KR102216599B1 - 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제조방법 및 이를 이용한 다슬기 추출 분말 - Google Patents

근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제조방법 및 이를 이용한 다슬기 추출 분말 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고령화 대응 근감소증 예방을 위해 다슬기와 녹차의 유용 성분을 활용할 수 있도록 유효성분 추출방법에 관한 것으로, 근감소증 개선용 건강기능성 식품 원료 성분으로 이용할 수 있는 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제조방법은 녹차 1 중량부에 대하여 증류수 100 중량부를 혼합한 후 80℃에서 30분 동안 녹차추출물을 제조하는 제1단계; 다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 2 중량부를 혼합하고, 단백질분해효소를 혼합한 뒤 50℃에서 4 내지 13시간 동안 1차 다슬기추출물을 제조하는 제2단계; 상기 1차 다슬기추출물을 90℃에서 1시간 동안 2차 다슬기추출물을 제조하는 제3단계; 상기 2차 다슬기추출물을 여과하는 제4단계; 상기 여과한 2차 다슬기추출물을 감압농축기에서 농축하는 제5단계; 상기 농축된 2차 다슬기추출물을 동결건조기에서 건조하는 제6단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제1단계는 녹차 1 중량부에 대하여 17v/v% 내지 50v/v% 에탄올(EtOH)을 혼합하여 80℃에서 30분 동안 추출하는 제1-1단계로 실시할 수 있다.
또한, 상기 제2단계는 상기 다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 4 중량부를 혼합하고 단백질분해효소를 혼합한 뒤 50℃에서 12시간 동안 추출하는 제2-1단계로 실시할 수 있다.

Description

근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제조방법 및 이를 이용한 다슬기 추출 분말{MANUFACTURING EXTRACT POWDER METHOD OF MELANIAN SNAIL AND GREEN TEA FOR SARCOPENIA IMPROVEMENT AND MELANIAN SNAIL EXTRACT POWDER FOR SARCOPENIA IMPROVEMENT THEREOF}
본 발명은 고령화 대응 근감소증 예방을 위해 다슬기와 녹차의 유용 성분을 활용할 수 있는 유효성분 추출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 근감소증 개선용 건강기능성 식품 원료 성분으로 이용할 수 있는 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제조방법에 관한 것이다.
한국은 2018년 고령 사회로 진입하면서 고령친화식품의 산업이 급성장하고 있다. 2016년 국내 고령친화식품 산업규모는 8,554억원이며, ‘23년에는 1조 9,647억원으로 연평균 12.6%의 높은 성장률로 성장할 전망이다. 일본의 사례를 통해 확인하면 고령 사회 진입 후 건강기능식품 시장이 성장하였으므로 국내 건강기능식품 시장도 2026년까지 성장할 것으로 예상된다.
고령친화식품에 가장 필요한 요건은 영양분, 소화, 저작 연하 용이 등의 순서이며, 노인에게 필요한 요소로 영양분(48.8%), 소화 잘되는 정도(26.5%), 치아와 미각 고려한 부드러움(20.3%) 등으로 나타났다.
고령 사회 선진국인 일본과 비교할 때, 우리나라의 고령 친화 식품 시장은 아직 미형성 단계로 판단되며 고령 사회의 문제점을 해결할 수 있는 고령 친화 식품 개발이 시급한 것으로 확인된다.
다슬기는 연체동물 중복족목 다슬기과에 속하는 담수패로서 한국, 일본, 대만 등지에 널리 분포한다. 다슬기는 하천과 호수 등 물이 깊고 물살이 센 곳의 바위틈에 주로 서식하는데, 동의보감, 본초강목 등 동양의학서의 기록에 의하면 숙취해독에 좋고 당뇨예방과 눈을 맑게 하는데 효과가 있으며, 열독을 풀어주고 주독을 해소하며 소갈증(당뇨), 이질, 취질, 위암, 변비에 좋은 것으로 알려져 있다. 또한, 다슬기는 피를 맑게 하여 두통, 여성 어지러움증, 선혈증에 좋으며, 피부미용, 위장병에 특별한 효능이 있다.
다슬기는 요리하면 국물이 푸른빛을 띠는데 이는 혈액 속에 헤모글로빈을 만드는 구리 성분이 미네랄 형태로 함유된 것으로 간의 정화작용에 큰 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그리고, 최근에 와서 다슬기의 몇 가지 주요 구성성분이 밝혀졌는데, 뼈와 치아를 튼튼하게 하고 불면증을 완화하며 신경전달 기능 및 근육 운동을 원활하게 하여 부정맥을 방지하고 골다공증을 예방하는 수용성 칼슘과 신체각 세포들의 산소공급에 필요한 헤모글로빈의 구성성분을 다량 함유하고 있음이 밝혀졌다.
또한, 녹차의 경우 항산화 물질에 의해 혈전을 막아주고 혈압을 조절하여 심장 동맥을 지켜주며, 면역력 증진 효과가 있고 특히 65세 이상 노인 1만여명을 대상으로 연구한 결과 녹차를 매일 마신 사람은 노화가 진행되었을 때 적절하게 대처할 뿐만 아니라 잘 마시지 않는 사람들에 비해 다양한 일상생활을 더욱 노련하게 하는 것으로 발표되었다. 또한, 녹차는 항산화 물질인 EGCG가 함유되어 있어 두뇌 세포가 원활하게 성장하도록 하여 기억력과 학습력이 강화되는 것으로 밝혀졌다.
따라서 본 발명에서는 고령 친화 식품의 개발을 위해 다슬기와 녹차를 이용하여 노인을 위한 식품에 응용할 수 있도록 유효성분을 추출하는 효과적인 방법에 대해 제시하고자 한다.
일본등록특허 JP4263513B9 (2009-02-20)
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로서, 본 발명은 다슬기와 녹차의 유효성분을 추출하는 효과적인 방법을 제시하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 다슬기와 녹차에서 추출된 추출물을 이용하여 노인을 위한 식품에 응용할 수 있는 유효 추출물을 제공하는데 그 목적이 있다.
발명이 해결하고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제조방법은 녹차 1 중량부에 대하여 증류수 100 중량부를 혼합한 후 80℃에서 30분 동안 녹차추출물을 제조하는 제1단계; 다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 2 중량부를 혼합하고, 단백질분해효소를 혼합한 뒤 50℃에서 4 내지 13시간 동안 1차 다슬기추출물을 제조하는 제2단계; 상기 1차 다슬기추출물을 90℃에서 1시간 동안 2차 다슬기추출물을 제조하는 제3단계; 상기 2차 다슬기추출물을 여과하는 제4단계; 상기 여과한 2차 다슬기추출물을 감압농축기에서 농축하는 제5단계; 상기 농축된 2차 다슬기추출물을 동결건조기에서 건조하는 제6단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제1단계는 녹차 1 중량부에 대하여 17v/v% 내지 50v/v% 에탄올(EtOH)을 혼합하여 80℃에서 30분 동안 추출하는 제1-1단계로 실시할 수 있다.
또한, 상기 제2단계는 상기 다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 4 중량부를 혼합하고 단백질분해효소를 혼합한 뒤 50℃에서 12시간 동안 추출하는 제2-1단계로 실시할 수 있다.
상기 과제의 해결 수단에 의해, 본 발명은 다슬기와 녹차의 유효성분을 추출하는 효과적인 방법을 제시할 수 있다.
또한, 본 발명은 다슬기와 녹차에서 추출된 추출물을 이용하여 노인을 위한 식품에 응용할 수 있는 유효 추출물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 다슬기와 녹차의 혼합물에서 아미노산의 함량을 증가시킬 수 있는 추출방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 근감소증 개선을 위해 근관세포(myotube) 분화, 근육 단백질 성장 억제인자(Myostatin) 감소 및 근육 세포 특이 효소인 크레아틴효소(Creatine kinase)의 활성을 증가시킬 수 있는 추출물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명인 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제1추출방법을 보여주는 순서도이다.
도 2는 본 발명인 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제2추출방법을 보여주는 순서도이다.
도 3은 본 발명인 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제3추출방법을 보여주는 순서도이다.
도 4는 본 발명인 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제4추출방법을 보여주는 순서도이다.
