KR101868778B1 - 단백질 제형 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 물과 단백질을 포함하는 수성 제형 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 수성 제형은 고도의 단백질 제형이고/이거나, 전도도 수준이 낮아 이온성 부형제의 수준이 낮을 수 있다. 또한, 본 발명에는 물과 낮은 몰삼투농도의 단백질을 포함하는 제형이 포함된다.

Description

단백질 제형 및 이의 제조방법{Protein formulations and methods of making same}

본 출원은 2007년 11월 30일자로 출원된 미국 가특허원 제61/004992호에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 상기 우선 출원의 내용은 본원에서 참조로서 도입된다.

약제학적 단백질 제형의 기본적 원리는 어느 정도의 불안정성이 극복되어야 한다는 것이다. 단백질의 열화 경로는 화학적 불안정성 및 물리적 불안정성을 수반하는 2가지 상이한 부류로 구분될 수 있다. 화학적 불안정성은 결합의 형성 또는 개열을 통한 단백질의 변형을 유도한다. 화학적 불안정성 문제의 예는 탈아미드화, 라세미체화, 가수분해, 산화, 베타 제거 및 디설파이드 교환을 포함한다. 한편, 물리적 불안정성은 단백질에서 공유결합 변화를 유도하지 않는다. 오히려, 이들은 단백질의 보다 고차 구조(2차 이상)의 변화와 관련된다. 이들은 변성, 표면에 대한 흡착, 응집 및 침전을 포함한다[참조: Manning et al., Pharm. Res. 6, 903 (1989)].

일반적으로, 약제학적 단백질 제형의 상업적 실행가능성 및 효율에 큰 효과를 가질 수 있는 이들 불안정성은 당해 제형에 추가의 분자를 포함시킴으로써 극복될 수 있는 것으로 인정된다. 단백질 안정성은 용액 속에서 당해 단백질과 상호작용하여 당해 단백질을 안정하고 용해성이며 비응집 상태로 유지시키는 부형제를 포함시킴으로써 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 염 화합물 및 기타 이온성 종이 단백질 제형에 대한 매우 통상적인 첨가제이다. 이들은 비특이적 방식으로 단백질에 결합하여 열적 안정성을 증가시킴으로써 단백질의 변성을 방지하는 것을 돕는다. 염 화합물(예: NaCl, KCl)은 응집 및 침전을 방지하기 위해 상업적 인슐린 제제에서 성공적으로 사용되어 왔다(상기 문헌에서, at 911). 아미노산(예: 히스티딘, 아르기닌)은 제형 첨가제로서 사용되는 경우에 단백질의 2차 구조의 변경을 감소시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Tian et al., Int'l J. Pharm. 355, 20 (2007)]. 통상 사용되는 첨가제의 기타 예에는 글리세롤 및 당 등의 폴리알콜 물질, 및 세정제, 비이온성(예: Tween, Pluronic) 및 음이온성(나트륨 도데실 설페이트) 등의 계면활성제가 포함된다. 모든 액체의 상업적 단백질 제형에서 첨가제의 거의 보편적인 보급은 이러한 화합물을 포함하지 않는 단백질 용액이 불안정성에 기인하는 열화의 도전에 직면할 수 있음을 나타낸다.

단백질 제형의 첫번째 목적은 약제학적 단백질 약물의 허용되는 저장 수명을 보장하기 위해 장기간에 걸쳐 이의 천연 약제학적 활성 형태로 소정 단백질의 안정성을 유지하는 것이다. 그러나, 용액에서 단백질의 안정성 및 용해도를 유지하는 것은 첨가제가 치료제에 포함되는 약제학적 제형에서 특히 요구받고 있다. 현재까지, 생물학적 제형은 단백질 안정성을 유지하기 위해 추가의 부형제를 필요로 한다. 전형적으로, 액체 약제학적 제형은 안정성을 위해 복수의 첨가제를 함유한다. 예를 들면, 사람 성장 호르몬, 노르디트로핀 심플렉스(Norditropin SimplexXx^R)의 환자 자가-투여용 액체 제형은 당해 호르몬을 안정화시키기 위해 첨가제인 만니톨(당 알콜), 히스티딘 및 폴록사머 188(계면활성제)을 함유한다.

약제학적 첨가제는 가용성, 무독성이어야 하고 특정한 치료학적 단백질에 대한 안정화 효과를 제공하는 특정한 농도에서 사용되어야 한다. 첨가제의 안정화 효과는 단백질-의존성 및 농도-의존성이기 때문에, 약제학적 제형에서 사용될 각 첨가제는 불안정성을 유발하지 않거나 당해 제형의 화학적 또는 물리적 구성에 대한 기타 부작용을 갖지 않도록 주의깊게 시험되어야 한다. 단백질의 안정화에 사용된 성분들은 시간 경과에 따른 단백질 안정성과 관련하여 또는 저장 동안 환경 변화에서 단백질 안정성과 관련하여 문제를 유발할 수 있다.

전형적으로, 장기간의 저장 수명은 단백질을 냉동된 형태(예, -80℃에서)로 저장하거나 단백질을 동결건조 공정으로 처리함으로써, 즉 단백질을 동결건조 형태로 저장함으로써 달성되는데, 이는 사용 직전에 재구성 단계를 필요로 하여 환자 편의성과 관련하여 상당한 단점을 제기한다. 그러나, 저장을 위한 단백질 제형의 냉동은 고농도의 단백질 및 첨가제를 국지화시킬 수 있으며, 이는 당해 제형내에서 pH, 열화 및 단백질 응집의 국소적 극단성을 생성할 수 있다. 또한, 냉동 및 해동 공정은 종종 단백질 안정성에 영향을 미치는 것(이는 냉동 형태로 약제학적 단백질의 저장조차도 냉동 및 해동 단계에 기인한 안정성의 손실과 관련될 수 있음을 의미한다)이 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 또한, 동결건조의 제1 공정 단계는 단백질 안정성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 냉동을 수반한다. 산업적 환경에서, 약제학적 단백질은 약물 제조(유지 단계, 약물 생성물 충전 마무리시에 타이밍 및 배치 크기 가요성을 증가시키기 위해 저장, 재냉동 및 재해동) 및 후속 약물 생성물 충전 마무리(동결건조) 동안 냉동-해동 처리를 반복할 수 있다. 약제학적 단백질이 직면하는 냉동-해동 주기 수의 증가에 따라 단백질 불안정성 현상의 발생 위험이 증가한다는 것은 공지되어 있기 때문에, 반복된 냉동-해동 공정동안 단백질 안정성을 유지하는 제형 조건을 달성하는 것이 도전 과제이다. 당해 제형 중에서 바람직하지 않은 특성을 생성하지 않으면서, 특히 pH, 몰삼투농도, 밀도 또는 단백질 또는 부형제 농도의 변화 없이 냉동 및 해동시킬 수 있는 제형이 생물약제학적 산업에서 요구되고 있다.

종종 단백질-기재의 약제학적 생성물은 치료 효과를 위해 고농도로 제형화되어야 한다. 고농축 단백질 제형은 보다 작은 용적의 용량이 가능하고 환자의 불편함이 제한되며 포장 및 저장이 보다 경제적이기 때문에 치료학적 사용에 바람직하다. 그러나, 고농도 단백질 제형의 개발은 제조, 안정성, 분석 등의 다수의 과제가 존재하고, 특히 치료학적 단백질의 경우에 전달 과제가 존재한다. 예를 들면, 단백질의 응집, 불용성 및 열화와 관련된 곤란함은 제형 중의 단백질 농도가 상승함에 따라 일반적으로 증가한다[참조: Shire, S.J. et al., J. Pharm. Sci., 93, 1390 (2004)]. 이전에는 발견되지 않은 부작용은, 저농도의 첨가제 또는 단백질에서는 유리한 효과를 제공하는 첨가제에 의해 유발될 수도 있다. 고농도 단백질 제형의 생성은 유백광, 응집 및 침전과 관련하여 상당한 문제를 유도할 수도 있다. 비천연 단백질 응집 및 미입자 형성의 가능성 이외에, 가역적 자가-결합이 발생할 수도 있으며, 이는 주입에 의한 전달을 복잡하게 하는 점도 증가 및 기타 특성을 생성할 수도 있다. 고점도는 또한 여과 방식에 의한 고농도 단백질의 제조를 복잡하게 할 수도 있다.

따라서, 약제학적 단백질 제형은 통상 주의깊게, 임의의 부작용을 제한하면서, 단백질 안정성 및 치료학적 요건을 향상시키기 위해 성분과 농도의 균형을 맞춘다. 생물학적 제형은, 잠재적인 치료학적 복잡성, 저장 문제 및 전체 비용을 감소시키는 특정량의 부형제와 함께 안정한 단백질을 고농도로 포함한다.

단백질 및 기타 생물거대분자가 약물 분자로서 관심이 증가됨에 따라, 이러한 분자를 전달하는 제형이 중요한 문제가 되고 있다. 치료학적 사용을 위한 단백질의 대량 생산에 있어서의 혁신적인 진보에도 불구하고, 체내에서 이들 제제의 효과적이고 편리한 전달은, 생물학적 막을 통한 불량한 투과, 거대 분자 크기, 짧은 혈장 반감기, 자가 결합, 물리적 및 화학적 불안정성, 응집성, 흡착 및 면역원성을 포함하는 이들의 고유한 물리화학적 및 생물학적 특성 때문에 주요한 과제로 남아 있다.

발명의 개요

본 발명은 물에서 제형화된 단백질이 장기간 액체 저장 및 기타 처리 단계, 예를 들면, 냉동/해동 및 동결건조 동안 고농도에서도 안정성 뿐만 아니라 용해도를 유지하는 놀라운 발견에 관한 것이다.

본 발명은, 추가 제제의 필요 없이 단백질이 안정한, 물과 단백질을 포함하는 수성 단백질 제형을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 방법 및 조성물은, 정용여과 매질로서 물을 사용하여 목적하는 단백질을 함유하는 제1 용액을 정용여과하는, 정용여과 방법에 기초한 것이다. 본 발명의 방법은 적어도 측정된 용적 교환, 예를 들면, 물에 의한 5배 용적 교환이 되도록 실행된다. 본 발명의 방법을 실시함으로써, 생성되는 수성 제형은 초기 단백질 용액과 비교하여 부형제의 전체 비율이 현저히 감소한다. 예를 들면, 초기 단백질 용액과 비교하여 95 내지 99% 미만의 부형제가 수성 제형에서 발견된다. 부형제의 감소에도 불구하고, 단백질은 용해 상태로 잔류하며, 고농도에서도 이의 생물학적 활성을 유지한다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 방법은 이온성 부형제 등의 추가 성분들을 감소시키면서 단백질의 농도가 증가된 조성물을 생성한다. 이와 같이, 수성 제형 중의 단백질의 수력학적 직경은 인산완충식염수(PBS) 등의 표준 완충 용액 중의 동일한 단백질보다 더욱 작다.

본 발명의 제형은 표준 완충된 제형 보다 많은 잇점을 갖는다. 한 가지 양태에서, 수성 제형은 고단백질 농도, 예를 들면, 50 내지 200 mg/mL 이상을 포함한다. 모든 크기의 단백질이 증가된 농도에서도 본 발명의 제형에 포함될 수 있다. 단백질의 고농도에도 불구하고, 본 발명의 제형은 최소 응집을 갖고, 고도 단백질 제형에서 예상될 수 있는 유해한 효과 없이, 다양한 방법 및 형태, 예를 들면, 냉동을 사용하여 저장할 수 있다. 본 발명의 제형은, 예를 들면, 용액 중 단백질을 안정화시키기 위해 종래의 제형에 사용되는 계면활성제 및 완충 시스템 등의 부형제를 필요로 하지 않는다. 낮은 수준의 이온성 부형제의 결과로서, 본 발명의 수성 제형은 전도도가 낮고, 예를 들면, 2 mS/cm 미만이다. 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 몰삼투농도(osmolality)가 낮은, 예를 들면, 30 mOsmol/kg 이하인 수성 단백질 제형을 제공한다. 또한, 본원에 기재된 제형은 이들이 단백질 안정화에 필요한 추가 제제의 부재에 기인하여 감소된 면역원성을 갖기 때문에 표준 제형 보다 바람직하다.

본 발명의 방법 및 조성물은 물과 목적하는 임의 단백질 종류를 포함하는 수성 제형을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 47 kDa보다 큰 단백질을 포함하는 거대 단백질에 사용된다. 생체내 및 시험관내 목적에 사용되는 것들을 포함하는 항체 및 이의 단편(fragment)은 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 단백질의 또 다른 예이다.

추가로, 단백질 및 펩티드 제형의 제조에 요구되는 다단계 정제 및 농축 공정은 종종 조성물의 변화를 유도하여, 제형의 정확한 조성은 다양하게 달라질 수 있다. 연방 규칙은 약물 조성이 제조업자의 위치 또는 로트 번호와 무관하게 이들 제형에서 매우 일정한 것을 요구한다. 본 발명의 방법은 완충제 및 부형제가 정확한 양으로 다시 첨가되는 물에서 제형화된 단백질의 용액을 생성하는데 사용될 수 있으며, 이는 완충제 및/또는 부형제의 농도가 정확한 단백질 제형을 생성하게 한다.

한 가지 양태에서, 본 발명은 단백질과 물을 포함하는 수성 제형을 제공하며, 여기서 당해 제형은 특정한 특징, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아지니만, 낮은 전도도, 예를 들면, 약 2.5 mS/cm 미만의 전도도, 약 10 ㎍/mL 이상의 단백질 농도 및 약 30 mOsmol/kg 이하의 몰삼투농도를 갖고/갖거나 당해 단백질은 약 47 kDa 초과의 분자량(M_w)을 갖는다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 개선된 안정성, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 장기간 동안 액체 형태에서의 안정성(예를 들면, 약 3개월 이상 또는 약 12개월 이상) 또는 1회 이상의 냉동/해동 주기(또는 그 이상의 냉동/해동 주기)를 통한 안정성을 갖는다. 한 가지 양태에서, 제형은 냉동, 동결건조 또는 분무건조로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형태에서 약 3개월 이상 동안 안정하다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 제형에 포함되는 단백질은 최소 크기를 가질 수 있고, 예를 들면, 약 47 kDa 초과의 분자량(M_w), 약 57 kDa 초과의 분자량, 약 100 kDa 초과의 분자량, 약 150 kDa 초과의 분자량, 약 200 kDa 초과의 분자량 또는 약 250 kDa 초과의 분자량을 포함한다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 전도도가 낮고, 예를 들면, 약 2.5 mS/cm 미만의 전도도, 약 2 mS/cm 미만의 전도도, 약 1.5 mS/cm 미만의 전도도, 약 1 mS/cm 미만의 전도도 또는 0.5 mS/cm 미만의 전도도를 포함한다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 제형에 포함되는 단백질은 소정 농도를 갖고, 예를 들면, 약 1 mg/mL 이상의 농도, 약 10 mg/mL 이상의 농도, 약 50 mg/mL 이상의 농도, 약 100 mg/mL 이상의 농도, 약 150 mg/mL 이상의 농도, 약 200 mg/mL 이상의 농도 또는 약 200 mg/mL 초과의 농도를 포함한다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 몰삼투농도가 약 15 mOsmol/kg 이하이다.

한 가지 양태에서, 본 발명은 물과 소정 농도의 단백질을 포함하는 수성 제형을 제공하며, 여기서 단백질의 수력학적 직경(D_h)은 소정 농도에서 완충된 용액 중의 단백질의 D_h보다 약 50% 이상 작다. 한 가지 양태에서, 단백질의 D_h는 소정 농도에서 인산완충식염수(PBS) 중의 단백질의 D_h보다 약 50% 이상 작고; 단백질의 D_h는 소정 농도에서 PBS 중의 단백질의 D_h보다 약 60% 이상 작고; 단백질의 D_h는 소정 농도에서 PBS 중의 단백질의 D_h보다 약 70% 이상 작다.

한 가지 양태에서, 본 발명은 단백질, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 수성 제형을 제공하고, 여기서 단백질의 수력학적 직경(D_h)은 약 5 ㎛ 미만이다. 한 가지 양태에서, 단백질의 D_h는 약 3 ㎛ 미만이다.

임의의 단백질을 본 발명의 방법 및 조성물에 사용할 수 있다. 한 가지 양태에서, 제형은 치료학적 단백질을 포함한다. 한 가지 양태에서, 제형은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 포함될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 종류에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 카메라 항체, 사람 항체, 사람화 항체 및 도메인 항체(dAb)가 포함된다. 한 가지 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-TNFα, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 아달리무맙 또는 골리무맙, 또는 항-IL-12 항체, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, J695가 포함된다. 또한, 본 발명의 제형은 또한 단백질의 2개 이상의 상이한 유형, 예를 들면, 아달리무맙 및 J695를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 제형은 비이온성 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 비이온성 부형제의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 당 알콜 또는 폴리올(예: 만니톨 또는 소르비톨), 비이온성 계면활성제(예: 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60) 및/또는 당(예: 슈크로즈)이 포함된다. 본 발명의 제형에 추가로 포함될 수 있는 비이온성 부형제의 다른 비제한적 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 비(non)-트레할로즈, 라피노즈 및 말토즈가 포함된다.

한 가지 양태에서, 제형은 긴장성(tonicity) 개질제, 안정화제, 계면활성제, 항산화제, 냉동보호제, 벌크화제, 동결보호제, 염기성 성분 및 산성 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제를 포함하지 않는다.

본 발명의 제형은 시험관내 및 생체내 용도를 포함하는 임의 용도에 적합할 수 있다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 투여 방식을 통해 환자에게 투여하는 데 적합하며, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 피하, 정맥내, 흡입, 피내, 경피, 복강내 및 근육내 투여가 포함된다. 본 발명의 제형은 환자의 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에는 본 발명의 제형을 전달하는데 사용될 수 있는 장치가 포함된다. 이러한 장치의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 시린지, 펜, 임플란트, 무침 주입 장치, 흡입 장치 및 패치가 포함된다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 약제학적 제형이다.

본 발명은 또한, 제1 용액 중에 단백질을 제공하는 단계 및 정용여과 매질로서 물을 사용하여 물에 의한 5배 이상의 용적 교환이 달성될 때까지 상기 제1 용액을 정용여과함으로써 수성 제형을 제조하는 단계를 포함하는, 단백질과 물을 포함하는 수성 제형의 제조방법을 제공한다. 한 가지 양태에서, 수득한 제형 중의 단백질은 이의 생물학적 활성을 유지한다.

본 발명은 추가로, 제1 용액 중에 단백질을 제공하는 단계, 정용여과 매질로서 물을 사용하여 물에 의한 5배 이상의 용적 교환이 달성될 때까지 상기 제1 용액을 정용여과함으로써 정용여과된 단백질 용액을 제조하는 단계 및 상기 정용여과된 단백질 용액을 농축시켜 단백질의 수성 제형을 제조하는 단계를 포함하는, 단백질의 수성 제형의 제조방법을 제공한다. 한 가지 양태에서, 수득한 제형 중의 단백질은 이의 생물학적 활성을 유지한다.

한 가지 양태에서, 정용여과된 단백질 용액의 농축은 원심분리에 의해 달성된다.

한 가지 양태에서, 정용여과 매질은 물로 이루어진다.

한 가지 양태에서, 제1 용액은 약 5배 초과의 용적 교환이 달성될 때까지 물로 정용여과된다. 한 가지 양태에서, 제1 용액은 약 6배 이상의 용적 교환이 달성될 때까지 물로 정용여과된다. 한 가지 양태에서, 제1 용액은 약 7배 이상의 용적 교환이 달성될 때까지 물로 정용여과된다.

한 가지 양태에서, 수성 제형의 최종 부형제 농도는 제1 용액보다 약 95% 이상 낮다.

한 가지 양태에서, 수성 제형의 최종 부형제 농도는 제1 용액보다 약 99% 이상 낮다.

한 가지 양태에서, 제1 단백질 용액은 포유동물 세포 발현 시스템으로부터 수득되고 숙주 세포 단백질(HCP)을 제거하기 위해 정제된다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 방법은 부형제를 수성 제형에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.

도면의 간단한 설명

도 1은 아달리무맙 참조 기준(reference standard) AFP04C (하부 라인), 아달리무맙 DS (DF/UF 처리 전의 약물 물질(중간 라인) 및 DF/UF 처리 후의 약물 물질(상부 라인))의 SEC 크로마토그램을 나타낸다.

도 2는 DF/UF 처리된 아달리무맙 단량체에 부형제 화합물의 첨가에 따르는 아달리무맙 단량체의 수력학적 직경(D_h)에 미치는 소르비톨(비-이온화가능한 부형제) 및 NaCl(이온화가능한 부형제) 농도의 영향을 나타낸다.

도 3은 J695 참조 기준(하부 그래프) 및 pH가 pH 4.4로 조절된 J695 DS(상부 그래프)의 IEC 프로필을 나타낸다.

도 4는 밀리-Q(Milli-Q) 물을 사용한 DF/UF 후의 J695(pH 4.7(상부 그래프)) 및 pH가 pH 4.4로 조절된 DF/UF 전의 J695 DS(하부 곡선)의 IEC 프로필을 나타낸다.

도 5는 아달리무맙(WFI에 용해시킴)의 수력학적 직경(z-평균)과 농도의 상관관계를 도식적으로 나타낸다. X: 추정된 샘플 점도로서 1.1 mPas를 사용하여 SOP로 측정함. y: 추정된 샘플 점도로서 1.9 mPas를 사용하여 SOP로 측정함.

도 6은 아달리무맙(WFI에 용해시킴)의 수력학적 직경(피크 단량체)과 농도의 상관관계를 도식적으로 나타낸다. X: 추정된 샘플 점도로서 1.1 mPas를 사용하여 SOP로 측정함. y: 추정된 샘플 점도로서 1.9 mPas를 사용하여 SOP로 측정함.

도 7은 J695(WFI에 용해시킴)의 수력학적 직경(z-평균)과 농도의 상관관계를 도식적으로 나타낸다. X: 추정된 샘플 점도로서 1.1 mPas를 사용하여 SOP로 측정함. y: 추정된 샘플 점도로서 1.9 mPas를 사용하여 SOP로 측정함.

도 8은 J695(WFI에 용해시킴)의 수력학적 직경(피크 단량체)과 농도의 상관관계를 도식적으로 나타낸다. X: 추정된 샘플 점도로서 1.1 mPas를 사용하여 SOP로 측정함. y: 추정된 샘플 점도로서 1.9 mPas를 사용하여 SOP로 측정함.

도 9는 주입용수에서 아달리무맙 농도에 따르는 아달리무맙의 리신 0, 1 및 2의 합(%)을 나타낸다.

도 10은 주입용수에서 J695 농도에 따르는 J695의 피크 1 내지 7의 합(%)을 나타낸다.

도 11은 주입용수에서 J695 농도에 따르는 J695의 산성 피크의 합(%)을 나타낸다.

도 12는 주입용수(WFI)에서 J695 농도에 따르는 J695의 염기성 피크의 합(%)을 나타낸다.

도 13a 및 13b는 제형의 몰삼투농도 및 전도도에 관여하는 성분의 감소와 관련하여 실시예 12에서 실시한 투석의 효율을 나타낸다(BDS, 74 mg/ml, 10 ml 샘플 용적, SpectraPor7 MWCO10k).

도 14는 투석된 아달리무맙 벌크 용액에서 pH 수준의 안정성을 나타낸다. 탈이온수(1:1,000,000)에 대한 투석 전후의 pH 수준이 도시되어 있다. (BDS, 74 mg/ml, 10 ml 샘플 용적, SpectraPor7 MWCO10k)

도 15는 냉동 해동후 250 mg/ml 및 200 mg/ml 저이온성 아달리무맙 용액에 대한 병 매핑(bottle mapping) 밀도 데이타를 나타낸다.

도 16은 냉동 해동후 250 mg/ml 및 200 mg/ml 저이온성 아달리무맙 용액에 대한 병 매핑 pH 데이타를 나타낸다.

도 17은 냉동 해동후 250 mg/ml 및 200 mg/ml 저이온성 아달리무맙 용액에 대한 병 매핑 농도 데이타를 나타낸다.

도 18은 냉동 해동후 250 mg/ml 및 200 mg/ml 저이온성 아달리무맙 용액에 대한 병 매핑 몰삼투농도 데이타를 나타낸다.

도 19는 냉동 해동후 250 mg/ml 및 200 mg/ml 저이온성 아달리무맙 용액에 대한 병 매핑 전도도 데이타를 나타낸다.

도 20은 DF/UF 후 2 내지 8℃에서 8.5개월 동안 저장(하부 곡선)하거나 DF/UF 후 -80℃에서 4.5개월 동안 저장(상부 곡선)한 저이온성 아달리무맙(도 20에서 D2E7로서 표시됨) 용액의 SEC 분석을 나타낸다.

도 21은 냉동-해동 공정 전(T0) 및 각각 4회의 냉동-해동 후(T1, T2, T3 및 T4)에 다양한 용액 및 물에서 제형화된 모노클로날 항체 1D4.7의 안정성을 나타낸다.

도 22는 냉동-해동 공정 전(T0) 및 각각 4회의 냉동-해동 후(T1, T2, T3 및 T4)에 물에서 제형화되고 다양한 완충제로 제형화된 모노클로날 항체 13C5.5의 안정성을 나타낸다. 블랭크 = WFI 대조군 샘플.

도 23은 냉동-해동 공정 전(T0) 및 각각 4회의 냉동-해동 후(T1, T2, T3 및 T4)에 물에서 제형화되고 첨가된 다양한 부형제와 함께 제형화된 모노클로날 항체 13C5.5의 안정성을 나타낸다. 블랭크 = WFI 대조군 샘플.

도 24는 용액 점도에 미치는 아달리무맙(WFI 제형)의 농도 및 용액 pH의 영향을 나타낸다.

도 25는 다양한 농도 및 pH 값의 아달리무맙 용액(WFI 제형)에 대한 혼탁도 데이타를 나타낸다.

도 26은 다양한 pH 값 및 농도에서 아달리무맙 용액(WFI 제형)에 대한 수력학적 직경(D_h) 데이타를 나타낸다.

도 27은 다양한 농도에서 수용액(pH 5) 중의 아달리무맙에 대한 강도(intensity) 그래프(D_h 측정)에 의한 크기 분포를 나타낸다.

도 28은 다양한 pH 값에서 물 중 100 mg/mL 아달리무맙에 대한 강도에 의한 크기 분포를 나타낸다.

도 29는 또한 다양한 pH 수준에서 물 중 100 mg/mL 아달리무맙에 대한 강도에 의한 크기 분포를 나타낸다.

도 30은 물 중의 아달리무맙에 대한 단량체 함량(SEC)를 나타낸다.

도 31은 물 중의 아달리무맙에 대한 응집물 함량(SEC)을 나타낸다.

도 32는 용액 온도의 함수로서 2개 J695 용액(WFI 제형)의 점도를 나타낸다.

도 33은 다수의 상이한 제형에 대한 반복된 냉동/해동(f/t) 주기 동안 육안으로 보이지 않는 입자(> 1㎛)로 측정한 1D4.7 항체 안정성을 그래프로 나타낸다.

도 34는 다수의 상이한 제형에 대한 반복된 냉동/해동(f/t) 주기 동안 육안으로 보이지 않는 입자(> 10㎛)로 측정한 13C5.5 항체 안정성을 그래프로 나타낸다.

도 35는 다수의 상이한 제형에 대한 반복된 냉동/해동(f/t) 주기 동안 육안으로 보이지 않는 입자(> 1㎛)로 측정한 13C5.5 항체 안정성을 그래프로 나타낸다.

도 36은 다수의 상이한 제형에 대한 반복된 냉동/해동(f/t) 주기 동안 육안으로 보이지 않는 입자(> 1㎛)로 측정한 7C6 항체 안정성을 그래프로 나타낸다.

발명의 상세한 설명

I. 정의

본원 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정한 용어가 먼저 정의된다.

본원에 사용된 용어 "산성 성분"은 산성 pH, 즉 pH 7.0 미만의 제제(용액 포함)를 의미한다. 산성 성분의 예에는 인산, 염산, 아세트산, 시트르산, 옥살산, 석신산, 타르타르산, 락트산, 말산, 글리콜산 및 푸마르산이 포함된다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 수성 제형은 산성 성분을 포함하지 않는다.

본원에 사용된 용어 "항산화제"는 산화를 억제함으로써 산화 공정에 의한 제제의 열화를 방지하기 위해 사용되는 제제를 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 화합물에는, 비제한적으로 예를 들면, 아세톤, 중황산나트륨, 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 시트르산, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 하이드로포스포러스산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 메티오닌, 나트륨 아스코르베이트, 나트륨 시트레이트, 황화나트륨, 아황산나트륨, 중아황산나트륨, 나트륨 포름알데히드 설폭실레이트, 티오글리콜산, 나트륨 메타비설파이트, EDTA (에데테이트), 펜테테이트 및 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 기타 화합물이 포함된다.

용어 "수성 제형"은 용매가 물인 용액을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "염기성 성분"은 알칼리성, 즉 pH 7.0 초과의 제제를 의미한다. 염기성 성분의 예에는 수산화칼륨 (KOH) 및 수산화나트륨 (NaOH)이 포함된다.

본원에 사용된 용어 "벌크화제"는 벌크를 재구성 고체에 부가하고/하거나 제조 동안 당해 제형의 특성 제어를 보조하기 위해 사용되는 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 화합물에는, 비제한적으로 예를 들면, 덱스트란, 트레할로즈, 슈크로즈, 폴리비닐피롤리돈, 락토즈, 이노시톨, 소르비톨, 디메틸설폭사이드, 글리세롤, 알부민, 칼슘 락토비오네이트 및 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 기타 화합물이 포함된다.

본원에 사용된 용어 "전도도"는 수용액이 2개 전극 사이에서 전류를 전도하는 능력을 의미한다. 일반적으로, 전기 전도도 및 비(specific)-전도도는 전류를 전도하는 물질 능력의 척도이다. 용액에서, 전류는 이온 수송에 의해 흐른다. 따라서, 수용액 중에 존재하는 이온의 양이 증가함에 따라, 용액은 보다 높은 전도도를 가질 것이다. 전도도의 측정 단위는 mmhos (mS/cm)이고, 예를 들면, 오리온 리써치 인코포레이티드 (Orion Research, Inc.)(Beverly, MA)에서 판매하는 전도도 측정기를 사용하여 측정할 수 있다. 용액의 전도도는 내부의 이온 농도를 변화시킴으로써 변경할 수 있다. 예를 들면, 용액 중의 이온성 부형제의 농도를 변경하여 목적하는 전도도를 달성할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "냉동보호제"는 일반적으로 냉동 유도된 변형력(stress)으로부터 단백질에 안정성을 제공하는 제제를 포함한다. 냉동보호제의 예에는 폴리올, 예를 들면, 만니톨이 포함되고, 다당류, 예를 들면, 슈크로즈가 포함되며, 또한 계면활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트, 폴록사머 또는 폴리에틸렌 글리콜 등이 포함된다. 냉동보호제는 또한 제형의 긴장성에 관여한다.

본원에 사용된 용어 "한외여과(ultrafiltration)" 또는 "UF"는 용매 또는 소형 용질 분자를 통과시키면서 거대분자를 유지시키는 반투과성 막으로 용액 또는 현탁액을 처리하는 임의의 기술을 의미한다. 한외여과는 용액 또는 현탁액에서 거대분자의 농도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 한외여과는 물 중의 단백질의 농도를 증가시키기 위해 사용된다.

본원에 사용된 용어 "정용여과(diafiltration)" 또는 "DF"는, 가용성 투과물(permeate) 성분을 감소시키기 위해 잔류물(retentate)을 용매로 희석하여 재여과하는 특화된 여과 부류를 의미하기 위해 사용된다. 정용여과는, 예를 들면, 단백질을 포함하는 보유된 성분의 농도 증가를 유도하거나 유도하지 않을 수 있다. 예를 들면, 연속 정용여과에서, 용매는 여액의 생성 속도와 동일한 속도로 잔류물에 연속적으로 첨가된다. 이 경우, 잔류물 용적 및 보유된 성분의 농도는 공정 동안 변화되지 않는다. 한편, 불연속 또는 순차 희석 정용여과에서, 한외여과 단계는 잔류물 측에 용매의 첨가를 수반하고; 잔류물에 첨가된 용매의 용적이 생성된 여액의 용적 이상인 경우, 보유된 성분은 높은 농도를 가질 것이다. 정용여과는 pH, 이온 강도, 염 조성, 완충제 조성, 또는 거대분자의 용액 또는 현탁액의 기타 특성을 변경하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "정용여과/한외여과" 또는 "DF/UF"는 한외여과 및/또는 정용여과를 순차적 또는 동시에 달성하는 임의의 방법, 기술 또는 기술의 조합을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "정용여과 단계"는 정용여과 공정 동안 전체 용적 교환을 의미한다.

용어 "부형제"는, 목적하는 농도(consistency)를 제공하고(예: 벌크 특성의 변경) 안정성을 개선시키며/시키거나 몰삼투농도를 조절하기 위해 제형에 첨가될 수 있는 제제를 의미한다. 통상 사용되는 부형제의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 당, 폴리올, 아미노산, 계면활성제 및 중합체가 포함된다. 본원에서 상호 교대로 사용되는 용어 "이온성 부형제" 또는 "이온화가능한 부형제"는 순 전하를 갖는 제제를 의미한다. 한 가지 양태에서, 이온성 부형제는 pH 등의 특정한 제형 조건하에 순 전하를 갖는다. 이온성 부형제의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 히스티딘, 아르기닌 및 염화나트륨이 포함된다. 본원에서 상호 교대로 사용되는 용어 "비이온성 부형제" 또는 "비이온화가능한 부형제"는 순 전하를 갖지 않는 제제를 의미한다. 한 가지 양태에서, 비이온성 부형제는 pH 등의 특정한 제형 조건하에 순 전하를 갖지 않는다. 비이온성 부형제의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 당 (예: 슈크로즈), 당 알콜 (예: 만니톨) 및 비이온성 계면활성제 (예: 폴리소르베이트 80)이 포함된다.

본원에 사용된 용어 "제1 단백질 용액" 또는 "제1 용액"은 본 발명의 방법에 사용되는 초기 단백질 용액 또는 출발 물질, 즉 물로 정용여과되는 초기 단백질 용액을 의미한다. 한 가지 양태에서, 제1 단백질 용액은 이온성 부형제, 비이온성 부형제 및/또는 완충 시스템을 포함한다.

용어 입자의 "수력학적 직경(hydrodynamic diameter)" 또는 "D_h"는 물의 밀도 및 입자와 동일한 속도를 갖는 구형 직경을 의미한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "단백질의 수력학적 직경"은 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 용액 중의 단백질에 대해 측정한 크기를 의미한다. DLS 측정 장치는 고정된 산란 각도에서 용액 중의 단백질로부터 산란하는 광의 강도에서 시간 의존적 변동을 측정한다. 단백질 D_h는 강도에 있어서 시간 의존적 변동의 강도 자가상관관계(autocorrelation) 함수로부터 결정된다. 산란 강도 데이타는 산란 분자, 즉 단백질 시료의 수력학적 크기 및 크기 분포에 대한 값을 측정하기 위해 DLS 장치 소프트웨어를 사용하여 처리된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "동결보호제"는 건조 또는 동결건조 공정의 물 제거 동안, 예를 들면, 단백질의 적절한 형상을 유지함으로써 단백질에 안정성을 제공하는 제제를 포함한다. 동결보호제의 예에는 다당류, 특히 이당류 또는 삼당류가 포함된다. 냉동보호제가 또한 동결보호 효과를 제공할 수 있다.

용어 "약제"는 질환 또는 장애의 치료에 유용한 조성물, 예를 들면, 수성 제형과 관련하여 본원에서 사용된다.

용어 "단백질"은 쇄 길이가 2차 및/또는 3차 및/또는 4차 구조의 보다 높은 수준을 생성하기에 충분한 아미노산 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 이는 이러한 구조를 갖지 않는 "펩티드" 또는 기타 소분자량 약물과 구별된다. 한 가지 양태에서, 본원에 사용된 단백질은 분자량이 약 47 kD 이상이다. 본원에 사용된 정의내에 포함되는 단백질의 예에는 치료학적 단백질이 포함된다. "치료학적 활성 단백질" 또는 "치료학적 단백질"은 치료학적 목적, 즉 환자의 장애의 치료에 사용될 수 있는 단백질을 의미한다. 치료학적 단백질은 치료 목적에 사용될 수 있지만, 상기 단백질은 또한 시험관내 연구에 사용될 수 있기 때문에, 본원 발명은 이러한 용도로 한정되지 않음에 주목해야 한다. 바람직한 양태에서, 치료학적 단백질은 융합 단백질 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 2개 이상의 상이한 단백질을 포함하며, 이는 상이한 아미노산 서열을 갖는 2개의 단백질로서 정의된다. 추가의 상이한 단백질은 단백질의 분해 생성물을 포함하지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 문구 "단백질을 물에 용해시킨다"는 소분자(예: 완충제, 부형제, 염, 계면활성제)의 양이 DF/UF 처리에 의해 감소되는 수용액 속에 단백질이 용해되어 있는 단백질 제형을 의미한다. 소분자의 완전한 제거는 DF/UF 처리에 의해 절대적 측면에서 달성될 수는 없지만, DF/UF를 적용하여 달성가능한 부형제의 이론상 감소는 배타적으로 물 중의 단백질의 제형을 생성하기에 충분히 크다. 예를 들면, 연속 방식 DF/UF 프로토콜에서 6용적 교환의 경우, 부형제의 이론상 감소는 약 99.8%이다(ci=e^-x, 여기서 ci는 초기 부형제 농도이고, x는 용적 교환 수이다).

용어 "약제학적 제형"은, 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하게 하는 형태로 존재하고, 따라서 치료 용도를 위해 환자에게 투여될 수 있는 제제를 의미한다.

"안정한" 제형은 저장시 단백질이 이의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 안정성을 실질적으로 보유하는 제형이다. 단백질 안정성을 측정하는 다양한 분석학적 기술은 당해 기술분야에서 이용가능하고, 예를 들면, 문헌[참조: Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에 검토되어 있다. 한 가지 양태에서, 단백질의 안정성은 분해된(예: 단편화된) 및/또는 응집된 단백질의 낮은 비율을 갖는 용액 중의 단량체 단백질의 비율에 따라 결정된다. 예를 들면, 안정한 단백질을 포함하는 수성 제형은 95% 이상의 단량체 단백질을 포함할 수 있다. 또는, 본 발명의 수성 제형은 5% 이하의 응집물 및/또는 분해 단백질을 포함할 수 있다.

용어 "안정화제"는 안정성을 개선시키거나 달리는 향상시키는 부형제를 의미한다. 안정화제에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, α-리포산, α-토코페롤, 아스코르빌 팔미테이트, 벤질 알콜, 비오틴, 비설파이트, 보론, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 아스코르브산 및 이의 에스테르, 카로테노이드, 칼슘 시트레이트, 아세틸-L-카미틴, 킬레이트화제, 콘드로이틴, 크로뮴, 시트르산, 조효소 Q-10, 시스테인, 시스테인 하이드로클로라이드, 3-데하이드로쉬키믹산(DHS), EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산; 에데테이트 이나트륨), 황산제1철, 엽산, 푸마르산, 알킬 갈레이트, 마늘, 글루코사민, 포도씨 추출물, 구굴, 마그네슘, 말산, 메타비설파이트, N-아세틸 시스테인, 니아신, 니코티노미드, 쐐기풀 뿌리, 오르니틴, 프로필 갈레이트, 피크노게놀, 톱 팔메, 셀레늄, 나트륨 비설파이트, 나트륨 메타비설파이트, 나트륨 설파이트, 칼륨 설파이트, 타르타르산, 티오설페이트, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 토코페롤 및 이들의 에스테르, 예를 들면, 토코페랄 아세테이트, 토코페롤 석시네이트, 토코트리에날, d-α-토코페롤 아세테이트, 비타민 A 및 이의 에스테르, 비타민 B 및 이의 에스테르, 비타민 C 및 이의 에스테르, 비타민 D 및 이의 에스테르, 비타민 E 및 이의 에스테르, 예를 들면, 비타민 E 아세테이트, 아연 및 이들의 배합물이 포함된다.

용어 "계면활성제"는 일반적으로 공기/용액 계면 유도된 변형력 및 용액/표면 유도된 변형력으로부터 단백질을 보호하는 제제를 포함한다. 예를 들면, 계면활성제는 단백질을 응집으로부터 보호할 수 있다. 적합한 계면활성제에는, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 예를 들면, Brij 35. RTM., 또는 폴록사머, 예를 들면, 트윈 20, 트윈 80 또는 폴록사머 188이 포함할 수 있다. 바람직한 세정제는 폴록사머, 예를 들면, 폴록사머 188, 폴록사머 407; 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 예를 들면, Brij 35. RTM., 크레모포르 A25, 심파텐(Sympatens) ALM/230; 및 폴리소르베이트/트윈, 예를 들면, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머, 예를 들면, 폴록사머 188, 및 트윈, 예를 들면, 트윈 20 및 트윈 80이다.

본원에 사용된 용어 "긴장성(tonicity) 개질제"는 액체 제형의 긴장성을 조정하기 위해 사용될 수 있는 화합물 또는 화합물들을 의미하는 것으로 이해된다. 적합한 긴장성 개질제에는 글리세린, 락토즈, 만니톨, 덱스트로즈, 염화나트륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 황산나트륨, 소르비톨, 트레할로즈, 슈크로즈, 라피노즈, 말토즈 및 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 기타 화합물이 포함된다. 한 가지 양태에서, 액체 제형의 긴장성은 혈액 또는 혈장의 긴장성에 근접한다.

용어 "물"은, 통상적으로 증류 또는 역삼투에 의해 오염물을 제거히기 위해 정제되는 물(또한 본원에서 "순수한 물"이라 칭명됨)을 의미하는 것으로 이해된다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 사용된 물은 부형제 비함유이다. 한 가지 양태에서, 물은 환자에의 투여에 적합한 멸균수를 포함한다. 또 다른 양태에서, 물은 주입용수(WFI)를 포함하는 것으로 이해된다. 한 가지 양태에서, 물은 시험관내 분석에 사용하기에 적합한 증류수 또는 물을 의미한다. 바람직한 양태에서, 정용여과는 정용여과 매질로서 물을 단독으로 사용하여 본 발명의 방법에 따라 실시된다.

본원에 언급되는 용어 "항체"는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부분") 또는 이들의 단쇄를 포함한다. "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호 결합된 2개 이상의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 글리코단백질 또는 이의 항원 결합 부분을 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(V_H로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어져 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(V_L로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도에민, CL로 이루어져 있다. V_H 및 V_L 영역은, 추가로 보다 보존된 영역(골격 영역(FR)으로서 칭명됨)과 함께 배치된 과가변능 영역(상보성 결정 영역(CDR))으로 세분될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 다음과 같은 순서로 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어져 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있으며, 이러한 숙주 조직 또는 인자에는 면역계의 다양한 세포(예: 효능기 세포) 및 고전적 상보성 시스템의 제1 성분(Clq)이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 항체의 "항원 결합 부분"(또는 간단히 "항체 부분")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편(예: TNFα, IL-12)을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전체 길이의 항체의 단편에 의해 실시될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포함된 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, 즉 V_L, V_H, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편, 즉 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) V_H 및 C_H1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) V_H 또는 V_L 도메인으로 이루어진 dAb 단편[참조: Ward et al., (1989) Nature 341:544-546] 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 더욱이, Fv 단편, 즉 V_L 및 V_H의 2개 도메인이 개별 유전자에 의해 코딩되는 경우에도, 이들은, 재조합 방법을 사용하여, V_L 및 V_H 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단쇄 Fv (scFv)로서 공지됨)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다[참조: Bird et al., (1988) Science 242:423-426; and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]. 이러한 단쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득되고, 단편들은 순수한 항체와 동일한 방식의 유용성을 위해 스크리닝된다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 항체 단편은 Fab, Fd, Fd', 단쇄 Fv (scFv), scFv_a 및 도메인 항체(dAb)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

또한, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 또는 항체 부분을 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와 공유 또는 비공유 결합시켜 형성한 보다 큰 면역부착 분자일 수 있다. 이들 다른 단백질 또는 펩티드는 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 정제를 가능하게 하거나 이들 서로간 또는 이들과 기타 분자와의 결합을 가능하게 하는 기능을 가질 수 있다. 따라서, 이러한 면역부착 분자의 예는 사량체성 단쇄 가변 단편(scFv) 분자를 제조하기 위한 스트렙트아비딘 코어 영역의 사용[참조: Kipriyanov et al., (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101] 및 2가 및 비오티닐화 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용[참조: Kipriyanov et al., (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058]을 포함한다. Fab 및 F(ab')₂ 단편 등의 항체 부분은 각각 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해 등의 통상의 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조할 수 있다. 더욱이, 항체, 항체 부분 및 면역부착 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득할 수 있다.

