JP2018517412A - 皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）を処置するためのｍｉＲ−１５５阻害剤 - Google Patents

皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）を処置するためのｍｉＲ−１５５阻害剤 Download PDF

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Abstract

本発明は、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤およびその組成物を提供する。本発明は、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を被験体に投与することによって、被験体においてＴ細胞リンパ腫などのがんを処置するための方法をさらに提供する。本発明は、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与することによって、悪性Ｔ細胞の増殖を低減または阻害するための方法もまた提供する。一局面において、１１〜１６ヌクレオチドの配列を含むｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤が提供され、このオリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有する。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年６月５日に出願された米国仮出願第６２／１７１，７５８号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権の利益を主張する。
本発明は、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤およびその組成物に関する。本発明はまた、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与することによって、それを必要とする被験体においてがんを処置または予防するための方法を提供する。ｍｉＲ−１５５の活性または機能は、オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後に被験体のがん細胞において低減される。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現の転写後リプレッサーとして作用する小さい内因性の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、それらの配列が完全に相補的である場合にはそれらの分解を促進することによって、またはそれらの配列がミスマッチを含有する場合には翻訳を阻害することによって、標的ｍＲＮＡのリプレッサーとして作用する。
ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ；Ｑｉら（２００６年）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３巻：４１１〜４１９頁を参照のこと）によって転写され、一般に数千塩基長である一次ｍｉＲＮＡ転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる初期転写物から生じる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｄｒｏｓｈａによって、核において約７０〜約１００ヌクレオチドのヘアピン形状の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）へとプロセシングされる。細胞質への輸送後に、ヘアピンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによってさらにプロセシングされて、二本鎖ｍｉＲＮＡを産生する。次いで、成熟ｍｉＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に取り込まれ、そこで、塩基対相補性によってその標的ｍＲＮＡと会合する。ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡ標的と完全に塩基対合する比較的稀な場合には、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分解を促進する。より一般には、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと不完全なヘテロ二重鎖を形成して、ｍＲＮＡ安定性に影響を与えるまたはｍＲＮＡ翻訳を阻害する。
ｍｉｃｒｏＲＮＡは、がんを含むいくつかの疾患に関与している。例えば、ヒトｍｉＲＮＡ遺伝子ｍｉＲ１５ａおよびｍｉＲ１６−１は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の症例のおよそ６０％において欠失または下方調節される（Ｃａｌｉｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、２００２年；９９巻：１５５２４〜１５５２９頁）。同様に、ｍｉＲ−１５５−５ｐの調節不全は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の病因に関与するシグナル伝達事象と関連付けられている。悪性Ｔ細胞は、ＩＬ−２受容体複合体、およびシグナル伝達性転写因子（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（ＳＴＡＴ）タンパク質を介して転写を活性化する関連するヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）を構成的に発現することが示されている。クロマチン免疫沈降実験により、ＳＴＡＴ−５は、ｍｉＲ−１５５−５ｐの宿主遺伝子であるＭＩＲ１５５ＨＧのプロモーターと会合したことが示された。これは、ｍｉＲ−１５５−５ｐがＣＴＣＬ悪性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ−５シグナル伝達経路を調節し得ることを示唆している。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害は、ｍｉＲ−１５５−５ｐ発現の下方調節を生じたが、ＳＴＡＴ−５を活性化するサイトカインによる細胞の処理は、増加したｍｉＲ−１５５−５ｐレベルを生じた（Ｋｏｐｐら２０１３年）。これらの結果は、ｍｉＲ−１５５−５ｐがＣＴＣＬの病因において役割を果たし得ることを示唆している。
現在、後期ＣＴＣＬ患者を治癒させるまたはその生存を延長させる治療は存在しない（Ｐｒｉｎｃｅら、２００９年）。疾患の初期段階にあるＣＴＣＬ患者のための処置は、注意深い医師のモニタリングを伴って、対症的かつ非攻撃的（ｎｏｎ−ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）である。より進行した段階のＣＴＣＬ患者は、典型的には、レチノイド（ベキサロテン）またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ボリノスタット）などの全身性薬物で処置される。放射線療法は、典型的には最後の砦であり、部分的な疾患退縮を生じることができるが、完全な根絶を生じることはできない。多くの処置は、重篤な副作用を有する、または時間と共に耐性を生じる。したがって、皮膚Ｔ細胞リンパ腫を処置するための新たな治療について、満たされていない医療上の要求が未だに存在する。
Ｑｉら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００６年）３巻：４１１〜４１９頁 Ｃａｌｉｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（２００２年）９９巻：１５５２４〜１５５２９頁
本発明は、被験体の細胞においてｍｉＲ−１５５の活性または機能をモジュレートするためのオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。一実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、投与後に被験体のがん細胞においてｍｉＲ−１５５の活性または機能を下方調節する。ある特定の実施形態では、がん細胞は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞およびメモリーＴ細胞を含む悪性Ｔ細胞である。
一実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１１〜１６ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から４番目のヌクレオチドもまたロックトヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から最初のヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。
別の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１１〜１４ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。これらの実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも５、６、７、８、９または１０個の改変型ヌクレオチドを含有し得る。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、７、８、９または１０個の改変型ヌクレオチドを含有する。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する７、８、９または１０個の改変型ヌクレオチドは、全てロックトヌクレオチドである。さらに一部の他の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する７、８、９または１０個の改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドと、他の改変、例えば、エチレン架橋ヌクレオチド、２’−Ｃ架橋二環式ヌクレオチド、および糖改変、例えば２’置換ヌクレオチドとの組合せである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から２番目のＤＮＡヌクレオチドは、未改変のＤＮＡヌクレオチドであり得る。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から最初の３個の改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。
さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１１〜１４ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも７ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。これらの実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも７、８、９または１０個の改変型ヌクレオチドを含有し得る。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する７、８、９または１０個の改変型ヌクレオチドは、全てロックトヌクレオチドである。さらに一部の他の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する７、８、９または１０個の改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドと、他の改変、例えば、エチレン架橋ヌクレオチド、２’−Ｃ架橋二環式ヌクレオチド、および糖改変、例えば２’置換ヌクレオチドとの組合せである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から最初の３ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から最初の３個の改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から２番目または３番目のヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から２番目のＤＮＡヌクレオチドは、未改変のＤＮＡヌクレオチドであり得る。
さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１１〜１４ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも４番目および５番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。これらの実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも７、８、９または１０個の改変型ヌクレオチドを含有し得る。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する７、８、９または１０個の改変型ヌクレオチドは、全てロックトヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から最初の３個の改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から４番目および／または５番目のＤＮＡヌクレオチドは、未改変のＤＮＡヌクレオチドであり得る。
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤中に存在し得る改変型ヌクレオチドには、ロックトヌクレオチド、エチレン架橋ヌクレオチド、２’−Ｃ架橋二環式ヌクレオチド、２’置換ヌクレオチド、ならびに本明細書に記載される他の糖および／または塩基改変が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する全ての改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。一部の他の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドと、他の改変、例えば、エチレン架橋ヌクレオチド、２’−Ｃ架橋二環式ヌクレオチド、および２’置換ヌクレオチド、ならびに本明細書に記載される他の糖および／または塩基改変との組合せである。
一実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１４ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも５、６、７、８、９または１０個のロックトヌクレオチドを含有する。一部の他の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１、２、３、４、５個またはそれを超えるＤＮＡヌクレオチドを含有する。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。ある特定のさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目および４番目のヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも６番目および／または８番目のヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。なおさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、５’末端から２番目、６番目および８番目の位置にＤＮＡヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号３〜２７および２９〜１２０から選択される配列を有する。例示的な実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号２５の配列を有する。別の例示的な実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号２２または２３の配列を有する。さらに別の例示的な実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号３３、３９、４３、４４、４７、５８、８４、９９、１１１、１１５および１２０から選択される配列を有する。
一実施形態では、本発明に従うｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、がん細胞の増殖を低減もしくは阻害する、および／またはがん細胞のアポトーシスを誘導する。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、がん細胞においてｍｉＲ−１５５の１個または複数の標的遺伝子を上方調節する。
本発明はまた、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を含む組成物およびその使用を提供する。一実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体においてがんを処置するための方法であって、治療有効量の本発明のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。ｍｉＲ−１５５の活性または機能は、オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後にがん細胞において低減される。一実施形態では、がんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）である。一部の実施形態では、がんを処置するための方法は、治療有効量の本発明のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤および治療有効量の第２の治療剤、例えば、レチノイドまたはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を被験体に投与するステップを含む。
一実施形態では、本発明は、本発明に従うｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む、悪性Ｔ細胞の増殖を低減または阻害するための方法を提供する。ｍｉＲ−１５５の活性または機能は、オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後に悪性Ｔ細胞において低減される。
図１は、定量的リアルタイムＰＣＲによって測定した、正常な末梢ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞と比較した種々のＣＴＣＬ細胞株におけるｍｉＲ−１５５−５ｐの絶対的発現を示す。
図２は、７２時間にわたる、１０μＭの、４種の抗ｍｉＲ−１５５化合物のうち１つによる処理に応答した、種々のＣＴＣＬ細胞におけるｍｉＲ−１５５の９個の標的遺伝子における遺伝子発現変化の「ヒートマップ」表示を示す。
図３Ａは、ＨｕＴ１０２細胞における、７２時間の２μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）を示す。図３Ｂは、ＨｕＴ１０２細胞における、７２時間の１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図３Ｃは、ＨｕＴ１０２細胞における、７２時間の５０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図３Ｄは、ＨｕＴ１０２細胞における、９６時間の２μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図３Ｅは、ＨｕＴ１０２細胞における、９６時間の１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図３Ｆは、ＨｕＴ１０２細胞における、９６時間の５０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。＊ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定により、未処理と比較してｐ値＜０．０００１。
