KR101235507B1 - 단백질을 함유하는 안정화 제제 - Google Patents

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Abstract

계면 활성제로서 폴록사머를 포함하는 단백질 제제, 및 계면 활성제로서 폴록사머를 첨가함으로써, 항산화제를 첨가하지 않고 단백질 제제 중의 생물 활성을 유지하고, 또한 불용성 이물질의 생성을 억제하는 방법.

Description

단백질을 함유하는 안정화 제제{STABILIZED PREPARATION CONTAINING PROTEIN}
본 발명은 안정적인 단백질 함유 안정화 제제에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 계면 활성제로서 폴록사머 (poloxamer) 를 함유하는 안정적인 단백질 함유 제제에 관한 것이다.
유전자 재조합 기술의 발달에 의해, 항체, 효소, 호르몬, 사이토카인 등의 생리 활성을 갖는 단백질에 관해서도 의약품으로서 이용하는 것이 가능해져 왔다. 이들을 안정적인 공급량으로 또한 고품질로 제공하기 위해서는, 구조 및 활성을 유지할 수 있는 제조 조건 및 보존 조건을 확립하는 것이 필요로 되고 있다.
일반적으로, 단백질을 보존하는 경우, 불용성 응집체의 생성을 비롯한 열화 현상이 문제가 되어, 그것을 방지할 필요가 있다.
예를 들어, 면역글로불린, 모노클로날 항체, 인간화 항체 등의 항체는 불안정적인 단백질이고, 정제 및 조제 행정에서 실시하는 여과 스트레스, 농축 스트레스, 열 스트레스, 나아가서는 원액, 제제 보존 중의 열, 광, 수송 스트레스 등에 의해 회합, 응집 등의 물리적, 화학적 변화를 일으키기 쉽다.
또한, 유전자 공학적 수법으로 항체를 얻을 때에는, 항체 생성 세포를 벌크 배양하고, 정제하여 얻어진 항체 함유 용액을 동결하여 보존하여, 제제화 단계에서 융해한다. 이러한 동결 융해를 반복하는 과정에서 항체 이량체나 불용성 미립자, 불용성 이물질이 생성하거나, 또한 장기 보존 중에 항체가 분해되어 분해물이 생겨, 결과적으로 항체의 잔존율이 저하되는 것이 문제이었다.
이러한 불용성 이물질의 생성을 억제하여 안정적인 단백질 함유 제제를 얻기 위해서는, 계면 활성제의 사용이 필수적이고, 특히 폴리소르베이트 20, 80 등의 계면 활성제가 널리 사용되어 왔다. 그러나, 폴리소르베이트 80 은 단백질을 산화시키고 (PDA J. Pharm. Sci. Technol. 50:3(1996); Formulation, Characterization, and Stability of Protein Drugs. Plenum Press, New Yolk, (1996)), 그 결과 항체 제제의 생물 활성을 저하시키는 성질이 있어서, 산화되기 쉬운 단백질 제제의 경우에는 폴리소르베이트 80 에 부가하여, 항산화제인 L-메티오닌 등을 첨가할 필요가 있었다 (일본 공개특허공보 2000-247903, J. Pharm. Sci. 90:3 (2001)). 그러나, 항산화제를 첨가할 때에는, 항산화제의 규격이나 첨가량을 엄밀히 정할 필요가 있는 등의 번잡함이 있었다.
그래서, 항산화제를 첨가하지 않고, 단백질의 산화를 억제하고, 또한 단백질 제제의 불용성 이물질 생성을 억제할 수 있는 계면 활성제가 요구되고 있었다. 또한, 동결 건조 제제로 하면 단백질의 산화는 억제할 수 있지만 (예를 들어 일본 공개특허공보 2000-247903), 재용해의 시간이 필요없는 사용하기 좋은 용액 제제에 대한 요구도 커서, 용액 제제로서도 안정적인 단백질 함유 제제가 요구되고 있었다.
본 발명의 목적은, 항산화제을 첨가하지 않고, 단백질의 산화를 억제함으로써 단백질의 생물 활성을 유지하고, 또한 단백질 제제의 불용성 이물질 생성을 억제할 수 있는 계면 활성제를 발견하여, 이 계면 활성제를 포함하는 단백질 함유 안정화 제제를 제공하는 것이다.
(발명의 개시)
상기 목적을 달성하기 위해서 예의 연구한 결과, 본 발명자들은, 폴록사머를 계면 활성제로서 첨가함으로써, 항산화제를 첨가하지 않아도 단백질을 산화시키지 않고 단백질의 생물 활성을 유지하고, 또한 단백질 함유 제제의 불용성 이물질의 생성을 억제할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 이하의 것을 제공한다:
(1) 계면 활성제로서 폴록사머를 포함하는 단백질 제제.
(2) 폴록사머가 폴록사머 188 인 상기 (1) 기재된 단백질 제제.
(3) 용액 제제인 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 단백질 제제.
(4) 단백질이 면역글로불린인 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 단백질 제제.
(5) 면역글로불린이 인간화 항체인 상기 (4) 기재된 단백질 제제.
(6) 면역글로불린이 항조직 인자 항체인 상기 (4) 기재된 단백질 제제.
(7) 항조직 인자 항체가 인간화 항조직 인자 항체인 상기 (6) 기재된 단백질 제제.
(8) 첨가제로서 항산화제를 포함하지 않은 상기 (1)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 단백질 제제.
(9) 계면 활성제로서 폴록사머를 첨가함으로써, 항산화제를 첨가하지 않고 단백질 제제의 생물 활성을 유지하고, 또한 불용성 이물질의 생성을 억제하는 방법.
