KR101072447B1 - 녹차로부터 카테친의 추출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹차로부터 카테친의 추출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 녹차를 물 또는 저급 알콜 수용액에 침지하여 녹차 추출물을 추출하는 단계, 상기 녹차 추출물의 추출 잔사를 제거한 여과액을 농축하여 알콜을 제거한 후 동량의 에칠아세테이트를 부여하여 혼합한 후 정치시켜 추출 수용매층과 에칠아세테이트층으로 분배시키는 단계, 상기 에칠아세테이트층을 감압농축하고 물을 가하여 농축물을 용해시킨 다음 물과 동량의 디클로로메탄을 부여하여 혼합한 후 정치시켜 물층과 디클로로메탄층으로 분배시키는 단계, 및, 상기 물층으로부터 카테친을 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 카테친의 추출방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 카페인 제거와 카테친 추출이 고효율로 이루어지며, 공정에 소요되는 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있고, 작업환경의 개선이 가능한 효과를 기대할 수 있다.

Description

녹차로부터 카테친의 추출방법{Extraction method of catechin from green tea leaves}

본 발명은 녹차로부터 다양한 카테친을 고효율로 추출하는 방법에 관한 것이다.

수천년 전부터 음용되어온 녹차는 카페인, 테아닌, 아미노산 등 기능성 물질을 함유하고 있어 혈액순환, 항암, 항산화, 노화억제, 항당뇨, 항균, 인체 독성 제거 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 최근 건강음료 식품으로 많은 주목을 받고 있는 물질로서 다당류, 플라보노이드(flavonoids), 비타민 B 복합체, 비타민 C, 비타민 E, 가바(GABA)와 불화물(fluoride)과 같은 다양한 유용성분을 포함하고 있다.

특히 녹차에 포함된 카테친 화합물은 강력한 항산화 및 항암 효과를 가지고 있고, 그에 대한 연구자료가 많이 보고되고 있다.

녹차에 포함된 대표적인 카테친 화합물은 에피갈로카테친(epigallocatechin, EGC), 에피카테친(epicatechin, EC), 에피갈로카테친 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG)와 에피카테친 갈레이트(epicathchin gallate, ECG) 등이 있다. 이들은 항산화 및 항암효과 이외에 면역체계 강화, 항혈전 효과, 피부암 예방, 심장병 예방과 콜레스테롤 예방 등의 효과를 가지고 있음이 알려져 있다.

따라서 현재까지 녹차로부터 기능성 물질을 추출하기 위한 기술은 크게 녹차로부터 카테친을 추출하는 기술이 대표적이며, 특히 카테친 화합물 중에 EGCG는 생리활성이 높고, 항산화활성이 높은 것으로 알려져 있는데, 식품을 비롯하여 일반 화장품의 항산화제로 많이 쓰이고 있는 비타민 C 보다는 20배, 비타민 E 보다는 30배, BHA나 BHT 보다는 2 내지 4 배의 강한 항산화 효과를 가지고 있음이 알려지면서 그 활용도가 더욱 높아지고 있다.

즉, 항산화제는 반응성이 높은 성분으로 잘 알려진 자유 라디칼이 DNA나 다른 생체 세포와 반응하기 전에 자유 라디칼을 흡수하여 세포를 보호한다. 그러므로 항산화제는 피부 변형속도를 감소시키는 효과를 가져온다. 따라서 화장품 관련 산업에서 카테친 화합물의 항산화 효과가 상당한 주목을 받고 있다.

따라서, 상기 에피갈로카테친 갈레이트를 추출하기 위한 방법이 주로 제시되어 왔다.

상기한 방법으로는 대한민국 공개특허 제2000-0046079호에는 폴리페놀 함량이 높은 녹차 추출물의 제조방법이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제2001-0035410호에는 카테친류의 신규한 추출방법 및 이를 이용한 음료가 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2006-0058356호에는 에피갈로카테친 갈레이트의 분리정제방법이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제2001-0050080호에는 에피갈로카테친 갈레이트의 제조방법이 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제418605호에는 녹차 추출물 유래의 고순도 EGCG 추출 방법이 개시되어 있다.

이와는 다르게 녹차 분말을 2% 인산 수용액과 혼합하고 이를 동량의 에탄올에 침지하여 추출한 후 이를 30 ℃조건에서 인큐베이션하여 항알러지 효과가 있음이 알려진 EGCG"3Me를 추출하는 방법이 일본의 차연보(차연보 94: 60 ~ 64, 2002)에 게재되기도 하였다.

한편, 카테친류의 상기와 같은 우수한 생리효과를 발현시키기 위해서는, 보다 간편하게 다량의 카테친류를 섭취할 수 있도록 하는 것이 중요하다. 그러나, 녹차 잎 속에는 카테친류가 약 15% 함유되어 있지만 카페인 성분도 통상 2∼4% 함유되어 있으며, 이 카페인은 중추신경 흥분 작용을 나타내기 때문에 수면 억제에 사용되고 있는 반면, 과잉 섭취에 의한 신경과민, 구역질, 불면 등의 유해작용을 일으키는 원인도 된다고 알려져 있다. 이 때문에, 함유 조성물에서 카페인만을 선택적으로 제거하는 방법이 검토되어 왔다.

구체적으로, 일본 공개특허공보 소53-18772호는 커피의 탈카페인 방법으로서 120∼250기압 하에서 커피를 활성탄 등의 카페인 흡착제와 접촉시키는 방법을 개시하고 있고, 일본 공개특허공보 평6-142405호는 카페인을 함유하는 수용액을 활성백토 또는 산성백토와 접촉시켜 선택적으로 카페인을 제거하는 방법을 개시하고 있으나, 전자의 경우 초임계 추출 기술로서 설비의 과부하와 유효성분인 카테친류 조성도 변화시키는 문제가 있고, 후자의 경우 선택적으로 카페인 제거는 가능하나 색상이 악화되는 경우가 있는 등의 문제가 있다.

또한, 녹차로부터 카테친 화합물을 추출하기 위한 방법으로 용매추출법, 초임계 유체를 이용한 추출법 등이 적용되고 있으며, 초임계 유체를 이용한 추출법의 경우 물이나 에탄올에 비해 카테친의 회수율이 낮은 것으로 알려져 있어 대부분의 기술은 용매를 이용한 추출법이 주로 적용되어 왔다.

