KR101635823B1

KR101635823B1 - 차 잎에 함유된 카테킨류의 분리정제 방법

Info

Publication number: KR101635823B1
Application number: KR1020140070123A
Authority: KR
Inventors: 정명근; 황영선; 이민석; 이진호
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 농업회사법인 주식회사 오설록농장
Priority date: 2014-06-10
Filing date: 2014-06-10
Publication date: 2016-07-04
Also published as: KR20150141422A

Abstract

본 발명은 차 잎 추출물에 함유된 카테킨류의 분리정제 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 차 잎 추출물을 획득하는 단계; 상기 추출물을 에틸아세테이트 및 디클로로메탄을 이용하여 액-액 분배하여 카테킨류를 포함하는 분획물을 획득하고 농축하는 단계; 및 농축된 카테킨류 분획물을 단계적으로(stepwise) 용출액의 극성을 조절하여 다양한 카테킨류를 극성에 따라 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 차 잎에 함유된 카테킨류의 분리정제 방법에 관한 것이다.

Description

차 잎에 함유된 카테킨류의 분리정제 방법{Method for separation and purification of catechin derivatives from tea leaf}

본 발명은 차 잎에 함유된 카테킨류의 분리정제 방법에 관한 것이다.

식물로부터 유효물질을 추출하는 방법으로는 일반적으로 상압 상태의 용기에서 가열하여 달이는 방법(즉, 100℃ 이하) 또는 오토클레이브(autoclave)와 같은 내압성 용기 내에서 회분식(batch)으로 추출하는 방법 등이 주로 이용되고 있다. 그러나 추출 대상이 되는 식물의 종류, 추출하고자 하는 성분, 추출에 사용되는 용매, 추출방법 등에 따라 추출하고자 하는 성분의 순도 또는 추출되는 성분의 수득량 등 추출 효율의 차이가 심하게 발생한다. 따라서 추출대상이 되는 식물로부터 유효물질을 추출하고자 할 때는 최적의 추출효율을 나타낼 수 있는 추출법을 적용하는 것이 무엇보다 중요하며, 이러한 최적의 추출방법을 적용하였을 경우, 순도가 높으면서도 대량의 유효물질을 추출할 수 있게 된다.

한편, 메틸화카테킨은 주로 차나무로부터 추출되는 성분으로, 국내에서는 잘 알려져 있지 않았으나 뛰어난 항알레르기 효과가 있어 이들의 산업적 이용이 기대되는 물질이다. 그러나 메틸화카테킨의 추출 방법에 대한 자료는 거의 없는 상태이다. 현재까지 알려진 기술의 일례로는 일본공개특허 제2011-173902호에 개시된 차 잎에 포함된 메틸화카테킨 성분을 액-액 분배법으로 추출하는 방법이 있고, 한국공개특허 제2013-0113226호에 개시된 차나무 잎, 녹차 또는 우롱차로부터 메틸화카테킨을 추출하기 위하여 개미산을 함유하는 추출용매를 이용한 추출방법 등이 있다. 이와 같은 종래 기술로 획득되는 메틸화카테킨의 양은 극히 소량에 불과하며, 메틸화카테킨의 구조적 불안정성과 추출과정 중 산도의 불균형 및 극단적인 고온에 의해 입체 이성질체를 이루는 전화 현상이 발생 될 수 있으므로 종래 카테킨 화합물에 적용하던 추출방법으로는 고순도 및 대량의 메틸화카테킨을 분리해 낼 수 없다. 특히, 현재까지 녹차 추출물에서 추출의 대상이 되는 지표물질이 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG) 성분으로만 평가되고 있어, 적용된 다양한 추출방법이 모두 극성이 높은 카테킨 화합물의 추출에 효율적인 방법이었고, 상대적으로 극히 극성이 낮은 메틸화카테킨을 순수하게 대량 추출하는 것은 어려운 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 차 잎에 함유된 카테킨류를 고순도로 대량 수득하기 위하여, 차 잎 추출물을 액-액 분배하여 분획물을 획득하고, 농축한 다음 단계적으로 용출액의 극성을 낮추는 방법을 이용하여 상기 분획물에 포함된 다양한 카테킨류를 분리정제함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(1) 카테킨류를 포함하는 차 잎 추출물을 획득하는 단계;