(10) 단백질이 과립구 콜로니 자극 인자인 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 단백질 제제.
(11) 단백질이 부갑상선 호르몬인 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 단백질 제제.
(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)
본 발명에 있어서, "단백질 함유 제제"란, 활성 성분으로서 단백질, 바람직하게는 생리 활성 단백질을 포함하며, 인간 등의 동물에게 투여할 수 있도록 조제된 제제를 말하고, 동결 건조 제제 및 용액 제제의 모두를 포함한다.
본 발명의 제제에 사용하는 단백질은, 항체, 효소, 사이토카인, 호르몬을 포함하지만 이것에 한정되지 않는다. 구체적으로는, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극인자 (GM-CSF), 에리스로포에틴 (EPO), 트롬보포에틴 등의 조혈 인자; 인터페론, IL-1 이나 IL-6 등의 사이토카인; 면역글로불린; 모노클로날 항체; 인간화 항체; 조직 플라스미노겐 활성화 인자 (TPA); 우로키나아제; 혈청 알부민; 혈액 응고 제 VIII 인자; 레프틴; 인슐린; 줄기 세포 성장 인자 (SCF) 등을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 단백질 중에서도, G-CSF, EPO 등의 조혈 인자, 부갑상선 호르몬 (PTH) 및 면역글로불린이 바람직하고, 특히 항체가 바람직하다. 항체로는 특히, 항조직 인자 항체가 바람직하다.
본 발명의 제제로 사용하는 단백질은, 포유 동물, 특히 인간의 생리 활성 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 활성을 갖는 것이며, 천연 유래의 것, 및 유전자 조작법에 의해 얻어진 것을 포함하지만, 바람직한 것은 유전자 조작법에 의해 얻어진 것이다. 유전자 조작법에 의해 얻어지는 단백질에는 천연 단백질과 아미노산 서열이 같은 것, 혹은 상기 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 결실, 치환, 부가한 것으로서 상기 생물학적 활성을 유지하는 것을 포함한다. 나아가서, 생리 활성 단백질은 PEG 등에 의해 화학 개질된 것도 포함한다.
특히 당쇄를 갖는 단백질이 바람직하다. 당쇄의 유래로는, 특별히 제한은 없지만, 포유 동물 세포에 부가되는 당쇄가 바람직하다. 표유 동물 세포에는, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, BHK 세포, COS 세포, 인간 유래의 세포 등이 있지만, 이 중에서도, CHO 세포가 가장 바람직하다.
단백질이 EPO 인 경우에는, EPO 는 어떠한 방법으로 제조된 것이어도 되고, 인간의 뇨에서 여러 방법으로 추출하여, 분리 정제한 것, 또는 유전자 공학적 수법 (예를 들어 일본 공개특허공보 소61-12288호) 에 의해 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO), BHK 세포, COS 세포, 인간 유래의 세포 등에 생성시켜, 여러 방법으로 추출하여 분리 정제한 것이 사용된다. 나아가서는, PEG 등에 의해 화학 개질된 EPO 도 포함한다 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 90/12874 참조). 또한, 당쇄가 붙어 있지 않은 EPO 를 PEG 등에 의해 화학 수식한 것도 포함한다. 또한, EPO 의 아미노산 서열 중의 N-결합 탄수화물쇄 결합 부위 혹은 O-결합 탄수화물쇄 결합 부위에 있어서, 1 이상의 글리코실화 부위의 수를 증가시키도록 개질한 EPO 유사체도 포함한다 (예를 들어, 일본 공개특허공보 평8-151398호, 일본 특허공표공보 평8-506023호 참조). 또한, 당쇄 결합 부위의 수는 변화시키지 않고, 시알산 등의 함량을 증가시킴으로써 당쇄의 양을 증가시킬 수 있다.
단백질이 G-CSF 인 경우, 임의의 고순도로 정제된 인간 G-CSF 를 사용할 수 있다. 본 발명에서의 G-CSF 는, 어떠한 방법으로 제조된 것이어도 되고, 인간 종양 세포의 세포주를 배양하고, 이것에서 여러 방법으로 추출하여 분리 정제한 것, 혹은 유전자 공학적 수법에 의해 대장균 등의 세균류; 이스트균; 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, C127 세포, COS 세포 등의 동물 유래의 배양 세포 등에 생성시켜, 여러 방법으로 추출하여 분리 정제한 것이 사용된다. 바람직하게는 대장균, 이스트균 또는 CHO 세포에서 유전자 재조합법에 의해, 가장 바람직하게는 CHO 세포에서 유전자 재조합법에 의해 G-CSF 가 생산된다. 나아가서는, PEG 등에 의해 화학 개질된 G-CSF 도 포함한다 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 90/12874 참조).
단백질이 항체인 경우, 항체는 원하는 항원과 결합하는 한 특별히 제한은 없고, 마우스 항체, 래트 항체, 토끼 항체, 양 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등을 적절히 사용할 수 있다. 항체는, 폴리클로날 또한 모노클로날 항체이어도 되지만, 균질한 항체를 안정적으로 생산할 수 있는 점에서 모노클로날 항체가 바람직하다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체는 당업자에 방법에 의해 제작할 수 있다.
모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마는, 기본적으로는 공지 기술을 사용하여, 아래와 같이 하여 제작할 수 있다. 원하는 항원이나 원하는 항원을 발현하는 세포를 면역 항원(immunizing antigen)으로서 사용하여, 통상의 면역 방법에 따라서 숙주세포를 면역시키고, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지된 부모 세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의해, 모노클로날 항체 생성 세포 (하이브리도마) 를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다. 하이브리도마의 제작은, 예를 들어, 밀스테인 등의 방법 (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzy㏖. (1981) 73:3-46) 등에 준하여 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮은 경우에는, 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대 분자와 결합시켜, 면역을 행하면 된다.
