서, miR-155-5p의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 표 1에서 선택된 서열을 갖는다.
SEQ ID NO. 변형이 있는 서열(5'-3') 1
SEQ ID NO: 3 5'-lAs.dTs.dCs.dAs.lCs.lGs.dAs.lTs.dTs.lAs.lGs.dCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 4 5'-lAs.dTs.dCs.dAs.lCs.lGs.dAs.dTs.lTs.lAs.lGs.dCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 5 5'-lAs.lTs.dCs.dAs.dCs.lGs.dAs.lTs.dTs.lAs.lGs.dCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 6 5'-lAs.lTs.dCs.dAs.dCs.lGs.lAs.dTs.dTs.lAs.lGs.lCs.dAs.lTs.dTs.lA-3'
SEQ ID NO: 7 5'-lAs.dTs.dCs.dAs.lCs.lGs.dAs.lTs.dTs.lAs.lGs.dCs.lAs.lTs.dTs.lA-3'
SEQ ID NO: 8 5'-lAs.lTs.dCs.dAs.lCs.dGs.dAs.dTs.lTs.lAs.dGs.lCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 9 5-lAs.dTs.dCs.dAs.lCs.dGs.lAs.dTs.lTs.lAs.dGs.lCs.lAs.dTs.lTs.lA-3
SEQ ID NO: 10 5'-lAs.dTs.dCs.lAs.dCs.dGs.lAs.lTs.dTs.lAs.lGs.dCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 11 5'-lAs.dTs.lCs.dAs.dCs.lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.dGs.lCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 12 5'-lAs.lTs.dCs.lAs.lCs.dGs.dAs.dTs.lTs.lAs.dGs.lCs.lAs.dTs.dTs.lA-3'
SEQ ID NO: 13 5'-lAs.dTs.lCs.dAs.dCs.dGs.lAs.dTs.lTs.lAs.dGs.lCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 14 5'-lAs.dTs.lCs.dAs.lCs.dGs.lAs.dTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 15 5'-lTs.dCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.dTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.dTs.lA-3'
SEQ ID NO: 16 5'-lTs.dCs.lAs.dCs.dGs.lAs.lTs.dTs.dAs.lGs.dCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 17 5'-lTs.dCs.dAs.dCs.lGs.lAs.lTs.dTs.dAs.lGs.dCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 18 5'-lTs.lCs.lAs.dCs.lGs.dAs.dTs.lTs.lAs.dGs.lCs.dAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 19 5'-lTs.dCs.dAs.lCs.dGs.dAs.dTs.lTs.lAs.lGs.lCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 20 5'-lTs.dCs.lAs.dCs.lGs.lAs.lTs.dTs.dAs.lGs.lCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 21 5'-lGs.lAs.lTs.lTs.lAs.lGs.dCs.lAs.lTs.dTs.lA-3'
SEQ ID NO: 22 5'-lCs.dGs.lAs.lTs.lTs.lAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 23 5'-lCs.dGs.lAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 24 5'-lCs.lAs.dCs.lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 25 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 26 5'-lTs.dCs.lAs.mdCs.lGs.lAs.lTs.dTs.dAs.lGs.lCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 27 5'-lTs.lAs.lGs.lCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 29 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.lAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 30 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.lAs.dTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 31 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.lAs.lGs.dCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 32 5'-dCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 33 5'-lCs.lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 34 5'-lCs.dAs.dCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 35 5'-lCs.dAs.lCs.lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 36 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.lAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 37 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.dTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 38 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.dTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 39 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.lAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 40 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.dGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 41 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.lCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 42 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.dAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 43 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 44 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.dTs.lA-3'
SEQ ID NO: 45 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.dA-3'
SEQ ID NO: 46 5'-dCs.lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 47 5'-lCs.lAs.dCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 48 5'-lCs.dAs.dCs.lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 49 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.lAs.dTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 50 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.dTs.lAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 51 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.lAs.dGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 52 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.dGs.lCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 53 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.lCs.dAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 54 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 55 5'-lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 56 5'-lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 57 5'-dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 58 5'-lAs.dCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 59 5'-lAs.lCs.lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 60 5'-lAs.lCs.dGs.lAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 61 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.dTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 62 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.dTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 63 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.lAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 64 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.dGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 65 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.lCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 66 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.dAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 67 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 68 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.dTs.lA-3'
SEQ ID NO: 69 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.dA-3'
SEQ ID NO: 70 5'-lAs.dCs.lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 71 5'-lAs.lCs.dGs.lAs.dTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 72 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 73 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.dTs.lAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 74 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.lAs.dGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 75 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.dGs.lCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 76 5'-lAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.lCs.dAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 77 5'-dCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 78 5'-lCs.lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 79 5'-lCs.dGs.lAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 80 5'-lCs.dGs.dAs.dTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 81 5'-lCs.dGs.dAs.lTs.dTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 82 5'-lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.lAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 83 5'-lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.dGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 84 5'-lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.lCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 85 5'-lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.dAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 86 5'-lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 87 5'-lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.dTs.lA-3'
SEQ ID NO: 88 5'-lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.dA-3'
SEQ ID NO: 89 5'-dCs.lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 90 5'-lCs.dGs.lAs.dTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 91 5'-lCs.dGs.dAs.lTs.dTs.lAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 92 5'-lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.lAs.dGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 93 5'-lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.dGs.lCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 94 5'-lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.lCs.dAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 95 5'-dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 96 5'-lGs.lAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 97 5'-lGs.dAs.dTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 98 5'-lGs.dAs.lTs.dTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 99 5'-lGs.dAs.lTs.lTs.lAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 100 5'-lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.dGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 101 5'-lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.lCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 102 5'-lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.dAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 103 5'-lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.dTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 104 5'-lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.dTs.lA-3'
SEQ ID NO: 105 5'-lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.dA-3'
SEQ ID NO: 106 5'-dGs.lAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 107 5'-lGs.lAs.dTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 108 5'-lGs.dAs.lTs.dTs.lAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 109 5'-lGs.dAs.lTs.lTs.lAs.dGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 110 5'-lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.dGs.lCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 111 5'-lGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.lCs.dAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 112 5'-eCs.dAs.eCs.dGs.dAs.eTs.eTs.dAs.eGs.dCs.eAs.eTs.eTs.eA-3'
SEQ ID NO: 113 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.eAs.lTs.lTs.eA-3'
SEQ ID NO: 114 5'-eCs.dAs.eCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 115 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.eGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 116 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.eTs.eTs.dAs.lGs.dCs.lAs.eTs.eTs.lA-3'
SEQ ID NO: 117 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.eTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3'
SEQ ID NO: 118 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.eTs.lA-3'
SEQ ID NO: 119 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.abAs.lTs.lTs.abA-3'
SEQ ID NO: 120 5'-abCs.dAs.abCs.dGs.dAs.abTs.abTs.dAs.abGs.dCs.abAs.abTs.abTs.abA-3'
1l = 잠금 핵산 변형; d = 데옥시리보뉴클레오타이드; s = 포스포로티오에이트 결합; md = 5-메틸사이토신; e = 에틸렌-가교 뉴클레오타이드(ENA); ab = 아미노-2'-C-가교 바이사이클릭 뉴클레오타이드(CBBN).
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 대상에게 투여하면 대상의 세포에서 miR-155의 활성 또는 기능이 감소되거나 억제된다. 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 암세포에서 miR-155의 활성 또는 기능을 억제하며, 면역계의 세포는 B 및 T 림프구, 단핵구, 대식세포, 소교세포, NK 세포 및 염증 세포를 포함한다. 한 실시태양에서, 암세포는 악성 T 세포이다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제로 치료할 수 있는 악성 T 세포는 피부 T 세포 림프종(CTCL) 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, αβT 세포, γδT 세포 및 기억 T 세포를 포함한다. 한 실시 양태에서, 악성 T 세포는 피부 T 세포 림프종 (CTCL) 세포이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 특정 올리고뉴클레오타이드 억제제는 다른 miR-155 억제제와 비교하여 악성 T 세포와 같은 암 세포에서 miR-155의 활성 또는 기능의 더 큰 억제를 나타낼 수 있다. 용어 "다른 miR-155 억제제"는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, antimiR, antagomiR, 믹서, 갭머, 앱타머, 리보자임, 소형 간섭 RNA 또는 소형 헤어핀 RNA와 같은 핵산 억제제; 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및/또는 miR-155의 활성 또는 기능을 억제하는 약물을 포함한다. 본 발명의 특정 올리고뉴클레오타이드 억제제가 본 발명의 다른 올리고뉴클레오타이드 억제제와 비교하여 악성 T 세포와 같은 암 세포에서 miR-155의 더 큰 억제를 나타낼 수 있음이 가능하다. 본 발명에 사용된 용어 "더 큰(greater)"은 양적으로 더 많거나 통계적으로 유의하게 더 많은 것을 의미한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여는 대상의 세포에서 miR-155 표적 유전자의 발현 또는 활성을 상향 조절한다. miR-155에 대한 표적 유전자는 INPP50/SHIP1, Jarid2, Picalm, Bach1, Wee1, CUX1, Cebpb, SPIB/PU.1 및 IL7R을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 암 세포에서 miR-155의 적어도 4개의 표적 유전자의 발현 또는 활성을 상향 조절하며, 면역계의 세포는 B 및 T 림프구, 단핵구, 대식세포, 소교세포, NK 세포 및 염증 세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제에 의해 상향 조절된 4개의 표적 유전자는 Bach1, Jarid2, Picalm 및 SHIP1을 포함한다. 본 발명은 miR-155 억제제의 활성을 측정하는 수단으로서 이들 4개 유전자(유전자 발현 시그니처)의 발현에 변화를 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여시 miR-155 표적 유전자의 발현 또는 활성에 그 사이의 값을 포함하는 약 1.25배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배 또는 8배 변화가 존재한다. 한 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여시 miR-155 표적 유전자의 발현 또는 활성에 그 사이의 값을 포함하는 적어도 약 2배, 3배, 4배 또는 5배 변화가 존재한다.
한 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 다른 miR-155 억제제와 비교하여 악성 T 세포와 같은 암 세포에서 miR-155 표적 유전자의 더 큰 상향 조절을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 다른 miR-155 억제제와 비교하여 암 세포에서 miR-155의 적어도 4개의 표적 유전자의 더 큰 상향 조절을 나타낸다. 한 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 다른 miR-155 억제제와 비교하여 암세포에서 4개 유전자, 즉 Bach1, Jarid2, Picalm 및 SHIP1의 발현 또는 활성의 더 큰 상향 조절을 나타낸다. 다양한 실시태양에서, "더 큰 상향 조절"은 다른 miR-155 표적 유전자와 비교하여 miR-155 표적 유전자의 발현 또는 활성에 그 사이 값을 포함하는 약 2배, 3배, 4배 또는 5배 증가를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 피부 T 세포 림프종(CTCL) 세포를 포함하는 악성 T 세포와 같은 암세포의 증식을 감소 또는 억제 및/또는 암세포의 세포사멸을 유도한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여는 암 세포의 수에 그 사이 값을 포함하는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 까지의 감소를 제공할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 암 세포의 수에 그 사이 값을 포함하는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 감소를 제공할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 다른 miR-155 억제제와 비교하여 암세포의 증식의 더 큰 억제 및/또는 암세포의 더 큰 세포자멸사의 더 큰 유도를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 다른 miR-155 억제와 비교하여 암 세포의 수에 그 사이 값을 포함하는 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 까지의 감소를 나타낼 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 이를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. miR-155의 활성 또는 기능은 올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여 후 대상의 암 세포에서 감소된다.