동종 쌍 또는 그룹을 형성하는 구조 패밀리에 속하거나 이러한 패밀리로부터 형성되어 이들 특성을 보유하는 2개의 항체 도메인은 "상보성"이다. 예를 들면, 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인은 상보성이고, 2개의 VH 도메인은 비상보성이며, 2개의 VL 도메인은 비상보성이다. 상보성 도메인은 면역글로불린 수퍼패밀리의 다른 구성원, 예를 들면, T-세포 수용체의 Vα 및 Vβ (또는 감마 및 델타) 도메인에서 발견될 수 있다.

용어 "도메인"은 나머지 단백질과 독립적으로 이의 3차 구조를 보유하는 중첩된 단백질 구조를 의미한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 분리된 작용성 폴리펩티드에 관여할 수 있고, 다수의 경우에는 나머지 단백질 및/또는 도메인의 기능 손실 없이 다른 단백질에 부가, 제거 또는 전달될 수 있다. 단일 항체 가변 도메인이란 항체 가변 도메인의 서열 특징을 포함하는 중첩된 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 따라서, 이는, 예를 들면, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인 또는 절단된 항체 가변 도메인의 특징이 아니거나, 또는 전체 길이 도메인의 결합 활성 및 특이성을 적어도 부분적으로 보유하는 가변 도메인의 중첩 단편 뿐만 아니라 N- 또는 C-말단 연장부를 포함하는 서열에 의해 치환된 완전 항체 가변 도메인 및 변형된 가변 도메인을 포함한다.

본 발명의 가변 도메인은 조합되어 도메인 그룹을 형성할 수 있고; 예를 들면, 상보성 도메인은 조합될 수 있으며, 예를 들면, VL 도메인은 VH 도메인과 조합될 수 있다. 또한, 비상보성 도메인이 조합될 수 있다. 도메인은 공유결합 또는 비공유결합 수단에 의한 도메인의 연결을 수반하는 다수의 방식으로 조합될 수 있다.

"dAb" 또는 "도메인 항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 단일 항체 가변 도메인(V_H 또는 V_L) 폴리펩티드를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "항원 결합 영역" 또는 "항원 결합 부위"는,항원과 상호작용하는 아미노산 잔기를 함유하고, 항원에 대한 이의 특이성 및 친화성을 항체에 제공하는 항체 분자의 부분(들) 또는 이의 항원 결합 부분을 의미한다.

용어 "에피토프"는 하나 이상의 항체의 항원 결합 영역에서 항체에 의해 인식되고 이에 결합될 수 있는 모든 분자의 부분을 의미한다. 본 발명과 관련하여, 제1 및 제2 "에피토프"는 동일하지 않고 단일 모노특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 의해 결합되지 않은 에피토프인 것으로 이해된다.

문구 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 작제 또는 분리된 항체, 예를 들면, 숙주 세포내로 형질감염된 재조합체 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합체의 조합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 사람 면역글로불린 유전자의 유전자 이식된 동물(예: 마우스)로부터 분리된 항체[참조: Taylor et al., (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295], 또는 다른 DNA 서열에 대한 특정한 면역글로불린 유전자 서열(예: 사람 면역글로불린 유전자 서열)의 스플라이싱을 수반하는 기타 임의 수단에 의해 제조, 발현, 작제 또는 분리된 항체를 포함한다. 재조합 항체의 예는 키메라, CDR-그래프트 및 사람화 항체를 포함한다.

용어 "사람 항체"는, 예를 들면, 문헌[참조: Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]에 기재된 바와 같이 사람 생식세포 면역글로불린 서열에 상응하거나 이로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 그러나, 본 발명의 사람 항체는, 예를 들면, CDR에서 및 특히 CDR3에서 사람 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내에서 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 사람 항체는 가변 영역을 갖고, 또한 사람 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도된 불변 영역을 포함할 수 있다[참조: Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]. 그러나, 특정한 양태에서, 이러한 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이 유발(또는, 사람 Ig 서열에 대해 동물 이식유전자가 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)로 처리되고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 사람 생식세포 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 이와 관련되는 경우, 생체내에서 사람 항체 생식세포 레파토리에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 그러나, 특정한 양태에서, 이러한 재조합 항체는 선택 돌연변이유발 또는 역돌연변이 또는 이들 둘 다의 결과이다.

용어 "역돌연변이"는 사람 항체의 체세포 돌연변이된 아미노산의 일부 또는 전부가 상동성 생식세포 항체 서열로부터의 상응하는 생식세포 잔기로 치환되는 과정을 의미한다. 본 발명의 사람 항체의 중쇄 및 경쇄 서열은 최고 상동성을 갖는 서열을 확인하기 위해 VBASE 데이타베이스에서 생식세포 서열과 별도로 정렬된다. 본 발명의 사람 항체의 차이는 이러한 상이한 아미노산을 인코딩하는 규정된 뉴클레오티드 위치를 돌연변이시킴으로써 생식세포 서열로 반송된다. 역돌연변이의 후보자로서 이렇게 동정된 각 아미노산의 역할은 항원 결합에서 직접 또는 간접 역할에 대해 조사되어야 하고, 사람 항체의 바람직한 특징에 영향을 미치기 위해 돌연변이 후에 발견된 임의의 아미노산은 최종 사람 항체에 포함되지 않아야 한다. 아미노산 개체의 수를 최소화하기 위해, 가장 근접한 생식세포 서열과 상이하지만 제2 생식세포 서열 중의 상응하는 아미노산과 동일한 것으로 발견된 이들 아미노산 위치는 잔류할 수 있으며, 단 제2 생식세포 서열은 당해 아미노산의 양 측면에서 적어도 10개, 바람직하게는 12개 아미노산 서열에 대해 본 발명의 사람 항체의 서열과 동일하고 동일선상에 존재한다. 역돌연변이는 항체 최적화의 임의의 단계에서 발생할 수 있다.

용어 "키메라 항체"는 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 및 또 다른 종으로부터의 불변 영역 서열을 포함하는 항체를 의미하며, 예를 들면, 항체는 사람 불변 영역에 연결된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는다.

용어 "CDR-그래프트 항체"는 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL의 하나 이상의 CDR 영역의 서열이 또 다른 종의 CDR 서열로 치환되는 항체를 의미하며, 예를 들면, 항체는 하나 이상의 뮤린 CDR(예: CDR3)이 사람 CDR 서열로 치환된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는다.

용어 "사람화 항체"는 비사람 종(예: 마우스)으로부터의 중쇄 및 경쇄 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부분이 보다 "사람 유사", 즉 사람 생식세포 가변 서열에 보다 유사해지도록 변경된 항체를 의미한다. 사람화 항체의 한가지 유형은 사람 CDR 서열이 비사람 VH 및 VL 서열 내로 도입되어 상응하는 비사람 CDR 서열을 치환하는 CDR 그래프트 항체이다.

본 발명의 다양한 양태는 다음 섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.

II. 본 발명의 방법

일반적으로, 정용여과는 단백질, 펩티드, 핵산 및 기타 생물분자를 함유하는 용액으로부터 염 또는 용매를 제거, 치환 또는 이의 농도를 저하시키기 위해 막을 사용하는 기술이다. 단백질 생산 작업은 종종 이의 발현을 일으키는 불순물(예: 숙주 세포 단백질)로부터 정제되는 경우에 제형 완충제로 단백질 용액의 최종 정용여과를 수반한다. 본원에 기재된 발명은 정용여과 용액으로서 물을 단독으로 사용하여 단백질 용액을 정용여과함으로써 수성 제형을 수득하는 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명의 제형은 정용여과 공정 동안 제형 매질로서 물을 사용하는 것에 기초하며, 최종 제형 중의 단백질을 용해시키고/시키거나 안정화시키기 위해 사용된 계면활성제 등의 부형제를 포함하는 종래의 제형 매질에 의존하지 않는다. 본 발명은 안정한 제형에 사용하기 위해 단백질을 순수한 물로 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 단백질은 이의 안정성을 유지하기 위해 다른 제제를 사용하지 않고서 용액 상태로 유지되고 고도로 농축시킬 수 있다.

본원의 교시에 따르는 정용여과 또는 DF/UF 전에, 본 발명의 방법은 먼저 단백질을 제1 용액에 제공하는 단계를 포함한다. 단백질은 당해 기술분야에 잘 확립된 기술, 예를 들면, 합성 기술(예: 재조합 기술, 펩티드 합성 또는 이의 조합)을 사용하여 제형을 포함하는 제1 용액 속에서 제형화시킬 수 있다. 또는, 본 발명의 방법 및 조성물에 사용된 단백질은 단백질의 내인성 공급원으로부터 분리된다. 초기 단백질 용액은 단백질을 단백질의 이종 혼합물로부터 정제함으로써 정제 공정을 사용하여 수득할 수 있다. 한 가지 양태에서, 본 발명에 사용된 초기 단백질 용액은, 포유동물 발현 시스템에서 발현된 단백질(항체 포함)을, 단백질 용액으로부터 숙주 세포 단백질(HCP)를 제거하는 다수의 크로마토그래피 단계로 처리함으로써 정제 방법으로 수득한다. 한 가지 양태에서, 제1 단백질 용액은 포유동물 세포 발현 시스템으로부터 수득되며, 정제되어 숙주 세포 단백질(HCP)를 제거한다. 정제 방법의 예는 본원에서 참조로서 인용되는 미국 특허원 제11/732,918호 (US 20070292442)에 기재되어 있다. 본 발명의 방법에 따르는 제1 단백질 용액은 특별한 제조방법이 요구되지 않음에 주목해야 한다.

본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 단백질은 임의의 크기, 즉 분자량(M_w)을 가질 수 있다. 예를 들면, 단백질은 약 1 kDa 이상의 M_w, 약 10 kDa 이상의 M_w, 약 47 kDa 이상의 M_w, 약 57 kDa 이상의 M_w, 약 100 kDa 이상의 M_w, 약 150 kDa 이상의 M_w, 약 200 kDa 이상의 M_w, 약 250 kDa 이상의 M_w를 가질 수 있다. 상기 인용된 M_w의 중간 수치, 예를 들면, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 153, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170 등 뿐만 아니라 본원에 인용된 기타 모든 수치는 또한 본원의 일부인 것으로 의도된다. 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 수치의 임의의 조합을 사용하는 수치 범위는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 의도된다. 예를 들면, 본 발명에 사용된 단백질은 57 kDa 내지 250 kDa, 56 kDa 내지 242 kDa, 60 kDa 내지 270 kDa 등의 크기 범위를 가질 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 2개 이상의 상이한 단백질을 포함하는 제1 단백질 용액의 정용여과를 포함한다. 예를 들면, 단백질 용액은 상이한 분자, 또는 동일한 분자의 상이한 에피토프와 관련된 2개 이상의 항체 종류를 함유할 수 있다.

한 가지 양태에서, 용액에 존재하는 단백질은 융합 단백질 및 효소를 포함하는 치료학적 단백질이며, 이로써 한정되는 것은 아니다. 치료학적 단백질의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 풀모자임(Pulmozyme) (Dornase alfa), 레그라넥스(Regranex) (Becaplermin), 악티바세(Activase) (Alteplase), 알두라자임(Aldurazyme) (Laronidase), 아메비브(Amevive) (Alefacept), 아라네스프(Aranesp) (Darbepoetin alfa), 베카플레르민(Becaplermin) 농축물, 베타세론(Betaseron) (Interferon beta-1b), 보톡스(BOTOX) (Botulinum Toxin Type A), 엘리텍(Elitek) (Rasburicase), 엘스파르(Elspar) (Asparaginase), 에포겐(Epogen) (Epoetin alfa), 엔브렐(Enbrel) (Etanercept), 파브라자임(Fabrazyme) (Agalsidase beta), 인페르겐(Infergen) (Interferon alfacon-1), 인트론(Intron) A (Interferon alfa-2a), 키네레트(Kineret) (Anakinra), 미오블록(MYOBLOC) (Botulinum Toxin Type B), 뉼라스타(Neulasta) (Pegfilgrastim), 뉴메가(Neumega) (Oprelvekin), 뉴포겐(Neupogen) (Filgrastim), 온탁(Ontak) (Denileukin diftitox), 페가시스(PEGASYS) (Peginterferon alfa-2a), 프로류킨(Proleukin) (Aldesleukin), 풀모자임(Pulmozyme) (Dornase alfa), 레비프(Rebif) (Interferon beta-1a), 레그라넥스(Regranex) (Becaplermin), 레타바스(Retavase) (Reteplase), 로페론(Roferon)-A (Interferon alfa-2), TNKase (Tenecteplase), 지그리스(Xigris) (Drotrecogin alfa), 아르칼리스트(Arcalyst) (Rilonacept), N플레이트(NPlate) (Romiplostim), 미르세라(Mircera) (methoxypolyethylene glycol-epoetin beta), 신리제(Cinryze) (C1 esterase inhibitor), 엘라프라세(Elaprase) (idursulfase), 미오자임(Myozyme) (alglucosidase alfa), 오렌시아(Orencia) (abatacept), 나글라자임(Naglazyme) (galsulfase), 케피반스(Kepivance) (palifermin) 및 악티뮨(Actimmune) (interferon gamma-1b)이 포함된다.

본 발명에 사용된 단백질은 또한 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 항체의 예에는 키메라 항체, 비사람 항체, 사람 항체, 사람화 항체 및 도메인 항체(dAb)가 포함된다. 한 가지 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-TNFα 및/또는 항-IL-12 항체 (예를 들면, 이는 이중 가변 도메인(DVD) 항체일 수 있다)이다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 다른 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 1D4.7 (항-IL-12/IL-23 항체; Abbott Laboratories), 2.5(E)mg1 (항-IL-18; Abbott Laboratories), 13C5.5 (항-IL-13 항체; Abbott Laboratories), J695 (항-IL-12; Abbott Laboratories), 아펠리모맙(Afelimomab) (Fab 2 항-TNF; Abbott Laboratories), 후미라(Humira) ((adalimumab) Abbott Laboratories), 캠파트(Campath) (Alemtuzumab), CEA-Scan 아르시누모맙(Arcitumomab) (fab 단편), 에르비툭스(Erbitux) (Cetuximab), 헤르셉틴(Herceptin) (Trastuzumab), 마이오신트(Myoscint) (Imciromab Pentetate), 프로스타신트(ProstaScint) (Capromab Pendetide), 레미케이드(Remicade) (Infliximab), 레오프로(ReoPro) (Abciximab), 리툭산(Rituxan) (Rituximab), 시물렉트(Simulect) (Basiliximab), 시나기스(Synagis) (Palivizumab), 베르루마(Verluma) (Nofetumomab), 졸레르(Xolair) (Omalizumab), 제나팍스(Zenapax) (Daclizumab), 제발린(Zevalin) (Ibritumomab Tiuxetan), 오르토클론(Orthoclone) 0KT3 (Muromonab-CD3), 파노렉스(Panorex) (Edrecolomab), 밀로타르그(Mylotarg) (Gemtuzumab ozogamicin), 골리무맙(golimumab) (Centocor), 심지아(Cimzia) (Certolizumab pegol), 솔리리스(Soliris) (Eculizumab), CNTO 1275 (ustekinumab), 벡티빅스(Vectibix) (panitumumab), 벡사르(Bexxar) (tositumomab and I¹³¹ tositumomab), 항-IL-17 항체(전체 내용이 본원에서 참조로서 인용되는 국제공개공보 제WO 2007/149032호(Cambridge Antibody Technology)에 기재된 바와 같은 항체 7), 항-IL-13 항체 CAT-354 (Cambridge Antibody Technology), 항-사람 CD4 항체 CE9y4PE (IDEC-151, clenoliximab) (Biogen IDEC/Glaxo Smith Kline), 항-사람 CD4 항체 IDEC CE9.1/SB-210396 (keliximab) (Biogen IDEC), 항-사람 CD80 항체 IDEC-114 (galiximab) (Biogen IDEC), 항-광견병 바이러스 단백질 항체 CR4098 (foravirumab), 및 항-사람 TNF-관련된 아폽토시스-유도 리간드 수용체 2 (TRAIL-2) 항체 HGS-ETR2 (lexatumumab) (Human Genome Sciences, Inc.) 및 아바스틴 (bevacizumab)이 포함된다.

항체의 제조 기술은 하기에 제공된다.

폴리클로날 항체

폴리클로날 항체는 일반적으로 특정한 항원에 특이적이지만 상기 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 항체의 혼합물을 의미한다. 폴리클로날 항체는 일반적으로 관련 항원과 애주번트의 다중 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주입에 의해 동물에서 상승된다. 이는, 이관능성 또는 유도체화제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드(리신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데히드, 석신산 무수물, SOCl₂ 또는 R₁NCNR(여기서, R 및 R₁은 상이한 알킬 그룹이다)를 사용하여, 관련 항원을 면역화되는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합시키는 데 유용할 수 있다. 폴리클로날 항체를 제조하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Antibodies: A Laboratory Manual, Lane and Harlow (1988)]에 기재되어 있다.

모노클로날 항체

본원에 사용된 "모노클로날 항체"는 하이브리도마-유도된 항체(예: 하이브리도마 기술, 예를 들면, 표준 코흘러(Kohler) 및 밀스테인(Milstein) 하이브리도마 방법으로 제조한 하이브리도마에 의해 분비된 항체)를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 먼저 문헌[참조: Kohler et al., Nature, 256:495(1975)]에 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호)으로 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 하이브리도마-유도된 이중-특이성 항체는 하나 이상의 단일 항원에 대해 항원 특이성을 갖더라도 모노클로날 항체로서 언급된다.

모노클로날 항체는 실질적으로 동종성 항체의 모집단으로부터 수득되며, 즉, 모집단을 구성하는 개개 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 변형인자(modifier) "모노클로날"은 항체의 특성을 분리된 항체의 혼합물이 아닌 것으로 나타낸다.

추가의 양태에서, 항체는 문헌[참조: McCafferty et al., Nature, 348:552- 554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생성한 항체 파지 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 문헌[참조: McCafferty et al., Nature, 348-552-554(1990), Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]은 파지 라이브러리를 사용하는 뮤린 및 사람 항체의 분리를 각각 기재한다. 후속적인 공개문헌은 쇄 셔플링(chain shuffling)에 의한 고친화성 (nM 범위) 사람 항체의 생성[참조: Marks et al., Bio/Technology, 10:779- 783 (1992)] 및 매우 큰 파지 라이브러리를 작제하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합[참조: Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)]을 기재한다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체를 분리하기 위한 종래의 모노클로날 항체 하이브리도마 기술의 실용적인 대안이다.

항체 및 항체 단편은 미국 특허 제6,423,538호; 제6,696,251호; 제6,699,658호; 제6,300,065호; 제6,399,763호; 및 제6,114,147호에 기재된 바와 같이 발현 라이브러리를 사용하여 효모 및 기타 진핵 세포로부터 분리할 수 있다. 진핵 세포는 유전자 조작하여 라이브러리 단백질을 발현시킴으로써, 조합 항체 라이브러리로부터 세포 표면 상에 나타나고, 친화성을 갖는 항체에 대해 특정 세포 함유 라이브러리 클론을 선별하여 표적 분자를 선별하게 한다. 분리된 세포로부터의 회수 후, 목적하는 항체를 코딩하는 라이브러리 클론을 적합한 포유동물 세포주로부터 고도로 발현시킬 수 있다.

목적하는 항체를 개발하는 추가의 방법은 미국 특허 제7,195,880호; 제6,951,725호; 제7,078,197호; 제7,022,479호; 6,518,018호; 제7,125,669호; 제6,846,655호; 제6,281,344호; 제6,207,446호; 제6,214,553호; 제6,258,558호; 제6,261,804호; 제6,429,300호; 제6,489,116호; 제6,436,665호; 제6,537,749호; 제6,602,685호; 제6,623,926호; 제6,416,950호; 제6,660,473호; 제6,312,927호; 제5,922,545호; 및 제6,348,315호에 기재된 바와 같이 핵산 표시 기술을 사용하는 세포-유리 스크리닝을 포함한다. 이들 방법을 사용하여, 단백질을 이들이 기원하는 핵산에 물리적으로 연결 또는 결합시키는 방식으로, 시험관내에서 핵산으로부터 단백질을 전사할 수 있다. 표적 분자로 발현된 단백질을 선별함으로써, 단백질을 코딩하는 핵산을 또한 선별한다. 세포-유리 스크리닝 기술의 한 가지 변형에 있어서, 면역계 세포로부터 분리된 항체 서열은 분리될 수 있고, 항체 분화를 증가시키기 위해 폴리머라제 연쇄 반응 돌연변이유발 기술을 부분적으로 램덤화시킬 수 있다. 이어서, 이들 부분적으로 랜덤화된 항체 유전자는 핵산과 항체 사이에 생성된 공동 물리적 결합으로 세포-유리 시스템에서 발현된다.

DNA는 또한, 예를 들면, 코딩 서열을 상동성 뮤린 서열 대신에 사람 중쇄 및 경쇄 불변 도메인으로 치환시킴으로써(미국 특허 제4,816,567호; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다.

전형적으로, 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인을 치환하거나 항체의 하나의 항원-조합 부위의 가변 도메인을 치환하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-조합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-조합 부위를 포함하는 키메라 이중 항체를 생성한다.

키메라 또는 하이브리드 항체는 또한, 가교결합제를 수반하는 것을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조할 수 있다. 예를 들면, 면역독소는 디설파이드-교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성함으로써 작제할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예에는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트가 포함된다.

사람화 항체

비-사람 항체를 사람화시키는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 사람화 항체는 비-사람인 공급원으로부터 내부로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-사람 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 칭명되며, 이는 통상 "수입" 가변 도메인으로부터 입수한다. 사람화는 비-사람(예: 설치류) CDR 또는 CDR 서열을 사람 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 윈터(Winter) 등의 방법에 따라 실질적으로 실시할 수 있다[참조: Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]. 따라서, 이러한 "사람화된" 항체는 키메라 항체이며(미국 특허 제4,816,567호), 여기서 실질적으로 보다 적은 순수 사람 가변 도메인은 비-사람 종의 상응하는 서열에 의해 치환되어 있다. 실제로, 사람화 항체는 통상적으로, 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 골격(FR) 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위의 잔기로 치환되어 있는 사람 항체이다. 사람화 공정을 기재하는 추가의 참조문은 각각 본원에서 참조로서 인용되는 문헌[참조: Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)]을 포함한다.

사람 항체

또는, 면역화시키면, 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에 사람 항체의 완전 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자이식 동물(예: 마우스)를 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들면, 키메라 및 생식세포주 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(J_H)의 동형 결실은 내인성 항체 생성의 완전한 억제를 일으킨다고 기재되어 있다. 이러한 생식세포주 돌연변이 마우스에서 사람 생식세포주 면역글로불린 유전자 배열의 이동은 항원 접종시에 사람 항체를 생성시킬 것이다[참조: Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immune, 7:33 (1993)]. 사람 항체는 또한 파지-표시 라이브러리로부터 유도할 수 있다[참조: Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)].

한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은, 예를 들면, 아달리무맙(또한 후미라, 아달리무맙 또는 D2E7로서 언급됨; Abbott Laboratories)을 포함하여 사람 TNFα에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함한다. 한 가지 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 1 x 10^-8 M 이하의 K_d 및 1 x 10^-3 s^-1 이하의 K_off (둘 다 표면 플라즈몬 공명으로 측정함)에서 사람 TNFα로부터 해리하고, 1 x 10^-7 M 이하의 IC₅₀으로 표준 시험관내 L929 분석에서 사람 TNFα 세포독성을 중화시킨다. 항체 서열을 포함하여 사람 TNFα에 대해 고친화성을 갖는 사람 중화 항체의 제조방법은 본원에서 참조로서 인용되는 미국 특허 제6,090,382호 (D2E7로서 언급됨)에 기재되어 있다.
한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 1번, 4번, 5번, 7번 또는 8번 위치에서 단일 알라닌 치환으로 변형된 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 2번, 3번, 4번, 5번, 6번, 8번, 9번, 10번 또는 11번 위치에서 단일 알라닌 치환으로 변형된 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 함유하는 인간 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 바람직하게는, 상기 LCVR은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 (즉, D2E7 VL CDR2)을 추가로 가지며, 상기 HCVR은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 (즉, D2E7 VH CDR2)을 추가로 갖는다. 더욱 바람직하게는, 상기 LCVR은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인 (즉, D2E7 VL CDR1)을 추가로 가지며, 상기 HCVR은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인 (즉, D2E7 VH CDR1)을 추가로 갖는다.
한 가지 양태에서, 본 발명의 제형에서 사용하기 위한 인간 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR) (즉, D2E7 VL) 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR) (즉, D2E7 VH)을 포함한다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은, 예를 들면, 항체 J695 (Abbott Laboratories; 또한 ABT-874로서 언급됨) (미국 특허 제6,914,128호)를 포함하여 사람 IL-12에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함한다. J695는 인터류킨-12 및 인터류킨-23을 표적화하고 중화시키도록 설계된 완전 사람 모노클로날 항체이다. 한 가지 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음 특성을 갖는다: 이는 3 x 10^-7 M 이하의 K_D에서 사람 IL-1α로부터 해리하고, 5 x 10^-5 M 이하의 K_D에서 사람 IL-1β로부터 해리하며, 마우스 IL-1α 또는 마우스 IL-1β에 결합하지 않는다. 항체 서열을 포함하여 사람 IL-12에 대해 고친화성을 갖는 사람 중화 항체의 예 및 제조방법은 본원에서 참조로서 인용되는 미국 특허 제6,914,128호에 기재되어 있다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은, 예를 들면, 항체 2.5(E)mg1 (Abbott Bioresearch; 또한 ABT-325로서 언급됨) (참조: 본원에서 참조로서 인용되는 미국 특허원 제2005/0147610호)를 포함하여 사람 IL-18에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함한다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 항체 1D4.7 (Abbott Laboratories; 또한 ABT-147로서 언급됨) (참조: 본원에서 참조로서 인용되는 국제공개공보 제WO 2007/005608 A2호, 2007년 1월 11일자 공개)인 항-IL-12/항-IL-23 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함한다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 항체 13C5.5 (Abbott Laboratories; 또한 ABT-308로서 언급됨) (참조: 본원에서 참조로서 인용되는 제PCT/US2007/19660호 (WO 08/127271))인 항-IL-13 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함한다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 항체 7C6, 항-아밀로이드 β 항체 (Abbott Laboratories; 본원에 참조로서 인용되는 PCT 공개공보 제WO 07/062852호)인 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함한다.

이중특이적 항체

이중특이적 항체(BsAbs)는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이러한 항체는 전체 길이의 항체 또는 항체 단편(예: F(ab')2 이중특이적 항체)으로부터 유도될 수 있다.

이중특이적 항체의 제조방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 전체 길이의 이중특이적 항체의 종래의 제조방법은, 2개의 쇄가 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초한다[참조: Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 조합으로 인해, 이들 하이브리도마(quadromas)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하며, 이들 중의 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 통상 실시되는 정확한 분자의 정제는 오히려 방해되고, 생성물 수율은 낮다. 유사한 절차가 국제공개공보 제WO 93/08829호 및 문헌[참조: Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.

상이한 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성(항체-항원 조합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열과 융합된다.

융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 적어도 하나의 융합물에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물 및 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA를 분리된 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체에 공형질감염시킨다. 이는, 작제시에 사용된 3개 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않는 비율이 최적 수율을 제공하는 양태에서 3개 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는 데에 있어서 큰 융통성을 제공한다. 그러나, 2개 이상의 폴리펩티드 쇄를 동일한 비율로 발현하는 것이 높은 수율을 제공하거나 당해 비율이 특히 중요하지 않은 경우에는 2개의 또는 3개의 모든 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.

이러한 방법의 바람직한 양태에서, 이중특이적 항체는 하나의 암(arm)에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)으로 이루어져 있다. 이러한 대칭 구조는, 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 방식의 분리를 제공하기 때문에, 바람직하지 않은 면역글로불린 쇄 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 촉진시킨다. 이러한 방법은 1994년 3월 3일자로 공개된 국제공개공보 제WO 94/04690호에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 상세는 문헌[참조: Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.

이중특이적 항체는 가교결합 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들면, 이종접합물 중의 항체 중 하나는 아비딘에 결합할 수 있고, 다른 하나는 비오틴에 결합할 수 있다. 이러한 연구는, 예를 들면, 면역계 세포를 바람직하지 않은 세포에 표적화하기 위해(미국 특허 제4,676,980호) 및 HIV 감염을 치료하기 위해(WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089) 제안되어 있다. 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 또한 문헌에 기재되어 있다. 다음 기술은 또한, 반드시 이중특이적인 것은 아닌 2가 항체 단편의 생산에 사용될 수 있다. 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli)로부터 회수된 Fab 단편을 시험관내에서 화학적으로 커플링시켜 2가 항체를 형성할 수 있다[참조: Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)].

재조합 세포 배양물로부터 2가 항체 단편을 직접 제조하여 분리하는 다양한 기술이 또한 기재되어 있다. 예를 들면, 2가 헤테로이량체는 류신 지퍼를 사용하여 생성되었다[참조: Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 호모이량체는 힌지 영역에서 감소되어 단량체를 형성한 다음, 재산화되어 항체 헤테로이량체를 형성하였다. 문헌[참조: Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중특이적/2가 항체 단편의 또 다른 제조 메카니즘을 제공한다. 당해 단편은, 너무 짧아서 동일한 쇄 상에서 2개 도메인 사이에 쌍을 이루지 못하는 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(LH)를 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루게 됨으로써 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용한 이중특이적/2가 항체 단편의 또 다른 제조 전략은 문헌[참조: Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]에 보고되어 있다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 IL-1(IL-1α 및 IL-1β 포함)에 이중특이적인 항체를 포함한다. 이중특이적 IL-1 항체의 제조예 및 제조방법은 2006년 12월 29일자로 출원된 미국 가특허원 제60/878165호에서 발견될 수 있다.

정용여과/한외여과(또한 일반적으로 본원에서 DF/UF로서 언급됨)은 투과성(다공성) 막을 선택적으로 사용하여 이들의 분자 크기에 기초하여 용액 및 현탁액의 성분들을 분리한다. 막은 당해 막의 기공보다 큰 분자를 보유하지만, 보다 작은 분자, 예를 들면, 투과성인 염, 용매 및 물은 당해 막을 통해 자유롭게 통과한다.

막에 의해 보유된 용액은 농축물 또는 잔류액으로서 공지되어 있다. 막을 통해 통과한 용액은 여액 또는 투과물로서 공지되어 있다. 농축용 막을 선택하는 한 가지 파라미터는 농축되는 샘플에 대한 이의 보유 특성이다. 일반적으로, 막의 분획 분자량(MWCO; molecular weight cut-off)은 보유되는 분자의 1/3 내지 1/6 분자량이어야 한다. 이는 완전한 보유를 보장한다. MWCO가 샘플의 MWCO에 근접할수록, 농축 동안 소형 생성물 소실 위험은 보다 커진다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 막의 예에는 오메가(Omega™) PES 막 (30 kDa MWCO, 즉 30 kDa 초과의 분자는 당해 막에 의해 보유되고, 30 kDa 미만의 분자는 당해 막의 여액 부분으로 통과한다)(Pall Corp., Port Washington, NY); 밀렉스(Millex®)-GV 시린지 구동 필터 장치, PVDF 0.22 ㎛ (Millipore Corp., Billerica, MA); 밀렉스(Millex®)-GP 시린지 구동 필터 장치, PES 0.22 ㎛; 스테리벡스(Sterivex®) 0.22 ㎛ 필터 장치(Millipore Corp., Billerica, MA); 및 비바스핀 농축기 (MWCO 10 kDa, PES; MWCO 3 kDa, PES) (Sartorius Corp., Edgewood, NY)이 포함된다. 본 발명의 저이온성 단백질 제형을 제조하기 위해, 단백질 용액(이는 완충 제형에 용해될 수 있다)을 DF/UF 공정으로 처리하고, 여기서 물이 DF/UF 매질로서 사용된다. 바람직한 양태에서, DF/UF 매질은 물로 이루어지고, 임의의 다른 부형제를 포함하지 않는다.

임의의 물을 본 발명의 DF/UF 공정에 사용할 수 있으나, 바람직한 물은 정제수 또는 탈이온수이다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 당해 기술분야에 공지된 물의 종류에는 주입용수(WFI)(예를 들면, HyPure WFI Quality Water (HyClone), AQUA-NOVA® WFI (Aqua Nova)), UltraPure™ Water (Invitrogen), 및 증류수 (Invitrogen; Sigma-Aldrich)가 포함된다.

불연속 방식의 DF/UF 및 연속 방식의 DF/UF를 포함하는 2가지 형태의 DF/UF가 있다. 본 발명의 방법은 어느 방식에 따라서도 실시할 수 있다.

연속 DF/UF(또한 일정 용적 DF/UF로서 언급됨)은 여액이 생성되는 것과 동일한 속도로 잔류물에 물 또는 새로운 완충제를 첨가함으로써 잔류물(샘플 또는 제1 단백질 용액)에서 본래 완충제 염(또는 기타 저분자량 종)을 세척하는 것을 수반한다. 그 결과, 잔류물 용적 및 생성물 농도는 DF/UF 공정 동안 변화하지 않는다. 제거된 염의 양은 잔류물 용적에 비례하여 생성된 여액 용적과 관련된다. 생성된 여액 용적은 일반적으로 "정용여과 용적"으로 언급된다. 단일 정용여과 용적(DV; diafiltration volume)은 정용여과가 개시될 때의 잔류물 용적이다. 연속 정용여과의 경우, 액체를 여액의 생성 속도와 동일한 속도로 첨가한다. 수집된 여액의 용적이 개시 잔류물 용적과 동일해지는 경우, 1 DV가 처리되었다.

불연속 DF/UF(이의 예는 하기 실시예 부분에 제공된다)는 2가지 상이한 방법, 즉 불연속 순차 DF/UF 및 용적 감소 불연속 DF/UF를 포함한다. 순차 희석에 의한 불연속 DF/UF는 먼저 샘플(또는 제1 단백질 용액)을 소정 용적까지 물로 희석시키는 것을 수반한다. 이어서, 희석된 샘플을 UF에 의해 이의 본래 용적까지 다시 농축시킨다. 용적 감소에 의한 불연속 DF/UF는 먼저 샘플을 소정 용적까지 농축시킨 다음, 샘플을 물 또는 치환 완충제로 이의 본래 용적까지 희석시키는 것을 수반한다. 연속 DF/UF에서와 같이, 당해 공정은 바람직하지 않은 용질(예: 이온성 부형제)의 수준이 제거될 때까지 반복한다.

DF/UF는 물(예: WFI)을 DF/UF 매질로서 사용하는 당해 기술분야에 공지된 통상의 기술에 따라 수행할 수 있다[참조: Industrial Ultrafiltration Design and Application of Diafiltration Processes, Beaton & Klinkowski, J. Separ. Proc. Technol., 4(2) 1-10 (1983)]. DF/UF를 실시하기 위한 상업적으로 시판되는 장치의 예에는 밀리포어(Millipore) 랩스케일(Labscale™) TFF 시스템 (Millipore), LV 센트라메이트(Centramate™) Lab 탄젠트 유동 시스템(Tangential Flow System)(Pall Corporation), 및 유니플럭스 시스템(UniFlux System) (GE Healthcare)이 포함된다.

예를 들면, 바람직한 양태에서, 500 mL 저장기를 갖는 밀리포어(Millipore) 랩스케일(Labscale™) 탄젠트 유동 여과(TFF; Tangential Flow flitration) 시스템을 사용하여 본 발명의 방법을 실시함으로써 정용여과된 항체 용액을 생성한다. DF/UF 공정은 불연속 방식으로 수행하며, 이는 14개 공정 단계를 사용하여 물 중의 고농도 항체 제형을 생성한다. 추가의 예시적 장치에 있어서, 본 발명의 특정한 양태의 용액 및 물 용적, 공정 단계의 수 및 기타 파라미터는 하기 실시예 부분을 참조한다.

본 발명에 따라 단백질을 물로 재제형화하는 완충제 교환을 위한 또 다른 정용여과 방법은 투석 및 겔 여과를 포함하며, 이들 모두는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있는 기술이다. 투석은 투석 백(규정된 다공도의 막 케이스)을 충전하고, 당해 백을 결속하고, 당해 백을 수욕에 배치하는 것을 필요로 한다. 확산을 통해, 백 중의 염의 농도는 욕 중의 농도와 평형화될 것이며, 여기서 보다 큰 분자(예: 백을 통해 확산할 수 없는 단백질)는 백 속에 잔류한다. 백 중의 샘플 용적과 비교하여 백의 용적이 클수록, 도달할 수 있는 평형 농도는 보다 낮아진다. 일반적으로, 욕의 물의 치환은 염 모두를 완전히 제거하기 위해 요구된다. 겔 여과는 분자 크기에 기초하여 분자를 분리하는 비흡착성 크로마토그래피 기술이다. 겔 여과에 있어서, 큰 분자(예: 단백질)은 보다 작은 분자(예: 염)로부터 크기 배제에 의해 분리될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 제1 단백질 용액을 물로 반복 용적 교환시켜, 실질적으로 물과 단백질인 수성 제형을 수득한다. 정용여과 단계는 용액 중의 단백질에 따라 임의의 횟수로 실시할 수 있으며, 여기서 1회의 정용여과 단계는 1회의 전체 용적 교환에 필적한다. 한 가지 양태에서, 정용여과 공정은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9회로 수행하거나, 또는 단백질이 실질적으로 물에 용해되도록 제1 단백질 용액으로부터 부형제(예: 염)을 제거하는데 필요하다고 생각되는 다수의 회수까지 실시한다. 단백질 용액의 개시 용적과 동등한 잔류물 측에 소정 용적의 물을 첨가하는 경우에 1회의 또는 1단계의 정용여과가 달성된다.

한 가지 양태에서, 단백질 용액은 2회 이상의 정용여과 단계로 처리한다. 한 가지 양태에서, 물을 사용한 정용여과 단계 및 용적 교환은 4회 이상, 및 바람직하게는 5회 이상 반복할 수 있다. 한 가지 양태에서, 제1 단백질 용액은 6배 이상의 용적 교환이 달성될 때까지 물로 정용여과한다. 또 다른 양태에서, 제1 단백질 용액은 7배 이상의 용적 교환이 달성될 때까지 물로 정용여과한다. 상기 인용된 회수에 대한 중간 범위, 예를 들면, 4 내지 6배 또는 5 내지 7배도 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 예를 들면, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 수치의 조합을 사용하는 수치 범위는 포함되는 것으로 의도된다.

바람직한 양태에서, 한외여과 막의 여액 측에 대한 단백질 손실은 최소화되어야 한다. 특정 막의 여액 측으로의 단백질 손실의 위험은 막의 기공 크기 및 단백질의 농도에 비례하여 단백질 크기에 따라 달라진다. 단백질 농도가 증가함에 따라, 여액으로의 단백질 손실 위험이 증가한다. 특정 막의 세공 크기와 관련하여, 단백질 손실 위험은, 보다 큰 단백질의 경우보다, 단백질의 크기가 막의 MWCO에 근접하는 보다 작은 단백질의 경우에 더욱 커진다. 따라서, 보다 작은 단백질에 대해 DF/UF를 실시하는 경우, 허용되지 않는 단백질 손실을 발생시키지 않으면서, 동일한 막을 사용하여 보다 큰 단백질에 대해 DF/UF를 실시하는 것과 비교하여 동일한 용적 감소를 달성할 수 없다. 달리 말하면, 동일한 장치 및 막을 사용하는 보다 작은 단백질 용액의 한외여과와 비교하여, 보다 큰 단백질 용액은 당해 용액에서 단백질의 보다 높은 농도로 보다 작은 용적으로 한외여과될 수 있다. 특정한 기공 크기 막을 사용하는 DF/UF 공정은 보다 큰 단백질보다 보다 작은 단백질에서 보다 많은 공정 단계를 필요로 할 수 있고; 보다 큰 단백질에서 보다 큰 용적 감소와 농도는 다시 첨가되는 물의 용적을 보다 크게 하여, 개개 공정 단계에서 단백질 용액 중의 잔류 완충제 또는 부형제 성분의 희석을 보다 크게 한다. 따라서, 보다 작은 단백질의 경우와 비교하여 보다 큰 단백질의 경우에는 보다 적은 수의 공정 단계가 용질의 특정한 감소를 달성하는 데 요구될 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는, 공정에 사용되는 단백질 크기 및 한외여과 장치의 기공 크기가 제공되면, 각 공정 단계에서 가능한 농도의 양 및 특정한 용질 감소를 달성하는데 필요한 전체 공정 단계의 수를 계산할 수 있다.

본 발명의 정용여과 방법의 결과로서, 제1 단백질 용액 중의 용질의 농도는 본질적으로 물 및 단백질을 포함하는 최종 수성 제형에서 현저히 감소한다. 예를 들면, 수성 제형은 최종 부형제 농도가 제1 단백질 용액보다 95% 이상, 바람직하게는 제1 단백질 용액보다 99% 이상 낮다. 예를 들면, 한 가지 양태에서, WFI에 단백질을 용해시키는 것은 일정한 용적의 정용여과에 의해 5배 정용여과 용적, 즉 대략적으로 Ci e^-5 = 0.00674에 같거나 이에 도달한, 즉 대략 99.3%의 최대 부형제 감소율에 도달한 이론상 최종 부형제 농도를 생성하는 공정이다. 한 가지 양태에서, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 일정한 용적의 정용여과로 상업적 DF/UF의 최종 단계 동안 6회 용적 교환을 실시할 수 있다. 즉 Ci는 C_i e^-6 = 0.0025일 수 있다. 이는 대략 99.75% 최대 이론상 부형제 감소율을 제공할 수 있다. 또 다른 양태에서, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 이론상 약 99.9% 최대 부형제 감소율을 수득하기 위해 8회 정용여과 용적 교환을 사용할 수 있다.

용어 "부형제 비함유" 또는 "부형제 부재"는 당해 제형이 부형제를 실질적으로 포함하지 않음을 나타낸다. 한 가지 양태에서, 부형제 비함유는 완충제 비함유, 염 비함유, 당 비함유, 아미노산 비함유, 계면활성제 비함유 및/또는 폴리올 비함유를 나타낸다. 한 가지 양태에서, 용어 "실질적으로 부형제 비함유"는 용액 또는 제형이 부형제를 99% 이상 함유하지 않음을 나타낸다. 그러나, 특정한 양태에서, 제형은 소정의 명시된 비이온성 부형제, 예를 들면, 슈크로즈 또는 만니톨을 포함할 수 있고, 당해 제형은 다른 부형제를 포함하지 않음에 주목해야 한다. 예를 들면, 제형은 물, 단백질 및 만니톨을 포함할 수 있으며, 여기서 당해 제형은 다른 부형제를 함유하지 않는다. 또 다른 예에서, 제형은 물, 단백질 및 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있으며, 여기서 제형은 다른 부형제를 포함하지 않는다. 또 다른 예에서, 제형은 물, 단백질, 소르비톨 및 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있으며, 여기서 제형은 다른 부형제를 포함하지 않는다.