상기와는 달리 대한민국 등록특허 제859579호에는 클로로포름을 사용하여 카페인을 미리 제거한 후 에칠아세테이트를 사용하여 카테친을 회수하는 방법을 제시하고 있으나, 상기한 방법의 경우 먼저 수행되는 클로로포름층을 분리하기 위하여 장시간이 소요되며, 클로로포름층 분리시 다량의 카테친도 같이 제거되는 점과, 클로로포름에 의한 카테친의 손실을 줄이기 위해 클로로포름 분리의 횟수를 줄이면 카페인이 완전히 제거되지 않는 점 및 발암물질로 분류되는 독성이 강한 클로로포름을 장기간 사용하여야 하는 점 등의 문제점이 지적된다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 녹차로부터 먼저 카테친을 충분히 회수한 후 이때 같이 추출된 카페인을 다시 제거함으로써, 녹차로부터 카페인 제거효율이 높으면서 카테친은 고수율로 추출할 수 있는 새로운 추출방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명의 녹차 카테친 추출방법은, 녹차를 물 또는 탄소수 1 내지 5의 저급 알콜 수용액에 침지하여 녹차 추출물을 추출하는 단계, 상기 녹차 추출물의 추출 잔사를 제거한 여과액에 동량의 에칠아세테이트를 부여하여 혼합한 후 정치시켜 추출 수용매층과 에칠아세테이트층으로 분배시키는 단계, 상기 에칠아세테이트층을 감압농축하고 물을 가하여 농축물을 용해시킨 다음 물과 동량의 디클로로메탄을 부여하여 혼합한 후 정치시켜 물층과 디클로로메탄층으로 분배시키는 단계, 및 상기 물층으로부터 개별 카테친을 순수 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명의 녹차 카테친 추출방법을 각 단계별로 구체적으로 설명한다.

본 명세서에서, "녹차"는 시중에 판매되는 가루녹차, 티백 녹차, 잎 녹차, 수확되어 건조된 녹차 잎을 포함하는 의미이고, "카테친"은 현재까지 녹차의 카테친 성분으로 알려진 카테친(catechin; C), 갈로카테친(gallocatechin: GC), 에피카테친(epicatechin: EC), 에피카테친 갈레이트(epicatechin gallate: ECG), 에피갈로카테친(epigallocatechin: EGC), 및 에피갈로카테친 갈레이트(epigalocatechin gallate; EGCG)를 포함하는 주요 카테친과, 소량 존재하는 갈릭산(gallic acid), 갈로카테친 갈레이트(gallocatechin gallate: GCG) 및 메칠화에피갈로카테친갈레이트(epigalocatechin gallate-3Me)를 포함하는 의미이며, “%”는 별도의 단서가 없는 한 “중량%”의 의미이다.

먼저, 녹차 추출물을 추출하는 단계이다.

녹차를 물 또는 탄소수 1 내지 5의 저급 알콜 수용액에 침지하여 녹차 추출물을 추출하는데, 바람직하기로는 에탄올 수용액을 사용하는 것이 카테친을 높은 수율로 얻기에 좋다. 알콜 수용액의 경우 알콜 함량이 30 내지 50 % 범위로 하는 것이 높은 카테친 회수에 바람직하며, 알콜 함량이 40%인 경우 더욱 바람직하다.

상기 녹차 추출물을 얻기 위하여 물 또는 저급 알콜 수용액에 침지한 후 상온에서 2 시간 내지 6 시간 동안 교반 추출할 경우 카테친의 회수에 바람직하며, 상온에서 2시간동안 추출할 경우 더욱 바람직한 것으로 확인되었다.

상기 추출은 초음파 추출, 환류 추출 등의 다양한 방법을 적용할 수 있는데, 초음파 추출을 적용할 경우에는 25 내지 45 ℃로 조절한 조건에서 30 분 내지 2 시간 동안 수행할 경우 카테친 회수에 바람직하며, 40 ℃로 조절한 조건에서 2 시간동안 초음파 추출을 수행할 경우 카테친 회수에 더욱 바람직하다. 환류 추출을 적용할 경우에는 60 내지 80 ℃로 조절한 조건에서 30분 내지 1 시간 동안 수행할 경우 카테친 회수에 바람직하며, 80 ℃로 조절한 조건에서 1 시간동안 수행할 경우 더욱 바람직하며, 추출시간이 너무 길어지면 일부 카테친의 구조적 파괴가 수반되므로 바람직하지 못하다.

두 번째로, 에칠아세테이트 분배 단계이다.

상기 녹차 추출물의 추출 잔사를 제거한 여과액을 농축하여 에탄올 성분만을 증발시키고 얻어진 수용매의 농축물에 동량의 에칠아세테이트를 부여하여 혼합한 후 정치시켜 추출 수용매층과 에칠아세테이트층으로 분배시킨다.

상기 단계에서 충분히 녹차를 침지 및 추출하여 추출물을 얻은 후 이를 여과하여 잔사를 제거한 여과액을 농축하여 에탄올 성분만을 증발시키고 얻어진 수용매의 농축물인 녹차 추출물을 얻는다. 이하, “녹차 추출물”은 이와 같이 에탄올 성분만을 증발시키고 얻어진 수용매 상태의 농축물을 의미하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

상기 녹차 추출물에는 카테친 외에도 카페인, 클로로필, 녹차 단백질, 지방 등의 불순물이 함유되어 있으므로 이로부터 카테친을 분리하기 위해 카페인을 위시한 불순물을 제거하기 위하여 분배시킨다.

기존의 경우, 녹차 추출물로부터 직접 카페인을 먼저 제거한 후 카테친을 추출하였다. 이를 위하여 카페인 등을 용해시킬 수 있는 클로로포름 등을 먼저 녹차 추출물과 혼합하여 사용하였다.

이때 사용되는 클로로포름은 카페인 외에도 일부 카테친을 용해시켜 추출하므로 전체적으로 카테친의 회수량이 적어지게 되는 이유가 된다. 또한 녹차 추출물로부터 분배시킨 클로로포름층은 녹차 단백질 및 지방 등 점질물을 구성하는 다량의 불순물을 포함하고 있으므로 추출물층(물층)과의 분리가 쉽게 이루어지지 않아 완전한 층분리에 24 시간 이상의 장시간이 소요되며, 클로로포름 자체가 가지는 독성으로 인해 작업환경이 바람직하지 않아지는 문제가 있다.

본 발명의 경우, 기존과 달리 녹차 추출물로부터 카테친을 먼저 완전히 추출한다. 이를 위하여 에칠아세테이트를 사용하여 분배시키는 단계가 선행하게 되는 것이다.

