JPWO2006061947A1 - 蛍光顕微鏡及び観察方法 - Google Patents

Abstract

蛍光の飽和成分に基づいて観察を行なうことで、空間分解能を向上する。本発明にかかる蛍光顕微鏡は、励起光となるレーザ光を出射する光源１０と、レーザ光を集光して試料に照射する対物レンズ１３と、レーザ光により試料１４で発生した蛍光を検出する検出器２２と、レーザ光と試料１４との相対位置を変化させて走査を行うステージ１５とを備え、レーザ光の強度が最大の時に、蛍光の飽和が生じるよう、前記レーザ光の強度を変化させて試料に照射し、レーザ光の強度に応じた蛍光を検出器２２で検出し、蛍光の飽和成分に基づいて観察を行うものである。

Description

本発明は、蛍光顕微鏡及び観察方法に関し、特に詳しくは試料に励起光を照射し、試料からの蛍光を検出して観察を行う蛍光顕微鏡及び観察方法に関する。

現在、医学、生物学研究に有用なツールとして、蛍光顕微鏡が広く利用されている。蛍光顕微鏡では光源からの励起光を試料内の蛍光物質に照射して、蛍光物質から蛍光を発生させる。そして、この蛍光を励起光と分離して検出することにより試料の蛍光像を観察する。蛍光顕微鏡では、蛍光物質を蛍光プローブとして用い、様々な細胞やたんぱく質の標識とすることにより、その局在を観察することができる。

さらに、レーザ走査方式の蛍光顕微鏡が用いられている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。レーザ走査方式の蛍光顕微鏡では、試料を走査しながらレーザ光を照射して、蛍光像を撮像する。

一般に顕微鏡では、空間分解能が回折限界によって制限されている。従って、従来の顕微鏡では光の波長と開口数が決まってしまうと、空間分解能を一定以上に向上させることができないという問題点があった。
特開２００３−０５７５５４号公報 特開２００３−３４４７７６号公報

このように従来の顕微鏡では、空間分解能を向上することができないという問題点があった。
本発明は上述の問題点に鑑みてなされたものであり、空間分解能を向上することができる蛍光顕微鏡及び、観察方法を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様にかかる蛍光顕微鏡は、励起光となるレーザ光を出射するレーザ光源（例えば、本発明の実施の形態にかかる光源１０）と、前記レーザ光を集光して試料に照射する対物レンズ（例えば、本発明の実施の形態にかかる対物レンズ１３）と、前記レーザ光により前記試料で発生した蛍光を検出する検出器（例えば、本発明の実施の形態にかかる検出器２２）と、前記レーザ光と前記試料との相対位置を変化させて走査を行う走査手段（例えば、本発明の実施の形態にかかるステージ１５）とを備え、前記レーザ光の強度が最大の時に、蛍光の飽和が生じることによってレーザ光の強度と蛍光の強度との関係が非線形になる非線形領域となるよう、前記レーザ光の強度を変化させて試料に照射し、前記レーザ光の強度に応じた蛍光を前記検出器で検出し、前記蛍光の飽和成分に基づいて観察を行うものである。これにより、空間分解能を向上することができる。

本発明の第２の態様にかかる蛍光顕微鏡は、上述の蛍光顕微鏡において、前記レーザ光の強度が時間に応じて変化するよう変調する変調器（例えば、本発明の実施の形態にかかる変調器１６）をさらに備え、前記レーザ光がピークとなる時間において前記蛍光が非線形領域となる強度で試料に照射され、前記変調器で変調しながら走査して、前記試料で発生した蛍光を前記検出器で検出し、前記検出器で検出された蛍光から、前記変調器での周波数に対する高調波成分を取り出して観察を行うものである。これにより、簡易な構成で空間分解能を向上することができる。

本発明の第３の態様にかかる蛍光顕微鏡は、上述の蛍光顕微鏡において、前記高調波成分がロックインアンプにより取り出されているものである。これにより、高感度で検出することができる。

本発明の第４の態様にかかる蛍光顕微鏡は、上述の蛍光顕微鏡において、前記レーザ光源にパルスレーザ光源を用いているものである。これにより、試料の損傷及び蛍光の褪色を防ぐことができる。

本発明の第５の態様にかかる蛍光顕微鏡は、上述の蛍光顕微鏡において、前記レーザ光の強度を、前記蛍光が前記非線形領域となる第1の強度と、前記第１の強度と異なる第２の強度の少なくとも２つの強度で前記試料に照射し、前記レーザ光が前記第１の強度及び前記第２の強度のそれぞれの強度で前記試料に照射された状態で走査を行い、前記第１の強度での蛍光の強度及び前記第２の強度での蛍光の強度に基づいて前記試料からの蛍光の飽和成分を算出するものである。これにより、簡易な構成で空間分解能を向上することができる。

本発明の第６の態様にかかる蛍光顕微鏡は、上述の蛍光顕微鏡において、前記レーザ光源が多光子励起を発生させる多光子励起光源である。これにより、より高感度の検出を行うことができる。

本発明の第７の態様にかかる蛍光顕微鏡は、上述の蛍光顕微鏡において、波長の差に基づいて前記レーザ光から蛍光を分離する分離手段をさらに備え、前記分離手段により分離された蛍光を前記検出器で検出するものである。これにより、空間分解能を向上することができる。