한 실시태양에서, 암을 치료하는 방법은 11 내지 16개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
다른 실시태양에서, 암을 치료하는 방법은 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
다른 실시태양에서, 암을 치료하는 방법은 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 적어도 7개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
또 다른 실시태양에서, 암을 치료하는 방법은 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터의 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 네 번째 및 다섯 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 암은 피부 T 세포 림프종(CTCL) 및 B 세포 림프종 및 피부암과 같은 T 세포 림프종을 포함하는 림프종을 포함한다. 특정 실시태양에서, 암을 치료하는 방법은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 및 SEQ ID NO: 25로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 다른 실시태양에서, 암을 치료하는 방법은 SEQ ID NO: 33, 39, 43, 44, 47, 58, 84, 99, 111, 115 및 120으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 대상에게 투여함으로써 CTCL의 균상 식육종(MF) 형태를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, CTCL의 MF 형태를 치료하는 방법은 11 내지 16개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 CTCL의 균상 식육종(MF)을 치료하는 방법을 제공하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 CTCL의 균상 식육종(MF)을 치료하는 방법을 제공하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 적어도 7개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 CTCL의 균상 식육종(MF)을 치료하는 방법을 제공하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 네 번째 및 다섯 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
특정 실시태양에서, CTCL의 MF 형태를 치료하는 방법은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 및 SEQ ID NO: 25로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 다른 실시태양에서, CTCL의 MF 형태를 치료하는 방법은 SEQ ID NO: 33, 39, 43, 44, 47, 58, 84, 99, 111, 115 및 120으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 제 2 치료제와 조합하여 본 발명에 따른 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 CTCL을 치료하는 방법을 포함한다. CTCL의 현재 치료법은 국소 스테로이드, 국소 질소 머스타드(메클로르에타민 HCL), 국소 레티노이드, 광선요법, 자외선 치료, 소라른 자외선 치료, 방사선 요법, 전자빔 요법 등과 같은 피부 관련 요법 및 히스톤데아세틸라아제(HDAC) 억제제, 레티노이드(벡사로틴), 인터페론 및 저용량 항산화제(예를 들어, 메토트렉세이트 및 프랄라트렉세이트)의 투여와 같은 전신 요법을 포함한다. 항-CD30 항체(예를 들어, 브렌툭시맙), 항-CCR4 항체(예를 들어, 모가물리즈맙) 및 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체와 같은 추가적인 치료 옵션이 현재 테스트 중이다. 제 2 치료제는 일반적으로 이들 치료법 중 하나로부터 선택된 약제 또는 치료제를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 HDAC 억제제, 레티노이드, 인터페론, 항폴린산산제, 국소 스테로이드, 국소 레티노이드, 국소 질소 머스타드, 광선요법, 자와선광, 소라른 및 자외선광, 방사선 요법, 전자빔 요법, 항-CD30 항체(예를 들어, 브렌툭시맙), 항-CCR4 항체(예를 들어, 모가물리주맙) 및 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체에 의한 치료법와 같은 제 2 치료제와 조합하여 miR-155의 올리고 뉴클레오타이드 억제제를 투여함으로써 CTCL을 치료하는 방법을 포함한다.
다양한 HDAC 억제제가 공지되어 있으며, 이들 중 일부는 임상 용도로 FDA에 의해 승인되고 일부는 임상 시험 중이다. 본 발명에 따른 암을 치료하기 위한 방법은 보리노스타트, 로미뎁신, 파노비노스타트(LBH589), 모세티노스타트, 벨리노스타트(PXD101), 아벡시노스타트, CI-994(타세디날린) 및 MS-275(엔티노스타트)를 포함하나 이에 제한되지 않는 HDAC 억제제의 사용을 포함한다. 제 2 치료제/제제가 포함되는 실시태양에서, 제 2 치료제/제제는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여 전후에 상이한 시간에 투여될 수 있다. 선행 투여는, 예를 들어, 제 2 약제 투여 전에 약 1주 내지 최대 30분 범위 내의 제 1 약제의 투여를 포함한다. 선행 투여는 또한, 예를 들어, 제 2 약제 투여 전에 약 2주 내지 최대 30분 범위 내의 제 1 약제의 투여를 포함할 수 있다. 이후 또는 나중의 투여는, 예를 들어, 제 1 약제 투여 후 약 1주 내지 최대 30분 범위 내의 제 2 약제 투여를 포함한다. 이후 또는 나중의 투여는, 예를 들어, 제 1 약제 투여 후 약 2주 내지 최대 30분 범위 내의 제 2 약제 투여를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 11 내지 16개의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여함으로써 암세포, 특히 악성 T 세포의 증식을 감소 또는 억제하는 방법을 제공하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암 세포, 특히 악성 T 세포의 증식을 감소 또는 억제하는 방법을 제공하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암 세포, 특히 악성 T 세포의 증식을 감소 또는 억제하는 방법을 제공하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 적어도 7개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암 세포, 특히 악성 T 세포의 증식을 감소 또는 억제하는 방법을 제공하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 네 번째 및 다섯 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
특정 실시태양에서, 암세포, 특히 악성 T 세포의 증식을 감소 또는 억제하는 방법은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 및 SEQ ID NO: 25로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 다른 실시태양에서, 암세포, 특히 악성 T 세포의 증식을 감소 또는 억제하는 방법은 SEQ ID NO: 33, 39, 43, 44, 47, 58, 84, 99, 111, 115 및 120으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.
악성 T 세포는 피부 T 세포 림프종(CTCL) 세포, CD4+ T 세포 및 기억 T 세포를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여는 투여 후 악성 T 세포에서 miR-155의 활성 또는 기능을 감소 및/또는 miR-155의 하나 이상의 표적 유전자를 상향 조절한다. 암세포의 증식을 감소 또는 억제하기 위한 방법은 또한 본 올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여와 함께 상기 제 2 치료제/제제의 사용을 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명에 포함되는 방법은 환자의 피부 병변 당 18.75, 37.5 또는 75mg의 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 환자에게 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 그 사이 값을 포함하는 총 약 37.5, 75, 150, 300, 600, 900 또는 1200mg을 전신 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 환자에게 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 그 사이 값을 포함하는 총 약 350, 700, 1050, 1400, 1750, 2100, 2450, 2800, 3150 또는 3500mg을 전신 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 대상에 대한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여는 암과 관련된 하나 이상의 증상 또는 병인의 개선을 초래한다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 단독으로 또는 HDAC 억제제와 같은 제 2 치료제와 조합한 본 발명의 올리고 뉴클레오타이드 억제제의 투여는 피부 병변의 수를 감소시키며; 피부에 붉고 가려운 패치 또는 플라크의 수; 및/또는 CTCL과 관련된 새로운 피부 병변/패치 /플라크의 형성을 감소시킨다. 한 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제 단독으로 또는 HDAC 억제제와 같은 제 2 치료제와 조합한 투여는 악성 T 림프구가 피부로 이동하는 것을 감소시키거나 억제한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고 뉴클레오타이드 억제제 단독으로 또는 제 2 치료제와 조합한 투여는 피부의 전체 악성 T 림프구를 감소시킨다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고 뉴클레오타이드 억제제 단독으로 또는 제 2 치료제와 조합한 투여는 피부에서 빠져 나가거나 주변으로 이동할 수 있는 악성 T 세포의 수를 감소시킨다.
본 발명에 사용된 용어 "대상" 또는 "환자"는 인간 및 다른 영장류(예를 들어, 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소 및 말), 가정용 포유류 (예를 들어, 개 및 고양이), 실험용 동물(예를 들어, 생쥐, 쥐 및 기니피그 등의 설치류) 및 조류(예를 들어, 닭, 칠면조 및 다른 가금류, 오리, 오리, 거위 등과 같은 가정용, 야생용 및 경기용 조류)를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 척추동물을 의미한다. 일부 실시태양에서, 대상은 포유동물이다. 다른 실시태양에서, 대상은 인간이다.
본 발명에 기술된 miR-155의 임의의 뉴클레오타이드 억제제는 세포에 miR-155 뉴클레오타이드 억제제를 암호화하는 발현 벡터를 전달함으로써 표적 세포(예를 들어, 악성 T 세포)에 전달될 수 있다. "벡터"는 관심 핵산을 세포의 내부로 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오타이드, 이온성 또는 친양쪽성 화합물과 연관된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하지만 여기에 제한되지 않는 여러 벡터가 당업계에 알려져 있다. 따라서 용어 "벡터"는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 바이러스성 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나 여기에 제한되지 않는다. 발현 구조체(expression construct)는 살아있는 세포(living cell)에서 복제되거나 또는 합성적으로 만들어질 수 있다. 본 출원의 목적을 위하여, 용어 "발현 구조체", "발현 벡터", 및 "벡터"라는 용어는 일반적이고, 설명적인 의미에서 본 발명의 출원을 설명하기 위해 상호 교환적으로 사용되며 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
한 실시태양에서, miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 발현하기 위한 발현 벡터는 올리고뉴클레오타이드 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 본 발명에서 사용된 "작동가능하게 연결된(operably linked)" 또는 "전사 조절 하에서(under transcriptional control)"라는 문구는 프로모터가 RNA 중합효소 및 폴리뉴클레오타이드의 발현에 의해 전사의 개시를 제어하기 위해 폴리뉴클레오타이드에 대한 관계에서 정확한 위치와 방향에 있다는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "프로모터"는 세포의 합성 기관(synthetic machinery) 또는 유전자의 특정 전사를 시작하기에 필요한 유도된 합성 기관(induced synthetic machinery)에 의해 인식된 DNA 서열을 의미한다. 적합한 프로모터는 RNA 중합효소I(polI), RNA 중합효소II(polII), RNA 중합효소III(polIII), 및 바이러스성 프로모터(viral promoter)(예를 들어, 인간 세포거대바이러스 즉각 조기 유전자 프로모터(human cytomegalovirus (CMV) immediate early gene promoter), SV40 초기 프로모터(SV40 early promoter), 및 라우스육종바이러스 긴말단 반복(the Rous sarcoma virus long terminal repeat)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 한 실시태양에서, 프로모터는 lck 유전자의 근위 및 원위 프로모터 또는 CD4 유전자의 프로모터 및 인핸서 서열과 같은 T-세포 특이적 프로모터이다.