물이 본원에 기재된 방법에 따라 제1 단백질 용액의 정용여과에 사용되는 경우, 이온성 부형제는 세척될 것이며, 그 결과, 정용여과된 수성 제형의 전도도는 제1 단백질 용액보다 낮다. 수용액이 전기를 전도하는 경우, 이는 이온성 부형제에서 발견되는 바와 같이 이온을 함유해야 한다. 따라서, 저전도도 측정치는 본 발명의 수성 제형이 이온성 부형제를 포함하여 현저히 감소된 부형제를 가짐을 나타낸다.

용액의 전도도는 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 측정된다. 전도도 계측기 및 셀을 사용하여 수성 제형의 전도도를 측정할 수 있으며, 사용 전에 표준 용액에 대해 교정되어야 한다. 당해 기술분야에서 이용가능한 전도도 계측기의 예에는 마이론(MYRON) L 디지탈 (Cole Parmer®), 컨덕토미터(Conductometer) (Metrohm AG) 및 시리즈 3105/3115 통합 전도도 분석기(Integrated Conductivity Analyzers) (Kemotron)가 포함된다. 한 가지 양태에서, 수성 제형은 전도도가 3 mS/cm 미만이다. 또 다른 양태에서, 수성 제형은 전도도가 2 mS/cm 미만이다. 또 다른 양태에서, 수성 제형은 전도도가 1 mS/cm 미만이다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 수성 제형은 전도도가 0.5 mS/cm 미만이다. 상기 인용된 수치의 중간 범위, 예를 들면, 1 내지 3 mS/cm은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 예를 들면, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 수치의 조합을 사용하는 수치 범위는 포함되는 것으로 의도된다. 또한, 인용된 수치에 포함되는 수치, 예를 들면, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0 등도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 중요한 양태는 정용여과된 단백질 용액(제1 단백질 용액의 정용여과 공정에 따라 수득한 용액)을 농축시킬 수 있다는 것이다. 이러한 공정에 따르면, 고농도 단백질이 물에서 안정한 것으로 밝혀졌다. 정용여과 후의 농축은 제1 단백질 용액과 비교하여 물과 증가된 단백질 농도를 함유하는 수성 제형을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 정용여과 매질로서 물을 사용하여 단백질 용액을 정용여과한 다음, 생성된 수용액을 농축시키는 단계를 포함한다. 정용여과된 단백질 용액의 농축은 원심분리를 포함하여 당해 기술분야에 공지된 수단을 통해 달성할 수 있다. 예를 들면, 정용여과 후, 수계 정용여과 단백질 용액을, 수계 용액을 유지하면서 한외여과를 통해 단백질을 고농도 제형으로 농축시키는데 사용되는, 원심분리 공정으로 처리한다. 한외여과 막 및/또는 장치로, 예를 들면, 비바스핀(Vivaspin) 원심분리 농축기(Sartorius Corp. Edgewood, NY)에서 원심분리를 통해 용액을 농축시키는 수단은 당해 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명의 방법은, 추가의 안정화제를 필요로 하지 않으면서, 물에서 단백질을 고농도로 농축시키는 수단을 제공한다. 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 수성 제형 중의 단백질의 농도는 목적하는 농도에 따라 임의의 양일 수 있다. 예를 들면, 본원의 방법에 따라 제조한 수용액 중의 단백질의 농도는 약 10 ㎍/mL 이상; 약 1 mg/mL 이상; 약 10 mg/mL 이상; 약 20 mg/mL 이상; 약 50 mg/mL 이상; 약 75 mg/mL 이상; 약 100 mg/mL 이상; 약 125 mg/mL 이상; 약 150 mg/mL 이상; 약 175 mg/mL 이상; 약 200 mg/mL 이상; 약 220 mg/mL 이상; 약 250 mg/mL 이상; 약 300 mg/mL 이상; 또는 약 300 mg/mL 초과이다. 상기 인용된 농도의 중간 범위, 예를 들면, 약 113 mg/mL 이상, 약 214 mg/mL 이상 및 약 300 mg/mL 이상도 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 또한, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 수치(또는 상기 기재된 범위 사이의 수치)의 조합을 사용하는 수치 범위, 예를 들면, 100 내지 125 mg/mL, 113 내지 125 mg/mL 및 126 내지 200 mg/mL 또는 그 이상도 포함되는 것으로 의도된다.

본 발명의 방법은, 수성 단백질 제형의 높은 농도에도 불구하고, 생성되는 제형은 단백질 응집물의 비율이 낮다는 잇점을 제공한다. 한 가지 양태에서, 물과 고농도의 단백질, 예를 들면, 항체를 포함하는 수성 제형은 계면활성제 또는 기타 종류의 부형제의 부재하에서도 약 5% 미만의 단백질 응집물을 함유한다. 한 가지 양태에서, 제형은 약 7.3% 이하의 응집물 단백질을 포함하거나, 제형은 약 5% 이하의 응집물 단백질을 포함하거나, 제형은 약 4% 이하의 응집물 단백질을 포함하거나, 제형은 약 3% 이하의 응집물 단백질을 포함하거나, 제형은 약 2% 이하의 응집물 단백질을 포함하거나, 제형은 약 1% 이하의 응집물 단백질을 포함한다. 한 가지 양태에서, 제형은 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 단량체 단백질을 포함한다. 상기 인용된 농도의 중간 범위, 예를 들면, 약 98.6% 이상, 약 4.2% 이하도 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 수치의 조합을 사용하는 수치 범위는 포함되는 것으로 의도된다.

다수의 단백질-기재 약제학적 생성물은 고농도로 제형화되어야 한다. 예를 들면, 항체-기재 생성물은, 적절한 효능을 달성하고 최대 약 1 mL 주입 용적의 대표적 환자 이용 요건을 충족시키기 위해, 이들의 약물 생성물(DP) 제형에서 100 mg/mL를 초과하는 경향이 증가하고 있다. 따라서, 단백질 농도를 증가시키기 위해 최종 제형 완충제 내로의 정용여과 또는 한외여과 등의 다운스트림 처리 단계도 또한 보다 높은 농도에서 수행된다.

전통적인 동력학은 분자간 상호작용이 특히 보다 고단백질 농도에서 투석 막을 통한 소형 용질의 분배에 영향을 미칠 수 있음을 예상하며, 비이상적 투석 평형 및 분자간 상호작용의 효과를 기재하는 모델이 이용가능하다[참조: Tanford Physical chemistry or macromolecules. New York, John Wiley and Sons, Inc., p. 182, 1961; Tester and Modell Thermodynamics and its applications, 3rd ed. Upper Saddle River, NL, Prentice-Hall, 1997]. 이들 종류의 모델을 적용하는데 필요한 공정 개발 환경에서 상세한 동력학적 데이타의 입수가능성의 부재하에, 분자간 상호작용은 상업적 DF/UF 조작의 설계시에 거의 고려되지 않는다. 결과적으로, DP 부형제 농도는 표지된 농도와 현저히 상이할 수 있다. 상업적 및 개발 생성물에서 이러한 불일치의 몇가지 예는 공개되어 있다: 예를 들면, 클로라이드는 IL-1 수용체 길항제에서 표지된 것보다 30%까지 낮고, 히스티딘은 PEG-sTNF 수용체에서 표지된 것보다 40% 낮으며, 아세테이트는 융합 접합물 단백질에서 표지된 것보다 200%까지 높다[참조: Stoner et al., J. Pharm. Sci, 93, 2332-2342 (2004)]. 실제 DP가, 단백질이 정용여과되는 완충제 조성물과 상이할 수 있는 몇가지 이유가 있으며, 여기에는 도난(Donnan) 효과[참조: Tombs and Peacocke (1974) Oxford; Clarendon Press], 비특이적 상호작용[참조: Arakawa and Timasheff, Arch. Biochem. Biophys., 224, 169-77 (1983); Timasheff, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 22, 67-97 (1993)] 및 용적 배제 효과가 포함된다. 용적 배제는 부분 비용적이 0.7 내지 0.8 mL/g⁵인 대부분의 단백질을 포함한다. 따라서, 100 mg/mL의 구형 단백질의 경우, 단백질 분자는 전체 용액 용적의 약 7.5%를 점유한다. 현저한 분자간 상호작용이 가정되지 않으면, 이는 막의 잔류물 측에서 용질 몰 농도, 즉 막의 투과물 측에서 몰 농도의 92.5%로 해석될 것이다. 이는 기본적으로 모든 단백질 용액 조성물이 한외여과 처리 동안 필수적으로 변화되는 이유를 설명한다. 예를 들면, 40 mg/mL에서 단백질 분자는 전체 용액 용적의 약 3%를 차지하고, 농도를 150 mg/mL로 증가시키는 한외여과 단계는 반드시 몰 부형제 농도를 8% 초과까지 변화시킬 것이다(150 mg/mL의 단백질은 전체 용액 용적의 11% 초과를 나타내기 때문에). 또한, 상기 인용된 퍼센트의 중간 범위는 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 수치의 조합을 사용하는 수치 범위도 포함되는 것으로 의도된다.

본 발명의 방법 및 조성물에 따라서, DF/UF 실행 동안 완충제 조성 변화는 정용여과 매질로서 순수한 물을 사용함으로써 방지할 수 있다. 단백질을 최종 벌크 DS에 요구되는 농도보다 약 20% 높게 농축시킴으로써, 부형제는, 예를 들면, 고도로 농축된 부형제 스톡 용액을 통해 첨가될 수 있다. 이어서, 부형제 농도 및 용액 pH를 표지된 것과 동일해지도록 보장할 수 있다.

본 발명의 수성 제형은, 부형제를 실질적으로 함유하지 않기 때문에, 출발 물질로서 잇점을 제공한다. 물에서의 정용여과 후에 제형에 첨가되는 임의의 부형제(들)는 정확하게 계산될 수 있다. 즉, 부형제의 기존 농도는 당해 계산을 방해하지 않는다. 약제학적으로 허용되는 부형제의 예는 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 비이온성 부형제(들) 또는 이온성 부형제(들)을 포함하여 공지된 농도의 부형제(들)를 갖는 제형, 특히 약제학적 제형을 제조하기 위해, 본원에 기재된 방법을 통해 수득한 수성 제형을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 한 가지 양태는 부형제(들)를, 물과 단백질을 포함하는 수성 제형에 첨가하는 추가의 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은, 부형제를 실질적으로 함유하지 않고, 물, 단백질 및 특정 농도의 부형제를 포함하는 제형을 제조하기 위해 출발 물질로서 사용될 수 있는, 수성 제형을 제공한다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 방법은, 특성, 예를 들면, 단백질 농도, 단백질의 수력학적 직경, 전도도 등을 변화시키지 않으면서, 비이온성 부형제, 예를 들면, 폴리소르베이트 및 폴록사머 등의 당 또는 비이온성 계면활성제를 제형에 첨가하기 위해 사용될 수 있다.

상기 방법을 사용하여 수득한 수성 제형의 추가의 특징 및 잇점은 하기 섹션 III에 기재되어 있다. 본 발명의 방법을 실시하는 예시적 프로토콜도 하기 실시예에 기재되어 있다.

III. 본 발명의 제형

본 발명은, 추가의 부형제를 요구하지 않고서 물 속에서 단백질의 안정성, 단백질의 용해도를 유지하기 위한 추가의 부형제를 요구하지 않고서 단백질의 농도 증가 및 낮은 몰삼투농도를 포함하여, 당해 기술분야의 종래의 제형에 비해 다수의 잇점을 갖는, 단백질과 물을 포함하는 수성 제형을 제공한다. 또한, 본 발명의 제형은, 제형 중의 단백질이 고단백질 농도 및 반복된 냉동/해동 처리 단계에서도 저장 동안, 예를 들면, 7℃에서 3개월 이상 동안 또는 냉동/해동 조건에서 액체 형태로 저장하는 동안 안정한 상태를 유지하기 때문에 유리한 저장 특성을 갖는다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 고농도의 단백질을 포함하므로 수성 제형은 현저한 유백광, 응집 또는 침전을 나타내지 않는다.

본 발명의 수성 제형은 표준 부형제, 예를 들면, 긴장성 개질제, 안정화제, 계면활성제, 항산화제, 냉동보호제, 벌크화제, 동결보호제, 염기성 성분 및 산성 성분에 의존하지 않는다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 제형은 물, 하나 이상의 단백질 및 비이온성 부형제(예: 염, 유리 아미노산)를 함유한다.

특정한 양태에서, 본 발명의 수성 제형은 50 mg/mL 이상의 단백질 농도 및 물을 포함하고, 여기서 제형은 몰삼투농도가 30 mOsmol/kg 이하이다. 수성 제형의 몰삼투농도의 하한치는 또한 본 발명에 포함된다. 한 가지 양태에서, 수성 제형의 몰삼투농도는 15 mOsmol/kg 이하이다. 본 발명의 수성 제형은 몰삼투농도가 30 mOsmol/kg 미만일 수 있고, 또한 단백질 농도가 높을 수 있으며, 예를 들면, 단백질 농도는 100 mg/mL 이상 및 200 mg/mL 초과일 수 있다. 상기 인용된 농도 및 몰삼투농도 단위의 중간 범위도 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 수치의 조합을 사용하는 수치 범위도 포함되는 것으로 의도된다.

본 발명의 수성 제형의 농도는 단백질 크기에 의해 한정되지 않고, 당해 제형은 임의 크기 범위의 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 범위에는, 크기가 5 kDa 내지 150 kDa 또는 그 이상일 수 있는 50 mg/mL 이상 및 200 mg/mL 이상의 단백질을 포함하는 수성 제형이 포함된다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형 중의 단백질은 크기가 약 15 kD 이상, 약 20 kD 이상, 약 47 kD 이상, 약 60 kD 이상, 약 80 kD 이상, 약 100 kD 이상, 약 120 kD 이상, 약 140 kD 이상, 약 160 kD 이상, 또는 약 160 kD 초과이다. 상기 인용된 크기의 중간 범위도 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 수치의 조합을 사용하는 수치 범위도 포함되는 것으로 의도된다.

본 발명의 수성 제형은 용액 중의 단백질의 수력학적 직경(D_h)에 의해 특성화할 수 있다. 용액 중의 단백질의 수력학적 직경은 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 측정할 수 있으며, 이는 단백질의 D_h를 측정하는 확립된 분석 방법이다. 모노클로날 항체(예: IgG)에 대한 전형적인 값은 약 10 nm이다. 본원에 기재된 것들과 같은 저이온성 제형은 단백질의 D_h가 이온성 부형제를 포함하는 단백질 제형보다 현저히 낮다는 점에서 특성화할 수 있다. 교환 매질로서 순수한 물을 사용하는 DF/UF를 사용하여 제조한 수성 제형 중의 항체의 D_h 값은 단백질 농도와 독립적인 통상의 제형 중의 항체의 D_h보다 현저히 낮은 것으로 밝혀졌다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 수성 제형 중의 항체는 D_h가 4 nm 미만 또는 3 nm 미만이다.

한 가지 양태에서, 수성 제형 중의 단백질의 D_h는, 단백질 농도와 상관 없이, 완충 용액 중의 동일한 단백질의 D_h와 비교하여 보다 작다. 따라서, 특정한 양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조한 수성 제형 중의 단백질은 동일한 소정 농도에서 완충 용액 중의 단백질의 D_h보다 25% 이상 낮은 D_h를 가질 것이다. 완충 용액의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아지니만, 인산완충식염수(PBS)가 포함된다. 특정한 양태에서, 본 발명의 수성 제형 중의 단백질은 D_h가 PBS 중의 소정 농도의 단백질의 D_h보다 50% 이상, PBS 중의 소정 농도의 단백질의 D_h보다 60% 이상, PBS 중의 소정 농도의 단백질의 D_h보다 70% 이상 낮거나, PBS 중의 소정 농도의 단백질의 D_h보다 70% 초과로 낮다. 또한, 상기 인용된 퍼센트의 중간 범위, 예를 들면, 55%, 56%, 57%, 64%, 68% 등도 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 수치의 조합을 사용하는 수치 범위, 예를 들면, 50% 내지 80%도 포함되는 것으로 의도된다.

단백질 응집은 단백질 용액에서 통상적인 문제이며, 종종 단백질의 농도 증가를 일으킨다. 본 발명은 고농도의 저응집 단백질 제형을 달성하는 수단을 제공한다. 본 발명의 제형은, 제형 중의 단백질을 가용 상태로 유지하고 응집을 방지하기 위해, 완충 시스템 및 계면활성제를 포함한 부형제에 의존하지 않는다. 본 발명의 제형은, 용액 중 단백질의 안정한 고농도를 달성하기 위해 기타 제제에 의존하지 않으면서 단백질 농도가 높고 수계이기 때문에, 치료학적 목적에 유리할 수 있다.

생물학적 생성물(항체 포함)의 대부분은 용액 중의 비효소적 반응을 빈번히 발생시키는 다수의 분해 공정으로 처리된다. 이들 반응은 생성물 안정성, 안전성 및 효율에 장기간 영향을 미칠 수 있다. 이들 불안정성은, 제거되지 않으면, 0℃ 이하에서 생성물을 저장함으로써 지체되어, 생성물 저장 주기 동안 공급물의 가요성 및 이용가능성 측면에서 제조업자에게 거대한 잇점을 제공할 수 있다. 냉동은 종종 생물학적 생성물 저장에 있어서 가장 안전하고 가장 신뢰성 있는 방법이지만, 고유한 위험을 갖는다. 냉동은, 물이 결정화되는 경우, 아이스-액체 계면을 도입하고 용질을 동결-농축(냉동농축)시킴으로써 냉각 변성을 통해 단백질의 변형력을 유도할 수 있다.

냉동농축은, 용질 분자(단백질 제형에 통상 사용되는 슈크로즈, 염 및 기타 부형제 등의 소분자 또는 단백질 등의 거대분자)를 배제하는 냉동 동안 편평한, 비조절된 이동 아이스 전면(front)를 형성하는 공정이며, 이는 국소 pH 또는 이온성 농도 극단을 잠재적으로 유도할 수 있는 농도에서 기타 용질의 존재하에 단백질이 비교적 고농도로 발견될 수 있는 구역을 유도한다. 대부분의 단백질의 경우에, 이들 조건은 변성을 유도하고, 몇몇 경우에, 단백질 및 용질 침전을 유도할 수 있다. 완충제 염 및 기타 용질은 또한 이러한 조건하에 농축되기 때문에, 이들 성분은 냉동 매스의 구역에서 pH 및/또는 레독스 변화를 유도하기에 충분히 높은 농도에 도달할 수 있다. 냉동 동안 용액 중의 완충제 염 결정화(예: 인산염)의 결과로서 관찰되는 pH 이동은 몇몇 pH 단위에 걸칠 수 있고, 이는 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있다.

농축된 용질은 또한 용질이 전혀 냉동되지 않을 수 있는 정도까지 냉동점의 저하를 유도할 수 있고, 단백질은 이들 불리한 조건하에 용액 속에 존재한다. 종종, 신속한 냉각을 적용하여 단백질이 이들 바람직하지 않는 조건에 노출되는 시간을 감소시킬 수 있다. 그러나, 신속한 냉동은 큰 면적의 아이스-물 계면을 유도할 수 있는 반면, 느린 냉각은 보다 작은 계면 영역을 유도한다. 예를 들면, 1회의 냉동/해동 단계 동안 6개 모델 단백질의 신속한 냉각은 느린 냉각의 10회 주기보다 큰 변성 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌고, 이는 소수성 아이스 표면-유도된 변성의 큰 탈안정화 가능성을 입증한다.

본 발명의 수성 제형은 유리한 안정성 및 저장 특성을 갖는다. 수성 제형의 안정성은 저장 형태에 의존하지 않고, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 냉동, 동결건조 또는 분무 건조되는 제형을 포함한다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정할 수 있다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 수성 제형 중의 단백질은 액체 형태에서 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 12개월 이상 동안 안정하다. 상기 인용된 기간의 중간 범위, 예를 들면, 9개월 등의 범위도 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 수치의 조합을 사용하는 수치 범위도 포함되는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 제형은 실온(약 30℃) 또는 40℃에서 1개월 이상 동안 안정하고/하거나, 약 2 내지 8℃에서 1년 이상 동안 안정하거나, 보다 바람직하게는 약 2 내지 8℃에서 2년 이상 동안 안정하다. 추가로, 제형은 바람직하게는 제형의 냉동(예: -80℃까지) 및 해동 후(이하 "냉동/해동 주기"로서 언급된다)에 안정하다.

단백질의 안정성은 또한 생학물적 활성 상태를 유지하는 능력으로서 정의될 수 있다. 단백질은, 약제학적 제형 중의 단백질이 환자에게 투여시에 생물학적으로 활성인 경우에 약제학적 제형에서 "이의 생물학적 활성을 보유한다". 예를 들면, 항체의 생물학적 활성은 약제학적 제형에서 항체의 생물학적 활성이 약제학적 제형의 제조 시점에서 나타난 생물학적 활성의 약 30% 이내, 약 20% 또는 약 10%(분석 에러 이내) 이내인 경우에 보유된다(예를 들면, 항원 결합 분석으로 측정됨).

수성 제형에서 단백질의 안정성은 또한 제형 중의 단백질의 단량체, 응집물 또는 단편 또는 이의 조합물의 퍼센트로서 정의될 수 있다. 단백질은, 색 및/또는 선명도의 육안 검사 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정할 때 응집, 침전 및/또는 변성 징후를 실질적으로 나타내지 않는 경우에 제형에서 "이의 물리적 안정성을 보유한다". 본 발명의 한 가지 양태에서, 안정한 수성 제형은 약 10% 미만 및 바람직하게는 약 5% 미만의 단백질이 제형에서 응집물로서 존재하는 제형이다.

본 발명의 수성 제형의 또 다른 특징은, 몇몇 예에서, 물을 사용한 단백질의 정용여과가 제1 단백질 용액과 비교하여 개선된 점도 특성을 갖는 수성 제형을 생성하는 것이다(즉, 정용여과된 단백질 용액의 점도는 제1 단백질 용액과 비교하여 감소된다). 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 점도를 측정하는 다수의 방법을 본 발명의 다양한 양태에서 제형의 제조에 사용할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 운동학적 점도 데이타(cSt)는 모세관을 사용하여 생성할 수 있다. 다른 양태에서, 동적 점도 데이타는 단독으로 또는 다른 점도 데이타와 함께 언급된다. 동적 점도 데이타는 운동학적 점도 데이타를 밀도와 곱함으로써 생성할 수 있다.

한 가지 양태에서, 본 발명은 또한, 비유백광 등의 기타 바람직한 특성을 변화시키지 않으면서, 만니톨 등의 비이온성 부형제를 첨가함으로써 고농도 단백질-물 용액에서 요구되는 몰삼투농도 및/또는 점도 등의 특정한 특성을 조절하는 방법을 제공한다. 이와 같이, 단백질을 물에 전달하는 동안 또는 이후에 또는 정용여과 과정 동안 부형제를 첨가하는 경우, 예를 들면, 제형의 몰삼투농도 또는 점도 특성이 개선되는, 물에 기초하고 단백질의 농도가 높은 제형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 따라서, 본 발명의 범위 내에는 최종 저이온성 제형 내로 단백질을 전달하는 공정 동안 이러한 비이온성 부형제를 첨가하는 것이 포함된다. 제형의 목적하는 특성을 변경하기 위해 본 발명의 제형에 첨가될 수 있는 비이온성 부형제의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 만니톨, 소르비톨, 비이온성 계면활성제(예: 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 또는 폴리소르베이트 80), 슈크로즈, 트레할로즈, 파리노즈 및 말토즈가 포함된다.

본원의 제형은 또한 하나 이상의 단백질을 함유할 수 있다. 약제학적 제형과 관련하여, 추가의 상이한 단백질, 바람직하게는 다른 단백질에 악영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 단백질을 치료되는 특정 징후를 위해 필요에 따라 첨가할 수 있다. 예를 들면, 단일 제형에서 TNF 또는 IL-12에 결합하는 2개 이상의 항체를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 항-TNF 또는 항-IL-12 항체를 하나의 제형에서 조합할 수 있다. 이러한 단백질은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.

수성 제형에 포함될 수 있는 단백질의 예에는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 포함된다. 본 발명에 사용될 수 있는 상이한 종류의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 키메라 항체, 사람 항체, 사람화 항체 및 도메인 항체(dAb)가 포함된다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 사용된 항체는 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 항-IL-12 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 포함된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 추가의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 1D4.7 (항-IL-12/IL-23; Abbott Laboratories), 2.5(E)mg1 (항-IL-18; Abbott Laboratories), 13C5.5 (항-IL-13; Abbott Laboratories), J695 (항-IL-12; Abbott Laboratories), 아펠리모맙(Afelimomab) (Fab 2 항-TNF; Abbott Laboratories), 후미라(Humira) ((adalimumab) Abbott Laboratories), 캠파트(Campath) (Alemtuzumab), CEA-Scan 아르시누모맙(Arcitumomab) (fab 단편), 에르비툭스(Erbitux) (Cetuximab), 헤르셉틴(Herceptin) (Trastuzumab), 마이오신트(Myoscint) (Imciromab Pentetate), 프로스타신트(ProstaScint) (Capromab Pendetide), 레미케이드(Remicade) (Infliximab), 레오프로(ReoPro) (Abciximab), 리툭산(Rituxan) (Rituximab), 시물렉트(Simulect) (Basiliximab), 시나기스(Synagis) (Palivizumab), 베르루마(Verluma) (Nofetumomab), 졸레르(Xolair) (Omalizumab), 제나팍스(Zenapax) (Daclizumab), 제발린(Zevalin) (Ibritumomab Tiuxetan), 오르토클론(Orthoclone) 0KT3 (Muromonab-CD3), 파노렉스(Panorex) (Edrecolomab), 밀로타르그(Mylotarg) (Gemtuzumab ozogamicin), 골리무맙(golimumab) (Centocor), 심지아(Cimzia) (Certolizumab pegol), 솔리리스(Soliris) (Eculizumab), CNTO 1275 (ustekinumab), 벡티빅스(Vectibix) (panitumumab), 벡사르(Bexxar) (tositumomab and I¹³¹ tositumomab) 및 아바스틴 (bevacizumab)이 포함된다.

한 가지 대체 양태에서, 단백질은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 풀모자임(Pulmozyme) (Dornase alfa), 레그라넥스(Regranex) (Becaplermin), 악티바세(Activase) (Alteplase), 알두라자임(Aldurazyme) (Laronidase), 아메비브(Amevive) (Alefacept), 아라네스프(Aranesp) (Darbepoetin alfa), 베카플레르민(Becaplermin) 농축물, 베타세론(Betaseron) (Interferon beta-1b), 보톡스(BOTOX) (Botulinum Toxin Type A), 엘리텍(Elitek) (Rasburicase), 엘스파르(Elspar) (Asparaginase), 에포겐(Epogen) (Epoetin alfa), 엔브렐(Enbrel) (Etanercept), 파브라자임(Fabrazyme) (Agalsidase beta), 인페르겐(Infergen) (Interferon alfacon-1), 인트론(Intron) A (Interferon alfa-2a), 키네레트(Kineret) (Anakinra), 미오블록(MYOBLOC) (Botulinum Toxin Type B), 뉼라스타(Neulasta) (Pegfilgrastim), 뉴메가(Neumega) (Oprelvekin), 뉴포겐(Neupogen) (Filgrastim), 온탁(Ontak) (Denileukin diftitox), 페가시스(PEGASYS) (Peginterferon alfa-2a), 프로류킨(Proleukin) (Aldesleukin), 풀모자임(Pulmozyme) (Dornase alfa), 레비프(Rebif) (Interferon beta-1a), 레그라넥스(Regranex) (Becaplermin), 레타바스(Retavase) (Reteplase), 로페론(Roferon)-A (Interferon alfa-2), TNKase (Tenecteplase), 지그리스(Xigris) (Drotrecogin alfa), 아르칼리스트(Arcalyst) (Rilonacept), N플레이트(NPlate) (Romiplostim), 미르세라(Mircera) (methoxypolyethylene glycol-epoetin beta), 신리제(Cinryze) (C1 esterase inhibitor), 엘라프라세(Elaprase) (idursulfase), 미오자임(Myozyme) (alglucosidase alfa), 오렌시아(Orencia) (abatacept), 나글라자임(Naglazyme) (galsulfase), 케피반스(Kepivance) (palifermin) 및 악티뮨(Actimmune) (interferon gamma-1b)이 포함된다.

본원에 기재된 방법 및 조성물에 포함될 수 있는 단백질의 다른 예에는, 이의 재조합체 단백질을 포함하는 포유동물 단백질, 예를 들면, 성장 호르몬(사람 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬 포함); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; α-1-안티트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 류테인화 호르몬; 글루카곤; 응결 인자, 예를 들면, 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예들 들면, 단백질 C; 심방 나트륨뇨배설 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화인자, 예를 들면, 유로키나제 또는 조직-타입 플라스미노겐 활성화인자(t-PA); 봄바진; 트롬빈; 종양 괴사 인자-α 및 -β 엔케팔리나제; RANTES(정상 활성화시에 발현 및 분비된 T-세포 조절); 사람 마크로파지 염증 단백질(MIP-1-α); 혈청 알부민, 예를 들면, 사람 혈청 알부민; 뮬러 억제 물질; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀 결합 펩티드; DNase; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 호르몬 또는 성장 인자용 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티즘 인자; 향신경성 인자, 예를 들면, 골 유도된 향신경성 인자(BDNF), 향신경성-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들면, NGF-β; 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예를 들면, aFGF 및 bFGF; 상피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예를 들면, TGFα 및 TGF-β(TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-.β4 또는 TGF-β5 포함); 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I); 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예를 들면, CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴(EPO); 트롬보포이에틴(TPO); 골유도 인자; 면역독소; 골 형태유전학적 단백질(BMP); 인터페론, 예를 들면, 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자(CSFs), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨(ILs), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 부패 촉진 인자(DAF); 바이러스 항원, 예를 들면, AIDS 엔벨로프 부분; 수송 단백질, 귀환 수용체; 어드레씬; 조절 단백질; 면역부착인자; 항체; 및 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편 또는 변이체가 포함된다.

IV. 본 발명의 용도

본 발명의 제형은 치료학적(즉 생체내) 또는 시험관내 또는 정위치(in situ) 목적용 시약으로서 사용될 수 있다.

치료학적 용도

본 발명의 방법은 치료학적 사용에 유리한 특성을 갖는 수계 제형의 제조에 사용될 수 있다. 수성 제형은 환자의 장애를 치료하기 위한 약제학적 제형으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 제형은 치료학적 단백질이 치료에 적절한 모든 장애의 치료에 사용될 수 있다. "장애"는 단백질을 사용한 치료가 유익할 수 있는 임의의 상태이다. 여기에는 포유동물이 당해 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 상태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환이 포함된다. 항-TNFα 항체의 경우, 치료학적 유효량의 항체는 자가면역 질환, 예를 들면, 류마티스성 관절염, 위장 장애(예: 크론병), 척추관절병(예: 강직관절염) 또는 피부 장애(예: 건선)를 치료하기 위해 투여할 수 있다. 항-IL-12 항체의 경우, 치료학적 유효량의 항체는 신경 장애(예: 다발성 경화증) 또는 피부 장애(예: 건선)를 치료하기 위해 투여할 수 있다. 본 발명의 제형이 치료에 사용될 수 있는 장애의 다른 예에는, 유방암, 백혈병, 림파종 및 결장암을 포함하는 암이 포함된다.

용어 "환자"는 살아 있는 유기체, 예를 들면, 원핵 및 진핵생물을 포함하는 것으로 의도된다. 환자의 예에는 포유동물, 예를 들면, 사람, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 래빗, 랫트 및 유전자이식 비사람 동물이 포함된다. 본 발명의 특정한 양태에서, 환자는 사람이다.

용어 "치료"는 치료학적 치료 및 예방학적 수단 모두를 의미한다. 치료를 필요로 하는 것들은 장애가 예방되어야 하는 것들 뿐만 아니라 장애를 이미 갖는 것들이 포함된다.

수성 제형은, 공지된 투여 방법에 따라 치료를 필요로 하는, 사람을 포함하는 포유동물에 투여될 수 있다. 투여 방법의 예에는 정맥내 투여(예: 볼루스) 또는 소정 기간에 걸친 연속 주입, 근육내, 복강내, 척수내, 피하, 관절내, 활액내, 난포내, 피내, 경피내, 경구, 국소 또는 흡입 투여가 포함된다.

한 가지 양태에서, 수성 제형은 피하 투여에 의해 포유동물에게 투여된다. 이를 위해, 제형은 시린지, 및 주입 장치(예: Inject-ease 및 Genject 장치); 인젝터 펜(예: GenPen); 무침 장치(예: MediJector 및 Biojectorr 2000) 및 피하 패치 전달 시스템을 포함하는 기타 장치를 사용하여 주입할 수 있다. 한 가지 양태에서, 장치(예: 시린지, 자가주입 펜)는 크기 범위가 25G이거나 직경이 보다 작은 게이지를 갖는 니들을 함유한다. 한 가지 양태에서, 니들 게이지는 크기 범위가 25G 내지 33G(이의 중간 범위를 포함함, 예를 들면, 25sG, 26, 26sG, 27G, 28G, 29G, 30G, 31G, 32G 및 33G)이다. 바람직한 양태에서, 최저 니들 직경 및 적절한 길이는 제형의 점도 특성 및 본 발명의 제형을 전달하는데 사용된 장치에 따라 선택된다.

본 발명의 방법/조성물의 한 가지 잇점은 이들이 무침 장치를 사용하여 환자에게 단백질을 투여하는데 이상적일 수 있는 용액 중의 단백질의 거대 농축물을 제공한다는 점이다. 이러한 장치는, 니들에 의한 주입을 필요로 하지 않고서, 환자의 조직을 통해 단백질을 분산시킨다. 무침 장치의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, Biojectorr 2000 (Bioject Medical Technologies), Cool.Click (Bioject Medical Technologies), Iject (Bioject Medical Technologies), Vitajet 3, (Bioject Medical Technologies), Mhi500 (The Medical House PLC), Injex 30 (INJEX - Equidyne Systems), Injex 50 (INJEX - Equidyne Systems), Injex 100 (INJEX-Equidyne Systems), Jet Syringe (INJEX - Equidyne Systems), Jetinjector (Becton-Dickinson), J-Tip (National Medical Devices, Inc.), Medi-Jector VISION (Antares Pharma), MED-JET (MIT Canada, Inc.), DermoJet (Akra Dermojet), Sonoprep (Sontra Medical Corp.), PenJet (PenJet Corp.), MicroPor (Altea Therapeutics), Zeneo (Crossject Medical Technology), Mini-Ject (Valeritas Inc.), ImplaJect (Caretek Medical LTD), Intraject (Aradigm), 및 Serojet (Bioject Medical Technologies)가 포함된다.

또한, 본 발명에는 수성 제형을 하우징하는 전달 장치가 포함된다. 이러한 장치의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 시린지, 펜(예: 자가주입 펜), 임플란트, 흡입 장치, 무침 장치 및 패치가 포함된다. 자가주입 펜의 예는 2007년 6월 29일자로 출원된 미국 특허원 제11/824516호에 기재되어 있다.

본 발명은 또한 이러한 전달을 위해 상기 제형을 함유하는 흡입 및 흡입 장치에 의해 본 발명의 제형을 전달하는 방법을 제공한다. 한 가지 양태에서, 수성 제형은 연무기 또는 액체 흡입기를 사용한 흡입을 통해 환자에게 투여된다. 일반적으로, 연무기는 압축 공기를 사용하여 흡입용 에어로졸 또는 미스트로서 약제를 전달하고, 따라서 약물은 물에 가용성인 것이 요구된다. 연무기의 종류에는 제트 연무기(에어-제트 연무기 및 액체-제트 연무기) 및 초음파 연무기가 포함된다.

연무기의 예에는 Akita™ (Activaero GmbH) (참조: US2001037806, EP1258264)가 포함된다. Akita™은 환자의 호흡 패턴에 따라 완전한 제어를 제공하는 파리 LC 스타에 기초하는 탁상 연무기 흡입 시스템(Wt: 7.5 kg, BxWxH: 260 x 170 x 270)이다. 당해 장치는 폐 및 폐 주변으로 매우 빠른 전달 속도로 용액 중의 약물 500 mg을 10분 이내에 전달할 수 있다. 연무 입자의 65%는 5 마이크론 미만이고, 질량 중간 공기역학적 직경(MMAD)은 1.8 bar에서 3.8 마이크론이다. 최소 충전 용적은 2 mL이고, 최대 용적은 8 mL이다. 흡기 유량 (200 mL/초) 및 연무기 압력(0.3-1.8 bar)은 스마트 카드에 의해 설정된다. 당해 장치는 폐 기능 시험에 기초하여 각 환자에 대해 개별적으로 조절될 수 있다.

본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있는 연무기의 또 다른 예에는 Aeroneb® Go/Pro/Lab 연무기(AeroGen)가 포함된다. Aeroneb® 연무기는 OnQ™ 기술, 즉 1000개 이상의 정밀 형성된 테이퍼링 홀을 함유하는 독특한 돔 형상의 개구 플레이트로 구성되고 진동 부재에 의해 둘러싸여 있는 전자 마이크로펌프(직경 3/8 인치 및 웨이퍼-박막)에 기초한다. Aeroneb® Go는 가정용의 휴대용 장치이고, Aeroneb® Pro는 병원 및 외래 진료에서 사용하기 위한 재사용가능한 및 자가분리가능한 장치이며, Aeroneb® Lab은 임상전 에어로졸 연구 및 흡입 연구에 사용하기 위한 장치이다. 당해 시스템의 특징은 에어로졸 액적 크기의 최적화 및 맞춤화; 정확하게 조절된 액적 크기를 갖는 저속 에어로졸 전달; 호흡계 내에서 표적화 약물 전달의 보조; 투약 융통성; 용액 또는 현탁액 또는 범용 연무기에서 사용하기 위한 상업적으로 시판되는 용액에 고정 용량의 약물을 함유하는 범용 단일 투약 앰플의 순응; 연속 호흡-활성화 또는 프래그래밍; 및 다양한 환자 요구의 적합성(소아 및 초로 포함); 단일 또는 다중 환자의 사용을 포함한다.

Aerocurrent™ (AerovertRx corp)은 또한 본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있다(참조: WO2006006963). 이 연무기는 1회용의 예비 충전되거나 사용자 충전된 약물 카트리지를 특징으로 하는 휴대용의 진동 메쉬 연무기이다.

Staccato™ (Alexza Pharma)은 또한 본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있다(참조: WO03095012). Staccato™ 기술의 요지는 열적 분해 없이 약물의 기화이고, 이는 약물의 박막을 신속히 가열함으로써 달성된다. 0.5초 이내에, 약물은 고체 약물 필름을 증기로 전환시키기에 충분한 온도로 가열된다. 흡입기는 3개의 코어 성분: 가열 기재, 기재 상에 피복된 약물의 박막 및 환자가 흡입하는 기도로 이루어진다. 흡입기는 20-25 mg의 최대 전달 용량 및 1-2 마이크론 범위의 MMAD로 호흡 작동된다.

AERx® (Aradigm)는 또한 본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있다(참조: WO9848873, US5469750, US5509404, US5522385, US5694919, US5735263, US5855564). AERx®는 AERx® 스트립으로부터 제형을 방출하기 위해 피스톤 메카니즘을 사용하는 소형 배터리 작동되는 장치이다. 당해 장치는 환자의 호흡 공기 유량을 모니터링하고, 최적 호흡 패턴이 달성되는 경우에만 작동한다. 당해 장치는 방출된 용량으로서 용량의 약 60%를 전달하고 개체간 진동능이 25% 미만인 심폐 내로 방출된 용량의 50-70%를 전달할 수 있다.

본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있는 연무 장치의 또 다른 예는 Respimat® (Boehringer)를 포함한다. Respimat®는 장치 기재를 돌림으로써 주입되는 다중 용량 저장 시스템이고, 이는 스프링을 압축하고 계량된 용량의 제형을 약물 카트리지로부터 투약 챔버내로 전달한다. 당해 장치를 작동시키는 경우, 스프링은 이완되고, 이는 마이크로 피스톤을 투약 챔버 내로 강제로 유입시키고 유니블록을 통해 용액을 추진하며, 유니블록은 2개의 미세 배출 노즐 채널을 갖는 필터 구조로 이루어져 있다. Respimat®에 의해 생성된 MMAD는 2 ㎛이고, 당해 장치는 호흡기 질환의 치료에 종래 사용된 저용량 약물에 적합하다.

본 발명의 조성물은 또한 Collegium Nebulizer™ (Collegium Pharma)를 사용하여 전달할 수 있으며, 이는 막 위에 침착된 약물로 구성된 연무 시스템이다. 용량 형태는 재구성 용매에 의한 재구성 후에 Collegium Nebulizer를 사용하여 경구 또는 비내 흡입을 통해 투여된다.

본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있는 연무기 장치의 또 다른 예에는 Inspiration® 626 (Respironics)이 포함된다. 상기 626은 가정용 압축기 기재 연무기이다. 상기 626은 크기 0.5 내지 5마이크론의 입자를 전달한다.

본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있는 연무기는 Adaptive Aerosol Delivery® 기술(Respironics)을 포함할 수 있으며, 이는 환자의 연령, 사이즈 또는 호흡 패턴에 무관하게 정확하고 재생가능한 흡입된 약물 용량을 환자에게 전달한다. AAD® 시스템은 전자부품 및 센서를 핸드피스 내에 도입하여, 호흡 동안 압력 변화를 검출함으로써 환자의 호흡 패턴을 모니터링한다. 센서는 제1 흡식 부분 동안 약제의 에어로졸 전달의 펄스 시점을 측정한다. 치료 전체에 걸쳐, 센서는 이전 3회 호흡을 모니터링하고, 환자의 호흡 패턴에 적용한다. AAD® 시스템은 환자가 마우스피스를 통해 호흡하는 경우에만 약제를 전달하기 때문에, 이들 장치는 약제의 낭비 없이 환자가 치료시에 휴식을 취하게 한다. AAD® 시스템 연무기의 예에는 HaloLite® AAD®, ProDose® AAD® 및 I-Neb® AAD®가 포함된다.

HaloLite® Adaptive Aerosol Delivery (AAD)® (Respironics)은 휴대용 컴프레서에 의해 동력 전달된 공기 에어로졸화 시스템이다. AAD® 기술은 환자의 호흡 패턴(전형적으로 10 밀리초마다)을 모니터링하며, 사용된 시스템에 따라 에어로졸화 약물의 펄스를 특정한 흡입 부분으로 방출하거나 "기립 에어로졸 구름"으로부터 흡입 동안 취해진 용량을 계산한다(참조: 본원에 참조로서 인용되는 EP 0910421).

ProDos AAD® (Respironics)는 "ProDose Disc™" 시스템(Respironics)에 의해 제어되는 연무 시스템이다. ProDos AAD®는 휴대용 컴프레서에 의해 동력 전달된 공기 에어로졸 시스템이고, 여기서 전달되는 용량은, 그 중에서도 전달 용량을 시스템에 지시하는, 당해 시스템에 삽입된 마이크로칩 함유 디스크에 의해 제어된다. ProDose Disc™은 마이크로칩을 함유하는 플라스틱 디스크이며, 이는 ProDose AAD® 시스템에 삽입되어 있고 전달되어 투여되는 것, 및 약물 배치 코드 및 만료일을 포함하는 다양한 제어 데이타와 함께 전달될 수 있는 용량의 회수에 관해 지시한다(참조: 본원에 참조로서 인용되는 EP 1245244). Promixin®은, 특히 낭성 섬유증에서 슈도모나스 에루기노사 폐 감염을 처치하기 위해 Prodose AAD®을 통해 전달될 수 있다. Promixin®은 사용 전에 재구성되는 연무용 분말제로서 공급된다.

I-neb AAD®는, 분리된 컴프레서("I-Neb") 없이, 정확하고 재생가능한 약물 용량을 환자의 호흡 패턴 내로 전달하는 포켓용 AAD® 시스템이다. I-neb AAD®는 전자적 메쉬계 에어로졸화 기술(Omron) 및 AAD® 기술의 조합에 기초하는 소형화 AAD® 흡입기로서 환자의 호흡 패턴 내로의 투약을 제어한다. 당해 시스템은 대략 휴대폰 크기 및 8온스 미만의 중량이다. I-neb AAD®는 Ventavis® (iloprost) (CoTherix / Schering AG)의 전달에 사용된다.