에칠아세테이트 분배가 이루어지면 에칠아세테이트 분획 중에 카테친을 포함하여 일부 카페인이 함께 추출된다. 녹차 추출물로부터 에칠아세테이트 분배가 선행하는 경우에는 층분리가 쉽게 일어나게 되는데, 상온에서 정치 10 분경이면 추출 수용매층과 에칠아세테이트 분획층이 완전하게 분리된다. 카테친을 먼저 완전히 추출하기 위해 에칠아세테이트 분배를 3회 수행하는 경우 녹차 추출물 원액 대비 추출된 카페인이 약 76%로서 제거된 카페인의 양은 약 24 %로 나타나며, 각 카테친의 회수율은 EGC+C(에피갈로카테친(EGC)와 카테친(C))의 경우 71%가 회수되며, EGC+C를 제외한 대부분의 EGCG, ECG, EC 등은 약 99 % 이상으로 거의 녹차 추출물 원액 대비 전량의 카테친이 회수되는 것으로 확인되었다.

세 번째로, 디클로로메탄 분배 단계이다.

상기 에칠아세테이트층을 감압농축하고 물을 가하여 농축물을 용해시킨 다음 물과 동량의 디클로로메탄을 부여하여 혼합한 후 정치시켜 물층과 디클로로메탄층으로 분배시키는 단계이다.

상기 에칠아세테이트층에는 녹차 추출물 원액 대비 거의 전량의 카테친과 카페인이 녹차 추출물 원액대비 약 76 %가 포함되어 있다. 여기에서 카페인만을 추출 제거하기 위하여 본 발명에서는 에칠아세테이트 분획 농축물에 물을 가하여 희석한 후 디클로로메탄을 부여한다. 디클로로메탄 분배가 이루어진 후 층분리된 디클로로메탄층을 제거한 후 남은 물층에는 녹차 추출물 원액 대비 카페인 함량이 약 3.8 %인 것으로 확인되었는데, 녹차 추출물로부터 에칠아세테이트 분배시 에칠아세테이트의 극성에 의하여 추출 수용매층에 잔존하여 제거된 카페인 약 24 %와 함께, 층분리가 된 디클로로메탄층을 제거함으로서 제거된 카페인이 71.9%, 결국 총 제거된 카페인의 함량은 약 96.2 % 이상으로 나타나는 것을 확인할 수 있다.

즉, 에칠아세테이트로 먼저 카테친을 거의 전량 회수하고, 카테친과 함께 에칠아세테이트층에 추출되어진 카페인을 디클로로메탄으로 제거할 경우에는 카테친의 손실을 최소화하면서 고효율로 카페인만의 제거가 가능하다.

마지막으로, 카테친을 분리하는 단계이다.

상기 녹차 추출물로부터 에칠아세테이트 분배를 거치고, 이의 농축물을 증류수로 희석한 후 디클로로메탄 분배를 수행하고 남은 물층에서 카테친을 분리한다.

카테친의 분리는 오픈컬럼크로마토그라피(open column chromatography), 고속액체크로마토그라피(High performance liquid chromatography), 분취-고속액체크로마토그라피(preparative-high performance liquid chromatography), 향류분배크로마토그라피(counter current chromatography) 및 박층크로마토그라피(thin layer chromatography) 중에서 선택된 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 이외에 새로이 개발되거나 앞으로 개발될 분리방법이 적용되어도 무방하며, 이들의 방법은 당업자의 선택에 의하는 것이므로 이들의 한정으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

상기한 본 발명에 의하면, 먼저 카테친을 전량 회수하고 이때 같이 추출되어 오는 카페인을 다시 제거하는 방법을 선택함으로써 카페인 제거율과 카테친의 회수율을 모두 극히 높일 수 있는 효과를 얻을 수 있다.

또한 본 발명에 의하면, 기존의 EGCG, EC, ECG, EGC 및 C 등의 알려진 주요 카테친 외에 소량 존재하는 갈릭산(gallic acid), 갈로카테친 갈레이트(gallocatechin gallate: GCG) 및 메칠화에피갈로카테친 갈레이트(epigalocatechin gallate-3Me)도 고효율로 회수할 수 있는 효과를 얻을 수 있을 것이다.

또한 본 발명에 의하면, 녹차 추출물 원액으로부터 카테친 또는 카페인 추출시 소요되는 시간을 대폭 축소할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.

또한 본 발명에 의하면, 기존의 카페인 제거를 위하여 사용하던 클로로포름보다 낮은 독성을 가지는 디클로로메탄을 사용함으로써 작업환경을 개선할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 분획 시작전 녹차 추출물 원액의 HPLC 크로마토그램을 나타내는 것이다.
도 2는 비교예에 의하여 녹차 추출물 중 먼저 카페인을 제거하기 위해 클로로포름 분획을 순차적으로 실시할 때에 얻어진 카페인 제거효율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 비교예에 의하여 녹차 추출물로부터 먼저 카페인을 제거하기 위해 3회의 클로로포름 분획 후 추출 수용매층에 잔존하고 있는 카테친 함량을 녹차 추출물 원액에 대비하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 비교예에 의하여 얻어진 녹차 추출물로부터 먼저 카페인을 제거한 후 에칠아세테이트를 이용하여 카테친을 회수하였을 때 분획 횟수별 카테친 회수율을 클로로포름으로 분획한 수용매층 대비 및 녹차 추출물 원액 대비로 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 비교예에 의하여 녹차 추출물의 클로로포름 분획과 이의 에칠아세테이트 분획에서 회수된 총 카테친 함량을 클로로포름으로 분획한 수용매층 대비 및 녹차 추출물 원액 대비로 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 녹차 추출물에서 카페인을 먼저 제거하기 위해 클로로포름 또는 디클로로메탄을 첨가하여 혼합 후 정치 12 시간에 나타나는 층분리 양상이다[우측 분액여두가 클로로포름을 사용한 사례이고, 좌측 분액여두가 디클로로메탄을 사용한 사례이다].
도 7은 실시예에 의하여 녹차 추출물에서 카테친을 먼저 회수하기 위해 에칠아세테이트 분획을 횟수별로 실시하였을 때 회수된 카테친 및 카페인의 함량을 녹차 추출물 원액 대비로 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예에서 에칠아세테이트층 분리에 의해 회수된 카테친 및 카페인 혼합 용출물의 농축상태를 보여주는 사진이다.
도 9는 실시예에 따라 에칠아세테이트 분획에서 카페인만의 제거를 위해 디클로로메탄으로 분획한 용액을 농축건조하여 제거된 카페인의 농축 상태를 보여주는 사진이다.
도 10은 도 9의 디클로로메탄으로 분획한 용액의 농축물을 확대한 사진으로 바닥면에 제거된 흰색분말상의 카페인이 응고된 상태를 보여주는 사진이다.
도 11은 실시예에서 에칠아세테이트 분획과 디클로로메탄 층을 분리한 후의 녹차 추출물 원액대비 제거된 총 카페인의 함량을 디클로로메탄 분획 횟수별로 나타낸 그래프이다.
도 12는 실시예에서 녹차 추출물 원액 대비 카테친의 회수를 위한 에칠아세테이트 분획 직후와 다시 디클로로메탄으로 카페인을 제거한 후의 카테친 회수율을 나타낸 그래프이다.
도 13은 비교예와 실시예의 녹차 추출물 원액대비 최종 녹차 카페인의 제거효율 및 카테친의 분리 효율을 비교한 그래프이다.
도 14는 녹차 추출물 원액에 클로로포름 또는 에칠아세테이트를 사용하였을때 층분리가 되는 양상을 나타낸 사진으로, 좌측은 녹차 추출물 원액에 카페인을 먼저 제거하기 위해 클로로포름을 가하여 1차 분리 시작 후 24 시간 경과시 사진이고, 우측은 녹차 추출물 원액에 카테친을 먼저 회수하기 위해 에칠아세테이트를 가하여 1차 분리 시작 후 10 분 경과시 사진이다.
도 15는 도 14의 좌측 분액여두에서 하층의 클로로포름층을 회수하여 재 촬영한 사진으로 다량의 백색 점질성 물질이 존재하여 분리가 잘 이루어지지 않은 원인물질을 확대 재촬영한 사진이다.
도 16은 녹차 추출물 원액으로부터 비교예와 실시예에 의하여 분리 정제된 녹차 카테친의 크로마토그램을 나타낸 것으로, 적색선은 실시예이고, 청색선은 비교예를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예 등에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 등에 의하여 한정되는 것은 아니다.