(2) 상기 차 잎 추출물을 액-액 분배하여 1차 분획물을 획득하고 농축하는 단계;

(3) 상기 농축된 1차 분획물을 고형상 카트리지에 로딩하고, 증류수를 용출하여 2차 분획물을 회수하는 단계;

(4) 상기 단계 (3) 이후에, 5 내지 10%(v/v)의 에탄올로 용출하여 3차 분획물을 회수하는 단계;

(5) 상기 단계 (4) 이후에, 11 내지 17%(v/v)의 에탄올로 용출하여 4차 분획물을 회수하는 단계;

(6) 상기 단계 (5) 이후에, 18 내지 22%(v/v)의 에탄올로 용출하여 5차 분획물을 회수하는 단계; 및

(7) 상기 단계 (6) 이후에, 23 내지 27%(v/v)의 에탄올로 용출하여 6차 분획물을 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 차 잎에 함유된 카테킨류의 분리정제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 카테킨류를 포함하는 차 잎 추출물을 획득하는 단계;

(3) 상기 농축된 1차 분획물을 고형상 카트리지에 로딩하고, 증류수로 용출하는 단계;

(4) 상기 단계 (3) 이후에, 5 내지 10%v/v)의 에탄올로 용출하는 단계;

(5) 상기 단계 (4) 이후에, 11 내지 17%(v/v)의 에탄올로 용출하는 단계;

(6) 상기 단계 (5) 이후에, 18 내지 22%(v/v)의 에탄올로 용출하는 단계; 및

(7) 상기 단계 (6) 이후에, 23 내지 27%(v/v)의 에탄올로 용출하여 2차 분획물을 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 차 잎에 함유된 메틸화카테킨의 분리정제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 분리정제 방법으로 회수된 상대순도가 15 내지 20%인 메틸화카테킨(EGCG-3Me)을 포함하는 차 잎 분획물을 제공한다.

본 발명은 차 잎에 함유된 카테킨류의 분리정제 방법에 관한 것으로, 차 잎에 함유된 다양한 카테킨을 대량으로 분리정제하는데 매우 편리할 뿐만 아니라, 극미량 함유된 메틸화카테킨의 상대 순도가 높은 분획물을 획득할 수 있는 이점이 있다.