본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있는 연무기의 또 다른 예는 Aria™ (Chrysalis)이다. Aria는 모세관 에어로졸 생성 시스템에 기초한다. 당해 에어로졸은 약물 제형을 소형의 전기적 가열 모세관을 통해 펌핑함으로써 형성된다. 모세관을 빠져나오면, 제형은 주위 공기에 의해 신속하게 냉각되어 0.5-2.0 ㎛ 범위의 MMAD로 에어로졸을 생성한다.

또한, TouchSpray™ 연무기 (Odem)를 사용하여 본 발명의 조성물을 전달할 수 있다. TouchSpray™ 연무기는 천공 막을 사용하는 포켓용 장치이고, 이는 저장기 유체와의 접촉시에 초음파 주파수를 진동시켜 에어로졸 구름을 생성한다. 진동 작용은 막 속의 홀을 통해 유체 제트를 배출하여, 제트를 약물 구름으로 분쇄한다. 액적의 크기는 약물 용액의 표면 화학 및 조성 뿐만 아니라 홀의 형상/크기에 의해 제어된다. 이 장치는 계량 용량의 83%를 심폐로 전달하는 것으로 보고되어 있다. TouchSpray™ 연무기의 상세는 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제6659364호에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있는 추가의 연무기는, 환자가 흡식할 때에 에어로졸 배출량을 최대화하고 환자가 호식할 때에 에어로졸 배출량을 최소화하는 휴대용 장치로서 2개의 1방향 밸브를 사용하는 연무기를 포함한다(참조: PARI nebulizers (PARI GmbH)). 배플은 최적 크기의 입자가 연무기에서 배출되도록 한다. 이 결과는 폐로의 개선된 약물 전달을 유도하는 호흡가능한 범위의 입자 비율이 높다. 이러한 연무기는 특정한 환자 모집단, 예를 들면, 3세 미만의 환자(PARI BABY™) 및 노령 환자용 연무기(PARI LC PLUS® 및 PARI LC STAR®)용으로 설계될 수 있다.

본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있는 추가의 연무기는 e-Flow® 연무기(PARI GmbH)이고, 이는 현탁액 또는 콜로이드 분산액 뿐만 아니라 약물 용액을 에어로졸화하기 위해 진동 막 기술을 이용한다(TouchSpray™; ODEM (United Kingdom)). e-Flow® 연무기는 0.5 ml 내지 5 ml의 유체 용적을 취급할 수 있고, 활성 약물의 밀도가 매우 높고 정확하게 규정된 액적 크기를 가지며 최소 시간 내에 전달된 호흡가능한 액적의 비율이 높은 에어로졸을 생성할 수 있다. e-Flow® 연무기를 사용하여 전달되는 약물은 아즈트레오남 및 리도카인을 포함한다. e-Flow® 연무기에 관한 추가의 상세는 본원에서 참조로서 인용되는 미국 특허 US 6962151에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있는 추가의 연무기는 Microair® 전자 연무기(Omron) 및 Mystic™ 연무기(Ventaira)이다. Microair® 연무기는 매우 소형이고, 용액 약제를 효율적으로 전달하기 위해 진동 메쉬 기술을 사용한다. Microair 장치는 7 mL 용량을 갖고, 5 마이크론 크기의 약물 입자 MMAD를 생성한다. Microair® 연무기에 관한 추가의 상세는 본원에 참조로서 인용되는 미국 공개특허 제2004045547호를 참조한다. Mystic™ 연무기는 강력한 전계를 사용하여 액체를 거의 단분산된 하전 입자의 분무로 분쇄한다. Mystic™ 시스템은 격납 장치, 용량 계량 시스템, 에어로졸 생성 노즐 및 변압기를 포함하고, 이는 다용량 또는 단위 용량 전달 옵션을 함께 제공한다. Mystic™ 장치는 호흡 활성화되고, Corus 1030™ (리도카인 HCl), Resmycin® (독소루비신 하이드로클로라이드), Acuair (플루티카존 프로피오네이트), ViroPharm사의 NCE, 및 Pfizer사의 NCE와 함께 사용된다. Mystic™ 연무기에 대한 추가의 상세는 본원에서 참조로서 인용되는 미국 특허 제6397838호에 기재되어 있다.

본 발명의 제형의 폐 전달을 위한 추가의 방법은 본원에서 참조로서 인용되는 미국 특허원 제12/217,972호에 제공되어 있다.

단백질의 적절한 용량("치료학적 유효량")은, 예를 들면, 치료되는 상태, 상태의 중중도 및 경과, 단백질이 예방적 또는 치료적 목적으로 환자에게 투여되는지의 여부, 선행 치료, 환자의 병력 및 단백질에 대한 반응, 사용된 단백질의 종류 및 주치의의 판단에 따라 달라질 수 있다. 단백질은 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여되고, 진단 이후에 언제라도 환자에게 투여될 수 있다. 단백질은 단독 치료로서 또는 당해 상태의 치료에 유용한 다른 약물 또는 요법과 병행하여 투여될 수 있다.

본 발명의 제형은 고농도 단백질과 종종 관련되는 단백질 응집에 대한 통상의 문제를 극복하고, 따라서 고도의 치료학적 단백질을 환자에게 투여할 수 있는 신규 수단을 제공한다. 본 발명의 고농도 제형은 표준 치료용 제형과 동등하거나 이보다 낮은 용적을 사용하여 환자에게 투여될 수 있다. 치료학적 단백질에 대한 표준 처방은 단백질 제조업자가 제공한 라벨 위에 기재되어 있다. 예를 들면, 제조업자가 제공한 라벨에 따르면, 인플릭시맙은 동결건조 단백질을 10 mg/mL의 농도로 재구성함으로써 류마티스성 관절염을 치료하기 위해 투여된다. 본 발명의 제형은 고농도의 인플릭시맙을 포함할 수 있고, 여기서 고농도는 표준 10 mg/mL보다 높은 농도를 포함할 것이다. 또 다른 예에서, 제조업자가 제공한 라벨에 따르면, 졸레르(오말리주맙)는 동결건조 단백질을 125 mg/mL의 농도로 재구성함으로써 천식을 치료하기 위해 투여된다. 이러한 예에서, 본 발명의 고농도 제형은 표준 125 mg/mL보다 높은 항체 오말리주맙의 농도를 포함할 것이다.

따라서, 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은, 공지된 표준 제형 중의 치료학적 단백질의 농도보다 큰, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상, 약 110% 이상, 약 120% 이상, 약 130% 이상, 약 140% 이상, 약 150% 이상, 약 175% 이상, 약 200% 이상, 약 225% 이상, 약 250% 이상, 약 275% 이상, 약 300% 이상, 약 325% 이상, 약 350% 이상, 약 375% 이상, 약 400% 이상 등인 높은 농도를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 제형은, 공지된 표준 제형 중의 치료학적 단백질의 농도보다 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상 큰 높은 농도를 포함한다.

수성 제형의 특징은 치료학적 용도를 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 항체 제형의 점도는 정용여과 매질로서 부형제 없이 물을 사용하여 항체 단백질 용액을 정용여과함으로써 개선시킬 수 있다. 섹션 II에 기재된 바와 같이, 점도를 개선시키는 부형제는, 부형제의 최종 농도가 공지되어 있고 제형의 특정한 특징이 명시된 용도를 개선하도록, 수성 제형에 다시 첨가할 수 있다. 예를 들면, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 약제학적 제형의 목적하는 점도가 제형의 전달 방식, 예를 들면, 주입, 흡입, 피부 흡수 등에 따라 달라질 수 있음을 인지할 것이다. 종종, 목적하는 점도는 제형을 수용하는 환자의 편안함과 치료 효과에 요구되는 제형 중의 단백질의 용량이 균형을 이루는 것이다. 예를 들면, 주입되는 제형에 대한 일반적으로 허용되는 점도 수준은 100 mPas 미만, 바람직하게는 75 mPas 미만, 보다 바람직하게는 50 mPas 미만의 점도 수준이다. 이와 같이, 수성 제형의 점도는 치료학적 용도에 허용될 수 있거나, 목적하는 특성을 개선시키기 위해 부형제(들)의 첨가를 필요로 할 수도 있다.

한 가지 양태에서, 본 발명은 물 및 사람 TNFα 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 수성 제형을 제공하고, 여기서, 당해 제형은 치료제로서 사용하기에 유리한 점도, 예를 들면, 단백질 농도가 약 175 mg/mL인 경우에 8℃에서 40 cP 미만 및 25℃에서 25 cP 미만의 낮은 점도를 갖는다. 한 가지 양태에서, 점도가 개선된 제형 중의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 농도는 약 50 mg/mL 이상이다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 점도 범위가 약 1 내지 약 2 mPas이다.

비치료학적 용도

본 발명의 수성 제형은 또한 비치료학적 용도, 즉 시험관내 목적에 사용될 수 있다.

본원에 기재된 수성 제형은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 게놈, 프로테오믹, 생물정보학, 세포 배양, 식물 생물학 및 세포 생물학을 포함하여, 의학 및 생명공학에서 진단학적 또는 실험적 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 수성 제형은 표지 및 검출 방법에서 분자 프로브로서 필요한 단백질을 제공하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 제형의 추가의 용도는 제조 목적을 위한 세포 성장 및 단백질 생산을 포함하여 세포 배양 시약용 보충물을 제공하는 것이다.

본원에 기재된 수성 제형은, 당해 제형 중의 부형제가 실험 환경과 어떻게 반응하는지, 예를 들면, 프로토콜에 사용되는 또 다른 시약을 간섭하는지에 관한 중요성이 작은 프로토콜에 사용할 수 있다. 또 다른 예에서, 고농도의 단백질을 함유하는 수성 제형은 실험실 용도의 시약으로서 사용할 수 있다. 이러한 고농축 형태의 단백질은 실험실 실험의 현재의 범위를 확장시킬 것이다.

본 발명의 제형의 또 다른 대체 용도는 식품 제품에 대한 첨가제를 제공하는 것이다. 본 발명의 수성 제형은 실질적으로 물과 단백질로 이루어져 있기 때문에, 당해 제형은 고농도의 목적하는 단백질, 예를 들면, 영약 보충제를 식품 항목에 전달하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 수성 제형은, 사람의 소비에 적합하지 않을 수 있는 안정성/용해도가 요구되는 부형제에 대한 염려 없이, 고농도의 단백질을 물에 제공한다. 예를 들면, 유장- 및 대두-유도된 단백질은, 이들 단백질이 지방 입맛 및 질감을 흉내내는 능력을 갖기 때문에 식품에 다양성을 제공한다. 이와 같이, 유장- 및 대두-유도된 단백질은 식품에 첨가되어, 만족감을 희생시키지 않고서, 전체 지방 함량을 감소시킬 수 있다. 따라서, 적합한 양의 유장- 및 대두-유도된 단백질을 포함하는 수성 제형은 식품 제품을 보충하기 위해 제형화되어 사용될 수 있다.

제조 물품

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 수성 제형을 함유하고 이의 사용 지침서를 제공하는 제조 물품이 제공된다. 당해 제조 물품을 용기를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알(예: 이중 챔버 바이알), 시린지(예: 이중 챔버 시린지), 시린지를 함유하는 자가주입 펜 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리, 플라스틱 또는 폴리카보네이트 등의 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기는 수성 제형 및 라벨을 결합하여 수용하고, 용기는 사용 지침서를 표시할 수도 있다. 예를 들면, 라벨은, 당해 제형이 피하 투여에 유용하거나 이에 의도됨을 나타낼 수 있다. 제형을 수용하는 용기는 다용도 바이알일 수도 있고, 이는 수성 제형의 반복 투여(예: 2 내지 6회 투여)가 가능하다. 제조 물품은 추가로 제2 용기를 포함할 수 있다. 제조 물품은, 기타완충제, 희석제, 필터, 니들, 시린지 및 사용자 지침을 갖는 포장 삽입체를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 재료를 추가로 포함할 수 있다.

본원 전체에 걸쳐 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 공개 특허원의 내용은 본원에서 참조로서 인용된다.

본 발명은 제한적인 것으로 해석되지 않아야 하는 다음 실시예에 의해 추가로 예시된다.

실시예

다음 실시예는 용액 매질로서 물을 포함하는 수성 제형에 관한 실험을 기술한다. 일부 예에서, 소수 자리는 유럽 십진 기수법을 사용하여 기술된다는 것을 주의해야 한다. 예를 들면, 표 31에서 수 "0,296"은 "0.296"와 동의어이다.

실시예 1: 아달리무맙 및 J695를 사용하는 정용여과/한외여과

재료 및 방법

아달리무맙 및 J695를 순수한 물을 사용하여 정용여과하였다. 순수한 물로 5배 이상 용적 교환 후, 단백질 용액을 최종 표적 농도 150mg/mL 이상으로 한외여과하였다. 몰삼투농도, 육안 검사 및 단백질 농도 측정(OD280)을 수행하여 DF/UF 처리 동안 단백질의 상황을 모니터하였다.

크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 출발 제형, 예를 들면, 약물 물질(DS) 출발 물질 및 단백질 표준과 비교하여 각각 최종 DF/UF 생성물에서의 단백질 안정성을 특성화하였다. 약물 물질 또는 "DS"는 활성 약제학적 성분을 나타내고, 일반적으로 통상의 벌크 용액 중의 치료 단백질을 의미한다.

■ 아달리무맙 약물 물질, (아달리무맙 흡광 계수 280㎚: 1.39mL/mg cm). 약물 물질은 폴리소르베이트 80을 함유하지 않는다. DS 조성: 5.57mM 일염기성 인산나트륨, 8.69mM 이염기성 인산나트륨, 106.69mM 염화나트륨, 1.07mM 나트륨 시트레이트, 6.45mM 시트르산, 66.68mM 만니톨.

■ 동적 광 산란(DLS) 측정용으로 사용된 아달리무맙 용액: 교환 매질로서 순수한 물을 사용하여 정용여과된 아달리무맙 용액을, 상기 아달리무맙 용액을 각각 밀리-Q 물 및 부형제 스톡 용액(밀리-Q 물에 용해된 부형제)으로 희석시켜, 1mg/mL 농도로 조정하였다.

■ J695 약물 물질, (J695 흡광 계수 280㎚: 1.42mL/mg cm). DS 조성: 히스티딘, 메티오닌, 만니톨, pH 5.8, 및 폴리소르베이트 80.

■ 500mL 저장기가 구비된 밀리포어 랩스케일(Millipore Labscale™) 탄젠트 유동 여과(Tangential Flow Filtration; TFF). 랩스케일 TFF 시스템을 밀리포어 작동 지침에 따라 주위 온도에서 불연속 방식으로 작동시켰다. 교반기 속도는 약 1.5로 설정하고, 펌프 속도는 약 3으로 설정하였다. 표적 유입구 및 배출구 압력은 각각 15mm psig 및 약 50mm psig였다.

■ Omega™ PES 막, 30kDa 컷-오프가 구비된 미니메이트(Minimate™) 탄젠트 유동 여과 캡슐. 캡슐을 0.1N NaOH로 30분 동안, 밀리-Q 물로 추가로 30분 동안 세정하였다.

■ pH 프로브 Pt1000, 번호 6.0258.010이 구비되고, 완충제 교정 용액 VWR, pH 4.00 완충제 용액 레드, 카탈로그 번호 34170-127 및 pH 7.00 완충제 용액 옐로우, 카탈로그 번호 34170-130로 교정된 780 pH 측정기, 메트롬(Metrohm).

■ 고정된 캐리 50 셀이 구비된 배리언(Varian) 50 Bio UV 가시 분광광도계, AI 9655를 단백질 농도 측정용으로 사용하였다(280㎚ 파장). 100μL 단백질 샘플을 물(HPLC용 밀리-Q 물)로 DF/UF 후 모든 J695 샘플 및 아달리무맙 용액의 단백질 농도 측정을 위해 최종 용적 50.00mL로 희석시켰다. 모든 기타 아달리무맙 샘플의 농도는 40μL 샘플 용액을 1960μL 밀리-Q 물로 희석시켜 모니터하였다. 1회용 UV 큐벳, 1.5mL, 세미-마이크로, 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)를 농도 측정용으로 사용하여, 밀리-Q 물을 OD 280 블랭크로서 사용하였다.

■ HPLC 등급용 밀리-Q 물을 DF/UF 매질로서 사용하였다.

■ 맬버른 제타사이저 나노(Malvern Zetasizer nano) ZS, 장치 번호 AI 9494를 DLS 측정용으로 사용하였다.

■ 헬마 정밀 셀, 수프라실, 타입 번호 105.251-QS, 광 경로 3mm, 중심 8.5를 DLS 측정용으로 사용하였다(75μL 샘플, 맬버른 마스터사이저 나노 ZS, 항목 번호 AI 9494로 충전됨).

■ 독일 베를린의 크나우어 삼투압계 자동(Knauer Osmometer Automatic), 장치 번호 83963을 몰삼투농도 측정(400 mOsmol/kg NaCl 교정 용액, Art. No. Y 1241로 교정됨, 독일 베를린 소재의 헤르베르트 크나우어 게엠베하(Herbert Knauer GmbH))용으로 사용하였다.

■ 미국 뉴욕 코닝사의 250mL 코닝 셀 배양 플라스크, 75cm², 폴리스티렌, 멸균성을 DF/UF 작업 후 단백질 용액 저장용으로 사용하였다.

■ 염화나트륨: J.T. 베이커를 2M NaCl 스톡 용액을 제조하는데 사용하였다. 스톡 용액을 사용하여 각종 농도의 NaCl(10, 20, 30 및 50mM)로 순수한 물 중에서 1mg/mL 아달리무맙 용액을 제조하였다.

■ 미주리주 63178 세인트 루이스 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)의 D-소르비톨을 200mg/mL 소르비톨 스톡 용액을 제조하는데 사용하였다. 스톡 용액을 사용하여 각종 농도의 소르비톨(10, 20, 30 및 40mg/mL)로 순수한 물 중에서 1mg/mL 아달리무맙 용액을 제조하였다.

HPLC 방법

■ 아달리무맙, SEC 분석: 세파덱스(Sephadex) 200 컬럼(Pharmacia 카탈로그 번호 175175-01, S/N 0504057). 이동상 20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨, pH 7.5, 0.5mL/분 유량, 주위 온도, 검출 UV 214㎚ 및 280㎚. 각 샘플을 밀리-Q 물, 샘플 주입 적재 50㎍(중복 주입)으로 1.0mg/mL로 희석시켰다.

■ 아달리무맙, IEC 분석: 상응하는 가드 컬럼(p/n 054994)과 함께 디오넥스, 프로팍(Dionex, Propac) WCX-10 컬럼(p/n 054993). 분리 조건: 이동상 A: 10mM 인산나트륨, pH 7.5; 이동상 B 10mM 인산나트륨, 500mM 염화나트륨, pH 5.5. 1.0mL/분 유량, 주위 온도. 각 샘플을 밀리-Q 물, 샘플 주입 적재 100㎍, 중복 주입으로 1.0mg/mL로 희석시켰다.

■ J695, SEC 분석: 토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience) G3000swxl, 7.8mm x 30 cm, 5㎛(카탈로그 번호 08541). 이동상 211mM Na₂SO₄/92mM Na₂HPO₄, pH 7.0. 0.3mL/분 유량, 주위 온도, 검출 UV 214㎚ 및 280㎚. 각 샘플을 밀리-Q 물, 샘플 주입 적재 50㎍(중복 주입)으로 2.5mg/mL로 희석시켰다.

■ J695, IEC 분석: 상응하는 가드 컬럼(p/n 054994)와 함께 디오넥스, 프로팍 WCX-10 컬럼(p/n 054993). 분리 조건: 이동상 A: 10mM Na₂HPO₄, pH 6.0; 이동상 B 10mM Na₂HPO₄, 500mM NaCl, pH 6.0. 1.0mL/분 유량, 35℃ 온도. 각 샘플을 밀리-Q 물, 샘플 주입 적재 100㎍으로 1.0mg/mL로 희석시켰다. J695 참조 기준 2900 IBF를 비교용으로서 3회 작동시키고, 분석 증명서로부터의 농도를 기준으로 하여 밀리-Q 물로 1mg/ml로 희석시켰다.

단백질 농도의 계산

계산식:

상기 식에서,

ε는 흡광 계수이고,

c는 농도이고,

d는 광이 통과하는 큐벳의 길이이고,

E는 흡광도이고,

I₀는 초기 광 강도이고,

I는 샘플을 통해 통과 후의 광 강도이다.

1.1: 아달리무맙의 DF/UF 처리

DF/UF 실험을 DF/UF 장치 제조업자의 표준 작업 절차에 따라 수행한다. 예를 들면, 밀리포어 랩스케일 TFF 시스템에 500mL 저장기를 구비시키고, 시스템을 밀리포어 작업 지침에 따라 주위 온도에서 불연속 방식으로 작동시켰다. 교반기 속도는 약 1.5로 설정하고, 펌프 속도는 약 3으로 설정하였다. 표적 유입구 및 배출구 압력은 각각 15mm psig 및 약 50mm psig이고, 표적 압력을 모니터하여 이들이 초과하지 않음을 보장하였다.

Omega™ PES 막(Pall Corp., Port Washington, NY), 30kDa MWCO가 구비된 미니메이트 탄젠트 유동 여과 캡슐을 사용하였다. 캡슐을 사용 전에 0.1N NaOH로 30분 동안 세정하고, 추가로 30분 동안 밀리-Q 물로 세정하였다.

약 500mL의 아달리무맙 용액을 TFF 저장기에 위치시키고, DF/UF 처리를 불연속 방식으로 개시하였다. 표 1은 DF/UF 공정을 특성화하는 공정관리(In-Process-Control; IPC) 데이타에 대한 상세를 제공한다.

표 1

아달리무맙 DF/UF 처리에 대한 개관

"-"로 표시된 필드는 그 단계에서 어떤 IPC 샘플도 수집하지 않았음을 지시한다.

DF/UF 처리를 약 5배 용적 교환(1용적 교환은 약 250mL 정용여과 매질을 차지한다) 후에 중단하였다. 이상적 100% 부형제 막 투과를 가정하여, 적용된 실험 파라미터에 의해 도달된 이론상 최종 부형제 농도는 C_i(250/500)⁵ = 0.03125*Ci이고, 여기서 Ci는 초기 농도이다. 따라서, 최대 부형제 감소율은 96.875%였다(일정한 용적 정용여과가 사용될 경우, 5회 정용여과 용적에 의한 이론상 부형제 감소는 C_i e^-5 = 0.00674, 즉 약 99.3% 최대 부형제 감소율일 것이다). 아달리무맙 용액을 TFF 시스템으로부터 250mL 세포 배양 플라스크로 배출하였다(TFF 시스템의 저용적 세정을 WFI를 사용하여 수행하여 175.05mg/mL 농도를 수득하고; 세정 없이, 잔류물 농도는 213.87mg/mL이었다). 샘플을 pH, 몰삼투농도 및 아달리무맙 농도 측정을 위해 수집하였다. 추가로, 샘플을 SEC 및 IEC에 의한 특성화를 위해 수집하였다. 각각 DF/UF 처리 전후의 아달리무맙 용액의 특정한 파라미터는 표 2에 제시한다.

표 2

아달리무맙 용액에 대한 DF/UF 처리의 영향

* 샘플은 SEC 및 IEC를 통해 분석하기 전에 하나의 냉동/해동 단계(-80℃/25℃)에 적용하였다.

DF/UF 처리 도중, 아달리무맙 농도는 210mg/mL를 초과하였다. 실험 전반에 걸쳐, 단백질 용액은 투명하게 잔류하고, 아달리무맙 용해도 한계를 지시하는 용액 흐림 또는 단백질 침전은 전혀 관찰되지 않았다. 원래의 아달리무맙 DS 용액(약 55mg/mL)에 비해, DF/UF 교환 매질로서 순수한 물을 사용하여 정용여과된 아달리무맙 용액은 단백질 농도의 3배 이상 증가(약 175mg/mL)에도 불구하고, 낮은 유백광을 나타냈다.

1.2: 크로마토그래피를 통한 아달리무맙 특성화

도 1은 DF/UF 처리 전(중간 선) 및 후(상부 선)의 아달리무맙 약물 표준 용액과 비교한 아달리무맙 참조 기준(아달리무맙 표준(하부 선))의 SEC 크로마토그램을 도시한다. 모든 샘플이 분석 전에 -80℃에서 냉동되었음을 주시한다.

표 3은 또한 IEC 크로마토그램 데이타를 함유한다(모든 샘플이 분석 전에 -80℃에서 냉동되었음을 주시한다).

표 3

각종 아달리무맙 샘플의 IEC 데이타

1.3: 아달리무맙 수력학적 직경(D_h)에 대한 부형제의 영향

동적 광 산란(DLS) 측정법으로 측정된 J695의 수력학적 직경은 J695를 순수한 물 중에서 제형화할 경우 현저하게 감소되었다는 것이 이미 측정되었다. WFI 중의 J695의 D_h는 면역글로불린에 대해 기대된 값보다 훨씬 미만인 약 3㎚였다. 소량의 이온성 NaCl 첨가시, D_h 값은 약 10㎚로 증가되었다(NaCl 농도와 무관). 비이온성 만니톨을 첨가하면 J695 용액 몰삼투농도를 증가시키지만, J695 D_h에는 아무런 영향을 미치지 않았다.

상기 DF/UF 절차에 따라 처리된 아달리무맙의 수력학적 직경에 대한 부형제의 영향을 평가하기 위해, DF/UF 실험으로부터의 아달리무맙 용액을 사용하여 각각 상이한 수준의 NaCl(0-50mM) 및 소르비톨(0-40mg/mL)을 사용하여 아달리무맙 용액을 순수한 물 중에서 제형화하였다. 아달리무맙 단량체의 D_h에 대한 소르비톨(비이온성 부형제) 및 NaCl(이온성 부형제) 농도의 영향을 도 2에 도시한다.

순수한 물 중의 아달리무맙 단량체의 수력학적 직경은 2.65㎚였다. 염 및 비이온성 부형제에 대한 아달리무맙 D_h 반응은 이전에 제시된 J695 반응과 동일하였다. 아달리무맙 D_h는 실질적으로 소르비톨의 존재에 의해 영향을 받지 않았다. 저농도의 NaCl은 단량체 수력학적 직경을 기대 수준인 약 11㎚로 증가시켰다. 이러한 발견은 동적 광 산란으로 측정된 단백질 수력학적 직경은 이온성 부형제의 존재에 의해 결정적으로 영향을 받는다는 것을 입증한다. 이온성 부형제의 부재는 또한 용액 점도와 결부된다.

이러한 발견은 고농축 단백질 용액에 대해 수력학적 직경이 작을수록, 공간 용적 단백질이 적게 차지한다는 의미를 갖는다. 고농도 시나리오에서, DF/UF 교환 매질로서 물을 사용하여 제조된 단백질 용액의 점도는 상당량의 이온성 완충제 부형제를 함유하는 통상적 단백질 제형의 점도보다 실질적으로 낮다. 아달리무맙 데이타가 이를 확인하는데, 이는 주입용수 중의 200mg/mL 아달리무맙 용액의 점도가 pH에 무관하게(예: pH 4, pH 5 및 pH 6) 50mPas 훨씬 미만인 것으로 밝혀졌기 때문이다. D_h에 대한 pH의 영향에 대한 추가의 데이타는 이하 실시예 17에서 찾을 수 있다.

총괄하면, 이들 발견은 고농도 단백질 제형 활성에 유용하고, 여기서 점도 관련 제조 및 투여/전달 문제는 익히 공지되어 있다. 또한, 이들 발견은 최종 약물 생성물의 몰삼투농도를 각각 단백질 D_h 및 용액 점도를 증가시키지 않고 비이온성 부형제, 예를 들면, 당 또는 당 알콜을 사용하여 목적한 대로 조정할 수 있음을 보여준다.

1.4: J695(항-IL12 항체)의 DF/UF 처리

약 200mL의 J695 용액을 1M 인산을 사용하여 pH 4.4로 조정하고, TFF 저장기에 충전하였다(pH 조정하여 J695 단량체의 포지티브 제타-전위를 보장하고, 따라서 데이타에 대한 비하전된 단백질 단량체의 잠재적 영향을 피하였다). 이어서, 300mL의 밀리-Q 물을 TFF 저장기에 첨가하고, DF/UF 처리를 불연속 방식으로 개시하였다. 250mL 저장기 용적, 250mL의 밀리-Q 물을 첨가하고, DF/UF 처리를 다시 개시하였다. 총 5회 용적 교환 단계를 수행(1회 용적 교환은 약 250mL를 차지한다)한 후, DF/UF 처리를 중단하였다.

이상적 100% 부형제 막 투과를 가정하여, 적용된 실험 파라미터에 의해 도달된 이론상 최종 부형제 농도는 Ci(250/500)⁵ = 0.03125*Ci이고, 여기서 Ci는 초기 농도이다. 따라서, 최대 부형제 감소율은 96.875%였다(일정한 용적 정용여과가 사용될 경우, 5회 정용여과 용적에 의한 이론상 부형제 감소는 Ci e^-5 = 0.00674, 즉 약 99.3% 최대 부형제 감소율일 것이다). J695 용액을 TFF 시스템으로부터 250mL 세포 배양 플라스크로 배출하였다(TFF 시스템을 세정하지 않았다). 샘플을 pH, 몰삼투농도 및 J965 농도 측정을 위해 수집하였다. 추가로, 샘플을 SEC 및 IEC에 의한 특성화를 위해 수집하였다. 각각 DF/UF 처리 전후의 J695 용액의 특징적 파라미터는 표 4에 제시한다.

표 4

J695 용액에 대한 DF/UF 처리의 영향

아달리무맙의 경우와 같이, J695에 대한 DF/UF 실험은 DF/UF 작업에서 교환 매질로서 순수한 물을 사용하여 J695를 처리하고 제형화하는 주요 가능성을 구체화한다. SEC 및 IEC 데이타는 모두 정용여과 매질로서 밀리-Q 물을 사용하여 주위 온도에서 총 1.5일 동안(밤새 공정 중단) DF/UF 처리하면서 J695 안정성에 대한 실절적인 영향이 없었다는 것을 제시한다. 실험 전반에 걸쳐, 단백질 용액은 투명하게 잔류하고, 이는 잠재적 J695 용해도 제한이 없음을 지시한다.

1.5: J695 특성화

표 5는 SEC 크로마토그램으로 측정된 바와 같은 3개의 용액에 대한 응집물, 단량체 및 단편의 비율을 기술한다.

표 5

SEC 크로마토그램으로부터의 데이타

도 3은 J695 참조 기준(하부 그래프) 및 pH 4.4로 pH 조정된 J695 DS(상부 그래프)의 IEC 프로파일을 도시한다.

응집물 함량의 약간의 증가가 DF/UF 처리 후 J695 샘플에서 관찰되었다.

도 4는 밀리-Q 물에 의한 DF/UF 후, pH 4.7의 J695(상부 그래프) 및 pH 4.4로 pH 조정된 DF/UF 전의 J695 DS의 IEC 프로파일을 도시한다. 도 4에 도시된 바와 같이, DF/UF 단계는 IEC로 모니터할 경우, J695 안정성에 대한 주목할 만한 영향을 미치지 않는다. 두 J695 참조 기준 사이의 차이(참조: 도 3)는 3000 L 및 6000 L DS 캠페인 사이의 제조 공정 차이에 기인할 수 있다. 표 6은 IEC 데이타에 대한 보다 상세를 강조한다.

표 6

각종 J695 샘플의 IEC 데이타

1.6: 결론

상기 실시예는 물(HPLC용 밀리-Q 물)이 모노클로날 항체 아달리무맙 및 J695의 정용여과 매질로서 사용되는 정용여과/한외여과(DF/UF) 실험을 제공한다.

아달리무맙을 DF/UF 교환 매질로서 순수한 물을 사용하여 DF/UF 처리에 적용하고, 용액 흐림, 심한 유백광 또는 혼탁도 형성 없이 고농도(>200mg/mL)에서 pH 5.2에서 제형화하였다. 1회 후속 냉동/해동 단계시, SEC 및 IEC 데이타는 DF/UF 처리를 통해 물 중에서 제형화된 아달리무맙 용액과 원래의 아달리무맙 DS 사이에는 주목할 만한 차이가 존재하지 않았음을 제시하였다.

J695를 또한 DF/UF 교환 매질로서 순수한 물을 사용하여 DF/UF 처리에 적용하고, J695 안정성(육안 검사, SEC, IEC)에 영향을 미치지 않고 pH 4.7에서 제형화하였다.

이러한 DF/UF 처리를 사용하여 제형화할 경우, 아달리무맙 단량체의 수력학적 직경(D_h)은 약 2.65㎚였다. 40mg/mL 이하의 농도의 비이온성 부형제, 예를 들면, 소르비톨의 존재는 D_h 데이타에 어떤 영향을 갖지 않는 것으로 나타난 반면, 이미 저농도의 이온성 부형제, 예를 들면, NaCl은 아달리무맙 단량체 D_h를 약 11㎚(이러한 D_h 데이타는 IgG에 대해 통상적으로 모니터된다)로 증가시킨다는 것이 입증되었다. 유사한 발견은 J695에 대해 초기에 수행되었다.

결론적으로, 단백질을 DF/UF 교환 매질로서 순수한 물을 사용하여 처리하고 제형화하는 것은 쉽다. 이상적 100% 부형제 막 침투를 가정하여, 5개의 정용여과 용적을 사용하는 일정한 용적 정용여과에 의해 도달된 이론상 최종 부형제 농도는 Ci e-5 = 0.00674, 즉, 약 99.3% 최대 부형제 감소율일 것이다. 6개 정용여과 용적 교환을 사용하여, 이론상 약 99.98% 최대 부형제 감소율이 생성될 것이다.

실시예 2 내지 5는 수성 제형으로 농축된 3개의 상이한 단백질에 관한 실험 수행을 기술하고, 실시예 6 내지 11은 수성 제형 각각의 분석을 기술한다.

실시예 2 내지 11을 위한 재료 및 방법

■ 주입용수 중의 아달리무맙 단백질 용액(10mg/mL), 단백질 약물 물질(DS) 재료(49.68mg/mL), DS는 Tween 80, 아달리무맙, 아달리무맙 약물 생성물(DP)(40mg, 주입용수, 상업적으로 생산된 여과된 용액). 단백질 흡광 계수 280㎚: 1.39.

■ 주입용수 중의 J695 단백질 용액(10mg/mL), 단백질 약물 물질(DS) (54mg/mL), DS는 Tween 80을 함유한다. 흡광 계수 280㎚: 1.42

■ 주입용수 중의 HSA 단백질 용액(10mg/mL), Tween 80 없는 DP, Grifols Human Serum Albumin Grifols®, 20%, 50mL. 흡광 계수 280㎚: 1.042

■ 6R 바이알 및 10R 바이알

■ 바이알 제조: 바이알을 세척하고 오토클레이빙하였다.

■ 스토퍼(stopper), 19mm, West, 4110/40/grey

■ 샘플 저장기(예: 에펜도르프(Eppendorf) 샘플 저장기, 세이프-락(Safe-Lock) 또는 단순한 스냅-핏(snap-fit), 1 내지 2mL)

■ 단일 사용 시린지, 멸균성, 20mL; NormJect, 10mL

■ 단일 사용 필터 장치(필터 Millex®-GV, 시린지 구동 필터 장치, PVDF 0.22㎛; Millex®-GP, 시린지 구동 필터 장치, PES 0.22㎛, Sterivex® 0.22㎛ 필터 장치)

■ 비바스핀(Vivaspin) 농축기(컷오프 10kDa, PES; 컷오프 3kDa, PES)

■ 피펫(예: 에펜도르프, 최대: 1000μL)

■ 주입용수

■ 원심분리기(에펜도르프) 및 원심분리기 제1호(온도 조절됨)

■ 정용여과 장치: 밀리포어 랩스케일 TFF 시스템, 밀리포어 정용여과 막: 아달리무맙: 폴리에테르설폰; J695: 폴리에테르설폰; HSA: 재생 셀룰로스

■ pH 프로브 (메트롬 pH-측정기, 단백질- 적합한 프로브, 바이오트로드(biotrode) 46)

■ 층류 공기 유동(Laminar-Air-Flow) 벤치, Steag LF-Werkbank, Mp. -No. 12.5

■ NaCl; 만니톨

■ 제미니(Gemini) 150 펠티에르 플레이트 레오미터(Peltier Plate Rheometer), 맬버른

■ 레오미터 MCR 301[온도 조절된 P-PTD 200(펠티에르템퍼링을 갖는 플레이트)] 및 콘/플레이트 측정 시스템 CP50/0.5°Ti 뿐만 아니라 CP5O/1°(스테인레스 강); 안톤 파르(Anton Paar)

■ 모세관 점도계, 쇼트(Schott), 모세관: 타입 537 20, 타입 537 10, 타입 537 13

■ 1M 염산(J.T. Baker)

분석

■ UV/VIS 분광광도법(OD 280nm); 광자 상관 분광학(PCS): 약 10mg/mL 및 약 20mg/mL: 1.1mPas, 3회 작동, 30s, 1회 측정, 25℃, 약 30mg/mL 이상: 1.9mPas, 30s, 3회 작동, 1회 측정, 25℃

■ 이하 기술된 바와 같은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 이온 교환 크로마토그래피(IEC).

■ 점도 측정: 개별적이고 상이한 구조(set up)를 갖는 상이한 점도계

단백질 농도의 계산

계산식:

상기 식에서,

ε는 흡광 계수이고,

c는 농도이고,

d는 광이 통과하는 큐벳의 길이고,

E는 흡광도이고,

I₀는 초기 광 강도이고,

I는 샘플을 통해 통과 후의 광 강도이다.

아달리무맙의 점도 데이타 및 계산

아달리무맙 시판 제형(약 194mg/mL) 밀도:

아달리무맙 시판 제형(약 194mg/mL) 운동학적 점도:

K는 모세관 상수이고,

t는 용액이 모세관을 통과하는데 필요한 시간[s]이고,

ν는 운동학적 점도이다.

아달리무맙 시판 제형(약 194mg/mL) 동적 점도:

η은 동적 점도이고,

ρ는 밀도이다.

사람 혈청 알부민의 점도 데이타 및 계산

HSA 시판 제형(약 200mg/mL) 밀도:

HSA 시판 제형(약 200mg/mL) 운동학적 점도:

K는 모세관 상수이고,

t는 용액이 모세관을 통과하는데 필요한 시간[s]이고,

ν는 운동학적 점도이다.

HSA 시판 제형(약 200mg/mL) 동적 점도:

η은 동적 점도이고,

ρ는 밀도이다.

WFI 중의 HSA(약 180mg/mL) 밀도:

WFI 중의 HSA(약 180mg/mL) 운동학적 점도:

K는 모세관 상수이고,

t는 용액이 모세관을 통과하는데 필요한 시간[s]이고,

ν는 운동학적 점도이다.

WFI 중의 HSA(약 180mg/mL) 동적 점도:

η은 동적 점도이고,

ρ는 밀도이다.

고농도 제형에 도달하기 위한 일반적 실험 수행

일반적으로, 고농도 염 비함유 단백질 제형에 도달하기 위한 공정은 초기 약물 물질 재료의 정용여과에 이어 용액 중의 약물 물질의 농도를 증가시키기 위한 절차를 포함한다. 이는 개별적인 절차로 수행될 수 있거나, 동일 절차내에서 개별적으로 또는 동시 단계로 수행될 수 있다.

정용여과

충분한 양의 약물 물질(DS) 재료(DS의 단백질 농도에 따라)를 정용여과시켰다. 정용여과 전에, DS 재료를 주입용수로 약 10mg/ml로 희석시켰다. 전체로, 약 540mL의 10mg/mL 용액이 실험에 필요하였다는 것에 주목한다.

주입용수를 정용여과 매질로서 사용하였다. 수행된 정용여과 단계의 수는 5 내지 7이다(하나의 정용여과 단계는 하나의 전체 용적 교환과 동일하다). 공정관리(IPC) 샘플은 정용여과 단계 전후에 수집하였다(몰삼투농도의 경우 200μL, SEC의 경우 120μL).

TFF 장치를 사용한 정용여과는 다음과 같은 파라미터를 적용하여 수행한다:

- 교반기: 위치 2

- 펌프: 위치 2

- 압력 업스트림/유입구: 최대 20 내지 30psi

- 압력 다운스트림/배출구: 최대 10psi

(이 실험에 사용된 파라미터는 제조업자의 추천으로부터 유도되었다. 당해 기술 분야의 숙련가는 장치 중의 특별한 단백질 또는 변형물, 제형, 점도 및 기타 파라미터를 조정하기 위해 장치 작동 파라미터를 변경할 수 있다.)

정용여과 후, 단백질 농도는 OD280으로 평가하였다. 단백질 농도가 10mg/mL 초과이면, 용액을 주입용수로 적합하게 희석시켜 단백질 농도를 10mg/mL로 희석시켰다.

농축

20mL의 정용여과된 단백질 용액(예: 아달리무맙, J695, HSA)을 비바스핀 20 농축기에 넣었다. 농축기를 밀폐시키고, 원심분리기에 넣었다. 단백질 용액을 최대 속도(5000rpm)에서 원심분리시켰다.

샘플 수집(pull)

농축 용액 샘플을 10mg/mL에서 수집한 다음, 10mg/mL 마다(20, 30, 40mg/ml 등) 또는 단백질이 가시적으로 응집될 때까지 수집하고, 샘플을 다음과 같이 분석하였다:

- 단백질 용액은 비바스핀 농축기로 균질화시키고, 적당한 바이알에 충전시켰다.

- 광학적 외관을 바이알에서 직접 검사하였다.

- UV 분광학을 위해 300μL, PCS를 위해 160μL, SEC를 위해 120μL, IEX를 위해 300μL를 사용하였다.

- SEC 및 IEX용 샘플을 -80℃에서 저장하였다.

동적 광 산란(DLS) 프로토콜

동적 광 산란은 헬마 정밀 셀(Plainview, NY), 수프라실 석영, 타입 105.251-QS, 광 경로 3mm, 중심 Z8.5mm가 구비되고, 60μL 이상의 샘플 충전물을 갖는 제타사이저 나노 ZS(Malvern Instruments, Southborough, MA)를 사용하여 단백질 샘플을 그대로 사용하여 수행하고, 측정 셀에 직접 위치시켰다. 측정 전에, 셀 윈도우를 체크하여 용액이 DLS 측정에 영향을 미칠 수 있는 기포 또는 입자/분진/기타 오염물을 함유하지 않음을 입증하였다. 측정은 표준 작업 절차("일반적 목적" 방식, 25℃, 굴절률은 1.45로 설정하고, 측정 방식은 "수동"으로 설정하고, 측정당 1회 작동, 각각 30초의 3회 측정을 각각 포함함, 측정 형태를 "사이즈"로 설정함). 분산 기술 소프트웨어, 버젼 4.10b1, 맬버른 인스트루먼트를 데이타를 분석하는데 사용하였다. 약 70μL의 샘플 용액을 수력학적 직경(D_h) 분석을 위한 정밀 셀에 충전시켰다. 디폴트 샘플 점도는 저 농축 단백질 용액(예: 5mg/mL 미만)의 경우 1.1mPas로 설정하였다. 측정 원리에 기초하여 측정되는 샘플 용액과 디폴트 점도의 사용의 실제 점도 값의 최소 차이는 DLS 데이타 판독에 실질적으로 영향을 미치지 않는다고 결론지었다. 이는 용액 점도가 측정되고, 후속적 DLS 측정에서 고려되는 저농도 단백질 용액(5mg/mL 미만)의 DLS 측정을 수행함으로써 입증되었다. 고단백질 농도를 갖는 모든 샘플의 경우, 점도를 측정하여 DLS 측정 동안 고려하였다.