도 5는 녹차 및 발효차 추출물의 DPPH 라디칼 소거능(DPPH Radical Scavenging activity) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 녹차 및 발효차 추출물의 전체 페놀 함량(Total Phenolic compounds(mgGAE/g)) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 1차 다슬기추출물을 증류수로 5시간 추출한 경우 최소량 단백질분해효소별 루신(Leucine) 함량(mg/mL) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 1차 다슬기추출물을 녹차추출물로 5시간 추출한 경우 최대량 단백질분해효소별 루신(Leucine) 함량(mg/mL) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 1차 다슬기추출물을 증류수로 단백질분해효소 최소량 추출 후 슬러리 형태를 나타낸 사진이다.
도 10은 1차 다슬기추출물을 녹차추출물로 단백질분해효소 최대량 추출 후 슬러리 형태를 나타낸 사진이다.
도 11은 1차 다슬기추출물을 건조다슬기를 이용하여 12시간 추출한 경우 단백질분해효소별 루신(Leucine) 함량(mg/mL) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 1차 다슬기추출물을 건조하지 않은 다슬기를 이용하여 12시간 추출한 경우 단백질분해효소별 루신(Leucine) 함량(mg/mL) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 1차 다슬기추출물을 건조다슬기를 이용하여 12시간 추출한 경우 슬러리 형태를 나타낸 사진이다.
도 14는 1차 다슬기추출물을 건조하지 않은 다슬기를 이용하여 12시간 추출한 경우 슬러리 형태를 나타낸 사진이다.
도 15는 본 발명에 의해 제조된 다슬기추출물의 세포독성 실험을 나타낸 그래프 및 실험 사진이다.
도 16은 본 발명에 의해 제조된 다슬기추출물의 근관세포 분화에 미치는 효과를 나타낸 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 17은 녹차추출물(GT)과 다슬기추출물(BT)의 상온, 열수, 17% 에탄올 및 50% 에탄올 추출물의 세포독성 시험을 나타낸 그래프이다.
도 18은 녹차추출물(GT)과 다슬기추출물(BT)가 근관세포 분화에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 덱사메타손을 처리한 근감소 세포모델에서 본 발명에 의해 제조된 다슬기추출물에 의한 근관세포 보호 효과를 나타낸 사진이다.
도 20은 덱사메타손을 처리한 근감소 세포모델에서 본 발명에 의해 제조된 다슬기추출물이 근감소 관련 바이오마커의 발현에 미치는 효능 분석한 그래프(A) 및 웨스턴블로팅 분석자료(B)이다.
본 명세서에서 사용되는 용어에 대해 간략히 설명하고, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
명세서 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
아래에서는 첨부한 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명에 대한 해결하고자 하는 과제, 과제의 해결 수단, 발명의 효과를 포함한 구체적인 사항들은 다음에 기재할 실시 예 및 도면들에 포함되어 있다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
<녹차추출물을 이용한 다슬기분말 제조방법>
도 1은 본 발명에 따른 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제조방법의 흐름을 나타내는 순서도이다.
먼저, 제1단계(S100)는 녹차 1 중량부에 대하여 증류수 100 중량부를 혼합한 후 80℃에서 30분 동안 녹차추출물을 제조한다.
상기 녹차추출물은 상기 녹차 1 중량부에 대하여 물 100 중량부 미만인 경우 녹차의 유효 성분이 추출되지 않을 우려가 있고 상기 녹차 1 중량부에 대하여 물 100 중량부를 초과한 경우 제조된 녹차 추출물의 쓴맛이 강한 문제점이 있으므로 상기 조건으로 실시하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 녹차추출물은 80℃ 미만으로 제조되는 경우 녹차의 유효 성분이 추출되지 않아 본 발명에 의해 제조된 다슬기추출물이 활성 산소족인 라디칼에 대한 소거능으로 항산화력을 측정하였을 때 항산화력이 낮아질 우려가 있고, 80℃를 초과하는 경우 상기 물이 증발되면서 녹차 추출물의 쓴맛이 강한 문제점이 있으므로 상기 조건으로 실시하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 녹차추출물은 30분 미만으로 추출하는 경우 하기 실시되는 아미노산 중 루신의 함량이 낮아 본 발명에 의해 제조된 다슬기추출물의 근감소증 개선 효과가 낮아질 우려가 있고, 상기 녹차추출물을 30분 초과하여 추출하는 경우 녹차 추출물의 쓴맛이 강한 문제점이 있으므로 상기 조건으로 실시하는 것이 바람직하다.
다음으로, 제2단계(S200)는 다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 2 중량부를 혼합하고, 단백질분해효소를 혼합한 뒤 50℃에서 4 내지 13시간 동안 1차 다슬기추출물을 제조한다.
상기 다슬기 과육은 삶은 다슬기의 껍데기를 제거하고 과육만 분리하여 -20℃ 미만으로 보관하며 전처리하는 것이 바람직하다.
상기 다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 2 중량부 미만으로 혼합하는 경우 본 발명에 의해 제조된 다슬기추출물이 활성 산소족인 라디칼에 대한 소거능으로 항산화력을 측정하였을 때 항산화력이 낮아질 우려가 있고, 상기 다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 2 중량부를 초과하여 혼합하는 경우 본 발명에 의해 제조된 다슬기추출물의 근감소증 개선 효과가 낮아질 우려가 있으므로 상기 조건으로 실시하는 것이 바람직하다.
상기 단백질분해효소는 알칼라아제(Alcalase) 2.4L, 플라보자임(Flavourzyme) 500MG, 뉴트라아제(Neutrase) 0.8L 및 파파인(Papain) T 100 MG중 어느 하나 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
상기 단백질분해효소는 단백질 분해에 탁월한 endo-peptidase이며, 해산물 분해에 탁월한 효소인 알칼라아제(Alcalase) 2.4L, 중성 pH에서 잘 분해하는 효소인 뉴트라아제(Neutrase) 0.8L, 다양한 조건에서 안정적인 활성을 나타내며, 해산물 분해에 널리 사용되는 효소인 파파인(Papain) T 100 MG 효소, 내부와 외부의 펩타이드(peptide) 결합을 동시에 끊어주는 효소인 플라보자임(Flavourzyme) 500MG를 예비 실험의 효소로 선정한 후 동일한 조건 하에서 가장 높은 수율을 가지는 효소를 본 실험의 효소로 선정하였다. 각 단백질분해효소별 추출 조건은 [표 1]과 같다.
Alcalase 2.4L Neutrase 0.8L Papain T 100MG Flavourzyme 500MG
사용량 분해물질중량
0.1~0.3%		 분해물질중량
0.2~0.5%		 분해물질중량
0.01~0.2%		 Alcalase 2.4L
동량
적정PH 8 7 5.0-7.5 5.5-7.5
적정온도
(℃)		 50-60 50 50-70 50-55
특히, 박테리아 유래 단백질 분해효소인 상기 알칼라아제(Alcalase) 2.4L와 산업용 단백효소인 플라보자임(Flavourzyme) 500MG을 동량으로 혼합하여 사용한 경우 동일한 조건에서 다른 단백질분해효소의 조합 보다 본 발명에 의해 제조되는 다슬기 추출물의 루신(Leucine)의 함량이 최대인 것으로 확인되었다.
상기 알칼라아제(Alcalase) 2.4L, 플라보자임(Flavourzyme) 500MG은 각각 상기 다슬기과육 중량의 0.3%를 혼합하는 것이 바람직하다. 상기 단백질분해효소의 주입 최소량 및 최대량을 살펴보면, 상기 뉴트라아제(Neutrase) 0.8L는 상기 다슬기과육 중량의 0.2%~0.5%, 알칼라아제(Alcalase) 2.4L는 상기 다슬기과육 중량의 0.1%~0.3%, 상기 플라보자임(Flavourzyme) 500MG는 상기 다슬기과육 중량의 0.1%~0.3%, 상기 파파인(Papain) T 100 MG는 상기 다슬기과육 중량의 0.01%~0.2%인 것으로 확인되었으므로 상기 단백질분해효소의 주입 최소량 이상 혼합하는 것이 바람직하며, 본 발명에서는 상기 단백질분해효소의 최대량을 혼합하였다.