특정 실시태양에서, miR-155 올리고뉴클레오타이드 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터는 당업계에 공지되어 있으며 테트라사이클린 프로모터(tetracycline promoter), 메탈로티오네인 IIA 프로모터(metallothionein IIA promoter), 열충격 프로모터(heat shock promoter), 스테로이드/갑상선호르몬/레티노산 반응 요소(steroid/thyroid hormone/retinoic acid response elements), 아데노바이러스 후기 프로모터(the adenovirus late promoter), 및 유도성 생쥐 유방 종양 바이러스 LTR(the inducible mouse mammary tumor virus LTR)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
발현 구조체와 핵산을 세포에 전달하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 인산칼슘 공동 침전, 전기천공법, 미세주사, DEAE-덱스트란, 리포펙션, 폴리아민 형질감염 시약을 사용하는 형질감염, 세포 초음파, 고속 미세추진체를 사용하는 유전자 충돌 및 수용체-매개 형질감염을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 CTCL을 진단하는 방법 및 CTCL의 치료를 받는 환자의 임상 상태를 모니터링하는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 antimiR-55 화합물의 투여가 대조군-치료된 세포 또는 세자리 증후군 세포과 비교하여 3개의 모든 MF 세포주(HuT102, MJ 및 MyLa)에서 고유한 유전자 세트를 상향 조절 및/또는 하향 조절한다는 것을 나타낸다. 본 발명은 miR-155 억제제에 의한 CTCL 치료의 진행을 모니터 할뿐만 아니라 CTCL의 MF 아형을 진단하기 위해 이 독특한 유전자 세트에 기초한 유전자 발현 시그니처를 사용하는 것을 고려한다. 예를 들어, 본 발명은 표 2에 열거된 유전자 세트가 본 발명의 antimiR-155 화합물에 반응하여 3개의 모든 MF 세포주에서 상향 조절되거나 하향 조절된다는 것을 보여준다. 한 실시태양에서, 본 발명은 CTCL로 고생하는 것으로 의심되는 대상에서 표 2에 열거된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하고, 발현 수준을 기준 수준(예를 들어, 건강한 대상 또는 CTCL 대상의 비-암세포에서의 발현 수준)과 비교하고, 대상의 발현 수준이 기준 수준에 비해 하향 조절되거나 상향 조절되는 경우 대상이 CTCL을 갖는 것으로 진단함으로써 CTCL을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 antimiR-155 화합물에 반응하여 3개의 모든 MF 세포주에서 현저하게 상향 조절되거나 하향 조절된 유전자 목록
CFLAR GALC SMARCA2 HIF1A FSD1L CLINT1
CIAPIN1 TAB2 OSTM1 CCNB1IP1 TLE4 SUB1
GCFC2 TRAF1 UBA5 BRMS1L GATA3 ST8SIA4
LAMP2 RC3H2 APLP2 TM9SF1 OBFC1 GNPDA1
KDM7A PITHD1 SCAMP1 NELFCD DNAJC12 H2AFY
GGCT SLC2A3 WDFY1 PRPF6 TSPAN14 SMAD5
JARID2 ASUN DIMT1 TCFL5 RAD51C CSNK1A1
MBTD1 IPO5 SEPHS1 AHCY DHX40 NIT2
COX15 DGKA ZFAND6 DNTTIP1 RPS6KB1 KPNA1
ZMYND11 FAM107B UIMC1 TIMP1 PIGL TUSC2
ZDHHC6 TRMT11 GMCL1 NDFIP2 CPD NCBP2
BIRC3 SP100 KLHL42 SLC25A15 PEX12 HEMK1
DEPDC1 TRAM1 DNM1L ARL2BP RAB5C MAPKAPK3
NR1H3 CBFB TGDS HSDL1 MLX COMMD2
TBPL1 TGFBR3 FKBP1A USP10 UNC119 ACTR1B
PIAS1 GBA2 TRMT6 TSC2 TMEM33 GTF3C2
TBC1D23 HLTF PEBP1 EIF3J CLCN3 GCA
GOPC MPP5 GANAB OIP5 GALNT7 STAT1
VAMP3 PDE8A MAEA BLOC1S6 KLHL5 MOB4
HOMER3 PTGS2 GLG1 NCALD ZPR1 GORASP2
AKR7A2 PICALM pk TSTA3 HIPK3 SLC1A4
AP5M1 NUAK1 GEMIN2 ASAH1 SLC35F2 NFE2L2
KIF1B DPP8 RFFL RELB ELK3 PLEKHA3
FAM168A SRI CDC7 FAM32A VPS29 EDEM3
FOXO3 TUBA3D ERMP1 TBCB COPS7A CD58
UCHL3 EXOSC7 HSD17B7P2 PRKD2 BTN3A3 WARS2
ITGB1BP1 TPD52 CIRBP CDC37 ASF1A SLAMF1
CPSF3 TOP2B MAPK1 ARRDC2 STK38 SSX2IP
TRIM32 TM9SF3 MFNG NAMPT MRPL18 NENF
PPP6C UBE2T KIAA0930 WDR91 ALDH5A1 RCN2
HSDL2 DYNC1I2 CSF2RB GARS ACOT13 CTSD
VPS4B UBE2K SDR39U1 RPA3 GMNN KMT2A
RBM25 C12orf5 CNIH1 GLCCI1 TRIM38 PLAGL1
SLC17A5 KEAP1 TIMM9 PSMA2 PHACTR2 MYB
TAF12 RAB21 CEP128 RHEB KIF20A TMEM5
HSPH1 RBCK1 IMPA1 FAM8A1 ATG12 MSI2
DUSP4 RRBP1 RRAS2 SDCBP DDX46 ZUFSP
NAA50 PDCD2L SARAF FXYD2 G3BP1 PITPNC1
CD80 RAP1B ARL8B TUBGCP4 FARS2 FAM69A
LRIF1 SMARCA4 NAPG ADAM10 MUT BTG3
FYTTD1 TST NARS HADHB DYNLT1 XPC
ACOT9 CALU CCNH ATAD1 WTAP ATP6V1C1
CDK2 MTX2 DDB2 ABI2 C7orf55-LUC7L2 SAMSN1
FAM199X GAD1 ETS1 BMP2K SH3KBP1 SLC26A2
LPGAT1 SNRPN RFK FAM60A TERF1 DCK
FAM210B PSMG2 UBQLN1 ZCRB1 AUH BACH1
SDC4 EIF2AK4 ANXA1 COMMD4 STOM SFXN2
CSE1L CALML4 HILPDA SCAPER POLE3 EEF1A1
TMEM189-UBE2V1 PSMA1 TES FANCI GLUD1 WDYHV1
STAU1 DCTD MAP3K7 TXNL4B ADD3 BUB1B
XPO5 CDKN2D PRADC1 RANBP10 BTBD10 GATAD1
OARD1 PARP2 NTPCR RPRD1A SSRP1 PINK1
GLO1 ARHGEF6 TAF5L ITGB3BP CELF1 RAPGEF6
RIOK1 ZSWIM6 SP110 CTTNBP2NL TMEM138 MRPL10
SLC35B3 ATXN10 MRPS9 PSMA5 EI24 CCDC117
ATXN1 UBE2M VPS36 ALDH9A1 PDCD4 GNE
RAP2A LRRC47 BORA CREG1 ITPR1 CALM3
CLPP COX7B PHF11 RGL1 TMEM263 TMPRSS3
ATP1A1 SH3BP5 NUDT15 PYCR2 TWF1 SQSTM1
PRKCI NDFIP1 IL6 CHAC2 SRFBP1 CYB561A3
AIM2 VIMP TTC5 CIAO1 GUF1 EXTL2
EIF5A2 CHSY1 VEZF1 TPRKB TMEM123 DENND2D
SNHG16 ACTR10 RPS6KC1 RALB GPD1L IER5
COX18 DNAJB1 C9orf78 ZC3H8 PELO BPNT1
GYG1 TBC1D14 STX17 KIAA1715 CENPH TYW5
ZMYM6 HRSP12 ATP6V1G1 SUMF1 ANAPC1 H3F3A
TKT SYT11 ENPP2 FAM134A CETN3 RNF149
ZNF691 SERINC3 APTX ARL6IP5 RASSF3 CDC42EP3
METAP1 RFXAP TCF19 KLHL8 RPIA S100A11
RNF123 CSNK1G2 FLOT1 TBCK ARFIP1 CCNYL1
ABCE1 BAG5 TBCA PRKRA YRDC CCPG1
MOCS2 WBP1L RNASEH1 SLC26A11 C6orf106 NUDCD2
WDR41 AKIP1 PRNP FRAT2 SLC39A10 CHCHD7
GRPEL2 ATMIN ZNF217 YIPF6 WDR45 AC093323.3
SLC35A1 TMEM41B KRCC1 C5orf24 GMFB FEZ2
CAMLG WEE1 MRPL13 DEXI IGF2R PPID
HEY1 AP1G1 ISG20 P2RY8 PSMD12 SEPW1
CTSB FAM96A RASGRP1 C8orf33 FAR1 TMTC2
RAD21 TMEM194A MIR4435-1HG ADI1 MRPL42 TCAIM
C7orf55 HDHD2 TADA2B ANXA2 TUBA3C PACS2
YWHAZ GPX4 NOC3L SRPR MAK16 SEPHS2
KIAA0196 TSR1 SSSCA1 DAZAP2 TCAF1 FAM72B
NFIL3 FTH1 CXorf23 BCOR TXNRD1 ARID2
GKAP1 RAB4A RBM4B TMEM186 STK39 BLOC1S2
MID1IP1 DDIT4 FBXO45 RAD51D GRK5 ACADSB
PMPCA IRF2BP2 DENND4A SDHAP1 PRC1 SUPT3H
HPRT1 BMI1 AKIRIN1 BRWD1 C1orf174 ATXN1L
TRUB1 ARF4 KIAA1551 MORF4L1 COX20 RP11-175O19.4
FRAT1 CMAHP SRP72 LAMP1 MICB MCTS1
PTPLA POLR3D DENND6A BICD2 TRIM27 AC093673.5
ARL5B STAT3 PDE12 POLR1D ZBTB10 LINC00657
IKBIP LDLRAD4 YIF1A MKL2 LIN52 HNRNPA3
ASH1L-AS1 SNTB2 CCNE2 TAF9B DNAJC19 NT5DC1
PLGLA MAP2K1 RAB6A SECISBP2 ANKRD28 DCUN1D3
AP001258.4 CSNK1G1 CDC26 SEMA4D SACM1L KANSL1-AS1
CCDC71L NMD3 EID2 ZFP69B TSN PTGER4
OTUD6B-AS1 CRADD DNAJC30 EIF4EBP1 ARHGAP19 IARS
CUX1 ARL13B RPS6KA3 TPRG1 IRF9
추가의 실시태양에서, 본 발명은 대상의 CTCL 세포에서 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계, 여기서 하나 이상의 유전자는 모든 MF 세포에서 조절되는 유전자, 예를 들어, 표 2로부터 선택된다; 대상의 CTCL 세포에서 하나 이상의 유전자의 수준을 하나 이상의 유전자의 기준 수준과 비교하는 단계; 및 CTCL의 치료를 위해 기준 수준과 비교하여 CTCL 세포에서 하나 이상의 유전자의 수준의 증가 또는 감소를 갖는 대상을 선별하는 단계를 포함하여, CTCL 치료를 위한 대상을 선택하는 방법을 제공한다. 다른 실시 양태에서, CTCL 치료를 위한 대상을 선택하는 방법은 INPP50/SHIP1, Jarid2, Picalm, Bach1, Wee1, CUX1, Cebpb, SPIB/PU.1, 및 IL7R로 이루어진 그룹에서 선택된 4개 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계; 대상의 CTCL 세포에서 4개 이상의 유전자의 수준을 4개 이상의 유전자의 기준 수준과 비교하는 단계; 및 CTCL 치료에 대한 기준 수준과 비교하여CTCL 세포에서 4개 이상의 유전자의 수준이 감소된 대상을 선택하는 단계를 포함한다. 한 실시태양에서, CTCL 치료를 위한 대상을 선택하는 방법은 4개 유전자의 기준 수준과 비교하여 대상의 CTCL 세포에서 4개 유전자 Bach1, Jarid2, Picalm 및 SHIP1의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, CTCL의 치료를 위한 대상을 선택하는 방법은 4개 유전자의 기준 수준과 비교하여 대상의 CTCL 세포에서 4개 유전자, Bach1, Jarid2, Picalm 및 SHIP1의 수준을 결정하는 단계; 및 CTCL 치료에 대한 기준 수준과 비교하여CTCL 세포에서 4개 이상의 유전자의 수준이 적어도 2배 감소된 대상을 선택하는 단계를 포함한다. 한 실시태양에서, 기준 수준은 대조군 올리고뉴클레오타이드-치료된 세포에서 동일한 유전자의 발현 수준이다. 다른 실시태양에서, 기준 수준은 세자리 증후군 세포에서 동일한 유전자의 발현 수준이다. 또 다른 실시태양에서, 기준 수준은 건강한 대상(예를 들어, 피부암의 2 이상의 증상을 나타내지 않는 대상, 피부 암으로 진단되지 않은 대상 및/또는 피부암의 가족력이 없는 대상)에서 동일한 유전자의 발현 수준이다.