또한, 항체 유전자를 하이브리도마에서 클로닝하여, 적당한 벡터에 넣고, 이것을 숙주에 도입하여, 유전자 재조합 기술을 사용하여 생성시킨 유전자 재조합형 항체를 사용할 수 있다 (예를 들어, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD,. 1990 참조). 구체적으로는, 하이브리도마의 mRNA 에서 역전사 효소를 사용하여 항체의 가변 영역 (V 영역) 의 cDNA 서열을 합성한다. 목적하는 항체의 V 영역을 코드하는 DNA 서열이 얻어지면, 이것을 원하는 항체 불변 영역 (C 영역) 을 코드하는 DNA 서열과 연결하여, 이것을 발현 벡터에 넣는다. 다르게는, 항체의 V 영역을 코드하는 DNA 서열과, 항체 C 영역의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터에 넣어도 된다. 발현 제어 영역, 예를 들어, 인핸서 및 프로모터의 제어 하에서 발현하도록 발현 벡터에 넣는다. 다음으로, 이 발현 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환하여, 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명에서는, 인간에 대한 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개질한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 항체, 인간화 항체 등을 사용할 수 있다. 이들 개질 항체는, 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 키메라 항체는, 인간 이외의 포유 동물, 예를 들어, 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역과 인간 항체의 중쇄 및 경쇄의 불변 영역으로 이루어지는 항체이고, 마우스 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 인간 항체의 불변 영역을 코드하는 DNA 서열과 연결하고, 이것을 발현 벡터에 넣어 숙주를 형질전환시켜서 키메라 항체를 생성하도록 함으로써, 얻을 수 있다.
인간화 항체는, 재구성 (reshaped) 인간 항체로도 불리우며, 인간 이외의 포유 동물, 예를 들어 마우스 항체의 상보성 결정 영역 (CDR) 을 인간 항체의 상보성 결정 영역으로 이식하여 얻을 수 있고, 이를 위한 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는, 마우스 항체의 CDR 과 인간 항체의 프레임워크 영역 (framework region; FR) 을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 제작한 수 개의 올리고뉴클레오티드에서 PCR 법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA 서열을 인간 항체 불변 영역을 코드하는 DNA 서열과 연결하고, 이어서 발현 벡터에 넣고, 이것을 숙주에 도입하여 형질전환시켜서 재구성 항체를 생성하도록 한다 (유럽 특허 출원 공개 번호 EP 239400, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 96/02576 참조). CDR 을 통해 연결되는 인간 항체의 FR 은, 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간화 항체의 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역의 프레임워크 영역의 일부 아미노산을 치환할 수 있다 (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
또한, 인간 항체의 취득 방법도 알려져 있다. 예를 들어, 인간 림프구를 in vitro 에서 원하는 항원 또는 원하는 항원을 발현하는 세포로 시험관내에서 면역시키고, 면역 림프구를 인간 골수종 세포, 예를 들어 U266 과 융합시켜, 원하는 항원에 대한 결합 활성을 갖는 원하는 인간 항체를 얻을 수 있다 (일본 특허공보 평1-59878 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 트랜스제닉 동물을 항원으로 면역함으로써 원하는 인간 항체를 취득할 수 있다 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/O2602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조). 또한, 인간 항체 라이브러리를 사용하여, 패닝(panning)에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 1 개쇄 항체 절편 (scFv) 로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현시켜, 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv 절편의 DNA 서열이 해명되면, 이를 기초로 적당한 발현 벡터를 제작하여, 전체 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388 에 이미 공지되어 있다.
항체 유전자를 일단 단리하고, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제작하는 경우, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 적당한 진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진균 세포를 사용할 수 있다. 동물 세포로는, (1) 포유류 세포, 예를 들어, CHO, COS, 골수종, BHK (baby hamster kidney), HeLa 및 Vero, (2) 양서류 세포, 예를 들어, 아프리카 발톱 개구리(Xenopus) 난모 세포, 또는 (3) 곤충 세포, 예를 들어, sf9, sf21 및 Tn5 등이 알려져 있다. 식물 세포로는, 니코티아나 (Nicotiana) 속, 예를 들어 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 알려져 있고, 이것을 캘러스(callus) 배양하면 된다. 진균 세포로는, 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속, 예를 들어 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces serevisiae) 및 사상균, 예를 들어, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 속, 예를 들어 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) 등이 알려져 있다. 원핵 세포를 사용하는 경우, 세균 세포를 사용하는 생성 시스템이 있다. 세균 세포로는, 대장균 (E. coli) 및 바실루스 서브틸리스가 알려져 있다. 이들 세포에, 목적하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 시험관내에서 배양함으로써 항체가 얻어진다.
본 발명의 안정화 제제에 포함되는 항체로는, 항 IL-6 리셉터 항체, 항 HM1.24 항원 모노클로날 항체, 항 부갑상선 호르몬 관련 펩티드 항체 (항 PTHrP 항체), 항조직 인자 항체 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
재구성 인간화 항체로는, 인간화 항 IL-6 리셉터 항체 (hPM-1) (국제 특허 출원 공개 번호 WO 92-19759 를 참조), 인간화 항 HM1.24 항원 모노클로날 항체 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 98-14580 을 참조), 인간화 항 부갑상선 호르몬 관련 펩티드 항체 (항 PTHrP 항체) (국제 특허 출원 공개 번호 WO 98-13388 을 참조) 등을 본 발명에서 사용하는 바람직한 항체로서 들 수 있다.