상기 단백질분해효소는 단독으로 사용한 경우 상기 뉴트라아제(Neutrase) 0.8L가 가장 높은 분해율로 아미노산 중 루신(Leucine)의 함량이 높았으나, 상기 알칼라아제(Alcalase) 2.4L와 상기 플라보자임(Flavourzyme) 500MG을 혼합한 경우 동일 조건에서 가장 높은 루신(Leucine) 함량을 나타내었다. 상기 알칼라아제(Alcalase) 2.4L의 경우 해산물 분해에 적합하고 다양한 조건에서 안정적인 특성을 가지고 있고, 상기 플라보자임(Flavourzyme) 500MG은 단백질의 내부와 외부의 펩타이드 결합을 동시에 끊어주므로 상기 알칼라아제(Alcalase) 2.4L와 상기 플라보자임(Flavourzyme) 500MG을 혼합하는 것이 가장 효과적인 다슬기 추출물의 분해를 나타내었다.
상기 1차 다슬기추출물은 50℃에서 미만으로 추출하는 경우 상기 추출된 다슬기추출물의 유용한 성분의 추출이 미미할 우려가 있고, 50℃를 초과하여 추출하는 경우 상기 단백질분해효소가 변성되어 루신(Leucine) 함량이 낮아질 우려가 있으므로 상기 조건으로 실시하는 것이 바람직하다.
상기 1차 다슬기추출물은 4시간 미만으로 추출하는 경우 상기 추출된 다슬기추출물의 유용한 성분의 추출이 미미할 우려가 있고, 13시간을 초과하여 추출하는 경우 상기 단백질분해효소가 변성되므로 상기 조건으로 실시하는 것이 바람직하다.
다음으로, 제3단계(S300)는 상기 1차 다슬기추출물을 90℃에서 1시간 동안 2차 다슬기추출물을 제조한다. 상기 제2단계(S200)에서 상기 1차 다슬기추출물을 제조한 이후 2차 다슬기추출물을 따로 제조하는 것은 상기 제2단계(S200)에서 발생할 수 있는 균들을 고온에서 살균하기 위함이다.
상기 2차 다슬기추출물은 90℃ 미만으로 추출하는 경우 고온 살균 효과가 미미하거나 상기 추출된 다슬기추출물의 유용한 성분의 추출이 미미할 우려가 있고, 90℃를 초과하여 추출하는 경우 상기 혼합물 중 다슬기 또는 녹차 성분이 변성되거나 상기 증류수가 증발할 우려가 있으므로 상기 조건으로 실시하는 것이 바람직하다.
상기 2차 다슬기추출물은 1시간 미만으로 추출하는 경우 상기 추출된 다슬기추출물의 유용한 성분의 추출이 미미할 우려가 있고, 1시간을 초과하여 추출하는 경우 상기 혼합물 중 다슬기 또는 녹차 성분이 변성되거나 상기 증류수가 증발할 우려가 있으므로 상기 조건으로 실시하는 것이 바람직하다.
다음으로, 제4단계(S400)는 상기 2차 다슬기추출물을 여과한다. 상기 2차 다슬기추출물은 WATMAN No.4 여과지로 여과하는 것이 바람직하다.
다음으로, 제5단계(S500)는 상기 여과한 2차 다슬기추출물을 감압농축기에서 농축한다. 상기 여과된 2차 다슬기추출물은 대형감압농축기(Loborota 20 Control, Heidolph, Schwabach, Germany)로 30℃의 온도, 40rpm이하의 속도, 30mbar 압력조건으로 농축한다.
다음으로, 제6단계(S600)는 상기 농축된 2차 다슬기추출물을 동결건조기에서 건조한다. 상기 농축된 2차 다슬기추출물을 100hPa 이하의 압력, -40℃이하 온도 조건의 동결건조기(Heto PowerDry PL9000, Thermo Fisher Scientific-Inc, Waltham-MA, USA)를 활용하여 건조시킨다.
또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 상기 제1단계(S100)는 제1-1단계(S101)로 대체하여 본 발명인 다슬기 추출물을 제조할 수 있다. 제1-1단계(S101)는 녹차 1 중량부에 대하여 17v/v% 내지 50v/v% 에탄올(EtOH) 100중량부를 혼합하여 80℃에서 30분 동안 추출한다.
상기 제1단계(S100)의 경우 열수추출을 통해 다슬기 추출물을 제조하였으나, 상기 제1-1단계(S101)는 에탄올로 추출한다. 상기 녹차 1 중량부에 대하여 17v/v% 미만의 에탄올(EtOH)인 경우 상기 녹차의 유효 성분이 추출되지 않을 우려가 있고 상기 녹차 1 중량부에 대하여 50v/v% 에탄올(EtOH)를 초과하는 경우 상기 녹차의 유효 성분인 폴리페놀 성분이 충분히 추출되지 않을 우려가 있으므로 상기 조건으로 실시하는 것이 바람직하다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 제2단계(S200)는 제2-1단계(S201)로 대체하여 본 발명인 다슬기 추출물을 제조할 수 있다. 상기 제2-1단계(S201)는 상기 다슬기과육은 드라이오븐(dry oven)에서 80℃로 건조한 건조 다슬기과육을 사용하고, 상기 건조 다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 4 중량부를 혼합하고 단백질분해효소를 혼합한 뒤 50℃에서 12시간 동안 추출한다.
상기 건조 다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 4 중량부 미만으로 혼합하는 경우 다슬기의 유효 성분이 추출되지 않을 우려가 있고 상기 건조 다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 4 중량부를 초과한 경우 제조된 녹차 추출물의 쓴맛이 강한 문제점이 있으므로 상기 조건으로 실시하는 것이 바람직하다.
또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 상기 제1단계(S100) 대신 제1-1단계(S101)를 실시한 뒤 상기 제2단계(S200) 대신 제2-1단계(S201)를 실시하고 상기 제3단계(S300)를 실시하여 다슬기 추출물을 제조할 수 있다.
하기에서는 본 발명에서의 다슬기 및 녹차의 유효성분 추출 시 사용되는 단백질 조건을 달리하여 제조한 아미노산 함량의 실험 내용을 상세하게 설명한다.
[실시예 1]
녹차 20g에 100배수의 용매(증류수)를 첨가하여 water bath(JSEB-60T, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 담근 후 80℃에서 30분간 녹차 추출한다. 다슬기 과육 250에 대하여 2배수의 용매(녹차추출물)를 첨가하여 water bath(JSEB-60T, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 추출한다. 다슬기 과육 대비 최대 함량인 Alcalase 2.4L 0.3%, Flavourzyme 500MG 0.3%를 첨가하여 50℃에서 5시간 추출한 후 90℃에서 1시간 추출하였다.
[실시예 2]
녹차 20g에 100배수의 용매(17v/v% 에탄올(EtOH))를 첨가하여 water bath(JSEB-60T, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 담근 후 80℃에서 30분간 녹차 추출한다. 다슬기 과육 250에 대하여 2배수의 용매(녹차추출물)를 첨가하여 water bath(JSEB-60T, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 추출한다. 다슬기 과육 대비 최대 함량인 Alcalase 2.4L 0.3%, Flavourzyme 500MG 0.3%를 첨가하여 50℃에서 5시간 추출한 후 90℃에서 1시간 추출하였다.
[실시예 3]
녹차 20g에 100배수의 용매(50v/v% 에탄올(EtOH))를 첨가하여 water bath(JSEB-60T, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 담근 후 80℃에서 30분간 녹차 추출한다. 다슬기 과육 250에 대하여 2배수의 용매(녹차추출물)를 첨가하여 water bath(JSEB-60T, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 추출한다. 다슬기 과육 대비 최대 함량인 Alcalase 2.4L 0.3%, Flavourzyme 500MG 0.3%를 첨가하여 50℃에서 5시간 추출한 후 90℃에서 1시간 추출하였다.
[실시예 4]
녹차 20g에 100배수의 용매(증류수)를 첨가하여 water bath(JSEB-60T, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 담근 후 80℃에서 30분간 녹차 추출한다. 드라이오븐(dry oven)(JSOF-150, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 80℃로 건조시킨 다슬기 90g에 녹차추출물 360mL를 첨가하여 water bath(JSEB-60T, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 추출한다. 다슬기 과육 대비 최대 함량인 Alcalase 2.4L 0.3%, Flavourzyme 500MG 0.3%를 첨가하여 50℃에서 12시간 추출한 후 90℃에서 1시간 추출하였다.