또한, 본 발명의 분리정제 방법으로 획득된 카테킨류 중에서 메틸화카테킨은 항알레르기 예방 또는 치료용 약학조성물, 건강기능식품 및 화장료 조성물 등에 적용하여 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 녹차 추출물(A) 및 표준품(B)의 HPLC 크로마토그램으로 녹차 추출물(A)에는 GA(3.5%), Caffeine(27.54%), EGCG(24.95%), EC(3.7%), EGCG-3Me(2.10%) 및 ECG(11.52%)의 성분이 포함되어 있음을 확인한 것이다. GA는 갈릭산이고, GC는 갈로카테킨이고, EGC는 에피갈로카테킨이고, C는 카테킨이고, Caffeine은 카페인이고, EGCG는 에피갈로카테킨갈레이트이고, EC는 에피카테킨이고, GCG는 갈로카테킨갈레이트이고, EGCG-3Me는 메틸화카테킨이고, ECG는 에피카테킨갈레이트이다.
도 2는 카테킨 회수를 위한 액-액 분배 후, 카페인 및 클로로필이 제거된 HPLC 크로마토그램으로 분획물에 포함된 카테킨류을 확인한 것이다.
도 3은 고형상(Sep-Pak) 카트리지를 이용한 녹차 추출물의 분리정제 모식도를 나타낸 것으로, 단계적 극성 변화를 통한 카테킨류의 분리정제를 최적화한 것이다.
도 4는 차 잎 추출액의 HPLC 크로마토 그램(A)과 액-액 분배 후, 10㎖의 녹차 추출물(분획물)을 고형상 카트리지에 로딩하고 5㎖의 증류수를 용출하여 획득한 용출액의 HPLC 크로마토그램(B)을 나타낸 것으로, 5㎖의 증류수를 용출하여 획득한 용출액의 HPLC 크로마토그램(B)으로 상대순도가 91.35%인 갈릭산(GA) 성분이 포함된 것을 확인한 것이다.
도 5는 차 잎 추출액의 HPLC 크로마토 그램(A)과 도 4 이후에, 10㎖의 10%(v/v) 에탄올로 용출하고 이어 30㎖의 15%(v/v) 에탄올로 용출하여 획득한 혼합 카테킨 성분을 확인한 HPLC 크로마토그램(B)으로 순차적으로 EGCG와 EC 성분이 분리되었고, 이들의 상대순도는 75.45%(EGCG)와 8.78%(EC)인 것을 확인한 것이다.
도 6은 차 잎 추출액 HPLC 크로마토 그램(A)과 도 5 이후에, 10㎖의 20%(v/v) 에탄올로 용출하여 획득한 혼합 카테킨 성분을 확인한 HPLC 크로마토그램(B)으로, 순차적으로 EGCG, EC, EGCG-3Me 및 ECG 성분이 분리되었고, 이들의 상대순도는 60.42%(EGCG), 10.62%(EC), 7.54%(EGCG-3Me) 및 18.13%(ECG)인 것을 확인한 것이다.
도 7은 차 잎 추출액의 HPLC 크로마토 그램(A)과 도 6 이후에, 15㎖의 25%(v/v) 에탄올로 용출하여 획득한 혼합 카테킨 성분을 확인한 HPLC 크로마토그램(B)이며, 순차적으로 EGCG, EC, EGCG-3Me 및 ECG 성분이 분리되었고, 이들의 상대순도는 6.84%(EGCG), 1.34%(EC), 18.85%(EGCG-3Me) 및 65.69%(ECG)인 것을 확인한 것이다.
도 8은 차 잎 추출액의 HPLC 크로마토 그램(A)과 도 7 이후에, 10㎖의 30%(v/v) 에탄올로 용출하여 획득한 혼합 카테킨 성분을 확인한 HPLC 크로마토그램(B)이다.
도 9는 차 잎 추출액의 HPLC 크로마토 그램(A)과 도 8 이후에, 10㎖의 40%(v/v) 에탄올로 용출하여 획득한 혼합 카테킨 성분을 확인한 HPLC 크로마토그램(B)이다.
도 10은 고형상(Sep-Pak) 카트리지를 이용하여 메틸화카테킨의 분리정제하는 모습을 나타낸 사진이다.

본 발명은

(1) 카테킨류를 포함하는 차 잎 추출물을 획득하는 단계;

상기 단계 (7) 이후에, 28 내지 33%(v/v)의 에탄올로 용출하여 회수하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 차 잎 추출물은 물 또는 에탄올의 추출용매로 추출하는 것이 바람직하지만 이에 한정되지 않고, 필요에 따라 적절하게 변형하여 추출하는 것이 가능하다.

상기 단계 (2)에서의 액-액 분배는 에틸아세테이트 또는 디클로로메탄 용액 중에서 선택된 하나 이상의 용액을 이용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 (2)에서 획득한 1차 분획물은 카페인 및 클로로필이 제거된 분획물인 것이 특징이며, 농축하는 방법은 한정되지 않고 사용될 수 있으나, 바람직하게는 감압농축 하는 것이다.

상기 카테킨류는 메틸화카테킨(EGCG-3Me), 갈릭산(GA), 갈로카테킨(GC), 에피갈로카테킨(EGC), 카테킨(C), 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 에피카테킨(EC), 갈로카테킨갈레이트(GCG) 및 에피카테킨갈레이트(ECG) 중에서 선택된 하나 이상이지만 이에 한정되지 않으며, 차 잎에 함유된 카테킨류를 모두 포함할 수 있다.

