JP2020094073A - 皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)を処置するためのmiR−155阻害剤 - Google Patents
皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)を処置するためのmiR−155阻害剤 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)を処置するためのmiR−155阻害剤の提供。【解決手段】本発明は、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤およびその組成物を提供する。本発明は、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を被験体に投与することによって、被験体においてT細胞リンパ腫などのがんを処置するための方法をさらに提供する。本発明は、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与することによって、悪性T細胞の増殖を低減または阻害するための方法もまた提供する。【選択図】なし
Description
関連出願への相互参照
この出願は、2015年6月5日に出願された米国仮出願第62/171,758号(この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される)への優先権の利益を主張する。
この出願は、2015年6月5日に出願された米国仮出願第62/171,758号(この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される)への優先権の利益を主張する。
本発明は、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤およびその組成物に関する。本発明はまた、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与することによって、それを必要とする被験体においてがんを処置または予防するための方法を提供する。miR−155の活性または機能は、オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後に被験体のがん細胞において低減される。
microRNA(miRNA)は、遺伝子発現の転写後リプレッサーとして作用する小さい内因性の非コードRNAである。miRNAは、それらの配列が完全に相補的である場合にはそれらの分解を促進することによって、またはそれらの配列がミスマッチを含有する場合には翻訳を阻害することによって、標的mRNAのリプレッサーとして作用する。
miRNAは、RNAポリメラーゼII(pol II)またはRNAポリメラーゼIII(pol III;Qiら(2006年)Cellular & Molecular Immunology、3巻:411〜419頁を参照のこと)によって転写され、一般に数千塩基長である一次miRNA転写物(pri−miRNA)と呼ばれる初期転写物から生じる。pri−miRNAは、RNase Droshaによって、核において約70〜約100ヌクレオチドのヘアピン形状の前駆体(pre−miRNA)へとプロセシングされる。細胞質への輸送後に、ヘアピンpre−miRNAは、Dicerによってさらにプロセシングされて、二本鎖miRNAを産生する。次いで、成熟miRNA鎖は、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)中に取り込まれ、そこで、塩基対相補性によってその標的mRNAと会合する。miRNAがmRNA標的と完全に塩基対合する比較的稀な場合には、miRNAは、mRNA分解を促進する。より一般には、miRNAは、標的mRNAと不完全なヘテロ二重鎖を形成して、mRNA安定性に影響を与えるまたはmRNA翻訳を阻害する。
microRNAは、がんを含むいくつかの疾患に関与している。例えば、ヒトmiRNA遺伝子miR15aおよびmiR16−1は、B細胞慢性リンパ性白血病(CLL)の症例のおよそ60%において欠失または下方調節される(Calinら、Proc Natl Acad Sci、2002年;99巻:15524〜15529頁)。同様に、miR−155−5pの調節不全は、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)の病因に関与するシグナル伝達事象と関連付けられている。悪性T細胞は、IL−2受容体複合体、およびシグナル伝達性転写因子(signal transducers and activators of transcription)(STAT)タンパク質を介して転写を活性化する関連するヤヌスキナーゼ(JAK)を構成的に発現することが示されている。クロマチン免疫沈降実験により、STAT−5は、miR−155−5pの宿主遺伝子であるMIR155HGのプロモーターと会合したことが示された。これは、miR−155−5pがCTCL悪性T細胞においてSTAT−5シグナル伝達経路を調節し得ることを示唆している。JAK/STAT経路の阻害は、miR−155−5p発現の下方調節を生じたが、STAT−5を活性化するサイトカインによる細胞の処理は、増加したmiR−155−5pレベルを生じた(Koppら2013年)。これらの結果は、miR−155−5pがCTCLの病因において役割を果たし得ることを示唆している。
現在、後期CTCL患者を治癒させるまたはその生存を延長させる治療は存在しない(Princeら、2009年)。疾患の初期段階にあるCTCL患者のための処置は、注意深い医師のモニタリングを伴って、対症的かつ非攻撃的(non−aggressive)である。より進行した段階のCTCL患者は、典型的には、レチノイド(ベキサロテン)またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤(ボリノスタット)などの全身性薬物で処置される。放射線療法は、典型的には最後の砦であり、部分的な疾患退縮を生じることができるが、完全な根絶を生じることはできない。多くの処置は、重篤な副作用を有する、または時間と共に耐性を生じる。したがって、皮膚T細胞リンパ腫を処置するための新たな治療について、満たされていない医療上の要求が未だに存在する。
現在、後期CTCL患者を治癒させるまたはその生存を延長させる治療は存在しない(Princeら、2009年)。疾患の初期段階にあるCTCL患者のための処置は、注意深い医師のモニタリングを伴って、対症的かつ非攻撃的(non−aggressive)である。より進行した段階のCTCL患者は、典型的には、レチノイド(ベキサロテン)またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤(ボリノスタット)などの全身性薬物で処置される。放射線療法は、典型的には最後の砦であり、部分的な疾患退縮を生じることができるが、完全な根絶を生じることはできない。多くの処置は、重篤な副作用を有する、または時間と共に耐性を生じる。したがって、皮膚T細胞リンパ腫を処置するための新たな治療について、満たされていない医療上の要求が未だに存在する。
Qiら、Cellular & Molecular Immunology(2006年)3巻:411〜419頁
Calinら、Proc Natl Acad Sci(2002年)99巻:15524〜15529頁
本発明は、被験体の細胞においてmiR−155の活性または機能をモジュレートするためのオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。一実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、投与後に被験体のがん細胞においてmiR−155の活性または機能を下方調節する。ある特定の実施形態では、がん細胞は、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、αβT細胞、γδT細胞およびメモリーT細胞を含む悪性T細胞である。
一実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、11〜16ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から4番目のヌクレオチドもまたロックトヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から最初のヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。
別の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、11〜14ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。これらの実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも5、6、7、8、9または10個の改変型ヌクレオチドを含有し得る。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、7、8、9または10個の改変型ヌクレオチドを含有する。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する7、8、9または10個の改変型ヌクレオチドは、全てロックトヌクレオチドである。さらに一部の他の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する7、8、9または10個の改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドと、他の改変、例えば、エチレン架橋ヌクレオチド、2’−C架橋二環式ヌクレオチド、および糖改変、例えば2’置換ヌクレオチドとの組合せである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から2番目のDNAヌクレオチドは、未改変のDNAヌクレオチドであり得る。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から最初の3個の改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。
さらに別の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、11〜14ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも7ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。これらの実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも7、8、9または10個の改変型ヌクレオチドを含有し得る。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する7、8、9または10個の改変型ヌクレオチドは、全てロックトヌクレオチドである。さらに一部の他の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する7、8、9または10個の改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドと、他の改変、例えば、エチレン架橋ヌクレオチド、2’−C架橋二環式ヌクレオチド、および糖改変、例えば2’置換ヌクレオチドとの組合せである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から最初の3ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から最初の3個の改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から2番目または3番目のヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から2番目のDNAヌクレオチドは、未改変のDNAヌクレオチドであり得る。
さらに別の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、11〜14ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも4番目および5番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。これらの実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも7、8、9または10個の改変型ヌクレオチドを含有し得る。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する7、8、9または10個の改変型ヌクレオチドは、全てロックトヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から最初の3個の改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から4番目および/または5番目のDNAヌクレオチドは、未改変のDNAヌクレオチドであり得る。
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤中に存在し得る改変型ヌクレオチドには、ロックトヌクレオチド、エチレン架橋ヌクレオチド、2’−C架橋二環式ヌクレオチド、2’置換ヌクレオチド、ならびに本明細書に記載される他の糖および/または塩基改変が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する全ての改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。一部の他の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドと、他の改変、例えば、エチレン架橋ヌクレオチド、2’−C架橋二環式ヌクレオチド、および2’置換ヌクレオチド、ならびに本明細書に記載される他の糖および/または塩基改変との組合せである。
一実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、12〜14ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも5、6、7、8、9または10個のロックトヌクレオチドを含有する。一部の他の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも1、2、3、4、5個またはそれを超えるDNAヌクレオチドを含有する。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである。ある特定のさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目および4番目のヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも6番目および/または8番目のヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである。なおさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、5’末端から2番目、6番目および8番目の位置にDNAヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号3〜27および29〜120から選択される配列を有する。例示的な実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号25の配列を有する。別の例示的な実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号22または23の配列を有する。さらに別の例示的な実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号33、39、43、44、47、58、84、99、111、115および120から選択される配列を有する。
一実施形態では、本発明に従うmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、がん細胞の増殖を低減もしくは阻害する、および/またはがん細胞のアポトーシスを誘導する。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、がん細胞においてmiR−155の1個または複数の標的遺伝子を上方調節する。
本発明はまた、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を含む組成物およびその使用を提供する。一実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体においてがんを処置するための方法であって、治療有効量の本発明のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。miR−155の活性または機能は、オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後にがん細胞において低減される。一実施形態では、がんは、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)である。一部の実施形態では、がんを処置するための方法は、治療有効量の本発明のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤および治療有効量の第2の治療剤、例えば、レチノイドまたはヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を被験体に投与するステップを含む。
一実施形態では、本発明は、本発明に従うmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む、悪性T細胞の増殖を低減または阻害するための方法を提供する。miR−155の活性または機能は、オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後に悪性T細胞において低減される。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
11〜16ヌクレオチドの配列を含むmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤であって、
前記オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである、オリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目2)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から4番目のヌクレオチドがロックトヌクレオチドである、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目3)
少なくとも9個のロックトヌクレオチドを含有する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目4)
12ヌクレオチドの長さを有する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目5)
14ヌクレオチドの長さを有する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目6)
配列番号25の配列を有する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目7)
配列番号22の配列を有する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目8)
配列番号23の配列を有する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目9)
miR−155の活性または機能を低減する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目10)
がん細胞の増殖を低減する、項目1から9のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目11)
がん細胞のアポトーシスを誘導する、項目1から10のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目12)
前記がん細胞が悪性T細胞である、項目1から11のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目13)