[실시예 5]
녹차 20g에 100배수의 용매(17v/v% 에탄올(EtOH))를 첨가하여 water bath(JSEB-60T, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 담근 후 80℃에서 30분간 녹차 추출한다. 드라이오븐(dry oven)(JSOF-150, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 80℃로 건조시킨 다슬기 90g에 녹차추출물 360mL를 첨가하여 water bath(JSEB-60T, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 추출한다. 다슬기 과육 대비 최대 함량인 Alcalase 2.4L 0.3%, Flavourzyme 500MG 0.3%를 첨가하여 50℃에서 12시간 추출한 후 90℃에서 1시간 추출하였다.
[실시예 6]
녹차 20g에 100배수의 용매(50v/v% 에탄올(EtOH))를 첨가하여 water bath(JSEB-60T, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 담근 후 80℃에서 30분간 녹차 추출한다. 드라이오븐(dry oven)(JSOF-150, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 80℃로 건조시킨 다슬기 90g에 녹차추출물 360mL를 첨가하여 water bath(JSEB-60T, JS Research Ich, gongju-si, Korea)에서 추출한다. 다슬기 과육 대비 최대 함량인 Alcalase 2.4L 0.3%, Flavourzyme 500MG 0.3%를 첨가하여 50℃에서 12시간 추출한 후 90℃에서 1시간 추출하였다.
(가) 실험방법
1) DPPH Radical Scavenging activity
본 실험은 대표적인 활성 산소족인 라디칼에 대한 소거능으로 항산화력을 측정한 실험이다. 보라색을 나타내는 DPPH는 분자 내에 안정한 라디칼을 함유하지만, 항산화활성이 있는 물질과 만나면 라디칼이 소거되며 노란빛을 띄게 된다. 이때의 DPPH의 거동은 ·OH와 유사하며, 반응의 정도는 항산화제의 수소 공여능에 의존하며, 이런 DPPH 라디칼을 이용하여 일정량의 시료 용액과의 반응에 의하여 DPPH 라디칼이 감소하는 정도를 흡광도로 측정하여 시료의 항산화 활승을 측정하는 방법으로 이용할 수 있다.
㉮ DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성은 Blois의 방법에 따라 DPPH에 대한 전자공여활성으로 나타냄
㉯ 0.1mM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 80% methanol에 용해시킨 후, 517nm에서 흡광도 값이 1.00±0.02이 나오도록 80% methanol에 희석시켜 사용함
㉰ 시료용액 0.1mL에 흡광도 값을 맞춘 DPPH 용액 2.9mL를 가한 후 vortex mixer로 균일하게 혼합함
㉱ 실온에서 30분 방치한 후, 517nm에서 흡광도를 측정함
DPPH Radical Scavenging activity (%) = (1-A1/A0)×100
(A1: 시료처리군의 흡광도, A0: 시료대조군의 흡광도)
2) 총 폴리페놀 분석(Folin-Denis method)
㉮ 폴리페놀 함량은 Folin-Cioclateu 방법으로 측정함
㉯ 시료 1g에 에탄올 50mL를 넣어 2시간동안 교반한 후, 여과하여 여과액 500μL와 0.2N Folin 시약 2.5mL를 test tube에 넣어 5분간 반응시킴
㉰ 반응이 끝난 반응액에 7.5% Na2CO3 2mL를 넣고, 차광시켜 상온에서 2시간 동안 반응시킴
㉱ 2시간 후, 96 well에 반응액을 200μL씩 넣고, UV 765nm에서 측정함
㉲ 본 실험의 검량선은 Gallic acid(Sigma, ≥97%)를 사용하여 작성하였음
3) 카테킨·카페인 분석
㉮ 시료 0.5g에 50mL의 50% ethanol을 첨가하여 1시간 동안 sonicator로 추출한 후 30분간 상온에서 방치함
㉯ 상층액 45mL에 에틸아세테이트 45mL를 첨가하여 분획 후 분획물을 획득함
㉰ 분획물을 농축하여 그 농축물을 고성능 액체크로마토그래피(HPLC, Ultimate 3000, Thermo Scientific, Korea) 장비를 이용하여 비교 분석함
㉱ 시료의 카테킨 및 카페인의 동시분석을 위한 기기분석 조건은 [표 2]에 나타냄
Item Method
Column TOSOH TSK-GELⓡ ODS-80TM C18 5 ㎛, 4.6 mm × 25.0 cm
Mobile phase
(v/v) : gradient		 Time 2 min 40 min 42 min 44~47 min
0.2% H3PO4 in water 85% 70% 0% 85%
Acetonitrile 15% 30% 100% 15%
Flow rate 1.0 mL/min
Column oven temp. 40℃
Detector UV 250 nm
Analytical time 42 min
4) 아미노산 함량
㉮ 시료 0.3g에 증류수 10ml을 첨가하여 Shaking Incubator(Shaking Incubator SI-600R ,Lab.Companion, Jeio Tech, Korea)에 넣고 200rpm으로 24시간동안 방치함
㉯ 10%의 5-Sulfosalicylic acid dihydrate 1ml를 첨가한 후 4℃ 냉장고에서 24시간 동안 방치하여 단백질을 침전시킴
㉰ 4,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 40℃이하에서 감압농축기(Rotary evporator, EYELA N-1100V-W, JAPAN)를 이용하여 농축 시킨 후 sample dilution buffer를 5ml 첨가하여 용해함
㉱ 0.45 Membrance filter로 여과하여 120ul를 아미노산분석기(Sykam S7130 Aminoacid reagent organiger, Germany)로 분석하였고, UV/VIS detector 400nm(1.00 AU)와 570nm(1.00 AU)로 검출함
(나) 실험결과
1) 녹차 및 발효차의 분석 결과
① DPPH 라디칼 소거능(DPPH Radical Scavenging activity)
녹차 및 발효차에 대한 열수추출물, 상온(RT)추출물, 에탄올(EtOH)추출물의 DPPH 라디칼 소거활성의 결과는 [표 3] 및 [도 5]와 같다. 발효차보다 녹차의 DPPH 라디칼 소거활성능이 뛰어나며 그 중 에탄올(EtOH) 50%에 추출 하였을 때 90.981%로 가장 높았다. RT추출이 다른 추출보다 DPPH 라디칼 소거활성이 낮다는 것을 확인할 수 있다.
아래 비교예로 사용된 발효차는 (재)하동녹차연구소에서 제공하는 잭살 발효차를 사용하였다. 상기 발효차는 햇볕에서 2 내지 3시간 정도 시들린 후 20 내지 30분 동안 2회 정도 비벼준다. 이후, 실외에서 햇볕에 3 내지 4시간 동안 산화발효 시킨 후 햇볕에서 4 내지 5시간 동안 말리며 건조시킨다.
추출물 추출방법 ppm DPPH RSA(%)
녹차 Vit C 1000 92.9932
상온(RT) 추출 250 30.435
500 52.174
1000 84.585
열수 추출 250 42.328
500 87.46
1000 90.729
에탄올(EtOH) 17% 추출 250 47.898
500 78.081
1000 90.837
에탄올(EtOH) 50% 추출 250 42.292
500 72.08
1000 90.981
발효차 Vit C 1000 92.9932
상온(RT) 추출 250 17.643
500 17.284
1000 38.196
열수 추출 250 19.296
500 28.962
1000 59.289
에탄올(EtOH) 17% 추출 250 13.582
500 27.884
1000 55.552
② 총 페놀 함량분석(Folin-Denis method)
총 페놀 함량분석 실험은 Folin & Ciocalteau’s phenol reagent 시약을 사용하였다. 녹차추출물에서는 에탄올(EtOH) 17v/v%에서 추출한 경우의 총 페놀 함량이 273.781mgGAE/g으로 가장 높게 나왔으며, 발효차에서는 열수 추출한 경우 119.114mgGAE/g이 가장 높았다. 발효차에서 가장 높게 나온 열수 추출의 119.114mgGAE/g은 녹차추출물에서 가장 낮은 함량인 상온(RT)추출의 156.067mgGAE/g보다 낮은 총 페놀 함량을 보였다. 발효차는 폴리페놀 성분들이 산화되어 테아블라빈(Theaflavins, TF)과 테아루비긴(Thearubigins, TR)로 전환되어 녹차에 비해 총 페놀 함량이 낮게 나왔다.