참고예 . 시약 및 기기

다음 실험예, 실시예 및 비교예 등에서 사용한 시약과 기기 및 HPLC 분석조건은 다음과 같다.

먼저, 추출을 위해 사용된 증류수는 초순수 제조기(Milli-Q system, USA)에서 비저항값이 18 MΩ 이상으로 제조된 초순수 증류수(pH 6.7)를 사용하였고, 추출용 에탄올(ethanol)은 국산 GR 등급을, 분석 및 분취용 HPLC의 이동상 용매로 사용된 메탄올(methanol)은 Merck Inc. (USA)의 HPLC 등급을 구입하여 사용하였다.

고순도 분리 및 정성분석에 사용된 Preparative-HPLC 및 Analytical-HPLC는 Agillent 1200 series (Agillent, Wilmington, DE, USA)를 사용하였다. 분석용 HPLC 컬럼은 YMC 사의 ODS AM 303 컬럼(4.6 × 250 mm)을 사용하였고, 분석파장 280 nm, 분당 유속 1mL, 분석 용매로 A용매는 증류수, B용매는 메탄올 (0분 : 20% B, 35분 : 35% B, 36분 : 20% B, 46분 : 20% B)을 사용하였고, 시료 주입량은 20㎕로 조절하여 분석을 실시하였다.

또한 최종 카페인이 거의 전량 제거되고 회수된 카테친 함유 용액은 Preparative-HPLC를 이용하여 각각의 개별 카테친으로 순수 분리될 수 있는데, 이때 분리에 사용된 preprative-HPLC 칼럼은 HiQ sil C18-10 (21.0 × 250 mm, KYA TECH, Japan)을 이용하였고, 분석파장 280 nm, 분당 유속 10 mL, 분석 용매로 A용매는 증류수, B용매는 메탄올 (0분 : 20% B, 35분 : 35% B, 36분 : 20% B, 46분 : 20% B)을 사용하였고, 시료 주입량은 2 mL로 조절하여 개별 카테친 성분을 고순도로 분리할 수 있다.

실험예 1. 추출용매 선정 시험

아모레퍼시픽 그룹 (주) 장원으로부터 분양받은 재래종 녹차의 건조 잎을 사용하였다.

녹차 분말 0.1g에 증류수, 에탄올 함량이 10 내지 80%로 조절된 에탄올 수용액을 이용하여 상온 조건에서 12 시간동안 교반 추출을 이용하여 카테친을 최대로 추출할 수 있는 최적의 추출용매를 선정하기 위하여 실험한 결과 40% 에탄올 수용액이 가장 높은 추출율을 나타내는 것을 확인하였다. 각 실험은 3 반복으로 수행되었으며, 성분별 함량은 1g 당 mg으로 환산하여 다음 표 1에 나타내었다.

추출 용매	반복	카페인*	카테친*(mg/g)
			EGC+C	EGCG	EC	ECG	카테친 합계
H2O	1	18.00	9.18	16.07	7.67	1.78	34.70
	2	18.62	9.20	20.98	7.52	2.32	40.02
	3	17.97	8.88	18.45	7.48	2.07	36.88
	평균	18.20	9.09	18.50	7.56	2.06	37.20
10%EtOH	4	18.54	9.02	37.58	7.85	4.62	59.07
	5	18.65	8.98	37.27	7.77	4.97	58.98
	6	18.31	9.05	37.41	7.82	4.96	59.24
	평균	18.50	9.02	37.42	7.82	4.85	59.10
20%EtOH	7	18.81	9.02	51.19	7.79	7.21	75.21
	8	19.08	9.19	51.92	7.97	7.33	76.41
	9	18.56	9.01	50.11	7.78	7.06	73.96
	평균	18.82	9.07	51.07	7.84	7.20	75.19
30%EtOH	10	18.58	9.49	58.25	8.18	8.42	84.33
	11	19.09	9.64	60.30	8.26	8.72	86.92
	12	18.22	9.48	57.20	8.23	8.25	83.16
	평균	18.63	9.54	58.58	8.22	8.46	84.80
40%EtOH	13	18.76	9.84	62.14	8.09	9.04	88.12
	14	19.03	9.57	63.29	8.20	9.23	90.29
	15	18.27	8.74	59.34	7.96	8.59	84.63
	평균	18.69	9.05	61.59	8.08	8.96	87.68
50%EtOH	16	18.63	7.30	59.48	7.61	9.02	83.41
	17	18.41	7.08	58.86	8.04	8.79	82.76
	18	18.62	7.16	60.19	7.81	8.93	84.09
	평균	18.55	7.18	59.51	7.82	8.91	83.42
60%EtOH	19	18.79	3.82	50.22	6.97	9.07	70.08
	20	19.02	3.98	49.75	6.76	9.18	69.57
	21	18.70	3.93	49.41	7.38	9.06	69.68
	평균	18.84	3.85	49.79	7.04	9.10	69.78
80%EtOH	22	17.60	3.44	32.71	3.25	7.64	47.03
	23	18.17	3.05	35.64	2.92	7.73	49.35
	24	17.67	3.38	35.29	3.12	7.49	49.28
	평균	17.81	3.29	34.54	3.10	7.62	48.55
* 1g으로 환산한 함량

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 30 내지 50 % 에탄올 수용액을 사용하였을 경우 높은 함량의 총 카테친을 얻을 수 있으며, 40% 에탄올 수용액을 추출용매로 사용하였을 경우 얻어진 총 카테친 함량이 가장 높은 것을 확인할 수 있다.