前記がん細胞が皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)細胞である、項目10から12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目14)
悪性T細胞においてmiR−155の1個または複数の標的遺伝子の発現または活性を上方調節する、項目1から13のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目15)
項目1から14のいずれか一項に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
(項目16)
レチノイドまたはヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤である第2の治療剤をさらに含む、項目15に記載の医薬組成物。
(項目17)
11〜14ヌクレオチドの配列を含むmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤であって、
前記オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的で
あり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目18)
少なくとも7個の改変型ヌクレオチドを含有する、項目17に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目19)
前記改変型ヌクレオチドが、ロックトヌクレオチド、エチレン架橋ヌクレオチド、2’−C架橋二環式ヌクレオチドおよび2’置換ヌクレオチドからなる群から選択される、項目17または18に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目20)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から2番目のヌクレオチドが未改変のDNAヌクレオチドである、項目17に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目21)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から最初の3ヌクレオチドがロックトヌクレオチドである、項目17に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目22)
配列番号39、58、84、99、111、115および120からなる群から選択される配列を有する、項目17に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目23)
11〜14ヌクレオチドの配列を含むmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤であって、
前記オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも7ヌクレオチドが改変型ヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目24)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドである、項目23に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目25)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から2番目または3番目のヌクレオチドがDNAヌクレオチドである、項目23に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目26)
前記改変型ヌクレオチドが、ロックトヌクレオチド、エチレン架橋ヌクレオチド、2’−C架橋二環式ヌクレオチドおよび2’置換ヌクレオチドからなる群から選択される、項目23に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目27)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から2番目のヌクレオチドが未改変のDNAヌクレオチドである、項目23に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目28)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から最初の3ヌクレオチドがロックトヌクレオチドである、項目23に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目29)
配列番号39、43、44、58、84、99、111、115および120からなる群から選択される配列を有する、項目23に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目30)
がんの処置を必要とする被験体においてがんを処置するための方法であって、項目1、17または23に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
(項目31)
前記がんがリンパ腫である、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記がんが皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)である、項目30に記載の方法。
(項目33)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から4番目のヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドである、項目30に記載の方法。
(項目34)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、少なくとも9個のロックトヌクレオチドを含有する、項目30から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が12ヌクレオチドの長さを有する、項目30から34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が14ヌクレオチドの長さを有する、項目30から35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号25の配列を有する、項目30に記載の方法。
(項目38)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号22の配列を有する、項目30に記載の方法。
(項目39)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号23の配列を有する、項目30に記載の方法。
(項目40)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、配列番号39、43、44、58、84、99、111、115および120からなる群から選択される配列を有する、項目30に記載の方法。
(項目41)
第2の治療または薬剤を前記被験体に投与するステップをさらに含む、項目30から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記第2の治療または薬剤が、HDAC阻害剤、レチノイド、インターフェロン、葉酸代謝拮抗剤、外用ステロイド、外用レチノイド、外用ナイトロジェンマスタード、光線療法、紫外線、ソラレンおよび紫外線、放射線療法、電子線治療、抗CD30抗体、抗CCR4抗体、抗PD−1抗体ならびに抗PD−L1抗体からなる群から選択される、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記第2の治療または薬剤が、レチノイドまたはHDAC阻害剤である、項目41に記載の方法。
(項目44)
前記レチノイドがベキサロテンである、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記HDAC阻害剤が、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット(LBH589)、モセチノスタット、ベリノスタット(PXD101)、アベキシノスタット、CI−994(タセジナリン)およびMS−275(エンチノスタット)からなる群から選択される、項目43に記載の方法。
(項目46)
miR−155の活性または機能が、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後に前記被験体のがん細胞において低減される、項目30から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、がん細胞の増殖を低減する、項目30から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、がん細胞のアポトーシスを誘導する、項目30から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、悪性T細胞においてmiR−155の機能または活性を阻害する、項目30に記載の方法。
(項目50)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、悪性T細胞においてmiR−155の1個または複数の標的遺伝子の発現または活性を上方調節する、項目30に記載の方法。
(項目51)
項目1、17または23に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む、悪性T細胞の増殖を低減または阻害するための方法。
(項目52)
前記悪性T細胞が皮膚T細胞リンパ腫細胞である、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記悪性T細胞がCD4+T細胞である、項目51に記載の方法。
(項目54)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から4番目のヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドである、項目51に記載の方法。
(項目55)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、少なくとも9個のロックトヌクレオチドを含有する、項目51から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が12ヌクレオチドの長さを有する、項目51から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が14ヌクレオチドの長さを有する、項目51から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号25の配列を有する、項目51に記載の方法。
(項目59)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号22の配列を有する、項目51に記載の方法。
(項目60)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号23の配列を有する、項目51に記載の方法。
(項目61)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、配列番号39、43、44、58、84、99、111、115および120からなる群から選択される配列を有する、項目51に記載の方法。
(項目62)
第2の治療または薬剤を前記被験体に投与するステップをさらに含む、項目51から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記第2の治療または薬剤が、HDAC阻害剤、レチノイド、インターフェロン、葉酸代謝拮抗剤、外用ステロイド、外用レチノイド、外用ナイトロジェンマスタード、光線療法、紫外線、ソラレンおよび紫外線、放射線療法、電子線治療、抗CD30抗体、抗CCR4抗体、抗PD−1抗体ならびに抗PD−L1抗体からなる群から選択される、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記第2の治療または薬剤が、レチノイドまたはHDAC阻害剤である、項目63に記載の方法。
(項目65)
前記レチノイドがベキサロテンである、項目64に記載の方法。
(項目66)
前記HDAC阻害剤が、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット(LBH589)、モセチノスタット、ベリノスタット(PXD101)、アベキシノスタット、CI−994(タセジナリン)およびMS−275(エンチノスタット)からなる群から選択される、項目64に記載の方法。
(項目67)
miR−155の活性または機能が、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後に悪性T細胞において低減される、項目51から66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、がん細胞のアポトーシスを誘導する、項目51から66のいずれか一項に記載の方法。
(項目69)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、悪性T細胞においてmiR−155の機能または活性を阻害する、項目51に記載の方法。
(項目70)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、悪性T細胞においてmiR−155の1個または複数の標的遺伝子の発現または活性を上方調節する、項目51に記載の方法。
(項目71)
CTCLの処置のために被験体を選択するための方法であって、前記被験体の細胞において、表2に列挙された遺伝子から選択される1個または複数の遺伝子の発現のレベルを決定するステップ;前記被験体の前記細胞における前記1個または複数の遺伝子の前記レベルを、前記1個または複数の遺伝子の参照レベルと比較するステップ;ならびに前記参照レベルと比較して、前記細胞における前記1個または複数の遺伝子の前記レベルにおける増加および/または減少を有する被験体をCTCLの処置のために選択するステップを含む、方法。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
11〜16ヌクレオチドの配列を含むmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤であって、
前記オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである、オリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目2)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から4番目のヌクレオチドがロックトヌクレオチドである、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目3)
少なくとも9個のロックトヌクレオチドを含有する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目4)
12ヌクレオチドの長さを有する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目5)
14ヌクレオチドの長さを有する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目6)
配列番号25の配列を有する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目7)
配列番号22の配列を有する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目8)
配列番号23の配列を有する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目9)
miR−155の活性または機能を低減する、項目1に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目10)
がん細胞の増殖を低減する、項目1から9のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目11)
がん細胞のアポトーシスを誘導する、項目1から10のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目12)
前記がん細胞が悪性T細胞である、項目1から11のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目13)
前記がん細胞が皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)細胞である、項目10から12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目14)
悪性T細胞においてmiR−155の1個または複数の標的遺伝子の発現または活性を上方調節する、項目1から13のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目15)
項目1から14のいずれか一項に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
(項目16)
レチノイドまたはヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤である第2の治療剤をさらに含む、項目15に記載の医薬組成物。
(項目17)
11〜14ヌクレオチドの配列を含むmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤であって、
前記オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的で
あり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目18)
少なくとも7個の改変型ヌクレオチドを含有する、項目17に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目19)
前記改変型ヌクレオチドが、ロックトヌクレオチド、エチレン架橋ヌクレオチド、2’−C架橋二環式ヌクレオチドおよび2’置換ヌクレオチドからなる群から選択される、項目17または18に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目20)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から2番目のヌクレオチドが未改変のDNAヌクレオチドである、項目17に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目21)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から最初の3ヌクレオチドがロックトヌクレオチドである、項目17に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目22)
配列番号39、58、84、99、111、115および120からなる群から選択される配列を有する、項目17に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目23)
11〜14ヌクレオチドの配列を含むmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤であって、
前記オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも7ヌクレオチドが改変型ヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目24)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドである、項目23に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目25)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から2番目または3番目のヌクレオチドがDNAヌクレオチドである、項目23に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目26)