図４Ａは、ＭＪ細胞における、７２時間の２μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図４Ｂは、ＭＪ細胞における、７２時間の１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図４Ｃは、ＭＪ細胞における、７２時間の５０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図４Ｄは、ＭＪ細胞における、９６時間の２μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図４Ｅは、ＭＪ細胞における、９６時間の１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図４Ｆは、ＭＪ細胞における、９６時間の５０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。＊ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定により、未処理と比較してｐ値＜０．０００１。
図５Ａは、ＨＨ細胞における、７２時間の２μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図５Ｂは、ＨＨ細胞における、７２時間の１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図５Ｃは、ＨＨ細胞における、７２時間の５０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図５Ｄは、ＨＨ細胞における、９６時間の２μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図５Ｅは、ＨＨ細胞における、９６時間の１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図５Ｆは、ＨＨ細胞における、９６時間の５０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。＊ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定により、未処理と比較してｐ値＜０．０００１。
図６Ａは、Ｍｙ−ＬＡ細胞における、７２時間の２、１０および５０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図６Ｂは、Ｍｙ−Ｌａ細胞における、９６時間の２、１０および５０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。＊ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定により、未処理と比較してｐ値＜０．０００１。
図７Ａは、ＨｕＴ７８細胞における、７２時間の２μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図７Ｂは、ＨｕＴ７８細胞における、７２時間の１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図７Ｃは、ＨｕＴ７８細胞における、７２時間の５０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図７Ｄは、ＨｕＴ７８細胞における、９６時間の２μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図７Ｅは、ＨｕＴ７８細胞における、９６時間の１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図７Ｆは、ＨｕＴ７８細胞における、９６時間の５０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。
図８Ａは、ＨｕＴ１０２細胞における、１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物または対照オリゴによる処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。図８Ｂは、ＭＪ細胞における、１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物または対照オリゴによる処理に応答した、４個のｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。＊ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定により、未処理と比較してｐ値＜０．０００１。
図９は、４または８日間抗ｍｉＲ−１５５化合物で処理したＭＪ細胞における示差的遺伝子発現シグネチャーのヒートマップを示す。抗ｍｉＲ−１５５で処理したＭＪ細胞を、全ゲノム発現プロファイリングに供した。示差的発現シグネチャーを、≦０．０５の偽発見率補正したｐ値で有意に変化した遺伝子についてフィルタリングした。
図１０は、４または８日間抗ｍｉＲ−１５５化合物で処理したＨｕＴ１０２細胞における示差的遺伝子発現シグネチャーのヒートマップを示す。抗ｍｉＲ−１５５で処理したＨｕＴ１０２細胞を、全ゲノム発現プロファイリングに供した。示差的発現シグネチャーを、≦０．０５の偽発見率補正したｐ値で有意に変化した遺伝子についてフィルタリングした。
図１１Ａは、ＭＪ細胞およびＨｕＴ１０２細胞の両方における、抗ｍｉＲｓ−１５５に応答して上方調節された遺伝子の遺伝子発現プロファイルのアノテーションを示す。遺伝子シグネチャーは、１．６ｅ−２５の富化についての超幾何ｐ値で、ｍｉＲ−１５５のシードマッチした直接的標的について富化される。本明細書で同定された遺伝子は、≦０．０５の偽発見率補正したｐ値で、未処理群と比較して、抗ｍｉＲ−１５５処理によって有意に変化した。図１１Ｂは、非シード含有転写物と比較した、８、７または６ヌクレオチドのシード配列を含有するｍｉＲ−１５５の直接的標的遺伝子の示差的発現の累積分布関数グラフを示す。示されるｐ値は、２つのデータセット間の有意差を決定するためのコルモゴロフ−スミルノフ検定の結果である。
図１２は、ＭＪ細胞およびＨｕＴ１０２細胞の両方における、８日間抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理に応答して上方調節または下方調節された遺伝子のアノテートされた遺伝子発現プロファイルを示す。
図１３は、ＣＴＣＬ細胞における、配列番号２５の配列を有する抗ｍｉＲ−１５５による８日間の処理に応答して上方調節または下方調節された遺伝子の発現プロファイルを示す。
図１４Ａは、ＨｕＴ１０２細胞の増殖に対する抗ｍｉＲ−１５５化合物の効果を示す。図１４Ｂは、ＨｕＴ１０２細胞におけるカスパーゼ３／７活性に対する抗ｍｉＲ−１５５化合物の効果を示す。
図１５Ａは、処理の８日目における、種々の濃度の抗ｍｉＲ−１５５化合物に応答したＨｕＴ１０２細胞の増殖を示す。図１５Ｂは、処理の８日目における、種々の濃度の抗ｍｉＲ−１５５化合物に応答したＨｕＴ１０２細胞におけるカスパーゼ３／７活性を示す。
図１６Ａは、ＨｕＴ１０２細胞の増殖に対する抗ｍｉＲ−１５５化合物の効果を示す。図１６Ｂは、ＨｕＴ１０２細胞におけるカスパーゼ３／７活性に対する抗ｍｉＲ−１５５化合物の効果を示す。
図１７Ａは、Ｍｙ−Ｌａ細胞の増殖に対する抗ｍｉＲ−１５５化合物の効果を示す。図１７Ｂは、Ｍｙ−Ｌａ細胞におけるカスパーゼ３／７活性に対する抗ｍｉＲ−１５５化合物の効果を示す。
図１８Ａは、処理の８日目における、種々の濃度の抗ｍｉＲ−１５５化合物に応答したＭｙ−Ｌａ細胞の増殖を示す。図１８Ｂは、処理の８日目における、種々の濃度の抗ｍｉＲ−１５５化合物に応答したＭｙ−Ｌａ細胞におけるカスパーゼ３／７活性を示す。
図１９Ａは、ＨｕＴ１０２細胞の増殖に対する、１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物および０．２５μＭのＨＤＡＣ阻害剤の効果を示す。図１９Ｂは、ＨｕＴ１０２細胞の増殖に対する、１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物および０．５０μＭのＨＤＡＣ阻害剤の効果を示す。
図２０Ａは、ＨｕＴ１０２細胞におけるカスパーゼ３／７活性に対する、１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物および０．２５μＭのＨＤＡＣ阻害剤の効果を示す。図２０Ｂは、ＨｕＴ１０２細胞におけるカスパーゼ３／７活性に対する、１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物および０．５０μＭのＨＤＡＣ阻害剤の効果を示す。
図２１は、化合物４（配列番号２５）に応答して、４日目または８日目に３つ全ての菌状息肉症細胞株において上方調節または下方調節された５８７個の遺伝子における発現変化のヒートマップを示す。
図２２は、ｍｉＲ−１５５結合部位を含む二重ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定した、異なる長さのオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性を示す。
図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃおよび２３Ｄは、ｍｉＲ−１５５結合部位を含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定した、変動する数のロックトヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性を示す。 図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃおよび２３Ｄは、ｍｉＲ−１５５結合部位を含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定した、変動する数のロックトヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性を示す。 図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃおよび２３Ｄは、ｍｉＲ−１５５結合部位を含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定した、変動する数のロックトヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性を示す。 図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃおよび２３Ｄは、ｍｉＲ−１５５結合部位を含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定した、変動する数のロックトヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性を示す。
図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃおよび２４Ｄは、ｍｉＲ−１５５結合部位を含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定した、種々の位置においてロックトヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性を示す。 図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃおよび２４Ｄは、ｍｉＲ−１５５結合部位を含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定した、種々の位置においてロックトヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性を示す。 図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃおよび２４Ｄは、ｍｉＲ−１５５結合部位を含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定した、種々の位置においてロックトヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性を示す。 図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃおよび２４Ｄは、ｍｉＲ−１５５結合部位を含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定した、種々の位置においてロックトヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性を示す。
図２５は、ｍｉＲ−１５５結合部位を含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定した、種々のヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性を示す。
図２６は、ｍｉＲ−１５５結合部位を含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定した、種々の１４ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性を示す。
図２７は、ｍｉＲ−１５５結合部位を含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定した、配列番号２５および２３のオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性を示す。
図２８は、配列番号２５および１２０のオリゴヌクレオチド阻害剤による処理に応答した、ｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現における変化倍数を示す。
本開示を通じて言及される全ての特許および非特許文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、がん細胞においてｍｉＲ−１５５の活性または機能を阻害するオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。ヒトでは、ｍｉＲ−１５５は、ＭＩＲ１５５宿主遺伝子即ちＭＩＲ１５５ＨＧによってコードされ、ヒト第２１染色体上に位置する。ｐｒｅ−ｍｉＲ−１５５の両方のアームが成熟ｍｉＲＮＡを生じ得るので、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１５５のプロセシング産物は、ｍｉＲ−１５５−５ｐ（５’アームから）およびｍｉＲ−１５５−３ｐ（３’アームから）と称される。ヒトｍｉＲ−１５５−５ｐおよびｍｉＲ−１５５−３ｐについての成熟配列を以下に示す：
ヒト成熟ｍｉＲ−１５５−５ｐ（配列番号１）
５’−ＵＵＡＡＵＧＣＵＡＡＵＣＧＵＧＡＵＡＧＧＧＧＵ−３’
ヒト成熟ｍｉＲ−１５５−３ｐ（配列番号２）
５’−ＣＵＣＣＵＡＣＡＵＡＵＵＡＧＣＡＵＵＡＡＣＡ−３’
ｍｉＲ−１５５−５ｐは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球および顆粒球を含む造血細胞において発現される（Ｌａｎｄｇｒａｆら２００７年）。ｍｉＲ−１５５−５ｐは、骨髄造血および赤血球形成の両方の制御において非常に重要な分子である。このｍｉＲＮＡは、初期幹前駆段階にある造血幹前駆細胞において高度に発現され、より成熟した造血細胞（例えば、リンパ球、赤血球）へのそれらの分化をブロックする。ｍｉＲ−１５５−５ｐ発現は、これらの系譜に沿って細胞が成熟するにつれて漸進的に減少し、成熟造血細胞では約２００分の１である（Ｍａｓａｋｉら２００７年；Ｇｅｒｌｏｆｆら２０１５年）。
ｍｉＲ−１５５−５ｐは、炎症応答および免疫応答を媒介することにおいて重要な役割を果たす。ｍｉＲ−１５５−５ｐを欠くマウスは、正常な数および分布のＴリンパ球およびＢリンパ球亜集団を示すが、特に、最適なＴ細胞依存性抗体応答を生じさせるためのＴヘルパー細胞分化および胚中心反応の調節において、欠損した免疫応答を示す（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら２００７年；Ｔｈａｉら２００７年）。ｍｉＲ−１５５−５ｐは、Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）、Ｔｈ２およびＴｈ１７サブセットのＴヘルパー細胞へのＣＤ４＋Ｔ細胞の分化を制御し、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の発生に影響を与える（ＢａｕｍｊｏｈａｎｎおよびＡｎｓｅｌ ２０１３年）。ｍｉＲ−１５５−５ｐは、ウイルス感染に対するエフェクターおよびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞応答（Ｄｕｄｄａら２０１３年；Ｇｒａｃｉａｓら２０１３年）、ならびに正常なＢ細胞分化および抗体産生もまた調節する。ヒトでは、ｍｉＲ−１５５−５ｐ発現は、非リンパ系器官ならびに静止中のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞では低い。ｍｉＲ−１５５−５ｐ発現は、Ｂ細胞およびＴ細胞の抗原受容体刺激によって（Ｔａｍ ２００１年；Ｈａａｓｃｈら２００２年；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら ２００３年；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら ２００７年；Ｔｈａｉら ２００７年；Ｖｉｇｏｒｉｔｏら２００７年；Ｂａｎｅｒｊｅｅら２０１０年）、ならびにマクロファージおよび樹状細胞のＴｏｌｌ様受容体アゴニスト刺激によって（Ｔａｇａｎｏｖら２００６年；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら２００７年；Ｃｅｐｐｉら２００９年；Ｍａｏら２０１１年）、大きく増強される。ＭＩＲ１５５ＨＧの活性化は、ＡＰ１媒介性機構およびＮＦ−κＢ媒介性機構の両方を含む。
菌状息肉症（ＭＦ）サブタイプのＣＴＣＬと診断された患者における皮膚プラークまたは腫瘍は、上昇したレベルのｍｉＲ−１５５−５ｐを有する。対照皮膚生検材料と比較してＭＦ患者の皮膚生検材料において増加したｍｉＲ−１５５−５ｐが、いくつかのグループによって報告されている（ｖａｎ Ｋｅｓｔｅｒら２０１１年；Ｍａｊら２０１２年；Ｋｏｐｐら２０１３年ｂ；Ｍｏｙａｌら２０１３年）。１つの研究では、ｍｉＲ−１５５−５ｐレベルは、初期ＭＦ生検材料と比較して、腫瘍段階の生検材料において４．１６倍高く（Ｍｏｙａｌら２０１３年）、これは、ｍｉＲ−１５５−５ｐレベルが疾患の進行と相関し得ることを示唆している。ｍｉＲ−１５５−５ｐを発現する具体的な細胞型を同定することを目的とした第２の研究では、ｍｉＲＮＡは、ＣＴＣＬ病変中の悪性Ｔ細胞および非悪性Ｔ細胞の両方において発現されることが見出された（Ｋｏｐｐら２０１３年ｂ）。
菌状息肉症（ＭＦ）は、全ての原発性皮膚リンパ腫の５０〜７０％を占める、ＣＴＣＬの最も蔓延しているサブタイプである。２番目に蔓延しているサブタイプは、ＣＴＣＬ症例の１５％を構成するセザリー症候群（ＳＳ）である。ＭＦは、表皮においてパッチ、プラークまたは結節性腫瘍を形成する、大脳様核を有する非定型の小さい〜中間のサイズのＴリンパ球の増殖により特徴付けられる。ＭＦは典型的には、高齢者が罹患し（診断時の年齢中央値：５５〜６０歳）、パッチおよびプラークが腫瘍の形成に先行するまたは腫瘍の形成と同時発生的である、無痛性の臨床経過を有する。一部の後期腫瘍段階の症例では、リンパ節および内臓器官の関与が観察される。腫瘍段階のＭＦの間、皮膚浸潤はより散在性になり、非定型Ｔ細胞の表皮向性は喪失され得る。対照的に、ＳＳは、皮膚の広範な発赤および落屑（ｓｃａｌｉｎｇ）（紅皮症）、肥大したリンパ節、ならびに末梢循環中の悪性細胞により特徴付けられる、より侵襲性の白血病性形態のＣＴＣＬである（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、２０１２年；Ｊａｗｅｄら２０１４年）。