종류 추출법 페놀 함량(mg GAE/g)
*1000ppm에서 분석
녹차 상온(RT) 156.067
열수 245.781
에탄올(EtOH) 17% 273.781
에탄올(EtOH) 50% 241.781
발효차 상온(RT) 75.59
열수 119.114
에탄올(EtOH) 17% 117.495
③ 카테킨 및 카페인 함량
녹차추출물 및 발효차의 추출 조건에 따른 카테킨과 카페인 함량 분석은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 활용하였다. 녹차추출물의 경우 카테킨의 종류별 함량에서는 EGCG((-)-epigallocatechine gallate)의 함량이 총 카테킨 함량의 변화에 주 영향을 미치는 것으로 유추할 수 있다. 발효차의 경우 EC((-)-epicatechine)의 함량이 총 카테킨 함량의 변화에 주 영향을 미치는 것으로 유추할 수 있다. 카페인의 함량은 녹차보다 발효차에서 더 높게 나오는 것을 확인할 수 있었다. 발효가 진행됨에 따라 카테킨류, 특히 EGCG가 크게 감소하였기 때문에 EGCG가 항산화활성에 기여도가 가장 높을 것으로 예상된다. 발효차의 카테킨 성분들이 산화되어 테아블라빈(Theaflavins, TF)과 테아루비긴(Thearubigins, TR)로 전환되어 녹차에 비해 총 카테킨 함량이 낮게 나왔다.
녹차추출물 발효차
열수 상온(RT) 에탄올(EtOH) 17v/v% 에탄올(EtOH)
50v/v%		 열수 상온(RT) 에탄올(EtOH)
17v/v%
카페인(mg/g) 52.867 49.400 51.556 54.911 59.200 60.711 83.800
카테킨 (mg/g) EGC 23.622 26.756 28.244 33.444 0.311 0.556 0.578
C 1.333 0.733 0.844 0.800 0.000 0.000 0.000
EC 11.956 13.067 14.200 15.733 1.444 1.156 1.222
EGCG 69.444 82.578 68.911 42.822 0.933 0.333 1.711
ECG 18.000 22.289 16.378 7.933 0.356 0.422 0.978
Total Catechin 124.356 145.422 129.578 100.733 3.044 2.467 4.489
④ 결론
항산화활성은 DPPH RSA를 보았을 때 녹차 열수추출물의 활성이 가장 높았으며, 총 페놀 함량은 녹차 에탄올(EtOH) 17 v/v% 추출물의 활성이 가장 높았다. 총 카테킨 함량은 녹차 상온(RT) 추출물에서 가장 높았으며, 카테킨류 중에서 EGCG의 함량이 총 카테킨의 함량에 기여를 많이 하는 것으로 판단된다. 항산화활성과 카테킨 및 카페인의 함량을 통해 발효차보다 녹차가 본 과제에 적합하다고 판단된다. 녹차 추출물 중 녹차 에탄올(EtOH) 17v/v% 추출물이 가장 활성이 좋다고 판단되었고, 열수추출 또한 그 값이 유의하고 용이성을 고려하여 녹차 열수추출물 또한 아미노산 함량 측성 분석에 사용하였다.
2) 아미노산 함량
[표 6]에 나타난 바와 같이, 다슬기를 각 조건별로 추출한 추출물을 동결건조하여 분석에 사용하였다. [표 6] 및 [도 7]에서 동일한 조건에서 최소량의 단백질분해효소를 첨가하였을 경우 Alcalase 2.4L과 Neutrase 0.8L와 Alcalase 2.4L와 Flavourzyme 500MG를 함께 사용한 경우의 아미노산 함량이 Papain T 100MG를 사용한 경우보다 아미노산 함량이 증가한 것을 확인할 수 있다. 열수 추출의 경우 역시 Leucine의 함량이 Papain T 100MG와 비슷하게 나왔다.
No 아미노산명 열수 Papain T
100MG		 Neutrase
0.8L		 Alcalase
2.4L		 Alcalase 2.4L +
Flavourzyme 500MG
추출
시간		 1h 추출시간 5h 추출
시간		 5h 추출시간 5h 추출
시간		 5h
- 효소
사용량		 0.01% 효소
사용량		 0.2% 효소
사용량		 0.1% 효소
사용량		 0.1%
1 O-Phospho-L-serine 0.0594 0.0635 0.2207 0.3431 0.3722
2 Taurine 0.0144 0.0138 0.0457 0.0584 0.0620
3 O-Phosphoethanolamine 0.0000 0.0134 0.0000 0.0000 0.0000
4 Urea 0.0000 0.0047 0.0000 0.0000 0.0000
5 L-Aspartic Acid 0.0479 0.0139 0.1509 0.4279 0.6086
6 Hydroxy-L-proline 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
7 L-Threonine 0.0276 0.0333 0.1366 0.2669 0.7950
8 L-Serine 0.0047 0.0073 0.0543 0.1422 0.7547
9 L-Asparagine 0.0000 0.0000 0.0000 1.5355 0.0000
10 L-Glutamic Acid 0.0033 0.0021 0.1100 0.1834 0.5344
11 D,L-α-Aminoadipic acid 0.0068 0.0049 0.0204 0.1329 0.1530
12 Proline 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
13 Glycine 0.0000 0.0000 0.0000 0.3871 0.0000
14 L-Alanine 0.0708 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
15 L-citrulline 0.0126 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
16 L-α-Amino-n-butyric acid 0.0067 0.0030 0.0000 0.0592 0.0201
17 L-Valine 0.0319 0.0150 0.4012 0.0000 1.1628
18 L-Cystine 0.0029 0.0065 0.0300 0.1581 0.1423
19 L-Methionine 0.0210 0.0278 0.2344 0.3648 0.7246
20 L-Isoleucine 0.0156 0.0113 0.4454 0.2411 0.7002
21 L-Leucine 0.0324 0.0221 1.3257 1.1668 2.3407
22 L-Tyrosine 0.0392 0.0308 0.1678 0.2589 0.7461
23 L-Phenylalanine 0.0305 0.0167 0.3910 0.4469 1.1165
24 b-Alanine 0.0227 0.0215 0.0000 0.4306 0.5229
25 D,L-β-Aminoisobutyric acid 0.0405 0.0429 0.0000 1.5870 1.6299
26 4-Amino-n-butyric acid 0.0897 0.0409 0.1877 0.3561 0.3229
27 L-Histidine 0.0195 0.0208 0.1372 0.1808 0.5456
28 1-Methyl-L-histidine 0.0000 0.0000 0.0000 0.0163 0.0183
29 3-Methyl-L-histidine 0.0016 0.0017 0.0000 0.0000 0.0207
30 L-Tryptophan 0.0010 0.0057 0.0000 0.0161 0.0412
31 L-Ornithine-monohydrochloride 0.0000 0.0000 0.0000 0.0122 0.0276
32 L-Lysine 0.0005 0.0037 0.0120 0.0367 0.0258
33 Ammonium Chloride 0.0000 0.0000 0.0000 0.0164 0.0053
34 L-Arginine 0.0010 0.0013 0.0191 0.0167 0.0113
Totals 0.6043 0.4287 4.0902 8.8420 13.4049
[표 7] 및 [도 8]에 나타난 바와 같이, 동일한 조건에서 단백질분해효소의 양을 최대로 하여 추출한 경우 Leucine의 함량은 Alcalase 2.4L와 Flavourzyme 500MG를 혼합하여 사용할 때 4.9273mg/mL로 가장 높게 나왔음을 확인할 수 있다.