前記改変型ヌクレオチドが、ロックトヌクレオチド、エチレン架橋ヌクレオチド、2’−C架橋二環式ヌクレオチドおよび2’置換ヌクレオチドからなる群から選択される、項目23に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目27)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から2番目のヌクレオチドが未改変のDNAヌクレオチドである、項目23に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目28)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から最初の3ヌクレオチドがロックトヌクレオチドである、項目23に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目29)
配列番号39、43、44、58、84、99、111、115および120からなる群から選択される配列を有する、項目23に記載のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤。
(項目30)
がんの処置を必要とする被験体においてがんを処置するための方法であって、項目1、17または23に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
(項目31)
前記がんがリンパ腫である、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記がんが皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)である、項目30に記載の方法。
(項目33)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から4番目のヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドである、項目30に記載の方法。
(項目34)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、少なくとも9個のロックトヌクレオチドを含有する、項目30から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が12ヌクレオチドの長さを有する、項目30から34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が14ヌクレオチドの長さを有する、項目30から35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号25の配列を有する、項目30に記載の方法。
(項目38)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号22の配列を有する、項目30に記載の方法。
(項目39)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号23の配列を有する、項目30に記載の方法。
(項目40)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、配列番号39、43、44、58、84、99、111、115および120からなる群から選択される配列を有する、項目30に記載の方法。
(項目41)
第2の治療または薬剤を前記被験体に投与するステップをさらに含む、項目30から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記第2の治療または薬剤が、HDAC阻害剤、レチノイド、インターフェロン、葉酸代謝拮抗剤、外用ステロイド、外用レチノイド、外用ナイトロジェンマスタード、光線療法、紫外線、ソラレンおよび紫外線、放射線療法、電子線治療、抗CD30抗体、抗CCR4抗体、抗PD−1抗体ならびに抗PD−L1抗体からなる群から選択される、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記第2の治療または薬剤が、レチノイドまたはHDAC阻害剤である、項目41に記載の方法。
(項目44)
前記レチノイドがベキサロテンである、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記HDAC阻害剤が、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット(LBH589)、モセチノスタット、ベリノスタット(PXD101)、アベキシノスタット、CI−994(タセジナリン)およびMS−275(エンチノスタット)からなる群から選択される、項目43に記載の方法。
(項目46)
miR−155の活性または機能が、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後に前記被験体のがん細胞において低減される、項目30から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、がん細胞の増殖を低減する、項目30から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、がん細胞のアポトーシスを誘導する、項目30から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、悪性T細胞においてmiR−155の機能または活性を阻害する、項目30に記載の方法。
(項目50)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、悪性T細胞においてmiR−155の1個または複数の標的遺伝子の発現または活性を上方調節する、項目30に記載の方法。
(項目51)
項目1、17または23に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む、悪性T細胞の増殖を低減または阻害するための方法。
(項目52)
前記悪性T細胞が皮膚T細胞リンパ腫細胞である、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記悪性T細胞がCD4+T細胞である、項目51に記載の方法。
(項目54)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から4番目のヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドである、項目51に記載の方法。
(項目55)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、少なくとも9個のロックトヌクレオチドを含有する、項目51から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が12ヌクレオチドの長さを有する、項目51から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が14ヌクレオチドの長さを有する、項目51から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号25の配列を有する、項目51に記載の方法。
(項目59)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号22の配列を有する、項目51に記載の方法。
(項目60)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号23の配列を有する、項目51に記載の方法。
(項目61)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、配列番号39、43、44、58、84、99、111、115および120からなる群から選択される配列を有する、項目51に記載の方法。
(項目62)
第2の治療または薬剤を前記被験体に投与するステップをさらに含む、項目51から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記第2の治療または薬剤が、HDAC阻害剤、レチノイド、インターフェロン、葉酸代謝拮抗剤、外用ステロイド、外用レチノイド、外用ナイトロジェンマスタード、光線療法、紫外線、ソラレンおよび紫外線、放射線療法、電子線治療、抗CD30抗体、抗CCR4抗体、抗PD−1抗体ならびに抗PD−L1抗体からなる群から選択される、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記第2の治療または薬剤が、レチノイドまたはHDAC阻害剤である、項目63に記載の方法。
(項目65)
前記レチノイドがベキサロテンである、項目64に記載の方法。
(項目66)
前記HDAC阻害剤が、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット(LBH589)、モセチノスタット、ベリノスタット(PXD101)、アベキシノスタット、CI−994(タセジナリン)およびMS−275(エンチノスタット)からなる群から選択される、項目64に記載の方法。
(項目67)
miR−155の活性または機能が、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後に悪性T細胞において低減される、項目51から66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、がん細胞のアポトーシスを誘導する、項目51から66のいずれか一項に記載の方法。
(項目69)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、悪性T細胞においてmiR−155の機能または活性を阻害する、項目51に記載の方法。
(項目70)
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、悪性T細胞においてmiR−155の1個または複数の標的遺伝子の発現または活性を上方調節する、項目51に記載の方法。
(項目71)
CTCLの処置のために被験体を選択するための方法であって、前記被験体の細胞において、表2に列挙された遺伝子から選択される1個または複数の遺伝子の発現のレベルを決定するステップ;前記被験体の前記細胞における前記1個または複数の遺伝子の前記レベルを、前記1個または複数の遺伝子の参照レベルと比較するステップ;ならびに前記参照レベルと比較して、前記細胞における前記1個または複数の遺伝子の前記レベルにおける増加および/または減少を有する被験体をCTCLの処置のために選択するステップを含む、方法。
本開示を通じて言及される全ての特許および非特許文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、がん細胞においてmiR−155の活性または機能を阻害するオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。ヒトでは、miR−155は、MIR155宿主遺伝子即ちMIR155HGによってコードされ、ヒト第21染色体上に位置する。pre−miR−155の両方のアームが成熟miRNAを生じ得るので、pre−miR−155のプロセシング産物は、miR−155−5p(5’アームから)およびmiR−155−3p(3’アームから)と称される。ヒトmiR−155−5pおよびmiR−155−3pについての成熟配列を以下に示す:
ヒト成熟miR−155−5p(配列番号1)
5’−UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU−3’
ヒト成熟miR−155−3p(配列番号2)
5’−CUCCUACAUAUUAGCAUUAACA−3’
ヒト成熟miR−155−5p(配列番号1)
5’−UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU−3’
ヒト成熟miR−155−3p(配列番号2)
5’−CUCCUACAUAUUAGCAUUAACA−3’
miR−155−5pは、B細胞、T細胞、単球および顆粒球を含む造血細胞において発現される(Landgrafら2007年)。miR−155−5pは、骨髄造血および赤血球形成の両方の制御において非常に重要な分子である。このmiRNAは、初期幹前駆段階にある造血幹前駆細胞において高度に発現され、より成熟した造血細胞(例えば、リンパ球、赤血球)へのそれらの分化をブロックする。miR−155−5p発現は、これらの系譜に沿って細胞が成熟するにつれて漸進的に減少し、成熟造血細胞では約200分の1である(Masakiら2007年;Gerloffら2015年)。
miR−155−5pは、炎症応答および免疫応答を媒介することにおいて重要な役割を果たす。miR−155−5pを欠くマウスは、正常な数および分布のTリンパ球およびBリンパ球亜集団を示すが、特に、最適なT細胞依存性抗体応答を生じさせるためのTヘルパー細胞分化および胚中心反応の調節において、欠損した免疫応答を示す(Rodriguezら2007年;Thaiら2007年)。miR−155−5pは、Tヘルパー1型(Th1)、Th2およびTh17サブセットのTヘルパー細胞へのCD4+T細胞の分化を制御し、調節性T細胞(Treg)の発生に影響を与える(BaumjohannおよびAnsel 2013年)。miR−155−5pは、ウイルス感染に対するエフェクターおよびメモリーCD8+T細胞応答(Duddaら2013年;Graciasら2013年)、ならびに正常なB細胞分化および抗体産生もまた調節する。ヒトでは、miR−155−5p発現は、非リンパ系器官ならびに静止中のナイーブCD4+T細胞では低い。miR−155−5p発現は、B細胞およびT細胞の抗原受容体刺激によって(Tam 2001年;Haaschら2002年;van den Bergら 2003年;Rodriguezら 2007年;Thaiら 2007年;Vigoritoら2007年;Banerjeeら2010年)、ならびにマクロファージおよび樹状細胞のToll様受容体アゴニスト刺激によって(Taganovら2006年;O’Connellら2007年;Ceppiら2009年;Maoら2011年)、大きく増強される。MIR155HGの活性化は、AP1媒介性機構およびNF−κB媒介性機構の両方を含む。
菌状息肉症(MF)サブタイプのCTCLと診断された患者における皮膚プラークまたは腫瘍は、上昇したレベルのmiR−155−5pを有する。対照皮膚生検材料と比較してMF患者の皮膚生検材料において増加したmiR−155−5pが、いくつかのグループによって報告されている(van Kesterら2011年;Majら2012年;Koppら2013年b;Moyalら2013年)。1つの研究では、miR−155−5pレベルは、初期MF生検材料と比較して、腫瘍段階の生検材料において4.16倍高く(Moyalら2013年)、これは、miR−155−5pレベルが疾患の進行と相関し得ることを示唆している。miR−155−5pを発現する具体的な細胞型を同定することを目的とした第2の研究では、miRNAは、CTCL病変中の悪性T細胞および非悪性T細胞の両方において発現されることが見出された(Koppら2013年b)。
菌状息肉症(MF)は、全ての原発性皮膚リンパ腫の50〜70%を占める、CTCLの最も蔓延しているサブタイプである。2番目に蔓延しているサブタイプは、CTCL症例の15%を構成するセザリー症候群(SS)である。MFは、表皮においてパッチ、プラークまたは結節性腫瘍を形成する、大脳様核を有する非定型の小さい〜中間のサイズのTリンパ球の増殖により特徴付けられる。MFは典型的には、高齢者が罹患し(診断時の年齢中央値:55〜60歳)、パッチおよびプラークが腫瘍の形成に先行するまたは腫瘍の形成と同時発生的である、無痛性の臨床経過を有する。一部の後期腫瘍段階の症例では、リンパ節および内臓器官の関与が観察される。腫瘍段階のMFの間、皮膚浸潤はより散在性になり、非定型T細胞の表皮向性は喪失され得る。対照的に、SSは、皮膚の広範な発赤および落屑(scaling)(紅皮症)、肥大したリンパ節、ならびに末梢循環中の悪性細胞により特徴付けられる、より侵襲性の白血病性形態のCTCLである(Yamashitaら、2012年;Jawedら2014年)。
腫瘍段階のMFの分子的分析により、正常な皮膚、炎症した皮膚および正常なT細胞と比較して、遺伝子発現における有意な変化が明らかになったが(van Kesterら2012年)、遺伝子発現におけるこれらの差異の遺伝的またはエピジェネティックな起源は未知である。初期皮膚病変は、正常な表現型を有するT細胞、ならびに異常な形態学および悪性表現型を有するT細胞のより小さい集団を含む、多数の炎症細胞を含有する。浸潤物は、非悪性Th1細胞、調節性T細胞および細胞傷害性CD8+T細胞から主になる。悪性T細胞は、典型的には、クローン起源のCD4+メモリーT細胞である。疾患発達の間、表皮向性は、悪性CD4+T細胞における増加および非悪性CD8+T細胞における減少と随伴して、徐々に失われる。
CTCLは、転写因子およびシグナル伝達の調節因子の異常な発現および機能により特徴付けられる。シグナル分子およびサイトカインの機能不全性調節は、CTCLの悪性形質転換および病因において重要な役割を果たすと仮説が立てられている(Girardiら、2004年;Zhangら、2006年;van Doornら、2009年;KadinおよびVonderheid、2010年)。CTCLのこれらの変種についての別個の病因と一致して、MFおよびSS細胞の遺伝子発現プロファイルにおいて有意差が観察されている(van Doornら、2009年;Campbellら、2010年)。最近、microRNA(miRNA)は、CTCLの病因において示差的に発現され、CTCLの病因に潜在的に関与することが報告されている。miR−155−5pは、miRNAの中で菌状息肉症において最も上方調節されるが(Koppら、2013年a;Koppら、2013年b)、別個のサブセットの調節不全のmiRNAは、セザリー症候群を識別し、miR−155−5pは、このサブタイプのCTCLでは上方調節されない(Ballabioら、2010年)。
本発明は、ヒトmiR−155の活性または機能を低減または阻害するオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。本発明に関して、用語「オリゴヌクレオチド阻害剤」、「抗miR」(例えば、抗miR−155)、「アンタゴニスト」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド即ちASO」、「オリゴマー」、「抗microRNAオリゴヌクレオチド即ちAMO」または「ミックスマー(mixmer)」は、広く使用され、miRNAに完全にまたは部分的にハイブリダイズし、それによって標的miRNAの機能または活性を抑制することによって、標的microRNA(miRNA)の活性または機能を阻害する、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改変型リボヌクレオチド、改変型デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの組合せを含むオリゴマーを包含する。
用語「miR−155」は、本明細書で使用する場合、pri−miR−155、pre−miR−155、miR−155−5pおよびhsa−miR−155−5pを含む。
一実施形態では、本発明は、11〜16ヌクレオチドの長さを有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。一部の他の実施形態では、本発明は、11〜14ヌクレオチドの長さを有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。種々の実施形態では、miR−155を標的化するオリゴヌクレオチド阻害剤は、11、12、13、14、15または16ヌクレオチド長である。一実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、12ヌクレオチドの長さを有する。別の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、14ヌクレオチドの長さを有する。
本発明に従うmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列は、生理的条件下でmiR−155−5pにハイブリダイズし、被験体の細胞においてmiR−155−5pの活性または機能を阻害するのに十分に、miR−155−5pの成熟配列に対して相補的である。例えば、一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155−5pの成熟配列に対して少なくとも部分的に相補的な配列、例えば、miR−155−5pの成熟配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%相補的な配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155−5pの成熟配列に対して実質的に相補的、即ち、miR−155−5pの成熟配列に対して少なくとも約90%、95%、96%、97%、98%または99%相補的であり得る。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155−5pの成熟配列に対して100%または完全に相補的な配列を含む。オリゴヌクレオチド阻害剤の配列は、オリゴヌクレオチド配列が、天然に存在するヌクレオチドの代わりに改変型ヌクレオチドを含む場合であっても、miR−155に対して相補的であるとみなされると理解される。例えば、miR−155の成熟配列が、特定の位置においてグアノシンヌクレオチドを含む場合、オリゴヌクレオチド阻害剤は、対応する位置において、改変型シチジンヌクレオチド、例えば、ロックトシチジンヌクレオチドまたは2’−フルオロ−シチジンを含み得る。