실시예 2: 고농도 TNFα 항체를 포함하는 제형

2.1: 정용여과

정용여과 전에, 아달리무맙(49.68mg/mL)을 주입용수로 약 15mg/mL의 농도로 희석시켰다. 따라서, 140.8mL 아달리무맙 용액(49.68mg/mL)을 500mL 용적 플라스크에 충전시켰다. 플라스크에 주입용수를 교정 마크까지 충전시켰다. 용적 플라스크를 밀폐시키고, 용액의 균질화를 위해 완만하게 진탕시켰다. TFF 랩스케일 시스템을 물로 풀러슁하였다. 이어서, 막(PES)를 채택하고, 또한 1L의 증류수로 플러슁하였다. 이후, TFF 랩스케일 시스템 및 막을 약 300mL의 주입용수로 플러슁하였다. 이어서, 희석된 아달리무맙 용액을 TFF의 저장기에 충전하였다. 몰삼투농도 측정(300μL), UV 분광광도법(500μL)을 위한 샘플 및 SEC 분석(120μL)용 샘플을 수집하였다. 시스템을 밀폐시키고, 정용여과를 개시하였다. DF/UF(정용여과/한외여과)를 5개의 용적 교환 후 및 몰삼투농도 값 3mosmol/kg에 도달한 후 종결하였다. 정용여과 후 아달리무맙 용액의 pH-값은 pH 5.25이었다.

TFF 장치에 의한 정용여과는 다음과 같은 파라미터를 적용하여 수행하였다:

- 교반기: 위치 2

- 펌프: 위치 2

- 압력 업스트림/유입구: 최대 20 내지 30psi

- 압력 다운스트림/배출구: 최대 10psi

정용여과 후, 단백질 농도는 OD280으로 평가하였다. 농도는 13.29mg/mL로 측정되었다.

아달리무맙 용액을 멸균 여과시켰다.

TFF 및 막을 약 1L의 증류수에 이어, 500mL 0.1M NaOH로 풀러슁하였다. 막을 0.1M NaOH에 저장하고, TFF를 약 500mL의 증류수로 다시 플러슁하였다.

2.2: 단백질 농축

항체를 농축시키기 전에, 단백질 농도를 OD280으로 다시 평가하였다. 아달리무맙 농도는 13.3mg/mL로 측정되었다. 이어서, 아달리무맙 용액을 10mg/mL로 희석시켰다. 375.94mL의 아달리무맙 용액(13.3mg/mL)을 500mL 용적 플라스크에 충전시키고, 플라스크에 주입용수(WFI)를 교정 마크까지 충전시켰다. 75.19mL의 아달리무맙 용액(13.3mg/mL)을 또한 100mL 용적 플라스크에 충전시키고, 순수한 물, 즉 주입용수(WFI)를 교정 마크까지 충전시켰다. 두 플라스크를 모두 균질화를 위해 온화하게 진탕시켰다. 두 플라스크로부터 용액을 1L PETG 병에 위치시켰다. 병을 균질화를 위해 온화하게 진탕시켰다.

4개의 비바스핀 20 농축기(10kDa)를 사용하였다. 3개의 비바스핀에, 20mL의 아달리무맙 용액(10mg/mL)을 충전시켰다(각각). 4번째 비바스핀 장치에서, 물을 원심분리시키면서 평형추 균형으로 충전시켰다. 농축기를 밀폐시키고, 원심분리기에 넣었다. 아달리무맙 용액을 4500 x g 원심력을 적용하여 원심분리시켰다(선회 로터에서).

2.3: 샘플 수집

농축 아달리무맙 용액 샘플을 농도 10mg/mL에 도달하고, 후속적으로 10mg/mL씩 농도 증분 증가시(20mg/mL, 30mg/mL, 40mg/mL 등. 약 200mg/mL까지) 수집하였다. 40분 간격으로, 농축기를 원심분리기로부터 꺼내고, 용액을 균질화시키고, 용액 및 원심분리 어댑터를 약 10분 동안 아이스 위에서 냉각시켰다. 10mg/mL씩 농축 증분 후, 농축기 중의 용액을 균질화시키고, 광학적 외관을 체크하고, 샘플을 UV(300μL), PCS(160μL), SEC(120μL) 및 IEC(300μL)를 통한 분석을 위해 수집하였다. 샘플 수집 후, 아달리무맙 용액(10mg/mL)을 농축기에 약 20mL까지 충전시켰다.

단백질 침전의 육안 검사 및 PCS 분석을 사용하여 용액 중의 아달리무맙 단백질(즉, 이소폼)의 용해도 한계를 측정하였다.

약 80mg/mL의 농도에서, 아달리무맙 용액이 더이상 유백광을 띄지 않는다는 것이 명백해졌고, 유백광은 다량의 단편을 갖는 아달리무맙 용액의 공지된 특징이다. 따라서, 단편화가 실험 수행 동안 발생할 수 있다고 간주되었다. 추가의 분석을 위해, 아달리무맙 용액 샘플(약 80mg/mL)을 SEC로 분석하였다. 각 비바스핀 중의 용액의 나머지 뿐만 아니라 아달리무맙 용액의 나머지(10mg/mL)를 50mL 팔콘 튜브에서 분리하고, -80℃에서 저장하였다. SEC 분석은 99.6% 단량체 순도를 나타냈다.

용액을 25℃에서 수욕에서 해동시키고, 멸균 여과하였다. 이후, 3개의 팔콘 튜브로부터 용액을 각 비바스핀에 위치시켰다. 농축기에 약 20mL까지 충전시키고, 계속 농축시켰다. 약 200mg/mL의 농도에 도달할 때 실험을 마무리하였다.

모든 SEC 및 IEC 샘플을 추가로 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다. UV 및 PCS 측정은 샘플 수집 후 직접 수행하였다. 농축 아달리무맙 용액의 나머지를 에펜도르프 저장기에 위치시키고, -80℃에서 저장하였다.

이하 제시된 표 7은 아달리무맙 용액을 농축시키면서 농축기에 재충전되는 단백질 용액의 용적의 계산을 기술한다. 용적 샘플이 수집되어야 하는 실험 수행을 규정하기 전에 도식을 계산하였다. 원심분리 기간은 표 8에 제시한다.

표 7

원심분리 도식

표 8

아달리무맙 용액을 농축시키는데 필요한 원심분리 시간

아달리무맙의 농축으로부터 생성되는 결과는 또한 이하 표 12에 제시한다.

2.4: 점도 측정

WFI 중의 50mg/mL 또는 WFI 중의 200mg/mL를 포함하는 아달리무맙 용액의 점도를 측정하였다. WFI 중의 50mg/mL 및 200mg/mL는 제미니 150 펠티에르 플레이트 레오미터((Malvern)을 사용하여 측정하고, WFI 용액 중의 200mg/mL는 또한 레오미터 MCR 301[온도 조절된 P-PTD 200(펠티에르 템퍼링을 갖는 플레이트)] 및 콘/플레이트 측정 시스템 CP50/1(스테인레스 강); 안톤 파르)을 통해 측정하였다.

저장 튜브 중의 아달리무맙 용액(200mg/mL)을 해동하고, 6R 바이알에서 균질화시켰다. 1mL 아달리무맙(200mg/mL)을 3mL WFI로 희석시켜 희석된 용액(50mg/ml 아달리무맙 용액)을 수득하였다.

레오미터 제미니 150의 경우, 측정에 약 2mL가 필요하고, MCR 301의 경우, 1mL 미만이 필요하다.

시판 제형 중의 아달리무맙(약 194mg/mL)은 비바스핀 튜브를 사용하여 수득하였다. 튜브를 시판 완충제 중의 아달리무맙 용액으로 충전시키고, 194mg/mL 농도에 도달할 때까지 원심분리를 적용하였다. 점도는 모세관 점도계 스콧을 사용하여 측정하였다.

2.5: 요약

요약하면, 아달리무맙은 4개의 상이한 튜브 중의 비바스핀 20 튜브 중에서 50mg/mL에서 약 194mg/mL로 농축되었다. 초기에는, 20mL의 아달리무맙 용액(50mg/mL)이 튜브마다(4개의 튜브) 존재하였다. 농축 말기에는 5mL의 아달리무맙 용액(약 194mg/mL)이 튜브마다 존재하였다. 농축 단계를 5000rpm(약 4500g)에서 수행하였다. 매 시간 후, 직사각형 비이커 및 비바스핀 튜브 중의 단백질 용액을 파쇄된 아이스로 약 10 내지 15분 동안 냉각시켰다. 밀도는 밀도 측정 장치 DMA 4500, 안톤 파르로 측정하였다. 고농도 아달리무맙 제형의 추가 분석은 실시예 5 내지 11에 제공한다.

실시예 3: 고농도 IL-12 항체를 포함하는 제형

3.1: 정용여과

정용여과 전에, IL-12 항체 J695(54mg/mL)를 주입용수로 약 15mg/mL의 농도로 희석시켰다. 이는 150mL J695 용액(54mg/mL)을 500mL 용적 플라스크에 위치시키고, 플라스크에 주입용수를 교정 마크까지 충전시켜 수행하였다. 용적 플라스크를 밀폐시키고, 용액의 균질화를 위해 온화하게 진탕시켰다. TFF 랩스케일 시스템을 물로 풀러슁하였다. 이어서, 폴리에테르설폰 막(PES)을 채택하고, 또한 1L의 증류수로 플러슁하였다. 이후, TFF 랩스케일 시스템 및 막을 약 300mL의 주입용수로 플러슁하였다. 이어서, 희석된 J695 용액을 TFF의 저장기에 위치시켰다. 몰삼투농도 측정(300μL), UV 분광광도법(500μL)을 위한 샘플 및 SEC 분석(120μL)용 샘플을 수집하였다. 시스템을 밀폐시키고, 정용여과를 개시하였다. DF 용적 200mL를 처리한 후, 정용여과를 중단하고, UV 측정을 위한 또다른 샘플을 수집하였다. DF/UF를 1800mL 정용여과 용적(약 3.5배 용적 교환) 후 중단하고, 이때 몰삼투농도 값 4mosmol/kg에 도달하였다. 정용여과 후 J695 용액의 pH-값은 pH 6.48이었다.

TFF 장치에 의한 정용여과는 다음과 같은 파라미터를 적용하여 수행하였다:

- 교반기: 위치 2

- 펌프: 위치 2

- 압력 업스트림/유입구: 최대 20 내지 30psi

- 압력 다운스트림/배출구: 최대 10psi

정용여과 후, 단백질 농도는 OD280으로 평가하였다. 농도는 16.63mg/mL로 측정되었다.

J695 용액을 멸균 여과시켰다.

TFF 장치 및 막을 약 1L의 증류수에 이어, 500mL 0.1M NaOH로 풀러슁하였다. 막을 0.1M NaOH에 저장하고, TFF를 약 500mL의 증류수로 다시 플러슁하였다.

3.2: 농축

농축시키기 전에, J695 농도를 10mg/mL로 희석시키고; 316mL의 J695 용액(16.63mg/mL)을 500mL 용적 플라스크에 충전시키고, 플라스크에 주입용수(WFI)를 교정 마크까지 충전시켰다. 추가로, 64mL의 J695 용액(16.63mg/mL)을 100mL 용적 플라스크에 위치시키고, 주입용수를 교정 마크까지 충전시켰다. 두 플라스크를 모두 균질화를 위해 온화하게 진탕시켰다. 두 플라스크로부터 용액을 1L PETG 병에 위치시켰다. 병을 균질화를 위해 온화하게 진탕시켰다.

4개의 비바스핀 20 농축기(10kDa 컷-오프)를 사용하였다. 20mL의 J695 용액(10mg/mL)을 3개의 비바스핀 각각에 위치시켰다. 4번째 비바스핀 장치에서, 물을 원심분리시키면서 평형추 균형으로 충전시켰다. 농축기를 밀폐시키고, 원심분리기에 넣었다. J695 용액을 4500 x g 원심력을 적용하여 원심분리시켰다(선회 로터에서).

3.3: 샘플 수집

농축 J695 용액 샘플을, 이들이 농도 10mg/mL에 도달하고, 각각 후속적으로 10mg/mL씩 농도 증분 증가시(20mg/mL, 30mg/mL, 40mg/mL 등. 약 200mg/mL까지) 수집하였다. 매 40분 후, 농축기를 원심분리기로부터 꺼내고, 용액을 균질화시키고, 용액 및 원심분리 어댑터를 약 10분 동안 아이스 위에서 냉각시켰다. 10mg/mL씩 농도 증가 후, 농축기 중의 용액을 균질화시키고, 광학적 외관을 체크하고, 샘플을 UV(300μL), PCS(160μL), SEC(120μL) 및 IEC(300μL) 분석을 위해 수집하였다. 샘플 수집 후, J695 용액(10mg/mL)을 농축기에 약 20mL까지 충전시켰다.

육안 검사 및 PCS 분석을 사용하여 J695의 용해도(즉, 잠재적 침전을 체크하기 위해) 및 안정성을 측정하였다.

실험 완료시, 마지막에 약 200mg/mL의 농도에 도달하였다.

모든 SEC 및 IEC 샘플을 추가로 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다(이하 참조). UV 광도분광학 및 PCS 측정은 각 샘플 수집 후 직접 수행하였다. 농축 J695 용액의 나머지를 에펜도르프 저장기에 위치시키고, -80℃에서 저장하였다.

원심분리 도식에 대한 상세는 상기 표 7에 제공하였다. J695 원심분리 기간은 표 9에 제시한다.

표 9

J695 용액을 농축시키는데 필요한 원심분리 시간

3.4: J695의 수력학적 직경에 대한 부형제의 영향

이 실험에서, J695의 수력학적 직경에 대한 염화나트륨 및 만니톨의 영향을 별도로 분석하였다. 이러한 목적을 위해, 염화나트륨(12mg/mL)의 스톡 용액 및 만니톨(120mg/mL)의 스톡 용액을 제조하였다. 1.2g NaCl을 비이커에 칭량하고, 이를 약 70mL의 WFI로 충전시키고, 12.002g의 만니톨을 비이커에 칭량하고 약 7OmL의 WFI로 충전시켰다. 두 용액을 균질화를 위해 교반시켰다. 각 용액을 용적 플라스크에 위치시키고, 이를 WFI로 교정 마크까지 충전시켰다. 플라스크를 균질화를 위해 온화하게 진탕시켰다.

약 8mL의 J695 용액(약 200mg/mL)을 37℃에서 해동시켰다. 용액을 10R 바이알에 충전시키고, 균질화시켰다. 7개의 2R 바이알을 각각 500μL의 J695 용액(약 200mg/mL)으로 충전시켰다. 충전 도식은 이하 표 10에 기술한다.

표 10

상이한 농도의 NaCl 또는 만니톨을 함유하는 J695 용액을 제조하기 위한 충전 도식

2R 바이알을 진탕시켜 온화하게 균질화시켰다. 이후, 상이한 J695 용액(100mg/mL)의 PCS 및 몰삼투농도 측정을 수행하였다.

PCS 분석용 샘플을 제조하기 위해, 큐벳을 먼저 50μL의 샘플로 풀러슁하였다. 이어서, 100μL의 샘플을 사용하여 측정을 수행하였다.

고농도 J695 제형의 추가의 분석은 실시예 5 내지 11에 제공한다.

실시예 4: 고농도 사람 혈청 알부민(HSA) 제형

4.1: 정용여과

정용여과 전에, HSA 용액(200mg/mL, 시판 제형)을 주입용수로 15.29mg/mL의 농도로 희석시켰다. 이를 달성하기 위해, 38mL HSA(200mg/mL)를 500mL 용적 플라스크에 충전시켰다. 플라스크에 주입용수를 교정 마크까지 충전시켰다. 용적 플라스크를 밀폐시키고, 용액의 균질화를 위해 온화하게 진탕시켰다. TFF 랩스케일 시스템을 물로 풀러슁하였다. 이어서, 막(재생 셀룰로스)를 적용하고, 또한 1L의 증류수로 플러슁하였다. 이후, TFF 랩스케일 시스템 및 막을 약 300mL의 주입용수로 플러슁하였다. 이어서, 희석된 HSA 용액을 TFF의 저장기에 충전하였다. 몰삼투농도 측정(300μL), UV 분광광도법(500μL)을 위한 샘플 및 SEC 분석(120μL)용 샘플을 수집하였다. 시스템을 밀폐시키고, 정용여과를 개시하였다. 약 300mL의 용적의 정용여과 후, 투과물의 UV 측정을 수행하였다. 투과물은 2.74mg/mL의 농도를 나타내고, 이는 단백질이 막을 통해 통과했음을 지시한다. 약 500mL의 DF 및 UV 측정용 다른 샘플을 수집한 후(HSA 농도 11.03mg/mL), 정용여과를 중단하였다. DF/UF를 950mL의 정용여과 용적 후(약 2개의 용적 교환) 및 몰삼투농도 값 4mosmol/kg에 도달한 후 완성하였다. 정용여과 후 HSA 용액의 pH-값은 pH 7.13이었다.

투과물의 UV 분광광도법 측정은 3회 수행하였다(n=3).

TFF 장치에 의한 정용여과는 다음과 같은 파라미터를 적용하여 수행하였다:

- 교반기: 위치 2

- 펌프: 위치 2

- 압력 업스트림/유입구: 최대 20 내지 30psi

- 압력 다운스트림/배출구: 최대 10psi

정용여과 후, 단백질 농도는 OD280으로 평가하였다. 농도는 9.41mg/mL로 측정되었다.

HSA 용액을 멸균 여과시켰다. TFF 및 막을 약 1L의 증류수로 풀러슁하였다. 이후, 통합 시험을 수행하였다(참조: Operating Instructions 랩스케일™ TFF 시스템, page 5-3 to 5-5, 1997). 용적 유량은 1.2mL/분이고, 따라서 통합 시험을 통과하였다(허용 최고 한계: 3mL/분). 막은 500mL의 증류수에 이어, 500mL의 0.05M NaOH로 한번 더 풀러슁하였다. 막을 0.05M NaOH에 저장하고, TFF를 약 500mL의 증류수로 다시 플러슁하였다.

4.2: 농축 공정

HSA 단백질 용액을 농축시키기 전에, OD280으로 농도를 평가하고, 9.52mg/mL인 것으로 측정되었다. 4개의 비바스핀 20 농축기(10kDa)를 사용하였다. 20mL의 HSA 용액(9.52mg/mL)을 3개의 비바스핀 농축기 각각에 위치시켰다. 4번째 비바스핀에 물을 원심분리시키면서 평형추 균형으로 충전시켰다. 농축기를 밀폐시키고, 원심분리기에 넣었다. HSA 용액을 4500 x g 원심력을 적용하여 원심분리시켰다(선회 로터에서).

4.3: 샘플 수집

농축 HSA 용액 샘플을 농도 10mg/mL에 도달하고, 후속적으로 매 10mg/mL 농도 증분 증가시(20mg/mL, 30mg/mL, 40mg/mL 등. 약 180mg/mL까지) 수집하였다. 40분 마다, 농축기를 원심분리기로부터 꺼내고, 용액을 균질화시키고, 용액 및 원심분리 어댑터를 약 10분 동안 아이스 위에서 냉각시켰다. 매 10mg/mL 농도 증분 증가시, 농축기 중의 용액을 균질화시키고, 광학적 외관을 체크하고, 샘플을 UV(300μL), PCS(160μL), SEC(120μL) 및 IEC(300μL)를 통한 분석을 위해 수집하였다. 샘플 수집 후, HSA 용액(9.52mg/mL)을 농축기에 약 20mL까지 첨가하였다.

농축기 중의 HSA 용액의 계획된 농도가 약 20mg/mL에 달할 경우, 투과물을 OD280을 통해 측정하여 0.5964mg/mL의 농도를 나타냈다. HSA 용액의 농도는 단지 15.99mg/mL이고, 이는 기대치 미만이었다. WFI(10mg/mL) 중의 농축 HSA 용액 샘플을 SEC를 통해 분석하여 강력한 단편화를 세밀히 조사하였다. 비바스핀 중의 HSA 용액(15.99mg/mL)을 팔콘 튜브에 위치시키고, -80℃에서 저장하였다. 농축기를 충전시키는데 사용되는 원래의 HSA 용액의 나머지(9.52mg/mL)를 또한 -80℃에서 저장하였다.

SEC 분석을 수행하여 HSA 단백질이 분해되는지의 여부를 측정하여 막을 통해 통과할 수 있는 작은 단편을 생성하였다. 그러나, SEC 분석은 실질적으로 단편 없이 WFI 중의 10mg/mL HSA에 대해 92.45%의 단량체 양을 나타냈다.

-80℃에서 저장된 용액을 25℃에서 해동시키고 멸균 여과하였다. 팔콘 튜브 중의 용액을 하나의 비바스핀 20 농축기에 각각 옮겼다(3kDa 컷-오프). 비바스핀을 HSA 용액(9.52mg/mL)으로 충전시키고, 원심분리하였다(참조: 상기한 3.2 농축 공정).

육안 검사 및 PCS 분석을 사용하여 HSA 용해도 한계를 측정하였다.

실험 완료시, 약 180mg/mL HSA의 농도에 도달하였다.

모든 SEC 및 IEC 샘플을 추가로 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다. UV 및 PCS 측정은 샘플 수집 후 직접 수행하였다. 농축 HSA 용액의 나머지를 에펜도르프 저장기에 위치시키고, -80℃에서 저장하였다.

원심분리 도식의 개관은 표 7에 상기 기술하였다. HSA를 농축시키는데 사용되는 원심분리 기간은 표 11에 기술한다.

표 11

HSA 용액을 농축시키는데 필요한 원심분리 시간

4.4: HSA의 수력학적 직경에 대한 pH 값의 영향

다음 실험 파트를 수행하여 단백질이 WFI에 용해될 때 HSA의 수력학적 직경에 대한 pH의 잠재적인 영향을 평가하였다. 4개의 6R 바이알에 5.09mL의 HSA 용액(9.83mg/mL)을 충전시키고, 1M HCl(실제 pH: 3.04, 3.99, 5.05, 6.01)을 사용하여 pH 값 3 내지 6으로 설정하였다. 이들 용액을 각각 개별적 10mL 용적 플라스크에 옮겼다. 이어서, 플라스크를 교정 마크까지 충전시키고, 균질화를 위해 온화하게 진탕시켰다.

HCl 용액을 10R 바이알에 위치시키고, PCS를 통해 분석하였다. 용액을 멸균 여과시키고, PCS를 통해 다시 측정하였다. 또한, 5.09mL HSA 용액(9.83mg/mL)을 10mL 용적 플라스크에 옮기고, 이를 WFI를 사용하여 교정 마크까지 충전시켰다. 플라스크를 균질화를 위해 온화하게 진탕시킨 다음, 용액을 멸균 여과시키고, PCS를 통해 측정하였다.

PCS 측정용 샘플 제조:

큐벳을 50μL의 샘플로 플러슁하였다. 100μL의 샘플 용적을 사용하여 측정을 수행하였다.

4.5: 점도 측정

시판 제형 중의 HSA(200mg/mL) 및 WFI 중의 HSA(약 180mg/mL)를 위해, 점도를 모세관 점도계(쇼트, MP.-No. 33.2)로 측정하였다.

15mL 분취량을 시판 제형 HSA의 50mL 병으로부터 수집하였다. WFI 중의 HSA를 약 20℃에서 해동시키고, 약 9mL를 팔콘 튜브에서 분주하였다. 밀도는 밀도 측정 장치 DMA 4500, 안톤 파르로 측정하였다.

높은 HSA 농도 제형의 추가의 분석은 실시예 5 내지 11에 제공한다.

실시예 5: 고단백질 제형의 분석- 광학적 외관

시판 제형 중의 아달리무맙과 대조적으로, WFI 중의 아달리무맙은 유백광을 나타내지 않았다. J695도 또한 WFI에 용해될 경우 어떤 유백광 현상도 나타내지 않았다. 아달리무맙의 단백질 농도가 WEFI 중에서 80mg/mL 및 200mg/mL이라는 사실에도 불구하고, 실질적으로 어떤 유백광도 관찰되지 않았다. 대조적으로, 50mg/mL 아달리무맙을 포함하는 시판 제형은 통상의 제형에서 주목할 만한 유백광을 나타냈다. 따라서, 순수한 물, 즉, WFI를 용해 매질로서 사용하면 단백질 용액 유백광에 긍정적인 효과를 갖는다.

(상기한 고단백질 농도에서 모두 가용성인 것 외에) WFI 중의 아달리무맙은 고농도, 예를 들면, 200mg/mL에서 저점도를 갖는 것으로 나타났다는 것은 놀라운 관찰이었다.

농도에 따라, HSA 용액의 광학적 특징/색상은 투명한 엷은 황색(WFI 중의 10mg/mL)에서 투명한 황색(WFI 중의 약 180mg/mL)으로 변하였다.

농축 공정 동안, 아달리무맙 용액 및 HSA 용액에 대해 어떤 침전도 관찰되지 않았다. 침전은 용해도 제한에 대한 표시일 수 있다. 용액은 실험이 끝날 때까지 투명하게 유지되었다. 잠재적 용해도 제한에 접근하여 침전이 발생하기 때문에 실험이 끝나지 않지만, 농축기에 잔류하는 용액 용적이 농축을 진행하기에 충분하지 않기 때문에(즉, 재료 부족) 완료되었다는 것이 강조되었다. 아달리무맙, J695 및 HSA의 용해도 한계가 220mg/mL를 훨씬 초과한다는 것이 나타나기 쉽다.

J695 용액에서, 고농축 용액을 농축기에서 2 내지 8℃에서 밤새 저장할 경우(약 120mg/mL), 결정형 침전이 관찰되었다. 결정형 침전은 용액이 주위 온도에서 저장될 경우, 약 3 내지 5분 후에 재용해시켰다. 따라서, J695를 고농도에서 순수한 물에 용해시킴으로써 생성된 환경은 단백질 결정화가 단지 온도 주기(예: 주위 온도에서 2 내지 8℃로)에 의해 수행될 수 있는 조건을 제공한다.

실시예 6: 고단백질 제형의 분석 - 단백질 농도

단백질 농도의 계산은 재료 및 방법 단락에서 상기 제공되었다.

순수한 물중 고단백질 제형에서의 아달리무맙, J695 및 HSA의 농도에 대한 개관은 이하 표 12 내지 14에 제공한다:

표 12

농축 공정 동안 OD280을 통해 평가된 아달리무맙의 농도

표 13

농축 공정 동안 OD280을 통해 평가된 J695의 농도

표 14a 및 표 14b: 농축 공정 동안 OD280을 통해 평가된 HSA의 농도

표 14a

표 14b

3개의 단백질 모두 평가된 농도 범위(즉, 아달리무맙 및 J695의 경우 200mg/mL 초과, HSA의 경우 175mg/mL 초과)에서 가용성으로 잔류하는 것으로 평가되었다. 불용성에 대한 표시, 즉 용액에 발생하는 흐림 현상 또는 침전이 전혀 관찰되지 않았다. 아달리무맙의 경우, 결과는 평가된 농도 범위에서 모든 아달리무맙 이소폼(즉, 리신 변이체)이 가용성으로 잔류하여 어떤 침전도 전혀 발생하지 않았음을 지시한다. 이 관찰은 또한 실시예 11에 기술된 이온 교환 크로마토그래피 데이타와 일치하고, 이는 유지된 리신 변이체의 합이 아달리무맙 농도와 무관하게 실질적으로 일관된다는 것을 기술한다.

실시예 7: 고단백질 제형의 분석 - 점도

7.1: 아달리무맙 점도

주입용수 중의 아달리무맙의 점도(약 50mg/mL)는 약 1.5 내지 2mPas인 것으로 측정되었다. WFI 중의 아달리무맙(약 200mg/mL)의 경우, 두 개의 값이 측정되었다. 맬버른으로부터 콘/플레이트 레오미터(Gemini 150)로 측정한 하나의 값은 약 6 내지 6.5mPas인 반면, 나머지 값(안톤 파르로부터의 콘/플레이트 레오미터, MCR 301로 측정됨)은 약 12mPas였다.

아달리무맙 시판 제형(약 194mg/mL) 점도:

K는 모세관 상수이고,

t는 용액이 모세관을 통과하는데 필요한 시간[s]이고,

ν는 운동학적 점도이고,

η은 동적 점도이고,

ρ는 밀도이다.

WFI 중의 아달리무맙의 점도(약 200mg/mL)는 안톤 파르로부터의 점도계에 의해 약 12mPas인 것으로 측정되고, 맬버른으로부터의 점도계에 의해 약 6mPas인 것으로 측정되었다. 대조적으로, 시판 제형 중의 아달리무맙의 점도(약 194mg/mL)는 (쇼트로부터의 모세관 점도계로 측정된) 9.308mPas보다 높다.

7.2: 사람 혈청 알부민 점도

HSA 시판 제형(약 200mg/mL) 점도:

K는 모세관 상수이고,

t는 용액이 모세관을 통해 작동하는데 필요한 시간[s]이고,

ν는 운동학적 점도이고,

η은 동적 점도이고,

ρ는 밀도이다.

WFI 중의 HSA(약 180mg/mL)의 점도:

K는 모세관 상수이고,

t는 용액이 모세관을 통해 작동하는데 필요한 시간[s]이고,

ν는 운동학적 점도이고,

η은 동적 점도이고,

ρ는 밀도이다.

WFI 중의 HSA(약 180mg/mL)의 점도는 약 19.121mPas인 것으로 측정되었다. 시판 제형 중의 HSA(약 194mg/mL)의 점도는 9.308mPas(쇼트로부터의 모세관 점도계로 측정됨)인 것으로 측정되었다.

7.3: 아달리무맙 및 HSA의 점도 분석

WFI 중의 아달리무맙 50mg/mL의 동적 점도는 각각 WFI 및 시판 완충제 중의 아달리무맙 200mg/mL의 점도보다 낮다. HSA의 경우, WFI 중의 180mg/mL의 농도에 대한 동적 점도는 시판 완충제 중의 200mg/mL의 농도에 비해 약 6배 이상 높다. 따라서, 용해 매질로서의 순수한 물에 의해 전달되는 효과에 기인하는 점도 변화(즉, 각각 증가 및 감소)의 강도는 개별 단백질에 좌우될 수 있는 것으로 나타난다.

실시예 8: 고단백질 제형의 수력학적 직경의 분석- 광자 상관 분광학(PCS)

다음 실시예는 본 발명의 DF/UF 방법을 사용하여 수득된 수성 제형 중의 각종 단백질의 수력학적 직경(D_h)(평균 수력학적 분자 직경의 z-평균)의 분석을 제공한다.

8.1: 아달리무맙 수력학적 직경

도 5 및 6에 도시된 바와 같이, 수력학적 직경(D_h)이 아달리무맙 농도 증가와 함께 증가하는 경향이 관찰될 수 있다. 도 5는 수력학적 직경(z-평균)과 WFI 중의 아달리무맙의 농도 사이의 상관관계를 도시한다. 도 6은 수력학적 직경(피크 단량체)와 WFI 중의 아달리무맙의 농도 사이의 상관관계를 도시한다.

34.20mg/mL 샘플에 비해 23.27mg/mL 샘플로부터 측정된 D_h 사이의 차이는 수력학적 직경 측정을 위한 표준 작업 절차(SOP)에서 수행된 가정 때문에 존재한다. 23.27mg/mL 이하 농도를 갖는 아달리무맙 샘플의 경우, PCS 측정법은 샘플의 점도를 1.1mPas로 가정한 SOP로 수행하였다. 34.20mPas 이상의 아달리무맙 샘플의 경우, 1.9mPas 샘플 점도를 가정하는 SOP를 사용하였다. PCS 데이타가 샘플 점도에 의해 영향을 받는 샘플 시험편의 랜덤한 브라운 운동(random Brownian motion)에 기초하기 때문에, PCS 데이타는 소정의 샘플 용액의 점도에 의해 강하게 영향을 받는다는 것이 공지되었다. 따라서, 단백질 농도를 증가시키는 것이 용액의 점도를 증가시키기 때문에(고점도는 낮은 브라운 운동 및 높은 계산된 D_h 데이타를 유도한다), 단백질 농도 증가에 따라 수력학적 직경의 증가가 설명될 수 있다. 단백질 분자는 보다 낮은 랜덤한 브라운 운동을 경험하고, 따라서, 소정의 점도의 경우, 샘플 시험편의 수력학적 직경은 보다 높게 계산된다. 결국, D_h 값에 기초하는 z-평균과 단량체의 D_h 값은 충분히 일치한다. 추가로, 농도가 증가함에 따라 단백질 불용해도의 표시인 D_h의 증가가 관찰되지 않는다(즉, 고분자량 응집물 및 침전이 (존재할 경우) D_h의 상당한 증가를 유도할 것이다).

8.2: J695 수력학적 직경

도 7 및 8은 J695의 수력학적 직경인 114.52mg/mL 농도에 도달할 때까지 비교적 단백질 농도와 무관하다는 것을 보여준다. J695 농도를 114.52mg/mL에서 133.25mg/mL로 증가시키면 신속한 D_h 증가를 유도한다. 217.53mg/mL 농도에서의 수력학적 직경은 114.52mg/mL에서보다 높았다. 이 발견은 단백질 농도가 증가함에 따라 점도가 증가할 때, 두 단백질 용액을 동일한 SOP(동일 점도 1.9mPas로 가정)를 사용하여 측정하기 때문에 놀랍지 않다. 따라서, 114.52mg/mL로부터 133.25mg/mL로의 강한 증가는 인위적 결과로서 설명될 수 있다.

8.3: 사람 혈청 알부민 수력학적 직경

WFI 중의 HSA의 수력학적 직경은 농도가 9.88mg/mL에서 112.74mg/mL로 증가함에 따라 감소하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 112.74mg/mL로부터 177.69mg/mL에서는 수력학적 직경이 증가하는 것으로 밝혀졌다.

HSA는 기초하는 이론적 원리에 따라 단백질 농도가 증가함에 따라 수력학적 직경(피크 단량체)이 증가하는 일반적 경향을 나타냈다. 9.88mg/mL로부터 22.89mg/mL로의 D_h의 감소는 측정 SOP의 변화로 유도된다(가정된 점도 1.1mPas로부터 가정된 점도 1.9mPas로의 전환).

상기를 기술하는 수치 데이타는 부록 A에 제공한다.

실시예 9: J695: 수력학적 직경에 대한 부형제의 영향

단백질이 순수한 물에 고농도로 용해될 수 있다는 놀라운 결과를 밝혀내어 비경구 제형에 통상적으로 사용된 이온성 부형제 및 비이온성 부형제의 수력학적 직경에 대한 영향을 평가하였다. J695를 모델 단백질로서 사용하였다.

표 15는 용액 몰삼투농도가 염화나트륨의 농도에 직접 비례한다는 것을 보여준다. 단백질 용액 중의 몰삼투농도는 NaCl 농도에 따라 증가한다(거의 선형 관계). 흥미롭게도, J695 단백질의 수력학적 직경은 염 농도 증가에 따라 증가한다. NaCl은 음이온성 부형제이고, 단백질의 표면에서 흡수될 수 있는 양으로 하전된 나트륨 이온과 음으로 하전된 클로라이드 이온으로 해리된다. 염이 존재하지 않고, J695의 수력학적 직경은 통상적으로 J695에 대해 기대되는 것보다 극적으로 낮다(일반적으로, 10nm 주위의 값이 측정된다).

표 15에 예시된 바와 같이, 몰삼투농도는 단백질 용액 중의 만니톨의 농도 증가에 따라 선형으로 증가하였다. 대조적으로, 수력학적 직경은 만니톨 농도에 대한 의존성을 나타내지 않았다. 만니톨은 비이온성 당 알콜/폴리올이다. 만니톨 또는 폴리올은 비경구 제형 발생 및 최종 제형화 동안 안정화제로서 사용된다. 만니톨은 우선 배제로 단백질을 안정화시킨다. 기타 삼투물질(osmolytes)로서, 만니톨이 단백질 표면으로부터 우선 배제되고, 이는 단백질의 수화물 쉘의 외부에 존재한다. 따라서, 단백질의 접힌 상태가 안정한데, 이는 거대한 표면을 갖는 접히지 않은 상태가 열역학적으로 덜 바람직하게 되기 때문이다[참조: Foster, T.M., Thermal instability of low molecular weight urokinase during heat treatment. III. Effect of salts, sugars and Tween 80, 134 International Journal of Pharmaceutics 193 (1996); Singh, S. and Singh, J., Effect of polyols on the conformational stability and biological activity of a model protein lysozyme, 4 AAPS PharmSciTech, Article 42 (2003)]. 그러나, 몰삼투농도가 단백질의 D_h에 영향을 미치지 않고, 경우에 따라 염기성으로 조정될 수 있다-이는 본원에서 기술된 단백질 발견의 중요한 특징이다-는 것은 흥미롭다. 이러한 발견은 고농도 단백질 제형에서 유용할 수 있고, 여기서 만니톨에 의한 몰삼투농도 조정이 단백질 D_h의 증가로 반영되지 않기 때문에(점도가 일정하게 유지될 것으로 기대된다는 것을 의미한다), 점도 관련 제조 및 용량 문제가 존재할 수 있다.

표 15

J695 몰삼투농도 및 Z-평균에 대한 부형제의 영향

실시예 10: 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 고단백질 제형의 분석

SEC 분석을 위해, 아달리무맙, J695 및 HSA의 샘플을 주입 전에 2mg/mL로 희석시켰다. 아달리무맙의 주입 용적은 20μL였다. J695 및 HSA의 경우, 10μL의 주입 용적이 사용되었다.

10.1: 아달리무맙의 SEC 분석

아달리무맙의 단량체의 양은 99.4%에서 98.8%로 약간 감소되면서 9.35mg/mL에서 206.63mg/mL로 농축되는 경향이 있다. 단량체의 그러한 감소는 각각 23.27mg/mL에서 206.62mg/mL으로 농축되면서 0.4%에서 1.1%로 증가하는 아달리무맙 용액 중의 응집물의 양과 관련된다. 분획의 양은 단백질 농도와 무관하게 0.1%로 일정하게 유지된다(참조: 부록 B의 표). 따라서, 아달리무맙은 WFI에서 안정하다.

결국, 단백질 농도 증가에 따른 단백질 응집의 증가는 단지 최소로 간주된다. 단량체 감소에서의 유사한 경향이, 단백질이 완충 시스템 중에서 제형화될 경우 및 추가의 계면활성제가 첨가될 경우에 기대될 것이다. 아달리무맙 단백질은 순수한 물에서 제형화할 경우 놀랍게도 안정한 것으로 나타난다.

10.2: J695의 SEC 분석

J695 단량체의 양은 9.99mg/mL에서 217.53mg/mL로의 단백질 농도 증가와 함께 99.4%에서 98.6%로 약간 감소하였다. 단량체의 감소는 9.99mg/mL에서 217.53mg/mL로의 단백질 농도 증가와 함께 약 0.4%에서 약 1.2%로의 응집물 증가와 관련된다. 단백질 농도와 무관하게, 단편의 양은 9.99mg/mL에서 217.53mg/mL로의 단백질 농도 증가와 함께 0.17%에서 0.23%로 거의 일정하였다.

결국, 단백질 농도 증가와 함께 단백질 응집물의 증가는 단지 최소인 것으로 간주된다. 단량체 감소에서의 유사한 경향이, 단백질이 완충 시스템 중에서 제형화될 경우 및 추가의 계면활성제가 첨가될 경우에 기대될 것이다. 따라서, J695 단백질은 순수한 물 중에서 제형화될 경우 놀랍게도 안정하게 나타난다.

10.3: HSA의 SEC 분석

단량체 HSA의 양은 9.88mg/mL에서 112.74mg/mL로 농축되면서 95.9%에서 92.75%로 감소되었다. 177.69mg/mL의 샘플의 경우, 94.5% 이하까지의 단량체 증가가 측정되었다. 단량체 양의 감소는 9.88mg/mL에서 112.74mg/mL로 농축되면서 4.1%에서 7.25%로 증가하는 단백질 응집물에 따른다. 따라서, HSA 단백질은 또한 순수한 물 중에서 제형화될 경우 안정한 것으로 나타난다.

상기한 SEC 실험을 기술하는 수치 데이타는 부록 B에 제공한다.

실시예 11: 고단백질 제형의 분석-이온 교환 크로마토그래피(IEC)

IEC 분석을 위해, 아달리무맙, J695 및 HSA의 샘플을 주입 전에 1mg/mL로 희석시켰다. 모든 단백질에 대한 주입 용적은 100μL였다.

11.1: 아달리무맙의 IEC 분석

도 9에 도시된 바와 같이, 아달리무맙은 WFI에서 안정하였다. 도 9는 리신 변이체의 합(리신 0, 1 및 2)이 WFI 중의 아달리무맙의 농도 증가에 따라 감소한다는 것을 지시하는 것으로 해석될 수 있는 약간의 경향을 나타낸다. 그러나, 결국 리신 변이체의 퍼센트는 0.25% 미만으로 변한다.

11.2: J695의 IEC 분석

도 10은 J695 피크 1 내지 7의 합은 J695 농도 증가와 함께 약간 감소됨을 나타낸다. 피크 1 내지 7의 감소와 함께, 산성 및 염기성 피크의 합은 약간 증가하고, 산성 피크에서의 증가가 조금 더 현저하다(참조: 도 11 및 12). 산성 피크의 합은 약 10.2%에서 10.6%로, 염기성 피크의 합은 0.52%에서 0.59%로 각각 약간 증가한다.

결국, 순수한 물에서 J695 제형의 주요한 불안정성 효과 또는 불용해성 효과는 IEC를 통해 전혀 관찰되지 않았다는 것을 기술할 수 있다.

상기한 IEC 실험을 기술하는 수치 데이타는 부록 C에 제공한다.

실시예 2 내지 11에서의 발견의 요약

초기에는 단백질, 예를 들면, 항체를 WFI로 옮기면 단백질을 순수한 물에서 이의 용해도 한계를 초과하여 농축시킴으로써 단백질 침전을 야기할 것이라고 생각되었다. 상기 연구는 항체를 포함하는 단백질이 저농도에서 임의의 침전 현상 및 용해도 제한을 경험하지 않고 순수한 WFI로 옮겨질 수 있을 뿐만 아니라 놀랍게도 아달리무맙(뿐만 아니라 기타 2개의 시험 단백질)은 UF/DF 및 원심분리 기술(예: TFF 장치, 비바스핀 장치)를 사용하여 200mg/mL를 초과하는 초고농도로 순수한 물에서 농축될 수 있음을 입증한다. 또한, 아달리무맙 유백광은 단백질이 WFI에서 제형화될 경우에 실질적으로 감소되는 것으로 예기치 않게 밝혀졌다. 몰삼투농도는 아달리무맙 완충 매질이 염 비함유 순수한 물(즉, WFI)로 완전히 교환됨을 보장하기 위해 모니터하였다. 또한, 냉동-해동 공정은 분석을 위한 샘플 제조 동안 수행하고, 실질적으로 불안정성 현상은 SEC 및 IEC 분석으로 관찰되지 않았다.

단백질, 예를 들면, 아달리무맙을 WFI에서 고농도로 제형화하는 접근법은 점도 현상을 감소시키는데 잠재력을 나타내고, 이는 흔히 고단백질 농도에서 간단한 약물 생성물 개발을 지연시킨다.

최종적으로, 아달리무맙의 수력학적 직경(양자 상관 분광학, PCS으로 측정됨)은 통상의 완충제(저점도 성향의 표시)에서보다 WFI에서 현저하게 낮은 것으로 밝혀졌다.