No 아미노산명 Alcalase 2.4L Flavourzyme 500MG Alcalase 2.4L +
Flavourzyme 500MG
추출시간 5h 추출시간 5h 추출시간 5h
효소
사용량		 0.3% 효소
사용량		 0.3% 효소
사용량		 0.3%
1 O-Phospho-L-serine 0.3092 0.2384 0.3411
2 Taurine 0.0206 0.0442 0.0321
3 O-Phosphoethanolamine 0.0076 0.0129 0.0073
4 Urea 0.0386 0.0112 0.0033
5 L-Aspartic Acid 0.5646 0.5919 1.2579
6 Hydroxy-L-proline 0.0936 0.1948 0.1851
7 L-Threonine 0.4214 0.5571 1.7050
8 L-Serine 0.3465 0.6069 1.8090
9 L-Asparagine 0.5021 0.6743 2.1535
10 L-Glutamic Acid 1.8700 0.9094 2.7912
11 D,L-α-Aminoadipic acid 0.1136 0.0148 0.2178
12 Proline 1.0063 0.9094 1.3836
13 Glycine 0.1564 0.3080 0.7492
14 L-Alanine 0.7942 1.2001 2.2827
15 L-citrulline 0.0380 0.0053 0.0464
16 L-α-Amino-n-butyric acid 0.0064 0.0065 0.0105
17 L-Valine 0.4962 0.6903 2.2226
18 L-Cystine 0.0479 0.0125 0.0613
19 L-Methionine 0.4222 0.1436 1.0989
20 L-Isoleucine 0.3227 0.4907 1.4356
21 L-Leucine 1.8790 1.5342 4.9273
22 L-Tyrosine 0.3969 0.5051 1.7296
23 L-Phenylalanine 0.6343 0.6658 2.3243
24 b-Alanine 0.3861 0.0219 0.2908
25 D,L-β-Aminoisobutyric acid 0.7874 0.0325 0.7344
26 4-Amino-n-butyric acid 0.1398 0.0609 0.1091
27 L-Histidine 0.2513 0.2275 0.8719
28 1-Methyl-L-histidine 0.0030 0.0021 0.0065
29 3-Methyl-L-histidine 0.0214 0.0066 0.0069
30 Tryphanhan 0.0127 0.1071 0.1098
31 L-Ornithine-monohydrochloride 0.1645 0.2040 0.1684
32 L-Lysine 0.4765 0.7960 2.5067
33 Ammonium Chloride 0.2911 0.3397 0.3745
34 L-Arginine 1.1010 1.4427 3.2625
Totals 14.1231 13.5684 37.2168
본 발명에 의해 실시되는 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제조방법에 의해 필수 아미노산 중 루신의 함량이 매우 높은 다슬기 추출물을 획득할 수 있다. 근육 형성에는 적당량의 단백질을 섭취해야 할 뿐 아니라 여기에 아미노산인 루신이 반드시 포함되어야 한다. 루신은 필수 아미노산 중의 한 가지로 건강 유지에 절대로 필요하다 루신은 혈당 조절, 군살이 없는 조직에 쓰이는 단백질 이용은 물론 근육 및 뼈의 손상을 수리하는 데 도움을 주면서 근육 단백질이 스트레스나 손상에 의해서 분해되는 것을 막아주는 역할도 한다. 이러한 루신은 영양제를 통해 섭취할 수도 있으나 전문가들은 음식물을 통한 루신 섭취를 추천하고 있다. 추천된 단백질 섭취는 매끼마다 25~30그램이며, 여기에 2.5~2.8그램의 필수 아미노산인 루신이 포함되어야 한다.
3) 건조다슬기 및 생 다슬기 카테킨 및 카페인 함량
앞서 실험예를 통해 녹차추출물이 본 발명에서 다슬기 추출방법에 적합하다고 판정되어 다슬기에 녹차 추출물을 사용하여 실험을 진행하였다. 다슬기를 드라이오븐(dry oven)에 건조하여 본 과제에 사용되는 생 다슬기와 비교 실험하였다. 생 다슬기의 수분 함량은 15.55%였고, 건조 다슬기는 0.97%의 수분 함량을 나타냈다.
[표 8]에 나타난 바와 같이, 건조 다슬기로 실험을 하였을 경우 Caffeine의 함량은 Alcalase 2.4L 효소를 사용하였을 경우 156.789mg/g으로 가장 높았지만, 생 다슬기에서 가장 낮게 나온 Flavourzyme 효소인 212.104mg/g보다 낮아 생 다슬기가 건조 다슬기보다 Caffeine을 많이 함유하고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 다슬기에 녹차 추출물과 효소를 첨가한 후 추출한 경우에서 Caffeine의 함량은 Alcalase 2.4L와 Flavourzyme 500MG를 혼합한 경우 272.85mg/g으로 가장 높게 나왔다. EGC와 EC, EGCG는 생 다슬기에 녹차 추출물과 Flavourzyme 500MG 효소를 첨가 한 경우 가장 높게 나왔으며, ECG는 생 다슬기에 녹차 추출물과 Alcalase 2.4L과 Flavourzyme 500MG를 혼합하여 첨가한 경우 가장 높게 나왔다.
녹차추출물 + 생 다슬기 녹차추출물 + 건조다슬기
Alcalase Flavouryzme Neutrase Alcalase+
Flavourzyme 		Alcalase Flavouryzme Alcalase+
Flavourzyme
카페인(mg/g) 261.282 212.104 248.004 0.000 156.789 136.690 131.019
카테킨 (mg/g) EGC 0.000 2.961 1.196 0.000 0.000 0.001 0.000
C 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
EC 0.000 3.916 3.789 0.000 0.000 0.002 0.000
EGCG 0.000 0.478 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
ECG 0.249 0.287 0.299 1.048 0.000 0.000 0.199
Total Catechin 0.249 7.641 5.284 1.048 0.000 3.190 0.199
4) 단백질분해효소 및 산 추출 아미노산 함량 실험 결과
다슬기를 녹차 추출물에 각 단백질분해효소를 첨가한 후 추출한 추출물을 동결건조하여 분석에 사용하였다. 다슬기를 드라이오븐(dry oven)에 건조하여 본 과제에 사용되는 생 다슬기와 비교 실험하였다. 이전 실험과 비교하여 동일 추출시간에서 단백질분해효소의 양을 다르게 하여 비교 실험하였다. 본 실험에는 추출시간을 5시간에서 12시간으로 늘려 진행하였다. 다슬기를 대봉감식초에 1시간 선행추출 한 후, 녹차추출물과 효소를 첨가하여 12시간 추출하여 녹차추출물에만 추출한 다슬기와 비교하였다.
[표 9] 및 [도 11]에 나타난 바와 같이, Leucine의 함량은 건조다슬기에 녹차추출물을 혼합하고 Alcalase 2.4L과 Flavourzyme 500MG를 혼합하여 추출한 다슬기에서 2.7542mg/mL로 가장 높게 나왔다.
No 아미노산명 Alcalase 2.4L Flavouryzme 500MG Alcalase 2.4L+
Flavourzyme 500MG
추출
시간		 5h 추출
시간		 5h 추출
시간		 5h
효소
사용량		 0.3% 효소
사용량		 0.3% 효소
사용량		 0.3%
1 O-Phospho-L-serine 0.2109 0.1388 0.2638
2 Taurine 0.0110 0.0164 0.0107
3 O-Phosphoethanolamine 0.0028 0.0028 0.0040
4 Urea 0.0141 0.0437 0.0410
5 L-Aspartic Acid 0.3696 0.1360 0.7199
6 Hydroxy-L-proline 0.0104 0.0046 0.0046
7 L-Threonine 0.1187 0.2815 0.8109
8 L-Serine 0.1423 0.1548 0.6389
9 L-Asparagine 0.2476 0.3046 1.0094
10 L-Glutamic Acid 0.9651 0.5551 1.2330
11 D,L-α-Aminoadipic acid 0.0420 0.0069 0.0955
12 Proline 0.1370 0.0904 0.1697
13 Glycine 0.1999 0.2485 0.5105
14 L-Alanine 1.0019 0.8036 1.4843
15 L-citrulline 0.0396 0.0022 0.0388
16 L-α-Amino-n-butyric acid 0.0409 0.0063 0.0305
17 L-Valine 0.4860 0.3823 1.2568
18 L-Cystine 0.0205 0.0025 0.0281
19 L-Methionine 0.3595 0.2042 0.7751
20 L-Isoleucine 0.2897 0.2307 0.7739
21 L-Leucine 1.3776 0.7673 2.7542
22 L-Tyrosine 0.4332 0.2709 0.9324
23 L-Phenylalanine 0.6398 0.3316 1.3897
24 b-Alanine 0.2041 0.0125 0.3069
25 D,L-β-Aminoisobutyric acid 0.2247 0.0350 0.5629
26 4-Amino-n-butyric acid 0.0388 0.0257 0.0525
27 L-Histidine 0.1846 0.1334 0.4891
28 3-Methyl-L-histidine 0.0143 0.0008 0.0196
29 1-Methyl-L-histidine 0.0228 0.0035 0.0387
30 Tryphanhan 0.0201 0.0047 0.0337
31 L-Ornithine-monohydrochloride 0.1548 0.2106 0.2906
32 L-Lysine 0.2501 0.4176 1.2267
33 Ammonium Chloride 0.6141 0.3367 0.6549
34 L-Arginine 0.5210 0.6841 1.6376
Totals 9.4097 6.8502 20.2887
[표 10] 및 [도 12]에 나타난 바와 같이, 식초에 추출한 후 녹차추출물에 Alcalase 2.4L과 Flavourzyme 500MG를 혼합하여 추출한 다슬기의 Leucine 함량은 2.3723mg/mL로 Neutrase 0.8L 효소를 단독으로 사용한 경우인 2.3609mg/mL와 큰 차이를 보이지 않았다. Leucine의 함량이 가장 높게 나온 경우는 생 다슬기에 녹차추출물과 2.4L과 Flavourzyme 500MG를 혼합하여 추출한 다슬기에서 5.0322mg/mL로 가장 높게 나왔다.