用語「約」は、本明細書で使用する場合、+/−10%の、より好ましくは+/−5%の変動を包含し、かかる変動は、本発明の実施に適切である。
一部の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列全体が、ヒトmiR−155−5pの成熟配列に対して完全に相補的である。種々の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列が部分的に、実質的にまたは完全に相補的であるヒトmiR−155−5pの成熟配列は、配列番号1の5’末端からヌクレオチド1〜17、またはヌクレオチド2〜17、またはヌクレオチド2〜16、またはヌクレオチド2〜15、またはヌクレオチド2〜14、またはヌクレオチド2〜13、またはヌクレオチド2〜12を含む。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列が部分的に、実質的にまたは完全に相補的であるヒトmiR−155−5pの成熟配列は、配列番号1の5’末端からヌクレオチド2〜15を含む。別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列が部分的に、実質的にまたは完全に相補的であるヒトmiR−155−5pの成熟配列は、配列番号1の5’末端からヌクレオチド2〜13を含む。
一実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも1つの骨格改変、例えば、少なくとも1つのホスホロチオエート、モルホリノまたはホスホノカルボキシレート(phosphonocarboxylate)ヌクレオチド間連結を含有する(例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,693,187号および同第7,067,641号を参照のこと)。ある特定の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、完全にホスホロチオエート連結される。
一実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも1個の改変型ヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも5、6、7、8、9、10個またはそれを超える改変型ヌクレオチドを含有する。用語「改変型ヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、糖、塩基および/または骨格改変を有するヌクレオチドを包含する。改変型ヌクレオチドの例には、ロックトヌクレオチド(LNA)、エチレン架橋ヌクレオチド(ENA)、2’−C架橋二環式ヌクレオチド(CBBN)、S−cEtまたはcEtと呼ばれる2’,4’−拘束エチル核酸、2’−4’−炭素環式LNA、および2’置換ヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない。
用語「ロックトヌクレオチド」、「ロックト核酸単位」、「ロックト核酸残基」または「LNA単位」は、本開示を通じて相互交換可能に使用され得、二環式ヌクレオシドアナログを指す。例えば、適切なオリゴヌクレオチド阻害剤は、BSNを含有するオリゴヌクレオチドとそれらの相補的標的鎖との間で形成される複合体に増強された熱安定性を付与する1つまたは複数の「コンフォメーション的に拘束された」または二環式糖ヌクレオシド改変(BSN)から構成され得る。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、2’−O,4’−C−メチレンリボヌクレオシド(構造A)を含有するロックトヌクレオチド即ちLNAを含有し、ここで、リボース糖部分は、「ロックト」コンフォメーションである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも1つの2’−C,4’−C架橋2’デオキシリボヌクレオシド(構造B)を含有する。例えば、その両方がそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,403,566号およびWangら(1999年)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters、9巻:1147〜1150頁を参照のこと。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、構造Cで示される構造を有する改変型ヌクレオシドを少なくとも1個含有する。miR−155を標的化するオリゴヌクレオチド阻害剤は、BSN(LNA、2’−C,4’−C架橋2’デオキシリボヌクレオシドなど)または他の改変型ヌクレオチドと、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドとの組合せを含有し得る。
用語「非LNAヌクレオチド」および「非LNA改変」は、本明細書で使用する場合、LNAヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを指す、即ち、用語は、DNAヌクレオチド、RNAヌクレオチド、ならびに改変がLNA改変でない点を除いて塩基および/または糖が改変された改変型ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、非LNA改変を含有するヌクレオチドを少なくとも1個含有する。例えば、一実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国付与前公開第2016/0010090A1号(「‘090公報」)に記載されるような、2’−C架橋二環式ヌクレオチド(CBBN)を少なくとも1個含有する。‘090公報は、種々のCBBN改変、例えば、2’−CBBN、オキソCBBN、アミノCBBN、チオCBBNなどを記載している。‘090公報に記載される全てのCBBN改変は、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤において使用され得る。別の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する非LNA改変は、エチレン架橋核酸(ENA)改変であり得る。例えば、一実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、本明細書でエチレン架橋ヌクレオチドとも呼ばれるエチレン架橋核酸(ENA)を少なくとも1つ含有する。他の架橋された改変には、S−cEtまたはcEtと称される2’,4’−拘束エチル核酸および2’−4’−炭素環式LNA(carba−LNA)が含まれる。
本発明に関してその対応するロックトヌクレオチドによってDNAまたはRNAヌクレオチドを置換することに言及する場合、用語「対応するロックトヌクレオチド」は、DNA/RNAヌクレオチドが、それが置き換えたDNA/RNAヌクレオチドと同じ天然に存在する窒素性塩基、または化学的に改変された同じ窒素性塩基を含有するロックトヌクレオチドによって置き換えられていることを意味することを意図する。例えば、窒素性塩基Cを含有するDNAヌクレオチドの対応するロックトヌクレオチドは、同じ窒素性塩基C、または5−メチルシトシンなどの、化学的に改変された同じ窒素性塩基Cを含有し得る。
ある特定の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも5、6、7、8、9、10または11個のロックトヌクレオチドを含有する。一実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも7、8、9または10個のロックトヌクレオチドを含有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の4ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から最初のヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個または少なくとも5個のDNAヌクレオチドを含有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目および4番目のヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである。
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、塩基改変または置換を有する改変型ヌクレオチドを含み得る。RNA中の天然または未改変の塩基は、プリン塩基アデニン(A)およびグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基シトシン(C)およびウラシル(U)(DNAはチミン(T)を有する)である。複素環式塩基部分とも称される改変型塩基には、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2−プロピルおよび他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシン、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニルウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(シュードウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシルならびに他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−ハロ(5−ブロモ、5−トリフルオロメチルならびに他の5−置換ウラシルおよびシトシンを含む)、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン、2−F−アデニン、2−アミノ−アデニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニンならびに3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニンが含まれる。ある特定の実施形態では、miR−155を標的化するオリゴヌクレオチド阻害剤は、塩基改変(例えば、5−メチルシトシン)と組み合わせて、1つまたは複数のBSN改変を含む。
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、改変型糖部分を有するヌクレオチドを含み得る。代表的な改変型糖には、炭素環式または非環式の糖、それらの2’位、3’位または4’位のうち1つまたは複数において置換基を有する糖、および糖の1個または複数の水素原子の代わりに置換基を有する糖が含まれる。ある特定の実施形態では、糖は、2’位に置換基を有することによって改変される。さらなる実施形態では、糖は、3’位に置換基を有することによって改変される。他の実施形態では、糖は、4’位に置換基を有することによって改変される。糖が、それらの位置のうち1つよりも多くにおいて改変を有し得ること、またはオリゴヌクレオチド阻害剤が、1つの位置において糖改変を有する1個もしくは複数のヌクレオチドを有し得、異なる位置において糖改変を有する1個もしくは複数のヌクレオチドもまた有し得ることもまた企図される。
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤中の企図される糖改変には、OH;F;O−、S−もしくはN−アルキル;O−、S−もしくはN−アルケニル;O−、S−もしくはN−アルキニル;またはO−アルキル−O−アルキルから選択される置換基が含まれるがこれらに限定されず、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、C1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルで置換されていても置換されていなくてもよい。一実施形態では、改変には、2’−メトキシエトキシ(2’−O−(2−メトキシエチル)または2’−MOEとしても公知の2’−O−CH2CH2OCH3)、即ち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。別の改変には、2’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、2’−DMAOEとしても公知のO(CH2)2ON(CH3)2基、および2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(当該分野で2’−O−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは2’−DMAEOEとしても公知)即ち、2’−O−CH2−O−CH2−N(CH3)2が含まれる。
さらなる糖置換基には、アリル(−CH2−CH=CH2)、−O−アリル、メトキシ(−O−CH3)、アミノプロポキシ(−OCH2CH2CH2NH2)およびフルオロ(F)が含まれる。2’位(2’−)上の糖置換基は、アラビノ(上)位置またはリボ(下)位置にあり得る。1つの2’−アラビノ改変は、2’−Fである。他の類似の改変は、糖部分上の他の位置、特に、3’末端ヌクレオシド上または2’−5’連結されたオリゴヌクレオチド中の糖の3’位、および5’末端ヌクレオチドの5’位においてもなされ得る。ある特定の実施形態では、糖改変は、2’−O−アルキル(例えば、2’−O−メチル、2’−O−メトキシエチル)、2’−ハロ(例えば、2’−フルオロ、2’−クロロ、2’−ブロモ)および4’チオ改変である。
その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,838,283号に記載されるものなどの、安定性を増強し、効力を改善するためのオリゴヌクレオチド阻害剤の他の改変が当該分野で公知であり、本発明の方法における使用に適切である。例えば、in vivo送達および安定性を促進するために、オリゴヌクレオチド阻害剤は、その3’末端において、コレステロール部分などのステロイド、ビタミン、脂肪酸、炭水化物もしくはグリコシド、ペプチド、または他の小分子リガンドに連結され得る。
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、ステロイド(コレステロール)などの担体分子にコンジュゲートされ得る。担体分子は、直接、またはリンカーもしくはスペーサー基を介してのいずれかで、オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端または5’末端に付着される。種々の実施形態では、担体分子は、コレステロール、コレステロール誘導体、コール酸またはコール酸誘導体である。その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,202,227号に開示される担体分子の使用もまた想定される。ある特定の実施形態では、担体分子はコレステロールであり、少なくとも6炭素のリンカーを介して、オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端または5’末端に付着される。一部の実施形態では、担体分子は、6または9炭素のリンカーを介して、オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端または5’末端に付着される。一部の実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。種々の実施形態では、リンカーは、実質的に直鎖状の炭化水素部分を含む。炭化水素部分は、約3〜約15個の炭素原子を含み得、比較的非極性の基、例えば、エーテルまたはチオエーテル連結を介してコレステロールにコンジュゲートされ得る。ある特定の実施形態では、炭化水素リンカー/スペーサーは、任意選択で置換されたC2〜C15の飽和または不飽和の炭化水素鎖(例えば、アルキレンまたはアルケニレン)を含む。その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国付与前公開第2012/0128761号に記載される種々のリンカー/スペーサー基が、本発明において使用され得る。
一実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、11〜16ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から4番目のヌクレオチドもまた、ロックトヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目および4番目のヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、12または14ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも5、6、7、8、9または10個のロックトヌクレオチドを含有する。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも6番目および/または8番目のヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである。なおさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、5’末端から2番目、6番目および8番目の位置にDNAヌクレオチドを含む。
別の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、11〜14ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、改変型または未改変のデオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。
さらに別の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、11〜14ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも7ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、改変型または未改変のデオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。
さらに別の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、11〜14ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも4番目および5番目のヌクレオチドは、改変型または未改変のデオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から4番目および/または5番目のDNAヌクレオチドは、未改変のDNAヌクレオチドである。
オリゴヌクレオチド阻害剤が11〜14ヌクレオチド長である一部の実施形態では、前記阻害剤は、少なくとも5、6、7、8、9または10個の改変型ヌクレオチドを含有する。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、7、8、9または10個の改変型ヌクレオチドを含有する。オリゴヌクレオチド阻害剤が11〜14ヌクレオチド長である一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドである。一部の実施形態では、全ての改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する5、6、7、8、9または10個の改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドと、非LNA改変を含有するヌクレオチド、例えば、エチレン架橋ヌクレオチド、2’−C架橋二環式ヌクレオチド、2’置換ヌクレオチド、ならびに本明細書に記載される他の糖および/または塩基改変との組合せである。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から2番目のヌクレオチドは、未改変のデオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。