결국, 순수한 물에 초고농도로 가용성인 항체 및 구형 모델 단백질 HSA의 발견은 기본적인 단백질 섭생에 새로운 시각을 제공하고, 단백질 약물 제형에 새로운 접근법을 강력하게 제공하는 잠재력을 제공하고, 예를 들면,

- 고농축 단백질 제형의 유백광을 감소시키고,

- 고농축 단백질 제형의 점도를 감소시키고,

- 몰삼투농도를 점도 및 비유백광과 같은 특징을 변화시키지 않고 비이온성 부형제, 예를 들면, 만니톨을 첨가하여 단백질-WFI 용액 중에서 목적한 바로 조정할 수 있고(J695의 경우, 수력학적 직경 및 유백광은 만니톨이 첨가될 경우 변화되지 않지만 NaCl이 첨가될 경우 극적으로 증가되는 것으로 입증되었다),

- 약물 물질 제형에 새로운 패러다임을 제공하고, 그대로 처리하여 단백질을 WFI에서 초고농도로 농축시키기 위한 작업, 예를 들면, DF/UF에 적용하여 상당한 안정성 관련 없이 냉동시키고 해동시킬 수 있음을 입증한다. DF/UF 동안, 단백질 제형의 조성은, 특히 고농도로 처리 동안, 필수적으로 변한다는 익히 공지된 배경이 제공되고[참조: Stoner, M. et al., protein-solute interactions affect the outcome of ultrafiltration/diafiltration operations, 93 J. Pharm. Sci. 2332 (2004)], 이들 새로운 발견은 순수한 물에서의 단백질의 DF/UF에 의해 약물 물질 농도를 조정한 다음, 고 DS 농도에서 부형제를 첨가하여 유리하게 적용할 수 있다(이에 의해, 공정 장치 작업 동안 DS 제형이 변화하는 위험을 방지함). 또는, 부형제를 최종 약물 생성물 충전 마무리 동안 약물 물질에 첨가할 수 있다.

실시예 12: 물 제형 중의 아달리무맙의 제조

다음 실시예는 물 중에서 아달리무맙의 대량 생산을 유도하는 DF/UF 절차의규모확대를 예시한다.

12.1: 공정 파라미터의 평가

투석 공정 평가 연구를 실험실 규모로 수행하여 기타 부형제, 예를 들면, 만니톨 및 염화나트륨(도 13 및 14)을 함유하는 포스페이트/시트레이트 완충 시스템 중에서 제형화된 벌크 아달리무맙 약물 용액의 투석을 위한 적합한 파라미터를 규정하였다.

전도도 측정치는 단백질 용액 중에서 전도도 분석에 적합한 시판되는 전도도 측정기, 예를 들면, 광범위한 pH 범위에 대한 팽창 용량을 갖는 전도도 측정기 모델 세븐멀티(SevenMulti)(Mettler Toledo, Schwerzenbach, Switzerland)로 수행할 수 있다. 장치는 제조업자의 지침에 따라 작동된다(예: 전도도 센서가 메틀러 톨레이도 장치에서 변할 경우, 교정은 다시 수행되어야 하는데, 이는 각 센서가 상이한 셀 상수를 갖기 때문이고; 모델 세븐멀티 전도도 측정기의 작업 지침을 의미한다). 지침을 따를 경우, 전도도 측정치는 측정 프로브를 샘플 용액에 직접 침지시켜 수행할 수 있다.

도 13은 74mg/mL에서 아달리무맙을 함유하는 제형의 몰삼투농도 및 전도도의 원인이 되는 성분의 감소와 관련하여, 투석 절차의 효율을 도시한다. 항체 용액 중의 용질의 100배 감소 후, 몰삼투농도 및 전도도 측정치는 시판 제형으로부터의 이들 파라미터의 원래 측정치보다 훨씬 미만의 수준에서 크게 안정화된다.

도 14는 투석된 아달리무맙 벌크 용액 중의 pH의 안정성을 도시한다. 탈이온수에 대한 투석 전후(1:1,000,000)의 pH 수준은 아달리무맙 용액의 경우 상이한 초기 pH 판독치 범위를 갖는 것으로 나타난다. pH 수준은 투석 전후에 잔류물 중에서 거의 동일하게 잔류한다.

12.2: 벌크 약물 수용액 중의 고농축 아달리무맙의 제조

제1 단계에서, 제형화된 벌크 약물 용액(기타 부형제, 예를 들면, 만니톨 및 염화나트륨을 함유하는 포스페이트/시트레이트 완충 시스템)은 한외여과/정용여과에 의해 약 100mg/ml(12L 스케일, 밀리포어 펠리컨(Millipore Pellicon) 2 Mini Bio-A MWCO 10k 컬럼)으로 상향 농축시켰다. 제2 단계에서, 상향 농축된 용액을 탈이온수에 대해 투석하였다(SpectraPor7 MWCO10k, 희석 배율 1:100,000). 제3 단계로서, 투석된 용액을 한외여과/정용여과에 의해 밀리포어 펠리컨 2 Mini Bio-A MWCO 10k 컬럼을 사용하여 약 250mg/ml의 농도로 상향 농축시켰다.

표 16a는 단계 3의 절차 후 (DF/UF 처리된) 벌크 약물 수용액 중의 고농축 아달리무맙의 분석 결과를 나타낸다.

표 16a

DF/UF 벌크 처리된 아달리무맙의 몰삼투농도 및 전도도 데이타

12.3: 냉동/해동(F/T) 절차 모의 제조 조건

냉동은 -50℃ 이하, 통상적으로 -70 내지 -80℃의 온도에서 냉동되는 액체 47kg의 제조 규모 적재로 초저 온도 동결기(Revco Ultima II, 20 cu.ft.)를 사용하여 수행하였다. 액체를 1.6kg 충전 중량(예: 날젠(Nalgene) 2L PETG 스퀘어 매질)의 개별 병에 충전시켰다. 냉동은 48시간 후 완료하였다. 해동은 재료가 완전히 해동될 때까지 20 내지 40℃의 온도, 통상적으로 30℃에서 24kg의 제조 규모 적재로 순환 수욕(예: Lindergh/Blue)에서 수행하였다.

12.4: 냉동 및 해동 동안 병 매핑

병 용적 중의 개별 수평 용액 층을 분리하여 분석하였다. 250mg/mL 및 200mg/mL의 단백질 농도에서, 단지 최소의 구배 형성이 표 15 내지 19에 도시된 바와 같이 아달리무맙 수용액 중에서 검출되었다. 그러나, 250mg/mL 및 200mg/mL에서 제형화된 아달리무맙 용액(기타 부형제, 예를 들면, 만니톨 및 염화나트륨을 함유하는 포스페이트/시트레이트 완충 시스템을 갖는 용액)의 냉동 및 해동은 병의 하부에 침전물의 형성을 유도한다.

12.5: 아달리무맙의 시판 제형 및 저이온성 제형에서의 구배 형성

아달리무맙의 시판 제형 및 저이온성 (물) 제형에서의 동결 냉동 절차에 의한 구배의 형성을 비교하였다. 표 16b는 f/t 단계 후, 각종 농도의 시판 아달리무맙 용액의 육안 검사 결과를 도시한다. 침전물의 형성은 f/t 절차에 의해 용액 중에서 불안정성이 생성되었음을 지시한다. 100mg/mL 이상에서, 상당한 침전물 형성이 관찰되었다. 표 17은 냉동-해동 실험 전 2개의 50mg/mL 용액 및 1개의 100mg/mL 저이온성 제형의 분석 데이타를 제시한다.

표 16b

F/T 후 시판 아달리무맙 용액에서 관찰된 침전

표 17

냉동-해동 전 용액 분석 데이타

각각의 제형 1600mL(50mg/mL 용액) 또는 800mL(100mg/mL 용액)를 PETG 병에 위치시키고, 통상의 냉동(-80℃) 해동(23℃, 수욕) 절차를 수행하였다. 이어서, 샘플을 PETG 병의 상부, 중간 및 하부로부터 수집하고, pH, 밀도, 몰삼투농도 및 단백질 농도를 분석하였다. 분석 결과는 표 18에 제시한다.

표 18

냉동/해동 용액으로부터 병-매핑 층의 분석

아달리무맙의 시판 제형은 밀도(단백질 및 부형제의 이종/구배를 지시함), 몰삼투농도(부형제 구배 지시) 및 단백질 함량과 관련하여 냉동/해동시 상당한 구배를 나타냈다. 대조적으로, 냉동/해동시 50mg/mL 저이온성 아달리무맙 제형 중에서는 어떤 구배도 발견되지 않았다.

고농도 단백질에서, 구배 제형은 때때로 악화될 것으로 기대될 수 있다. 그러나, pH, 밀도, 몰삼투농도 및 단백질 농도에 관련하여 냉동/해동시 100mg/ml 저이온성 아달리무맙 제형에서 어떤 구배도 발견되지 않았다.

실시예 13: DF/UF 후 J695의 안정성

다음 실시예는 본 발명의 방법에 따라 DF/UF 처리 후 J695 안정성에 대한 데이타를 제공한다.

통상의 DS 완충제 중의 J695으로부터의 단백질 샘플을 pH 조정 후 또는 정용여과 후에 분석하였다. pH는 0.1M 인산, 단백질 농도 112mg/mL로 pH 4.4로 조정하였다. WFI 중의 농축된 샘플의 경우, 단백질 샘플을 30kDa RC 막이 구비된 TFF를 사용하여 약 1.5일 동안 주위 온도에서 정용여과시켰다(DF/UF). DF/UF 후의 단백질 농도는 192mg/mL. pH 4.7로 측정되었다.

13.1: 크기 배제 분석(SEC) 실험 절차

크기 배제 방법을 J695의 순도 평가를 위해 전개시켰다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 분자량에 따라 거대분자를 분리한다. 수지는 체질제로서 작용하여 수지의 세공에 소분자를 보유하고 거대분자가 컬럼을 통해 통과하도록 한다. 체류 시간 및 해상도는 선택된 수지의 세공 크기의 함수이다.

각 샘플을 기술된 농도를 기준으로 하여 정제수(밀리-Q)를 사용하여 2.5mg/mL로 희석시켰다. 50㎍의 각 샘플을 컬럼 위에 이중으로 주입하였다. 토소 바이오사이언스 G3000swxl, 7.8mm x 30cm, 5㎛(Cat # 08541) SEC 컬럼을 분리용으로 사용한다. 완충제 A로, 211mM Na₂SO₄/92mM Na₂HPO₄, pH 7.0을 사용하였다. 검출은 280㎚ 및 214㎚에서 수행하였다. 컬럼을 유량 0.3mL/분으로 실온에서 유지시켰다.

이 크로마토그래피는 50분 동안 100% 이동상 A 용매를 갖는 등용매 구배를 사용한다.

13.2: SEC 데이타

표 19는 크기 배제 크로마토그래피 실험으로부터의 데이타를 기술한다.

표 19

J695 참조 기준, DS 및 (물 중) DF/UF 후 SEC 분석 데이타

13.3: SEC 분석 결론

표 19의 데이타는 J695의 시판 제형(DS PFS, pH = 4.4)은 J695 참조 기준으로서 단편 및 응집물의 필적할 만한 수준을 갖는다는 것을 보여준다. 시판 제형 J695 대조군 및 물 중에서 DF/UF를 수행하는 J965(H₂O 중의 DS, pH=4.7, 192mg/ml) 사이의 응집물 양에서 주시되는 차이가 있다: 응집물의 0.4%에서 0.7%로의 증가가 관찰되었다. 이는 상당한 증가가 아니었고, UF/DF 동안 실온에서 소비되는 시간에 기인할 수 있다. 단편에서의 변화는 존재하지 않는다.

13.4: IEC(WCX-10) 실험 절차

양이온 교환 방법을 디오넥스(Dionex) WCX-10 컬럼을 사용하여 J695의 이종성의 평가를 위해 전개하였다. 일반적으로, 양이온 교환 크로마토그래피는 겉보기 pI 및 수지와의 표면 전하 상호작용에 따라 단백질 이소폼을 분리한다. 목적하는 단백질을 특이한 저 염 출발 조건하에 컬럼에 결합시키고, 구배를 통해 염 농도를 증가시켜 컬럼으로부터 용출시켰다. 겉보기 pI가 낮은 단백질은 양이온 교환 컬럼에 덜 긴밀하게 결합하고, 최초로 용출되고, 겉보기 pI가 높은 단백질은 보다 긴밀하게 결합하고, 최후로 용출된다.

WCX-10을 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피를 많은 방출 검정으로서 품질 대조에 사용하였다. 검정 조건을 변형하여 공지된 J695 이소폼의 분리를 향상시켰다.

샘플을 정제수(밀리-Q)를 사용하여 1.0mg/mL로 희석시켰다. 참조 기준은 비교용으로서 3회 작동시키고, 정제수(밀리-Q)로 1.0mg/mL로 희석시켰다.

상응하는 가드 컬럼(p/n 054994)과 함께 디오넥스 프로팍(Dionex Propac) WCX-10 컬럼을 분리용으로 사용하였다. 절차에 사용된 완충제는 완충제 A(10mM Na₂HPO₄, pH=6.0) 및 완충제 B(10mM Na₂HPO₄, 500mM NaCl, pH = 6.0)를 포함한다. 컬럼 온도는 35℃에서 유지시키고, 컬럼 유량은 1mL/분이었다. 주입 용적은 100㎍ 적재에 대해 100μl이고, 검출은 280㎚에서 수행하였다. 크로마토그래피 분리 과정 동안 완충제 구배를 표 20에 제시한다.

표 20

J695의 IEC 분석에 사용된 완충제 구배

13.5: IEC 데이타

표 21은 시판 완충제(DS pH=4.4)에서 J695 참조 기준을 J695와 비교하는 실험 및 DF/UF(DF/UF H₂O, pH=4.7) 후 시판되는 완충제 제형과 J695의 비교로부터의 결과를 제공한다.

표 21

J695 참조 기준, 시판 제형(DS) 및 (물 중) DF/UF 후의 IEC 데이타

13.6: IEC 분석 결론

J695 참조 기준과 시판 제형(DS, pH 4.4) 사이에 약간의 차이가 주시된다. 이러한 차이는 DS 공학 작동 샘플의 초기 작동에서 주시되고, 3000L 및 6000L 캠페인 사이의 제조 공정의 차이에 기인한다. DS, pH 4.4 대조군과 H₂O 중의 J695 pH=4.7, 192mg/mL 샘플 사이에는 주목할 만한 차이가 없었다.

실시예 14: DF/UF 및 2 내지 8℃에서 장기간 저장 후의 아달리무맙의 안정성

다음 실시예는 2 내지 8℃에서 22.5개월 저장 후 본 발명의 방법에 따라 수성 제형에서의 아달리무맙의 안정성을 나타내는 데이타를 제공한다.

SEC 및 WCX-10 분석을 위한 아달리무맙 샘플을 물에 대해 정용여과시키고, 약 177mg/mL로 농축시켰다. 샘플을 저장하고, 각종 시간 지점에서 안정성에 대해 분석하였다.

시판되는 후미라(Humira) 완충제 중의 표준 아달리무맙 용액(DS, pH 약 5.2)을 물 중의 농축 용액을 생성하기 위한 출발 물질로서 사용하였다. 단백질 용액 샘플을 주위 온도에서 30kDa RC 막이 구비된 TFF를 사용하여 약 1.5일 동안 물에 대해 정용여과시켰다(DF/UF). DF/UF 후의 단백질 농도는 약 177mg/mL, pH 5.2로 측정되었다. 샘플을 분석 전에 2 내지 8℃에서 22.5개월 동안 저장하였다.

14.1: SEC 실험 절차

크기 배제 방법을 사전에 전개시켜 항체 단편 및 응집물의 존재에 대해 체크하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 분자량에 따라 거대분자를 분리한다. 수지는 체질제로서 작용하여 소분자를 수지의 세공에 유지시키고, 거대 분자를 컬럼을 통해 통과시켰다. 체류 시간 및 해상도는 선택된 수지의 세공 크기의 함수이다.

각 샘플을 밀리 Q 물을 사용하여 1.0mg/mL로 희석시키고, 각 샘플 50㎍를 컬럼에 주입하였다. SE-HPLC를 위해, 세파덱스 200 컬럼(Pharmacia cat# 175175-01, S/N 0504057) 또는 TSK 겔 G3000SW(cat# 08541; 22.5개월 샘플 분석을 위해)를 사용하였다. 컬럼의 이동상은 20mM 인산나트륨 및 150mM 염화나트륨, pH 7.5을 포함한다. 검출은 280㎚ 및 214㎚에서 수행하였다. 컬럼을 주위 온도에서 유지시키고, 유량은 0.5mL/분(세파덱스 컬럼) 또는 0.3mL/분(TSK 컬럼)이었다.

14.2: SEC 데이타

도 20 및 표 22는 액체로서 2 내지 8℃에서 8.5개월 동안 저장된 저이온성 아달리무맙 용액을 -80℃에서 저장된 동일 용액과 비교한 분석 결과를 함유한다. 표 23은 아달리무맙의 참조 기준 샘플과 비교하여 2 내지 8℃에서 22.5개월 동안 저장된 저이온성 아달리무맙 용액에 대한 분석 데이타를 함유한다.

표 22

냉동 저장된 아달리무맙 대 장기간 냉장 저장된 아달리무맙을 비교한 SEC 분석 데이타

표 23

아달리무맙 참조 기준 대 장기간 냉장 저장된 아달리무맙을 비교한 SEC 분석 데이타

표 22에서 알 수 있는 바와 같이, SEC 분석은 물 중의 아달리무맙이 2 내지 8℃에서 9개월 후에도 또는 -80℃에서 4.5개월 동안 안정한데, 이는 응집물 퍼센트(%HMW) 및 단편 퍼센트(%LMW)가 시간에 따라 아주 적기 때문이다.

14.3: SEC 분석 결론

2 내지 8℃에서 8.5개월 저장 후, 아달리무맙 용액(물에 대한 DF/UF)은 고부자량(HMW) 종의 작은 분획(0.2%) 및 단편의 작은 분획(0.3%)을 나타냈다. -80℃에서 4.5개월 저장 및 후속적 해동(수욕, 23℃)은 아달리무맙 안정성(0.1% 응집물, 0.3% 단편)에 영향을 미치지 않았다.

2 내지 8℃에서 22.5개월 동안 저장된 샘플의 분석은 또한 아달리무맙 참조 기준에 필적할 만한 단편 함량을 보여준다(표 23). 그러나, 22.5개월 안정성 샘플에서 검출된 응집물 수준(1.66%)은 참조 기준에서 검출된 응집물 수준보다 다소 높다.

항체의 자체 결합은 항체 농도, 즉 비공유 응집물의 형성에 크게 좌우되고, 결합 착물은 고농도 단백질에서 가장 현저하다는 것이 공지되었다. 이 자체 결합은 가역적이고, 완충 용액에 의한 희석은 감소된 자체 결합 경향을 유도한다[참조: Liu, J. et al., 94 Journal of Pharmaceutical Sciences 1928 (2004)].

따라서, 샘플 제제의 차이 및 아달리무맙 용액 희석(177mg/mL로부터 1mg/mL로) 및 SEC에 의한 후속적 샘플 분석 사이의 상이한 시간 지체는 8.5개월 및 9개월 안정성 샘플의 응집물 함량의 차이에 대한 원인일 수 있다.

14.4: IEC 실험 절차

양이온 교환 방법은 디오넥스 WCX-10 컬럼을 사용하여 항체 전하 이종성 평가용으로 전개하였다. 양이온 교환 크로마토그래피를 겉보기 pI 및 수지와의 표면 전하 상호작용에 따라 단백질 이소폼을 분리한다. 목적하는 단백질은 특이적 저 염 출발 조건하에 컬럼에 결합되고, 구배를 통해 염 농도를 증가시켜 컬럼으로부터 용출된다. 겉보기 pI가 낮은 단백질은 양이온 교환 컬럼에 덜 긴밀하게 결합하고 최초로 용출되고, 겉보기 pI가 높은 단백질은 보다 긴밀하게 결합하고 최종적으로 용출된다.

절차 전에, 샘플을 밀리 Q 물을 사용하여 1.0mg/mL로 희석시켰다. 상응하는 가드 컬럼(p/n 05499)과 함께 디오넥스 프로팍 WCX-10 컬럼(p/n 054993)을 분리용으로 사용하였다. 2개의 이동상 완충제로서, 10mM 인산나트륨, pH 7.5(완충제 A) 및 10mM 인산나트륨, 500mM 염화나트륨, pH 5.5(완충제 B)를 제조하였다. 컬럼을 주위 온도에서 유지시키고, 유량은 1.0mL/분이었다. 주입 용적은 100㎍ 적재에 대해 100μl이고, 검출은 280㎚에서 수행하였다. 크로마토그래피 분리 동안 완충제 구배는 표 24에 제시한다.

표 24

아달리무맙의 IEC 분석에 사용된 완충제 구배

14.5: 이온 교환 데이타

표 25는 아달리무맙 참조 기준, 시판 제형(150mg/mL) 및 저장 전 DF/UF 후 저이온성 용액의 이온 교환 크로마토그래피 데이타를 나타낸다. 표 26은 2 내지 8℃에서 22.5개월 저장 후 저이온성 용액과 비교한 참조 기준 데이타를 나타낸다.

표 25

아달리무맙 참조 기준, DS/시판 제형 및 (물 중) DF/UF 후의 IEC 분석 데이타

표 26

참조 기준과 장기간 냉장 저장된 DF/UF 샘플을 비교한 IEC 분석 데이타

14.6: 이온 교환 분석 결론

T0 샘플의 경우, 데이타는 참조 기준 아달리무맙, 시판 제형 아달리무맙(아달리무맙을 DF/UF에 의해 물 속에서 제형화하는데 DS로서 사용됨) 및 물에 대해 정용여과되고, 177mg/mL로 농축된 아달리무맙 사이의 산성 영역 1, 2, 0 Lys, 1 Lys 또는 2 Lys(즉, 전하 이종성)의 퍼센트에서 차이가 없음을 나타낸다(표 25).

또한, 177mg/mL 아달리무맙 샘플을 물에 22.5개월 저장 후, 아달리무맙 참조 기준과 비교시 0 Lys, 1 Lys 및 2 Lys 분획에서 단지 약간의 차이가 나타날 수 있다. 요약하면, 아달리무맙을 물 속에서 DF/UF 처리로 제형화하고, 177mg/mL 농도에서 2 내지 8℃에서 22.5개월 동안 저장시 어떤 상당한 화학적 불안정성 경향도 관찰되지 않는다.

실시예 15: 저이온성 1D4.7 용액의 냉동/해동 안정성

물 속에서 투석으로 제형화된(제조업자의 작업 지침에 따라 슬라이드-에이-라이저(slide-a-lyzer) 카셋트 사용, Pierce, Rockford, IL) 1D4.7 단백질(면역글로불린 G1) 항-IL 12/항-IL 23은 2mg/mL 농도, pH 6에서 반복 냉동/해동(f/t) 처리 동안(-80℃/25℃ 수욕) 안정한 것으로 입증되었다. 데이타를 통상의 제형(2mg/mL, pH 6)과 비교하고, 물에서 제형화된 1D4.7의 안정성은 통상적으로 스크리닝된 완충 시스템(예: 20mM 히스티딘, 20mM 글리신, 10mM 포스페이트, 10mM 시트레이트)에서 제형화된 1D4.7의 안정성을 초과하고, 단백질 제형화에 통상 사용되는 각종 부형제, 예를 들면, 10mg/mL 만니톨, 10mg/mL 소르비톨, 10mg/mL 슈크로즈, 0.01% 폴리소르베이트 80, 20mM NaCl을 포함하는 범용 완충제(10mM 포스페이트, 10mM 시트레이트)에 기초하는 1D4.7 제형의 안정성을 훨씬 초과한다고 밝혀졌다.

SEC, DLS 및 입자 계수를 수행하여 단백질 안정성을 모니터하고, 입자 계수는 1 내지 200㎛의 측정 범위를 갖는 입자 계수 시스템(예: 입자 계수기 모델 시린지, Markus Klotz GmbH, Bad Liebenzell, Germany)을 사용하여 수행하였다. 실험 상세는 다음과 같다:

- 물에서 제형화된 1D4.7을 상기 나열된 제형과 비교한다

- 4회 냉동/해동 주기를 적용한다

- 30mL PETG 저장기, 약 25mL 충전물, 2mg/mL, pH 6

- TO, T1(즉 1회 f/t 단계 이후), T2, T3 및 T4에서 샘플링

- 분석: 육안 검사, SEC, DLS, 육안으로 보이지 않는 입자 측정

도 21은 육안으로 보이지 않는 1㎛ 초과 입자의 형성에 의해 반영되는 반복 f/t 주기(-80℃/25℃) 동안 1D4.7 안정성을 나타낸다. 1D4.7을 범용 완충제(10mM 시트레이트, 10mM 포스페이트)에서 제형화한 다음, 다음 부형제 변형태를 시험하였다: 소르비톨(10mg/mL), 만니톨(10mg/mL), 슈크로즈(10mg/mL), NaCl(100mM) 및 폴리소르베이트 80(0.01%). 1D4.7은 또한 어떤 부형제도 전혀 첨가하지 않고 물에서 (투석으로) 제형화하였다. 주입용수를 또한 f/t 주기 및 육안으로 보이지 않는 입자 시험에 적용하여 입자 적재에 대한 재료 취급, f/t 및 샘플 수집의 잠재적 영향을 평가하였다.

f/t하여 물에서 제형화된 1D4.7의 안정성은 단백질 제형에 통상적으로 사용된 부형제로 제형화된 1D4.7 용액의 안정성을 초과한다. 만니톨, 슈크로즈 및 소르비톨은 동결보호제 및/또는 냉동보호제로서 작용하는 것으로 공지되고, 폴리소르베이트 80은 소수성-친수성 계면, 예를 들면, 각각 공기-물 및 아이스-물에 노출시 단백질의 물리적 안정성을 증가시키는 것으로 일반적으로 널리 공지된 비이온성 부형제이다. 따라서, 물에서 제형화된 1D4.7 용액은 적용된 기타 방법론(예: SEC, 육안 검사 등)으로 분석시 안정한 것으로 나타났다.

실시예 16: 저이온성 13C5.5 항체 용액의 냉동/해동 안정성

물에서 제형화된 13C5.5 항 IL-13 단백질은 2mg/mL 농도, pH 6에서 반복 냉동/해동(f/t) 처리 동안(-80℃/25℃ 수욕) 안정한 것으로 입증되었다. 데이타를 통상의 제형(2mg/mL, pH 6)과 비교하고, 물에서 제형화된 13C5.5의 안정성은 통상적으로 스크리닝된 완충 시스템(예: 20mM 히스티딘, 20mM 글리신, 10mM 포스페이트, 10mM 시트레이트)에서 제형화된 13C5.5의 안정성을 초과하고, 단백질 제형화에 통상 사용되는 각종 부형제(예: 10mg/mL 만니톨, 10mg/mL 소르비톨, 10mg/mL 슈크로즈, 0.01% 폴리소르베이트 80, 20mM NaCl, 200mM NaCl)를 포함하는 범용 완충제(10mM 포스페이트, 10mM 시트레이트)에 기초하는 13C5.5 제형의 안정성을 훨씬 초과한다고 밝혀졌다.

샘플 제조, 실험 처리, 샘플 수집 및 샘플 분석은 1D4.7에 대한 실시예 15에서 개략된 바와 동일한 방식으로 수행하였다.

- 물에서 제형화된 13C5.5를 상기 나열된 제형과 비교한다

- 4회 냉동/해동 주기를 적용한다

- 30mL PETG 저장기

- 2mg/mL, pH 6

- TO, T1, T2, T3 및 T4에서 샘플링

- 분석: 육안 검사, SEC, DLS, 육안으로 보이지 않는 입자 측정

도 22는 육안으로 보이지 않는 10㎛ 초과 입자의 형성에 의해 반영되는 반복 f/t 주기(-80℃/25℃) 동안 13C5.5 안정성을 나타낸다. 13C5.5를 10mM 포스페이트 완충제, 10mM 시트레이트 완충제, 20mM 글리신 완충제 및 20mM 히스티딘 완충제에서 제형화하였다. 13C5.5를 또한 어떤 부형제도 전혀 첨가하지 않고 물에서 (투석으로) 제형화하였다. 주입용수를 또한 f/t 주기 및 육안으로 보이지 않는 입자 시험에 적용하여 입자 적재(블랭크)에 대한 재료 취급, f/t 및 샘플 수집의 잠재적 영향을 평가하였다.

f/t시 물에서 제형화된 13C5.5의 안정성은 단백질 제형에 통상적으로 사용된 부형제로 제형화된 13C5.5 용액의 안정성을 초과한다. 물에서 제형화된 13C5.5 용액의 불안정성은 적용된 기타 분석학적 방법론(예: SEC, 육안 검사 등)으로는 관찰되지 않았다.

도 23은 육안으로 보이지 않는 1㎛ 초과 입자의 형성에 의해 반영되는 반복 f/t 주기(-80℃/25℃) 동안 13C5.5 안정성을 나타낸다. 13C5.5를 범용 완충제(10mM 시트레이트, 10mM 포스페이트)에서 제형화한 다음, 다음 부형제 변형태를 시험하였다: 소르비톨(10mg/mL), 만니톨(10mg/mL), 슈크로즈(10mg/mL), NaCl(200mM), NaCl(20mM) 및 폴리소르베이트 80(0.01%). 13C5.5는 또한 비교용으로 어떤 부형제도 전혀 첨가하지 않고(순수한 물) 물에서 (투석으로) 제형화하였다. 주입용수를 또한 f/t 주기 및 육안으로 보이지 않는 입자 시험에 적용하여 입자 적재에 대한 재료 취급, f/t 및 샘플 수집의 잠재적 영향을 평가하였다.

f/t하여 물에서 제형화된 13C5.5의 안정성은 단백질 제형에 통상적으로 사용된 부형제로 제형화된 13C5.5 용액의 안정성을 초과한다. 만니톨, 슈크로즈 및 소르비톨은 동결보호제 및/또는 냉동보호제로서 작용하는 것으로 공지되고, 폴리소르베이트 80은 소수성-친수성 계면, 예를 들면, 각각 공기-물 및 아이스-물에 노출시 단백질의 물리적 안정성을 증가시키는 것으로 일반적으로 널리 공지된 비이온성 부형제이다.

물에서 제형화된 13C5.5 용액의 불안정성은 적용된 기타 분석학적 방법론(예: SEC, 육안 검사 등)으로는 관찰되지 않았다.

f/t 절차 후 13C5.5 용액의 DLS 분석을 상기한 바와 같이 수행하였다. 0.01% Tween-80을 포함하는 13C5.5 용액은 단지 1회의 f/t 단계 후 상당한 고분자량(HMW) 응집물 형태를 함유하는 반면, 물 중의 13C5.5는 3회의 f/t 단계 후에도 어떤 HMW 응집물 형태도 함유하지 않았다.

실시예 17: WFI 중의 아달리무맙에 대한 용액 pH의 영향

다음 실험을 수행하여 WFI에서 제형화 고농축 아달리무맙의 물리-화학적 특징에 대한 용액 pH의 영향을 측정하였다. 다음 농도를 시험하였다: 2mg/mL, 50mg/mL, 100mg/mL, 150mg/mL, 200mg/mL 및 250mg/mL.

재료

· 아달리무맙 약물 물질(DS), 시판되는 재료

· 해동을 위해 사용된 25℃ 수욕(순환성)

· 정용여과 장치: 사르토리우스 사르토콘 슬라이스(Sartorius Sartocon Slice), 막: PES 50kD, 1000cm²

· 정용여과 장치: 밀리포어 랩스케일 TFF 시스템, 막: PLCTK 30kD, 재생 셀룰로스, 크기: 50cm²

· 에펜도르프 원심분리기 5810 R

· 원심분리용 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-15 저장기, 울트라셀(Ultracel)-30k, 재생 셀룰로스 30,000 MWCO

· 밀렉스 GV 0.22㎛, 샘플의 멸균성 여과용 밀리포어

· 샘플 저장기(에펜도르프 샘플 저장기 1.5mL, 로트 동결바이알(Roth cryovials) 5mL, PETG 병 125mL)

분석:

· 바이오트로드를 사용하는 pH 측정

· 밀도 측정

· 몰삼투농도 측정

· 단백질 농도 측정용 UV/VIS 분광광도계

· 광자 상관 분광학(PCS)

· 점도 측정

· 혼탁도 측정

· 크기 배제 크로마토그래피(SEC)

· 푸리에 중간 변환 적외선 분광학(FT-M-IR)

17.1 아달리무맙 시판 제형의 DF/UF를 위한 제제 개관

아달리무맙 DS 용액(120mg/mL)을 각각 0.25N NaOH 및 0.25N HCl로 pH3, pH4, pH5, pH6, pH7, pH8, pH9로 조정된 7개의 용적 부분으로 분할하였다. 이어서, 샘플을 각각의 pH의 아달리무맙 완충제로 100mg/mL로 희석시켰다. 용액은 멸균 여과(0.22㎛, PVDF 멸균성 필터) 후 사라지는 약간의 흐림을 나타냈다. 희석 후, pH 값을 다시 모니터하였다(참조: 이하 표 27).

100mg/mL 용액의 다음 샘플을 각각의 용액으로부터 수집하였다:

· 혼탁도 및 후속적 제타 전위 측정용 4mL

· 점도 측정용 1mL(드롭핑-볼 점도계 사용)

· 몰삼투농도 측정용 0.15mL

· 밀도 측정용 2mL

· PCS용 0.15mL(샘플 점도를 측정을 위해 고려한다)

· FT-M-IR용 1mL

· 점도 및 정적 광 산란 측정용 2mL

제타전위, 점도 및 정적 광 산란 측정용 샘플을 냉동시켰다(-80℃). pH 4, pH 5, pH 6, pH 7 및 pH 8 용액의 잔류 용액을 교환 매질로서 주입용수를 사용하여 연속 방식 정용여과에 적용하였다. 샘플을 우선 -80℃에서 냉동시켰다. DF/UF 전에, 샘플을 줄라보(Julabo) 수욕에서 25℃에서 해동시켰다.

17.2 DF/UF 및 농축 절차

농도 100mg/mL이고, pH 수준 4, 5, 6, 7 및 8인 시판 제형 중의 아달리무맙 용액을 DF/UF 처리에 적용하고, 추가로 원심분리기 중에서 UF를 사용하는 농축 공정에 적용하였다. 이 단락은 예로서 pH 6 아달리무맙 용액의 처리를 기술한다. 기타 용액의 처리는 유사한 방식으로 수행하였다.

아달리무맙 용액(100mg/mL, pH 6)을 25℃에서 수욕에서 해동시킨 다음, 균질화시켰다. 이어서, 용액을 교환 매질로서 주입용수를 사용하여 다음과 같은 파라미터를 적용하여 TFF 장치 M.P. 33.4를 사용하여 정용여과에 적용하였다:

· 교반기: 속도 2

· 펌프: 속도 1

· 압력 업스트림/유입구: 2 내지 2.4bar

· 압력 다운스트림/배출구: 0.6 내지 0.8bar

· 막: 재생 셀룰로스, 컷-오프 30kD

· 연속 방식 DF/UF

· DF/UF 작업 동안 적용된 약 6배 용적 교환

6개 용적 교환 단계를 적용한 후, 아달리무맙의 농도를 OD280, 광도계 M.P. 9.7로 측정하였다. 투과물 및 잔류물의 몰삼투농도를 체크하였다.

농도: 125.1mg/mL

몰삼투농도 투과물: 57mOsmol/kg

몰삼투농도 잔류물: 12mOsmol/kg

DF 후 물 중의 아달리무맙 용액을 주입용수를 사용하여 100mg/mL로 희석시키고, 멸균 여과시켰다. 다음 샘플을 DF/UF 공정 후 100mg/mL 용액으로부터 수집하였다:

· 혼탁도 및 후속적 제타 전위 측정용 4mL

· 점도 측정용 1mL

· 몰삼투농도 측정용 0.15mL

· 밀도 측정용 2mL

· PCS용 0.15mL(점도를 측정 동안 고려한다)

· SEC용 0.15mL

· pH- 측정

· FT-M-IR용 1mL

· 점도 및 정적 광 산란 측정용 2mL

100mg/mL 아달리무맙 용액 분량을 주입용수로 희석하여 50mg/mL 및 2mg/mL 용액을 생성하였다. 다음 샘플을 두 용액으로부터 수집하였다:

· 혼탁도 및 후속적 제타 전위 측정용 4mL

· 점도 측정용 2mL

· 몰삼투농도 측정용 0.15mL

· 밀도 측정용 2mL

· PCS용 0.15mL(점도를 고려한다)

· pH- 측정

물 중의 아달리무맙 용액(pH 6, 100mg/mL)을 원심분리를 사용하여 농축 실험에 적용하였다. 원심분리를 에펜도르프 원심분리기(5810R M.P. 33.57)로 수행하였다. 각각의 원심분리 단계를 4000rpm에서 15분 동안 적용하였다. 그 후, 원심분리 농축 장치 중의 샘플 용액의 균질화를 원만한 상하반전 회전으로 수행하여 용액을 균질화시키고, 이에 의해 막에 바로 인접한 영역에서 겔 형성을 피하였다. 농축 동안 온도는 15℃였다. 원심분리를 약 250mg/mL에서 수행하였다. 농도는 OD280, 광도계 M.P. 9.7로 측정하였다. 이어서, 아달리무맙 용액을 250mg/mL, 200mg/mL 및 150mg/mL의 농도로 희석시켰다.

다음 샘플을 농축 절차 후 및 각각의 개별적 희석 단계 후에 수집하였다. 250mg/mL 및 150mg/mL 용액으로부터 수집된 샘플 용적은 다음과 같다:

· 점도-측정용 2mL

· PCS용 0.15mL(점도를 고려한다)

· 몰삼투농도 측정용 0.15mL

· SEC용 0.15mL

· pH-측정

200mg/mL 용액으로부터 수집된 샘플 용적은 다음과 같다:

· 혼탁도 및 후속적 제타 전위 측정용 4mL

· 점도 측정용 1mL

· 몰삼투농도 측정용 0.15mL

· 밀도 측정용 2mL

· PCS용 0.15mL(점도를 고려한다)

· SEC용 0.15mL

· pH- 측정

· ABC에서 수행되는 분석 작업용 2mL(점도 및 정적 광 산란 측정)

물 중에서 아달리무맙 용액의 농축 처리를 각각의 pH 값에서 약 250mg/mL에서 중단했는데, 고농도에서, 특히 pI에 가까운 pH 값(아달리무맙에 대해 pH 약 8.5)에서 물에서의 아달리무맙 용액의 점도가 극적으로 증가되기 때문이다(점도 접근 겔 형성).

17.3 아달리무맙 용액의 육안 검사

DF/UF 및 250mg/mL로의 농축 후, 각종 pH에서 물 중의 아달리무맙 용액은 완충제 중의 아달리무맙 용액(시판 제형)보다 유백광을 덜 띄는 것으로 나타났다. 물 중의 아달리무맙 용액 모두가 각각 pH 값에서 투명한 용액으로 나타났다. 아달리무맙 용액 중의 어떤 것도 희석 후 유백광을 나타내지 않았다. 결국, 농축 및 희석 공정 동안, 물 중의 아달리무맙 용액에서 어떤 침전도 관찰되지 않았다.

17.4 점도

점도 측정은 각각의 개별 농도에서 pH 아달리무맙 용액의 밀도를 고려하여 수행하였다. 드롭핑-볼 점도계를 사용하였다. 200mPa*s보다 큰 점도를 모세관 점도계를 사용하여 측정하였다.

도 24는 각종 농도(2mg/mL 내지 250mg/mL, 50mg/mL 농축 단계 중)에서 4 내지 8의 pH 범위의 물 중의 아달리무맙 용액의 점도 데이타의 개관을 제공한다. 용액 pH, 농도 및 점도 사이에 명백한 상관관계가 있다. 점도는 용액 pH와 무관하게 단백질 농도 증가에 따라 증가한다. 아달리무맙의 pI에 밀접한 용액 pH 값(즉, pH 7 및 pH 8)에서, 용액 점도에서의 증가는 특히 고단백질 농도(즉, 200mg/mL, 250mg/mL)에서 가장 현저해졌다.

17.5 혼탁도

도 25에서 알 수 있는 바와 같이, 동일한 경향이 혼탁도 데이타에 대해 밝혀졌다(즉, 혼탁도는 농도 증가 및 pH 증가에 따라 증가하였다). 모든 샘플을 혼탁도 측정 전에 멸균 여과하였다(0.22㎛).

17.6 수력학적 직경(PCS)

PCS 측정을 각 농도 및 각 pH 값에서 각 샘플에 대한 점도를 고려하여 수행하였다. 200mg/mL 및 250mg/mL에서의 용액을 측정했지만, 제타사이저 나노 시리즈(Malvern Instruments) 장비의 시험 파라미터의 범위를 벗어나고, 결국 이들 측정으로부터의 데이타는 분석되지 않았다.

수력학적 직경(D_h)은 시판 제형으로 제형화된 아달리무맙(D_h 약 7㎚)와 비교하여 아달리무맙이 물 중에서 제형화될 경우(50mg/mL에서 D_h 약 2㎚, pH 5) 현저하게 감소되는 것으로 밝혀졌다. 도 26은 PCS 데이타를 예시한다(또한 표 39에서 밝혀진다). 상응하는 데이타 표는 이하 파트 17.11에서 제시된다.

도 26에 도시된 바와 같이, pH 값 4, 5 및 6에서 용액의 경우, 아달리무맙 단량체의 D_h는 증가하는 단백질 농도에 따라 일정하게 감소된다. 대조적으로, 아달리무맙의 pI에 근접한 pH 값(즉, pH 7 및 pH8에서)을 갖는 용액은 농도가 2mg/mL에서 50mg/mL로 증가함에 따라 D_h에서의 상당한 증가를 나타냈다. 그러나, pH 7 및 8 용액에서 농도가 50mg/mL를 초과하여 상승함에 따라, D_h는 감소되었다. 150mg/mL의 농도에서, 모든 용액은 2mg/mL에서의 상응하는 pH 용액보다 낮은 D_h 값을 가졌다. 도 27은 각종 농도의 pH 5 용액에 대한 D_h 크기 분포도를 나타낸다. 도 28은 각각 100mg/mL 단백질 농도 및 상이한 pH 값을 갖는 물에서 제형화된 5개의 아달리무맙 용액에 대한 D_h 크기 분포도를 나타낸다. 도 29는 5개의 아달리무맙 용액이 완충제에서 제형화된 것 이외에는 도 28의 데이타와 유사한 데이타를 나타낸다.

17.7 pH-측정

용액 pH 측정은 물을 사용하는 DF/UF 전후에 100mg/mL에서 수행하였다(즉, 각각 완충제 및 물에서 제형화된 아달리무맙에서 수행된다). 표 27은 결과를 나타낸다. pH 값은 DF/UF 전후에 pH 5, pH 6 및 pH 7에서 일정하게 유지된다. 용액 pH는 매질 변화 때문에 변하지 않는다. pH 값은 물을 사용하는 DF/UF 후에 pH 4에서 약간 증가하고, pH 8에서 약간 감소한다.

표 27

물을 사용하는 DF/UF 전후의 pH 값

17.8 몰삼투농도 측정

pH 5 용액 샘플의 DF/UF 동안, 용액 몰삼투농도를 각 용적 교환 단계 후(즉, 100mL 투과물, 200mL 투과물 등 후)에 측정하여 5배 용적 교환이 몰삼투농도를 15mOsmol/kg 이하로 감소시키기에 충분한지의 여부를 체크하였다. 표 28은 결과를 나타낸다.

표 28

물, pH 5 용액을 사용하는 DF/UF 동안 몰삼투농도 변화

pH 4, pH 6, pH 7 및 pH 8에서, 몰삼투농도를 단지 DF/UF 공정 말기에 측정하였다. 표 29는 각 pH에서 몰삼투농도 결과(단위: mOsmol/kg)를 나타낸다.

표 29

물을 사용하는 DF/UF 전후 각종 pH 값에서 몰삼투농도

몰삼투농도 측정은 냉동점 점도계를 사용하여 수행하였다.

17.9 단편화(SEC)

SEC 데이타는 전체 농도 범위(100 내지 250mg/mL)에 대해 pH 4 용액 중의 단백질의 비교적 현저한 단편화를 나타내는 반면, 동일 농도 범위에서 5 내지 8의 pH 범위에서 단편화가 거의 검출되지 않았다. 결과적으로, pH 4 용액의 단량체 함량은 따라서 감소된다(도 30). 응집물 값은 농도와 무관하게 pH 값의 증가(ph 4에서 pH 8로)에 따라 증가되는 것으로 밝혀졌다(도 31).