본 출원인은, 인간 조직 인자에 대한 마우스 모노클로날 항체의 가변 영역 (V 영역) 과 인간 항체의 불변 영역 (C 영역) 으로 이루어지는 인간/마우스 키메라 항체, 나아가서는 인간 조직 인자에 대한 마우스 모노클로날 항체의 경쇄 (L 쇄) V 영역 및 중쇄 (H 쇄) V 영역의 상보성 결정 영역이 인간 항체에 이식되어 있는 인간화 항체를 제작하였고, 이들이 뛰어난 DIC, 동맥 혈전증 및 정맥 혈전증 치료약으로서 기대된다는 것을 보고하였다 (WO 99/51743, WO 01/24626). 특히 바람직한 것은, WO 99/51743 에 기재된 인간화 H 쇄 버전 i 및 인간화 L 쇄 버전 b2 를 조합한 인간화 항인간 조직 인자 항체이고, 이는 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합형 항체이다. 항인간 조직 인자 항체에 관해서는, 이미 다수 보고되어 있다 (WO 99/51743, WO 88/07543, WO 96/40921, WO 98/40408, WO 01/70984). 이들의 항원 조직 인자는 이미 알려져 있기 때문에 (Ito T et al., J. Biochem. 114, 691-696, (1993)), 당업자에 공지된 방법으로 제작하는 것이 가능하다. 이들 항인간 조직 인자 항체도 본 발명에서 사용하는 바람직한 항체이다.
본 발명의 제제에 포함되는 항체는 임의의 면역글로불린 클래스에 속할 수 있지만, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등의 IgG 가 바람직하다.
본 발명에서, "항체 함유 용액"이란, 생체 유래 항체인지, 혹은 재조합 항체인지 상관없이, 어떠한 항체를 포함하는 용액이어도 되고, 바람직하게는, 배양하여 얻어진 항체를 포함하는 CHO 세포 등의 포유 동물 세포의 배양 배지, 혹은 이것에 부분적 정제 등의 일정한 처리를 하여 얻어진 용액 (벌크 용액), 혹은 상기 인간 등의 동물에게 투여할 수 있도록 조제된 용액 제제이다.
본 발명에 있어서, "불용성 이물질"이란, 일본 약국방의 일반 시험법, 주사제의 불용성 이물질 검사법에서 정하는 바와 같이, 용기에 넣은 용액 제제를 백색 광원의 직하, 약 1000 lux의 밝기의 위치에서 육안으로 관찰할 때에, 맑은 용액 제제로부터 간단히 검출되는 불용성 이물질을 말한다.
본 발명에 있어서, "항체의 생물 활성"이란 항체가 항원과 결합할 수 있는 능력을 말하며, 항원의 중화 활성 시험법에 의해 측정할 수 있다. 항체의 생물 활성이 유지된 제제란, 예를 들어, 인간화 항인간 조직 인자 항체의 경우에 있어서, 25℃ 에서 6 개월 보존하는 가속 시험을 행한 후의 생물 활성이, 항체 원액의 생물 활성의 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상이 유지되는 것을 말한다.
본 발명에서, 항체 제제의 순도 시험은, 후술하는 겔 여과 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 단백질 함유 제제에서, 계면 활성제로서 폴록사머를 첨가함으로써, 항산화제를 첨가하지 않아도 단백질을 산화시키지 않고 높은 생물 활성을 유지하고, 또한 단백질 함유 제제에서 불용성 이물질의 생성을 억제할 수 있다.
폴록사머는 비이온성 계면 활성제로서, 이하의 일반식을 갖는 에틸렌옥시드와 프로필렌옥시드의 블록 공중합체의 시리즈로 이루어진다:
HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH
폴록사머에는 USP (미국 약국방) 에 수록된 폴록사머 124, 188, 237, 338 및 407 이 포함되고, 본 발명에서는 특히 폴록사머 188 이 바람직하다. USP 기재된 폴록사머 188 은 상기 식에서의 a 가 80, b 가 27, 평균 분자량이 7680-9510 인 화합물이며, BP (영국 약국방) 기재된 폴록사머 188 은 상기 식에서의 a 가 약 75, b 가 약 30,평균 분자량이 8350 인 화합물이다. 또한, EP (유럽 약국방) 에는, 폴록사머 182, 184 및 331 이 기재되어 있다. 또한, Pluronic (BASF 사의 폴록사머 상표) 으로는, Pluronic L35, L43, L44, L61, L62, L64, F68, L81, P84, P85, F87, F88, L92, F98, L101, P103, P104, P105, F108, L121, P123 및 F127 이 있고, 이들도 본 발명에서의 폴록사머에 포함된다.
폴록사머는 의약품 제제에 있어서, 정맥 주사용 지방 유제의 유화제로서, 혹은 엘릭시르제나 시럽제의 투명성을 유지하기 위한 가용화제로서 사용되어 왔지만, 단백질 함유 제제의 안정화제로는 사용되고 있지 않다.
폴록사머의 첨가량은 사용하는 폴록사머의 종류 및 단백질의 농도 및 종류에 따라 다르지만, 폴록사머 188 의 경우에는, 일반적으로는 0.001∼100㎎/mL 이고, 바람직하게는 0.005∼50㎎/mL, 더욱 바람직하게는 0.01∼10㎎/mL 이다.