一実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号25の配列を含む。別の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号22の配列を含む。さらに別の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号23の配列を含む。
一部の他の実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号33、39、43、44、47、58、84、99、111、115および120からなる群から選択される配列を含む。
種々の実施形態では、miR−155−5pのオリゴヌクレオチド阻害剤は、表1から選択される配列を有する。
被験体への本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、被験体の細胞においてmiR−155の活性または機能を低減または阻害する。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、がん細胞、BおよびTリンパ球、単球、マクロファージ、小グリア細胞、NK細胞ならびに炎症細胞を含む免疫系の細胞において、miR−155の活性または機能を阻害する。一実施形態では、がん細胞は悪性T細胞である。本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤で処置され得る悪性T細胞には、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、αβT細胞、γδT細胞およびメモリーT細胞が含まれる。一実施形態では、悪性T細胞は、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)細胞である。
一部の実施形態では、本発明のある特定のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のmiR−155阻害剤と比較して、悪性T細胞などのがん細胞において、miR−155の活性または機能のより高い阻害を示し得る。用語「他のmiR−155阻害剤」は、核酸阻害剤、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗miR、アンタゴmiR、ミックスマー、ギャップマー(gapmer)、アプタマー、リボザイム、低分子干渉RNAもしくは低分子ヘアピンRNA;抗体もしくはその抗原結合性断片;および/またはmiR−155の活性もしくは機能を阻害する薬物を含む。本発明の特定のオリゴヌクレオチド阻害剤は、本発明の他のオリゴヌクレオチド阻害剤と比較して、悪性T細胞などのがん細胞において、miR−155のより高い阻害を示し得る可能性がある。用語「より高い」は、本明細書で使用する場合、定量的により多いこと、または統計的に有意により多いことを指す。
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、被験体の細胞においてmiR−155標的遺伝子の発現または活性を上方調節する。miR−155の標的遺伝子には、INPP50/SHIP1、Jarid2、Picalm、Bach1、Wee1、CUX1、Cebpb、SPIB/PU.1およびIL7Rが含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、がん細胞、BおよびTリンパ球、単球、マクロファージ、小グリア細胞、NK細胞ならびに炎症細胞を含む免疫系の細胞において、miR−155の少なくとも4個の標的遺伝子の発現または活性を上方調節する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤によって上方調節される4個の標的遺伝子は、Bach1、Jarid2、PicalmおよびSHIP1を含む。本発明は、miR−155阻害剤の活性を決定するための手段として、これら4個の遺伝子の発現における変化(遺伝子発現シグネチャー)を使用することを包含する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与の際に、miR−155標的遺伝子の発現または活性において、それらの間の値を含め、約1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍または8倍の変化が存在する。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与の際に、miR−155標的遺伝子の発現または活性において、それらの間の値を含め、少なくとも約2倍、3倍、4倍または5倍の変化が存在する。
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のmiR−155阻害剤と比較して、悪性T細胞などのがん細胞において、miR−155標的遺伝子のより高い上方調節を示す。ある特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のmiR−155阻害剤と比較して、がん細胞において、miR−155の少なくとも4個の標的遺伝子のより高い上方調節を示す。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のmiR−155阻害剤と比較して、がん細胞において、4個の遺伝子、即ち、Bach1、Jarid2、PicalmおよびSHIP1の発現または活性のより高い上方調節を示す。種々の実施形態では、「より高い上方調節」は、他のmiR−155阻害剤と比較して、miR−155標的遺伝子の発現または活性における、それらの間の値を含め、約2倍、3倍、4倍または5倍の増加を含む。
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)細胞を含む悪性T細胞などのがん細胞の増殖を低減もしくは阻害する、および/またはがん細胞のアポトーシスを誘導する。本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、それらの間の値を含め、最大で約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%または100%の、がん細胞の数における低減を提供し得る。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、それらの間の値を含め、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%または50%の、がん細胞の数における低減を提供し得る。
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のmiR−155阻害剤と比較して、がん細胞の増殖のより高い阻害および/またはがん細胞のアポトーシスにおけるより高い誘導を示し得る。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のmiR−155阻害剤と比較して、それらの間の値を含め、最大で約10%、15%、20%、25%、30%、35%または40%大きい、がん細胞の数における低減を示し得る。
本発明は、それを必要とする被験体においてがんを処置するための方法であって、本発明に従うmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。miR−155の活性または機能は、オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後に被験体のがん細胞において低減される。
一実施形態では、がんを処置するための方法は、11〜16ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。
別の実施形態では、がんを処置するための方法は、11〜14ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。
別の実施形態では、がんを処置するための方法は、11〜14ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも7ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。
さらに別の実施形態では、がんを処置するための方法は、11〜14ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも4番目および5番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。
本発明に従って処置され得るがんには、T細胞リンパ腫、例えば皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、およびB細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに皮膚がんが含まれる。ある特定の実施形態では、がんを処置するための方法は、配列番号22、配列番号23および配列番号25からなる群から選択されるmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。一部の他の実施形態では、がんを処置するための方法は、配列番号33、39、43、44、47、58、84、99、111、115および120からなる群から選択されるmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。
一実施形態では、本発明は、本発明に従うmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を被験体に投与することによって、菌状息肉症(MF)形態のCTCLを処置するための方法を提供する。一実施形態では、MF形態のCTCLを処置するための方法は、11〜16ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。
別の実施形態では、本発明は、11〜14ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む、菌状息肉症(MF)形態のCTCLを処置するための方法であって、オリゴヌクレオチド阻害剤が、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、11〜14ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む、菌状息肉症(MF)形態のCTCLを処置するための方法であって、オリゴヌクレオチド阻害剤が、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも7ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである、方法を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、11〜14ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む、菌状息肉症(MF)形態のCTCLを処置するための方法であって、オリゴヌクレオチド阻害剤が、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも4番目および5番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、MF形態のCTCLを処置するための方法は、配列番号22、配列番号23および配列番号25からなる群から選択されるmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。一部の他の実施形態では、MF形態のCTCLを処置するための方法は、配列番号33、39、43、44、47、58、84、99、111、115および120からなる群から選択されるmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。
本発明は、第2の治療剤と組み合わせて本発明に従うmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む、CTCLを処置するための方法もまた包含する。CTCLのための現行の処置としては、皮膚指向性の治療、例えば、外用ステロイド、外用ナイトロジェンマスタード(メクロレタミンHCL)、外用レチノイド、光線療法、紫外線処置、ソラレン紫外線処置、放射線療法、電子線治療など、ならびに全身治療、例えば、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤、レチノイド(ベキサロテン)、インターフェロンおよび低用量葉酸代謝拮抗剤(例えば、メトトレキセートおよびプララトレキセート)の投与が含まれる。さらなる処置選択肢、例えば、抗CD30抗体(例えば、ブレンツキシマブ)、抗CCR4抗体(例えば、モガムリズマブ)、および抗PD−1または抗PD−L1抗体は、現在試験されている。第2の治療剤は、一般に、これらの処置のうち1つから選択される薬剤または治療を含む。例えば、本発明は、HDAC阻害剤、レチノイド、インターフェロン、葉酸代謝拮抗剤、外用ステロイド、外用レチノイド、外用ナイトロジェンマスタード、光線療法、紫外線、ソラレンおよび紫外線、放射線療法、電子線治療、抗CD30抗体(例えば、ブレンツキシマブ)、抗CCR4抗体(例えば、モガムリズマブ)、ならびに抗PD−1または抗PD−L1抗体による処置などの第2の治療と組み合わせてmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与することによって、CTCLを処置するための方法を包含する。
種々のHDAC阻害剤が公知であり、そのうち一部は、臨床的使用のためにFDAによって承認されており、一部は、臨床試験において試験されている。本発明に従うがんを処置するための方法は、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット(LBH589)、モセチノスタット、ベリノスタット(PXD101)、アベキシノスタット(abexinostat)、CI−994(タセジナリン(tacedinaline))およびMS−275(エンチノスタット)が含まれるがこれらに限定されないHDAC阻害剤の使用を包含する。第2の治療/薬剤が含められる実施形態では、第2の治療/薬剤は、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与の前または後の異なる時点で投与され得る。事前の投与は、例えば、第2の薬剤の投与の約1週間前から30分前までの範囲内の第1の薬剤の投与を含む。事前の投与は、例えば、第2の薬剤の投与の約2週間前から30分前までの範囲内の第1の薬剤の投与もまた含み得る。後の(after)またはより後の(later)投与は、例えば、第1の薬剤の投与の約1週間後から30分後までの範囲内の第2の薬剤の投与を含む。後のまたはより後の投与は、例えば、第1の薬剤の投与の約2週間後から30分後までの範囲内の第2の薬剤の投与もまた含み得る。
本発明はまた、11〜16ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与することによって、がん細胞、特に悪性T細胞の増殖を低減または阻害するための方法であって、オリゴヌクレオチド阻害剤が、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がん細胞、特に悪性T細胞の増殖を低減または阻害するための方法であって、11〜14ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤が、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がん細胞、特に悪性T細胞の増殖を低減または阻害するための方法であって、11〜14ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤が、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも7ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである、方法を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、がん細胞、特に悪性T細胞の増殖を低減または阻害するための方法であって、11〜14ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤が、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも4番目および5番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、がん細胞、特に悪性T細胞の増殖を低減または阻害するための方法は、配列番号22、配列番号23および配列番号25からなる群から選択されるmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。一部の他の実施形態では、がん細胞、特に悪性T細胞の増殖を低減または阻害するための方法は、配列番号33、39、43、44、47、58、84、99、111、115および120からなる群から選択されるmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。
悪性T細胞には、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)細胞、CD4+T細胞およびメモリーT細胞が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、投与後に、miR−155の活性もしくは機能を低減するおよび/または悪性T細胞においてmiR−155の1個もしくは複数の標的遺伝子を上方調節する。がん細胞の増殖を低減または阻害するための方法は、本オリゴヌクレオチド阻害剤の投与と共に、上記第2の治療/薬剤の使用もまた含む。
ある特定の実施形態では、本発明によって包含される方法は、患者の皮膚病変1つ当たり18.75、37.5または75mgの本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。他の実施形態では、本発明の方法は、それらの間の値を含め、合計で約37.5、75、150、300、600、900または1200mgの本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤を患者に全身投与するステップを含む。さらに一部の他の実施形態では、本発明の方法は、それらの間の値を含め、合計で約350、700、1050、1400、1750、2100、2450、2800、3150または3500mgの本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤を患者に全身投与するステップを含む。
好ましくは、被験体への本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、がんと関連する1つまたは複数の症状または病態の改善を生じる。例えば、一実施形態では、単独でまたはHDAC阻害剤などの第2の治療剤と組み合わせた本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、皮膚病変の数;皮膚上の赤い痒いパッチもしくはプラークの数;および/またはCTCLと関連する新たな皮膚病変/パッチ/プラークの形成を低減する。一実施形態では、単独でまたはHDAC阻害剤などの第2の治療剤と組み合わせた本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、皮膚への悪性Tリンパ球の遊走を低減または阻害する。別の実施形態では、単独でまたは第2の治療剤と組み合わせた本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、皮膚において総悪性Tリンパ球を低減する。さらに別の実施形態では、単独でまたは第2の治療剤と組み合わせた本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、皮膚から末梢中に回避または遊走し得る悪性T細胞の数を低減する。
本明細書で使用する場合、用語「被験体」または「患者」は、ヒトおよび他の霊長類(例えば、チンパンジーならびに他の類人猿およびサル種)、家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ)、飼育哺乳動物(例えば、イヌおよびネコ)、実験動物(例えば、げっ歯類、例えば、マウス、ラットおよびモルモット)、ならびに鳥(例えば、家禽、野鳥および猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ類の鳥、アヒル、ガチョウなど)が含まれるがこれらに限定されない任意の脊椎動物を指す。一部の実施形態では、被験体は哺乳動物である。他の実施形態では、被験体はヒトである。