腫瘍段階のＭＦの分子的分析により、正常な皮膚、炎症した皮膚および正常なＴ細胞と比較して、遺伝子発現における有意な変化が明らかになったが（ｖａｎ Ｋｅｓｔｅｒら２０１２年）、遺伝子発現におけるこれらの差異の遺伝的またはエピジェネティックな起源は未知である。初期皮膚病変は、正常な表現型を有するＴ細胞、ならびに異常な形態学および悪性表現型を有するＴ細胞のより小さい集団を含む、多数の炎症細胞を含有する。浸潤物は、非悪性Ｔｈ１細胞、調節性Ｔ細胞および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞から主になる。悪性Ｔ細胞は、典型的には、クローン起源のＣＤ４＋メモリーＴ細胞である。疾患発達の間、表皮向性は、悪性ＣＤ４＋Ｔ細胞における増加および非悪性ＣＤ８＋Ｔ細胞における減少と随伴して、徐々に失われる。
ＣＴＣＬは、転写因子およびシグナル伝達の調節因子の異常な発現および機能により特徴付けられる。シグナル分子およびサイトカインの機能不全性調節は、ＣＴＣＬの悪性形質転換および病因において重要な役割を果たすと仮説が立てられている（Ｇｉｒａｒｄｉら、２００４年；Ｚｈａｎｇら、２００６年；ｖａｎ Ｄｏｏｒｎら、２００９年；ＫａｄｉｎおよびＶｏｎｄｅｒｈｅｉｄ、２０１０年）。ＣＴＣＬのこれらの変種についての別個の病因と一致して、ＭＦおよびＳＳ細胞の遺伝子発現プロファイルにおいて有意差が観察されている（ｖａｎ Ｄｏｏｒｎら、２００９年；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、２０１０年）。最近、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＣＴＣＬの病因において示差的に発現され、ＣＴＣＬの病因に潜在的に関与することが報告されている。ｍｉＲ−１５５−５ｐは、ｍｉＲＮＡの中で菌状息肉症において最も上方調節されるが（Ｋｏｐｐら、２０１３年ａ；Ｋｏｐｐら、２０１３年ｂ）、別個のサブセットの調節不全のｍｉＲＮＡは、セザリー症候群を識別し、ｍｉＲ−１５５−５ｐは、このサブタイプのＣＴＣＬでは上方調節されない（Ｂａｌｌａｂｉｏら、２０１０年）。
本発明は、ヒトｍｉＲ−１５５の活性または機能を低減または阻害するオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。本発明に関して、用語「オリゴヌクレオチド阻害剤」、「抗ｍｉＲ」（例えば、抗ｍｉＲ−１５５）、「アンタゴニスト」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド即ちＡＳＯ」、「オリゴマー」、「抗ｍｉｃｒｏＲＮＡオリゴヌクレオチド即ちＡＭＯ」または「ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）」は、広く使用され、ｍｉＲＮＡに完全にまたは部分的にハイブリダイズし、それによって標的ｍｉＲＮＡの機能または活性を抑制することによって、標的ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の活性または機能を阻害する、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改変型リボヌクレオチド、改変型デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの組合せを含むオリゴマーを包含する。
用語「ｍｉＲ−１５５」は、本明細書で使用する場合、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１５５、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１５５−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐを含む。
一実施形態では、本発明は、１１〜１６ヌクレオチドの長さを有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。一部の他の実施形態では、本発明は、１１〜１４ヌクレオチドの長さを有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。種々の実施形態では、ｍｉＲ−１５５を標的化するオリゴヌクレオチド阻害剤は、１１、１２、１３、１４、１５または１６ヌクレオチド長である。一実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２ヌクレオチドの長さを有する。別の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１４ヌクレオチドの長さを有する。
本発明に従うｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列は、生理的条件下でｍｉＲ−１５５−５ｐにハイブリダイズし、被験体の細胞においてｍｉＲ−１５５−５ｐの活性または機能を阻害するのに十分に、ｍｉＲ−１５５−５ｐの成熟配列に対して相補的である。例えば、一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５−５ｐの成熟配列に対して少なくとも部分的に相補的な配列、例えば、ｍｉＲ−１５５−５ｐの成熟配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的な配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５−５ｐの成熟配列に対して実質的に相補的、即ち、ｍｉＲ−１５５−５ｐの成熟配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的であり得る。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５−５ｐの成熟配列に対して１００％または完全に相補的な配列を含む。オリゴヌクレオチド阻害剤の配列は、オリゴヌクレオチド配列が、天然に存在するヌクレオチドの代わりに改変型ヌクレオチドを含む場合であっても、ｍｉＲ−１５５に対して相補的であるとみなされると理解される。例えば、ｍｉＲ−１５５の成熟配列が、特定の位置においてグアノシンヌクレオチドを含む場合、オリゴヌクレオチド阻害剤は、対応する位置において、改変型シチジンヌクレオチド、例えば、ロックトシチジンヌクレオチドまたは２’−フルオロ−シチジンを含み得る。
用語「約」は、本明細書で使用する場合、＋／−１０％の、より好ましくは＋／−５％の変動を包含し、かかる変動は、本発明の実施に適切である。
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列全体が、ヒトｍｉＲ−１５５−５ｐの成熟配列に対して完全に相補的である。種々の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列が部分的に、実質的にまたは完全に相補的であるヒトｍｉＲ−１５５−５ｐの成熟配列は、配列番号１の５’末端からヌクレオチド１〜１７、またはヌクレオチド２〜１７、またはヌクレオチド２〜１６、またはヌクレオチド２〜１５、またはヌクレオチド２〜１４、またはヌクレオチド２〜１３、またはヌクレオチド２〜１２を含む。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列が部分的に、実質的にまたは完全に相補的であるヒトｍｉＲ−１５５−５ｐの成熟配列は、配列番号１の５’末端からヌクレオチド２〜１５を含む。別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列が部分的に、実質的にまたは完全に相補的であるヒトｍｉＲ−１５５−５ｐの成熟配列は、配列番号１の５’末端からヌクレオチド２〜１３を含む。
一実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１つの骨格改変、例えば、少なくとも１つのホスホロチオエート、モルホリノまたはホスホノカルボキシレート（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）ヌクレオチド間連結を含有する（例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６９３，１８７号および同第７，０６７，６４１号を参照のこと）。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、完全にホスホロチオエート連結される。
一実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１個の改変型ヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも５、６、７、８、９、１０個またはそれを超える改変型ヌクレオチドを含有する。用語「改変型ヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、糖、塩基および／または骨格改変を有するヌクレオチドを包含する。改変型ヌクレオチドの例には、ロックトヌクレオチド（ＬＮＡ）、エチレン架橋ヌクレオチド（ＥＮＡ）、２’−Ｃ架橋二環式ヌクレオチド（ＣＢＢＮ）、Ｓ−ｃＥｔまたはｃＥｔと呼ばれる２’，４’−拘束エチル核酸、２’−４’−炭素環式ＬＮＡ、および２’置換ヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない。
用語「ロックトヌクレオチド」、「ロックト核酸単位」、「ロックト核酸残基」または「ＬＮＡ単位」は、本開示を通じて相互交換可能に使用され得、二環式ヌクレオシドアナログを指す。例えば、適切なオリゴヌクレオチド阻害剤は、ＢＳＮを含有するオリゴヌクレオチドとそれらの相補的標的鎖との間で形成される複合体に増強された熱安定性を付与する１つまたは複数の「コンフォメーション的に拘束された」または二環式糖ヌクレオシド改変（ＢＳＮ）から構成され得る。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド（構造Ａ）を含有するロックトヌクレオチド即ちＬＮＡを含有し、ここで、リボース糖部分は、「ロックト」コンフォメーションである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１つの２’−Ｃ，４’−Ｃ架橋２’デオキシリボヌクレオシド（構造Ｂ）を含有する。例えば、その両方がそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４０３，５６６号およびＷａｎｇら（１９９９年）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、９巻：１１４７〜１１５０頁を参照のこと。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、構造Ｃで示される構造を有する改変型ヌクレオシドを少なくとも１個含有する。ｍｉＲ−１５５を標的化するオリゴヌクレオチド阻害剤は、ＢＳＮ（ＬＮＡ、２’−Ｃ，４’−Ｃ架橋２’デオキシリボヌクレオシドなど）または他の改変型ヌクレオチドと、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドとの組合せを含有し得る。
用語「非ＬＮＡヌクレオチド」および「非ＬＮＡ改変」は、本明細書で使用する場合、ＬＮＡヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを指す、即ち、用語は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ならびに改変がＬＮＡ改変でない点を除いて塩基および／または糖が改変された改変型ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、非ＬＮＡ改変を含有するヌクレオチドを少なくとも１個含有する。例えば、一実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国付与前公開第２０１６／００１００９０Ａ１号（「‘０９０公報」）に記載されるような、２’−Ｃ架橋二環式ヌクレオチド（ＣＢＢＮ）を少なくとも１個含有する。‘０９０公報は、種々のＣＢＢＮ改変、例えば、２’−ＣＢＢＮ、オキソＣＢＢＮ、アミノＣＢＢＮ、チオＣＢＢＮなどを記載している。‘０９０公報に記載される全てのＣＢＢＮ改変は、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤において使用され得る。別の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する非ＬＮＡ改変は、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）改変であり得る。例えば、一実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、本明細書でエチレン架橋ヌクレオチドとも呼ばれるエチレン架橋核酸（ＥＮＡ）を少なくとも１つ含有する。他の架橋された改変には、Ｓ−ｃＥｔまたはｃＥｔと称される２’，４’−拘束エチル核酸および２’−４’−炭素環式ＬＮＡ（ｃａｒｂａ−ＬＮＡ）が含まれる。
本発明に関してその対応するロックトヌクレオチドによってＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを置換することに言及する場合、用語「対応するロックトヌクレオチド」は、ＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオチドが、それが置き換えたＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオチドと同じ天然に存在する窒素性塩基、または化学的に改変された同じ窒素性塩基を含有するロックトヌクレオチドによって置き換えられていることを意味することを意図する。例えば、窒素性塩基Ｃを含有するＤＮＡヌクレオチドの対応するロックトヌクレオチドは、同じ窒素性塩基Ｃ、または５−メチルシトシンなどの、化学的に改変された同じ窒素性塩基Ｃを含有し得る。
ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも５、６、７、８、９、１０または１１個のロックトヌクレオチドを含有する。一実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも７、８、９または１０個のロックトヌクレオチドを含有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の４ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から最初のヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個または少なくとも５個のＤＮＡヌクレオチドを含有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目および４番目のヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、塩基改変または置換を有する改変型ヌクレオチドを含み得る。ＲＮＡ中の天然または未改変の塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）（ＤＮＡはチミン（Ｔ）を有する）である。複素環式塩基部分とも称される改変型塩基には、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシンを含む）、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれる。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−１５５を標的化するオリゴヌクレオチド阻害剤は、塩基改変（例えば、５−メチルシトシン）と組み合わせて、１つまたは複数のＢＳＮ改変を含む。
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、改変型糖部分を有するヌクレオチドを含み得る。代表的な改変型糖には、炭素環式または非環式の糖、それらの２’位、３’位または４’位のうち１つまたは複数において置換基を有する糖、および糖の１個または複数の水素原子の代わりに置換基を有する糖が含まれる。ある特定の実施形態では、糖は、２’位に置換基を有することによって改変される。さらなる実施形態では、糖は、３’位に置換基を有することによって改変される。他の実施形態では、糖は、４’位に置換基を有することによって改変される。糖が、それらの位置のうち１つよりも多くにおいて改変を有し得ること、またはオリゴヌクレオチド阻害剤が、１つの位置において糖改変を有する１個もしくは複数のヌクレオチドを有し得、異なる位置において糖改変を有する１個もしくは複数のヌクレオチドもまた有し得ることもまた企図される。
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤中の企図される糖改変には、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される置換基が含まれるがこれらに限定されず、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルで置換されていても置換されていなくてもよい。一実施形態では、改変には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知の２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）、即ち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。別の改変には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、２’−ＤＭＡＯＥとしても公知のＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該分野で２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知）即ち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２が含まれる。
さらなる糖置換基には、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）およびフルオロ（Ｆ）が含まれる。２’位（２’−）上の糖置換基は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置にあり得る。１つの２’−アラビノ改変は、２’−Ｆである。他の類似の改変は、糖部分上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオシド上または２’−５’連結されたオリゴヌクレオチド中の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位においてもなされ得る。ある特定の実施形態では、糖改変は、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−ハロ（例えば、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ）および４’チオ改変である。
その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８３８，２８３号に記載されるものなどの、安定性を増強し、効力を改善するためのオリゴヌクレオチド阻害剤の他の改変が当該分野で公知であり、本発明の方法における使用に適切である。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ送達および安定性を促進するために、オリゴヌクレオチド阻害剤は、その３’末端において、コレステロール部分などのステロイド、ビタミン、脂肪酸、炭水化物もしくはグリコシド、ペプチド、または他の小分子リガンドに連結され得る。