17.10 결론

이 실험은 DF/UF 처리로 물에서 제형화된 아달리무맙 용액의 점도 및 D_h(수력학적 직경)에 대한 용액 pH 및 단백질 농도의 영향을 시험하기 위해 고안되었다. 이러한 용액은 저이온성 용액으로 칭명된다. 4 내지 8의 pH 범위를 평가하고, 시험된 단백질 농도는 2 내지 250mg/mL 범위에 존재하였다.

점도(단락 17.4)와 관련하여, 저이온성 아달리무맙 용액은 이온(즉, 이온성 부형제, 예를 들면, 유기 완충제 성분 또는 염)의 존재하에 제형화된 아달리무맙 용액과 동일한 특성을 갖는다:

- 단백질 농도가 높을수록, 용액 점도가 높다. 이 농도-점도 상관관계는 아달리무맙 pI에 근접한 pH 값(즉, pH 7 및 pH 8)을 갖는 용액의 경우에 더 현저하였다. 반대로, 일정한 농도에서의 용액의 경우, 점도는 용액의 pH 값의 아달리무맙의 pI에의 근접성과 관련된다.

DLS 데이타(단락 17.6)와 관련하여, 다음과 같은 결론이 도출될 수 있다:

- 저이온성 아달리무맙 용액의 DLS에 의해 측정된 아달리무맙 D_h 값은 특히 매우 낮은 용액 pH에서 아달리무맙 시판 제형에서 측정된 D_h 값 미만인 것으로 밝혀졌다.

- 용액 pH가 낮을수록, DLS로 측정된 D_h 값은 낮다.

- 단백질 농도가 높을수록, 소정의 pH의 저이온성 아달리무맙 용액에서의 D_h 값이 낮다.

이러한 거동에 대한 설명은 단백질 용액 중의 이온 강도(즉, 이온 및 이온화가능한 부형제의 존재)가 단백질-단백질 상호작용 정도에 중요하다는 것이다. 특히, 낮은 용액 pH에서, 전하-전하 반발 작용이 저이온성 아달리무맙 용액에서 더욱 현저하다. 단백질이 DF/UF 처리에서 교환 매질로서 물을 사용하여 물에서 제형화될 경우, 헬름홀츠 층과 구이-채프먼 층 모두를 구성할 수 있는 이온화가능한 카운터 이온의 존재량은 현저하게 감소된다. 결과적으로, 분자간 전하-전하 상호작용(단백질 표면에 존재하는 아미노산 잔기의 전하에 기인)은 이온화가능한 카운터 이온(예: 이온화가능한 부형제)가 풍부한 환경에서보다 더욱 현저해질 수 있고, 단백질 단량체 사이의 전하-전하 반발 작용(전하-전하 반발 작용의 경우 분자 운동을 유도) 및 랜덤한 브라운 운동은 DLS에 의해 측정된 단백질 분자의 이동성/운동에 기여한다. DLS 실험에서, 큰 분자 이동성은 큰 분자 확산 계수를 의미하고, 이는 일반적으로 스토크-아인슈타인 방정식(Stokes-Einstein equation)을 사용하여 소형의 수력학적 크기를 갖는 분자에 할당된다. 이는 단백질의 수력학적 직경이 저이온성 제형에서 왜 감소되는지를 설명할 수 있다.

항체 분자 사이의 전하-전하 상호작용은 반발성(낮은 용액 pH에서) 및 흡인성(단백질의 pI에 근접한 높은 용액 pH에서)일 수 있다.

17.11 데이타 표

표 30

표 31

표 32

표 33

표 34

표 35

표 36

표 37

표 38

표 39

표 40

SEC 데이타

실시예 18: J695 점도에 대한 pH 영향

점도 데이타는 교환 매질로서 물을 사용하여 DF/UF 처리 후 J695에 대해 생성하였다. J695 DS(참조: 실시예 1)를 5회 이상의 DF/UF 단계를 적용하여 물에 대해 정용여과하였다. 이어서, 점도를 플레이트-플레이트 점도계, 100rpm 전단 속도, 150㎛ 갭, 60mm 플레이트 직경(장치: 보흘린 제미님 점도계(Malvern Instruments, Southborough, MA), 평가된 온도 범위 8 내지 25℃)을 사용하여 각종 농도에서 측정하였다.

도 32에서 알 수 있는 바와 같이, 각각 179mg/mL 및 192mg/mL의 농도에서, J695 용액 점도는 12℃에서 70cP 이하, 20℃에서 40cP 이하, 25℃에서 30cP 이하였다.

실시예 19: 순수한 물 중의 항체의 약동학(PK)

본 연구의 목적은 아펠리모맙의 피하(s.c.) 투여 후 국소 내약성 및 PK에 대한 제형 파라미터(즉, 물을 함유하는 저이온성 단백질 제형 대 이온성 부형제, 예를 들면, 완충제 및 염을 사용하는 통상의 단백질 제형)의 잠재적 영향을 평가하기 위한 것이다. 또한, 제형의 전신 독성 및 독성 역학적 데이타를 조사하였다. 사용된 단백질 농도 범위는 50mg/mL 내지 200mg/mL이고, 이온 강도 범위는 3mOsm/kg 내지 300mOsm/kg이었다.

단일 (s.c.) 투여 가능성 연구를 웅성 스프라그-다울리 래트에게서 아펠리모맙(MAK195F - 마우스 항 사람 TNF F(ab')2(Abbott Laboratories))을 사용하여 수행하여 50 및 200mg/kg에서 액체 제형의 피하 투여 후 래트에게서 아펠리모맙의 국소 내성 및 독성을 평가하였다. 단일 피하 투여후 관찰/회복 기간이 뒤따랐다. 제한된 혈액 샘플링을 수행하여 순환성 아펠리모맙 수준을 측정하고, 흡수 및 반감기를 평가하였다. 투여된 용량 용적은 1mL/kg 체중이었다. 실험 그룹은 다음을 포함한다:

실험 그룹

01 대조군(비히클)

02 50mg/mL 아펠리모맙, 액체, 표준 제형

07 200mg/mL 아펠리모맙, 액체, 물 제형

그룹 A 2일 동안 관찰

그룹 B 7일 동안 관찰

그룹 C 14일 동안 관찰

그룹화 및 래트 동정(그룹 당 N=1)

동물들을 1일째에 투여 후 15분, 1시간, 3시간, 5시간 및 24시간에 및 이후 적어도 하루에 1번 임상 징후 및 사망률에 대해 반복 관찰하였다. 체중을 투여 당일(1일) 및 부검시(각각 3일, 15일 또는 21일) 및 가능할 경우, 1주일에 2회 측정하였다. 약물 분석을 위한 혈액 샘플을 1일째(투여 후 4시간) 및 가능할 경우, 2, 3, 5, 8 및 15일째에 수집하였다. 부검 전에, 혈액을 수집하고, 혈액학적 및 임상적 화학 파라미터를 평가하였다. 부검 전에 각 동물의 혈액 도말 표본을 제조하였다. 부검시, 체강의 육안검사를 수행하였다. 기관 중량 측정을 간, 신장, 흉선, 비장 및 임파절에서 수행하였다. 예비 조직병리학을 주입 위치 및 간, 신장, 흉선, 비장 및 임파절에서 수행하였다.

모든 동물은 계획된 부검시까지 연구 내내 생존하였다. 물 제형이 투여된 래트는 14일 내지 15일에 자궁 영역에서 껍질을 나타냈다. 체중에 대한 시험 항목 관련 영향은 전혀 관찰되지 않았다. 혈액학 및 임상 화학 값은 가변적이었다. 명백하게 시험 항목 관련 변화가 혈액학 또는 임상 화학에서 전혀 확인되지 않았다. 시험 항목 관련 변화는 요검사에서 관찰되지 않았다. 기관 중량의 측정은 높은 변화성을 유도하고, 기관 중량에서 명백하게 시험 항목 관련 변화는 존재하지 않았다.

전반적인 관찰에서, 주입 영역에서 피하조직의 적색화가 3일째에 물 제형을 수용한 래트에게서 주시되었다. 모든 기타 변화는 이러한 균주 및 연령의 스프라그-다울리 래트에게서 공통적으로 보여지는 자발적 발견 범위에 속한다.

현미경적 발견은 다음과 같다:

· 그룹 01, 02에서는 어떤 발견도 없다

· 그룹 07에서 최소 확산 피하 염증

· 투여 관련되는 것으로 간주되는, 그룹 07(3일)에서 전반적인 병리학에서의 적색화와 관련되는 집중 피하 출혈

· 국소 반응에서 pan-T, 억제인자/세포독성 T 세포/천연 킬러 세포, pan-B 세포 및 판-마크로파지 마커의 예비 면역 조직 화학 결과는 주로 피하 염증/침입에 관련되는 마크로파지 및 천연 킬러 세포를 지시한다. 따라서, 지금까지 사용된 제형에 대한 국소 면역성 반응에 대한 힌트가 없다.

모든 기타 변화는 이러한 균주 및 연령의 스프라그-다울리 래트에게서 공통적으로 보여지는 자발적 발견 범위에 속한다.

피하 투여 후, 아펠리모맙 흡수는 주입 후 0.2 내지 3일에 도달하는 최대 혈청 수준으로 빠르게 나타난다. 시험되는 모든 샘플 중의 아펠리모맙의 절대 수준은 낮았다. 샘플 사이에서 큰 변화성이 관찰되었는데, 이는 제한된 샘플링 빈도수 및 사용된 적은 동물 수 때문일 것이다. 대부분의 샘플에서, 5 내지 8일 후 혈청에서 어떤 아펠리모맙도 검출할 수 없었다. 혈청 수준에서의 이러한 강하는 아마도 F(ab')₂의 높은 청소율에 기인한다. 대부분의 샘플에 대해 관찰된 T1/2은 이전 관찰과 일치하여 1 내지 2일 범위 내에 존재하였다. 저이온성 제형의 긴 반감기(7.8 d)는 샘플의 연장된 흡수를 나타낼 수 있다. 데이타를 표 41 및 42에 제시한다.

표 41

MAK195F의 혈장 노출 수준

아펠리모맙 및 대조 물질에 대해서 액체에 대한 어떤 응집 상태 발견도 존재하지 않았다.

저이온성 강도 제형의 경우, 최소 확산 피하 주입 위치 염증이 보였다. 최소 내지 약간 또는 약간 내지 중간 정도의 염증이 단백질 농도(각각 50mg/mL 및 200mg/mL) 증가에 따라 보였다. 일부 국소 피하 출혈이 보이고, 이는 전반적인 병인론에서 적색화와 관련되고, 이는 주입 동안 혈관 상처의 결과인 것으로 간주된다. 주입 위치에서 일부 피하 적색화는 물 제형에 대해 3일째에 관찰되었지만 해로운 것으로 간주되지는 않았다. 결국, 제형은 국소적으로 내성이었다.

이하 표 42에, 통상의 액체 제형 대 물 제형의 PK 데이타를 제시한다.

표 42

상이한 제형의 피하 투여 후 MAK 195F의 약동학적 파라미터

검출가능한 혈청 수준 지속기간의 증가가 표 42에서 알 수 있는 바와 같이 저이온성 제형(즉, 물에서 제형화된 아펠리모맙)으로 알 수 있었다.

이 연구에서, 저이온성 용액(물) 중의 MAK195F의 관찰된 절대 수준은 통상의 MAK195F 액체 제형에서보다 우수한 노출, 보다 긴 검출가능한 혈청 수준 및 '반감기'를 제공한다.

아펠리모맙 반감기는 F(ab')₂ 분자에 대한 사전 관찰과 일치하여 표준 제형에서 1 내지 2일 범위내였다. 그러나, 표면상 긴 반감기는 저이온성 제형(7.8d)에 대해 관찰되었다. 따라서, 이 제형에서 MAK 195F의 평균 체류 시간은 시험된 표준 제형에 비해 더 긴 것으로 나타났다.

실시예 20: 2.5(E)mg1(항 IL-18 항체)의 DF/UF

2.5(E)mg1 벌크 용액(59.6mg/mL)의 정용여과/한외여과(연속 방식)을 주입용수(이후 "물"이라 칭명함)를 사용하여 약 4배 용적 교환을 적용하여 수행하였다. DF/UF 작업은 혼탁도, 단백질 농도(OD280), pH 및 잔류물의 몰삼투농도 및 DLS 측정치를 모니터하여 조절하였다. DF/UF 동안, 투과물 몰삼투농도를 또한 모니터하여 2.5(E)mg1 벌크 용액의 부형제 감소를 조절하였다.

재료 및 방법

- 2.5(E)mg1 벌크 약물 물질 (메티오닌, 히스티틴, 폴리소르베이트 80 부재)(Abbott Bioresearch Center, Worcester, MA): 총 589.12g 용액을 갖는 2 PETG 병, 용액 농도 59.6mg/mL.

- 암푸와(Ampuwa)(주입용수)(Fresenius Medical Care, Waltham, MA).

- 2 x 펠리컨 XL 필터 카세트, 밀리포어, PLCTK 30kDa 막, 재생 셀룰로스를 포함하는 밀리포어 랩스케일 TFF DF/UF 장치

- 파장 280㎚를 사용하는 UV/VIS 분광광도계, 스페코드(Specord) 50

- 바이오트로드 프로브 제57호를 갖는 메트롬(Metrohm) pH-측정기, 타입 744

- 삼투압계: 크나우어(Knauer), K-7400

- 파르의 장치, DMA 4100을 사용하는 밀도 측정

- 층류 공기 흐름 박스 헤로스(Hereaus)

- 혼탁도 측정: Hach, 2100 AN

- 점도계: 파르, AMVn

- 규모: 메틀러 톨레도(Mettler Toledo), AT261 및 33.45

- 필터: 밀렉스(Millex) AP 20(섬유유리) 및 미니사르트 하이 플로우 필터(Minisart High Flow Filter)(셀룰로스아세테이트), 0.20㎛ 세공 크기.

20.1 실험 절차

2.5(E)mg1 DS 샘플의 해동: 냉동된 DS를 함유하는 2L PETG 병들을 23℃에서 순환 수욕을 사용하여 2시간 내에 해동시켰다. 해동된 DS는 투명하고 약간 유백광을 띄고, 가시성 입자를 함유하지 않았다.

DF/UF에 의한 DS의 농축: 530mL의 DF/UF 장치 저장기 용적 한계에 기인하여, 2.5(E)mg1 DS는 최종 용적 525mL로 농축시켰다.

물을 사용하는 DF/UF(완충제 교환): DS(메티오닌, 히스티틴, 2.5(E)mg1)를 4배 용적 교환을 적용하여 DF/UF에 적용하였다. 표 43은 실험 전반에 걸쳐 사용된 물의 양을 제시하고, 표 44는 실험 파라미터를 제공한다.

표 43

DF/UF 수 용적 교환

표 44

DF/UF 절차 파라미터

투과물의 몰삼투농도 측정은 처리된 투과물 약 200mL 마다 수행하였다.

물에 대한 DF/UF 후, 2.5(E)mg1 용액의 용적은 450mL이고, 단백질 농도는 76.6mg/mL였다. 이어서, 물에 필수적으로 용해된 2.5(E)mg1을 함유하는 이 용액을 농축시켰다.

표 45

용액 농축을 위한 DF/UF 공정 파라미터

농축 용액(약 130mg/mL)을 0.2㎛ 여과에 적용하였다. 용액을 2 내지 8℃로 냉각시킨 다음, -80℃에서 저장하였다.

20.2 2.5(E)mg1의 DF/UF 동안 수집된 데이타

표 46

공정관리 데이타

표 47

투과물(공정 동안 단편화되고 측정됨)의 몰삼투농도

표 48

완충제 교환 후 2.5(E)mg1의 농축

표 49

농축된 2.5(E)mg1 용액(0.2㎛ 여과 전후)의 분석적 특성화

표 50

DF/UF 동안 동적 광 산란 데이타(단량체의 DH 및 용액 중에 존재하는 모든 시험편의 D_h=D_h의 z-평균 값 측정

20.3 논의

실험은 2.5(E)mg1(메티오닌, 히스티틴에서 완충됨)이 필수적으로 물에서 고농도로 제형화될 수 있음(130mg/mL에서 용해도 제한이 관찰되지 않았다)을 입증하였다. 물을 사용하는 3회 용적 교환 후, 투과물 및 잔류물의 몰삼투농도는 10mOsmol/kg 이하이고, 이는 완충제 부형제가 효과적으로 감소되었다는 것을 입증한다. 2.5(E)mg1 용액의 유백광은 물을 사용하는 DF/UF 동안 감소되고(최적 외관), 또한 DS 출발 용액의 감소된 혼탁도 값(네펠로 혼탁도 단위(nephelometric turbidity units; NTU) 14.5, 3배 용적 교환 후 6.55, 4배 용적 교환 후 10.5로 반영된다.

기타 항체로 알 수 있는 바와 같이, DLS로 측정된 수력학적 직경은 부형제 감소로 인해 감소되었다(랜덤한 브라운 운동에 첨가되는 분자간 전하-전하 반발작용은 높은 분자 이동성을 유도하고, 계산된 낮은 D_h 값을 의미한다). 2.5(E)mg1 용액의 pH는 DF/UF 작업 전(pH 5.94) 및 후(pH 5.99)와 기본적으로 동일하였다.

DLS 모니터로 제시된 바와 같이, 2.5(E)mg1은 DF/UF 작업 동안 안정하게 잔류하였다. 고분자량 시험편에서 상당한 증가는 검출되지 않았다.

실시예 21: 물에서 제형화된 아달리무맙의 제조 및 이의 안정성 연구

다음 실시예는 상기 실시예에서 기술된 공정으로부터 생성된 아달리무맙을 포함하는 제형의 안정성을 기술하고, 즉 아달리무맙은 물에서 성공적으로 투석되었다.

재료 및 방법

3323.6g의 아달리무맙 용액(71.3mg/mL)을 순수한 물을 사용하여 정용여과하였다. 순수한 물로 7배 용적 교환 후(이론상 부형제 감소율, 99.9%), 단백질 용액을 각각 220 및 63mg/mL의 최종 표적물 농도로 희석시키고/한외여과시켰다. pH, 몰삼투농도, 점도, 전도도, PCS, 육안 검사 및 단백질 농도 측정(OD280)을 수행하여 DF/UF 처리 후 단백질의 상황을 모니터하였다.

DF/UF 처리 후, 단백질 용액을 멸균 여과(0.22㎛ 밀리팩(Millipak)-60 및 밀리팩-200 막 필터)한 다음, 27.5G RNS 니들 및 멸균성 BD HyPak BSCF 4432/50 스토퍼가 구비된 BD HyPak SCF™ 1mL 길이 시린지에 충전시켰다. 충전 용적은 시린지당 약 0.825mL였다.

충전 후, 시린지를 각각 2 내지 8℃, 25℃ 및 40℃에서 저장하고, 이하 개략된 샘플 수집 도식에 기술된 바와 같이 분석하였다.

■ 아달리무맙 약물 물질(아달리무맙 흡광 계수 280㎚: 1.39mL/mg cm): 약물 물질은 폴리소르베이트 80을 함유하지 않았다. DS 완충제, pH 5.38.

■ 울트라서트(Ultrasert) PES 막 카세트(5OkDa 및 3OkDa 컷오프)가 구비된 소토리우스 사르토콘 슬라이드(Sortorius Sartocon Slice) 정용여과 시스템. 사르토콘 슬라이스 시스템을 사르토리우스 작업 지침에 따라 주위 온도에서 연속 방식으로 작동시켰다.

■ pH 전극

■ 퍼킨엘머(PerkinElmer) 자외선 가시성 분광광도계, 람다(Lambda) 35를 단백질 농도 측정(280㎚ 파장)용으로 사용하였다. 1회용 UV 큐벳, 1.5mL, 세미-마이크로, 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)를 농도 측정에 사용하였다.

■ 멸균 주입용수 Ph. Eur./ USP를 DF/UF 매질로서 사용하였다.

■ 보겔(Vogel) 삼투압계 OM815를 몰삼투농도 측정용으로 사용하였다(400mOsmol/kg NaCl 교정 용액, Art. No. Y1241로 교정됨, Herbert Knauer GmbH, Berlin, Germany).

■ 안톤 파르 미량점도계(Anton Paar Microviscosimeter), 타입 AWVn을 안톤 파르 작업 지침에 따라 단백질 용액의 점도 평가용으로 사용하였다. 점도는 20℃에서 평가하였다.

■ 이노랩 콘드 레벨(InoLab Cond Level)2 WTW 장치를 25℃에서 표준화된 전도도 측정용으로 사용하였다.

■ 맬버른 인스트루먼츠 제타사이저 나노(Malvern Instruments Zetasizer nano) ZS를 표준 방법을 적용하여 Z-평균 값 측정용으로 사용하였다. 측정은 낙구 점도계(안톤 파르 미량점도계, 타입 AWVn, 25℃)로 수득된 점도 데이타를 사용하여 25℃에서 수행하였다.

HPLC 방법

■ 아달리무맙, SEC 분석: 세파덱스 200 컬럼(Pharmacia 카탈로그 번호 175175- 01). 이동상 20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨, pH 7.5, 0.5mL/분 유량, 주위 온도, 검출 UV 214㎚ 및 280㎚. 각 샘플을 밀리-Q 물, 샘플 주입 적재 50㎍ (중복 주입)으로 1.0mg/mL로 희석시켰다.

■ 아달리무맙, IEC 분석: 상응하는 가드 컬럼(p/n 054994)과 함께 디오넥스, 프로팍 WCX-10 컬럼(p/n 054993). 분리 조건: 이동상 A: 10mM 인산나트륨, pH 7.5; 이동상 B 10mM 인산나트륨, 500mM 염화나트륨, pH 5.5. 1.0mL/분 유량, 주위 온도. 각 샘플을 밀리-Q 물, 샘플 주입 적재 100㎍, 중복 주입으로 1.0mg/mL로 희석시켰다.

단백질 농도의 계산

계산식:

상기 식에서,

ε는 흡광 계수이고,

c는 농도이고,

d는 광이 통과하는 큐벳의 길이고,

E는 흡광도이고,

I₀는 초기 광 강도이고,

I는 샘플을 통해 통과 후의 광 강도이다.

샘플 수집 도식

제조된 용액 샘플을 이하 나열된 온도에서 저장하고, 연구 개시 후 지시된 시간 지점에서 수집하였다(x).

아달리무맙의 DF/UF 처리

표 51은 정용여과 후 아달리무맙 특성을 기술한다.

표 51

저장시, 상이한 온도에서 선명도 및 유백광, 액체의 착색도, SEC를 포함하는 아달리무맙 특성화는 부록 D에 기술한다.

결론

상기 실시예는 물(멸균된 주입용수 Ph. Eur./USP)가 모노클로날 항체 아달리무맙의 정용여과 매질로서 사용되는 정용여과/한외여과(DF/UF) 실험을 제공한다.

아달리무맙을 DF/UF 교환 매질로서 순수한 물을 사용하여 DF/UF 처리에 적용하고, pH 5.57에서 고농도(220mg/mL)에서 및 pH 5.44에서 저농도(63mg/mL)에서 용액 흐림, 심한 유백광 또는 혼탁도 형성을 유도하지 않고 제형화하였다.

DF/UF 실험으로부터의 아달리무맙을 2 내지 8℃, 25℃ 및 40℃에서 3개월 동안 SCF 시린지에 저장하였다. 수득된 데이타는 단백질의 우수한 전반적인 안정성을 나타낸다.

결론적으로, DF/UF 교환 매질로서 순수한 물을 사용하여 단백질을 처리하고 제형화하는 것이 가능하다. 이상적 100% 부형제 막 투과성을 가정하여, 약 99.9% 최대 부형제 감소율이 추산될 수 있다.

실시예 22: 비이온성 부형제를 사용하여 물에서 제형화된 아달리무맙의 안정성 연구

다음 실시예는 추가의 비이온성 부형제를 사용하여 물 중에 항체, 즉, 아달리무맙을 함유하는 제형의 안정성 연구를 기술한다.

재료 및 방법

아달리무맙 재료는 실시예 21(DF/UF 처리)과 동일하다. DF/UF 처리 후, 단백질 용액을 표 52에 지시된 바와 같이 제형화하였다. 만니톨이 당 알콜 그룹, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨 등으로부터 예로서 선택되었다. 슈크로즈가 당 그룹, 예를 들면, 슈크로즈, 트레할로스, 라피노스, 말토스 등으로부터 예로서 선택되었다. 폴리소르베이트 80이 비이온성 계면활성제 그룹, 예를 들면, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 플루로닉 F68 등으로부터 예로서 선택되었다. 약 10.7mL를 제형화용으로 제조하였다. 몰삼투농도, 점도 및 PCS 측정은 제조후 제형에 대해 수행하였다.

표 52

- 주입용수 중의 0.5% 및 5% 폴리소르베이트 80 스톡 용액: 1:50 비율로 첨가(210μL 내지 10.5mL 아달리무맙 용액, 계면활성제 없이 제형화된 샘플에 210μL 주입용수를 첨가하여 동일 샘플에서의 동일한 단백질 농도를 보장한다)

- 고체 형태의 만니톨/슈크로즈(각각 525mg/840mg) 첨가.

제제를 멸균 여과(Millex GV, Millipore, 0.22㎛, Φ 33mm, Art. SLGV033RS)한 다음, 27.5G RNS 니들 및 멸균성 BD HyPak BSCF 4432/50 스토퍼가 구비된 BD HyPak SCF™ 1mL 길이 시린지에 충전시켰다. 충전 용적은 시린지당 약 0.6mL였다.

충전 후, 시린지를 각각 2 내지 8℃, 25℃ 및 40℃에서 저장하고, 이하 개략된 샘플 수집 도식에 기술된 바와 같이 분석하였다.

■ 아달리무맙 약물 물질(아달리무맙 흡광 계수 280㎚: 1.39mL/mg cm): 약물 물질은 폴리소르베이트 80을 함유하지 않았다. DS 완충제, pH 5.38.

■ pH 전극

■ 멸균 주입용수 Ph. Eur./ USP를 DF/UF 매질로서 사용하였다.

■ 만니톨, 폴리소르베이트 80 및 슈크로즈, 모두 Ph. Eur. 품질에 적합

■ 보겔 삼투압계 OM815를 몰삼투농도 측정용으로 사용하였다(400mOsmol/kg NaCl 교정 용액, Art. No. Y1241로 교정됨, Herbert Knauer GmbH, Berlin, Germany).

■ 안톤 파르 미량점도계, 타입 AWVn을 안톤 파르 작업 지침에 따라 단백질 용액의 점도 평가용으로 사용하였다. 점도는 20℃에서 평가하였다.

■ 플루오스타 옵티마(Fluostar Optima), 비엠지 랩테크(BMG Labtech) (충분한 플레이트 중에서 344㎚에서 흡수 측정, 혼탁도 평가)

■ 맬버른 인스트루먼츠 제타사이저 나노 ZS를 표준 방법을 적용하여 Z-평균 값 측정용으로 사용하였다. 측정은 낙구 점도계(안톤 파르 미량점도계, 타입 AWVn, 25℃)로 수득된 점도 데이타를 사용하여 25℃에서 수행하였다.

HPLC 방법

■ 아달리무맙, SEC 분석: 세파덱스 200 컬럼(Pharmacia 카탈로그 번호 175175- 01). 이동상 20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨, pH 7.5, 0.5mL/분 유량, 주위 온도, 검출 UV 214㎚ 및 280㎚. 각 샘플을 밀리-Q 물, 샘플 주입 적재 50㎍ (중복 주입)으로 1.0mg/mL로 희석시켰다.

■ 아달리무맙, IEC 분석: 상응하는 가드 컬럼과 함께 디오넥스, 프로팍 WCX-10 컬럼. 분리 조건: 이동상 A: 10mM 인산나트륨, pH 7.5; 이동상 B 10mM 인산나트륨, 500mM 염화나트륨, pH 5.5. 1.0mL/분 유량, 주위 온도. 각 샘플을 밀리-Q 물, 샘플 주입 적재 100㎍, 중복 주입으로 1.0mg/mL로 희석시켰다.

샘플 수집 도식

제조된 용액 샘플을 5℃, 25℃ 및 40℃에서 저장하고, 연구 개시 후 1분(5℃ 및 40℃) 또는 TO 및 1분(25℃)에 수집하였다. 시험 파라미터를 적합한 방법에 따라 측정하고, 예를 들면, 색상은 시각적으로 측정하고, 혼탁도는 344㎚에서의 흡광도로 측정하였다.

초기 제형 특성화

표 53은 초기 제형 몰삼투농도 및 점도를 기술한다.

표 53

한 농도의 모든 제형은 동일한 점도를 입증한다. 슈크로즈 함유 제형의 점도는 약간 높았다. 물 중의 매우 농축된 제형(실시예 A, 점도 27.9cP)에 비해 매우 농축된 제형의 감소된 점도는 실시예 21에서 약 215mg/mL 대 220mg/mL의 최종 농도를 유도하는 폴리소르베이트 80 스톡 용액 또는 맹물을 사용하는 동일한 희석물로 설명된다.

표 54는 각 샘플에 대해 측정된 PCS 데이타를 기술한다.

표 54

표 54에 제공된 데이타는 z-평균 값이 비이온성 부형제 부재 시스템 중의 아달리무맙 용액으로부터 수득된 값(63mg/mL, 1.85 d.nm, 220mg/mL, 0.34 d.nm, 실시예 21)과 현저하게 상이하지 않다는 것을 보여준다.

저장시 아달리무맙 특성화

부록 E는 저장시 아달리무맙 안정성에 대한 데이타를 제공한다.

위약 용액의 전도도

표 55는 각종 아달리무맙 제형의 전도도에 대한 비이온성 부형제의 영향을 기술한다. 모든 위약 용액은 멸균된 주입용수 Ph.Eur./USP를 사용하여 제조하였다.

표 55

결론

제제를 2 내지 8℃, 25℃ 및 40℃에서 1개월 동안 SCF 시린지에 저장하였다. 저장 연구로부터 수득된 데이타는 시험된 모든 제형에서 단백질의 전체 안정성이 있음을 나타냈다. 안정성 데이타는 실시예 21의 샘플의 안정성과 비교가능하다. 위약 용액을 함유하는 비이온성 부형제의 전도도 측정은 일부 부형제의 경우에 몇 μS/cm 범위로 약간의 전도도 증가를 증명한다. PCS 측정은 비이온성 부형제 비함유 시스템과 비교하여 수력학적 직경의 현저한 증가가 없음을 증명한다.

결론적으로, DF/UF 교환 매질로서 순수한 물을 사용하는 단백질 처리 및 비이온성 부형제를 갖는 제형이 실현가능하다. 또한, 아달리무맙은 다음 조성의 완충제에서 PCS에 의해 평가하였다: 10 mM 인산염 완충제, 100 mM 염화나트륨, 10 mM 시트레이트 완충제, 12 mg/mL 만니톨, 0.1% 폴리소르베이트 80, pH 5.2. 아달리무맙 농도는 각각 50 mg/mL 및 200 mg/mL이었다. z-평균 값은 각각 50 mg/mL 제형의 경우에 11.9 d.nm이고 200 mg/mL 제형의 경우에 1.01 d.nm이었다. 따라서, 소정 단백질 농도에서의 수력학적 직경은 이온 강도에 의존함이 명백히 증명되었다(염 함유 완충제에서 명백히 높은 직경).

실시예 23: 비이온성 부형제와 함께 물에서 제형화한 J695의 제조

다음 실시예는 추가의 비이온성 부형제와 함께 물에서 항체(즉, 아달리무맙)를 함유하는 제형의 제조를 기재한다. 또한 실시예는 추가의 비이온성 부형제와 함께 물에서 제형화된 J695의 안정성(예를 들면, SE-HPLC 및 IEC에 의해 측정함)을 기재한다.

재료 및 방법

상이한 pH에서 2 x 3OmL J695 용액(약 125 mg/mL)을 순수한 물을 사용하여 투석하여 슬라이드-에이-라이저 투석 카세트에 적용한다. 샘플의 투석은 각각 3L 순수한 물에 대해 3회 실시하였다(이론상 부형제 감소, 1:1,000,000). 단백질 용액을, 비바스핀 20 농축기를 사용하여 200 mg/mL의 최종 표적 농도까지 한외여과하였다. PH, 몰삼투농도, 점도, 전도도, PCS, 육안 검사, HPLC 및 단백질 농도 측정(OD280)을 실시하여 처리 동안 및 처리 후에 단백질 상태를 모니터하였다.

처리 후, 단백질 용액을 다음에 기재된 바와 같이 제형화하였다. 만니톨을 만니톨, 소르비톨 등의 당 알콜 그룹으로부터 사용예로서 선택하였다. 슈크로즈를 슈크로즈, 트레할로즈, 라피노즈, 말토즈 등의 당 그룹으로부터 사용예로서 선택하였다. 폴리소르베이트 80을 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 플루로닉 F68 등의 비이온성 계면활성제 그룹으로부터 사용예로서 선택하였다. 이들 각각의 제형에 대해 0.5 mL 용적을 제조하였다. PH, 몰삼투농도, 육안 검사 및 HPLC 분석을 실시하여 샘플 제조 후의 단백질의 상태를 모니터하였다.

표 56

다양한 J695 제형의 기재

용어 "/5" 또는 "/6"은 pH 5 및 6에서 샘플 사이를 차별화하기 위한 임의의 샘플명으로 부가된다.

- 주입용 멸균수 중의 폴리소르베이트 80 스톡 용액 0.5% 및 5%:

1:50 비율로 첨가(10 μL 내지 0.5 mL J695 용액, 모든 샘플에서 동등한 단백질 농도를 보장하기 위해 계면활성제 없이 제형화된 샘플에 10 μL 주입용수 첨가)

- 고체 형태로 만니톨/슈크로즈 첨가 (각각 25 mg/40 mg).

■ J695 약물 물질(J695 흡광 계수 280 nm: 1.42 mL/mg cm): 약물 물질은 폴리소르베이트 80을 함유하지 않는다. DS 완충제, pH 6.29.

■ pH 전극

■ 탈염수 및 멸균 여과수를 투석 매질로서 사용하였다.

■ 만니톨, 폴리소르베이트 80 및 슈크로즈, 모두 Ph. Eur. 품질에 부합

■ 보겔 삼투압계 OM815를 몰삼투농도 측정에 사용하였다(400 mOsmol/kg NaCl 교정 용액으로 교정함, Art. No. Y1241, Herbert Knauer GmbH, Berlin, Germany).

■ 안톤 파르 미량점도계, 타입 AWVn을 안톤 파르 작동 지침에 따라 단백질 용액의 점도 측정에 사용하였다. 점도는 20℃에서 평가하였다.

■ 플루오스타 옵티마(BMG Labtech)(웰 플레이트에서 344 nm에서 흡광도 측정, 혼탁도 평가)

■ 에펜도르프 원심분리기(Eppendorf Centrifuge) 5810 R

■ 슬라이드-에이-라이저 투석 카세트(Pierce Biotechnology) (Cat No 66830)

■ 비바스핀 20 농축기, 10 KDa PES 막(Vivascience, 제품번호 VS2001), 표준 작동 지침에 따라 사용됨

■ 퍼킨엘머(PerkinElmer) UV 가시 분광광도계, 람다 35를 단백질 농도 측정(280 nm 파장)에 사용하였다. 휴대용 UV 큐벳, 1.5 mL, 세미-마이크로, 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)를 농도 측정에 사용하였다.

■ 이노랩 콘드 레벨2 WTW 장치를 25℃로 표준화된 전도도 측정에 사용하였다.

■ 맬버른 인스트루먼츠 제타사이저 나노 ZS를 표준 방법에 적용하여 Z-평균 값 측정에 사용하였다. 측정은 낙구 점도계로 수득한 점도 데이타를 사용하여 25℃에서 수행하였다(안톤 파르 미량점도계, 타입 AWVn, 25℃에서).

HPLC 방법

■ J695, SEC 분석: 토소 바이오사이언스 G3000swxl, 7.8 mm x 30 cm, 5 ㎛ (카탈로그 번호 08541). 이동상 211 mM Na₂SO₄/92 mM Na₂HPO₄, pH 7.0. 0.25 mL/분 유량, 주위 온도, 검출 UV 214 nm 및 280 nm. 각 샘플을 2.0 mg/mL까지 밀리-Q 물로 희석시켰다. 샘플 주입 적재 20 ㎍ (중복 주입).

■ J695, IEC 분석: 상응하는 가드 컬럼 (p/n 054994)과 함께 디오넥스, 프로팍 WCX-10 컬럼 (p/n 054993). 분리 조건: 이동상 A: 10 mM Na₂HPO₄, pH 6.0; 이동상 B 10 mM Na₂HPO₄, 500 mM NaCl, pH 6.0. 1.0 mL/분 유량, 35℃ 온도. 각 샘플은 1.0 mg/mL까지 밀리-Q 물로 희석시켰다. 샘플 주입 적재 100 ㎍.

단백질 농도의 계산

계산식:

상기 식에서,

ε는 흡광 계수이고,

c는 농도이며,

d는 광이 통과하는 큐벳의 길이이고,

E는 흡광도이며,

I_o는 초기 광 강도이고,

I는 샘플을 통과한 후의 광 강도이다.

J695의 처리

물 중의 J695는 비이온성 부형제의 첨가 전에 특성화하였다. 표 57은 투석/한외여과 동안 J695 특성화의 상세를 제공한다.

표 57

비이온성 부형제를 갖는 제형의 특성화

다양한 비이온성 부형제를 J695 제형(표 56 기재 참조)에 첨가한 후, 각 제형을 분석하였다. 몰삼투농도 및 육안 검사 및 pH로부터의 결과는 하기 표 58에 기재되어 있다.

표 58

HPLC 데이타

각각의 비이온성 부형제를 함유하는 J695 제형은 또한 SE-HPLC 및 IEX를 사용하여 검사하였다. 이들 분석 데이타는 표 59 및 60에 제공되어 있고, 처리 및 제형화 동안의 J695 안정성의 개관을 제공한다.

표 59

다양한 J695 제형의 SE-HPLC 결과

표 60

다양한 J695 제형의 IEX 결과

결론

상기 실시예는 물(탈염수 및 멸균 여과수)을 모노클로날 항체 J695에 대한 투석 매질로서 사용한 실험을 제공한다.

J695는 교환 매질로서 순수한 물을 사용하여 투석 및 농축 처리하고, 용액 흐림, 심각한 유백광 또는 혼탁성 제형을 유도하지 않으면서, 고농도(각각 206 및 182 mg/mL)로 pH 5.40 및 6.46에서 제형화하였다.

처리 실험으로부터의 J695를 특성화하고, 다양한 비이온성 부형제와 함께 제형화하였다. 수득된 데이타는 시험된 제형에서 단백질의 양호한 전체 안정성을 나타낸다.

결론적으로, 교환 매질로서 순수한 물을 사용하는 단백질 처리 및 비이온성 부형제를 갖는 제형이 실시가능하다. 이상적 100%의 부형제 막 투과성을 가정하면, 대략 99.9%의 최대 부형제 감소율을 평가할 수 있다.

실시예 24: 물에서 제형화된 아달리무맙의 시린지능

실시예 21의 제형(63 및 220 mg/mL 아달리무맙)에 대해 시린지 고갈시의 힘 측정을 실시하였다. 아달리무맙 220 mg/mL 샘플을 각각 200 mg/mL, 150 mg/mL 및 100 mg/mL로 희석하고, 또한 평가하였다. 즈윅(Zwick) Z2.5/TN1S를 80 mm/분의 일정 속도로 사용하였다. 최종적으로, 제형의 점도 데이타는 안톤 파르 미량점도계, 타입 AWVn을 사용하여 20℃에서 평가하였다. 다음 데이타 수집은 니들 및 시린지 직경 둘 다가 시린지 고갈시의 활주력에 현저한 효과를 가짐을 시사한다. 놀랍게도, 220 mg/mL (20℃에서의 점도 27.9 cP)의 고농축 용액은 63 mg/mL (20℃에서의 점도 1.8 cP)의 저농축 제형과 동등한 고갈력을 적용함으로써 전달할 수 있다.

표 61

상이한 팩키징 시스템에서 아달리무맙 용액에 대해 수득한 활주력 값

상기 결과는 고농도의 단백질에서도 이러한 제형은 시린지를 사용한 투여(예: 피하)에 유리함을 시사한다.

실시예 25 내지 28

실시예 25 내지 28은 물에서 제형화된 항체를 함유하는 다양한 항체 제형(실시예 26 내지 28에서 저이온 강도 단백질 제형으로서 언급됨)의 해동/냉동 안정성 실험을 기재한다. 다수 항체의 냉동 해동 거동은 다양한 단백질 제형을 냉동 상태와 액체 상태로 4회 순환함으로써 평가하였다. 냉동은 온도 조절된 -80℃ 동결기에 의해 실시하고, 해동은 25℃ 온도 조절된 수욕에 의해 실시하였다. 각각 약 25 mL 항체 용액을 이들 일련의 실험을 위해 30 mL PETG 저장기에 충전시켰다.

육안으로 보이지 않는 입자의 형성은 약제학적 단백질 제형에서 주요 안전성 관계를 나타낸다. 육안으로 보이지 않는 단백질 입자는, 다른 분해 생성물, 예를 들면, 생성물 특성화 및 품질 보장 프로그램의 일부로서 평가되고 정량화되는 다른 분해 생성물, 예를 들면, 가용성 응집물 및 화학적으로 개질된 종과 유사하거나 이보다 큰 정도로 임상적 성능에 부정적 영향을 미칠 가능성이 있는 것으로 생각된다[참조: Carpenter, JF et al., Commentary: Overlooking subvisible particles in therapeutic protein products: baps that may compromise product quality. J. Pharm. Sci, 2008]. 하기 수록된 실시예에서 입증된 바와 같이, 다수의 항체는, 본 발명의 제형으로 제형화되는 경우, 특히 육안으로 보이지 않는 입자 형성과 관련하여 놀랍게도 안정하였다.

실시예 25: 물에서 및 비이온성 부형제와 함께 제형화된 아달리무맙의 냉동/해동 안정성

다음 실시예는 물 제형 및 비이온성 부형제가 첨가된 물 제형에서 항체(예: 아달리무맙)의 안정성을 기재한다. 실시예 21 및 22의 샘플 분취량을 냉동/해동 실험하고, SE-HPLC에 의해 평가하였다. 데이타는 다음 조성의 완충제에서 아달리무맙을 사용하는 냉동/해동 실험으로부터 유도된 SE-HPLC 결과와 비교하였다: 10 mM 인산염 완충제, 100 mM 염화나트륨, 10 mM 시트레이트 완충제, 12 mg/mL 만니톨, 0.1% 폴리소르베이트 80, pH 5.2. 당해 후자의 완충제 중의 아달리무맙은 각각 50 mg/mL 및 200 mg/mL로 사용하였다. 냉동/해동 주기는, -80℃로 냉동시켜 동결기에서 8시간 동안 저장한 다음, 실온에서 1시간 동안 해동시켜 샘플을 후속적으로 수집함으로써 에펜도르프 캡에서 실시하였다. 각 제형은 하기 표에 기재된 바와 같이 5회 주기, 즉 주기 0, 1, 2, 3, 4 및 5로 처리하였다.

HPLC 방법

아달리무맙, SEC 분석: 세파덱스 200 컬럼 (Pharmacia 카탈로그 번호 175175-01). 이동상 20 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 7.5, 0.5 mL/분 유량, 주위 온도, 검출 UV 214 nm 및 280 nm. 각 샘플을 1.0 mg/mL까지 밀리-Q 물로 희석시켰다. 샘플 주입 적재 50 ㎍ (중복 주입).

냉동/해동 주기에 의한 아달리무맙 특성화

표 62는 냉동/해동 실험 동안 아달리무맙 순도를 기재한다. 샘플 조성은 실시예 21 및 22를 참조한다.