本明細書に記載されるmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤のいずれかは、miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤をコードする発現ベクターを細胞に送達することによって、標的細胞(例えば、悪性T細胞)に送達され得る。「ベクター」は、細胞の内側に目的の核酸を送達するために使用され得る物質の組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスが含まれるがこれらに限定されない多数のベクターが、当該分野で公知である。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるがこれらに限定されない。特定の一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。発現構築物は、生細胞中で複製され得、または合成により作製され得る。本出願の目的のために、用語「発現構築物」、「発現ベクター」および「ベクター」は、一般的な説明的意味において本発明の適用を実証するために相互交換可能に使用され、本発明を限定することは意図しない。
一実施形態では、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を発現させるための発現ベクターは、オリゴヌクレオチド阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。語句「作動可能に連結した」または「転写制御下にある」は、本明細書で使用する場合、RNAポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、プロモーターがポリヌクレオチドに対して正確な位置および配向にあることを意味する。
本明細書で使用する場合、「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写を開始するために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列を指す。適切なプロモーターには、RNA pol I、pol II、pol IIIおよびウイルスプロモーター(例えば、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)最初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスの長い末端反復)が含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、プロモーターは、T細胞特異的プロモーター、例えば、lck遺伝子の近位および遠位プロモーター、またはCD4遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー配列などである。
ある特定の実施形態では、miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、当該分野で公知であり、これには、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインIIAプロモーター、ヒートショックプロモーター、ステロイド/甲状腺ホルモン/レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーター、および誘導性マウス乳癌ウイルスLTRが含まれるがこれらに限定されない。
発現構築物および核酸を細胞に送達する方法は、当該分野で公知であり、これには、例えば、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、DEAE−デキストラン、リポフェクション、ポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクション、細胞超音波処理、高速微小発射体(high velocity microprojectile)を使用する遺伝子銃(gene bombardment)、および受容体媒介性トランスフェクションが含まれ得る。
本発明は、CTCLを診断するための方法、およびCTCLのための処置を受けている患者の臨床状態をモニタリングするための方法もまた提供する。本発明は、本発明の抗miR−155化合物の投与が、対照処理細胞またはセザリー症候群細胞と比較して、3つ全てのMF細胞株(HuT102、MJおよびMyLa)において独自のセットの遺伝子を上方調節および/または下方調節することを示している。本発明は、MFサブタイプのCTCLを診断するため、およびmiR−155阻害剤によるCTCL処置の進行をモニタリングするために、この独自のセットの遺伝子に基づく遺伝子発現シグネチャーを使用することを企図する。例えば、本発明は、表2に列挙された遺伝子のセットが、本発明の抗miR−155化合物に応答して、3つ全てのMF細胞株において上方調節または下方調節されることを示している。一実施形態では、本発明は、CTCLに罹患している疑いがある被験体において、表2に列挙された1個または複数の遺伝子の発現レベルを測定し、発現レベルを参照レベル(例えば、健康な被験体における発現レベルまたはCTCL被験体の非がん細胞における発現レベル)と比較し、被験体における発現レベルが参照レベルと比較して下方調節または上方調節される場合に、被験体がCTCLを有すると診断することによって、CTCLを診断するための方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、CTCLの処置のために被験体を選択するための方法であって、被験体のCTCL細胞において1個または複数の遺伝子の発現のレベルを決定するステップであって、1個または複数の遺伝子が、全てのMF細胞においてモジュレートされた遺伝子のセット、例えば表2から選択される、ステップ;被験体のCTCL細胞における1個または複数の遺伝子のレベルを、1個または複数の遺伝子の参照レベルと比較するステップ;ならびに参照レベルと比較して、CTCL細胞における1個または複数の遺伝子のレベルにおける増加または減少を有する被験体をCTCLの処置のために選択するステップを含む、方法を提供する。別の実施形態では、CTCLの処置のために被験体を選択するための方法は、被験体のCTCL細胞において、INPP50/SHIP1、Jarid2、Picalm、Bach1、Wee1、CUX1、Cebpb、SPIB/PU.1およびIL7Rからなる群から選択される4個またはそれを超える遺伝子の発現のレベルを決定するステップ;被験体のCTCL細胞における4個またはそれを超える遺伝子のレベルを、4個またはそれを超える遺伝子の参照レベルと比較するステップ;ならびに参照レベルと比較して、CTCL細胞における4個またはそれを超える遺伝子のレベルにおける減少を有する被験体をCTCLの処置のために選択するステップを含む。一実施形態では、CTCLの処置のために被験体を選択するための方法は、4個の遺伝子Bach1、Jarid2、PicalmおよびSHIP1の参照レベルと比較して、被験体のCTCL細胞における4個の遺伝子のレベルを決定するステップを含む。ある特定の実施形態では、CTCLの処置のために被験体を選択するための方法は、4個の遺伝子の参照レベルと比較して、被験体のCTCL細胞における4個の遺伝子Bach1、Jarid2、PicalmおよびSHIP1のレベルを決定するステップ;ならびに参照レベルと比較して、CTCL細胞における4個の遺伝子のレベルにおける多くとも2分の1の減少を有する被験体をCTCLの処置のために選択するステップを含む。一実施形態では、参照レベルは、対照のオリゴヌクレオチド処理細胞における同じ遺伝子の発現のレベルである。別の実施形態では、参照レベルは、セザリー症候群細胞における同じ遺伝子の発現のレベルである。さらに別の実施形態では、参照レベルは、健康な被験体(例えば、皮膚がんの2つもしくはそれを超える症状を示さない被験体、皮膚がんと診断されていない被験体、および/または皮膚がんの家族歴を有さない被験体)における同じ遺伝子の発現のレベルである。
本発明はまた、抗miR−155化合物による処置の効力を評価するための方法であって、抗miR−155化合物による処置の前に、被験体の細胞において、1個または複数の遺伝子の発現のレベルを決定するステップであって、1個または複数の遺伝子が、全てのMF細胞においてモジュレートされた遺伝子のセット、例えば表2から選択される、ステップ;抗miR−155化合物による処置の後に、被験体の細胞において、同じ1個または複数の遺伝子の発現のレベルを決定するステップ;ならびに処置の前および後の発現レベルに基づいて、処置が有効である、あまり有効でない、または有効でないことを決定するステップを含む、方法を提供する。即ち、一実施形態では、表2に列挙された遺伝子は、抗miR−155処置の臨床的効力についてのバイオマーカーとして機能する。
一部の実施形態では、本発明は、参照レベルと比較して、CTCLに罹患している疑いがある被験体におけるmiR−155のレベルを測定することによってCTCLを診断する方法であって、被験体におけるmiR−155のより高い発現が、被験体がCTCLに罹患していることを示す、方法を提供する。CTCLに罹患している疑いがある被験体におけるmiR−155の発現のレベルは、被験体の皮膚病変、血漿、血清、白血球またはPBMCから単離された細胞を使用して決定され得る。ある特定の実施形態では、本発明は、参照レベルと比較して、被験体におけるmiR−155のレベルを測定することによって菌状息肉症形態のCTCLを診断する方法であって、被験体におけるmiR−155のより高い発現が、被験体がMF形態のCTCLに罹患していることを示す、方法を提供する。一部の他の実施形態では、本発明は、miR−155の参照レベルと比較して、処置を受けている被験体におけるmiR−155の発現のレベルを決定することによって、抗miR−155処置への応答を評価するための方法を提供する。参照レベルは、健康な被験体におけるmiR−155のレベル、または健康な被験体の群からのmiR−155の平均もしくは中央値レベル、またはセザリー症候群を有する被験体におけるmiR−155のレベルであり得る。
本発明は、本明細書に開示されるmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物もまた提供する。一実施形態では、医薬組成物は、有効用量の、11〜16ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。
別の実施形態では、医薬組成物は、有効用量の、11〜14ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。
別の実施形態では、医薬組成物は、有効用量の、11〜14ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも7ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも2番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。
さらに別の実施形態では、医薬組成物は、有効用量の、11〜14ヌクレオチドの配列を有するmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、miR−155の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し;前記オリゴヌクレオチド阻害剤の3’末端から少なくとも最初の3ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の5’末端から少なくとも4番目および5番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、有効用量の、配列番号22、配列番号23および配列番号25からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド阻害剤を含む。一部の他の実施形態では、医薬組成物は、有効用量の、配列番号33、39、43、44、47、58、84、99、111、115および120からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド阻害剤を含む。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、表1に列挙された配列から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド阻害剤を含む。
「有効用量」は、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。本発明のmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤の有効用量は、約1mg/kg〜約100mg/kg、約2.5mg/kg〜約50mg/kgまたは約5mg/kg〜約25mg/kgであり得る。一部の実施形態では、有効用量は、患者の皮膚病変1つ当たり約18.75、37.5または75mgのオリゴヌクレオチド阻害剤であり得る。有効用量とみなされるものの正確な決定は、患者の大きさ、年齢、障害の型、および阻害剤の形態(例えば、ネイキッドオリゴヌクレオチドまたは発現構築物など)を含む、各患者にとって個別の要因に基づき得る。したがって、投薬量は、本開示および当該分野の知識から、当業者によって容易に確認され得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤と組み合わせたHDAC阻害剤の使用を企図する。HDAC阻害剤が含められる実施形態では、HDAC阻害剤は、別々の製剤でではあるが同時発生的に、または逐次的に投与され得る。他の実施形態では、HDAC阻害剤は、miR−155阻害剤の投与の前または後の異なる時点で投与され得る。臨床適用が企図される場合、医薬組成物は、意図した適用に適切な形態で調製される。一般に、これは、発熱物質、およびヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物の調製を必然的に伴う。
一実施形態では、本発明は、miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤および1つまたは複数の美容的にまたは薬学的に許容される担体または賦形剤を含む外用組成物を提供する。用語「美容的に許容される」は、本明細書で使用する場合、担体または賦形剤が、過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー性応答などを伴わずに、組織(例えば、皮膚)と接触した使用に適切であることを意味する。
美容または医薬の担体または賦形剤は、液体、例えば、水、および石油、動物、植物または合成起源のものを含む油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。外用組成物は、水中油または油中水エマルジョンを含む場合が多い。本発明は、抗miR−155化合物の外用組成物を調製するためにかかるエマルジョンを使用することを包含する。適切な医薬担体は、E. W. Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。適切な美容担体は、以下に記載する。
一実施形態では、美容的に許容される外用担体は、組成物の約50重量%〜約99.99重量%(例えば、組成物の約80重量%〜約99重量%)である。外用組成物には、溶液、ローション、クリーム、ゲル、スティック、スプレー、軟膏、クレンジング液状洗剤、固形バー、シャンプー、ペースト、泡沫、粉末、ムース、シェービングクリーム、ワイプ、パッチ、ネイルラッカー、創傷包帯剤、粘着包帯、ヒドロゲルおよびフィルムが含まれるがこれらに限定されない。これらの製品型は、溶液、エマルジョン(例えば、マイクロエマルジョンおよびナノエマルジョン)、ゲル、固形物およびリポソームが含まれるがこれらに限定されない、いくつかの型の美容的に許容される外用担体を含み得る。かかる担体のある特定の非限定的な例は、本明細書で以下に示される。他の適切な担体は、当業者によって製剤化され得る。
本発明において有用な外用組成物は、皮膚軟化薬を含む溶液として製剤化され得る。かかる組成物は、好ましくは、約1%〜約50%の皮膚軟化薬(複数可)を含有する。本明細書で使用する場合、用語「皮膚軟化薬」は、乾燥の防止または緩和のため、ならびに皮膚の保護のために使用される材料を指す。いくつかの適切な皮膚軟化薬は、公知であり、本発明において使用され得る。例えば、Sagarin, Cosmetics, Science and Technology、第2版、1巻、32〜43頁(1972年)ならびにInternational Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook、WenningerおよびMcEwen編、1656〜61頁、1626頁および1654〜55頁(The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Assoc.、Washington, D.C.、第7版、1997年)(本明細書で以下「ICI Handbook」)は、適切な材料の多数の例を含有する。
ローションは、かかる溶液から製造され得る。ローションは、典型的には、約1%〜約20%(例えば、約5%〜約10%)の皮膚軟化薬(複数可)および約50%〜約90%(例えば、約60%〜約80%)の水を含む。
溶液から製剤化され得る製品の別の型は、クリームである。クリームは、典型的には、約5%〜約50%(例えば、約10%〜約20%)の皮膚軟化薬(複数可)および約45%〜約85%(例えば、約50%〜約75%)の水を含む。
溶液から製剤化され得る製品のさらに別の型は、軟膏である。軟膏は、動物油もしくは植物油または半固形炭化水素の単純な基剤を含み得る。軟膏は、約2%〜約10%の皮膚軟化薬(複数可)プラス約0.1%〜約2%の増粘剤(複数可)を含み得る。本明細書で有用な増粘剤または粘度増加剤のより完全な開示は、Sagarin, Cosmetics, Science and Technology、第2版、1巻、72〜73頁(1972年)およびICI Handbook 1693〜1697頁に見出すことができる。
本発明において有用な外用組成物は、エマルジョンとして製剤化され得る。担体がエマルジョンである場合、担体の約1%〜約10%(例えば、約2%〜約5%)は、乳化剤(複数可)を構成する。乳化剤は、非イオン性、アニオン性またはカチオン性であり得る。適切な乳化剤は、例えば、McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers、North American版、317〜324頁(1986年)、およびICI Handbook、1673〜1686頁に開示されている。
ローションおよびクリームは、エマルジョンとして製剤化され得る。典型的には、かかるローションは、0.5%〜約5%の乳化剤(複数可)を含む。かかるクリームは、典型的には、約1%〜約20%(例えば、約5%〜約10%)の皮膚軟化薬(複数可);約20%〜約80%(例えば、30%〜約70%)の水;および約1%〜約10%(例えば、約2%〜約5%)の乳化剤(複数可)を含む。
単相性(single)エマルジョンの皮膚ケア調製物、例えば、水中油型および油中水型のローションおよびクリームは、美容の分野で周知であり、本発明において有用である。多相性エマルジョン組成物、例えば、米国特許第4,254,105号および同第4,960,764号に開示されるような水中油中水型もまた、本発明において有用であり得る。一般に、かかる単相性または多相性のエマルジョンは、本質的な成分として、水、皮膚軟化薬および乳化剤を含有する。
本発明の外用組成物は、ゲル(例えば、適切なゲル化剤(複数可)を使用する、水性、アルコール、アルコール/水または油ゲル)としても製剤化され得る。水性ゲルに適切なゲル化剤としては、天然ガム、アクリル酸およびアクリレートのポリマーおよびコポリマー、ならびにセルロース誘導体(例えば、ヒドロキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース)が含まれるがこれらに限定されない。油(例えば、鉱油)に適切なゲル化剤には、水素化ブチレン/エチレン/スチレンコポリマーおよび水素化エチレン/プロピレン/スチレンコポリマーが含まれるがこれらに限定されない。かかるゲルは、典型的には、約0.1重量%と5重量%との間のかかるゲル化剤を含む。