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、ステロイド（コレステロール）などの担体分子にコンジュゲートされ得る。担体分子は、直接、またはリンカーもしくはスペーサー基を介してのいずれかで、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端または５’末端に付着される。種々の実施形態では、担体分子は、コレステロール、コレステロール誘導体、コール酸またはコール酸誘導体である。その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２０２，２２７号に開示される担体分子の使用もまた想定される。ある特定の実施形態では、担体分子はコレステロールであり、少なくとも６炭素のリンカーを介して、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端または５’末端に付着される。一部の実施形態では、担体分子は、６または９炭素のリンカーを介して、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端または５’末端に付着される。一部の実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。種々の実施形態では、リンカーは、実質的に直鎖状の炭化水素部分を含む。炭化水素部分は、約３〜約１５個の炭素原子を含み得、比較的非極性の基、例えば、エーテルまたはチオエーテル連結を介してコレステロールにコンジュゲートされ得る。ある特定の実施形態では、炭化水素リンカー／スペーサーは、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１５の飽和または不飽和の炭化水素鎖（例えば、アルキレンまたはアルケニレン）を含む。その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国付与前公開第２０１２／０１２８７６１号に記載される種々のリンカー／スペーサー基が、本発明において使用され得る。
一実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１１〜１６ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から４番目のヌクレオチドもまた、ロックトヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目および４番目のヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２または１４ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも５、６、７、８、９または１０個のロックトヌクレオチドを含有する。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも６番目および／または８番目のヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。なおさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、５’末端から２番目、６番目および８番目の位置にＤＮＡヌクレオチドを含む。
別の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１１〜１４ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、改変型または未改変のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。
さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１１〜１４ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも７ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、改変型または未改変のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。
さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１１〜１４ヌクレオチドの配列を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも４番目および５番目のヌクレオチドは、改変型または未改変のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から４番目および／または５番目のＤＮＡヌクレオチドは、未改変のＤＮＡヌクレオチドである。
オリゴヌクレオチド阻害剤が１１〜１４ヌクレオチド長である一部の実施形態では、前記阻害剤は、少なくとも５、６、７、８、９または１０個の改変型ヌクレオチドを含有する。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、７、８、９または１０個の改変型ヌクレオチドを含有する。オリゴヌクレオチド阻害剤が１１〜１４ヌクレオチド長である一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドである。一部の実施形態では、全ての改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤中に存在する５、６、７、８、９または１０個の改変型ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドと、非ＬＮＡ改変を含有するヌクレオチド、例えば、エチレン架橋ヌクレオチド、２’−Ｃ架橋二環式ヌクレオチド、２’置換ヌクレオチド、ならびに本明細書に記載される他の糖および／または塩基改変との組合せである。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から２番目のヌクレオチドは、未改変のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。
一実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号２５の配列を含む。別の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号２２の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号２３の配列を含む。
一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号３３、３９、４３、４４、４７、５８、８４、９９、１１１、１１５および１２０からなる群から選択される配列を含む。
種々の実施形態では、ｍｉＲ−１５５−５ｐのオリゴヌクレオチド阻害剤は、表１から選択される配列を有する。
被験体への本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、被験体の細胞においてｍｉＲ−１５５の活性または機能を低減または阻害する。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、がん細胞、ＢおよびＴリンパ球、単球、マクロファージ、小グリア細胞、ＮＫ細胞ならびに炎症細胞を含む免疫系の細胞において、ｍｉＲ−１５５の活性または機能を阻害する。一実施形態では、がん細胞は悪性Ｔ細胞である。本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤で処置され得る悪性Ｔ細胞には、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞およびメモリーＴ細胞が含まれる。一実施形態では、悪性Ｔ細胞は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）細胞である。
一部の実施形態では、本発明のある特定のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のｍｉＲ−１５５阻害剤と比較して、悪性Ｔ細胞などのがん細胞において、ｍｉＲ−１５５の活性または機能のより高い阻害を示し得る。用語「他のｍｉＲ−１５５阻害剤」は、核酸阻害剤、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ｍｉＲ、アンタゴｍｉＲ、ミックスマー、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）、アプタマー、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡもしくは低分子ヘアピンＲＮＡ；抗体もしくはその抗原結合性断片；および／またはｍｉＲ−１５５の活性もしくは機能を阻害する薬物を含む。本発明の特定のオリゴヌクレオチド阻害剤は、本発明の他のオリゴヌクレオチド阻害剤と比較して、悪性Ｔ細胞などのがん細胞において、ｍｉＲ−１５５のより高い阻害を示し得る可能性がある。用語「より高い」は、本明細書で使用する場合、定量的により多いこと、または統計的に有意により多いことを指す。
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、被験体の細胞においてｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現または活性を上方調節する。ｍｉＲ−１５５の標的遺伝子には、ＩＮＰＰ５０／ＳＨＩＰ１、Ｊａｒｉｄ２、Ｐｉｃａｌｍ、Ｂａｃｈ１、Ｗｅｅ１、ＣＵＸ１、Ｃｅｂｐｂ、ＳＰＩＢ／ＰＵ．１およびＩＬ７Ｒが含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、がん細胞、ＢおよびＴリンパ球、単球、マクロファージ、小グリア細胞、ＮＫ細胞ならびに炎症細胞を含む免疫系の細胞において、ｍｉＲ−１５５の少なくとも４個の標的遺伝子の発現または活性を上方調節する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤によって上方調節される４個の標的遺伝子は、Ｂａｃｈ１、Ｊａｒｉｄ２、ＰｉｃａｌｍおよびＳＨＩＰ１を含む。本発明は、ｍｉＲ−１５５阻害剤の活性を決定するための手段として、これら４個の遺伝子の発現における変化（遺伝子発現シグネチャー）を使用することを包含する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与の際に、ｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現または活性において、それらの間の値を含め、約１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍または８倍の変化が存在する。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与の際に、ｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現または活性において、それらの間の値を含め、少なくとも約２倍、３倍、４倍または５倍の変化が存在する。
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のｍｉＲ−１５５阻害剤と比較して、悪性Ｔ細胞などのがん細胞において、ｍｉＲ−１５５標的遺伝子のより高い上方調節を示す。ある特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のｍｉＲ−１５５阻害剤と比較して、がん細胞において、ｍｉＲ−１５５の少なくとも４個の標的遺伝子のより高い上方調節を示す。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のｍｉＲ−１５５阻害剤と比較して、がん細胞において、４個の遺伝子、即ち、Ｂａｃｈ１、Ｊａｒｉｄ２、ＰｉｃａｌｍおよびＳＨＩＰ１の発現または活性のより高い上方調節を示す。種々の実施形態では、「より高い上方調節」は、他のｍｉＲ−１５５阻害剤と比較して、ｍｉＲ−１５５標的遺伝子の発現または活性における、それらの間の値を含め、約２倍、３倍、４倍または５倍の増加を含む。
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）細胞を含む悪性Ｔ細胞などのがん細胞の増殖を低減もしくは阻害する、および／またはがん細胞のアポトーシスを誘導する。本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、それらの間の値を含め、最大で約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％または１００％の、がん細胞の数における低減を提供し得る。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、それらの間の値を含め、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％の、がん細胞の数における低減を提供し得る。
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のｍｉＲ−１５５阻害剤と比較して、がん細胞の増殖のより高い阻害および／またはがん細胞のアポトーシスにおけるより高い誘導を示し得る。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のｍｉＲ−１５５阻害剤と比較して、それらの間の値を含め、最大で約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％大きい、がん細胞の数における低減を示し得る。
本発明は、それを必要とする被験体においてがんを処置するための方法であって、本発明に従うｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。ｍｉＲ−１５５の活性または機能は、オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後に被験体のがん細胞において低減される。
一実施形態では、がんを処置するための方法は、１１〜１６ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。
別の実施形態では、がんを処置するための方法は、１１〜１４ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。
別の実施形態では、がんを処置するための方法は、１１〜１４ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも７ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。
さらに別の実施形態では、がんを処置するための方法は、１１〜１４ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも４番目および５番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。
本発明に従って処置され得るがんには、Ｔ細胞リンパ腫、例えば皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、およびＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに皮膚がんが含まれる。ある特定の実施形態では、がんを処置するための方法は、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２５からなる群から選択されるｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。一部の他の実施形態では、がんを処置するための方法は、配列番号３３、３９、４３、４４、４７、５８、８４、９９、１１１、１１５および１２０からなる群から選択されるｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。
一実施形態では、本発明は、本発明に従うｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を被験体に投与することによって、菌状息肉症（ＭＦ）形態のＣＴＣＬを処置するための方法を提供する。一実施形態では、ＭＦ形態のＣＴＣＬを処置するための方法は、１１〜１６ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。
別の実施形態では、本発明は、１１〜１４ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む、菌状息肉症（ＭＦ）形態のＣＴＣＬを処置するための方法であって、オリゴヌクレオチド阻害剤が、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、１１〜１４ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む、菌状息肉症（ＭＦ）形態のＣＴＣＬを処置するための方法であって、オリゴヌクレオチド阻害剤が、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも７ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである、方法を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、１１〜１４ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む、菌状息肉症（ＭＦ）形態のＣＴＣＬを処置するための方法であって、オリゴヌクレオチド阻害剤が、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも４番目および５番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、ＭＦ形態のＣＴＣＬを処置するための方法は、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２５からなる群から選択されるｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。一部の他の実施形態では、ＭＦ形態のＣＴＣＬを処置するための方法は、配列番号３３、３９、４３、４４、４７、５８、８４、９９、１１１、１１５および１２０からなる群から選択されるｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。
本発明は、第２の治療剤と組み合わせて本発明に従うｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む、ＣＴＣＬを処置するための方法もまた包含する。ＣＴＣＬのための現行の処置としては、皮膚指向性の治療、例えば、外用ステロイド、外用ナイトロジェンマスタード（メクロレタミンＨＣＬ）、外用レチノイド、光線療法、紫外線処置、ソラレン紫外線処置、放射線療法、電子線治療など、ならびに全身治療、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、レチノイド（ベキサロテン）、インターフェロンおよび低用量葉酸代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセートおよびプララトレキセート）の投与が含まれる。さらなる処置選択肢、例えば、抗ＣＤ３０抗体（例えば、ブレンツキシマブ）、抗ＣＣＲ４抗体（例えば、モガムリズマブ）、および抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、現在試験されている。第２の治療剤は、一般に、これらの処置のうち１つから選択される薬剤または治療を含む。例えば、本発明は、ＨＤＡＣ阻害剤、レチノイド、インターフェロン、葉酸代謝拮抗剤、外用ステロイド、外用レチノイド、外用ナイトロジェンマスタード、光線療法、紫外線、ソラレンおよび紫外線、放射線療法、電子線治療、抗ＣＤ３０抗体（例えば、ブレンツキシマブ）、抗ＣＣＲ４抗体（例えば、モガムリズマブ）、ならびに抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体による処置などの第２の治療と組み合わせてｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与することによって、ＣＴＣＬを処置するための方法を包含する。