No 아미노산명 Alcalase
2.4L		 Flavouryzme
500MG		 Neutrase
0.8L		 Alcalase 2.4L+
Flavourzyme 500MG		 식초 + Alcalase 2.4L +
Flavourzyme 500MG
추출
시간		 12h 추출
시간		 12h 추출
시간		 12h 추출
시간		 12h 추출
시간		 12h
효소
사용량		 0.3% 효소
사용량		 0.3% 효소
사용량		 0.5% 효소
사용량		 0.3% 효소
사용량		 0.3%
1 O-Phospho-L-serine 0.0000 0.0000 0.0009 0.3488 0.1357
2 Taurine 0.0031 0.0070 0.0061 0.0200 0.0152
3 O-Phosphoethanolamine 0.0040 0.0044 0.0093 0.0079 0.0134
4 Urea 0.0112 0.0262 0.0053 0.0532 0.0071
5 L-Aspartic Acid 0.3114 0.1922 0.0845 0.4618 0.7559
6 Hydroxy-L-proline 0.0497 0.2993 0.0592 0.0775 0.0000
7 L-Threonine 0.0926 0.1868 0.0471 0.5361 0.8979
8 L-Serine 0.0105 0.0184 0.0425 0.0211 0.8632
9 L-Asparagine 0.3994 0.0103 0.3074 1.2179 1.1280
10 L-Glutamic Acid 2.7557 1.4697 0.3283 2.0709 1.1679
11 D,L-α-Aminoadipic acid 0.1299 0.0046 0.0022 0.1993 0.1693
12 Proline 2.0373 1.4960 1.9020 1.5656 1.2197
13 Glycine 0.4628 0.4257 0.2731 1.0488 0.2211
14 L-Alanine 2.3903 1.1664 1.8873 2.2663 0.8305
15 L-citrulline 0.0871 0.0255 0.4005 0.1100 0.0597
16 L-α-Amino-n-butyric acid 0.1030 0.0300 0.0949 0.1200 0.0170
17 L-Valine 1.3398 0.6621 1.0968 2.6143 0.9501
18 L-Cystine 0.0286 0.0001 0.0088 0.0959 0.0476
19 L-Methionine 0.2360 0.3207 0.0183 1.3184 0.6149
20 L-Isoleucine 0.8806 0.3638 0.8201 1.7403 0.7171
21 L-Leucine 3.8303 2.4683 3.3609 8.0322 3.3723
22 L-Tyrosine 1.2935 0.5830 0.5648 2.2368 0.8688
23 L-Phenylalanine 1.7232 0.6197 0.9706 2.7277 1.0827
24 b-Alanine 0.1919 0.0109 0.0481 0.1754 0.1677
25 D,L-β-Aminoisobutyric acid 0.4367 0.0101 0.1191 0.5298 0.3333
26 4-Amino-n-butyric acid 0.0533 0.0284 0.0327 0.0761 0.1711
27 L-Histidine 0.5603 0.2776 0.2226 1.1097 0.4295
28 1-Methyl-L-histidine 0.0387 0.0005 0.0116 0.0153 0.0004
29 3-Methyl-L-histidine 0.0585 0.0012 0.0014 0.0807 0.0207
30 Tryphanhan 0.2827 0.1610 0.3551 0.5336 0.0177
31 L-Ornithine-monohydrochloride 0.2253 0.3019 0.3892 0.2930 0.1431
32 L-Lysine 0.3969 0.7846 0.0323 2.4954 1.4295
33 Ammonium Chloride 0.9864 0.7850 0.3037 1.9291 0.5065
34 L-Arginine 0.7772 1.0867 0.2563 3.3242 1.8783
Totals 22.1879 13.8281 14.063 39.4531 20.2529
카테킨 및 카페인의 실험 결과 생 다슬기가 건조다슬기보다 카테킨과 카페인의 함량이 높게 나온 것을 확인할 수 있었다. 카페인은 효소 Alcalase 2.4L을 첨가 한 경우 높게 나왔으며, 카테킨은 Flavourzyme 500MG와 Neutrase 0.8L 효소를 첨가 하였을 때 높게 나왔다. Leucine의 함량은 5시간 추출 한 경우보다 12시간 추출을 한 경우 높게 나온 것을 확인할 수 있었다. 건조다슬기와 생다슬기의 12시간 추출 아미노산 분석 결과를 보았을 때, 내부에서의 단백질 결합을 끊어주는 효소인 Alcalase 2.4L과 외부에서 결합을 끊어주는 효소인 Flavourzyme 500MG를 혼합하여 사용한 경우의 Leucine의 함량이 가장 높았다. 생다슬기를 두가지 효소를 혼합하여 12시간 추출한 결과 본 과제의 목표인 Leucine 함량 8mg/mL이 나온 것을 확인할 수 있었으며, 산을 첨가하지 않고 효소만으로 추출하여도 산의 추출한 경우보다 Leucine의 함량이 높게 나올 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 식초를 첨가하여 추출한 추출물은 점성이 있어 상용적으로 분말화하기 적합하지 않으며, 소비자의 부정적인 인식으로 인해 제품개발을 위한 원료로 사용하기 적합하지 않다고 판단된다.
(라) 근감소증 개선 효능 확인 방법
1) 근아세포 증식에 미치는 다슬기 추출물의 효능 평가
C2C12 근아세포에 다양한 분해효소를 사용한 다슬기 가수분해물과 추출 조건에 따른 녹차추출물을 농도별로 처리하여 C2C12 근아세포 성장에 미치는 다슬기 추출물의 효과를 분석하였다. C2C12 세포주(cell line)는 근관세포(myotubes)로 분화하는 근육분화(myogenesis) 동안 다양한 단백질을 발현하는 마우스 근아세포(myoblast) 세포주이다. C2C12 근아세포와 분화된 C2C12 세포는 당뇨병, 만성 심부전증, 만성 신장 질환과 같은 질병에 대한 역학 연구와 함께 근육 세포 재생, 대사, 인슐린 작용 및 근육 위축에 대한 연구를 포함하여 다양한 시험관내 연구에 사용된다.
① C2C12 근아세포를 24-well culture plate에 5×104/well로 seeding하여 37℃ CO2 배양기에서 배양함
② 24시간 배양 후 다슬기 추출물(0.1~0.8 mg/ml) 을 농도별로 24시간 처리
③ Cell Counting Kit-8(CCK-8)을 사용하여 세포 생존율을 측정
④ 각 well에 CCK-8을 첨가하고 2시간 반응 후 microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정
⑤ 무처리군을 100%로 하여 cell viability를 측정함
[도 15]에 나타난 바와 같이, C2C12 근아세포에 본 발명에 의해 제조된 다슬기 가수분해물을 농도별로 처리하여 C2C12 세포 성장에 미치는 다슬기 추출물의 효과를 분석한 결과 다슬기 원료소재의 농도가 0.1에서 0.8mg/ml까지 점차 증가하여도 세포생존율의 뚜렷한 변화는 관찰되지 않아 세포 독성을 크게 나타내지는 않았다.