실험예 2. 추출방법 실험

아모레퍼시픽 그룹 (주) 장원으로부터 분양받은 재래종 녹차의 건조 잎을 사용하였다.

녹차 분말 0.1g에 상기 실험예 1의 추출용매 선정시험에서 카테친을 가장 많이 추출할 수 있는 용매로 선정된 40% 에탄올 수용액을 이용하여 추출시간, 추출방법 등을 달리하였을 때 최적의 추출방법 및 시간을 결정한 결과 각 추출방법에서 가장 우수하였던 추출시간별로 비교한 결과를 다음 표 2 내지 5에 나타내었다.

처리별	카페인*	카테친*(mg/g)
		EGC+C	EGCG	EC	ECG	카테친 합계
상온 30분	18.77	8.72	59.18	7.85	8.84	84.59
상온 1시간	18.70	9.12	60.61	7.90	8.95	86.58
상온 2시간	19.12	9.16	63.51	8.20	9.58	90.46
상온 3시간	19.00	9.03	61.79	8.37	9.85	89.03
상온 6시간	19.24	9.00	62.51	8.12	9.78	89.41
상온 12시간	19.25	8.91	61.48	7.86	9.50	87.74
상온 24시간	19.48	8.66	60.14	7.80	9.18	85.78
* 1g으로 환산한 함량

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 상온에서 2 내지 6 시간의 경우 카테친 수득율이 높은 것을 확인할 수 있으며, 상온에서 2시간 추출할 경우 가장 높은 카테친 수득율을 보임을 확인할 수 있다.

처리별 (40℃)	카페인*	카테친*(mg/g)
		EGC+C	EGCG	EC	ECG	카테친 합계
초음파 30분	19.73	9.24	63.36	8.07	9.51	90.19
초음파 1시간	19.92	9.26	62.25	8.17	9.53	89.21
초음파 2 시간	20.15	9.48	65.22	8.18	9.73	92.60
초음파 3 시간	19.66	8.64	59.73	7.86	9.19	85.43
* 1g으로 환산한 함량

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 초음파 추출 30 분 내지 2 시간의 경우 카테친 수득율이 우수함을 확인할 수 있으며, 초음파 추출 2 시간의 경우 가장 우수한 카테친 수득율을 보임을 확인할 수 있다.

처리별 (80℃)	카페인*	카테친*(mg/g)
		EGC+C	EGCG	EC	ECG	카테친 합계
환류 30분	18.43	8.46	53.46	7.04	8.03	77.00
환류 1시간	18.14	8.07	52.06	7.07	8.05	75.24
환류 2시간	18.32	8.22	49.96	6.87	7.82	72.87
환류 3시간	18.84	8.89	51.80	7.19	8.23	76.11
* 1g으로 환산한 함량

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 환류 추출법을 적용할 경우 80 ℃에서 30 분 내지 1 시간의 경우 높은 카테친 수득율을 보임을 확인할 수 있으며, 환류 30 분의 경우 카테친 수득율이 가장 우수함을 확인할 수 있다.

처리별 우수	카페인*	카테친*(mg/g)
		EGC+C	EGCG	EC	ECG	카테친 합계
상온 2시간	19.12	9.16	63.51	8.20	9.58	90.46
초음파 2시간	20.15	9.48	65.22	8.18	9.73	92.60
환류 30분	18.43	8.46	53.46	7.04	8.03	77.00
* 1g으로 환산한 함량

상기 표 2 내지 4의 결과를 표 5로 정리하였으며, 그 결과, 40% 에탄올 수용액을 이용하고, 40 ℃ 조건의 초음파 추출을 2시간 수행하는 것이 카테친 합계 면에서 가장 카테친 성분을 잘 추출해 내는 것으로 확인되었다.

실험예 3. 녹차 추출물의 제조

아모레퍼시픽 그룹 (주) 장원으로부터 분양받은 재래종 녹차의 건조 잎을 사용하였다. 녹차 분말 10g과 40% 에탄올 수용액 1,000 ml를 혼합하여 40 ℃ 조건의 초음파세척기에서 2시간 동안 추출하고, 1차 여과 후 40 ℃ 조건의 감압농축기에서 에탄올과 일부 물을 증발시킨 후 다시 증류수에 희석하여 최종 부피가 200 ml로 조정된 녹차 추출물을 얻은 다음 카테친 분리, 정제 실험을 수행시 사용하였다.

상기 분획을 수행하지 않은 녹차 추출물 원액을 HPLC로 분석하여 보면, 다양한 종류의 카테친과 카페인 및 불순물이 공존함을 확인할 수 있다[도 1 참고].

비교예 . 녹차 카테친 추출 및 분리방법 비교(클로로포름 → 에칠아세테이트 )

상기 녹차 추출물 200ml에 카페인 및 클로로필 등의 불순물을 먼저 제거하기 위해 동량(200ml)의 클로로포름(CHCl₃)을 첨가하여 30분 동안 교반 추출한 다음 정치하여 층분리된 아래층인 클로로포름층을 분리하고(1차 클로로포름 분획), 다시 물층에 200ml의 클로로포름을 첨가하여 30분 동안 교반 추출한 다음 정치하여 층분리된 아래층인 클로로포름층을 분리하였으며(2차 클로로포름 분획) 이를 반복하여 총 3회의 클로로포름을 이용한 분배 추출을 시도하였다.

이때 횟수별 각 클로로포름층을 분리한 후의 물층에서 제거된 카페인의 함량을 HPLC를 이용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 의하면 1차 클로로포름 분획 시 총 녹차 추출물 원액대비 87.62%, 2차 분획 시 7.45%, 3차 분획시 1.9%가 제거되어, 총 제거된 카페인의 총량은 96.16% 였다.