본 발명의 단백질 함유 제제에서, 계면 활성제로서 폴록사머를 사용함으로써, 폴리소르베이트의 사용시에 필요로 했던 L-메티오닌 등의 항산화제을 첨가할 필요가 없다.
본 발명의 단백질 함유 제제에는 안정화제로서 아미노산을 첨가할 수 있다. 아미노산에는, 류신, 트립토판, 세린, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘 및 라이신 그리고 그 염을 포함하지만 이것에 한정되지 않는다.
또한 본 발명의 제제에는, 동결/해동 단계의 이량체 생성을 억제하기 위해서 만니톨, 소르비톨 등의 당 알코올; 수크로스, 트레할로스 등의 비환원 2 당류, 라피노스 등의 비환원 3 당류 등의 비환원 올리고당류 등을 첨가할 수도 있다. 특히, 비환원 올리고당류가 바람직하다. 비환원 올리고당류로는, 비환원 2 당류가 바람직하고, 수크로스, 트레할로스가 더욱 바람직하다.
본 발명의 항체 함유 용액 제제는 바람직하게는 안정화제로서 인간 혈청 알부민이나 정제 젤라틴 등의 단백질을 실질적으로 포함하지 않는다.
본 발명의 항체 제제의 pH 는, 바람직하게는 pH 4∼8 이고, 더욱 바람직하게는 pH 5∼7.5 이다. 그러나, pH 는 포함되는 항체에 따라 다르고, 상기 값에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제제는 등장화제로서 예컨대, 폴리에틸렌글리콜; 및 덱스트란, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 글루코스, 프룩토스, 락토스, 자일로스, 만노스, 말토스, 수크로스, 트레할로스, 라피노스 등의 당류를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 함유 용액 제제는, 필요에 의해 추가로 희석제, 용해 보조제, 부형제, pH 조정제, 무통화제(soothing agent), 완충제, 황함유 환원제, 산화 방지제 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 황함유 환원제로는, N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥트산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 및 탄소 원자수 1∼7 의 티오알칸산 등의 설프히드릴기 함유 화합물 등을 들 수 있다. 산화 방지제로는, 에리소르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤, L-아스코르브산 및 그 염, L-아스코르빌 팔미테이트, L-아스코르빌 스테아레이트, 중아황산나트륨, 아황산나트륨, 갈릭산트리아밀, 갈릭산프로필 또는 에틸렌디아민4아세트산2나트륨 (EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있다. 나아가서는, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼륨, 중탄산나트륨 등의 무기염; 시트르산나트륨, 시트르산칼륨, 아세트산나트륨 등의 유기염 등의 통상 첨가되는 성분이 포함될 수 있다.
본 발명의 제제는, 이들 성분을 인산 완충액 (바람직하게는 인산일수소나트륨-인산이수소나트륨계) 및/또는 시트르산 완충액 (바람직하게는 시트르산나트륨의 완충액) 등의 용액 제제 분야에서 공지된 수성 완충액에 용해함으로써 용액 제제를 조제하여 제조된다. 완충액의 농도는 일반적으로는 1∼500 mM, 바람직하게는 5∼100 mM, 더욱 바람직하게는 10∼50 mM 이다.
본 발명의 항체 함유 용액 제제는 통상 비경구 투여 경로로, 예를 들어 주사제 (피하주사, 정맥주사, 근육주사, 복강내 주사 등), 경피, 경점막, 경비, 경폐 등으로 투여되지만, 경구 투여도 가능하다.
본 발명의 단백질 함유 제제는 동결 건조 제제이어도 되고 용액 제제이어도 되나, 용액 제제가 바람직하다. 용액 제제는, 통상 밀봉, 멸균된 플라스틱 또는 유리제 바이알, 앰플, 주사기와 같은 규정 용량의 형상의 용기, 또는 병과 같은 대용량 형상의 용기로 공급할 수 있다. 사용의 편의성 면에서는 프리필드(prefilled) 주사기가 바람직하다.
본 발명의 제제 중에 포함되는 항체의 양은, 치료해야 할 질환의 종류, 질환의 중증도, 환자의 연령 등에 따라 결정할 수 있지만, 일반적으로는 0.1∼200㎎/㎖, 바람직하게는 1∼120㎎/㎖ 이다.
본 발명의 용액 제제는, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 계면 활성제로서 폴록사머를 첨가함으로써, 항산화제를 첨가하지 않아도 항체 제제의 생물 활성을 높게 유지할 수 있고, 또한 불용성 이물질의 생성을 억제할 수 있다.
본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 자세히 설명하지만, 본 발명의 범위는 이것에 한정되지 않는다. 본 발명의 기재에 기초하여 다양한 변경, 개질이 당업자에게는 가능하고, 이들 변경, 개질도 본 발명에 포함된다.
도 1 은, 여러 계면 활성제를 첨가한 항인간 조직 인자 항체 용액 제제에서의 생물 활성의 경시 변화를 나타내는 도면이다.
도 2 는, 폴록사머 188 또는 폴리소르베이트 80 을 첨가한 항인간 조직 인자 항체 용액 제제의 음이온 교환 크로마토그램이다.
도 3 은, 폴리소르베이트 80 에 의한 항인간 조직 인자 항체의 활성 저하에 대한 L-메티오닌의 첨가 효과와 폴록사머 첨가 효과의 비교를 나타내는 도면이다.
도 4 는, 과립구 콜로니 자극 인자의 산화에 대한 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 또는 폴록사머 188 의 영향을 나타내는 크로마토그램이다.
도 5 는, 부갑상선 호르몬의 산화에 대한 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 또는 폴록사머 188 의 영향을 나타내는 크로마토그램이다.