[도 16(A)]는 (재)하동녹차연구소에서 추출하여 공급한 다슬기 소재 5종에 대한 분화 촉진 효과를 관찰한 결과이며, 현미경 사진에서 근관세포로의 분화에서 큰 변화는 관찰되지 않았다. 분화 후 근관세포 직경에서 두드러진 증가 현상은 관찰되지 않았으나 [도 16(B)]에 나타난 바와 같이, Alcalase와 Flavourzyme을 병용 사용하여 추출한 본 발명에 의해 제조된 다슬기 추출물을 처리한 군에서 근관세포의 근육 구성 단백질 이화작용에 관련된 효소인 MuRF1의 발현을 감소시키고 MyoD의 발현을 증가시킨다. 상기 MuRF1(Muscle RING finger1) 유전자는 근세포에 특이적으로 발현하는 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)로, 이것의 발현 증가로 인하여 근육 단백질들이 유비퀴틴화(ubiquitination)되고 프로테아좀(proteosome) 의존적으로 분해됨으로써 근손실이 유발되는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 마이오디(MyoD)는 DNA에 결합하여 근세포가 형성되는 것을 조절하는 염기성 단백질을 말하는데, 이 단백질은 염기성의 나선-루프-나선 구조를 가지고 있다. 보다 구체적으로, MyoD 유전자란 MyoD가 유전자와 결합한 형태로 직접적으로 근아세포에 영향을 주어 근세포 생성을 조절하는 유전자이다. 이 유전자는 유전자 전사의 활성을 조절하여 근세포의 형성을 조절하는 전사인자 중의 하나이다.
2) 근육세포 분화유도에 미치는 녹차 및 발효차 추출물의 효과 검증
C2C12 근아세포에 녹차 및 발효차 추출물을 농도별로 처리하여 C2C12 세포 성장에 미치는 다슬기 추출물의 효과를 분석한 결과, [도 17]에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의해 제조된 다슬기 추출물의 농도가 10과 25㎍/ml에서 세포생존율의 뚜렷한 변화는 관찰되지 않아 세포 독성을 크게 나타내지는 않으나, 50㎍/ml 이상의 농도에서 세포독성이 관찰되어 이후 실험은 25㎍/ml까지의 농도를 사용하여 효능을 평가하였다.
[도 18]에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 제조된 녹차 열수추출물 10㎍/ml 처리시 MyoD mRNA 발현을 증가시켰으며, 녹차 17v/v% 에탄올 추출물을 10, 25 ㎍/ml로 처리하였을 때 농도 의존적으로 MAFbx mRNA 발현을 감소시켰다. 상기 MAFbx(Mouse muscle atrophic F-box)유전자와 상기 MuRF1은 골격근에서 단백질 분해 또는 근 위축에 기여한다(Bodine, S.C. et al, 2001, Science, 294, 1704-8). MAFbx 및 MuRF1은 근위축조절인자(atrogenes)로 불리며, 이 두 유전자는 근 위축이 발생하는 동안 미오게닌(myogenin) 및 포크헤드 박스 단백질 O(FoxO)의 활성을 통해 증가한다.
3) 덱사메타손을 이용한 근감소 세포모델에서 다슬기 가수분해물의 근감소 억제 효능 검증
[도 19]에 나타난 바와 같이, 분화 후 근관세포 수와 크기가 증가하였고, 덱사메타손(Dexa)을 처리한 근감소 세포모델에서 근관세포이 수와 크기가 현저히 감소하였다. 본 발명인 Alcalase와 Papain T로 가수분해한 다슬기 추출물을 처리한 군에서 근관세포이 크기와 수가 어느 정도 유지되었다.
본 발명에서 제조된 Alcalase로 가수분해한 다슬기 추출물을 400, 800 ㎍/ml 처리한 군에서 농도 의존적으로 근육 구성 단백질 이화작용에 관련된 효소인 MuRF1과 MAFbx의 발현이 감소되며, Papain T로 가수분해한 다슬기 추출물 800 ㎍/ml 처리한 군에서 MuRF1가 MAFbx의 mRNA 발현이 감소되었다(도 20). 근육세포 분화에 관여하는 전사인자의 발현 증가는 나타나지 않았다.
상기 과제의 해결 수단에 의해, 본 발명은 다슬기와 녹차의 유효성분을 추출하는 효과적인 방법을 제시할 수 있다.
또한, 본 발명은 다슬기와 녹차에서 추출된 추출물을 이용하여 노인을 위한 식품에 응용할 수 있는 유효 추출물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 다슬기와 녹차의 혼합물에서 아미노산의 함량을 증가시킬 수 있는 추출방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 근감소증 개선을 위해 근관세포(myotube) 분화, 근육 단백질 성장 억제인자(Myostatin) 감소 및 근육 세포 특이 효소인 크레아틴효소(Creatine kinase)의 활성을 증가시킬 수 있는 추출물을 제공할 수 있다.
이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
S100. 녹차 1 중량부에 대하여 증류수 100 중량부를 혼합한 후 80℃에서 30분 동안 녹차추출물을 제조하는 제1단계
S101. 녹차 1 중량부에 대하여 17v/v% 내지 50v/v% 에탄올(EtOH)을 혼합하여 80℃에서 30분 동안 추출하는 제1-1단계
S200. 다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 2 중량부를 혼합하고, 단백질분해효소를 혼합한 뒤 50℃에서 4 내지 13시간 동안 1차 다슬기추출물을 제조하는 제2단계
S201. 상기 다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 4 중량부를 혼합하고 단백질분해효소를 혼합한 뒤 50℃에서 12시간 동안 추출하는 제2-1단계
S300. 상기 1차 다슬기추출물을 90℃에서 1시간 동안 2차 다슬기추출물을 제조하는 제3단계
S400. 상기 2차 다슬기추출물을 여과하는 제4단계
S500. 상기 여과한 2차 다슬기추출물을 감압농축기에서 농축하는 제5단계
S600. 상기 농축된 2차 다슬기추출물을 동결건조기에서 건조하는 제6단계

Claims (13)

  1. 녹차 1 중량부에 대하여 증류수 100 중량부를 혼합한 후 80℃에서 30분 동안 녹차추출물을 제조하는 제1단계;
    다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 2 중량부를 혼합하고, 단백질분해효소를 혼합한 뒤 50℃에서 4 내지 13시간 동안 1차 다슬기추출물을 제조하는 제2단계;
    상기 1차 다슬기추출물을 90℃에서 1시간 동안 2차 다슬기추출물을 제조하는 제3단계;
    상기 2차 다슬기추출물을 여과하는 제4단계;
    상기 여과한 2차 다슬기추출물을 감압농축기에서 농축하는 제5단계;
    상기 농축된 2차 다슬기추출물을 동결건조기에서 건조하는 제6단계;를 포함하여 제조하되,
    상기 단백질분해효소는,
    알칼라아제(Alcalase) 2.4L와 플라보자임(Flavourzyme) 500Mg으로 하고, 상기 알칼라아제(Alcalase) 2.4L와 플라보자임(Flavourzyme) 500Mg은 각각 상기 다슬기과육 중량의 0.3%를 혼합하여,
    상기 제3단계에서 제조된 다슬기추출물의 루신(Leucine) 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제조방법.

  2. 제1항에 있어서,
    상기 다슬기과육은 드라이오븐(dry oven)에서 80℃로 건조한 건조 다슬기과육이고,
    상기 제2단계의 1차 다슬기추출물은,
    상기 건조 다슬기과육 1 중량부에 대하여 상기 녹차추출물 4 중량부를 혼합하고 단백질분해효소를 혼합한 뒤 50℃에서 12시간 동안 추출하는 제2-1단계로 실시하는 것을 특징으로 하는 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1단계의 녹차추출물은,
    녹차 1 중량부에 대하여 17v/v% 또는 50v/v% 에탄올(EtOH) 100중량부를 혼합하여 80℃에서 30분 동안 추출하는 제1-1단계로 실시하는 것을 특징으로 하는 근감소증 개선을 위한 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제조방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 녹차추출물 함유 다슬기 추출 분말 제조방법에 의해 제조되는 다슬기 추출 분말은,
    녹차 및 다슬기를 유효성분으로 함유하여 근관세포 분화를 촉진하되,
    상기 근관세포의 분화는,
    MuRF1(Muscle RING finger1) 유전자의 발현을 감소시키고,
    마이오디(MyoD) 유전자의 발현을 증가시키며,
    MAFbx(Mouse muscle atrophic F-box) mRNA 발현을 감소시켜 촉진하는 것을 특징으로 하는 다슬기 추출물.
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