상기 카페인이 제거되고 난 추출용매층(물층)에 존재하는 카테친의 함량을 HPLC를 이용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 의하면, 녹차 추출물 원액대비 EGC+C가 86.24%, EGCG가 80.67%, EC가 86.08%, ECG가 72.70%, 총 평균 81.42%가 존재하고 있어 카페인 제거를 위한 총 3회의 클로로포름을 이용한 분배 추출시 약 20% 수준의 카테친도 동반 손실이 발생된 것으로 확인되었다.

상기 카페인이 제거된 물층에서 카테친 화합물을 회수하기 위해 200ml의 에칠아세테이트(EtoAc)를 첨가하여 30분 동안 교반 추출한 다음 정치하여 층분리된 상층인 에칠아세테이트층을 회수하고, 계속하여 동일한 방법으로 총 3차의 에칠아세테이트 분배를 시행하였고, 이때 각 회수된 에칠아세테이트 층에 존재하는 카테친의 함량을 HPLC를 이용하여 평가하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 의하면, 1차 에칠아세테이트 분획에서는 녹차 추출물 원액대비 평균 58%의 카테친만이 추출되었고, 클로로포름 층분리에 의해 카페인이 이미 제거된 물분획, 즉, 이미 약 20%의 카테친이 손실된 분획층 대비 평균 72%의 카테친 회수율을 보였으며, 2차 분획시 최초 추출 원액대비 평균 11.9%, 카페인이 제거된 물분획 대비 14.1%, 3차 분획시 최초 추출 원액대비 평균 4.5%, 카페인이 제거된 물분획 대비 4.5% 가 회수되었다.

3회의 에칠아세테이트 분획으로 회수된 총 카테친 함량은 도 5에 나타내었다.

도 5에 의하면, 녹차 추출물 원액대비 평균 73.7%, 클로로포름 층분리에 의해 카페인이 이미 제거된 물분획 대비 평균 91.1%를 나타내지만, 카페인이 제거된 물분획 대비의 결과는 이미 최초 카페인 제거를 위해 클로로포름으로 3회의 층분리를 실시하면서 녹차 추출물 원액대비 약 20% 수준의 카테친 손실이 이미 이루어진 결과이다.

즉, 상기와 같이 클로로포름을 사용하여 카페인을 먼저 제거한 후 에칠아세테이트를 사용하여 카테친을 회수하는 경우, 카페인도 전량 제거가 불가능하며, 카페인의 다량 제거를 위해 클로로포름 분획 횟수가 많아질수록 카페인 제거율은 높일 수 있지만 이와 함께 카테친의 손실이 커지는 문제점을 나타내게 된다.

한편, 카페인과 클로로필 등을 제거하기 위해 최초의 클로로포름 층분리를 시행할 때 도 6에 나타난 바와 같이 층분리가 깨끗하게 잘 이루어지지 않는다. 참고로 도 6은 클로로포름을 첨가하여 교반한 후 12 시간 정치시 얻어진 사진이며, 이와 같이 12 시간 이상 정치해 두어야 겨우 층분리가 일부 유도됨을 알 수 있다. 특히 덩어리진 점질성 물질들이 중간부분에 가라앉아 있으므로 카테친이 함유된 상층인 물층과의 층분리에 장시간이 소요되는 양상이 발생하여 시간 소모적인 문제점이 있고, 장시간에 걸쳐 층분리를 시도하여도 최종 카테친의 회수량은 녹차 추출물 원액 대비 73% 수준의 카테친만 회수되므로 카테친의 손실양 27%를 감안하면 개선되어야 할 문제점임을 확인할 수 있다.

도 6은 녹차 추출물 원액에서 카페인을 먼저 제거하기 위해 클로로포름(우측) 또는 디클로로메탄(좌측)을 첨가하여 혼합 후 정치 12 시간에 나타나는 층분리 양상을 나타낸 사진으로, 아래층인 클로로포름층 혹은 디클로로메탄층에 거품성 점질물질이 형성되어 있어 층분리에 소요되는 시간이 길고, 층분리가 완전하게 이루어지지 않는다. 이러한 현상은 상기 클로로포름 대신 디클로로메탄을 사용하여도 유사하게 발생됨을 알 수 있다.

실시예 . 녹차 카테친 추출 및 분리방법 비교( 에칠아세테이트 →디클로로메탄)

상기 실험예 3에 의하여 얻어진 것으로 상기 비교예에서 사용된 것과 동일한 녹차 추출물 200ml에 먼저 카테친을 회수하기 위해 동량(200ml)의 에칠아세테이트를 첨가하여 30분 동안 교반 추출하고 정치하여 층분리시킨 후 상층인 에칠아세테이트층을 회수하고(1차 에칠아세테이트 분획), 다시 물층에 200ml의 에칠아세테이트를 첨가하여 30분 동안 교반 추출하고 정치하여 층분리시킨 후 역시 상층인 에칠아세테이트층을 회수하였으며(2차 에칠아세테이트 분획), 이러한 방법으로 총 3회의 에칠아세테이트를 이용한 분배 추출을 수행하였다.

이때 각 에칠아세테이트 층을 회수한 후 함유된 카테친 및 카페인의 함량을 HPLC를 이용하여 평가하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7 에 나타낸 바와 같이, 1차 에칠아세테이트 분획 시 녹차 추출물 원액대비 카페인이 36.4%, EGC+C가 36.7%, EGCG가 90.2%, EC가 73%, ECG가 93.7% 회수 되었고, 2차 분획 시 카페인이 24.1%, EGC+C가 21.7%, EGCG가 9%, EC가 25.7%, ECG가 3.5% 회수 되었고, 3차 분획 시 카페인이 15.2%, EGC+C가 12.2%, EGCG가 0.7%, EC가 1.1%, ECG가 0.8% 회수 되었음을 확인할 수 있다. 총 3회의 에칠아세테이트 분획을 실시한 결과 카페인은 원액 대비 총 75.7%가 회수되었으므로 에칠아세테이트 층분리를 통해 카테친을 회수하기 위한 작업에서 녹차 추출물 원액대비 24.3%가 자연적으로 제거되었으며, 나머지 각 카테친의 회수율은 EGC+C가 70.6%, EGCG가 99.9%, EC가 99.8%, ECG가 98.0% 회수 되어 EGC+C를 제외하고는 거의 원액대비 전량의 카테친이 회수된 것을 알 수 있고, 더불어 약 75.7%의 카페인도 함께 추출되었음을 알 수 있다.