본 발명은 또한 antimiR-155 화합물로 치료하기 전에 대상의 세포에서 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계, 여기서 하나 이상의 유전자는 모든 MF 세포에서 조절되는 유전자, 예를 들어, 표 2로부터 선택된다; antimiR-155 화합물로 치료한 후 대상의 세포에서 동일한 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계; 및 치료 전후의 발현 수준에 기초하여 유효, 비효율적 또는 유효하지 않은 치료를 결정하는 단계를 포함하여 antimiR-155 화합물에 의한 치료의 효능을 평가하는 방법을 제공한다. 즉, 한 실시태양에서, 표 2에 열거된 유전자는 antimiR-155 치료의 임상 효능을 위한 바이오 마커로서 작용한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 기준 수준와 비교하여 CTCL로 고생하는 것으로 의심되는 대상에서 miR-155의 수준을 측정함으로써 CTCL을 진단하는 방법을 제공하며, 대상에서 miR-155의 높은 발현은 대상이 CTCL로 고통 받고 있다는 것을 나타낸다. CTCL로 고생하는 것으로 의심되는 대상에서 miR-155의 발현 수준은 대상의 피부 병변, 혈장, 혈청, 백혈구 또는 PBMC로부터 분리된 세포를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 기준 수준과 비교하여 대상에서 miR-155의 수준을 측정함으로써 CTCL의 균상 식육종 형태를 진단하는 방법을 제공하며, 대상에서 miR-155의 높은 발현은 대상이 CTCL의 MF 형태로 고통 받고 있다는 것을 나타낸다. 일부 다른 실시태양에서, 본 발명은 miR-155의 기준 수준과 비교하여 치료를받는 대상에서 miR-155의 발현 수준을 결정함으로써 antimiR-155 치료에 대한 반응을 평가하는 방법을 제공한다. 기준 수준은 건강한 대상의 miR-155 수준 또는 건강한 대상의 miR-155 평균 또는 중간 수준 또는 세자리 증후군이 있는 대상의 miR-155 수준일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 개시된 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 한 실시태양에서, 약학적 조성물은 11 내지 16개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 유효량의 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
다른 실시태양에서, 약학적 조성물은 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 유효량의 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터 적어도 처음 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
다른 실시태양에서, 약학적 조성물은 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 유효량의 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 적어도 7개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 두 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
또 다른 실시태양에서, 약학적 조성물은 11 내지 14개 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 유효량의 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 억제제는 miR-155의 성숙한 서열에 완전히 상보적이고 완전한 포스포로티오에이트 백본을 가지며; 상기 올리고뉴클레오타이드 억제제의 3' 말단으로부터의 처음 3개의 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고 올리고뉴클레오타이드 억제제의 5' 말단으로부터 적어도 네 번째 및 다섯 번째 뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 뉴클레오타이드이다.
특정 실시태양에서, 약학적 조성물은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 및 SEQ ID NO: 25로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 갖는 유효량의 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 포함한다. 일부 다른 실시태양에서, 약학적 조성물은 SEQ ID NO: 33, 39, 43, 44, 47, 58, 84, 99, 111, 115 및 120으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 갖는 유효량의 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학적 조성물은 표 1에 열거된 서열로부터 선택된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
"유효량"은 유익한 또는 원하는 임상 결과를 얻기에 충분한 양이다. 본 발명의 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 유효량은 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 2.5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg 또는 약 5 mg/kg 내지 약 25 mg/kg일 수 있다. 일부 실시태양에서, 유효량은 환자의 피부 병변당 약 18.75, 37.5, 또는 75 mg일 수 있다. 유효량으로 생각될 양의 정확한 결정은 크기, 연령, 장애 유형 및 억제제의 형태(예를 들어, 네이키드 올리고뉴클레오타이드, 또는 발현 구조체 등)을 포함하여 각 환자에게 개별적인 요인에 기반할 수 있다. 따라서, 투여량은 본 발명 및 당업계의 지식으로부터 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 억제제와 조합된 HDAC 억제제의 사용을 고려한다. HDAC 억제제가 포함된 실시태양에서, HDAC 억제제는 동시에 투여되지만 별도의 제형으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 다른 실시태양에서, HDAC 억제제는 miR-155 억제제 투여 전후에 상이한 시간에 투여될 수 있다. 임상 적용이 고려되는 경우, 약학적 조성물은 의도된 용도에 적합한 형태로 제조될 것이다. 일반적으로, 이것은 발열원뿐만 아니라 인간 또는 동물에게 해를 줄 수 있는 다른 불순물이 본질적으로 없는 조성물의 제조를 수반할 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제 및 하나 이상의 화장용 또는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 국소 조성물을 제공한다. 본 발명에 사용된 용어 "화장용으로 허용되는"은 담체 또는 부형제가 과도한 독성, 비혼용성, 불안정성, 자극, 알레르기성 반응 등이 없이 조직(예를 들어, 피부)과의 접촉에 사용하기에 적합하다는 것을 의미한다.
화장품 또는 약학적 담체 또는 부형제는 물 및 땅콩 오일, 콩 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등과 같은 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 유래의 것을 포함하는 오일과 같은 액체일 수 있다. 국소 조성물은 종종 수중유 또는 유중수 에멀젼을 포함한다. 본 발명은 antimiR-155 화합물의 국소 조성물을 제조하는데 이런 에멀젼을 사용하는 것을 포함한다. 적합한 약학적 담체는 E. W. Martin의 "Remington 's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다. 적합한 화장용 담체는 아래 기술된다.
한 실시태양에서, 화장용으로 허용 가능한 국소용 담체는 조성물의 약 50중량% 내지 약 99.99중량%(예를 들어, 조성물의 약 80중량% 내지 약 99중량%)이다. 국소 조성물은 용액, 로션, 크림, 젤, 스틱, 스프레이, 연고, 세정액, 솔리드 바, 샴푸, 페이스트, 폼, 분말, 무스, 면도 크림, 와이프, 패치, 네일 락커, 상체 드레싱, 접착 밴드, 하이드로겔 및 필름을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 제품 유형은 용액, 에멀젼(예를 들어, 마이크로에멀젼 및 나노에멀젼), 겔, 고체 및 리포솜을 포함하나 이에 제한되지 않는 화장용으로 허용 가능한 몇 가지 유형의 국소 담체를 포함할 수 있다. 이러한 담체의 특정 비 제한적인 예는 이하에 기술된다. 다른 적합한 담체가 당업자에 의해 제제화될 수 있다.
본 발명에서 유용한 국소 조성물은 피부 연화제를 포함하는 용액으로서 제제화될 수있다. 이러한 조성물은 바람직하게는 약 1% 내지 약 50%의 연화제를 함유한다. 본 발명에서 사용된 "연화제"라는 용어는 피부의 보호뿐만 아니라 건조의 예방 또는 경감에 사용되는 물질을 의미한다. 다수의 적합한 연화제가 공지되어 있으며 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2 판, Vol. 1, pp. 32-43 (1972) 및 International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, eds. Wenninger and McEwen, pp 1656-61, 1626 및 1654-55(The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Assoc., Washington, D.C., 7th Edition, 1997) (이하에서 "ICI Handbook")은 적절한 재료의 많은 예를 포함한다.
로션은 이러한 용액으로부터 제조될 수 있다. 로션은 전형적으로 약 1% 내지 약 20%(예를 들어, 약 5% 내지 약 10%)의 연화제 및 약 50% 내지 약 90%(예를 들어, 약 60% 내지 약 80%)의 물을 포함한다.
용액으로부터 제제화될 수 있는 다른 형태의 제품은 크림이다. 크림은 전형적으로 물의 약 5% 내지 약 50%(예를 들어, 약 10% 내지 약 20%)의 연화제 및 약 45% 내지 약 85%(예를 들어, 약 50% 내지 약 75%)의 물을 포함한다.
용액으로부터 제제화될 수 있는 또 다른 유형의 생성물은 연고이다. 연고는 동물성 또는 식물성 오일 또는 반고체 탄화수소의 간단한 기재를 포함할 수 있다. 연고는 약 2% 내지 약 10%의 연화제 + 약 0.1% 내지 약 2%의 증점제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 증점제 또는 점도 증가제의 보다 완벽한 개시는 Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, Vol. 1, pp. 72-73 (1972) 및 ICI Handbook, pp. 1693-1697에서 발견될 수 있다.
본 발명에서 유용한 국소 조성물은 에멀젼로서 제제화될 수 있다. 담체가 에멀젼인 경우, 담체의 약 1% 내지 약 10%(예를 들어, 약 2% 내지 약 5%)는 유화제를 포함한다. 유화제는 비이온성, 음이온성 또는 양이온성일 수 있다. 적합한 유화제는, 예를 들어 McCutcheon 's Detergents and Emulsifiers, North American Edition, pp. 317-324 (1986) 및 ICI Handbook, pp.1673-1686에 개시되어있다.
로션 및 크림은 에멀젼으로서 제제화될 수 있다. 전형적으로, 이런 로션은 0.5% 내지 약 5%의 유화제를 포함한다. 이러한 크림은 전형적으로 약 1% 내지 약 20%(예를 들어, 약 5% 내지 약 10%)의 연화제; 약 20% 내지 약 80%(예를 들어, 30% 내지 약 70%)의 물; 및 약 1% 내지 약 10%(예를 들어, 약 2% 내지 약 5%)의 유화제를 포함할 것이다.
수중유 타입 및 유중수 타입의 로션 및 크림과 같은 단일 에멀젼 스킨 케어 제제는 화장품 분야에서 주지되어 있으며 본 발명에서 유용하다. 미국 특허 제4,254,105호 및 제4,960,764호에 개시된 바와 같은 다중상 에멀젼 조성물, 예를 들어 수중유중수 타입(water-in-oil-in-water type)은 또한 본 발명에 유용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 단일 또는 다중상 에멀젼은 필수 성분으로서 물, 연화제 및 유화제를 함유한다.
본 발명의 국소 조성물은 또한 겔(예를 들어, 적합한 겔화제를 사용하여 수성, 알코올, 알코올/물 또는 오일 겔)로서 제제화될 수 있다. 수성 겔에 적합한 겔화제는 천연 고무, 아크릴산 및 아크릴레이트 폴리머 및 폴리머, 및 셀룰로스 유도체(예를 들어, 하이드록시메틸 셀룰로오스 및 하이드록시프로필 셀룰로오스)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 오일(예를 들어, 광유)에 적합한 겔화제는 수소화 부틸렌/에틸렌/스티렌 코폴리머 및 수소화 에틸렌/프로필렌/스티렌 코폴리머를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 겔은 전형적으로 약 0.1중량% 내지 5중량%의 이런 겔화제를 포함한다.