リポソーム製剤もまた、本発明の有用な組成物である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リポソーム内に含有される。リポソームの例は、リン脂質を含有してもしなくてもよい、単層膜、多重膜および少重膜(paucilamellar)のリポソームである。かかる組成物は、オリゴヌクレオチド阻害剤をジパルミトイルホスファチジルコリンなどのリン脂質、コレステロールおよび水と組み合わせることによって調製され得る。本発明の核酸をがん細胞または皮膚組織に送達するのに適切であり得る市販の脂肪エマルジョンには、Intralipid(登録商標)、Liposyn(登録商標)、Liposyn(登録商標)II、Liposyn(登録商標)III、Nutrilipidおよび他の類似の脂質エマルジョンが含まれる。送達ビヒクルとしてのin vivoでの使用に好ましいコロイド系は、リポソーム(即ち、人工膜小胞)である。かかる系の調製および使用は、当該分野で周知である。例示的な製剤は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、US5,981,505;US6,217,900;US6,383,512;US5,783,565;US7,202,227;US6,379,965;US6,127,170;US5,837,533;US6,747,014;およびWO03/093449にも開示されている。
次いで、リポソーム調製物は、リポソーム製剤を産生するために、上記担体(例えば、ゲルまたは水中油エマルジョン)のうち1つ中に取り込まれ得る。外用適用されるリポソームの他の組成物および使用は、Mezei, M.、「Liposomes as a Skin Drug Delivery System」、Topics in Pharmaceutical Sciences(D. BreimerおよびP. Speiser編)、Elsevier Science Publishers B. V.、New York、N.Y.、1985年、345〜358頁、PCT特許出願第WO96/31194号、Niemiecら、12 Pharm. Res. 1184〜88頁(1995年)、および米国特許第5,260,065号に記載されている。
一実施形態では、リポソームは、組成物の総体積に基づいて、約5mg/ml〜約100mg/ml、例えば、約10mg/ml〜約50mg/mlの量で外用組成物中に存在する。
上記担体および賦形剤に加えて、他の皮膚軟化薬および表面活性剤が、トリオレイン酸グリセロール、アセチル化ジステアリン酸スクロース、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレン(1)、モノオレイン酸グリセロール、ジステアリン酸スクロース、モノステアリン酸ポリチレングリコール(50)、オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール、ペンタ−イソステアリン酸デカグリセリン(decaglycerin penta−isostearate)、セスキオレイン酸ソルビタン、ヒドロキシル化ラノリン、ラノリン、ジイソステアリン酸トリグリセリル、ポリオキシエチレン(2)オレイルエーテル、ステアロイル−2−乳酸カルシウム(calcium
stearoyl−2−lactylate)、セスキステアリン酸メチルグルコシド、モノパルミチン酸ソルビタン、メトキシポリチレングリコール−22/ドデシルグリコールコポリマー(Elfacos E200)、ポリチレングリコール−45/ドデシルグリコールコポリマー(Elfacos ST9)、ジステアリン酸ポリチレングリコール400、およびラノリン由来ステロール抽出物、ステアリン酸グリコールおよびステアリン酸グリセロール;アルコール、例えば、セチルアルコールおよびラノリンアルコール;ミリスチン酸エステル、例えば、ミリスチン酸イソプロピル;パルミチン酸セチル;コレステロール;ステアリン酸;プロピレングリコール;グリセリン、ソルビトールなどを含むエマルジョン中に取り込まれ得る。
stearoyl−2−lactylate)、セスキステアリン酸メチルグルコシド、モノパルミチン酸ソルビタン、メトキシポリチレングリコール−22/ドデシルグリコールコポリマー(Elfacos E200)、ポリチレングリコール−45/ドデシルグリコールコポリマー(Elfacos ST9)、ジステアリン酸ポリチレングリコール400、およびラノリン由来ステロール抽出物、ステアリン酸グリコールおよびステアリン酸グリセロール;アルコール、例えば、セチルアルコールおよびラノリンアルコール;ミリスチン酸エステル、例えば、ミリスチン酸イソプロピル;パルミチン酸セチル;コレステロール;ステアリン酸;プロピレングリコール;グリセリン、ソルビトールなどを含むエマルジョン中に取り込まれ得る。
ある特定の実施形態では、送達に使用されるリポソームは、米国付与前公開第20110076322号に詳細に記載されるSMARTICLES(登録商標)(Marina Biotech,Inc.)などの両性リポソームである。SMARTICLES(登録商標)上の表面電荷は、完全に可逆性であり、それを核酸の送達に特に適切なものにしている。SMARTICLES(登録商標)は、注射を介して送達され、安定なままであり、凝集体を含まず、細胞膜を横切って核酸を送達できる。
一般に、送達ビヒクルを安定にし、標的細胞による取込みを可能にするために、適切な塩および緩衝液を用いることが望ましい。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散された阻害剤ポリヌクレオチドを含む有効量の送達ビヒクル(例えば、リポソームまたは他の複合体もしくは発現ベクター)を含む。語句「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、動物またはヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー性のまたは他の都合の悪い反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、ヒトへの投与に適切な医薬品などの医薬品を製剤化する際の使用に許容される、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が本発明の活性成分と不適合性である場合を除き、治療組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性成分もまた、組成物のベクターまたはポリヌクレオチドを不活性化しない限り、組成物中に取り込まれ得る。
本発明の活性組成物は、古典的な医薬調製物を含み得る。本発明に従うこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般的な経路を介してであり得る。これには、経口、外用、非経口、皮内、皮下または静脈内注射が含まれる。別の実施形態では、本明細書に記載されるmiR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤を含む組成物は、クリーム、軟膏、ペースト、ローションまたはゲルなどの、外用適用に適切な形態で製剤化され得る。
活性化合物はまた、非経口投与され得る。例示として、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散物は、グリセロール、液体ポリチレングリコールおよびそれらの混合物中でも、ならびに油中でも調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は一般に、微生物の成長を防止するための防腐剤を含有する。
注射可能な使用に適切な薬学的形態には、例えば、無菌の水性溶液または分散物、および無菌の注射可能な溶液または分散物の即座の調製のための無菌粉末が含まれる。一般に、これらの調製物は、無菌であり、容易な注射可能性(injectability)が存在する程度まで流動的である。調製物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリチレングリコールなど)、それらの適切な混合物、および植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、組成物における、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
無菌の注射可能な溶液は、望ましい場合には任意の他の成分(例えば、上に列挙した通り)と共に、溶媒中に適切な量で活性化合物を取り込み、その後、濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、基本分散媒および例えば上に列挙した通りの所望の他の成分を含有する無菌ビヒクル中に、種々の無菌化された活性成分を取り込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法には、以前に無菌濾過されたその溶液から活性成分(複数可)プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥およびフリーズドライ技術が含まれる。
本発明の組成物は一般に、中性または塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、例えば、無機酸(例えば、塩酸またはリン酸)または有機酸(例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など)から誘導される酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ基と形成される)が含まれる。タンパク質の遊離カルボキシル基と形成される塩は、無機塩基(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄)からまたは有機塩基(例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど)からも誘導され得る。
製剤化の際に、組成物は、好ましくは、投薬製剤と適合性の様式で、治療的に有効な量で投与される。製剤は、種々の剤形、例えば、注射可能な液剤、クリーム剤、軟膏剤、ペースト剤、ローション剤またはゲル剤などで容易に投与され得る。水性溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液は一般に、適切に緩衝化され、液体希釈剤は、例えば十分な食塩水またはグルコースで最初に等張性にされる。かかる水性溶液は、例えば、静脈内、皮下および皮内投与に使用され得る。好ましくは、無菌水性媒体は、特に本開示に照らして、当業者に公知のように用いられる。投薬量における幾分かの変動が、処置されている被験体の状態に依存して必然的に生じる。投与を担う人は、いずれの事象においても、個々の被験体に適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与のために、調製物は、規制機関によって要求される無菌性、発熱性、全般的安全性および純度の標準を満たすべきである。
本発明のある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、投与のためのデバイスで包装され、または投与のためのデバイス内に貯蔵される。注射可能な製剤のためのデバイスには、事前充填シリンジ、注射ポート、オートインジェクター、注射ポンプおよび注射ペンが含まれるがこれらに限定されない。エアロゾル化製剤または粉末製剤のためのデバイスには、吸入器、注入器、吸引器などが含まれるがこれらに限定されない。本発明の組成物の皮膚送達のためのデバイスには、皮膚マイクロニードル注射またはパッチもまた含まれる。したがって、本発明は、本明細書に記載される障害のうち1つまたは複数を処置または予防するための本発明の医薬組成物を含む投与デバイスを含む。
本発明は、限定として解釈すべきではない以下のさらなる実施例によってさらに例示される。当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、開示された具体的実施形態に対して多くの変化がなされ得るが、同様または類似の結果がなおも得られ得ることを理解すべきである。
(実施例1:miR−155のオリゴヌクレオチド阻害剤(「抗miR−155」)は、増加したmiR−155発現を示す菌状息肉症細胞株において活性である)
CTCL患者に由来する細胞株においてmiR−155−5p発現を特徴付けるために、菌状息肉症(MF)、セザリー症候群(SS)、およびMFでもSSでもないと分類されたCTCL細胞株においてmiR−155−5pの絶対的レベルを測定した。検査した細胞株の細胞的、病理学的および分子的特徴を表3に示す。
CTCL患者に由来する細胞株においてmiR−155−5p発現を特徴付けるために、菌状息肉症(MF)、セザリー症候群(SS)、およびMFでもSSでもないと分類されたCTCL細胞株においてmiR−155−5pの絶対的レベルを測定した。検査した細胞株の細胞的、病理学的および分子的特徴を表3に示す。
正常な末梢CD4+Tヘルパー細胞と比較したCTCL細胞株におけるmiR−155−5pの絶対的発現を、各細胞型から単離した総RNAを鋳型として使用して、リアルタイムPCRによって測定した。Ct値をmiR−155−5pコピー数に相関させる検量線を、合成miR−155−5p RNA鋳型を使用して生成した。1細胞当たり10pgの総RNAを仮定して、合成鋳型を用いて生成した検量線を使用して、CTCL RNA試料または正常なCD4+T細胞のRNA試料について決定したCt値から、1細胞当たりのmiR−155−5pのコピー数を外挿した(図1)。菌状息肉症細胞株(HuT102、MJおよびMy−La)、ならびに特発性細胞株(HH)は、正常なCD4+T細胞と比較して高いmiR−155−5pの発現を示したが、セザリー症候群患者に由来する細胞株(HuT78)は、miR−155−5pを過剰発現しなかった。
CTCL細胞株を、2μM〜50μMの範囲の濃度の抗miR−155化合物1(配列番号27)、化合物2(配列番号22)、化合物3(配列番号23)および化合物4(配列番号25)を添加した完全成長培地中で培養した。抗miRを、任意のさらなる構成要素なしに培地に添加して、細胞取込みを増強した。細胞を、72時間の処理後に回収し、総RNAを精製した。リアルタイムPCRを、miR−155の13個の直接的遺伝子標的について実施した(Wormら2009年;O’Connellら2010年;Zhangら2012年;およびmiRagenの未公開データ)。未処理の細胞と比較した、抗miR処理細胞における13個の遺伝子の発現における相対的変化倍数を計算した。図2は、10μMの示された抗miRによる72時間の処理に応答した、遺伝子発現変化の「ヒートマップ」表示を示す。少なくとも1つの細胞株において発現を欠いた4個の予測された直接的標的は省略した。遺伝子発現変化倍数を、log10変換し、赤から青の比色スケール上にプロットし、最も濃い赤は遺伝子発現における最大の相対的増加を示し、逆に、最も濃い青は、遺伝子発現における最大の低減である。ヒートマップは、いくつかのmiR−155−5p標的遺伝子の発現が、3つの菌状息肉症細胞株(MJ、HuT102およびMy−La)において、miR−155−5pアンタゴニストへの曝露の際にモジュレートされたことを示した。類似しているがより控えめな遺伝子発現の変化が、高レベルのmiR−155−5pを発現する特発性細胞株(HH)において観察された。対照的に、これらの遺伝子の発現は、低レベルのmiR−155−5pを発現するセザリー症候群細胞株(HuT78)では有意に変更されず、これは、菌状息肉症細胞株およびHH細胞株における遺伝子発現レベルの変化が、miR−155−5pの拮抗作用によって媒介されることを示している。
(実施例2:抗miR−155化合物2(配列番号22)および4(配列番号25)は、他の抗miR化合物と比較して、菌状息肉症細胞株においてより高い活性を示す)
miR−155−5pの4個の直接的遺伝子標的(Bach1、Jarid2、PicalmおよびShip1)は、3つ全ての菌状息肉症細胞株(MJ、HuT102およびMy−La)において抗miR−155によってモジュレートされたので、これら4個の遺伝子をさらなる分析のために選択した。これらの遺伝子を、in vitroでの抗miR活性についての遺伝子発現シグネチャーを示すために選択した。さらに、4遺伝子シグネチャーを使用して、抗miR化合物の活性を比較した。これらの遺伝子変化は、変動する継代数の細胞を用いた3つの独立した実験にわたって再現性があった。図3、4、5、6および7は、それぞれ、HuT102、MJ、HH、My−LaおよびHut78細胞株におけるこの4遺伝子シグネチャーの変化倍数結果を示す。*ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定により、未処理に対してp値<0.0001。未処理細胞と比較して処理間での分散が不均等であるので、マン−ホイットニー検定を選択した。
miR−155−5pの4個の直接的遺伝子標的(Bach1、Jarid2、PicalmおよびShip1)は、3つ全ての菌状息肉症細胞株(MJ、HuT102およびMy−La)において抗miR−155によってモジュレートされたので、これら4個の遺伝子をさらなる分析のために選択した。これらの遺伝子を、in vitroでの抗miR活性についての遺伝子発現シグネチャーを示すために選択した。さらに、4遺伝子シグネチャーを使用して、抗miR化合物の活性を比較した。これらの遺伝子変化は、変動する継代数の細胞を用いた3つの独立した実験にわたって再現性があった。図3、4、5、6および7は、それぞれ、HuT102、MJ、HH、My−LaおよびHut78細胞株におけるこの4遺伝子シグネチャーの変化倍数結果を示す。*ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定により、未処理に対してp値<0.0001。未処理細胞と比較して処理間での分散が不均等であるので、マン−ホイットニー検定を選択した。
3つの用量(2μM、10μMおよび50μM)および3つの菌状息肉症細胞株にわたる累積データは、化合物2(配列番号22)および4(配列番号25)が化合物1(配列番号27)および3(配列番号23)よりも活性であったことを示した。図7に示されるように、4つ全ての抗miR−155−5p化合物は、セザリー症候群株(HuT78)では統計的に有意な活性を示さず、これは、図1に示されるこの細胞株におけるmiR−155のより低い発現レベルと一致している。
(実施例3:抗miR−155処理によって誘導された遺伝子発現変化は、miR−155の阻害に特異的である)
本発明の抗miR−155化合物によって誘導される遺伝子発現変化の特異性を試験するために、菌状息肉症細胞株を、miR−155を標的化しないオリゴ(対照オリゴ)で処理した。対照オリゴヌクレオチドは、哺乳動物では発現されないC.elegans miRNAを標的化する14ヌクレオチドの抗miRであった(対照1)。第2のオリゴは、14ヌクレオチド配列の抗miR−155化合物4のスクランブルである(対照2)。MJおよびHuT102細胞株を、10μMの抗miR−155化合物3(配列番号23)もしくは4(配列番号25)または2つの対照オリゴと共に72時間インキュベートした。図8は、PCRによって測定した、miR−155−5pの4個の直接的標的についての遺伝子発現における変化倍数を示す。抗miR−155化合物3(配列番号23)または4(配列番号25)で処理した細胞における遺伝子発現シグネチャーは、未処理の細胞のものとは統計的に有意に異なっていた。対照的に、対照化合物で処理した細胞における遺伝子発現は、未処理の細胞のものと異ならなかった。これらの結果は、miR−155の直接的標的が、オリゴ処理の非特異的効果に起因するのではなく、miR−155阻害に応答して抑制解除されたことを示している。*ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定により、未処理に対してp値<0.0001。
本発明の抗miR−155化合物によって誘導される遺伝子発現変化の特異性を試験するために、菌状息肉症細胞株を、miR−155を標的化しないオリゴ(対照オリゴ)で処理した。対照オリゴヌクレオチドは、哺乳動物では発現されないC.elegans miRNAを標的化する14ヌクレオチドの抗miRであった(対照1)。第2のオリゴは、14ヌクレオチド配列の抗miR−155化合物4のスクランブルである(対照2)。MJおよびHuT102細胞株を、10μMの抗miR−155化合物3(配列番号23)もしくは4(配列番号25)または2つの対照オリゴと共に72時間インキュベートした。図8は、PCRによって測定した、miR−155−5pの4個の直接的標的についての遺伝子発現における変化倍数を示す。抗miR−155化合物3(配列番号23)または4(配列番号25)で処理した細胞における遺伝子発現シグネチャーは、未処理の細胞のものとは統計的に有意に異なっていた。対照的に、対照化合物で処理した細胞における遺伝子発現は、未処理の細胞のものと異ならなかった。これらの結果は、miR−155の直接的標的が、オリゴ処理の非特異的効果に起因するのではなく、miR−155阻害に応答して抑制解除されたことを示している。*ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定により、未処理に対してp値<0.0001。
(実施例4:抗miR−155で処理したCTCL細胞株の全ゲノム発現プロファイリングは、標的係合を確認し、機構的洞察を提供する)
菌状息肉症細胞株におけるmiR−155阻害の分子的重要性のより完全な理解を得るために、全ゲノムトランスクリプトームプロファイリングを、抗miR−155化合物3(配列番号23)または4(配列番号25)で4日間(96時間)または8日間処理したMJおよびHuT102細胞株に対して実施した。統計的に有意な遺伝子発現シグネチャーは、同じ時点における未処理の細胞と比較した、抗miR処理細胞についての一元配置ANOVAによって規定した。データを、≦0.05の偽発見率補正したp値で有意に変化した遺伝子についてフィルタリングした。変化倍数結果を、図2について記載したのと同様、図9および10にヒートマップとして示す。