상기 단계 (3)에서의 2차 분획물은 갈릭산(GA)를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 단계 (4)에서의 3차 분획물은 극소량의 갈릭산(GA) 및 기타성분이 소량 포함되어 있는 것이 특징이며, 상기 단계 (5)에서의 4차 분획물은 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG) 및 에피카테킨(EC)을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 단계 (6)에서의 5차 분획물은 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 에피카테킨(EC), 메틸화카테킨(EGCG-3Me) 및 에피카테킨갈레이트(ECG)를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 단계 (7)에서의 상기 6차 분획물은 메틸화카테킨(EGCG-3Me) 및 에피카테킨갈레이트(ECG)를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 6차 분획물에서 메틸화카테킨(EGCG-3Me)의 상대 순도가 15 내지 20%인 것이 바람직하지만 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은

(1) 카테킨류를 포함하는 차 잎 추출물을 획득하는 단계;

(4) 상기 단계 (3) 이후에, 5 내지 10%(v/v)의 에탄올로 용출하는 단계;

또한, 본 발명은

(1) 카테킨류를 포함하는 차 잎을 75~85%(v/v) 에탄올에 혼합하여 35~45℃의 온도에서 추출하고, 에탄올 용매를 휘발시키는 단계;

(2) 상기 단계 (1)에서 추출한 차 잎 추출물을 에틸아세테이트 또는 디클로로메탄 용액 중에서 선택된 하나 이상의 용액을 이용하여 액-액 분배하여 카페인 및 클로로필이 제거된 1차 분획물을 획득하고, 이를 감압농축하는 단계;

(3) 상기 농축된 1차 분획물을 고형상 카트리지에 로딩하고, 증류수로 용출하여 갈릭산(GA)를 포함하는 2차 분획물을 회수하는 단계;

(4) 상기 단계 (3) 이후에, 5 내지 10%(v/v)의 에탄올로 용출하여 극소량의 갈릭산(GA)을 포함하는 3차 분획물을 회수하는 단계;

(5) 상기 단계 (4) 이후에, 11 내지 17%(v/v)의 에탄올로 용출하여 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG) 및 에피카테킨(EC)을 포함하는 4차 분획물을 회수하는 단계;

(6) 상기 단계 (5) 이후에, 18 내지 22%(v/v)의 에탄올로 용출하여 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 에피카테킨(EC), 메틸화카테킨(EGCG-3Me) 및 에피카테킨갈레이트(ECG)를 포함하는 5차 분획물을 회수하는 단계; 및

(7) 상기 단계 (6) 이후에, 23 내지 27%(v/v)의 에탄올로 용출하여 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 메틸화카테킨(EGCG-3Me) 및 에피카테킨갈레이트(ECG)를 포함하는 6차 분획물을 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 차 잎에 함유된 카테킨류의 분리정제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 분리정제 방법으로 회수된 상대순도 15 내지 20%의 메틸화카테킨(EGCG-3Me)을 포함하는 차 잎 분획물을 제공한다.

상기 메틸화카테킨은 알레르기 예방 및 치료용 약학 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 화장료 조성물로 이용할 수 있다. 상기 약학 조성물은 메틸화카테킨(EGCG-3Me)을 0.01 내지 20%(v/v)로 포함하는 것이 바람직하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 분리정제하는 방법에 의해 회수된 메틸화카테킨을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골순, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 상기 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 경구투여, 비경구 투여용, 주사용 등의 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 제제화에 필요한 통상의 성분들과 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키제(troches) 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 엘릭시르(elixirs), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이때, 정제, 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유 등을 혼합할 수도 있다. 캡슐 제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 혼합할 수도 있다.