리포솜 제제는 또한 본 발명의 유용한 조성물이다. 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드는 리포솜 내에 함유된다. 리포솜의 예는 단일층, 다중층 및 소수층(paucilamellar) 리포좀이며, 인지질을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 이러한 조성물은 올리고뉴클레오타이드 억제제와 인지질, 예컨대, 다이팔미토일 포스파티딜 콜린, 콜레스테롤 및 물을 조합함으로써 제조될 수있다. 본 발명의 핵산을 암 세포 또는 피부 조직으로 전달하기에 적합한 상업적으로 입수 가능한 지방 에멀젼은 Intralipid®, Liposyn®, Liposyn® II, Liposyn® III, Nutrilipid 및 기타 유사한 지질 에멀젼를 포함한다. 생체 내 전달 비히클로 사용하기에 바람직한 콜로이드 시스템은 리포솜(즉, 인공 막 소포)이다. 이러한 시스템의 제조 및 사용은 당업계에 주지되어 있다. 예시적인 제형은 또한 전문이 참조로 본 발명에 포함된 US 5,981,505; US 6,217,900; US 6,383,512; US 5,783,565; US 7,202,227; US 6,379,965; US 6,127,170; US 5,837,533; US 6,747,014; 및 WO03/093449에 기술되어있다.
리포솜 제제가 상기 담체 중 하나(예를 들어, 겔 또는 수중유 에멀젼)에 혼입되어 리포솜 제형을 제조할 수 있다. 국소적으로 도포된 리포좀의 다른 조성물 및 용도는 Mezei, M., "Liposomes as a Skin Drug Delivery System", Topics in Pharmaceutical Sciences (D. Breimer and P. Speiser, eds.), Elsevier Science Publishers B. V., New York, N.Y., 1985, pp. 345-358, PCT Patent Application No. WO96/31194, Niemiec, et al., 12 Pharm. Res. 1184-88 (1995), and U.S. Pat. No. 5,260,065에 기술되어 있다.
한 실시태양에서, 조성물의 총 부피를 기준으로, 리포솜은 약 5 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 예컨대 약 10 mg/ml 내지 약 50 mg/ml의 양으로 국소 조성물에 존재한다.
상기 담체 및 부형제 이외에, 글리세롤 트라이올레에이트, 아세틸화 수크로오스 다이스테아레이트, 소르비탄 트라이올레에이트, 폴리옥시에틸렌 (1) 모노스테아레이트, 글리세롤 모노올레에이트, 수크로오스 다이스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜(50) 모노스테아레이트, 옥틸페녹시폴리(에틸렌옥시) 에탄올, 데카글리세린 펜타아이소스테아레이트, 소르비탄 세스퀴올레에이트, 수소화 라놀린, 라놀린, 트라이글리세릴 다이아이소트테아레이트, 폴리옥시에틸렌(2) 올레일 에터, 칼슘 스테아로일-2-락틸레이트, 메틸 글루코시드 세스퀴스테아레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-22/도데실 글리콜 코폴리머(Elfacos E200), 폴리에틸렌 글리콜-45/도데실 글리콜 코폴리머(Elfacos ST9), 폴리에틸렌 글리콜 400 다이스테아레이트 및 라놀린 유도 스테롤 추출물, 글리콜 스테아레이트 및 글리세롤 스테아레이트; 세틸 알코올과 라놀린 알코올과 같은 알코올; 아이소프로필 미리스테이트과 같은 미리스테이트; 세틸 팔미테이트; 콜레스테롤; 스테아르산; 프로필렌 글리콜; 글리세린, 소르비톨 등을 포함하는 에멀젼에 혼합될 수 있다.
특정 실시태양에서, 전달에 사용되는 리포솜은 미국 특허 출원 공개공보 제 20110076322호에 상세히 기술된 SMARTICLES®(Marina Biotech, Inc.)와 같은 친양쪽성 리포좀이다. SMARTICLES®의 표면 전하는 완전히 가역적이라서 이를 핵산 전달에 특히 적합하게 만든다. SMARTICLES®는 주사를 통해 전달되고, 안정적으로 유지되며, 핵산을 전달하기 위해 유리 세포 및 교차 세포막을 응집시킬 수 있다.
전달 비히클을 안정하게 하고 표적 세포에 의한 흡수를 허용하도록 적절한 염 및 버퍼를 사용하길 원할 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 수성 매질(aqueous medium)에 용해 또는 분산된 억제제 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 리포솜 또는 다른 복합체 또는 발현 벡터)을 포함하는 유효량의 전달 비히클을 포함한다. "약학적으로 허용가능한" 또는 "약리학적으로 허용가능한"이란 문구는 동물 또는 사람에게 투여되었을 때, 해로운, 알레르기의, 또는 다른 뜻밖의(untoward) 반응들을 일으키지 않는 분자 독립체(molecular entities) 및 조성물을 나타낸다. 본 발명에 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"는 용매, 버퍼, 용액, 분산매, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 및 인간에 투여하기 적합한 약과 같은 약의 제제화에 사용이 허용되는 다른 물질을 포함한다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 본 발명의 활성 성분과 양립 불가능한 것을 제외하고는, 치료 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 약학적 활성 물질들을 위한 이와 같은 매질 및 제제의 사용은 당업계에 주지되어 있다. 보충적인 활성 성분들은 또한 벡터 또는 조성물의 폴리뉴클레오타이드를 불활성화하지 않는 경우, 조성물에 혼입될 수 있다.
본 발명의 활성 조성물은 전형적인 약학 제제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 이들 조성물의 투여는 표적 조직이 그 경로를 통해 이용 가능한 한 임의의 통상적인 경로를 통해 이루어질 수 있다. 이 경로는 구강, 국소, 비경구, 피내, 피하 또는 정맥 주사를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 기술된 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제를 포함하는 조성물은 크림, 연고, 페이스트, 로션 또는 겔과 같은 국소 적용에 적합한 형태로 제제화될 수 있다.
활성 화합물은 또한 비경구 투여될 수 있다. 예시로서, 유리 염기 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로서 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면 활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 일반적으로 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 함유한다.
주사용에 적합한 약학적 형태는, 예를 들어, 살균 수성 용액 또는 분산액 및 살균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 살균 분말을 포함한다. 일반적으로 이들 제제는 살균되며 쉬운 주입성이 존재할 정도로 유동성이다. 제제는 제조 및 보관 조건하에서 안정해야 하며 세균 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대비하여 보관되어야 한다. 적합한 용매 또는 분산매는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물, 및 식물 오일을 포함할 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등의 다양한 항균 및 항진균제에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에서, 등장성 물질, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수 지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용하여 이루어질 수 있다.
살균 주사 용액은 적절한 양의 컨주게이트를 용매에 원하는 임의의 다른 성분(예를 들어, 상기에서 열거한 것)과 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균 활성 성분들을 기본적인 분산매와 원하는 다른 성분들, 예를 들어 앞에서 열거한 것들을 포함하는 살균 비히클에 혼합함으로써 제조된다. 살균 주사 용액 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 상기 살균-여과된 용액으로부터 어떠한 추가적으로 요구되는 성분들을 더한 활성 성분(들)의 파우더를 생산하는 진공-건조 및 동결-건조 기술을 포함한다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은, 예를 들어, 무기산(예를 들어, 염산 또는 인산) 또는 유기산(예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등)으로부터 유도된 산 부가 염(단백질의 유리 아미노기로 형성됨)을 포함한다. 단백질의 유리 카복실기로 형성된 염은 무기 염기(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제 2 철) 또는 유기 염기(예를 들어, 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등)로부터 유도될 수 있다.
제제 시에, 조성물은 되도록 투약 제제에 적합한 방식 및 치료에 효과적인 양으로 투여된다. 제제는 주사 가능한 용액, 크림, 연고, 페이스트, 로션 또는 겔 등과 같은 다양한 제형으로 쉽게 투여될 수 있다. 수용액에서 비경구적 투여를 위해서, 예를 들어, 용액은 일반적으로 적절하게 완충되고, 액상 희석액은 먼저 예를 들어 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성을 만든다. 이러한 수용액은 예를 들어, 정맥내, 피하 및 피내 투여에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 특히 본 명세서의 관점에서, 당업계의 통상적인 기술을 가진자에게 이미 알려진 바대로 살균 수성 매질이 사용된다. 치료받는 대상의 질환에 따라 용량의 일부 변화는 필연적으로 생기게 된다. 투여에 대해 책임을 지는 사람은 어떤 일이 있어도 개개의 대상을 위한 적합한 용량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여에 있어, 제제는 제제 당국에 의해 요구되는 살균성, 발열원성, 일반 안전 및 순도 기준을 만족해야만 한다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 본 발명의 약학적 조성물은 투여용 장치와 함께 포장되거나 또는 투여용 장치 내에 저장된다. 주사 제제용 장치는 미리 채워진 주사기, 주사 포트, 자동 주사기, 주사 펌프 및 주사 펜을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 에어로졸 또는 분말 제제용 장치는 흡입기, 흡입기, 흡인기 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물의 피부 전달 장치는 피부 미세 바늘 주입 또는 패치를 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 기술된 하나 이상의 장애를 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 투여 장치를 포함한다.
본 발명은 제한적으로 해석되지 않는 다음 추가 실시예에 의해 추가로 설명된다. 당업자는 본 발명의 관점에서 개시된 특정 실시태양에 여러 변화를 가할 수 있고 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않고 유사하거나 동일한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 안다.
실시예:
실시예 1: miR-155("antimiR-155")의 올리고뉴클레오타이드 억제제는 증가된 miR-155 발현을 나타내는 균상 식육종 세포주에서 활성이다
CTCL 환자로부터 유래된 세포주에서 miR-155-5p 발현을 특성화하기 위해, 균상 식육종(MF), 세자리 증후군(SS) 및 MF 또는 SS로 분류되지 않은 CTCL 세포주에서의 miR-155-5p의 절대 수준을 측정하였다. 검사된 세포주의 세포적, 병리학적 및 분자적 특성을 표 3에 나타내었다.
CTCL 세포주의 특징
명칭 질환 연령 조직 출처 발현된 항원 분자 특징
HuT78 세자리 증후군 53 말초 혈액 CD4+ HTLV-
MJ 균상 식육종 50 말초 혈액 CD4+, CD3+, CD2+ HTLV+
My-La 균상 식육종 82 피부 플라크 CD4+, CD3+, CD2+ HTLV-
HuT102 균상 식육종 26 림프절 CD4+ HTLV+
HH 균상 식육종 또는 세자리 증후군도 아님 61 말초 혈액 CD4+, CD3+, CD2+, CD30+ HTLV-
정상적인 말초 CD4+ 헬퍼 T-세포와 비교하여 CTCL 세포주에서 miR-155-5p의 절대 발현을 각 세포 유형으로부터 분리된 전체 RNA를 주형으로 사용하여 실시간 PCR로 측정하였다. 합성 miR-155-5p RNA 주형을 사용하여 Ct 값과 miR-155-5p 사본 수를 연관시키는 표준 곡선을 만들었다. 세포당 총 RNA 10 pg을 가정할 때, 합성 주형으로 생성된 표준 곡선을 사용하여 CTCL RNA 샘플 또는 정상 CD4+ T 세포 RNA 샘플에 대해 결정된 Ct 값으로부터 miR-155-5p의 세포 당 사본 수를 외삽하였다(도 1). 특발성 세포주(HH)뿐만 아니라 균상 식육종 세포주(HuT102, MJ 및 My-La)는 정상 CD4+ T 세포와 비교하여 miR 155-5p의 높은 발현을 보인 반면, 세자리 증후군 환자(HuT78)로부터 유래된 세포주는 miR-155-5p를 과발현하지 않았다.