菌状息肉症細胞株におけるmiR−155阻害の分子的重要性のより完全な理解を得るために、全ゲノムトランスクリプトームプロファイリングを、抗miR−155化合物3(配列番号23)または4(配列番号25)で4日間(96時間)または8日間処理したMJおよびHuT102細胞株に対して実施した。統計的に有意な遺伝子発現シグネチャーは、同じ時点における未処理の細胞と比較した、抗miR処理細胞についての一元配置ANOVAによって規定した。データを、≦0.05の偽発見率補正したp値で有意に変化した遺伝子についてフィルタリングした。変化倍数結果を、図2について記載したのと同様、図9および10にヒートマップとして示す。
4日目および8日目における全体的遺伝子発現シグネチャーの検査により、抗miR−155処理に応答した遺伝子発現変化についての時間経過が示唆された:初期の時点(4日)または後期の時点(8日)において調節された独自の遺伝子セット、ならびに両方の時点において変化した一部の遺伝子が同定された(MJプロファイルについては図9、HuT102プロファイルについては図10)。さらに、発現プロファイリングにより、各細胞株において調節された独自の遺伝子セット、ならびに両方の細胞株において調節された一部の遺伝子が同定された。化合物4(配列番号25)は、化合物4(配列番号25)ヒートマップにわたる青色および赤色のより高い強度によって実証されるように、両方の細胞株で両方の時点において、より大きい大きさの遺伝子調節を実証した。
4日目における両方の細胞株および両方の化合物に共通する遺伝子発現プロファイルを、miR−155−5pのシードマッチした遺伝子標的(8、7および6ヌクレオチドの結合部位)の富化について分析した。これらの遺伝子の変化倍数を、図11にヒートマップで示す。150個の上方調節された遺伝子のこのシグネチャーは、1.6×10−25の超幾何p値で、miR−155−5pのシードマッチした標的(8、7および6ヌクレオチドの結合部位)について有意に富化された(図11A)。累積分布関数による分析は、シードマッチした標的についての富化を確認し、8mer>7mer>6merの結合部位についての富化を実証した(図11B)。遺伝子シグネチャーをまた、機能的遺伝子アノテーション富化についてDAVIDの生物情報学的資源を使用して分析した(Huang daら、2009年)。≦0.01のBenjamini補正したp値によって規定される通り、Gene Ontologyデータベースタームの有意な富化は存在しなかった。
8日目における両方の細胞株および両方の化合物に共通する遺伝子発現シグネチャー(合計で677個の遺伝子)を、シードマッチした遺伝子標的の富化および機能的遺伝子アノテーションについての分析に供した。上方調節された遺伝子シグネチャーは、<10−27の超幾何p値で、シードマッチした標的について有意に富化された。4日目のシグネチャーとは異なり、8日目のシグネチャーは、2つの機能的アノテーションタームの強い富化もまた示した:上方調節されたシグネチャーにおける抗原提示、および下方調節されたシグネチャーにおける有糸分裂細胞周期(図12)。合わせると、これらの結果は、抗miR化合物の効果が、miR−155−5pおよびその直接的遺伝子標的の阻害によって媒介されること、ならびにmiR−155−5p機能の阻害によって惹起される表現型が、増強された抗原提示、および増殖における低減を含み得ることを確認している。
抗miR−155化合物4(配列番号25)の活性を、4日間および8日間化合物4(配列番号25)で第3の菌状息肉症細胞株MyLaを処理し、遺伝子発現における変化をプロファイリングすることによって、さらに調査した。化合物4(配列番号25)の特異性を試験するために、セザリー症候群細胞株(HuT78)の細胞を、8日間化合物4(配列番号25)で処理し、遺伝子発現における変化をプロファイリングした。これらの結果を図13に示す。3つの菌状息肉症細胞株HuT102、MJおよびMy−Laにおいて化合物4(配列番号25)に応答して<0.05の偽発見率(FDR)補正したp値で統計的に変化する遺伝子を、上記のようにヒートマップに示す。ヒートマップ中の遺伝子の総数は、324個である。図13は、化合物4(配列番号25)によるセザリー症候群細胞株HuT78の処理が、遺伝子発現においてそれほどの変化を示さなかったことを示しており、これは、菌状息肉症細胞株における遺伝子発現変化が、化合物4(配列番号25)によるmiR−155−5pの阻害に実際に起因することを示している。
さらに、3つ全ての菌状息肉症細胞株において化合物4(配列番号25)によって調節された遺伝子を、化合物4(配列番号25)などの本発明の抗miR−155化合物による処理の臨床的評価に使用できるバイオマーカーシグネチャーとして同定した。同定されたセットの遺伝子は、3つ全ての細胞株において上方調節されたまたは3つ全ての細胞株において下方調節された。各時点(4日目および8日目)について共通するシグネチャーを同定し、次いで、単一の遺伝子リスト(表2)に統合した。遺伝子発現の大きさに対してはフィルターをかけなかった。したがって、表2は、4日目のみにおいて調節された、または8日目のみにおいて調節された、または両方の時点において調節された遺伝子を含有する。表2は、化合物4(配列番号25)によって調節された初期(直接的)標的および下流の(間接的)標的を含む587個の遺伝子を含有する(図21)。表2の遺伝子リストは、直接的標的であるBach1、PicalmおよびJarid2を含んでおり、これらの遺伝子が、複数の細胞株および時点にわたる化合物4(配列番号25)活性の堅固なマーカーであることを実証している。
(実施例5:本発明の抗miR−155化合物は、CTCL細胞において細胞増殖を阻害し、アポトーシスを増加させる)
CTCL細胞による抗miR−155化合物の受動的取込みは、細胞増殖における有意な低減を生じ、プログラム細胞死を誘導した。これらの効果は、2つのCTCL細胞株HuT102およびMyLaにおいて観察された。HuT102細胞株およびMyLa細胞株の両方において抗miR−155化合物3(配列番号23)よりも高い標的抑制解除を実証した抗miR−155化合物2(配列番号22)および4(配列番号25)は、増殖のより高い阻害およびより高いアポトーシス活性を示した。
CTCL細胞による抗miR−155化合物の受動的取込みは、細胞増殖における有意な低減を生じ、プログラム細胞死を誘導した。これらの効果は、2つのCTCL細胞株HuT102およびMyLaにおいて観察された。HuT102細胞株およびMyLa細胞株の両方において抗miR−155化合物3(配列番号23)よりも高い標的抑制解除を実証した抗miR−155化合物2(配列番号22)および4(配列番号25)は、増殖のより高い阻害およびより高いアポトーシス活性を示した。
図14Aは、HuT−102細胞の増殖に対する経時的な抗miR−155化合物4(配列番号25)の効果を示す。ATPのレベルは細胞数と直接相関するので、ATPを測定して細胞数を決定した。細胞数に対する化合物4(配列番号25)の効果は、CTCLのための標準治療的療法であるベキサロテンで見られたものと同等であった(図14A)。細胞数における低減には、カスパーゼ3/7活性によって測定されたアポトーシスにおける増加が伴った(図14B)。カスパーゼ3および7タンパク質は、システインアスパラギン酸特異的プロテアーゼ(カスパーゼ)ファミリーのメンバーである。カスパーゼファミリーは、哺乳動物細胞のアポトーシスにおいて重要なエフェクター的役割を果たす。適切に正規化されない場合には結果を混乱させ得る低レベルの基底カスパーゼ活性を全ての細胞が有するので、カスパーゼ活性をATPレベルに対して正規化した。化合物4(配列番号25)は、ベキサロテンよりも高い、アポトーシスの誘導を示した(図14B)。
時間経過に加えて、HuT102細胞における抗miR−155化合物の用量漸増(dose titration)を、8日間の処理後に実施したATPおよびカスパーゼ3/7測定を用いて実施した(それぞれ、図15Aおよび15B)。これらの結果は、化合物4(配列番号25)の阻害能力を確認する。
増殖およびカスパーゼ3/7活性化に対する類似の効果が、8日目にHuT−102細胞において抗miR−155化合物2(配列番号22)で観察された(それぞれ、図16Aおよび16B)。
化合物4(配列番号25)は、第2の菌状息肉症細胞株My−La細胞において類似の活性を示した。図17Aおよび17Bは、化合物3(配列番号23)および4(配列番号25)による経時的な増殖、およびカスパーゼ3/7の活性化を示す。HuT102細胞と類似して、化合物4(配列番号25)は、化合物3(配列番号23)と比較してより高い活性を示した。
時間経過に加えて、My−La細胞における抗miR−155化合物の用量漸増を、8日間の処理後のATPおよびカスパーゼ3/7測定を用いて実施した(それぞれ、図18Aおよび18B)。これらの結果は、化合物4(配列番号25)の阻害能力をさらに確認する。
(実施例6:HDAC阻害剤と組み合わせた抗miR−155処理は、細胞増殖およびアポトーシス活性に対する効果を増強する)
ボリノスタット(化学名:SAHA)は、進行した菌状息肉症を有する患者に対する標準治療のエピジェネティックな治療である。しかし、凡HDAC阻害剤の副作用は十分に記載されている。組合せ治療が個々の化合物による処理と比較して増強された活性を示すかどうかを決定するために、HuT102細胞を、抗miR−155と組み合わせた有効未満の用量のSAHAで処理した。
ボリノスタット(化学名:SAHA)は、進行した菌状息肉症を有する患者に対する標準治療のエピジェネティックな治療である。しかし、凡HDAC阻害剤の副作用は十分に記載されている。組合せ治療が個々の化合物による処理と比較して増強された活性を示すかどうかを決定するために、HuT102細胞を、抗miR−155と組み合わせた有効未満の用量のSAHAで処理した。
HuT102細胞を、0.25μMのSAHAおよび10μMの化合物3(配列番号23)または4(配列番号25)で、個々に、または組み合わせて処理した。細胞を毎日回収して、ATPレベルおよびカスパーゼ3/7活性を測定した。ATPレベルを図19Aに示す。類似の実験を、0.50μMのSAHAで実施した。図19Bは、HuT102細胞を0.50μMのSAHAおよび10μMの化合物3(配列番号23)または4(配列番号25)で、個々に、または組み合わせて処理した場合に得られたATPレベルを示す。
図20Aおよび20Bは、カスパーゼ3/7活性に対する効果を示す。0.25または0.5μMのSAHAと組み合わせた場合の化合物4(配列番号25)は、各処理単独と比較して増加したアポトーシスを生じた。このデータは、抗miR−155オリゴが、低用量の凡HDAC阻害剤と組み合わせて使用できることを示唆している。
(実施例7:異なる長さのオリゴヌクレオチドの抗miR−155活性)
miR−155阻害剤の活性を評価するために、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用した。簡潔に述べると、miR−155に対する結合部位を、市販のpsiCHECK−2ベクター系(Promega)内に位置するRenillaルシフェラーゼ遺伝子の3’UTR中にクローニングした。miR−155阻害剤の非存在下では、Renillaルシフェラーゼタンパク質の発現は、miR−155模倣物(mimic)によって抑制される。miR−155阻害剤の存在下では、Renillaルシフェラーゼタンパク質の発現は、抑制解除される。プラスミドのトランスフェクションについて制御するために、ベクターは、miR−155結合部位を含有しないホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する。Renillaまたはホタルのいずれかのルシフェラーゼの発現は、ルシフェラーゼタンパク質によって放射される光の検出を介して測定される。
miR−155阻害剤の活性を評価するために、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用した。簡潔に述べると、miR−155に対する結合部位を、市販のpsiCHECK−2ベクター系(Promega)内に位置するRenillaルシフェラーゼ遺伝子の3’UTR中にクローニングした。miR−155阻害剤の非存在下では、Renillaルシフェラーゼタンパク質の発現は、miR−155模倣物(mimic)によって抑制される。miR−155阻害剤の存在下では、Renillaルシフェラーゼタンパク質の発現は、抑制解除される。プラスミドのトランスフェクションについて制御するために、ベクターは、miR−155結合部位を含有しないホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する。Renillaまたはホタルのいずれかのルシフェラーゼの発現は、ルシフェラーゼタンパク質によって放射される光の検出を介して測定される。
miR−155結合部位を含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミド50ngを、miR−155模倣物なしで(「レポーター」のみ)、10nMのmiR−155模倣物と共に(「レポーター+模倣物」)、10nMのmiR−155模倣物および2nMの対照オリゴヌクレオチドと共に、または10nMのmiR−155模倣物および2nMの11〜14ヌクレオチド長の試験miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤(表4)と共に、HeLa細胞中にトランスフェクトした。miR−155模倣物は、Dharmaconから購入し(miRIDIAN microRNA ヒトhsa−miR−155−5p模倣物;受託番号MIMAT0000646;カタログ番号C−300647−05−0005)、成熟miRNA配列:−UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU−(配列番号121)を含有する。実験で使用した対照オリゴヌクレオチドは、以下の配列を有した:5’−lCs.dTs.dAs.lGs.dAs.lAs.dAs.lGs.lAs.dGs.lTs.dAs.lGs.lA−3’(配列番号122)。
図22は、レポータープラスミドおよび模倣物のトランスフェクションが、ルシフェラーゼの最大の抑制を生じたこと;レポータープラスミド単独のトランスフェクションが、ルシフェラーゼの最大の発現を生じたこと;レポーターおよび模倣物を伴った対照オリゴヌクレオチドのトランスフェクションが、ルシフェラーゼの発現を抑制解除しなかったこと;ならびにレポーターおよび模倣物を伴った試験miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤のトランスフェクションが、異なる程度までルシフェラーゼの発現を抑制解除したことを示す。
(実施例8:変動する数のロックトヌクレオチド(LNA)を含有するオリゴヌクレオチドの抗miR−155活性)
実験を、実施例7に記載したように実施した。この実験で使用した試験miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤は、含有されるLNAの数が異なっていた(表5〜8)。結果を図23A(表5)、23B(表6)、23C(表7)および23D(表8)に示す。
実験を、実施例7に記載したように実施した。この実験で使用した試験miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤は、含有されるLNAの数が異なっていた(表5〜8)。結果を図23A(表5)、23B(表6)、23C(表7)および23D(表8)に示す。
(実施例9:種々の位置にLNA改変を含有するオリゴヌクレオチドの抗miR−155活性)
実験を、実施例7に記載したように実施した。この実験で使用した試験miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤は、LNA改変の位置が異なっていた(表9〜12)。結果を図24A(表9)、24B(表10)、24C(表11)および24D(表12)に示す。
実験を、実施例7に記載したように実施した。この実験で使用した試験miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤は、LNA改変の位置が異なっていた(表9〜12)。結果を図24A(表9)、24B(表10)、24C(表11)および24D(表12)に示す。
(実施例10:種々のヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチドの抗miR−155活性)
実験を、実施例7に記載したように実施した。この実験で使用した試験miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤は、14ヌクレオチド長であり、各々9個のヌクレオチド改変を含有した(表13)。ヌクレオチド改変は、ロックトヌクレオチド(LNA)、エチレン架橋核酸/エチレン架橋ヌクレオチド(ENA)および2’−C架橋二環式ヌクレオチド(CBBN)を含んだ。結果を図25に示す。
実験を、実施例7に記載したように実施した。この実験で使用した試験miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤は、14ヌクレオチド長であり、各々9個のヌクレオチド改変を含有した(表13)。ヌクレオチド改変は、ロックトヌクレオチド(LNA)、エチレン架橋核酸/エチレン架橋ヌクレオチド(ENA)および2’−C架橋二環式ヌクレオチド(CBBN)を含んだ。結果を図25に示す。
(実施例11:14ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドの抗miR−155活性)
実験を、実施例7に記載したように実施した。この実験で使用した試験miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤は、14ヌクレオチド長であり、9または10個のLNA改変を含有した(表14)。結果を図26に示す。
実験を、実施例7に記載したように実施した。この実験で使用した試験miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤は、14ヌクレオチド長であり、9または10個のLNA改変を含有した(表14)。結果を図26に示す。
(実施例12:配列番号25および配列番号23を含有するオリゴヌクレオチド阻害剤の抗miR−155活性)
実験を、実施例7に記載したように実施した。この実験で使用した試験miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号25および配列番号23のオリゴヌクレオチド阻害剤であった。結果を図27に示す。
実験を、実施例7に記載したように実施した。この実験で使用した試験miR−155オリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号25および配列番号23のオリゴヌクレオチド阻害剤であった。結果を図27に示す。
(実施例13:配列番号25および配列番号120を含有するオリゴヌクレオチド阻害剤の抗miR−155活性)
配列番号25および配列番号120のmiR−155オリゴヌクレオチド阻害剤を、Oci−Ly3細胞株において受動的にトランスフェクトした。mRNAを4日目に単離し、miR−155標的遺伝子(Bach1、CEBPB、CUX1、INPP5D/SHIP1、Jarid2、PicalmおよびWee1)の発現についてqPCRによって分析した。図28は、配列番号25および配列番号120のオリゴヌクレオチド阻害剤のトランスフェクションの際の、これらの遺伝子の発現における変化倍数を示す。図28中の各データポイントにおいて、遺伝子は、左から右の順で、Bach1、CEBPB、CUX1、INPP5D/SHIP1、Jarid2、PicalmおよびWee1である。配列番号120は、配列番号25中のLNAと同じ位置にCBBNヌクレオチドを含有する。
配列番号25および配列番号120のmiR−155オリゴヌクレオチド阻害剤を、Oci−Ly3細胞株において受動的にトランスフェクトした。mRNAを4日目に単離し、miR−155標的遺伝子(Bach1、CEBPB、CUX1、INPP5D/SHIP1、Jarid2、PicalmおよびWee1)の発現についてqPCRによって分析した。図28は、配列番号25および配列番号120のオリゴヌクレオチド阻害剤のトランスフェクションの際の、これらの遺伝子の発現における変化倍数を示す。図28中の各データポイントにおいて、遺伝子は、左から右の順で、Bach1、CEBPB、CUX1、INPP5D/SHIP1、Jarid2、PicalmおよびWee1である。配列番号120は、配列番号25中のLNAと同じ位置にCBBNヌクレオチドを含有する。
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