또한, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 흉부내 주사 주입방식과 점막, 또는 국소에 적용되는데, 분산제, 좌제, 분제, 에어로졸(비강 스프레이 또는 흡입제), 겔, 현탁액제(수성, 또는 비수성 액상 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼), 용액제 등 비경구 투여에 적합한 액상 투여 형태 등에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효투입량은 환자의 연령, 신체적 조건, 몸무게 등의 상태를 고려하여 임상의 판단에 따라 필요한 범위로 조절될 수 있다. 일반적으로, 상기 약학적 조성물의 유효투입량은 성인 환자 체중 1㎏ 당 1 내지 200㎎/일이고, 바람직하기로는 5 내지 100㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 하루 2회 내지 5회 분할 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 녹차 추출물의 제조 및 농축

차나무 잎의 원료는 (주) 장원으로부터 분양받은 차나무 육종계통 녹차의 건조 잎을 사용하였고, 10g의 녹차 잎 분말과 1,000㎖의 80%(v/v) 에탄올을 혼합하여 40℃에서 초음파를 이용하여 30분 동안 추출하고, 동일한 추출방법으로 2회 더 추출하였다. 상기 추출물을 모두 혼합하여 1차 여과한 후, 40℃에서 감압 농축하여 에탄올과 일부의 물을 증발시키고, 녹차 추출물의 최종 부피를 200㎖이 되도록 농축하였다.

상기 녹차 추출물을 HPLC로 분석하였으며, 도 1에 나타낸 바와 같이 다양한 종류의 카테킨, 카페인 및 불순물이 공존함을 확인할 수 있었고, 메틸화카테킨의(EGCG-3Me)의 피크(peak)는 용출시간을 기준으로 약 35분 정도에서 확인되었다.

실시예 2. 녹차 추출물에서 카페인 및 클로로필 등의 불순물 제거

상기 실시예 1에서 추출한 녹차 추출물에서 카페인 및 클로로필 등의 불순물을 제거(decaffeine)하였다.

카페인의 제거는 액-액 분배 전후의 용출액을 이용하여 HPLC 분석에서 자외선 영역을 피크를 분석함으로써 확인하였고, 클로로필은 극성이 아주 낮은 지용성 물질로 가시광선 영역에서 흡광하므로 분획물의 성분 및 상대순도를 확인한 자외선 영역에서는 피크가 나타나지 않지만, 짙은 녹갈색의 색깔을 띠는 물질이므로 쉽게, 클로로필의 제거 여부를 확인할 수 있었다.

더욱 상세하게는 상기 200㎖의 녹차 추출물에 동량(200㎖)의 에틸아세테이트를 첨가하여 30분 동안 교반하고 정치하여 층 분리를 유도한 후, 상층인 에틸아세테이트 층을 회수하였다. 동일한 방법으로 총 3회의 에틸아세테이트를 이용한 분배 추출을 수행하였다.

계속하여 추출물을 다시 감압농축 후, 여기에 200㎖의 증류수를 첨가한 후, 200㎖의 디클로로메탄을 더 첨가하고, 30분 동안 교반하고 정치하여 층 분리시킨 후 아래층인 디클로로메탄층을 제거하고 동일한 방법으로 총 3회의 디클로로메탄을 이용한 액-액 분배 추출하였고, 결과를 도 2에 나타내었다.

실시예 3. 단계적( stepwise )으로 극성을 변화시키는 방법으로 고형상( SEP -PAK) 카트리지를 이용한 녹차 추출물에 함유된 카테킨류의 분리정제

상기 실시예 2에서 분리한 상기 분획물은 고형상(SEP-PAK) 카트리지를 이용하여 갈릭산(gallic acid; GA), 갈로카테킨(gallocatechin; GC), 에피갈로카테킨(epigallocatechin; EGC), 카테킨(catechin; C), 에피갈로카테킨갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG), 에피카테킨(epicatechin; EC), 갈로카테킨갈레이트(gallocatechin gallate; GCG), 메틸화카테킨(3-O-methyl epicatechin gallate; EGCG-3Me) 및 에피카테킨갈레이트(epicatechingallate; ECG)를 포함하는 카테킨류를 분리정제하였다.