種々のＨＤＡＣ阻害剤が公知であり、そのうち一部は、臨床的使用のためにＦＤＡによって承認されており、一部は、臨床試験において試験されている。本発明に従うがんを処置するための方法は、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、モセチノスタット、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、アベキシノスタット（ａｂｅｘｉｎｏｓｔａｔ）、ＣＩ−９９４（タセジナリン（ｔａｃｅｄｉｎａｌｉｎｅ））およびＭＳ−２７５（エンチノスタット）が含まれるがこれらに限定されないＨＤＡＣ阻害剤の使用を包含する。第２の治療／薬剤が含められる実施形態では、第２の治療／薬剤は、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与の前または後の異なる時点で投与され得る。事前の投与は、例えば、第２の薬剤の投与の約１週間前から３０分前までの範囲内の第１の薬剤の投与を含む。事前の投与は、例えば、第２の薬剤の投与の約２週間前から３０分前までの範囲内の第１の薬剤の投与もまた含み得る。後の（ａｆｔｅｒ）またはより後の（ｌａｔｅｒ）投与は、例えば、第１の薬剤の投与の約１週間後から３０分後までの範囲内の第２の薬剤の投与を含む。後のまたはより後の投与は、例えば、第１の薬剤の投与の約２週間後から３０分後までの範囲内の第２の薬剤の投与もまた含み得る。
本発明はまた、１１〜１６ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与することによって、がん細胞、特に悪性Ｔ細胞の増殖を低減または阻害するための方法であって、オリゴヌクレオチド阻害剤が、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がん細胞、特に悪性Ｔ細胞の増殖を低減または阻害するための方法であって、１１〜１４ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤が、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がん細胞、特に悪性Ｔ細胞の増殖を低減または阻害するための方法であって、１１〜１４ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤が、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも７ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである、方法を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、がん細胞、特に悪性Ｔ細胞の増殖を低減または阻害するための方法であって、１１〜１４ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤が、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも４番目および５番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、がん細胞、特に悪性Ｔ細胞の増殖を低減または阻害するための方法は、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２５からなる群から選択されるｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。一部の他の実施形態では、がん細胞、特に悪性Ｔ細胞の増殖を低減または阻害するための方法は、配列番号３３、３９、４３、４４、４７、５８、８４、９９、１１１、１１５および１２０からなる群から選択されるｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。
悪性Ｔ細胞には、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびメモリーＴ細胞が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、投与後に、ｍｉＲ−１５５の活性もしくは機能を低減するおよび／または悪性Ｔ細胞においてｍｉＲ−１５５の１個もしくは複数の標的遺伝子を上方調節する。がん細胞の増殖を低減または阻害するための方法は、本オリゴヌクレオチド阻害剤の投与と共に、上記第２の治療／薬剤の使用もまた含む。
ある特定の実施形態では、本発明によって包含される方法は、患者の皮膚病変１つ当たり１８．７５、３７．５または７５ｍｇの本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。他の実施形態では、本発明の方法は、それらの間の値を含め、合計で約３７．５、７５、１５０、３００、６００、９００または１２００ｍｇの本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤を患者に全身投与するステップを含む。さらに一部の他の実施形態では、本発明の方法は、それらの間の値を含め、合計で約３５０、７００、１０５０、１４００、１７５０、２１００、２４５０、２８００、３１５０または３５００ｍｇの本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤を患者に全身投与するステップを含む。
好ましくは、被験体への本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、がんと関連する１つまたは複数の症状または病態の改善を生じる。例えば、一実施形態では、単独でまたはＨＤＡＣ阻害剤などの第２の治療剤と組み合わせた本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、皮膚病変の数；皮膚上の赤い痒いパッチもしくはプラークの数；および／またはＣＴＣＬと関連する新たな皮膚病変／パッチ／プラークの形成を低減する。一実施形態では、単独でまたはＨＤＡＣ阻害剤などの第２の治療剤と組み合わせた本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、皮膚への悪性Ｔリンパ球の遊走を低減または阻害する。別の実施形態では、単独でまたは第２の治療剤と組み合わせた本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、皮膚において総悪性Ｔリンパ球を低減する。さらに別の実施形態では、単独でまたは第２の治療剤と組み合わせた本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、皮膚から末梢中に回避または遊走し得る悪性Ｔ細胞の数を低減する。
本明細書で使用する場合、用語「被験体」または「患者」は、ヒトおよび他の霊長類（例えば、チンパンジーならびに他の類人猿およびサル種）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、飼育哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス、ラットおよびモルモット）、ならびに鳥（例えば、家禽、野鳥および猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ類の鳥、アヒル、ガチョウなど）が含まれるがこれらに限定されない任意の脊椎動物を指す。一部の実施形態では、被験体は哺乳動物である。他の実施形態では、被験体はヒトである。
本明細書に記載されるｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤のいずれかは、ｍｉＲ−１５５オリゴヌクレオチド阻害剤をコードする発現ベクターを細胞に送達することによって、標的細胞（例えば、悪性Ｔ細胞）に送達され得る。「ベクター」は、細胞の内側に目的の核酸を送達するために使用され得る物質の組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスが含まれるがこれらに限定されない多数のベクターが、当該分野で公知である。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるがこれらに限定されない。特定の一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。発現構築物は、生細胞中で複製され得、または合成により作製され得る。本出願の目的のために、用語「発現構築物」、「発現ベクター」および「ベクター」は、一般的な説明的意味において本発明の適用を実証するために相互交換可能に使用され、本発明を限定することは意図しない。
一実施形態では、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を発現させるための発現ベクターは、オリゴヌクレオチド阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。語句「作動可能に連結した」または「転写制御下にある」は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、プロモーターがポリヌクレオチドに対して正確な位置および配向にあることを意味する。
本明細書で使用する場合、「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写を開始するために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。適切なプロモーターには、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩおよびウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスの長い末端反復）が含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、プロモーターは、Ｔ細胞特異的プロモーター、例えば、ｌｃｋ遺伝子の近位および遠位プロモーター、またはＣＤ４遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー配列などである。
ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−１５５オリゴヌクレオチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、当該分野で公知であり、これには、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、ヒートショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーター、および誘導性マウス乳癌ウイルスＬＴＲが含まれるがこれらに限定されない。
発現構築物および核酸を細胞に送達する方法は、当該分野で公知であり、これには、例えば、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、ポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクション、細胞超音波処理、高速微小発射体（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を使用する遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、および受容体媒介性トランスフェクションが含まれ得る。
本発明は、ＣＴＣＬを診断するための方法、およびＣＴＣＬのための処置を受けている患者の臨床状態をモニタリングするための方法もまた提供する。本発明は、本発明の抗ｍｉＲ−１５５化合物の投与が、対照処理細胞またはセザリー症候群細胞と比較して、３つ全てのＭＦ細胞株（ＨｕＴ１０２、ＭＪおよびＭｙＬａ）において独自のセットの遺伝子を上方調節および／または下方調節することを示している。本発明は、ＭＦサブタイプのＣＴＣＬを診断するため、およびｍｉＲ−１５５阻害剤によるＣＴＣＬ処置の進行をモニタリングするために、この独自のセットの遺伝子に基づく遺伝子発現シグネチャーを使用することを企図する。例えば、本発明は、表２に列挙された遺伝子のセットが、本発明の抗ｍｉＲ−１５５化合物に応答して、３つ全てのＭＦ細胞株において上方調節または下方調節されることを示している。一実施形態では、本発明は、ＣＴＣＬに罹患している疑いがある被験体において、表２に列挙された１個または複数の遺伝子の発現レベルを測定し、発現レベルを参照レベル（例えば、健康な被験体における発現レベルまたはＣＴＣＬ被験体の非がん細胞における発現レベル）と比較し、被験体における発現レベルが参照レベルと比較して下方調節または上方調節される場合に、被験体がＣＴＣＬを有すると診断することによって、ＣＴＣＬを診断するための方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、ＣＴＣＬの処置のために被験体を選択するための方法であって、被験体のＣＴＣＬ細胞において１個または複数の遺伝子の発現のレベルを決定するステップであって、１個または複数の遺伝子が、全てのＭＦ細胞においてモジュレートされた遺伝子のセット、例えば表２から選択される、ステップ；被験体のＣＴＣＬ細胞における１個または複数の遺伝子のレベルを、１個または複数の遺伝子の参照レベルと比較するステップ；ならびに参照レベルと比較して、ＣＴＣＬ細胞における１個または複数の遺伝子のレベルにおける増加または減少を有する被験体をＣＴＣＬの処置のために選択するステップを含む、方法を提供する。別の実施形態では、ＣＴＣＬの処置のために被験体を選択するための方法は、被験体のＣＴＣＬ細胞において、ＩＮＰＰ５０／ＳＨＩＰ１、Ｊａｒｉｄ２、Ｐｉｃａｌｍ、Ｂａｃｈ１、Ｗｅｅ１、ＣＵＸ１、Ｃｅｂｐｂ、ＳＰＩＢ／ＰＵ．１およびＩＬ７Ｒからなる群から選択される４個またはそれを超える遺伝子の発現のレベルを決定するステップ；被験体のＣＴＣＬ細胞における４個またはそれを超える遺伝子のレベルを、４個またはそれを超える遺伝子の参照レベルと比較するステップ；ならびに参照レベルと比較して、ＣＴＣＬ細胞における４個またはそれを超える遺伝子のレベルにおける減少を有する被験体をＣＴＣＬの処置のために選択するステップを含む。一実施形態では、ＣＴＣＬの処置のために被験体を選択するための方法は、４個の遺伝子Ｂａｃｈ１、Ｊａｒｉｄ２、ＰｉｃａｌｍおよびＳＨＩＰ１の参照レベルと比較して、被験体のＣＴＣＬ細胞における４個の遺伝子のレベルを決定するステップを含む。ある特定の実施形態では、ＣＴＣＬの処置のために被験体を選択するための方法は、４個の遺伝子の参照レベルと比較して、被験体のＣＴＣＬ細胞における４個の遺伝子Ｂａｃｈ１、Ｊａｒｉｄ２、ＰｉｃａｌｍおよびＳＨＩＰ１のレベルを決定するステップ；ならびに参照レベルと比較して、ＣＴＣＬ細胞における４個の遺伝子のレベルにおける多くとも２分の１の減少を有する被験体をＣＴＣＬの処置のために選択するステップを含む。一実施形態では、参照レベルは、対照のオリゴヌクレオチド処理細胞における同じ遺伝子の発現のレベルである。別の実施形態では、参照レベルは、セザリー症候群細胞における同じ遺伝子の発現のレベルである。さらに別の実施形態では、参照レベルは、健康な被験体（例えば、皮膚がんの２つもしくはそれを超える症状を示さない被験体、皮膚がんと診断されていない被験体、および／または皮膚がんの家族歴を有さない被験体）における同じ遺伝子の発現のレベルである。
本発明はまた、抗ｍｉＲ−１５５化合物による処置の効力を評価するための方法であって、抗ｍｉＲ−１５５化合物による処置の前に、被験体の細胞において、１個または複数の遺伝子の発現のレベルを決定するステップであって、１個または複数の遺伝子が、全てのＭＦ細胞においてモジュレートされた遺伝子のセット、例えば表２から選択される、ステップ；抗ｍｉＲ−１５５化合物による処置の後に、被験体の細胞において、同じ１個または複数の遺伝子の発現のレベルを決定するステップ；ならびに処置の前および後の発現レベルに基づいて、処置が有効である、あまり有効でない、または有効でないことを決定するステップを含む、方法を提供する。即ち、一実施形態では、表２に列挙された遺伝子は、抗ｍｉＲ−１５５処置の臨床的効力についてのバイオマーカーとして機能する。
一部の実施形態では、本発明は、参照レベルと比較して、ＣＴＣＬに罹患している疑いがある被験体におけるｍｉＲ−１５５のレベルを測定することによってＣＴＣＬを診断する方法であって、被験体におけるｍｉＲ−１５５のより高い発現が、被験体がＣＴＣＬに罹患していることを示す、方法を提供する。ＣＴＣＬに罹患している疑いがある被験体におけるｍｉＲ−１５５の発現のレベルは、被験体の皮膚病変、血漿、血清、白血球またはＰＢＭＣから単離された細胞を使用して決定され得る。ある特定の実施形態では、本発明は、参照レベルと比較して、被験体におけるｍｉＲ−１５５のレベルを測定することによって菌状息肉症形態のＣＴＣＬを診断する方法であって、被験体におけるｍｉＲ−１５５のより高い発現が、被験体がＭＦ形態のＣＴＣＬに罹患していることを示す、方法を提供する。一部の他の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−１５５の参照レベルと比較して、処置を受けている被験体におけるｍｉＲ−１５５の発現のレベルを決定することによって、抗ｍｉＲ−１５５処置への応答を評価するための方法を提供する。参照レベルは、健康な被験体におけるｍｉＲ−１５５のレベル、または健康な被験体の群からのｍｉＲ−１５５の平均もしくは中央値レベル、またはセザリー症候群を有する被験体におけるｍｉＲ−１５５のレベルであり得る。
本発明は、本明細書に開示されるｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物もまた提供する。一実施形態では、医薬組成物は、有効用量の、１１〜１６ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。
別の実施形態では、医薬組成物は、有効用量の、１１〜１４ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。
別の実施形態では、医薬組成物は、有効用量の、１１〜１４ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも７ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。
さらに別の実施形態では、医薬組成物は、有効用量の、１１〜１４ヌクレオチドの配列を有するｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を含み、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドは、改変型ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも４番目および５番目のヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、有効用量の、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２５からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド阻害剤を含む。一部の他の実施形態では、医薬組成物は、有効用量の、配列番号３３、３９、４３、４４、４７、５８、８４、９９、１１１、１１５および１２０からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド阻害剤を含む。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、表１に列挙された配列から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド阻害剤を含む。