CTCL 세포주를 2μM 내지 50μM 범위의 농도로 antimiR-155 화합물 1(SEQ ID NO: 27), 화합물 2(SEQ ID NO: 22), 화합물 3(SEQ ID NO: 23), 및 화합물 4(SEQ ID NO: 25)을 첨가하여 완전한 성장 배지에서 배양하였다. antimiR은 세포 흡수를 증진시키기 위해 임의의 추가 구성요소 없이 배지에 첨가하였다. 72시간의 처리 후에 세포를 수확하고 전체 RNA를 정제하였다. 실시간 PCR은 miR-155의 13개 직접 유전자 표적에 대해 수행되었다(Worm et al., 2009; O'Connell et al., 2010; Zhang et al., miRagen unpublished data). antimiR-치료된 세포에서 13개의 유전자의 발현의 상대적 배수 변화를 치료되지 않은 세포와 비교하여 계산하였다. 도 2는 표시된 antimiR의 10μM로 72시간의 치료에 반응하여 유전자 발현 변화의 "히트 맵" 묘사를 도시한다. 적어도 하나의 세포주에서 발현이 부족한 4개의 예측된 직접 표적은 생략되었다. 유전자 발현 배수 변화는 log10-형질전환되었으며, 적색 내지 청색 비색 스케일 상에 도표로 나타내었고, 가장 강한 적색은 유전자 발현의 최고 상대적 증가를 나타내었고, 반대로 가장 강한 청색은 유전자 발현의 가장 큰 감소이다. 히트 맵은 miR-155-5p 표적 유전자의 여러 발현이 3개의 균상 식육종 세포주(MJ, HuT102 및 My-La)에서 miR 155-5p 길항제에 노출되면 조절된다는 것을 보여주었다. miR-155-5p를 높은 수준으로 발현하는 특발성 세포주(HH)에서도 이와 유사하지만 좀 더 완만한 유전자 발현 변화가 관찰되었다. 대조적으로, 이들 유전자의 발현은 miR-155-5p의 낮은 수준을 발현하는 세자리 증후군 세포주(HuT78)에서 현저히 변화되지 않았으며, 균상 식육종 세포주 및 HH 세포주의 유전자 발현 수준의 변화가 miR-155-5p의 길항작용에 의해 매개되는 것을 나타내었다.
실시예 2: AntimiR-155 화합물 2(SEQ ID NO: 22) 및 4(SEQ ID NO: 25)는 다른 항생제 화합물과 비교하여 균상 식육종 세포주에서 더 큰 활성을 나타낸다
miR-155-5p의 4개의 직접 유전자 표적(Bach1, Jarid2, Picalm 및 Ship1)가 추가 분석을 위해 선택되었는데, 이는 이들 4개 유전자가 3개의 균상 식육종 세포주(MJ, HuT102 및 My-La) 모두에서 antimiR-155에 의해 조절 되었기 때문이다. 이들 유전자는 생체 외에서 antimiR 활성에 대한 유전자 발현 시그니처를 나타내기 위해 선택되었다. 또한 4개 유전자 시그니처를 사용하여 antimiR 화합물의 활성을 비교하였다. 이러한 유전자의 변화는 다양한 계통 번호의 세포를 가진 3회의 독립적인 실험을 통해 재현 가능하였다. 도 3, 4, 5, 6 및 7은 각각 HuT102, MJ, HH, My-La 및 Hut78 세포주에서 이 4개 유전자 시그니처의 배수 변화 결과를 나타낸다. 비모수적인 만-휘트니(Mann-Whitney) 테스트에 의한 *P 값 <0.0001 대 비치료. 만 휘트니 테스트는 치료되지 않은 세포와 비교된 치료 사이에 차이가 균등하지 않기 때문에 선택되었다.
3회 투여량(2μM, 10μM 및 50μM) 및 3개의 균상 식육종 세포주에 걸친 누적 데이터는 화합물 2(SEQ ID NO: 22) 및 4(SEQ ID NO: 25)가 화합물 1(SEQ ID NO: 27) 및 화합물 3(SEQ ID NO: 23)보다 활성적이었다는 것을 나타내었다. 도 7에 도시된 바와 같이, 4개의 antimi-155-5p 화합물 모두 세자리 증후군 세포주(HuT78)에서 통계적으로 유의한 활성을 나타내지 않았으며, 이는 도 1에 도시된 바와 같이 이 세포주에서 miR-155의 낮은 발현 수준과 일치한다.
실시예 3: antimiR-155 치료에 의해 유도된 유전자 발현 변화는 miR-155의 억제에 특이적이다
본 발명의 antimiR-155 화합물에 의해 유도된 유전자 발현 변화의 특이성을 테스트하기 위해, 균상 식육종 세포주를 miR-155를 표적화하지 않는 올리고(대조 올리고)로 처리하였다. 대조군 올리고뉴클레오타이드는 포유류(대조군 1)에서 발현되지 않은 C. elegans miRNA를 표적으로하는 14개 뉴클레오타이드 antimiR이었다. 두 번째 올리고는 antimiR-155 화합물 4(대조군 2)의 14개 뉴클레오타이드 서열의 스크램블이다. MJ 및 HuT102 세포주를 10μM antimiR-155 화합물 3(SEQ ID NO: 23) 또는 4(SEQ ID NO: 25) 또는 2개의 대조군 올리고로 72시간 동안 배양하였다. 도 8은 PCR로 측정한 miR-155-5p의 4개의 직접 표적에 대한 유전자 발현의 배수 변화를 도시한다. antimiR-155 화합물 3(SEQ ID NO: 23) 또는 4(SEQ ID NO: 25)로 치료된 세포에서의 유전자 발현 시그니처는 치료되지 않은 세포와 통계적으로 유의하게 상이하였다. 대조적으로, 대조군 화합물로 치료된 세포에서의 유전자 발현은 치료되지 않은 세포의 유전자 발현과 다르지 않았다. 이러한 결과는 miR-155 직접 표적이 올리고 치료의 비특이적 효과에 기인한 것이 아니라 miR-155 억제에 대한 응답으로 탈억제되었음을 보여준다. 비모수적인 만-휘트니(Mann-Whitney) 테스트에 의한 *P 값 <0.0001 대 비치료.
실시예 4: antimiR-155로 치료된 CTCL 세포주의 전체 게놈 발현 프로파일링은 표적 결합을 확인하고 역학적 통찰력을 제공한다
균상 식육종 세포주에서의 miR-155 억제제의 분자적 결과에 대한보다 완전한 이해를 얻기 위해, 전체 게놈 전사체 프로파일링을 antimiR-155 화합물 3(SEQ ID NO: 23) 또는 4(SEQ ID NO: 25)로 4일(96시간) 또는 8일 동안 치료한 MJ 및 HuT102 세포주에서 수행하였다. 통계적으로 유의미한 유전자 발현 시그니처는 antimiR-치료된 세포에 대한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 의해 동일한 시점에서 처리되지 않은 세포와 비교하여 정의되었다. 0.05≤의 거짓 발견율 보정된 p 값으로 현저하게 변화된 유전자에 대한 데이터를 필터링하였다. 도 2에 대해 기술한 바와 같이 배수 변화 결과는 도 9와 10에 히트 맵으로 표시된다.
4일째 및 8일째에 글로벌 유전자 발현 시그니처의 조사는 antimiR-155 치료에 대한 반응으로 유전자 발현 변화에 대한 시간 경과를 암시하였다: 초기 시점(4일) 또는 늦은 시점(8일)에서 조절된 독특한 유전자 세트뿐만 아니라 두 시점에서 변화된 일부 유전자를 확인하였다(MJ 프로파일의 경우 도 9, HuT102 프로파일의 경우 도 10). 또한, 발현 프로파일링(expression profiling)은 각 세포주에서 조절되는 독특한 유전자 세트와 두 세포주에서 조절되는 일부 유전자를 확인하였다. 화합물 4(SEQ ID NO: 25)는 화합물 4(SEQ ID NO: 25) 히트 맵을 통한 청색 및 적색의 더 큰 강도에 의해 입증됨에 따라 두 세포주 및 두 시점 모두에서 더 큰 크기의 유전자 조절을 입증하였다.
4일째에 두 세포주 및 두 화합물 모두에 공통된 유전자 발현 프로파일을 miR-155-5p 종자-매치 유전자 표적(8-, 7- 및 6-뉴클레오타이드 결합 부위)의 농축에 대해 분석하였다. 이 유전자의 배수 변화는 도 11의 히트 맵에 제공된다. 150개의 상향 조절된 유전자의 이런 시그니처는 1.6 x 10-25의 고지학적 p 값(도 11a)을 miR-155-5p 종자-매치 표적(8-, 7- 및 6-뉴클레오타이드 결합 부위)에 대해 현저하게 농축되었다. 누적 분포 함수에 의한 분석은 종자-매치 표적에 대한 농축을 확인하였고 8mer> 7mer> 6mer 결합 위치에 대한 농축을 입증하였다(도 11b). 유전자 시그니처는 기능 유전자 주석 농축을 위한 DAVID 생물 정보학 자원을 사용하여 분석되었다(Huang da et al., 2009). 0.01≤의 벤자미니-보정된 p 값에 의해 정의된 유전자 온톨로지 데이터베이스 용어의 현저한 농축은 없었다.
8일째(총 677개의 유전자)의 두 세포주 및 두 화합물에 공통된 유전자 발현 시그니처를 종자-매치 유전자 표적의 농축 및 기능적 유전자 주석에 대한 분석에 적용하였다. 상향 조절된 유전자 시그니처는 <10-27의 고지학적 p 값을 갖는 종자-매치 표적에 대해 유의하게 농축되었다. 4일 시그니처과 달리, 8일 시그니처는 2개의 기능적 주석 용어의 강한 농축을 보여주었다: 상향 조절된 시그니처의 항원 제시 및 하향 조절된 시그니처의 유사 분열 세포주기(도 12). 종합적으로, 이런 결과는 antimiR 화합물의 효과가 miR-155-5p 및 이의의 직접 유전자 표적의 억제에 의해 매개되고, miR-155-5p 기능의 억제에 의해 유도된 표현형이 증가된 항원 제시 및 증식의 감소를 포함할 수 있다는 것을 확인한다.
제 3 균상 식육종 세포주, MyLa를 화합물 4(SEQ ID NO: 25)로 4일 및 8일 동안 치료하고, 유전자 발현의 변화를 프로파일링하여 antimiR-155 화합물 4(SEQ ID NO: 25)의 활성을 추가로 조사하였다. 화합물 4(SEQ ID NO: 25)의 특이성을 테스트하기 위해, 세자리 증후군 세포주(HuT78)의 세포를 화합물 4(SEQ ID NO: 25)로 8일 동안 치료하고 유전자 발현의 변화를 분석하였다. 이런 결과는 도 13에 도시된다. 3개의 균상 식육종 세포주, HuT102, MJ 및 My-La에서 화합물 4(SEQ ID NO: 25)에 반응하여 <0.05의 거짓 발견률(FDR) 보정된 p 값으로 통계적으로 변화된 유전자는 상기한 바와 같이 히트 맵으로 표시된다. 히트 맵에서 총 유전자의 수는 324개이다. 도 13은 화합물 4(SEQ ID NO: 25)에 의한 세자리 증후군 세포주 HuT78의 치료는 유전자 발현이 크게 변화하지 않았음을 나타내며 균상 식육종 세포주에서 유전자 발현 변화는 실제로 화합물 4(SEQ ID NO: 25)에 의한 miR-155-5p의 억제에 기인한다는 것을 나타낸다.