더욱 상세하게는 고형상(SEP-PAK) 카트리지를 에탄올 및 증류수로 각각 충분히 세척한 후, 상기 실시예 2에서 분리한 10㎖의 녹차 분획물을 로딩하였다. 이후, 5㎖의 증류수를 용출하였으며, 이후 에탄올의 함량을 단계적(Stepwise)으로 증가시켜 극성을 점차 낮추는 방식으로 분획물 내의 카테킨류를 분리정제하였다(도 3).

단계 1. 고형상 ( SEP - PAK ) 카트리지의 세척

고형상(SEP-PAK) 카트리지를 에탄올 및 증류수로 각각 충분히 세척하였다.

단계 2. 10㎖의 녹차 분획물 로딩

10㎖의 녹차 분획물을 고형상(SEP-PAK) 카트리지에 로딩하였다.

단계 3. 5 ㎖ 의 증류수 용출

단계 3에서 용출된 분획물의 크로마토그램은 도 4에 나타내었고, 상대순도가 91.35%의 갈릭산(GA) 성분이 포함된 분획물을 획득하였다.

단계 4. 10㎖의 10%(v/v) 에탄올 용출

단계 4에서 용출된 분획물은 극소량의 갈릭산(GA)를 포함하는 기타 성분이 포함된 분획물을 획득하였다.

단계 5. 30㎖의 15%(v/v) 에탄올 용출

단계 5에서 30㎖의 15%(v/v) 에탄올로 용출된 분획물은 도 5에 나타내었고, 상대순도가 75.45%의 에피갈로카테킨갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG), 8.78%의 에피카테킨(epicatechin; EC), 극소량의 극성 카테킨(C), 카페인(caffeine) 및 메틸화카테킨(EGCG-3Me) 성분이 포함된 분획물을 획득하였다.

단계 6. 10㎖의 20%(v/v) 에탄올 용출

단계 6에서 10㎖의 20%(v/v) 에탄올로 용출된 분획물은 도 6에 나타내었고, 상대순도가 60.42%의 에피갈로카테킨갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG), 10.62%의 에피카테킨(epicatechin; EC), 7.54%의 메틸화카테킨(EGCG-3Me), 18.13%의 에피카테킨갈레이트(epicatechingallate; ECG) 및 극소량의 카페인이 포함된 분획물을 획득하였다.

단계 7. 15㎖의 25%(v/v) 에탄올 용출

단계 7에서 15㎖의 25%(v/v) 에탄올로 용출된 분획물은 도 7에 나타내었고, 상대순도 6.84%의 에피갈로카테킨갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG), 1.34%의 에피카테킨(epicatechin; EC), 18.85%의 메틸화카테킨(EGCG-3Me) 및 65.69%의 에피카테킨갈레이트(epicatechingallate; ECG)가 포함된 분획물을 획득하였다. 상기 단계별 용리체계 중에서 메틸화카테킨의 함량이 가장 높은 분획물이라는 것을 확인하였다.

단계 8. 10㎖의 30%(v/v) 에탄올 용출

단계 7 이후의 용리 체계에서는 각 카테킨 성분의 분리 면에서는 효율적인 양상을 확인할 수 없었다. 10㎖의 30%(v/v) 에탄올로 용출한 단계 8에서는 상대순도 5% 수준의 메틸화카테킨(EGCG-3Me)과 56% 수준의 에피카테킨갈레이트(ECG)가 분리되는 양상을 나타내었으나, 전체적 용출량이 적어 효율적 측면에서 의미가 없는 것으로 판단되었다(도 8).

단계 9. 10㎖의 40%(v/v) 에탄올 용출

10㎖의 40%(v/v) 에탄올로 용출한 단계 9에서도 역시 극소량의 에피카테킨갈레이트(ECG)와 완전 비극성 물질(noise)만이 분리되는 양상을 확인하였다(도 9).