도 8은 실시예에서 에칠아세테이트층 분리에 의해 회수된 카테친 및 카페인 혼합 용출물의 농축상태를 보여주는 사진으로, 둥근 플라스크 안에 미황색으로 응고된 물질이 회수된 카테친 및 카페인 혼합 용출물이다.

상기와 같이 총 3회의 에칠아세테이트 추출로 카테친을 회수하였지만 이때 카페인도 75.7% 수준으로 함유되어 있다. 이 카페인을 제거하기 위하여 상기 비교예에서 카페인을 제거하기 위해 사용한 클로로포름 보다 극성이 낮고(클로로포름의 극성이 4.1, 디클로로메탄의 극성은 3.1), 휘발성 및 독성이 약한 것으로 등록된 디클로로메탄을 사용하여 카테친의 손실을 최소화하면서 카페인의 제거 효과를 검토하였다.

즉, 3 회의 에칠아세테이트 추출로 카테친을 회수한 용액을 감압농축하고, 여기에 증류수 200ml를 첨가한 후 카페인을 제거하기 위해 디클로로메탄 200ml를 첨가하고, 30분 동안 교반 추출하고 정치하여 층분리시킨 후 아래층인 디클로로메탄층을 제거하고(1차 디클로로메탄 분획), 다시 물층에 200ml의 디클로로메탄을 첨가하여 30분 동안 교반 추출하고 정치하여 층분리시킨 후 아래층인 디클로로메탄층을 제거하였으며(2차 디클로로메탄 분획), 이러한 방법으로 총 3회의 디클로로메탄을 이용한 분배 추출을 시도하였다.

도 9는 실시예에 따라 에칠아세테이트 분획에서 카페인 제거를 위해 디클로로메탄으로 분획한 용액을 농축건조한 상태를 보여주는 사진이며, 카페인의 전형적인 흰 색상을 띄는 물질이 농축용 수기에 하얗게 붙어 있는 것을 볼 수 있다. 상기 수기의 밑부분을 확대한 도 10 을 보면 용출되어 제거된 카페인이 결정화 되어 있는 것을 볼 수 있다. 즉, 디클로로메탄 용액 층분리에 의해 흰색의 카페인이 카테친의 손실없이 잘 제거됨을 보여준다.

이때 각 디클로로메탄 층을 제거한 후의 물층에서 제거된 카페인의 함량을 HPLC를 이용하여 평가하였으며, 그 결과는 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 먼저 에칠아세테이트로 카테친을 추출할 때 녹차 추출물 원액대비 24.3%의 카페인이 이미 에칠아세테이트의 높은 극성(4.4) 차이 때문에 제거되었으며, 디클로로메탄으로 1차 분획 시 녹차 추출물 원액대비 62.7%, 2차 분획 시 7.7%, 3차 분획시 1.5%가 제거되고, 3회의 디클로로메탄 층분리로만 제거된 카페인의 함량은 71.9%이었으며, 에칠아세테이트 층분리에서 제거된 양을 포함하여 총 제거된 카페인의 총량은 96.2% 였다.

따라서 에칠아세테이트로 먼저 카테친을 회수한 후 카페인을 제거한다면 2차의 디클로로메탄을 이용한 층분리에서 카페인은 94.7% 제거효과가 발생할 수 있어 시간 및 노력 비용을 절감할 수 있는 효과가 발생할 수 있다.

또한 총 3회의 디클로로메탄을 이용한 층분리로 전체 원액대비 96.2%의 카페인을 제거하고 남은 물층에서 카페인이 제거된 후 잔존하는 카테친의 함량을 HPLC를 이용하여 각 카테친별 회수량을 평가한 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 녹차 추출물 원액에서 카테친을 먼저 회수하기 위해 에칠아세테이트 분획시의 카테친 회수율과 카테친을 회수한 후 디클로로메탄으로 다시 카페인을 제거한 후 카테친의 회수율을 상호비교하여 보면, EGC+C의 경우 카페인을 제거하기전인 에칠아세테이트 분획에서는 원액대비 70.6%가 잔존하였으나 3회의 디클로로메탄으로 카페인을 제거한 후에는 원액대비 69.6%로 약 1%의 손실이 있음을 확인할 수 있고, EGCG는 카페인을 제거하기 전인 에칠아세테이트 분획에서는 원액대비 99.9%가 잔존하였으나 3회의 디클로로메탄 추출로 카페인을 제거한 후에는 원액대비 99.2%로 약 0.7%의 손실이 있음을 확인할 수 있다. EC는 카페인을 제거하기 전인 에칠아세테이트 분획에서는 원액대비 99.8%가 잔존하였으나 3회의 디클로로메탄 추출로 카페인을 제거한 후에는 원액대비 97.3%로 약 2.5%의 손실이 있음을 확인할 수 있고, ECG는 카페인을 제거하기전인 에칠아세테이트 분획에서는 원액대비 98.0%가 잔존하였으나 3회의 디클로로메탄 추출로 카페인을 제거한 후에는 원액대비 97.6%로 약 0.4%의 손실이 발생하였음을 확인할 수 있다.

즉, 가장 많은 손실이 있은 EGC+C를 포함하여 평균을 확인하면 카페인을 제거하기전인 에칠아세테이트 분획에서는 녹차 추출물 원액대비 92.1%가 잔존하였으나 3회의 디클로로메탄 추출로 카페인을 제거한 후에는 녹차 추출물 원액대비 90.9%로 약 1.2%의 손실이 발생하였음을 확인할 수 있다.

따라서 거의 모든 카테친 성분이 대부분의 카페인을 제거하면서도 극소량(약 0.4 내지 2.5% 미만)만 손실되는 양상이었다.

상기한 결과를 비교예를 포함하는 기존의 방법과 비교해 보면 기존 방법에서는 먼저 카페인을 제거하기 위해 본 발명에서 사용한 디클로로메탄보다 극성이 높은 클로로포름을 이용해 카페인을 제거하는데, 이때 이미 모든 카테친이 평균 27% 이상 손실을 보지만(EGC+C의 경우 선행 비교예의 방법은 원액대비 40.7% 손실) 본 발명에 의하면 카페인도 거의 동량을 제거할 수 있으면서 녹차에서 미량 존재하는 MINOR 성분인 EGC+C의 경우만 30.4% 손실이 발생하고(이 수치도 비교예의 방법과 비교하면 10.3% 이상 상승된 효과임), 그 외 성분은 거의 원액대비 97.3% 내지 99.2% (EGCG가 99.2%, EC가 97.3%, ECG가 97.6%, 평균 90.9%)의 카테친 회수효과를 보임을 알 수 있다.