시료
1. 항체 시료
항인간 조직 인자 항체로서, WO 99/51743 에 기재된 인간화 H 쇄 버전 i 및 인간화 L 쇄 버전 b2 를 조합한 인간화 항인간 조직 인자 항체를 사용하였다. 본 실시예에서 사용한 항인간 조직 인자 항체는, CHO 세포에 의해 생성되는 재조합형 항체이고, IgG4 클래스의 항체이다.
2. 과립구 콜로니 자극 인자 (G- CSF )
과립구 콜로니 자극 인자는, 유전자 공학적 기술에 의해, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 이용하여 유전자 재조합법을 사용하여 생성하고, 추출하여 분리/정제한 것을 사용하였다.
3. 부갑상선 호르몬 ( PTH )
1∼84 잔기를 갖는 부갑상선 호르몬은, WO 9014415 에 기재되는 방법으로써 제조하였다.
시험 방법
(1) TF 중화 활성 시험
조직 인자 (TF) 는, 세포 표면에 발현되는 혈액 응고 제 VII 인자 수용체이고, 혈액 응고 반응이 실질적인 개시 인자로서 위치되어 있다. 조직 인자는 혈액 응고 제 VII 인자와의 복합체 형성을 통하여, 혈액 응고 제 IX 인자 및 X 인자를 활성화시킨다. 따라서, 인간화 항인간 조직 인자 항체의 생물 활성은 하기 방법에 의해, 혈액 응고 제 VIIa 인자 용액 및 혈액 응고 제 X 인자 용액을 사용하여 측정할 수 있다.
1. 이하의 용액을 조제하였다.
1) A.B. (Assay Buffer): 5m㏖/L CaCl2, 0.1% BSA 를 포함하는 TBS (pH7.6).
2) Factor VIIa & Thromborel S 의 혼합 용액: Factor VIIa 는 0.1 PEU/mL, Thromborel S 는 0.42㎎/mL 가 되도록 A.B. 로 희석하였다.
3) Factor X 용액: A.B. 로 Factor X 를 0.25 PEU/mL 로 희석하였다.
4) Testzyme 발색 기질 S-2222 혼합액: 1.5㎎/mL 발색 기질 S-2222 용액 1 에 대하여 물을 1 및 폴리브렌 수용액을 2 의 비율로 혼합하였다.
2. Factor VIIa & Thromborel S 의 혼합 용액을 60μL/웰로 플레이트에 분주하여 실온에서 60 분간 정치하였다.
3. Factor X 용액으로 희석한 항인간 조직 인자 항체 원액 (표준 용액) 및 시료 용액을 40μL/웰로 상기 플레이트에 분주하여 실온에서 30 분간 정치하였다.
4. 0.5㏖/L EDTA 용액을 10μL/웰 부가하여 반응을 멈춘 후, Testzyme 발색 기질 S-2222 혼합액을 50μL/웰로 플레이트에 분주하여 실온에서 30 분간 정치하였 다.
5. 405nm-655nm 의 흡광도를 측정하였다.
6. 검량선 (檢量線) 해석을 행하여, 표준 용액을 100% 로 하였을 때의 피험 시료의 생물 활성을 산출하였다.
약호
TBS: Tris Buffered Saline (트리스 완충 식염수)
BSA: Bovine Serum Albumin (소혈청 알부민)
EDTA: Ethylenediamine Tetraacetic Acid (에틸렌디아민 테트라아세트산)
(2) 이온 교환 크로마토그래피 (IEC)
하기의 조건으로 시험을 행하였다.
칼럼: DEAE-NPR (4.6㎜ I.D.×3.5㎝)
이동상:
A: 50m㏖/L 트리스 완충액, pH 8.0
B: 50m㏖/L 트리스 완충액 + 500m㏖/L NaCl, pH 8.0
구배:
0-5 분 B 액 0%
5-40 분 B 액 0→50%
유속: 1.0mL/분
검출: UV 280nm 흡수
시료 주입량 : 100㎍ 상당량
(3) 불용성 이물질 분석
일본 약방국의 일반 시험법, 주사제의 불용성 이물질 검사법에서 정하는 바와 같이, 용기에 넣은 용액 제제를 백색 광원의 직하, 약 1000lux 의 밝기의 위치에서 육안으로 관찰하였다.
실시예 1: 계면 활성제 첨가의 생물 활성에 대한 효과
여러 계면 활성제를 첨가한 항인간 조직 인자 항체 용액 제제의 생물 활성의 경시 변화를 시험하였다. 2.3㎎/mL 의 항인간 조직 인자 항체를 아세트산 완충액 중에 포함하는 시료 (pH 6.0) 에 계면 활성제로서 폴리소르베이트 20 또는 80 (모두 A 사 제조) 또는 폴록사머 188 (B 사 제조) 을 각각 0.5㎎/mL 첨가하여 5℃ 에서 14 일 및 40℃ 에서 14 일 보존한 후의 생물 활성 (TF-중화 활성) 을 시험하였다. 또한, 계면 활성제 무첨가 군도 동일하게 시험하여 비교하였다. 얻어진 결과를 도 1 에 나타낸다.
폴리소르베이트 80 을 첨가한 제제는 현저하게 항인간 조직 인자 항체의 생물 활성이 저하되었지만, 폴록사머 188 을 첨가한 제제에서는 계면 활성제 무첨가 제제와 동등한 활성을 유지하였다. 당해 분야에서 주사제용 계면 활성제로 알려진 폴리소르베이트 20 을 첨가한 경우에도 활성 저하가 관찰되었다.