부가적으로, 3개의 균상 식육종 세포주 모두에서 화합물 4(SEQ ID NO: 25)에 의해 조절되는 유전자는 본 발명의 화합물 4(SEQ ID NO: 25)와 같은 antimiR-155 화합물에 의한 치료의 임상 평가를 위해 사용될 수 있는 바이오마커 시그니처로서 확인되었다. 확인된 유전자 세트는 3개의 세포주 모두에서 상향 조절되었거나 3개의 세포주 모두에서 하향 조절되었다. 각 시점(4일 및 8일)에 대한 공통 시그니처를 확인한 다음 단일 유전자 목록(표 2)으로 결합하였다. 유전자 발현의 크기에 어떤 필터도 적용되지 않았다. 따라서, 표 2는 4일에만 또는 8일에만 조절되거나 두 시점 모두에서 조절되는 유전자를 포함한다. 표 2는 화합물 4(SEQ ID NO: 25)에 의해 조절된 초기(직접) 표적 및 하류(간접) 표적을 포함하는 587개의 유전자를 포함한다(도 21). 표 2의 유전자 목록은 직접 표적 Bach1, Picalm 및 Jarid2를 포함하며, 이들 유전자가 다중 세포주 및 시점에 걸쳐 화합물 4(SEQ ID NO: 25) 활성의 강력한 마커임인 것을 입증한다.
실시예 5: 본 발명의 AntimiR-155 화합물은 CTCL 세포에서 세포 증식을 억제하고 세포사멸을 증가시킨다
CTCL 세포에 의한 antimiR-155 화합물의 수동적 흡수는 세포 증식을 현저하게 감소시키고 프로그램된 세포 사멸을 유도하였다. 이러한 효과는 두 개의 CTCL 세포주, HuT102 및 MyLa에서 관찰되었다. HuT102 및 MyLa 세포주 모두에서 antimiR-155 화합물 3(SEQ ID NO: 23)보다 더 큰 표적 탈억제를 입증한 AntimiR-155 화합물 2(SEQ ID NO: 22) 및 4(SEQ ID NO: 25) 더 큰 증식 억제 및 더 큰 세포사멸 활성을 나타내었다.
도 14a는 시간 경과에 따른 HuT-102 세포의 증식에 대한 antimiR-155 화합물 4(SEQ ID NO: 25)의 효과를 나타낸다. ATP의 수준이 세포 수와 직접적으로 관련되기 때문에, ATP를 측정하여 세포 수를 결정하였다. 세포 수에 대한 화합물 4(SEQ ID NO: 25)의 효과는 CTCL에 대한 표준 치료제인 벡사로틴에서 볼 수 있는 효과와 필적할만하였다(도 14a). 세포 수의 감소는 카스파제 3/7 활성에 의해 측정된 바와 같은 세포사멸의 증가를 동반하였다(도 14b). 카스파제 3 및 7 단백질은 시스테인 아스파르트산 특이적 프로테아제(카스파제) 패밀리의 구성원이다. 카스파제 패밀리는 포유류 세포의 세포사멸에서 핵심 작용기 역할을 한다. 카스파제 활성은 모든 세포가 적절하게 표준화되지 않으면 결과를 혼란시킬 수 있는 낮은 수준의 기초 카스파제 활성을 가지기 때문에 ATP 수준으로 표준화되었다. 화합물 4(SEQ ID NO: 25)는 벡사로틴보다 더 큰 세포사멸 유도를 나타내었다(도 14b).
시간 경과 외에도, HuT102 세포에서의 antimiR-155 화합물의 용량 적정을 ATP로 수행하고, 8일의 치료 후 카스파제 3/7 측정을 수행하였다(각각 도 15a 및 15b). 이들 결과는 화합물 4(SEQ ID NO: 25)의 억제 가능성을 확인한다.
HuT-102 세포에서 8일째에 antimiR-155 화합물 2(SEQ ID NO: 22)에서의 증식 및 카스파제 3/7 활성화에 대한 유사한 효과가 관찰되었다(각각 도 16a 및 16b).
화합물 4(SEQ ID NO: 25)는 제 2 균상 식육종 세포주인 My-La 세포에서 유사한 활성을 나타냈다. 도 17a 및 17b는 화합물 3(SEQ ID NO: 23) 및 4(SEQ ID NO: 25)에 의한 시간에 따른 카스파제 3/7의 증식 및 활성화를 나타낸다. HuT102 세포와 유사하게, 화합물 4(SEQ ID NO: 25)는 화합물 3(SEQ ID NO: 23)과 비교하여 더 큰 활성을 나타냈다.
시간 경과 이외에, My-La 세포에서의 antimiR-155 화합물의 용량 적정을 ATP로 수행하고, 8일의 치료 후 카스파제 3/7 측정을 수행하였다(각각 도 18a 및 18b). 이들 결과는 화합물 4(SEQ ID NO: 25)의 억제 가능성을 추가로 확인한다.
실시예 6: HDAC 억제제와 조합된 AntimiR-155 치료는 세포 증식 및 세포사멸 활성에 대한 효과를 향상시킨다
보리노스타트(Vorinostat)(화학명: SAHA)는 진행된 균상 식육종 환자를 위한 표준 치료 추천 유전자 치료제이다. 그러나 pan-HDAC 억제제의 부작용은 잘 설명되어 있다다. 조합 요법이 개별 화합물 치료보다 강화된 활성을 보일 수 있는지를 결정하기 위해, HuT102 세포를 antimiR-155와 조합된 하위 유효량의 SAHA로 치료하였다.
HuT102 세포를 0.25μM SAHA 및 10μM 화합물 3(SEQ ID NO: 23) 또는 4(SEQ ID NO: 25)로 개별적으로 또는 조합하여 치료하였다. 세포를 매일 수확하여 ATP 수준 및 카스파제 3/7 활성을 측정하였다. ATP 수준은 도 19a에 도시된다. 유사한 실험을 0.50μM SAHA로 수행하였다. 도 19b는 HuT102 세포를 0.50μM SAHA 및 10μM 화합물 3(SEQ ID NO: 23) 또는 4(SEQ ID NO: 25)로 개별적으로 또는 조합하여 치료했을 때 얻어진 ATP 수준을 나타낸다.
도 20a 및 20b는 카스파제 3/7 활성에 대한 효과를 나타낸다. 화합물 4(SEQ ID: 25)는 0.25 또는 0.5μM의 SAHA와 조합하였을 때 각 치료제 단독에 비해 증가 된 세포사멸을 초래하였다. 이 데이터는 antimiR-155 올리고가 저용량 pan-HDAC 억제제와 함께 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 7: 상이한 길이의 올리고 뉴클레오타이드의 AntimiR-155 활성
miR-155 억제제의 활성을 평가하기 위하여, 이중 루시퍼라제 리포터 분석 시스템을 사용하였다. 요약하면, miR-155에 대한 결합 부위는 상업적으로 구입 가능한 psiCHECK-2 벡터 시스템(Promega) 내에 위치한 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 유전자의 3' UTR에 클로닝되었다. miR-155 억제제가 없는 경우, 레닐라 루시퍼라제 단백질의 발현은 miR-155 모방체에 의해 억제된다. miR-155 억제제가 있는 경우, 레닐라 루시퍼라제 단백질의 발현이 억제된다. 플라스미드의 형질감염을 제어하기 위해, 벡터는 miR-155 결합 부위를 함유하지 않는 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 함유한다. 레닐라 또는 반딧불이 루시퍼라제의 발현은 루시퍼라제 단백질에 의해 방출된 빛의 검출을 통해 측정된다.
miR-155 결합 부위를 함유하는 50ng의 이중 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 10nM miR-155 모방체("리포터 + 모방체"), 10nM miR-155 모방체 및 2nM 대조군 올리고뉴클레오타이드, 또는 10nM miR-155 모방체 및 2nM의 11-14 뉴클레오타이드 길이의 테스트 miR-155 올리고뉴클레오타이드 억제제와 함께 miR-155 모방체("리포터" 단독) 없이 HeLa 세포로 형질감염시켰다(표 4). miR-155 모방체는 Dharmacon(miRIDIAN microRNA Human hsa-miR-155-5 모방체, Accession number MIMAT0000646; 카탈로그 # C-300647-05-0005)에서 구입하였고, 성숙한 miRNA 서열: -UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-(SEQ ID NO 121)을 함유한다. 실험에 사용된 대조군 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열을 가졌다: 5'-lCs.dTs.dAs.lGs.dAs.lAs.dAs.lGs.lAs.dGs.lTs.dAs.lGs.lA-3'(SEQ ID NO: 122).
SEQ ID NO. 변형 서열 LNA # 길이
25 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
54 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 13
55 5'- lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 12
56 5'- lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 11
도 22는 리포터 플라스미드 및 모방체의 형질감염이 루시퍼라제의 최대 억제를 초래한다는 것을 나타낸다; 리포터 플라스미드 단독의 형질감염은 루시퍼라제의 최대 발현을 초래하였다; 리포터 및 모방체에 의한 대조군 올리고뉴클레오타이드의 형질감염은 루시퍼라제의 발현을 억제하지 않았다; 리포터 및 모방체에 의한 테스트 miR-155 올리고뉴클레오타이드 억제제의 형질감염은 상이한 정도로 루시퍼라제의 발현을 탈억제하였다.
실시예 8: 다양한 수의 잠금 뉴클레오타이드(LNA)를 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 AntimiR-155 활성
실험은 실시예 7에 기술된 바와 같이 수행하였다. 본 실험에서 사용된 테스트 miR-155 올리고뉴클레오타이드 억제제는 포함된 LNA의 수에 차이가 있었다(표 5-8). 그 결과는 도 23a(표 5), 23b(표 6), 23c(표 7) 및 23d(표 8)에 도시된다.
SEQ ID NO. 변형 서열 LNA # 길이
25 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
32 5'-dCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 14
33 5'-lCs;lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 10 14
34 5'-lCs;dAs;dCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 14
35 5'-lCs;dAs;lCs;lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 10 14
36 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;lAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 10 14
37 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;dTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 14
38 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;dTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 14
39 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;lAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 10 14
40 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;dGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 14
41 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;lCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 10 14
42 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;dAs;lTs;lTs;lA-3' 8 14
43 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;dTs;lTs;lA-3' 8 14
44 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;dTs;lA-3' 8 14
45 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;dA-3' 8 14
SEQ ID NO. 변형 서열 LNA # 길이
25 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
54 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 13
57 5'-dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 13
58 5'-lAs;dCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 13
59 5'-lAs;lCs;lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 10 13
60 5'-lAs;lCs;dGs;lAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 10 13
61 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;dTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 13
62 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;dTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 13
63 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;lAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 10 13
64 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;dGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 13
65 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;lCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 10 13
66 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;dAs;lTs;lTs;lA-3' 8 13
67 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;dTs;lTs;lA-3' 8 13
68 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;dTs;lA-3' 8 13
69 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;dA-3' 8 13
SEQ ID NO. 변형 서열 LNA # 길이
25 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
55 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 12
77 5'-dCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 7 12
78 5'-lCs;lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 12
79 5'-lCs;dGs;lAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 12
80 5'-lCs;dGs;dAs;dTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 7 12
81 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;dTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 7 12
82 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;lAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 12
83 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;dGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 7 12
84 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;lCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 12
85 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;dAs;lTs;lTs;lA-3' 7 12
86 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;dTs;lTs;lA-3' 7 12
87 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;dTs;lA-3' 7 12
88 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;dA-3' 7 12
SEQ ID NO. 변형 서열 LNA # 길이
25 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
56 5'-lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 11
95 5'-dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 7 11
96 5'-lGs;lAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 11
97 5'-lGs;dAs;dTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 7 11
98 5'-lGs;dAs;lTs;dTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 7 11
99 5'-lGs;dAs;lTs;lTs;lAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 11
100 5'-lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;dGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 7 11
101 5'-lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;lCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 11
102 5'-lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;dAs;lTs;lTs;lA-3' 7 11
103 5'-lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;dTs;lTs;lA-3' 7 11
104 5'-lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;dTs;lA-3' 7 11
105 5'-lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;dA-3' 7 11
실시예 9: 다양한 위치에 LNA 변형을 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 AntimiR-155 활성
실험은 실시예 7에 기술된 바와 같이 수행하였다. 본 실험에서 사용된 테스트 miR-155 올리고뉴클레오타이드 억제제는 포함된 LNA의 수에 차이가 있었다(표 9-12). 그 결과는 도 24a(표 9), 24b(표 10), 24c(표 11) 및 24d(표 12)에 도시된다.