본 실시예에서는 차 잎 함유 총 카테킨 대비 상대순도 1% 미만으로 극미량 함유된 메틸화카테킨의 상대순도를 향상시킨 분획물을 수득하는 분리정제방법을 확립하였다. 더욱 구체적으로는 녹차 추출물 원액을 에틸아세테이트 및 디클로로메탄을 이용하여 순차적으로 액-액 분배를 실시하여 대부분의 카페인을 제거한 후, 카테킨류 화합물만을 수득하여 C18 계열의 고형상 카트리지를 이용하여 단계적으로 극성을 변화시키는 방법으로 분리하며, 최종적으로 상기 고형상 분리법의 25%(v/v) 에탄올 15㎖로 용출한 단계 7에서 메틸화카테킨을 분리하는 것이 가장 효율적인 방법으로 확인되었다. 즉, 본 실시예의 단계 7에서는 상대순도가 18% 수준인 메틸화카테킨을 함유하는 분획물을 획득하였다.

다만, 상기 단계 8에서 분리된 메틸화카테킨(EGCG-3Me)의 상대적 비율은 단계 7에서 25%(v/v)의 에탄올을 용출한 경우보다 상대적 순도는 높지만, HPLC 피크 면적으로 계산하면 25%(v/v)의 에탄올을 용출한 경우는 447.6mAU이고, 30%의 에탄올로 용출한 경우는 43.6mAU이므로 수득 된 양의 차이가 25%(v/v)의 에탄올을 용출한 단계 7의 분획물이 30%(v/v)의 에탄올을 용출한 단계 8에서 획득한 메틸화카테킨(EGCG-3Me)의 용출액 대비 약 10.3배 더 높은 함량이 회수된다. 따라서 가장 효과적으로 회수하는 단계는 단계 7임을 알 수 있다.

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(1) 카테킨류를 포함하는 차 잎 추출물을 획득하는 단계;
(2) 상기 차 잎 추출물을 액-액 분배하여 1차 분획물을 획득하고 농축하는 단계;
(3) 상기 농축된 1차 분획물을 고형상 카트리지에 로딩하고, 증류수로 용출하는 단계;
(4) 상기 단계 (3) 이후에, 5 내지 10%(v/v)의 에탄올로 용출하는 단계;
(5) 상기 단계 (4) 이후에, 11 내지 17%(v/v)의 에탄올로 용출하는 단계;
(6) 상기 단계 (5) 이후에, 18 내지 22%(v/v)의 에탄올로 용출하는 단계; 및
(7) 상기 단계 (6) 이후에, 23 내지 27%(v/v)의 에탄올로 용출하여 2차 분획물을 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 차 잎에 함유된 메틸화카테킨의 분리정제 방법.
(1) 카테킨류를 포함하는 차 잎을 에탄올에 혼합하여 35~45℃의 온도에서 추출하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 추출한 차 잎 추출물을 에틸아세테이트 또는 디클로로메탄 용액 중에서 선택된 하나 이상의 용액을 이용하여 액-액 분배하여 카페인 및 클로로필이 제거된 1차 분획물을 획득하고, 이를 감압농축하는 단계;
(3) 상기 농축된 1차 분획물을 고형상 카트리지에 로딩하고, 증류수로 용출하여 갈릭산(GA)를 포함하는 2차 분획물을 회수하는 단계;
(4) 상기 단계 (3) 이후에, 5 내지 10%(v/v)의 에탄올로 용출하여 갈릭산(GA)를 포함하는 3차 분획물을 회수하는 단계;
(5) 상기 단계 (4) 이후에, 11 내지 17%(v/v)의 에탄올로 용출하여 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG)를 포함하는 4차 분획물을 회수하는 단계;
(6) 상기 단계 (5) 이후에, 18 내지 22%(v/v)의 에탄올로 용출하여 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 에피카테킨(EC), 메틸화카테킨(EGCG-3Me) 및 에피카테킨갈레이트(ECG)를 포함하는 5차 분획물을 회수하는 단계; 및
(7) 상기 단계 (6) 이후에, 23 내지 27%(v/v)의 에탄올로 용출하여 메틸화카테킨(EGCG-3Me) 및 에피카테킨갈레이트(ECG)를 포함하는 6차 분획물을 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 차 잎에 함유된 카테킨류의 분리정제 방법.
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