실시예 2: 계면 활성제의 생물 활성 및 순도에 대한 효과
항인간 조직 인자 항체 용액 제제의 생물 활성 및 순도로 미치는 계면 활성제의 첨가 효과를 시험하였다. 10mg/mL 의 항인간 조직 인자 항체를 아세트산 완충액 중에 포함하는 시료 (pH 5.5) 에 계면 활성제로서 폴리소르베이트 80 (C 사 제조) 또는 폴록사머 188 (D 사 제조) 을 0.5㎎/mL 첨가하여 25℃ 에서 6 개월 보존하는 가속 시험 후, 생물 활성을 TF-중화 활성 시험에 의해, 그리고 순도를 이온 교환 크로마토그래피 (IEC) 에 의해 시험하였다. 가속 시험을 행하지 않은 항인간 조직 인자 항체 원액 (bulk) 을 동일하게 시험하여 비교하였다. 얻어진 결과를 도 2 에 나타낸다.
항인간 조직 인자 항체 원액의 생물 활성을 100 으로 하였을 때의 폴록사머 188 첨가 제제의 생물 활성은 92% 이고, 폴리소르베이트 80 첨가 제제의 생물 활성은 52% 이었다.
이온 교환 크로마토그래피에서, 폴리소르베이트 80 을 첨가한 항인간 조직 인자 항체 용액 제제에서는 메인 피크가 하강하고, 메인 피크의 직전에 새로운 피크 (도 2 에 화살표로 표시) 가 출현하였다. 이 메인 피크 직전에 출현한 피크 분획은, 일부의 산화된 아미노산 잔기를 함유한 유도체로 인한 것이었다. 그러나 폴록사머 188 을 첨가한 제제는, 항인간 조직 인자 항체 원액에 가까운 크로마토그램을 유지하고 있었다.
상기 결과로부터, 생물 활성 및 순도 양면에서 폴록사머 188 이 폴리소르베이트 80 보다 우수한 것으로명되었다.
실시예 3: 리소르베이트 80 에 의한 항인간 조직 인자 항체의 활성 저하에 대한 L-메티오닌의 첨가 효과, 및 상기 첨가 효과와 폴록사머 첨가 효과의 비교
폴리소르베이트 80 첨가에 의한 항인간 조직 인자 항체 용액 제제의 활성 저하에 대한 L-메티오닌의 첨가 효과를 시험하고, 이것을 폴록사머 188 함유 제제와 비교하였다. 10㎎/mL 의 항인간 조직 인자 항체를 아세트산 완충액 중에 포함하는 시료 (pH 5.5) 에 이하의 물질을 첨가한 시료를 조제하였다:
1) 폴리소르베이트 80 0.5㎎/mL,
2) 폴리소르베이트 80 0.5㎎/mL + L-메티오닌 5㎎/mL, 또는
3) 폴록사머 188 0.5㎎/mL.
각 시료를 25℃ 에서 6 개월 보존하는 가속 시험 후, 생물 활성을 TF-중화 활성에 의해 시험하고, 항인간 조직 인자 항체 원액 (bulk) 의 생물 활성과 비교하였다.
얻어진 결과를 도 3 에 나타낸다. 폴리소르베이트 80 에 의한 활성 저하는 L-메티오닌의 첨가에 의해 억제할 수 있었다. 폴록사머 188 첨가 시료는, 폴리소르베이트 80 및 L-메티오닌 첨가 시료와 동등 또는 그 이상의 생물 활성을 나타내었다.
실시예 4: 계면 활성제의 불용성 이물질에 대한 효과
항인간 조직 인자 항체 용액 제제의 불용성 이물질의 생성에 미치는 계면 활성제의 첨가 효과를 시험하였다. 10mg/mL 의 항인간 조직 인자 항체를 아세트산 완충액 중에 포함하는 시료 (pH 6.0) 에 계면 활성제로서 폴리소르베이트 80 (C 사 제조) 또는 폴록사머 188 (D 사 제조) 을 각각 0.5㎎/mL 첨가한 것에 대하여, 조제 직후 및 5℃ 에서 24 개월 보존한 후의 불용성 이물질을 시험하였다. 계면 활성제 무첨가 군도 동일하게 시험하여 비교하였다. 얻어진 결과를 표 1 에 나타낸다. 시료 5 바이알 중, 불용성 이물질이 확인된 바이알의 개수를 나타내 었다. 계면 활성제 무첨가 샘플에서는 제조 직후부터 불용물이 육안으로 확인되었다. 그러나, 폴록사머 188 및 폴리소르베이트 80 함유 샘플에서는 모두 불용성 이물질의 생성은 관찰되지 않았다.
계면 활성제 없음 폴록사머 188 폴리소르베이트 80
초기 5/5 0/5 0/5
5℃-24M 5/5 0/5 0/5
(4) 폴록사머에 의한 단백질의 안정화 실험
상기 기술한 과립구 콜로니 자극 인자 용액 제제 및 부갑상선 호르몬 용액 제제에, 여러 계면 활성제를 첨가하여, 과립구 콜로니 자극 인자 및 부갑상선 호르몬의 산화에 대한 이의 효과를 검증하였다.
실시예 5: 계면 활성제의 과립구 콜로니 자극 인자의 산화에 대한 영향
과립구 콜로니 자극 인자 용액 제제에 대하여 계면 활성제가 어떠한 영향을 미치는지를 시험하였다. 0.25㎎/mL 의 콜로니 자극 인자를 인산 완충액 중에 포함하는 시료 (pH 6.5) 에 계면 활성제로서 폴리소르베이트 80 (A 사 제조), 폴리소르베이트 20 (A 사 제조) 또는 폴록사머 188 (B 사 제조) 을 0.05% 첨가하여, 25 ℃ 에서 5 주간 보존하는 가속 시험 후, 과립구 콜로니 자극 인자의 산화 유도체의 양을 역상 크로마토그래피 (RPC) 에 의해 측정하였다.