SEQ ID NO. 변형 서열 LNA # 길이
25 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
46 5'-dCs;lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
47 5'-lCs;lAs;dCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
48 5'-lCs;dAs;dCs;lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
49 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;lAs;dTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
50 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;dTs;lAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
51 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;lAs;dGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
52 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;dGs;lCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
53 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;lCs;dAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
SEQ ID NO. 변형 서열 LNA # 길이
25 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
54 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 13
70 5'-lAs;dCs;lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 13
71 5'-lAs;lCs;dGs;lAs;dTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 13
72 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 13
73 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;dTs;lAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 13
74 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;lAs;dGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 13
75 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;dGs;lCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 13
76 5'-lAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;lCs;dAs;lTs;lTs;lA-3' 9 13
SEQ ID NO. 변형 서열 LNA # 길이
25 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
55 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 12
89 5'-dCs;lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 12
90 5'-lCs;dGs;lAs;dTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 12
91 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;dTs;lAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 12
92 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;lAs;dGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 12
93 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;dGs;lCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 12
94 5'-lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;lCs;dAs;lTs;lTs;lA-3' 8 12
SEQ ID NO. 변형 서열 LNA # 길이
25 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
56 5'-lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 11
106 5'-dGs;lAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 11
107 5'-lGs;lAs;dTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 11
108 5'-lGs;dAs;lTs;dTs;lAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 11
109 5'-lGs;dAs;lTs;lTs;lAs;dGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 11
110 5'-lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;dGs;lCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 8 11
111 5'-lGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;lCs;dAs;lTs;lTs;lA-3' 8 11
실시예 10: 다양한 뉴클레오타이드 변형을 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 AntimiR-155 활성
실험은 실시예 7에 기술된 바와 같이 수행하였다. 본 실험에서 사용된 테스트 miR-155 올리고뉴클레오타이드 억제제는 길이가 14개 뉴클레오타이드이고 각각은 9개 뉴클레오타이드 변형을 포함하였다(표 13). 뉴클레오타이드 변형은 잠금 뉴클레오타이드(LNA), 에틸렌 가교 핵산/에틸렌 가교 뉴클레오타이드(ENA) 및 2'-C-가교 바이사이클릭 뉴클레오타이드(CBBN)를 포함하였다. 그 결과는 도 25에 도시된다.
SEQ ID NO. 변형 서열 Mod # 길이
25 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
112 5'-eCs;dAs;eCs;dGs;dAs;eTs;eTs;dAs;eGs;dCs;eAs;eTs;eTs;eA-3' 9 14
113 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;eAs;lTs;lTs;eA-3' 9 14
114 5'-eCs;dAs;eCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
115 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;eGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
116 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;eTs;eTs;dAs;lGs;dCs;lAs;eTs;eTs;lA-3' 9 14
117 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;eTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
118 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;eTs;lA-3' 9 14
119 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;abAs;lTs;lTs;abA-3' 9 14
1l = 잠금 핵산 변형; d = 데옥시리보뉴클레오타이드; s = 포스포로티오에이트 결합; e = 에틸렌-가교 뉴클레오타이드; ab = 아미노-2'-C-가교 바이사이클릭 뉴클레오타이드(CBBN).
실시예 11: 14-뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드의 AntimiR-155 활성
실험은 실시예 7에 기술된 바와 같이 수행하였다. 본 실험에서 사용된 miR-155 올리고뉴클레오타이드 억제제는 길이가 14개 뉴클레오타이드이고 9 또는 10개의 LNA 변형을 포함하였다(표 14). 그 결과는 도 26에 도시된다.
SEQ ID NO. 변형 서열 LNA # 길이
25 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
29 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;lAs;lTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 10 14
30 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;lAs;dTs;lTs;dAs;lGs;dCs;lAs;lTs;lTs;lA-3' 9 14
31 5'-lCs;dAs;lCs;dGs;dAs;lTs;lTs;lAs;lGs;dCs;lAs;dTs;lTs;lA-3' 9 14
실시예 12: SEQ ID NO: 25 및 23을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 억제제의 AntimiR-155 활성
실험은 실시예 7에 기술된 바와 같이 수행하였다. 본 실험에서 사용된 시험 miR-155 올리고뉴클레오타이드 억제제는 SEQ ID NO: 25 및 23의 올리고뉴클레오타이드 억제제이었다. 그 결과는 도 27에 도시된다.
실시예 13: SEQ ID NO: 25 및 120을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 억제제의 AntimiR-155 활성.
SEQ ID NO: 25 및 120의 miR-155 올리고뉴클레오타이드 억제제를 Oci-Ly3 세포주에서 수동적으로 형질감염시켰다. mRNA를 4일째에 분리하여 miR-155 표적 유전자(Bach1, CEBPB, CUX1, INPP5D/SHIP1, Jarid2, Picalm 및 Wee1)의 발현에 대해 qPCR에 의해 분석하였다. 도 28은 SEQ ID NO: 25 및 120의 올리고뉴클레오타이드 억제제의 형질감염시 이들 유전자의 발현에서의 배수 변화를 나타낸다. 도 28의 각 데이터 지점에서 왼쪽에서 오른쪽으로 유전자의 순서는 Bach1, CEBPB, CUX1, INPP5D / SHIP1, Jarid2, Picalm 및 Wee1이다. SEQ ID NO: 120은 SEQ ID NO: 25의 LNA와 동일한 위치에 CBBN 뉴클레오타이드를 함유한다.
SEQUENCE LISTING <110> MIRAGEN THERAPEUTICS, INC. Rodman, David Seto, Anita Dalby, Christina Jackson, Aimee Beatty, Xuan <120> miR-155 INHIBITORS FOR TREATING CUTANEOUS T CELL LYMPHOMA (CTCL) <130> MIRG-051/01WO 308934-2519 <150> US 62/171,758 <151> 2015-06-05 <160> 122 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 cuccuacaua uuagcauuaa ca 22 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-155 10101 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> May be joined through phosphorothioate bonds <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> May be locked nucleic acid adenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> May be locked nucleic acid cytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> May be locked nucleic acid guanosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> May be locked nucleic acid thymidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> May be locked nucleic acid 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Artificial Sequence <220> <223> miR-155 mimic 12960 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> May be joined through phosphorothioate bonds <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> May be locked nucleic acid cytidine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> May be locked nucleic acid cytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(7) <223> May be locked nucleic acid thymidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> May be locked nucleic acid guanosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> May be locked nucleic acid adenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> May be locked nucleic acid thymidine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> May be ethylene-bridged thymidine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> May be locked nucleic acid adenosine <400> 118 cacgattagc atta 14 <210> 119 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-155 mimic 12961 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> May be joined through phosphorothioate bonds <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> May be locked nucleic acid cytidine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> May be locked nucleic acid cytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(7) <223> May be locked nucleic acid thymidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> May be locked nucleic acid guanosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> May be amino-2'-C-bridged bicyclic adenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(13) <223> May be locked nucleic acid thymidine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> May be amino-2'-C-bridged bicyclic adenosine <400> 119 cacgattagc atta 14 <210> 120 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-155 mimic 12552 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> May be joined through phosphorothioate bonds <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> May be amino-2'-C-bridged bicyclic cytidine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> May be amino-2'-C-bridged bicyclic cytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(7) <223> May be amino-2'-C-bridged bicyclic thymidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> May be amino-2'-C-bridged bicyclic guanosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> May be amino-2'-C-bridged bicyclic adenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(13) <223> May be amino-2'-C-bridged bicyclic thymidine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> May be amino-2'-C-bridged bicyclic adenosine <400> 120 cacgattagc atta 14 <210> 121 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dharmacon miRIDIAN microRNA Human hsa-miR-155-5p mimic <400> 121 uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23 <210> 122 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-155 control oligo 11317 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> May be joined through phosphorothioate bonds <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> May be locked nucleic acid cytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> May be locked nucleic acid guanosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> May be locked nucleic acid adenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> May be locked nucleic acid guanosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> May be locked nucleic acid adenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> May be locked nucleic acid thymidine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> May be locked nucleic acid guanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> May be locked nucleic acid adenosine <400> 122 ctagaaagag taga 14

Claims (71)

  1. 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3' (SEQ ID NO: 25)의 서열을 포함하는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제로서, 여기서 l은 잠금 뉴클레오타이드를 나타내고, d는 데옥시리보뉴클레오타이드를 나타내고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내는 것인 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  2. 5'-lCs.dAs.lCs.dGs.dAs.lTs.lTs.dAs.lGs.dCs.lAs.lTs.lTs.lA-3' (SEQ ID NO: 25)의 서열로 이루어지는 miR-155의 올리고뉴클레오타이드 억제제로서, 여기서 l은 잠금 뉴클레오타이드를 나타내고, d는 데옥시리보뉴클레오타이드를 나타내고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내는 것인 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 따르는 올리고뉴클레오타이드 억제제를 포함하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 조성물은 암을 치료하기 위해 사용되는 약학적 조성물이고, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    제 2 약제를 더 포함하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    제 2 약제는 레티노이드 또는 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제인 것인 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    레티노이드는 벡사로틴(bexarotene)인 조성물.
  8. 암 치료가 필요한 환자에서 암 치료에 사용하기 위한 제 1 항 또는 제 2 항에 따르는 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  9. 제 8 항에 있어서,
    암은 림프종인 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  10. 제 9 항에 있어서,
    림프종은 T 세포 림프종인 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  11. 제 9 항에 있어서,
    림프종은 피부 T 세포 림프종(CTCL)인 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  12. 제 11 항에 있어서,
    피부 T 세포 림프종(CTCL)은 균상 식육종(MF) 아형인 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  13. T 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는데 사용하기 위한 제 1 항 또는 제 2 항에 따르는 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  14. 제 13 항에 있어서,
    T 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 것은 투여량 의존적인 것인 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  15. 암 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는데 사용하기 위한 제 1 항 또는 제 2 항에 따르는 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  16. 제 15 항에 있어서,
    암 세포는 악성 T 세포인 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  17. 제 16 항에 있어서,
    악성 T 세포는 피부 T 세포 림프종 세포인 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  18. 제 8 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여는 미처리된 세포에 비하여 암 세포의 증식을 30% 내지 90% 감소시키거나 억제하는 것인 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  19. 제 8 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여는 암 세포의 세포자멸사를 유도하는 것인 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  20. 제 8 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드 억제제의 투여는 미처리된 세포에 비하여 암세포에서 카스파제 활성을 적어도 2배 증가시키는 것인 올리고뉴클레오타이드 억제제.
  21. 제 4 항에 있어서,
    암은 림프종인 것인 조성물.
  22. 제 4 항에 있어서,
    림프종은 T 세포 림프종인 조성물.
  23. 제 21 항에 있어서,
    림프종은 피부 T 세포 림프종(CTCL)인 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    피부 T 세포 림프종(CTCL)은 균상 식육종(MF) 아형인 조성물.



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