「有効用量」は、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。本発明のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤の有効用量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇであり得る。一部の実施形態では、有効用量は、患者の皮膚病変１つ当たり約１８．７５、３７．５または７５ｍｇのオリゴヌクレオチド阻害剤であり得る。有効用量とみなされるものの正確な決定は、患者の大きさ、年齢、障害の型、および阻害剤の形態（例えば、ネイキッドオリゴヌクレオチドまたは発現構築物など）を含む、各患者にとって個別の要因に基づき得る。したがって、投薬量は、本開示および当該分野の知識から、当業者によって容易に確認され得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤と組み合わせたＨＤＡＣ阻害剤の使用を企図する。ＨＤＡＣ阻害剤が含められる実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、別々の製剤でではあるが同時発生的に、または逐次的に投与され得る。他の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、ｍｉＲ−１５５阻害剤の投与の前または後の異なる時点で投与され得る。臨床適用が企図される場合、医薬組成物は、意図した適用に適切な形態で調製される。一般に、これは、発熱物質、およびヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物の調製を必然的に伴う。
一実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤および１つまたは複数の美容的にまたは薬学的に許容される担体または賦形剤を含む外用組成物を提供する。用語「美容的に許容される」は、本明細書で使用する場合、担体または賦形剤が、過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー性応答などを伴わずに、組織（例えば、皮膚）と接触した使用に適切であることを意味する。
美容または医薬の担体または賦形剤は、液体、例えば、水、および石油、動物、植物または合成起源のものを含む油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。外用組成物は、水中油または油中水エマルジョンを含む場合が多い。本発明は、抗ｍｉＲ−１５５化合物の外用組成物を調製するためにかかるエマルジョンを使用することを包含する。適切な医薬担体は、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。適切な美容担体は、以下に記載する。
一実施形態では、美容的に許容される外用担体は、組成物の約５０重量％〜約９９．９９重量％（例えば、組成物の約８０重量％〜約９９重量％）である。外用組成物には、溶液、ローション、クリーム、ゲル、スティック、スプレー、軟膏、クレンジング液状洗剤、固形バー、シャンプー、ペースト、泡沫、粉末、ムース、シェービングクリーム、ワイプ、パッチ、ネイルラッカー、創傷包帯剤、粘着包帯、ヒドロゲルおよびフィルムが含まれるがこれらに限定されない。これらの製品型は、溶液、エマルジョン（例えば、マイクロエマルジョンおよびナノエマルジョン）、ゲル、固形物およびリポソームが含まれるがこれらに限定されない、いくつかの型の美容的に許容される外用担体を含み得る。かかる担体のある特定の非限定的な例は、本明細書で以下に示される。他の適切な担体は、当業者によって製剤化され得る。
本発明において有用な外用組成物は、皮膚軟化薬を含む溶液として製剤化され得る。かかる組成物は、好ましくは、約１％〜約５０％の皮膚軟化薬（複数可）を含有する。本明細書で使用する場合、用語「皮膚軟化薬」は、乾燥の防止または緩和のため、ならびに皮膚の保護のために使用される材料を指す。いくつかの適切な皮膚軟化薬は、公知であり、本発明において使用され得る。例えば、Ｓａｇａｒｉｎ， Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版、１巻、３２〜４３頁（１９７２年）ならびにＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ＷｅｎｎｉｎｇｅｒおよびＭｃＥｗｅｎ編、１６５６〜６１頁、１６２６頁および１６５４〜５５頁（Ｔｈｅ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ， Ｔｏｉｌｅｔｒｙ， ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ａｓｓｏｃ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．、第７版、１９９７年）（本明細書で以下「ＩＣＩ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」）は、適切な材料の多数の例を含有する。
ローションは、かかる溶液から製造され得る。ローションは、典型的には、約１％〜約２０％（例えば、約５％〜約１０％）の皮膚軟化薬（複数可）および約５０％〜約９０％（例えば、約６０％〜約８０％）の水を含む。
溶液から製剤化され得る製品の別の型は、クリームである。クリームは、典型的には、約５％〜約５０％（例えば、約１０％〜約２０％）の皮膚軟化薬（複数可）および約４５％〜約８５％（例えば、約５０％〜約７５％）の水を含む。
溶液から製剤化され得る製品のさらに別の型は、軟膏である。軟膏は、動物油もしくは植物油または半固形炭化水素の単純な基剤を含み得る。軟膏は、約２％〜約１０％の皮膚軟化薬（複数可）プラス約０．１％〜約２％の増粘剤（複数可）を含み得る。本明細書で有用な増粘剤または粘度増加剤のより完全な開示は、Ｓａｇａｒｉｎ， Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版、１巻、７２〜７３頁（１９７２年）およびＩＣＩ Ｈａｎｄｂｏｏｋ １６９３〜１６９７頁に見出すことができる。
本発明において有用な外用組成物は、エマルジョンとして製剤化され得る。担体がエマルジョンである場合、担体の約１％〜約１０％（例えば、約２％〜約５％）は、乳化剤（複数可）を構成する。乳化剤は、非イオン性、アニオン性またはカチオン性であり得る。適切な乳化剤は、例えば、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ版、３１７〜３２４頁（１９８６年）、およびＩＣＩ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１６７３〜１６８６頁に開示されている。
ローションおよびクリームは、エマルジョンとして製剤化され得る。典型的には、かかるローションは、０．５％〜約５％の乳化剤（複数可）を含む。かかるクリームは、典型的には、約１％〜約２０％（例えば、約５％〜約１０％）の皮膚軟化薬（複数可）；約２０％〜約８０％（例えば、３０％〜約７０％）の水；および約１％〜約１０％（例えば、約２％〜約５％）の乳化剤（複数可）を含む。
単相性（ｓｉｎｇｌｅ）エマルジョンの皮膚ケア調製物、例えば、水中油型および油中水型のローションおよびクリームは、美容の分野で周知であり、本発明において有用である。多相性エマルジョン組成物、例えば、米国特許第４，２５４，１０５号および同第４，９６０，７６４号に開示されるような水中油中水型もまた、本発明において有用であり得る。一般に、かかる単相性または多相性のエマルジョンは、本質的な成分として、水、皮膚軟化薬および乳化剤を含有する。
本発明の外用組成物は、ゲル（例えば、適切なゲル化剤（複数可）を使用する、水性、アルコール、アルコール／水または油ゲル）としても製剤化され得る。水性ゲルに適切なゲル化剤としては、天然ガム、アクリル酸およびアクリレートのポリマーおよびコポリマー、ならびにセルロース誘導体（例えば、ヒドロキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース）が含まれるがこれらに限定されない。油（例えば、鉱油）に適切なゲル化剤には、水素化ブチレン／エチレン／スチレンコポリマーおよび水素化エチレン／プロピレン／スチレンコポリマーが含まれるがこれらに限定されない。かかるゲルは、典型的には、約０．１重量％と５重量％との間のかかるゲル化剤を含む。
リポソーム製剤もまた、本発明の有用な組成物である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リポソーム内に含有される。リポソームの例は、リン脂質を含有してもしなくてもよい、単層膜、多重膜および少重膜（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌｌａｒ）のリポソームである。かかる組成物は、オリゴヌクレオチド阻害剤をジパルミトイルホスファチジルコリンなどのリン脂質、コレステロールおよび水と組み合わせることによって調製され得る。本発明の核酸をがん細胞または皮膚組織に送達するのに適切であり得る市販の脂肪エマルジョンには、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄおよび他の類似の脂質エマルジョンが含まれる。送達ビヒクルとしてのｉｎ ｖｉｖｏでの使用に好ましいコロイド系は、リポソーム（即ち、人工膜小胞）である。かかる系の調製および使用は、当該分野で周知である。例示的な製剤は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ５，９８１，５０５；ＵＳ６，２１７，９００；ＵＳ６，３８３，５１２；ＵＳ５，７８３，５６５；ＵＳ７，２０２，２２７；ＵＳ６，３７９，９６５；ＵＳ６，１２７，１７０；ＵＳ５，８３７，５３３；ＵＳ６，７４７，０１４；およびＷＯ０３／０９３４４９にも開示されている。
次いで、リポソーム調製物は、リポソーム製剤を産生するために、上記担体（例えば、ゲルまたは水中油エマルジョン）のうち１つ中に取り込まれ得る。外用適用されるリポソームの他の組成物および使用は、Ｍｅｚｅｉ， Ｍ．、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ ａ Ｓｋｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｄ． ＢｒｅｉｍｅｒおよびＰ． Ｓｐｅｉｓｅｒ編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ． Ｖ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８５年、３４５〜３５８頁、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９６／３１１９４号、Ｎｉｅｍｉｅｃら、１２ Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １１８４〜８８頁（１９９５年）、および米国特許第５，２６０，０６５号に記載されている。
一実施形態では、リポソームは、組成物の総体積に基づいて、約５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの量で外用組成物中に存在する。
上記担体および賦形剤に加えて、他の皮膚軟化薬および表面活性剤が、トリオレイン酸グリセロール、アセチル化ジステアリン酸スクロース、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレン（１）、モノオレイン酸グリセロール、ジステアリン酸スクロース、モノステアリン酸ポリチレングリコール（５０）、オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、ペンタ−イソステアリン酸デカグリセリン（ｄｅｃａｇｌｙｃｅｒｉｎ ｐｅｎｔａ−ｉｓｏｓｔｅａｒａｔｅ）、セスキオレイン酸ソルビタン、ヒドロキシル化ラノリン、ラノリン、ジイソステアリン酸トリグリセリル、ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル、ステアロイル−２−乳酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｓｔｅａｒｏｙｌ−２−ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、セスキステアリン酸メチルグルコシド、モノパルミチン酸ソルビタン、メトキシポリチレングリコール−２２／ドデシルグリコールコポリマー（Ｅｌｆａｃｏｓ Ｅ２００）、ポリチレングリコール−４５／ドデシルグリコールコポリマー（Ｅｌｆａｃｏｓ ＳＴ９）、ジステアリン酸ポリチレングリコール４００、およびラノリン由来ステロール抽出物、ステアリン酸グリコールおよびステアリン酸グリセロール；アルコール、例えば、セチルアルコールおよびラノリンアルコール；ミリスチン酸エステル、例えば、ミリスチン酸イソプロピル；パルミチン酸セチル；コレステロール；ステアリン酸；プロピレングリコール；グリセリン、ソルビトールなどを含むエマルジョン中に取り込まれ得る。
ある特定の実施形態では、送達に使用されるリポソームは、米国付与前公開第２０１１００７６３２２号に詳細に記載されるＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）などの両性リポソームである。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）上の表面電荷は、完全に可逆性であり、それを核酸の送達に特に適切なものにしている。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）は、注射を介して送達され、安定なままであり、凝集体を含まず、細胞膜を横切って核酸を送達できる。
一般に、送達ビヒクルを安定にし、標的細胞による取込みを可能にするために、適切な塩および緩衝液を用いることが望ましい。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散された阻害剤ポリヌクレオチドを含む有効量の送達ビヒクル（例えば、リポソームまたは他の複合体もしくは発現ベクター）を含む。語句「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、動物またはヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー性のまたは他の都合の悪い反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、ヒトへの投与に適切な医薬品などの医薬品を製剤化する際の使用に許容される、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が本発明の活性成分と不適合性である場合を除き、治療組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性成分もまた、組成物のベクターまたはポリヌクレオチドを不活性化しない限り、組成物中に取り込まれ得る。
本発明の活性組成物は、古典的な医薬調製物を含み得る。本発明に従うこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般的な経路を介してであり得る。これには、経口、外用、非経口、皮内、皮下または静脈内注射が含まれる。別の実施形態では、本明細書に記載されるｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤を含む組成物は、クリーム、軟膏、ペースト、ローションまたはゲルなどの、外用適用に適切な形態で製剤化され得る。
活性化合物はまた、非経口投与され得る。例示として、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散物は、グリセロール、液体ポリチレングリコールおよびそれらの混合物中でも、ならびに油中でも調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は一般に、微生物の成長を防止するための防腐剤を含有する。
注射可能な使用に適切な薬学的形態には、例えば、無菌の水性溶液または分散物、および無菌の注射可能な溶液または分散物の即座の調製のための無菌粉末が含まれる。一般に、これらの調製物は、無菌であり、容易な注射可能性（ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動的である。調製物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、組成物における、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
無菌の注射可能な溶液は、望ましい場合には任意の他の成分（例えば、上に列挙した通り）と共に、溶媒中に適切な量で活性化合物を取り込み、その後、濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、基本分散媒および例えば上に列挙した通りの所望の他の成分を含有する無菌ビヒクル中に、種々の無菌化された活性成分を取り込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法には、以前に無菌濾過されたその溶液から活性成分（複数可）プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥およびフリーズドライ技術が含まれる。
本発明の組成物は一般に、中性または塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、例えば、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）から誘導される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が含まれる。タンパク質の遊離カルボキシル基と形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄）からまたは有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）からも誘導され得る。
製剤化の際に、組成物は、好ましくは、投薬製剤と適合性の様式で、治療的に有効な量で投与される。製剤は、種々の剤形、例えば、注射可能な液剤、クリーム剤、軟膏剤、ペースト剤、ローション剤またはゲル剤などで容易に投与され得る。水性溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液は一般に、適切に緩衝化され、液体希釈剤は、例えば十分な食塩水またはグルコースで最初に等張性にされる。かかる水性溶液は、例えば、静脈内、皮下および皮内投与に使用され得る。好ましくは、無菌水性媒体は、特に本開示に照らして、当業者に公知のように用いられる。投薬量における幾分かの変動が、処置されている被験体の状態に依存して必然的に生じる。投与を担う人は、いずれの事象においても、個々の被験体に適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与のために、調製物は、規制機関によって要求される無菌性、発熱性、全般的安全性および純度の標準を満たすべきである。
本発明のある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、投与のためのデバイスで包装され、または投与のためのデバイス内に貯蔵される。注射可能な製剤のためのデバイスには、事前充填シリンジ、注射ポート、オートインジェクター、注射ポンプおよび注射ペンが含まれるがこれらに限定されない。エアロゾル化製剤または粉末製剤のためのデバイスには、吸入器、注入器、吸引器などが含まれるがこれらに限定されない。本発明の組成物の皮膚送達のためのデバイスには、皮膚マイクロニードル注射またはパッチもまた含まれる。したがって、本発明は、本明細書に記載される障害のうち１つまたは複数を処置または予防するための本発明の医薬組成物を含む投与デバイスを含む。
本発明は、限定として解釈すべきではない以下のさらなる実施例によってさらに例示される。当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、開示された具体的実施形態に対して多くの変化がなされ得るが、同様または類似の結果がなおも得られ得ることを理解すべきである。
（実施例１：ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤（「抗ｍｉＲ−１５５」）は、増加したｍｉＲ−１５５発現を示す菌状息肉症細胞株において活性である）