표 62

결론

상기 실시예는 물(주입 Ph.Eur./USP용의 멸균수)로 DF/UF 처리하고 다양한 비이온성 부형제와 함께 제형화한 아달리무맙을 냉동/해동 주기로 처리한 실험을 제공한다. 수득된 데이타(표 62에 기재됨)는 시험된 모든 제형에서 단백질의 양호한 전체 안정성을 나타낸다. 모든 제형은, 주기가 지속됨에 따라 최소량의 응집물 또는 단편과 함께, 5회의 냉동/해동 주기 후에 98.5% 이상의 단량체성 종을 함유하였다.

실시예 26: 저이온성 1D4.7 용액의 냉동/해동 안정성

1D4.7 단백질(항-IL 12/항-IL 23 IgG1)은 투석에 의해 물에서 제형화하고(슬라이드-에이-라이저 카세트 사용, 제조업자의 작동 지침에 따라 사용됨, Pierce, Rockford, IL), 2 mg/mL 농도(pH 6)에서 반복된 냉동/해동(f/t) 처리(-80℃/25℃ 수욕) 동안 안정한 것으로 증명되었다. 데이타를 비경구 단백질 제형 개발에 통상 사용되는 완충제 및 부형제를 사용하여 다양한 제형(2 mg/mL 단백질, pH 6)의 데이타와 비교하였다. 물에서 제형화된 1D4.7의 안정성은 확립된 완충제 시스템(예를 들면, 20 mM 히스티딘, 20 mM 글리신, 10 mM 인산염 또는 10 mM 시트레이트)에서 제형화된 1D4.7의 안정성을 초과하고, 단백질 제형의 안정화에 통상 사용되는 다양한 부형제(예를 들면, 10 mg/mL 만니톨, 10 mg/mL 소르비톨, 10 mg/mL 슈크로즈, 0.01% 폴리소르베이트 80 또는 20 mM NaCl)와 배합된 범용 완충제(인산염 10 mg/mL, 시트레이트 10 mg/mL)에 기초하는 1D4.7 제형의 안정성을 초과하였다.

SEC, DLS 및 입자 계수 분석을 적용하여 단백질 안정성을 모니터하고, 입자 계수는 1 내지 200 ㎛ 측정 범위로 입자 계수 시스템을 사용하여 실시하였다(입자 계수기 모델 시린지, Markus Klotz GmbH, Bad Liebenzell, Germany). 실험 상세는 다음과 같다:

- 물에서 제형화된 1D4.7를 상기 수록된 제형과 비교하였다.

- 4회의 냉동/해동 주기 적용

- 30 mL PETG 저장기, 약 20 mL 충전, 2 mg/mL 단백질, pH 6

- TO, T1 (즉 1회의 f/t 단계 후), T2, T3 및 T4에서 샘플링

- 분석: 육안 검사, SEC, DLS, 육안으로 보이지 않는 입자 측정

도 33은 1㎛ 초과의 육안으로 보이지 않는 입자의 형성에 의해 반영된 반복된 f/t 주기(-80℃/25℃) 동안의 1D4.7 안정성을 나타낸다. 1D4.7은 범용 완충제(10 mM 시트레이트, 10 mM 인산염)에서 제형화한 다음, 다음과 같은 부형제 변형태를 시험하였다: 소르비톨 (10 mg/mL), 만니톨 (10 mg/mL), 슈크로즈 (10 mg/mL), NaCl (100 mM) 및 폴리소르베이트 80 (0.01%). 1D4.7은 또한 부형제를 전혀 첨가하지 않은 물(투석)(도 33에서 "물")에서 제형화하였다. 주입용수는 또한 f/t 주기 및 육안으로 보이지 않는 입자 시험으로 처리하여 입자 적재에 미치는 재료 취급성, f/t 및 샘플 수집의 잠재적 영향을 평가하였다.

f/t하여 물에서 제형화된 1D4.7의 안정성은 단백질 제형에 통상 사용되는 부형제와 함께 제형화된 1D4.7 용액의 안정성을 초과하였다. 만니톨, 슈크로즈 및 소르비톨은 동결보호제 및/또는 냉동보호제로서 작용하는 것으로 공지되어 있고, 폴리소르베이트 80은, 각각 공기-물 및 아이스-물 등의 소수성-친수성 계면에의 노출시에 단백질의 물리적 안정성을 증가시키는 것으로 일반적으로 공지된 비이온성 부형제이다.

요약하면, 물에서 제형화된 1D4.7 용액은, 냉동-해동 처리시에 약제학적 단백질의 안정성을 모니터하기 위해 통상 적용되는 다양한 분석학적 방법(예: SEC, 육안 검사, 동적 광 산란 및 특히 광 불투명)으로 분석하는 경우에 놀랍도록 안정한 것으로 나타났다.

실시예 27: 저이온성 13C5.5 용액의 냉동/해동 안정성

물에서 제형화된 13C5.5 (항 IL-13 IgGl)는 2 mg/mL 농도(pH 6)에서 반복된 냉동/해동 처리(-80℃/25℃ 수욕) 동안 안정한 것으로 증명되었다. 데이타를 다른 제형(2 mg/mL 단백질, pH 6)과 비교하고, 물에서 제형화된 13C5.5의 안정성은 비경구 단백질 제형(예를 들면, 20 mM 히스티딘, 20 mM 글리신, 10 mM 인산염 또는 10 mM 시트레이트)에 종종 사용된 완충제 시스템에서 제형화된 13C5.5의 안정성을 초과하고, 심지어 단백질 제형에 통상 사용되는 다양한 부형제(예를 들면, 10 mg/mL 만니톨, 10 mg/mL 소르비톨, 10 mg/mL 슈크로즈, 0.01% 폴리소르베이트 80, 20 mM NaCl, 200 mM NaCl)와 조합된 범용 완충제(10 mM 인산염, 10 mM 시트레이트)에 기초하는 13C5.5 제형의 안정성을 초과하였다.

샘플 제조, 실험 과정, 샘플 수집 및 샘플 분석은 상기 실시예에 개략된 바와 동일한 방식으로 실시하였다.

- 물에서 제형화된 13C5.5를 상기 수록된 제형과 비교하였다.

- 4회의 냉동/해동 주기 적용

- 30 mL PETG 저장기

- 2 mg/mL, pH 6

- TO, T1, T2, T3 및 T4에서 샘플링

- 분석: 육안 검사, SEC, DLS, 육안으로 보이지 않는 입자 측정

도 34는 10㎛ 초과의 육안으로 보이지 않는 입자의 형성에 의해 반영된 반복된 f/t 주기(-80℃/25℃) 동안 13C5.5 안정성을 나타낸다. 13C5.5는 10 mM 인산염 완충제, 10 mM 시트레이트 완충제, 20 mM 글리신 완충제 및 20 mM 히스티딘 완충제에서 제형화하였다. 또한, 13C5.5는 부형제가 전혀 첨가되지 않은 본 발명의 제형(투석에 의해)에서 제형화하였다. 주입용수는 f/t 주기 및 육안으로 보이지 않는 입자 시험으로 처리하여, 입자 적재에 미치는 재료 취급성, f/t 및 샘플 수집에 미치는 잠재적 영향을 평가하였다(블랭크로서 언급됨).

f/t하여 물에서 제형화된 13C5.5의 안정성은 단백질 제형에 통상적으로 사용되는 완충제에서 제형화된 13C5.5 용액의 안정성을 초과하였다. 물에서 제형화된 13C5.5 용액의 불안정성은 적용된 다른 분석 방법(예: SEC, 육안 검사 등)으로 관찰되지 않았다.

도 35는 1㎛ 초과의 육안으로 보이지 않는 입자의 형성에 의해 반영된 반복된 f/t 주기(-80℃/25℃) 동안 13C5.5 안정성을 나타낸다. 13C5.5는 범용 완충제(10 mM 시트레이트, 10 mM 인산염)에서 및 다음과 같은 부형제 변형태와 조합된 범용 완충제에서 제형화하여 시험하였다: 소르비톨 (10 mg/mL), 만니톨 (10 mg/mL), 슈크로즈 (10 mg/mL), NaCl (200 mM), NaCl (20 mM) 및 폴리소르베이트 80 (0.01%). 13C5.5는 또한 비교를 위해 부형제가 전혀 첨가되지 않은 물(투석에 의해)(순수한 물)에서 제형화하였다. 주입용수를 또한, 입자 적재에 미치는 재료 취급성, f/t 및 샘플 수집에 대한 잠재적 영향을 평가하기 위해 f/t 주기 및 육안으로 보이지 않는 입자 시험으로 처리하였다.

f/t하여 물에서 제형화된 13C5.5의 안정성은 단백질 제형에서 통상 사용되는 부형제로 제형화된 13C5.5 용액의 안정성을 초과하였다. 만니톨, 슈크로즈 및 소르비톨은 냉동보호제 및/또는 동결보호제로서 작용하는 것으로 공지되어 있고, 폴리소르베이트 80은 각각 공기-물 및 아이스-물 등의 소수성-친수성 계면에의 노출시에 단백질의 물리적 안정성을 증가시키는 것으로 통상 공지된 비이온성 부형제이다. 본 발명의 제형으로 제형화된 13C5.5 샘플 중의 육안으로 보이지 않는 소수의 입자는 놀랍게도 낮은 수준인 것으로 밝혀졌고, 이는 이러한 제형의 높은 잠재적 안전성 및 안정화 잠재성을 입증한다.

물에서 제형화된 13C5.5 용액의 불안정성은 적용된 다른 분석학적 방법(예: SEC, 육안 검사 등)으로 관찰되지 않았다.

f/t 공정 후의 13C5.5 용액의 DLS 분석은 상기한 바와 같이 실시하였다. DLS 분석 결과는 0.01% 트윈-80이 함유된 13C5.5 용액이 1 f/t 단계 후에만 현저히 높은 분자량(HMW)의 응집물을 형성하는 반면, 물을 함유하는 13C5.5는 3 f/t 적용 후에도 HMW 응집물을 전혀 형성하지 않음을 나타냈다.

요약하면, 물에서 제형화된 13C5.5 용액은 냉동-해동 처리시에 약제학적 단백질의 안정성을 모니터하기 위해 통상 적용되는 다양한 분석 방법(예: SEC, 육안 검사, 동적 광 산란 및 특히 광 불투명)으로 분석하는 경우에 놀랍게도 안정한 것으로 나타났다.

실시예 28: 저이온성 7C6 용액의 냉동/해동 안정성

물에서 제형화된 7C6 (항 아밀로이드 베타 IgGl)은 2 mg/mL 농도(pH 6)에서 반복된 냉동/해동 처리(-80℃/30℃ 수욕) 동안 안정한 것으로 입증됐다. 데이타는 다른 제형(2 mg/mL 단백질, pH 6)과 비교하고, 이는 물에서 제형화된 7C6의 안정성이 비경구 단백질 제형에서 통상 사용되는 완충제 시스템에서 제형화된 7C6의 안정성을 초과하고, 단백질 제형에 통상 사용되는 다양한 부형제와 조합된 범용 완충제(10 mM 인산염, 10 mM 시트레이트)에 기초하는 7C6 제형의 안정성을 초과하였다.

다음 용액 조성물을 해동/냉동 실험 동안 7C6 물리적 안정성을 유지하는 이들의 잠재성에 대해 평가하였다:

- 인산염 완충제, 15 mM

- 시트레이트 완충제, 15 mM

- 석시네이트 완충제, 15 mM

- 히스티딘 완충제, 15 mM

- 아르기닌 완충제, 15 mM

- 저이온성 단백질 제형, 부형제 무첨가

- 범용 완충제, 소르비톨 (10 mg/mL)

- 범용 완충제, 만니톨 (10 mg/mL)

- 범용 완충제, 슈크로즈, (10 mg/mL)

- 범용 완충제, 트레할로즈 (10 mg/mL)

- 범용 완충제, 0.01% (w/w) 폴리소르베이트 80

샘플 제조, 실험 처리, 샘플 수집 및 샘플 분석은 실시예 26 및 27에 개략된 바와 매우 유사한 방식으로 실시하였다.

- 물에서 제형화된 7C6을 상기한 제형과 비교하였다.

- 4회의 냉동/해동 주기 적용

- 30 mL PETG 저장기, 대략 20 mL 충전

- 2 mg/mL, pH 6

- TO, T1, T2, T3 및 T4에서 샘플링

- 분석: Aβ-항체 안정성은 다음 방법으로 평가하였다:

- 단백질 용액의 육안 검사는 폴리프로필렌 환저 튜브에서 실시하고, 여기서 샘플을 광 불투명 측정을 위해 충전하였다. 흐림, 혼탁 및 입자 형성 등의 단백질의 물리적 불안정성을 나타내는 징후에 대해 흑색 및 백색 배경에 대하여 주의깊게 검사하였다.

- 동적 광 산란 (eZetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, AI9494; Hellma 정밀 셀이 구비됨, 수프라실 석영, 타입 105.251-QS, 광 경로 3 mm, 중심 Z8.5 mm, 60 μL 이상 샘플 충전, PP 환저 튜브에서 광 불투명 측정으로부터 잔류하는 단백질 샘플을 DLS 측정에 사용하였다). 자동화 측정(샘플당 1회 측정)을 실시하였다.

- 광 불투명 분석. 3.5 mL의 샘플을 층상 기류 조건하에 5 mL 환저 튜브에 충전하고, 측정은 초기 0.8 mL 세정 후에 n=3 모드에서 실시하였다(단일 측정당 0.8 mL).

- 크기 배제 크로마토그래피, UV₂₁₄/UV₂₈₀ 및 다중각 광 산란과 조합됨. 이동상: 100 mM Na₂HPO₄/200 mM Na₂SO₄, pH 7.0 (49.68 g 무수 인산수소이나트륨 및 99.44 g 무수 황산나트륨을 대략 3300 mL 밀리-Q 물에 용해시키고, pH는 1 M 인산을 사용하여 pH 7.0으로 조정하고, 밀리-Q 물로 3500 mL의 용적까지 충전시키고, 용액을 막 필터를 통해 여과하였다). SEC 컬럼, TSK 겔 가드 (카탈로그 번호 08543) 6.0 mm x 4.0 cm, 7 ㎛와 조합된 TSK 겔 G3000SW (카탈로그 번호 08541) 7.8 mm x 30 cm, 5 ㎛. 유량 0.3 mL/분, 주입 용적 20 μL (20 ㎍ 샘플에 상응), 컬럼 온도 실온, 자동샘플러 온도 2 내지 8℃, 작동 시간 50분, 구배 등용매, 10% 이소프로필 알콜로 피스톤 세정, UV 흡광을 통한 검출, 다이오드 정렬 검출기: 파장 214 nm, 피크 폭 > 0.1 분, 밴드 폭: 8 nm, 기준 파장 360 nm, 밴드 폭 100 nm

도 36은 1㎛ 초과의 육안으로 보이지 않는 입자의 형성에 의해 반영된 반복된 f/t 주기 동안 7C6 안정성을 나타낸다. 다수의 제형에 있어서 f/T하여 물에서 제형화된 7C6의 안정성은 단백질 제형에 통상 사용되는 완충제에서 제형화된 7C6 용액의 안정성을 초과하였다. 물에서 제형화된 7C6 용액의 불안정성은 적용된 다른 분석학적 방법(예: SEC, 육안 검사, 동적 광 산란)으로 관찰되지 않았다.

놀랍게도, f/t하여 물에서 제형화된 7C6의 안정성은 단백질 제형에서 통상 사용되는 부형제와 함께 제형화된 7C6 용액의 안정성을 초과하였다. 만니톨, 슈크로즈 및 소르비톨은 동결보호제 및/또는 냉동보호제로서 작용하는 것으로 공지되어 있고, 폴리소르베이트 80은 각각 공기-물 및 아이스-물 등의 소수성-친수성 계면에의 노출시에 단백질의 물리적 안정성을 증가시키는 것으로 일반적으로 공지된 비-이온성 부형제이다. 본 발명의 제형으로 제형화된 7C6 샘플 중의 육안으로 보이지 않는 소수의 입자는 놀랍게도 낮은 수준인 것으로 밝혀졌고, 이는 이러한 제형의 높은 잠재적 안전성 및 안정화 잠재성을 입증한다.

요약하면, 물에서 제형화된 7C6 용액은 냉동-해동 처리시에 약제학적 단백질의 안정성을 모니터하기 위해 통상 적용되는 다양한 분석적 방법(예: SEC, 육안 검사, 동적 광 산란 및 특히 광 불투명성)으로 분석하는 경우에 놀랍게도 안정한 것으로 나타났다.

실시예 29: 물에서 제형화된 J695의 제조 및 이의 안정성 연구

재료 및 방법

427.1g (80 mg/mL)의 J695를 40 mg/mL로 희석하고, 정제수를 사용하여 정용여과하였다. 정제수로 5배 용적 교환 후(이론상 부형제 감소율, 99.3%), 단백질 용액을 100 mg/mL의 표적 농도까지 한외여과하였다. pH, 몰삼투농도, 밀도, 육안 검사 및 단백질 농도 측정(OD280)을 수행하여 DF/UF 처리 후의 단백질의 상태를 모니터하였다.

DF/UF 처리 후, 단백질 용액을 60 mL PETG 병(Nalgene)으로 멸균 여과(0.22 ㎛ Sterivex GV 막 필터)한 다음, -80℃에서 3개월 동안 저장하였다.

37℃에서 해동 후, 용액을 멸균 여과(0.22 ㎛ Sterivex GV 막 필터)하고, 멸균 BD Hypak Physiolis SCF™ 1 mL 길이 시린지 29G, 1/2 inch, 5-bevel, RNS TPE에 충전시키고, 멸균 BD Hypak SCF™ 1mL W4023/50 Flur Daikyo 스토퍼로 밀폐시켰다. 충전 용적은 시린지당 1.000 mL이었다.

충전 후, 시린지를 2 내지 8℃ 및 40℃에서 각각 저장하고, 하기 도식된 샘플 수집 도식에 지시된 바와 같이 분석하였다.

■ J695 약물 물질(280 nm에서의 흡광 계수: 1.42 mL/mg cm): 약물 물질(pH 6.0)은 폴리소르베이트 80을 함유하지 않았다.

■ 사르토리우스 사르토콘 슬라이스 정용여과 시스템, 울트라서트 PES 막 카세트(50 kDa 컷오프)가 구비됨. 사르토콘 슬라이스 시스템은 사르토리우스 작동 지침에 따라 주위 온도에서 연속 방식으로 작동시켰다.

■ pH 전극

■ 퍼킨엘머 UV/Vis 분광광도계, 람다 25를 단백질 농도 측정(280 nm 파장)에 사용하였다. 휴대용 UV 큐벳, 1.5 mL, 세미-마이크로를 농도 측정에 사용하였다.

■ 0.22 ㎛ 여과된 정제수를 DF/UF 매질로서 사용하였다.

■ 안톤 파르 밀도 계측기 DMA 4100를 밀도 측정에 사용하였다.

■ 크나우어 삼투압계 타입 ML을 몰삼투농도 측정에 사용하였다(400 mOsmol/kg NaCl 교정 용액으로 교정함, Art. No. Y1241, Herbert Knauer GmbH, Berlin, Germany).

분석 방법

■ J695, SEC 분석: 수퍼덱스(Superdex) 200 컬럼(Pharmacia). 이동상 92 mM 인산수소이나트륨, 211 mM 황산나트륨, pH 7.0, 0.75 mL/분 유량, 주위 온도, 검출 UV 214 nm. 각 샘플을 이동상으로 2.0 mg/mL까지 희석시킴, 샘플 주입 적재 20 ㎍ (중복 주입).

■ J695, IEC 분석: 상응하는 가드 컬럼과 함께 디오넥스, 프로팍 WCX-10 컬럼. 분리 조건: 이동상 A: 20 mM 인산수소이나트륨 및 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 7.0; 이동상 B: 20 mM 인산수소이나트륨, 400 mM 염화나트륨, pH 5.0. 1.0 mL/분 유량, 주위 온도. 각 샘플을 밀리-Q 물로 1.0 mg/mL까지 희석시킴, 샘플 주입 적재 100 ㎍ (중복 주입)

■ J695, SDS-PAGE 분석: Novex 아크릴 아미드 슬랩 겔 (비-환원 조건의 경우에 8-16%, 환원 조건의 경우에 12%, Invitrogen), 쿠마시(Coomassie) 염색 (Invitrogen). 10x 스톡 용액(Invitrogen)으로 제조한 트리스-글리신 완충제를 사용하여 환원(β-머캅토에탄올) 및 비환원 조건하에 분리

■ J695, 완충제 성분의 정량화:

ｏ 만니톨: ReproGel Ca 컬럼당 분리(Dr. Maisch, Germany) 및 RI 검출 마다 분리, 이동상: 탈이온수, 0.6 mL/분 유량, 20 μL 샘플 주입. 정량화는 외부 교정 표준 곡선을 사용하여 실시하였다.

ｏ 히스티딘 및 메티오닌: OPA(오르토-프탈산 알데히드)를 사용한 아미노산의 형광 표지 및 레프로실(ReproSil) ODS-3 컬럼의 HPLC 분리(Dr. Maisch, Germany) 및 420 nm(330 nm에서 여기)에서 형광 검출, 이동상 A: 70% 시트르산 (10.51 g/L) 완충제, pH 6.5, 30% 메탄올, 이동상 B: 메탄올, 1.0 mL/분 유량, 20 μL 샘플 주입. 정량화는 외부 교정 표준 곡선을 사용하여 실시하였다.

■ J695, PCS 분석은 4.3875 mPas의 용액 점도를 가정하는 173°, 1.450의 단백질의 굴절률 및 1.335의 완충제 용액의 굴절률에서 맬버른 인스트루먼츠 제타사이저 나노 ZS를 사용하여 25℃에서 1회용 플라스틱 큐벳에서 100 mg/mL에서 희석하지 않고 실시하였다. 20 스캔, 20초 각각의 평균 결과를 보고하였다.

단백질 농도의 계산

계산식:

상기 식에서,

ε는 흡광 계수이고,

c는 농도이며,

d는 광이 통과하는 큐벳의 길이이고,

E는 흡광도이며,

I_o는 초기 광 강도이고,

I는 샘플을 통과한 후의 광 강도이다.

샘플 수집 도식

제조된 용액의 샘플을 하기 기재된 온도에서 저장하고, 연구 개시 후에 지시된 시점에서 수집하였다(x)(표 63). 시험 파라미터 및 방법은 표 64에 기재되어 있다.

표 63

표 64

J695의 DF/UF 처리

표 65는 정용여과 후의 J695 상태를 제공한다.

표 65

DF/UF 후, 본래 완충제 성분의 농도를 정량적으로 모니터하여 EF 효과를 평가하였다. 모든 결과는 상응하는 분석적 방법(각각 만니톨의 경우에 RI를 사용한 HPLC, 및 OPA 표지 후의 메티오닌 및 히스티딘의 경우에 형광 검출)의 실제 검출 한계(표 66 참조) 미만인 것으로 밝혀졌다.

표 66

저장시의 J695 특성화

하기 표 67은 저장시에 100 mg/mL에서 DF/UF 후의 J695의 안정성을 지지한다.

표 67

결론

상기 실시예는 물(0.22 ㎛ 여과된 정제수)를 모노클로날 항체 J695에 대한 정용여과 매질로서 사용하는 정용여과/한외여과(DF/UF) 실험을 제공한다.

J695는 DF/UF 교환 매질로서 순수한 물을 사용하여 DF/UF 처리하고, 용액 흐림, 심각한 불투명 또는 혼탁도 형성을 유도하지 않으면서 고농도(100 mg/mL)에서 약 pH 6.4로 제형화하였다.

DF/UF 시험으로부터의 J695를 2 내지 8℃ 및 40℃에서 6개월 이하 동안 SCF 시린지에 저장하였다. 수득된 데이타는 단백질의 양호한 전체 안정성을 나타낸다.

결론적으로, DF/UF 교환 매질로서 순수한 물을 사용하는 단백질의 처리 및 제형화는 실현가능하다. 이상적 100% 부형제 막 투과성을 가정하면, 약 99.3%의 최대 부형제 감소율을 평가할 수 있다. DF/UF 후에 부형제 농도는 실제 검출 한계 미만인 특정한 방법으로 입증된다.

실시예 30: 고농도 아달리무맙 수용액의 냉동/해동 특성 및 안정성 - 상동성 및 물리적 안정성

저이온성 아달리무맙 용액의 제조

2 L PETG 병 중의 1.6 L 약물 물질 (DS) 재료를 수욕에서 25℃로 해동시키고, 균질화시키고, 정용여과 교환 매질로서 주사용수를 사용하여 DF/UF 처리하였다. 정용여과는 다음 파라미터를 적용하여 사르토리우스 사르토콘 슬라이스 장치로 연속 방식으로 실시하였다.

- 펌프 배출: 8%

- 압력 유입구: 최대 1 bar (0.8 bar)

- 막: 2 x PES, 컷오프 50 kD

정용여과 동안 5배 용적의 교환은 몰삼투농도를 8 mOsmol/kg로 감소시키기에 충분하였다.

공정관리(IPC)하에 샘플은 정용여과전(SEC, OD280에 의한 단백질 농도, pH, 몰삼투농도 및 밀도) 및 정용여과후(OD280에 의한 단백질 농도, pH, 몰삼투농도 및 밀도)에 수집하였다. IPC 샘플은 멸균하지 않았다.

정용여과 후, 물에서 제형화된 약 70 mg/mL 아달리무맙을 주사용수로 50 mg/mL까지 희석하고, pH를 5.2로 조정하였다.

물에서 제형화된 1.6 L의 아달리무맙 50 mg/mL(pH 5.2)를 2 L PETG 병에 재충전시켰다. 잔여 용적의 아달리무맙 용액을 DF/UF 처리하여 농도를 100 mg/mL로 증가시켰다.

물에서 제형화된 아달리무맙 100 mg/mL(pH 5.3)를 멸균 여과하고, 이들 중 0.8 L를 1 L PETG 병에 충전시켰다.

분석

- 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)

- pH - 측정

- 몰삼투농도 측정

- 밀도 측정

- OD280에 의한 단백질 농도

- 광학 외관

- 이온 교환 크로마토그래피(IEC)

아달리무맙 1 L 용기의 냉동/해동 실험

1 L PETG 용기 중의 물에서 제형화된 아달리무맙 100 mg/mL를 2 내지 8℃로 미리 냉각시킨 다음, -80℃에서 냉동시켰다(냉동 주기 12시간 초과). 1 L PETG 중의 냉동된 샘플을 연속적으로 수욕에서 25℃로 해동시켰다. 해동 동안, 냉동된 용액의 병을 액체 수준 이하로 수욕에 침지시켰다. 다음 샘플을 균질화 없이 해동 직후에 및 15 내지 30회 상하 회전(turn)에 의한 균질화 후에 수집하였다.

표 68

샘플 수집 도식:

아달리무맙 용액의 특성화

물에서 제형화된 아달리무맙 50 mg/mL 및 100 mg/mL는 매회 투명하게 나타나고, 엷은 황색을 나타내며, 유백광이 없으며 온화한 이동 후에 파형이 없었다.

또한, 냉동 및 해동 후, 물에서 제형화된 아달리무맙은 외관 변화가 없었다(해동 직후 및 15 내지 30회 상하 회전 후).

약간의 파형은, 해동 직후 및 해동 직후의 샘플 수집 동안 용액 내로 니들의 침지 후에 병의 온화한 이동 후에 관찰되었다.

시판 완충제 중의 아달리무맙을 사용한 유사한 실험과는 대조적으로, 물 중의 아달리무맙 용액 50 mg/mL는 단백질 농도, 밀도 및 몰삼투농도의 어떠한 구배도 나타내지 않았다.

또한, 아달리무맙 100 mg/mL는 단백질 농도, 밀도 및 몰삼투농도의 어떠한 구배도 나타내지 않았다.

안정성은 각각 -30℃ 및 -80℃에서의 6개월 저장 후에 평가하였다.

다음에서, 각 분석 데이타를 요약하였다.

표 69

냉동/해동 처리 전의 아달리무맙 50 및 100 mg/mL

표 70

냉동/해동 처리 후에 물에서 제형화된 아달리무맙 50 mg/mL, pH 5.2

표 71

냉동/해동 처리 후에 물에서 제형화된 아달리무맙 100 mg/mL, pH 5.2

표 72

물에서 제형화된 아달리무맙 100 mg/mL, pH 5.2, 저장 후의 안정성

결론

냉동/해동 처리 후 및 -30℃ 및 -80℃에서 6개월 이하 동안 저장 후에 물에서 제형화된 50 및 100 mg/mL 아달리무맙의 현저한 안정성은 적용된 분석학적 방법으로 관찰되지 않았다.

실시예 31: 저이온성 제형에서 아달리무맙의 냉동 및 해동 - 단백질 함량을 포함하는 공정 설계 공간

용액의 제조

아달리무맙 BDS (벌크 약물 물질)를 23℃의 순환 수욕에서 해동시켰다. 용액은 한외여과/정용여과(UF/DF) 방법(펠리컨 "미니(Mini)" 2)을 사용하여 용적 감소를 위해 100 mg/ml의 표적 농도로 상승-농축시켰다. 바이오맥스(Biomax) 10K 폴리에테르설폰을 갖는 밀리포어 펠리컨 2 탄젠트 유동 미니-카세트의 2개 카세트를 펠리컨 2 장치에 설치하였다. 공정 개시 시점에서, 유량은 60 ml/분으로 측정됐고, 공급 압력은 21 psi이었다. 공정은 111.3 mg/mL 단백질 농도에서 중단하였다.

스펙트라/포르(Spectra/Por) 분자 다공성 막 관류를 투석에 사용하였다(직경 48mm, 18ml/cm 용적, 75 cm 길이). pH 5.2에서 아달리무맙 100 mg/ml의 8L 용적을 8개의 투석 튜브로 옮겼다. 각 튜브는 1L의 아달리무맙 100 mg/ml로 충전시켰다. 4L 용액에 상응하는 4개의 튜브를 주입용수 36L를 갖는 용기에 넣었다. 즉, 1:10의 용액 교환 인자를 달성하였다. 용액은 용적을 신선한 주입용수로 교환하기 전에 평형에 도달하게 하였다. 용액 교환은 1:100,000의 전체 용액 교환 인자에 도달할 때까지 5회 반복하였다.

용액을 투석에 의해 완전히 교환한 후, 제2 UF/DF 단계에 의해 농축시켰다. 제2 UF/DF 단계는 제1 단계와 유사하게 실시하였다. 저이온성 제형에서 247.5 mg/ml의 최종 농도를 달성하였다. UF/DF는 폴리소르베이트 80을 미리 함유하는 출발 재료로 실시하였다. 최종 단백질 용액에 축적된 폴리소르베이트 80은 0.1%보다 높은 폴리소르베이트 함량을 생성할 것으로 예상할 수 있다.

247.5 mg/ml 아달리무맙의 상승-농축된 벌크 용액을 WFI로 희석하여 필요한 단백질 농도 수준을 -200 mg/ml, 175 mg/ml, 150 mg/ml, 140 mg/ml, 130 mg/ml, 120 mg/ml, 100 mg/ml, 80 mg/ml, 50 mg/ml, 40mg/ml 및 25mg/ml로 저하시켰다. 병 충전 용적은 모든 실험에서 1600 ml이었다.

냉동 공정

냉동 속도의 일련의 증가를 당해 평가에서 사용하였다: 초저온 동결기 하부 선반 < 초저온 동결기 중간 선반 < 초저온 동결기 상부 선반 << 건조 아이스

-70℃ 미만의 동결기를 실험에 사용하였다(용량: 20.2 Cu. Ft. (572 리터)). 3개 선반을 사용하였다. 각각은 9개의 2L PETG 병에 적재하였다. 병을 동결기에 넣기 전에 실온에서 저장하였다. 냉동은 48시간 이상 동안 지속한다. 설계 공간 평가를 위해, 냉동 속도가 증가하는 3개의 위치를 선택하였다. 하부 선반 위의 전방 위치를 최저 냉동 속도에 사용하였다. 보다 빠른 냉동 속도는 중간 선반 상의 중간 위치에서 달성되었다. 동결기 설정에서 보다 빠른 냉동 속도는 상부 선반 위의 후측/우측 위치에서 실시하였다.

건조 아이스에 의한 냉동을 위해, 1개의 병을 8시간 이상 동안 드라이 아이스로 완전히 둘러쌌다. 스티로폼 박스에서, 하부를 드라이 아이스의 층(약 3 내지 5 cm 두께)으로 피복하였다. 1개의 병을 드라이 아이스 층의 상부에 정치시켰다. 결과적으로, 병과 스티로폼 박스의 내벽 사이의 공간을 캡 이외의 모든 표면이 피복될 때까지 드라이 아이스로 충전시켰다. 냉동 시간 후, 병을 제거하고, 즉시 해동하거나 저장을 위해 -70℃ 동결기에 넣었다.

해동 공정

일련의 해동 속도를 당해 평가에 사용하였다: 4℃에서 공기 냉각 << 수욕 23℃ < 수욕 37℃

분석

다음 분석을 실시하여 샘플을 특성화하였다:

ㆍ 몰삼투농도

ㆍ 전도도

ㆍ pH

ㆍ 밀도

ㆍ 직접 UV(280nm)에 의한 단백질 농축

농축 시험을 위해, 샘플을 1.2 미만의 흡광도에 도달할 때까지 물로 희석시켰다. 280nm에서 아달리무맙 분자에 대해 1.39의 흡광 계수를 사용하였다.

아달리무맙 용액의 특성화

병 매핑 연구는 병 용적에서의 구배 형성에 대한 약간의 경향을 나타냈다. 특히, 보다 느린 냉동 및 해동 속도의 경우, 보다 고단백질 농도는 하부 병 부근에서 검출되었다. 이러한 현상은 또한 전도도, 밀도 및 몰삼투농도 데이타에 반영되었다. pH는 모든 시험된 조건에서 실제로 일정한 것으로 나타난다.

초저온 동결기에서 병 기반 시스템의 경우에 냉동 및 해동 설계 공간에 대한 종래의 연구에서, 침강 외관은 허용가능한 작동 범위의 경계를 결정하는 주요 실패 방식인 것으로 밝혀졌다. 이러한 연구에서, 당해 경계는 조사된 설계 공간이 매우 넓은 범위를 피복하더라도 관찰되지 않았다. 이러한 생성물의 독특한 거동은 또한 당해 냉동 및 해동 공정 동안 농도 구배의 매우 낮은 형성 경향에 반영된다. 종래의 연구에서, 생성물 및 공정 고유의 구배 형성은 특정한 공정 조건하에 침전물의 발생을 유발하는 것으로 결론지었다. 결과적으로, 공정 관점에서 당해 시스템은 247.5 mg/ml의 벌크 약물 물질 농도까지 저이온성 제형(pH 5) 중의 아달리무맙에 실시가능한 것으로 측정되었다. 조사된 아달리무맙 물 제형은 놀랍게도 다른 시험된 아달리무맙 제형과 비교하여 우수한 성능을 입증하였다.

표 73

저이온성 제형 함유 병에서 갓 해동된(23℃ 수욕) 100mg/ml 아달리무맙에서 단백질 농도, 전도도, 몰삼투농도, 밀도 및 pH의 분포

냉동 & 해동 조건: -70℃ 상부/23℃ 해동

냉동 & 해동 조건: -70℃ 중간/23℃ 해동

냉동 & 해동 조건: -70℃ 하부/23℃ 해동

표 74

저이온성 제형 함유 병에서 갓 해동된(23℃ 수욕) 140mg/ml 아달리무맙에서 단백질 농도, 전도도, 몰삼투농도, 밀도 및 pH의 분포

냉동 & 해동 조건: -70℃ 상부/23℃ 해동

냉동 & 해동 조건: -70℃ 중간/23℃ 해동

냉동 & 해동 조건: -70℃ 하부/23℃ 해동

표 75

저이온성 제형 함유 병에서 갓 해동된(37℃ 수욕) 200mg/ml 아달리무맙에서 단백질 농도, 전도도, 몰삼투농도, 밀도 및 pH의 분포

냉동 & 해동 조건: -70℃ 상부/37℃ 해동

냉동 & 해동 조건: -70℃ 중간/37℃ 해동

냉동 & 해동 조건: -70℃ 하부/37℃ 해동

표 76

저이온성 제형 함유 병에서 갓 해동된(23℃ 수욕) 247.5mg/ml 아달리무맙에서 단백질 농도, 전도도, 몰삼투농도, 밀도 및 pH의 분포

냉동 & 해동 조건: -70℃ 상부/23℃ 해동

냉동 & 해동 조건: -70℃ 중간/23℃ 해동

냉동 & 해동 조건: -70℃ 하부/23℃ 해동

표 77

드라이 아이스 냉동 후 저이온성 제형 함유 병에서 갓 해동된(23℃ 수욕) 247.5mg/ml 아달리무맙에서 단백질 농도, 전도도, 몰삼투농도, 밀도 및 pH의 분포

냉동 & 해동 조건: 드라이 아이스 냉동/ 23℃ 해동

냉동 & 해동 조건: 드라이 아이스 냉동/2 내지 8℃ 해동

첨부 A: PCS 데이타

첨부 B: SEC 데이타

첨부 C: IEC 데이타

첨부 D

첨부 E

등가물

당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에는 본원에 기재된 본 발명의 특정한 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 단지 통상의 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음 특허청구범위에 포함되는 것으로 의도된다. 본원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 공개 특허원의 내용은 본원에 참조로서 도입된다.

SEQUENCE LISTING <110> FRAUNHOFER, Wolfgang BARTL, Annika KRAUSE, Hans-Jeurgen TSCHOPPE, Markus KALETA, Katharina <120> Protein Formulations and Methods of Making Same <130> 117813-26920 <140> PCT/US2008/085066 <141> 2008-11-28 <150> 61/004,992 <151> 2007-11-30 <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro 80 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp 20 25 30 Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu 65 70 75 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 80 85 90 95 Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = Thr or Ala <223> Variable light chain CDR3 <400> 3 Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Xaa 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = Tyr or Asn <223> Variable heavy chain CDR3 <400> 4 Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Xaa 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR2 <400> 5 Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR2 <400> 6 Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Glu Gly <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR1 <400> 7 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR1 <400> 8 Asp Tyr Ala Met His 1 5

Claims (156)

1. 50 mg/ml 이상의 농도의 아달리무맙 (adalimumab)과 물을 포함하는 약제학적 수성 제형으로서, 상기 제형의 전도도가 2.5 mS/cm 미만인, 약제학적 수성 제형.
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11. 제1항에 있어서, 상기 제형의 전도도가 2 mS/cm 미만인, 수성 제형.
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21. 50 mg/mL 이상의 농도의 아달리무맙 (adalimumab)과 물을 포함하는 약제학적 수성 제형으로서, 상기 제형의 몰삼투농도(osmolality)가 30 mOsmol/kg 이하인, 약제학적 수성 제형.
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27. 물과 50 mg/mL 이상의 농도의 아달리무맙 (adalimumab)을 포함하는 약제학적 수성 제형으로서, 상기 아달리무맙의 수력학적 직경(hydrodynamic diameter: D_h)이 완충제 용액 중 상기 소정 농도의 아달리무맙의 D_h보다 50% 이상 작은, 약제학적 수성 제형.
28. 제27항에 있어서, 상기 아달리무맙의 D_h가 인산완충식염수(PBS) 중 상기 소정 농도의 아달리무맙의 D_h보다 50% 이상 작은, 수성 제형.
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37. 50 mg/mL 이상의 농도의 아달리무맙 (adalimumab) 및 물을 포함하는 약제학적 수성 제형으로서, 상기 아달리무맙의 수력학적 직경(D_h)이 4 nm 미만인, 약제학적 수성 제형.
38. 제37항에 있어서, 상기 아달리무맙의 D_h가 3 nm 미만인, 수성 제형.
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42. 제1항, 제11항, 제21항, 제27항, 제28항 및 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 비이온성 부형제를 추가로 포함하는, 수성 제형.
43. 제42항에 있어서, 상기 비이온성 부형제가 폴리올, 비이온성 계면활성제, 슈크로즈, 트레할로즈, 라피노즈 및 말토즈로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 수성 제형.
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50. 제1항, 제11항, 제21항, 제27항, 제28항 및 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 제형이 시험관내 사용에 적합한, 수성 제형.
51. 제1항, 제11항, 제21항, 제27항, 제28항 및 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 제형이 생체내 사용에 적합한, 수성 제형.
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53. 제51항에 있어서, 환자의 장애 치료를 위한 수성 제형.
54. 제1항, 제11항, 제21항, 제27항, 제28항 및 제37항 중의 어느 한 항에 따르는 수성 제형을 포함하는 장치.
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56. 제1항, 제11항, 제21항, 제27항, 제28항 및 제37항 중의 어느 한 항에 따르는 수성 제형을 포함하는 제조 물품 (article of manufacture).
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118. 만니톨, 폴리소르베이트 80, 50 mg/mL 이상의 농도의 아달리무맙 (adalimumab) 및 물을 포함하는 약제학적 수성 제형으로서, 상기 제형의 전도도가 2.5 mS/cm 미만인, 약제학적 수성 제형.
119. 만니톨, 폴리소르베이트 80, 50 mg/mL 이상의 농도의 아달리무맙 (adalimumab) 및 물을 포함하는 약제학적 수성 제형으로서,
     상기 아달리무맙의 수력학적 직경(D_h)이 완충된 용액 중의 동일한 농도의 상기 아달리무맙의 D_h보다 50% 이상 작은, 약제학적 수성 제형.
120. 제119항에 있어서, 상기 아달리무맙의 D_h가 동일한 농도에서 인산완충식염수(PBS) 중의 상기 아달리무맙의 D_h보다 50% 이상 작은, 수성 제형.
121. 만니톨, 폴리소르베이트 80, 50 mg/mL 이상의 농도의 아달리무맙 (adalimumab) 및 물을 포함하는 약제학적 수성 제형으로서,
     상기 아달리무맙의 수력학적 직경(D_h)이 4 nm 미만인, 약제학적 수성 제형.
122. 제118항, 제119항 및 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 장애 치료를 위한 수성 제형.
123. 제118항, 제119항 및 제121항 중 어느 한 항의 제형을 포함하는 장치.
124. 제118항, 제119항 및 제121항 중 어느 한 항의 제형을 포함하는 제조 물품 (article of manufacture).
125. 제1항, 제21항, 제27항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아달리무맙의 농도가 100 mg/mL 이상의 농도, 150 mg/mL 이상의 농도, 200 mg/mL 이상의 농도 및 200 mg/mL 초과의 농도로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 수성 제형.
126. 제118항, 제119항 및 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아달리무맙의 농도가 100 mg/mL 이상의 농도, 150 mg/mL 이상의 농도, 200 mg/mL 이상의 농도 및 200 mg/mL 초과의 농도로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 수성 제형.
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131. 50 mg/mL 이상의 농도의 아달리무맙 (adalimumab), 비이온성 부형제, 완충제 및 물을 포함하는 약제학적 수성 제형으로서, 상기 제형의 전도도가 2.5 mS/cm 미만인, 약제학적 수성 제형.
132. 제42항에 있어서, 상기 비이온성 부형제가 폴리올인, 수성 제형.
133. 제132항에 있어서, 상기 폴리올이 만니톨인, 수성 제형.
134. 제132항에 있어서, 상기 폴리올이 솔비톨인, 수성 제형.
135. 제132항에 있어서, 상기 폴리올이 슈크로즈인, 수성 제형.
136. 제42항에 있어서, 상기 비이온성 부형제가 비이온성 계면활성제인, 수성 제형.
137. 제136항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 또는 폴리소르베이트 80인, 수성 제형.
138. 제136항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 80인, 수성 제형.
139. 제1항, 제21항, 제27항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 만니톨 및 폴리소르베이트 80을 추가로 포함하는, 수성 제형.
140. 제1항, 제21항, 제27항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 슈크로즈 및 폴리소르베이트 80을 추가로 포함하는, 수성 제형.
141. 제131항에 있어서, 상기 비이온성 부형제가 폴리올인, 수성 제형.
142. 제131항에 있어서, 상기 비이온성 부형제가 비이온성 계면활성제인, 수성 제형.
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