한편, 도 13에는 비교예와 본 발명의 실시예의 방법을 적용하여 녹차 카테친 분리 효율을 최종 비교하여 나타내었다.

도 13에 의하면, 카페인의 제거효과는 두 방법 모두 96.2%(제거되지 않고 남은 잔존량으로 3.8%)로 동일하게 나타나지만, 본 발명의 실시예의 경우 카테친으로서 EGC+C는 10.6%, EGCG는 19%, EC는 14.3%, ECG는 25.1%, 총 카테친은 평균 17.2%의 상승된 추출효과를 확인할 수 있어 훨씬 개선된 방법으로 평가할 수 있다.

본 발명에 의하여 녹차 추출물로부터 에칠아세테이트 분획을 먼저 시작하여 거의 전량의 카테친과 일부 카페인이 제거된 상태에서 카테친부터 회수하고 난 뒤 디클로로메탄을 이용하여 잔존하는 카페인을 제거할 경우에는 이와 같이 층분리에 과다하게 시간이 소요되는 등의 문제점을 해소할 수 있다.

도 14는 클로로포름 또는 에칠아세테이트를 사용한 층분리 양상을 나타낸 사진으로, 좌측 분액여두는 녹차 추출물에 클로로포름을 가하여 1차 분리 시작 후 24 시간 경과시 사진이고, 우측 분액여두는 녹차 추출물에 에칠아세테이트를 가하여 1차 분리 시작 후 10 분 경과시 사진을 나타내었다.

도 14에 의하면, 클로로포름을 사용하여 녹차 추출물로부터 카페인을 먼저 제거하는 좌측 분액여두의 경우 층분리 24 시간이 지난 후 아래층인 클로로포름층의 분리가 어느 정도 진행되었으나, 클로로포름층에 점질성 거품 물질이 많이 포함되어 있는 상태임을 볼 수 있으며, 상기 좌측 분액여두의 하층인 클로로포름층을 회수하여 재 촬영한 사진을 보면, 녹차 잎에서 추출된 지방, 카페인 성분, 일부 단백질 등의 비극성 성분이 덩어리가 져 있음을 확인할 수 있으며, 이로 인해 층분리에 많은 어려움이 발생되었음을 예측할 수 있다[도 15 참고].

그러나, 에칠아세테이트를 사용하여 녹차 추출물로부터 카테친을 먼저 추출하는 우측 분액여두의 경우 층분리에 적용된 시간이 10분에 불과하지만 점질성 거품 물질에 의한 분리 방해가 전혀 발생되지 않고, 상층인 에칠아세테이트 용액을 회수할 수 있음을 확인할 수 있다.

도 16은 녹차 추출물 원액을 대상으로 하여 비교예 및 실시예에 의하여 녹차 카테친을 분리 정제한 결과를 크로마토그램에 의하여 동시에 비교한 것으로, 청색선은 비교예를 나타내고, 적색선은 실시예를 나타낸다. 도 16에 의하면 두 방법 모두 카페인과 알 수없는 불순물의 PEAK가 잘 제거된 결과를 나타냄을 알 수 있다.

그러나 동일한 농도를 가지고 각각 실험을 수행하였지만, 방법의 차이에 의해 회수되어지는 최종 산물인 카테친의 함량이 달라지는데 청색(비교예)보다 적색(실시예)에서 피크(PEAK)의 높이가 더 높은 것을 볼 수 있으며, 이는 상대적으로 회수된 각각의 카테친 함량이 비교예 보다 실시예에 의한 방법이 월등함을 증명해 주는 자료가 된다. 즉 비교예의 경우 분리과정 중 상당량의 카테친 손실이 유도되지만 본 발명에 의할 경우 카테친 손실이 거의 없이 카페인과 불순물이 잘 제거됨을 확인할 수 있다.

상기한 결과 외에도, 본 발명의 경우 암 발생 등이 심하고 독성이 심한 클로로포름 대신 독성이 상대적으로 약한 디클로로메탄을 사용하므로 작업환경을 개선할 수 있고, 극성이 높은 에칠아세테이트를 먼저 사용하므로 비극성 물질의 혼입을 줄여 층 분리가 쉽게 유도되어 공정에 소요되는 시간을 줄일 수 있는 등의 부가적인 잇점을 가진다.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

EGC + C는 에피갈로카테친(EGC)과 카테친(C), EGCG는 에피갈로카테친 갈레이트(epigallocatechin gallate), EGC는 에피갈로카테친(epigallocatechin), EC는 에피카테친(epicatechin), ECG는 에피카테친 갈레이트(epicathchin gallate)를 나타낸다. EtoAC는 에칠아세테이트(ethylacetate)를 나타낸다.

Claims (6)

1. 녹차를 물 또는 탄소수 1 내지 5의 저급 알콜 수용액에 침지하여 녹차 추출물을 추출하는 단계,
   상기 녹차 추출물의 추출 잔사를 제거한 여과액을 농축하여 알콜을 제거한 후 동량의 에칠아세테이트를 부여하여 혼합한 후 정치시켜 추출 수용매층과 에칠아세테이트층으로 분배시키는 단계,
   상기 에칠아세테이트층을 감압농축하고 물을 가하여 농축물을 용해시킨 다음 물과 동량의 디클로로메탄을 부여하여 혼합한 후 정치시켜 물층과 디클로로메탄층으로 분배시키는 단계, 및,
   상기 물층으로부터 카테친을 분리하는 단계
   를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 녹차 카테친의 추출방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 알콜 수용액은 알콜 함량이 30 내지 50 중량% 범위인 것을 특징으로 하는 녹차 카테친의 추출방법.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 추출은 상온에서 2 시간 내지 6 시간 동안 교반하는 교반 추출에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 녹차 카테친의 추출방법.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 추출은 25 내지 45 ℃ 조건에서 30 분 내지 2 시간동안 초음파 추출에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 녹차 카테친의 추출방법.
   
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 추출은 60 내지 80 ℃ 조건에서 30분 내지 1 시간 동안 환류 추출에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 녹차 카테친의 추출방법.
   
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 물층으로부터 카테친의 분리는 오픈컬럼크로마토그라피(open column chromatography), 고속액체크로마토그라피(High performance liquid chromatography), 분취-고속액체크로마토그라피(preparative-high performance liquid chromatography), 향류분배크로마토그라피(counter current chromatography) 및 박층크로마토그라피(thin layer chromatography) 중에서 선택된 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 녹차 카테친의 추출방법.

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