ＣＴＣＬ患者に由来する細胞株においてｍｉＲ−１５５−５ｐ発現を特徴付けるために、菌状息肉症（ＭＦ）、セザリー症候群（ＳＳ）、およびＭＦでもＳＳでもないと分類されたＣＴＣＬ細胞株においてｍｉＲ−１５５−５ｐの絶対的レベルを測定した。検査した細胞株の細胞的、病理学的および分子的特徴を表３に示す。
正常な末梢ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞と比較したＣＴＣＬ細胞株におけるｍｉＲ−１５５−５ｐの絶対的発現を、各細胞型から単離した総ＲＮＡを鋳型として使用して、リアルタイムＰＣＲによって測定した。Ｃｔ値をｍｉＲ−１５５−５ｐコピー数に相関させる検量線を、合成ｍｉＲ−１５５−５ｐ ＲＮＡ鋳型を使用して生成した。１細胞当たり１０ｐｇの総ＲＮＡを仮定して、合成鋳型を用いて生成した検量線を使用して、ＣＴＣＬ ＲＮＡ試料または正常なＣＤ４＋Ｔ細胞のＲＮＡ試料について決定したＣｔ値から、１細胞当たりのｍｉＲ−１５５−５ｐのコピー数を外挿した（図１）。菌状息肉症細胞株（ＨｕＴ１０２、ＭＪおよびＭｙ−Ｌａ）、ならびに特発性細胞株（ＨＨ）は、正常なＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して高いｍｉＲ−１５５−５ｐの発現を示したが、セザリー症候群患者に由来する細胞株（ＨｕＴ７８）は、ｍｉＲ−１５５−５ｐを過剰発現しなかった。
ＣＴＣＬ細胞株を、２μＭ〜５０μＭの範囲の濃度の抗ｍｉＲ−１５５化合物１（配列番号２７）、化合物２（配列番号２２）、化合物３（配列番号２３）および化合物４（配列番号２５）を添加した完全成長培地中で培養した。抗ｍｉＲを、任意のさらなる構成要素なしに培地に添加して、細胞取込みを増強した。細胞を、７２時間の処理後に回収し、総ＲＮＡを精製した。リアルタイムＰＣＲを、ｍｉＲ−１５５の１３個の直接的遺伝子標的について実施した（Ｗｏｒｍら２００９年；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら２０１０年；Ｚｈａｎｇら２０１２年；およびｍｉＲａｇｅｎの未公開データ）。未処理の細胞と比較した、抗ｍｉＲ処理細胞における１３個の遺伝子の発現における相対的変化倍数を計算した。図２は、１０μＭの示された抗ｍｉＲによる７２時間の処理に応答した、遺伝子発現変化の「ヒートマップ」表示を示す。少なくとも１つの細胞株において発現を欠いた４個の予測された直接的標的は省略した。遺伝子発現変化倍数を、ｌｏｇ１０変換し、赤から青の比色スケール上にプロットし、最も濃い赤は遺伝子発現における最大の相対的増加を示し、逆に、最も濃い青は、遺伝子発現における最大の低減である。ヒートマップは、いくつかのｍｉＲ−１５５−５ｐ標的遺伝子の発現が、３つの菌状息肉症細胞株（ＭＪ、ＨｕＴ１０２およびＭｙ−Ｌａ）において、ｍｉＲ−１５５−５ｐアンタゴニストへの曝露の際にモジュレートされたことを示した。類似しているがより控えめな遺伝子発現の変化が、高レベルのｍｉＲ−１５５−５ｐを発現する特発性細胞株（ＨＨ）において観察された。対照的に、これらの遺伝子の発現は、低レベルのｍｉＲ−１５５−５ｐを発現するセザリー症候群細胞株（ＨｕＴ７８）では有意に変更されず、これは、菌状息肉症細胞株およびＨＨ細胞株における遺伝子発現レベルの変化が、ｍｉＲ−１５５−５ｐの拮抗作用によって媒介されることを示している。
（実施例２：抗ｍｉＲ−１５５化合物２（配列番号２２）および４（配列番号２５）は、他の抗ｍｉＲ化合物と比較して、菌状息肉症細胞株においてより高い活性を示す）
ｍｉＲ−１５５−５ｐの４個の直接的遺伝子標的（Ｂａｃｈ１、Ｊａｒｉｄ２、ＰｉｃａｌｍおよびＳｈｉｐ１）は、３つ全ての菌状息肉症細胞株（ＭＪ、ＨｕＴ１０２およびＭｙ−Ｌａ）において抗ｍｉＲ−１５５によってモジュレートされたので、これら４個の遺伝子をさらなる分析のために選択した。これらの遺伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗ｍｉＲ活性についての遺伝子発現シグネチャーを示すために選択した。さらに、４遺伝子シグネチャーを使用して、抗ｍｉＲ化合物の活性を比較した。これらの遺伝子変化は、変動する継代数の細胞を用いた３つの独立した実験にわたって再現性があった。図３、４、５、６および７は、それぞれ、ＨｕＴ１０２、ＭＪ、ＨＨ、Ｍｙ−ＬａおよびＨｕｔ７８細胞株におけるこの４遺伝子シグネチャーの変化倍数結果を示す。＊ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定により、未処理に対してｐ値＜０．０００１。未処理細胞と比較して処理間での分散が不均等であるので、マン−ホイットニー検定を選択した。
３つの用量（２μＭ、１０μＭおよび５０μＭ）および３つの菌状息肉症細胞株にわたる累積データは、化合物２（配列番号２２）および４（配列番号２５）が化合物１（配列番号２７）および３（配列番号２３）よりも活性であったことを示した。図７に示されるように、４つ全ての抗ｍｉＲ−１５５−５ｐ化合物は、セザリー症候群株（ＨｕＴ７８）では統計的に有意な活性を示さず、これは、図１に示されるこの細胞株におけるｍｉＲ−１５５のより低い発現レベルと一致している。
（実施例３：抗ｍｉＲ−１５５処理によって誘導された遺伝子発現変化は、ｍｉＲ−１５５の阻害に特異的である）
本発明の抗ｍｉＲ−１５５化合物によって誘導される遺伝子発現変化の特異性を試験するために、菌状息肉症細胞株を、ｍｉＲ−１５５を標的化しないオリゴ（対照オリゴ）で処理した。対照オリゴヌクレオチドは、哺乳動物では発現されないＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ｍｉＲＮＡを標的化する１４ヌクレオチドの抗ｍｉＲであった（対照１）。第２のオリゴは、１４ヌクレオチド配列の抗ｍｉＲ−１５５化合物４のスクランブルである（対照２）。ＭＪおよびＨｕＴ１０２細胞株を、１０μＭの抗ｍｉＲ−１５５化合物３（配列番号２３）もしくは４（配列番号２５）または２つの対照オリゴと共に７２時間インキュベートした。図８は、ＰＣＲによって測定した、ｍｉＲ−１５５−５ｐの４個の直接的標的についての遺伝子発現における変化倍数を示す。抗ｍｉＲ−１５５化合物３（配列番号２３）または４（配列番号２５）で処理した細胞における遺伝子発現シグネチャーは、未処理の細胞のものとは統計的に有意に異なっていた。対照的に、対照化合物で処理した細胞における遺伝子発現は、未処理の細胞のものと異ならなかった。これらの結果は、ｍｉＲ−１５５の直接的標的が、オリゴ処理の非特異的効果に起因するのではなく、ｍｉＲ−１５５阻害に応答して抑制解除されたことを示している。＊ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定により、未処理に対してｐ値＜０．０００１。
（実施例４：抗ｍｉＲ−１５５で処理したＣＴＣＬ細胞株の全ゲノム発現プロファイリングは、標的係合を確認し、機構的洞察を提供する）
菌状息肉症細胞株におけるｍｉＲ−１５５阻害の分子的重要性のより完全な理解を得るために、全ゲノムトランスクリプトームプロファイリングを、抗ｍｉＲ−１５５化合物３（配列番号２３）または４（配列番号２５）で４日間（９６時間）または８日間処理したＭＪおよびＨｕＴ１０２細胞株に対して実施した。統計的に有意な遺伝子発現シグネチャーは、同じ時点における未処理の細胞と比較した、抗ｍｉＲ処理細胞についての一元配置ＡＮＯＶＡによって規定した。データを、≦０．０５の偽発見率補正したｐ値で有意に変化した遺伝子についてフィルタリングした。変化倍数結果を、図２について記載したのと同様、図９および１０にヒートマップとして示す。
４日目および８日目における全体的遺伝子発現シグネチャーの検査により、抗ｍｉＲ−１５５処理に応答した遺伝子発現変化についての時間経過が示唆された：初期の時点（４日）または後期の時点（８日）において調節された独自の遺伝子セット、ならびに両方の時点において変化した一部の遺伝子が同定された（ＭＪプロファイルについては図９、ＨｕＴ１０２プロファイルについては図１０）。さらに、発現プロファイリングにより、各細胞株において調節された独自の遺伝子セット、ならびに両方の細胞株において調節された一部の遺伝子が同定された。化合物４（配列番号２５）は、化合物４（配列番号２５）ヒートマップにわたる青色および赤色のより高い強度によって実証されるように、両方の細胞株で両方の時点において、より大きい大きさの遺伝子調節を実証した。
４日目における両方の細胞株および両方の化合物に共通する遺伝子発現プロファイルを、ｍｉＲ−１５５−５ｐのシードマッチした遺伝子標的（８、７および６ヌクレオチドの結合部位）の富化について分析した。これらの遺伝子の変化倍数を、図１１にヒートマップで示す。１５０個の上方調節された遺伝子のこのシグネチャーは、１．６×１０−２５の超幾何ｐ値で、ｍｉＲ−１５５−５ｐのシードマッチした標的（８、７および６ヌクレオチドの結合部位）について有意に富化された（図１１Ａ）。累積分布関数による分析は、シードマッチした標的についての富化を確認し、８ｍｅｒ＞７ｍｅｒ＞６ｍｅｒの結合部位についての富化を実証した（図１１Ｂ）。遺伝子シグネチャーをまた、機能的遺伝子アノテーション富化についてＤＡＶＩＤの生物情報学的資源を使用して分析した（Ｈｕａｎｇ ｄａら、２００９年）。≦０．０１のＢｅｎｊａｍｉｎｉ補正したｐ値によって規定される通り、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベースタームの有意な富化は存在しなかった。
８日目における両方の細胞株および両方の化合物に共通する遺伝子発現シグネチャー（合計で６７７個の遺伝子）を、シードマッチした遺伝子標的の富化および機能的遺伝子アノテーションについての分析に供した。上方調節された遺伝子シグネチャーは、＜１０−２７の超幾何ｐ値で、シードマッチした標的について有意に富化された。４日目のシグネチャーとは異なり、８日目のシグネチャーは、２つの機能的アノテーションタームの強い富化もまた示した：上方調節されたシグネチャーにおける抗原提示、および下方調節されたシグネチャーにおける有糸分裂細胞周期（図１２）。合わせると、これらの結果は、抗ｍｉＲ化合物の効果が、ｍｉＲ−１５５−５ｐおよびその直接的遺伝子標的の阻害によって媒介されること、ならびにｍｉＲ−１５５−５ｐ機能の阻害によって惹起される表現型が、増強された抗原提示、および増殖における低減を含み得ることを確認している。
抗ｍｉＲ−１５５化合物４（配列番号２５）の活性を、４日間および８日間化合物４（配列番号２５）で第３の菌状息肉症細胞株ＭｙＬａを処理し、遺伝子発現における変化をプロファイリングすることによって、さらに調査した。化合物４（配列番号２５）の特異性を試験するために、セザリー症候群細胞株（ＨｕＴ７８）の細胞を、８日間化合物４（配列番号２５）で処理し、遺伝子発現における変化をプロファイリングした。これらの結果を図１３に示す。３つの菌状息肉症細胞株ＨｕＴ１０２、ＭＪおよびＭｙ−Ｌａにおいて化合物４（配列番号２５）に応答して＜０．０５の偽発見率（ＦＤＲ）補正したｐ値で統計的に変化する遺伝子を、上記のようにヒートマップに示す。ヒートマップ中の遺伝子の総数は、３２４個である。図１３は、化合物４（配列番号２５）によるセザリー症候群細胞株ＨｕＴ７８の処理が、遺伝子発現においてそれほどの変化を示さなかったことを示しており、これは、菌状息肉症細胞株における遺伝子発現変化が、化合物４（配列番号２５）によるｍｉＲ−１５５−５ｐの阻害に実際に起因することを示している。
さらに、３つ全ての菌状息肉症細胞株において化合物４（配列番号２５）によって調節された遺伝子を、化合物４（配列番号２５）などの本発明の抗ｍｉＲ−１５５化合物による処理の臨床的評価に使用できるバイオマーカーシグネチャーとして同定した。同定されたセットの遺伝子は、３つ全ての細胞株において上方調節されたまたは３つ全ての細胞株において下方調節された。各時点（４日目および８日目）について共通するシグネチャーを同定し、次いで、単一の遺伝子リスト（表２）に統合した。遺伝子発現の大きさに対してはフィルターをかけなかった。したがって、表２は、４日目のみにおいて調節された、または８日目のみにおいて調節された、または両方の時点において調節された遺伝子を含有する。表２は、化合物４（配列番号２５）によって調節された初期（直接的）標的および下流の（間接的）標的を含む５８７個の遺伝子を含有する（図２１）。表２の遺伝子リストは、直接的標的であるＢａｃｈ１、ＰｉｃａｌｍおよびＪａｒｉｄ２を含んでおり、これらの遺伝子が、複数の細胞株および時点にわたる化合物４（配列番号２５）活性の堅固なマーカーであることを実証している。
（実施例５：本発明の抗ｍｉＲ−１５５化合物は、ＣＴＣＬ細胞において細胞増殖を阻害し、アポトーシスを増加させる）
ＣＴＣＬ細胞による抗ｍｉＲ−１５５化合物の受動的取込みは、細胞増殖における有意な低減を生じ、プログラム細胞死を誘導した。これらの効果は、２つのＣＴＣＬ細胞株ＨｕＴ１０２およびＭｙＬａにおいて観察された。ＨｕＴ１０２細胞株およびＭｙＬａ細胞株の両方において抗ｍｉＲ−１５５化合物３（配列番号２３）よりも高い標的抑制解除を実証した抗ｍｉＲ−１５５化合物２（配列番号２２）および４（配列番号２５）は、増殖のより高い阻害およびより高いアポトーシス活性を示した。
図１４Ａは、ＨｕＴ−１０２細胞の増殖に対する経時的な抗ｍｉＲ−１５５化合物４（配列番号２５）の効果を示す。ＡＴＰのレベルは細胞数と直接相関するので、ＡＴＰを測定して細胞数を決定した。細胞数に対する化合物４（配列番号２５）の効果は、ＣＴＣＬのための標準治療的療法であるベキサロテンで見られたものと同等であった（図１４Ａ）。細胞数における低減には、カスパーゼ３／７活性によって測定されたアポトーシスにおける増加が伴った（図１４Ｂ）。カスパーゼ３および７タンパク質は、システインアスパラギン酸特異的プロテアーゼ（カスパーゼ）ファミリーのメンバーである。カスパーゼファミリーは、哺乳動物細胞のアポトーシスにおいて重要なエフェクター的役割を果たす。適切に正規化されない場合には結果を混乱させ得る低レベルの基底カスパーゼ活性を全ての細胞が有するので、カスパーゼ活性をＡＴＰレベルに対して正規化した。化合物４（配列番号２５）は、ベキサロテンよりも高い、アポトーシスの誘導を示した（図１４Ｂ）。
時間経過に加えて、ＨｕＴ１０２細胞における抗ｍｉＲ−１５５化合物の用量漸増（ｄｏｓｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を、８日間の処理後に実施したＡＴＰおよびカスパーゼ３／７測定を用いて実施した（それぞれ、図１５Ａおよび１５Ｂ）。これらの結果は、化合物４（配列番号２５）の阻害能力を確認する。
増殖およびカスパーゼ３／７活性化に対する類似の効果が、８日目にＨｕＴ−１０２細胞において抗ｍｉＲ−１５５化合物２（配列番号２２）で観察された（それぞれ、図１６Ａおよび１６Ｂ）。
化合物４（配列番号２５）は、第２の菌状息肉症細胞株Ｍｙ−Ｌａ細胞において類似の活性を示した。図１７Ａおよび１７Ｂは、化合物３（配列番号２３）および４（配列番号２５）による経時的な増殖、およびカスパーゼ３／７の活性化を示す。ＨｕＴ１０２細胞と類似して、化合物４（配列番号２５）は、化合物３（配列番号２３）と比較してより高い活性を示した。
時間経過に加えて、Ｍｙ−Ｌａ細胞における抗ｍｉＲ−１５５化合物の用量漸増を、８日間の処理後のＡＴＰおよびカスパーゼ３／７測定を用いて実施した（それぞれ、図１８Ａおよび１８Ｂ）。これらの結果は、化合物４（配列番号２５）の阻害能力をさらに確認する。
（実施例６：ＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせた抗ｍｉＲ−１５５処理は、細胞増殖およびアポトーシス活性に対する効果を増強する）
ボリノスタット（化学名：ＳＡＨＡ）は、進行した菌状息肉症を有する患者に対する標準治療のエピジェネティックな治療である。しかし、凡ＨＤＡＣ阻害剤の副作用は十分に記載されている。組合せ治療が個々の化合物による処理と比較して増強された活性を示すかどうかを決定するために、ＨｕＴ１０２細胞を、抗ｍｉＲ−１５５と組み合わせた有効未満の用量のＳＡＨＡで処理した。
ＨｕＴ１０２細胞を、０．２５μＭのＳＡＨＡおよび１０μＭの化合物３（配列番号２３）または４（配列番号２５）で、個々に、または組み合わせて処理した。細胞を毎日回収して、ＡＴＰレベルおよびカスパーゼ３／７活性を測定した。ＡＴＰレベルを図１９Ａに示す。類似の実験を、０．５０μＭのＳＡＨＡで実施した。図１９Ｂは、ＨｕＴ１０２細胞を０．５０μＭのＳＡＨＡおよび１０μＭの化合物３（配列番号２３）または４（配列番号２５）で、個々に、または組み合わせて処理した場合に得られたＡＴＰレベルを示す。
図２０Ａおよび２０Ｂは、カスパーゼ３／７活性に対する効果を示す。０．２５または０．５μＭのＳＡＨＡと組み合わせた場合の化合物４（配列番号２５）は、各処理単独と比較して増加したアポトーシスを生じた。このデータは、抗ｍｉＲ−１５５オリゴが、低用量の凡ＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせて使用できることを示唆している。
（実施例７：異なる長さのオリゴヌクレオチドの抗ｍｉＲ−１５５活性）
ｍｉＲ−１５５阻害剤の活性を評価するために、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用した。簡潔に述べると、ｍｉＲ−１５５に対する結合部位を、市販のｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクター系（Ｐｒｏｍｅｇａ）内に位置するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ中にクローニングした。ｍｉＲ−１５５阻害剤の非存在下では、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質の発現は、ｍｉＲ−１５５模倣物（ｍｉｍｉｃ）によって抑制される。ｍｉＲ−１５５阻害剤の存在下では、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質の発現は、抑制解除される。プラスミドのトランスフェクションについて制御するために、ベクターは、ｍｉＲ−１５５結合部位を含有しないホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する。Ｒｅｎｉｌｌａまたはホタルのいずれかのルシフェラーゼの発現は、ルシフェラーゼタンパク質によって放射される光の検出を介して測定される。
ｍｉＲ−１５５結合部位を含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミド５０ｎｇを、ｍｉＲ−１５５模倣物なしで（「レポーター」のみ）、１０ｎＭのｍｉＲ−１５５模倣物と共に（「レポーター＋模倣物」）、１０ｎＭのｍｉＲ−１５５模倣物および２ｎＭの対照オリゴヌクレオチドと共に、または１０ｎＭのｍｉＲ−１５５模倣物および２ｎＭの１１〜１４ヌクレオチド長の試験ｍｉＲ−１５５オリゴヌクレオチド阻害剤（表４）と共に、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。ｍｉＲ−１５５模倣物は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入し（ｍｉＲＩＤＩＡＮ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ヒトｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ模倣物；受託番号ＭＩＭＡＴ００００６４６；カタログ番号Ｃ−３００６４７−０５−０００５）、成熟ｍｉＲＮＡ配列：−ＵＵＡＡＵＧＣＵＡＡＵＣＧＵＧＡＵＡＧＧＧＧＵ−（配列番号１２１）を含有する。実験で使用した対照オリゴヌクレオチドは、以下の配列を有した：５’−ｌＣｓ．ｄＴｓ．ｄＡｓ．ｌＧｓ．ｄＡｓ．ｌＡｓ．ｄＡｓ．ｌＧｓ．ｌＡｓ．ｄＧｓ．ｌＴｓ．ｄＡｓ．ｌＧｓ．ｌＡ−３’（配列番号１２２）。
図２２は、レポータープラスミドおよび模倣物のトランスフェクションが、ルシフェラーゼの最大の抑制を生じたこと；レポータープラスミド単独のトランスフェクションが、ルシフェラーゼの最大の発現を生じたこと；レポーターおよび模倣物を伴った対照オリゴヌクレオチドのトランスフェクションが、ルシフェラーゼの発現を抑制解除しなかったこと；ならびにレポーターおよび模倣物を伴った試験ｍｉＲ−１５５オリゴヌクレオチド阻害剤のトランスフェクションが、異なる程度までルシフェラーゼの発現を抑制解除したことを示す。
（実施例８：変動する数のロックトヌクレオチド（ＬＮＡ）を含有するオリゴヌクレオチドの抗ｍｉＲ−１５５活性）