하기의 조건으로 시험을 하였다.
칼럼: DAISOPAK SP-300-5-C4-P (4.6㎜ I.D.×25㎝)
이동상:
A 아세토니트릴:물:트리플루오로아세트산=400:600:1
B 아세토니트릴:물:트리플루오로아세트산=800:200:1
구배:
0-25 분 B 액 20→90%
25-40 분 B 액 90→90%
40-41 분 B 액 90→20%
41-60 분 B 액 20%
유속: 0.3mL/분
주입량: 10μL
칼럼 온도: 35℃
검출 파장: UV 215nm 흡수
얻어진 결과를 도 4 에 나타낸다.
역상 크로마토그래피로부터 알 수 있는 바와 같이, 각종 계면 활성제를 첨가한 과립구 콜로니 자극 인자 용액 제제의 메인 피크 직전에, 산화 유도체 (도 4 에 화살표로 표시) 가 출현하였다. 이들 피크 분획은, 일부 산화 아미노산 잔기를 함유한 과립구 콜로니 자극 인자의 유도체로 인한 것이었다.
산화 유도체의 양은, 폴리소르베이트 20 을 첨가한 시료가 가장 많고, 이어서 폴리소르베이트 80, 폴록사머 188 의 순이었다.
실시예 6: 계면 활성제의 부갑상선 호르몬의 산화에 대한 영향
부갑상선 호르몬 용액 제제에 대하여 계면 활성제가 어떠한 영향을 미치는지를 시험하였다. 0.25㎎/mL 의 부갑상선 호르몬을 시트르산 완충액 중에 포함하는 시료 (pH 5.0) 에 계면 활성제로서 폴리소르베이트 80 (A 사 제조), 폴리소르베이트 20 (A 사 제조) 또는 폴록사머 188 (B 사 제조) 을 0.05% 첨가하여, 40℃ 에서 2 주간 보존하는 가속 시험 후, 부갑상선 호르몬의 산화 유도체의 양을 역상 크로마토그래피 (RPC) 에 의해 측정하였다.
하기의 조건으로 시험을 하였다.
칼럼: YMC-Pack ODS A-312 (4.6㎜ I.D.×15㎝)
이동상:
A 아세토니트릴:물:트리플루오로아세트산=0:1000:1
B 아세토니트릴:물:트리플루오로아세트산=600:400:1
구배:
0-40 분 B 액 40→60%
40-42 분 B 액 60→60%
42-42.5 분 B 액 60→40%
42.5-60 분 B 액 40%
유속: 1.0mL/분
주입량: 10μL
칼럼 온도: 25℃
검출 파장: UV 215nm 흡수
얻어진 결과를 도 5 에 나타낸다.
역상 크로마토그래피로부터 알 수 있는 바와 같이, 각종 계면 활성제를 첨가한 부갑상선 호르몬 용액 제제의 메인 피크 직전에, 산화 유도체 (도 5 에 화살표로 표시) 가 출현하였다. 이들 피크 분획은 산화 아미노산 잔기를 함유한 부갑상선 호르몬의 유도체로 인한 것이었다.
산화 유도체의 양은, 폴리소르베이트 20 을 첨가한 시료가 가장 많고, 이어서 폴리소르베이트 80, 폴록사머 188 의 순이었다.
상기의 결과로부터, 단백질 용액 제제의 산화를 억제하는 효과는, 폴록사머 188 이 폴리소르베이트류보다도 우수함이 판명되었다.
본 발명의 단백질 함유 안정화 제제는, 장기 보존 후에도 생물 활성의 저하가 없고, 불용성 이물질의 생성도 없다. 또한 단백질의 산화 유도체 생성률이 효과적으로 억제된 안정적인 제제이다.

Claims (13)

  1. 계면 활성제로서 폴록사머를 포함하고, 첨가제로서 항산화제를 포함하지 않는 주사용 단백질 함유 용액 제제.
  2. 제 1 항에 있어서, 폴록사머가 폴록사머 188 인 단백질 함유 용액 제제
  3. 삭제
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단백질이 면역글로불린인 단백질 함유 용액 제제.
  5. 제 4 항에 있어서, 면역글로불린이 인간화 항체인 단백질 함유 용액 제제.
  6. 제 4 항에 있어서, 면역글로불린이 항조직 인자 항체인 단백질 함유 용액 제제.
  7. 제 6 항에 있어서, 항조직 인자 항체가 인간화 항조직 인자 항체인 단백질 함유 용액 제제.
  8. 삭제
  9. 계면 활성제로서 폴록사머를 첨가함으로써, 항산화제를 첨가하지 않고 주사용 단백질 함유 용액 제제 중의 생물 활성을 유지하고, 또한 불용성 이물질의 생성을 억제하는 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단백질이 과립구 콜로니 자극 인자인 단백질 함유 용액 제제.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단백질이 부갑상선 호르몬인 단백질 함유 용액 제제.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단백질이 조혈 인자, 부갑상선 호르몬 또는 항체인 단백질 함유 용액 제제.
  13. 제 9 항에 있어서, 단백질이 조혈 인자, 부갑상선 호르몬 또는 항체인 방법.
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KR20000053328A (ko) * 1996-11-19 2000-08-25 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 단클론성 또는 다클론성 항체의 안정한 동결건조 제약학적 물질

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