実験を、実施例７に記載したように実施した。この実験で使用した試験ｍｉＲ−１５５オリゴヌクレオチド阻害剤は、含有されるＬＮＡの数が異なっていた（表５〜８）。結果を図２３Ａ（表５）、２３Ｂ（表６）、２３Ｃ（表７）および２３Ｄ（表８）に示す。
（実施例９：種々の位置にＬＮＡ改変を含有するオリゴヌクレオチドの抗ｍｉＲ−１５５活性）
実験を、実施例７に記載したように実施した。この実験で使用した試験ｍｉＲ−１５５オリゴヌクレオチド阻害剤は、ＬＮＡ改変の位置が異なっていた（表９〜１２）。結果を図２４Ａ（表９）、２４Ｂ（表１０）、２４Ｃ（表１１）および２４Ｄ（表１２）に示す。
（実施例１０：種々のヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチドの抗ｍｉＲ−１５５活性）
実験を、実施例７に記載したように実施した。この実験で使用した試験ｍｉＲ−１５５オリゴヌクレオチド阻害剤は、１４ヌクレオチド長であり、各々９個のヌクレオチド改変を含有した（表１３）。ヌクレオチド改変は、ロックトヌクレオチド（ＬＮＡ）、エチレン架橋核酸／エチレン架橋ヌクレオチド（ＥＮＡ）および２’−Ｃ架橋二環式ヌクレオチド（ＣＢＢＮ）を含んだ。結果を図２５に示す。
（実施例１１：１４ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドの抗ｍｉＲ−１５５活性）
実験を、実施例７に記載したように実施した。この実験で使用した試験ｍｉＲ−１５５オリゴヌクレオチド阻害剤は、１４ヌクレオチド長であり、９または１０個のＬＮＡ改変を含有した（表１４）。結果を図２６に示す。
（実施例１２：配列番号２５および配列番号２３を含有するオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性）
実験を、実施例７に記載したように実施した。この実験で使用した試験ｍｉＲ−１５５オリゴヌクレオチド阻害剤は、配列番号２５および配列番号２３のオリゴヌクレオチド阻害剤であった。結果を図２７に示す。
（実施例１３：配列番号２５および配列番号１２０を含有するオリゴヌクレオチド阻害剤の抗ｍｉＲ−１５５活性）
配列番号２５および配列番号１２０のｍｉＲ−１５５オリゴヌクレオチド阻害剤を、Ｏｃｉ−Ｌｙ３細胞株において受動的にトランスフェクトした。ｍＲＮＡを４日目に単離し、ｍｉＲ−１５５標的遺伝子（Ｂａｃｈ１、ＣＥＢＰＢ、ＣＵＸ１、ＩＮＰＰ５Ｄ／ＳＨＩＰ１、Ｊａｒｉｄ２、ＰｉｃａｌｍおよびＷｅｅ１）の発現についてｑＰＣＲによって分析した。図２８は、配列番号２５および配列番号１２０のオリゴヌクレオチド阻害剤のトランスフェクションの際の、これらの遺伝子の発現における変化倍数を示す。図２８中の各データポイントにおいて、遺伝子は、左から右の順で、Ｂａｃｈ１、ＣＥＢＰＢ、ＣＵＸ１、ＩＮＰＰ５Ｄ／ＳＨＩＰ１、Ｊａｒｉｄ２、ＰｉｃａｌｍおよびＷｅｅ１である。配列番号１２０は、配列番号２５中のＬＮＡと同じ位置にＣＢＢＮヌクレオチドを含有する。

Claims (71)

  1. １１〜１６ヌクレオチドの配列を含むｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤であって、
    前記オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；
    前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである、オリゴヌクレオチド阻害剤。
  2. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から４番目のヌクレオチドがロックトヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  3. 少なくとも９個のロックトヌクレオチドを含有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  4. １２ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  5. １４ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  6. 配列番号２５の配列を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  7. 配列番号２２の配列を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  8. 配列番号２３の配列を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  9. ｍｉＲ−１５５の活性または機能を低減する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  10. がん細胞の増殖を低減する、請求項１から９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  11. がん細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  12. 前記がん細胞が悪性Ｔ細胞である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  13. 前記がん細胞が皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）細胞である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  14. 悪性Ｔ細胞においてｍｉＲ−１５５の１個または複数の標的遺伝子の発現または活性を上方調節する、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  15. 請求項１から１４のいずれか一項に記載のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
  16. レチノイドまたはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤である第２の治療剤をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. １１〜１４ヌクレオチドの配列を含むｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤であって、
    前記オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；
    前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  18. 少なくとも７個の改変型ヌクレオチドを含有する、請求項１７に記載のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  19. 前記改変型ヌクレオチドが、ロックトヌクレオチド、エチレン架橋ヌクレオチド、２’−Ｃ架橋二環式ヌクレオチドおよび２’置換ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１７または１８に記載のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  20. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から２番目のヌクレオチドが未改変のＤＮＡヌクレオチドである、請求項１７に記載のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  21. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から最初の３ヌクレオチドがロックトヌクレオチドである、請求項１７に記載のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  22. 配列番号３９、５８、８４、９９、１１１、１１５および１２０からなる群から選択される配列を有する、請求項１７に記載のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  23. １１〜１４ヌクレオチドの配列を含むｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤であって、
    前記オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１５５の成熟配列に対して完全に相補的であり、かつ完全ホスホロチオエート骨格を有し；
    前記オリゴヌクレオチド阻害剤の少なくとも７ヌクレオチドが改変型ヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである、ｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  24. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３ヌクレオチドが、改変型ヌクレオチドである、請求項２３に記載のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  25. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から２番目または３番目のヌクレオチドがＤＮＡヌクレオチドである、請求項２３に記載のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  26. 前記改変型ヌクレオチドが、ロックトヌクレオチド、エチレン架橋ヌクレオチド、２’−Ｃ架橋二環式ヌクレオチドおよび２’置換ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２３に記載のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  27. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から２番目のヌクレオチドが未改変のＤＮＡヌクレオチドである、請求項２３に記載のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  28. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から最初の３ヌクレオチドがロックトヌクレオチドである、請求項２３に記載のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  29. 配列番号３９、４３、４４、５８、８４、９９、１１１、１１５および１２０からなる群から選択される配列を有する、請求項２３に記載のｍｉＲ−１５５のオリゴヌクレオチド阻害剤。
  30. がんの処置を必要とする被験体においてがんを処置するための方法であって、請求項１、１７または２３に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
  31. 前記がんがリンパ腫である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記がんが皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）である、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から４番目のヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドである、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、少なくとも９個のロックトヌクレオチドを含有する、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が１２ヌクレオチドの長さを有する、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が１４ヌクレオチドの長さを有する、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号２５の配列を有する、請求項３０に記載の方法。
  38. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号２２の配列を有する、請求項３０に記載の方法。
  39. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号２３の配列を有する、請求項３０に記載の方法。
  40. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、配列番号３９、４３、４４、５８、８４、９９、１１１、１１５および１２０からなる群から選択される配列を有する、請求項３０に記載の方法。
  41. 第２の治療または薬剤を前記被験体に投与するステップをさらに含む、請求項３０から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記第２の治療または薬剤が、ＨＤＡＣ阻害剤、レチノイド、インターフェロン、葉酸代謝拮抗剤、外用ステロイド、外用レチノイド、外用ナイトロジェンマスタード、光線療法、紫外線、ソラレンおよび紫外線、放射線療法、電子線治療、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＰＤ−１抗体ならびに抗ＰＤ−Ｌ１抗体からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記第２の治療または薬剤が、レチノイドまたはＨＤＡＣ阻害剤である、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記レチノイドがベキサロテンである、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、モセチノスタット、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、アベキシノスタット、ＣＩ−９９４（タセジナリン）およびＭＳ−２７５（エンチノスタット）からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
  46. ｍｉＲ−１５５の活性または機能が、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後に前記被験体のがん細胞において低減される、請求項３０から４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、がん細胞の増殖を低減する、請求項３０から４５のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、がん細胞のアポトーシスを誘導する、請求項３０から４５のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、悪性Ｔ細胞においてｍｉＲ−１５５の機能または活性を阻害する、請求項３０に記載の方法。
  50. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、悪性Ｔ細胞においてｍｉＲ−１５５の１個または複数の標的遺伝子の発現または活性を上方調節する、請求項３０に記載の方法。
  51. 請求項１、１７または２３に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む、悪性Ｔ細胞の増殖を低減または阻害するための方法。
  52. 前記悪性Ｔ細胞が皮膚Ｔ細胞リンパ腫細胞である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記悪性Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から４番目のヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドである、請求項５１に記載の方法。
  55. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、少なくとも９個のロックトヌクレオチドを含有する、請求項５１から５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が１２ヌクレオチドの長さを有する、請求項５１から５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が１４ヌクレオチドの長さを有する、請求項５１から５５のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号２５の配列を有する、請求項５１に記載の方法。
  59. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号２２の配列を有する、請求項５１に記載の方法。
  60. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が配列番号２３の配列を有する、請求項５１に記載の方法。
  61. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、配列番号３９、４３、４４、５８、８４、９９、１１１、１１５および１２０からなる群から選択される配列を有する、請求項５１に記載の方法。
  62. 第２の治療または薬剤を前記被験体に投与するステップをさらに含む、請求項５１から６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記第２の治療または薬剤が、ＨＤＡＣ阻害剤、レチノイド、インターフェロン、葉酸代謝拮抗剤、外用ステロイド、外用レチノイド、外用ナイトロジェンマスタード、光線療法、紫外線、ソラレンおよび紫外線、放射線療法、電子線治療、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＰＤ−１抗体ならびに抗ＰＤ−Ｌ１抗体からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記第２の治療または薬剤が、レチノイドまたはＨＤＡＣ阻害剤である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記レチノイドがベキサロテンである、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、モセチノスタット、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、アベキシノスタット、ＣＩ−９９４（タセジナリン）およびＭＳ−２７５（エンチノスタット）からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
  67. ｍｉＲ−１５５の活性または機能が、前記オリゴヌクレオチド阻害剤の投与後に悪性Ｔ細胞において低減される、請求項５１から６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、がん細胞のアポトーシスを誘導する、請求項５１から６６のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、悪性Ｔ細胞においてｍｉＲ−１５５の機能または活性を阻害する、請求項５１に記載の方法。
  70. 前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、悪性Ｔ細胞においてｍｉＲ−１５５の１個または複数の標的遺伝子の発現または活性を上方調節する、請求項５１に記載の方法。
  71. ＣＴＣＬの処置のために被験体を選択するための方法であって、前記被験体の細胞において、表２に列挙された遺伝子から選択される１個または複数の遺伝子の発現のレベルを決定するステップ；前記被験体の前記細胞における前記１個または複数の遺伝子の前記レベルを、前記１個または複数の遺伝子の参照レベルと比較するステップ；ならびに前記参照レベルと比較して、前記細胞における前記１個または複数の遺伝子の前記レベルにおける増加および／または減少を有する被験体をＣＴＣＬの処置のために選択するステップを含む、方法。
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