本発明の第８の態様にかかる蛍光顕微鏡は、上述の蛍光顕微鏡において、前記対物レンズの焦点位置を光軸方向に沿って変化させる焦点位置変化手段をさらに備えるものである。これより、３次元観察を行なうことができる。
本発明の第９の態様にかかる蛍光顕微鏡は、上述の蛍光顕微鏡において、前記レーザ光を前記試料に照射することにより発生した蛍光をコンフォーカル光学系を介して前記検出器で検出するものである。これにより、さらに空間分解能を向上することができる。

本発明の第１０の態様にかかる観察方法は、励起光であるレーザ光を試料に照射し、前記試料からの蛍光を検出して前記試料を観察する観察方法であって、前記レーザ光の強度が最大の時に、蛍光の飽和が生じることによってレーザ光の強度と蛍光の強度との関係が非線形となる非線形領域になるよう、前記レーザ光の強度を変化させて、前記強度が変化されたレーザ光を集光して、前記試料に照射し、前記試料と前記レーザ光との相対位置を変化させるよう走査し、前記レーザ光により試料で発生した蛍光をレーザ光と分離し前記レーザ光から分離された蛍光を検出し前記検出された蛍光から蛍光の飽和成分に基づいて観察を行うものである。これにより、空間分解能を向上することができる。

本発明の第１１の態様にかかる観察方法は、上述の観察方法において、前記レーザ光を時間に応じて強度が変化するよう変調して、前記レーザ光の強度を変化させ、前記変調されたレーザ光がピークとなる時間において蛍光が前記非線形領域となるよう、前記試料にレーザ光を集光して照射し、前記レーザ光を変調させている状態で、前記試料と前記レーザ光の相対位置を変化させるよう走査を行うものである。これにより、簡易な方法で空間分解能を向上することができる。

本発明の第１２の態様にかかる観察方法は、上述の観察方法において、前記検出された蛍光から、変調の周波数に対する高調波成分を取り出して観察を行うものである。これにより、空間分解能を容易に向上することができる。

本発明の第１３の態様にかかる観察方法は、上述の観察方法において、前記レーザ光をパルスレーザ光とし、前記パルスレーザ光を強度変調しているものである。これにより、より高感度の検出を行うことができる。

本発明の第１４の態様にかかる観察方法は、上述の観察方法において、蛍光が前記非線形領域となる第１の強度と、前記第１の強度と異なる第２の強度の少なくとも２つの強度とで前記試料に照射されるよう前記レーザ光の強度を変化させ、前記第１の強度及び前記第２の強度のそれぞれの強度に対して、走査を行い、前記第１の強度での蛍光の強度及び前記第２の強度での蛍光の強度に基づいて蛍光の飽和成分を算出するものである。これにより、簡易な方法で、空間分解能を向上することができる。

本発明の第１５の態様にかかる観察方法は、上述の観察方法において、多光子励起法により蛍光を検出していることを特徴とするものである。これにより、より高感度の検出を行うことができる。

本発明の第１６の態様にかかる観察方法は、上述の観察方法において、前記試料が量子ドットで標識されているものである。これにより、低強度のレーザ光を用いることができる。

本発明の第１７の態様にかかる観察方法は、上述の観察方法において、前記試料中における前記レーザ光の焦点位置を光軸方向に沿って変化させて、前記蛍光を検出するものである。これにより、簡易な構成で空間分解能を向上することができる。
本発明の第１８の態様にかかる観察方法は、上述の観察方法において、前記レーザ光を前記試料に照射することにより発生した前記蛍光をコンフォーカル光学系を介して検出するものである。これにより、さらに空間分解能を向上することができる。
本発明の第１９の態様にかかる観察方法は、励起光となるレーザ光を出射するレーザ光源と、前記レーザ光を集光して試料に照射する対物レンズと、前記レーザ光により前記試料で発生した蛍光を検出する検出器と、前記レーザ光と前記試料との相対位置を変化させて走査を行う走査手段とを備え、前記レーザ光の強度が最大の時に、蛍光の飽和が生じるよう、前記レーザ光の強度を変化させて試料に照射し、前記レーザ光の強度に応じた蛍光を前記検出器で検出し、前記蛍光の飽和成分に基づいて観察を行うものである。これにより、空間分解能を向上することができる。
なお、上述の観察方法において、特に指定のない限り、ステップの記載順は処理の順番を示すものではない。

本発明によれば、空間分解能が高い蛍光顕微鏡及び観察方法を提供することができる。

図１は、本発明にかかる蛍光顕微鏡の構成を示す図である。 図２は、本発明において、励起光であるレーザ光と励起光によって発生する蛍光の空間分布を模式的に示す図である。 図３Ａは、本発明の実施の形態１にかかる蛍光顕微鏡において変調された励起光と励起光によって発生する蛍光の強度変化を模式的に示す図である。 図３Ｂは、本発明の実施の形態１にかかる蛍光顕微鏡において変調された励起光と励起光によって発生する蛍光の強度変化を模式的に示す図である。 図４は、励起光強度と蛍光強度の関係を模式的に示す図である。 図５は、蛍光強度の角周波数に対する振幅スペクトルを模式的に示す図である。 図６Ａは、蛍光の空間分布を模式的に示す図である。 図６Ｂは、蛍光の１次の周波数成分の空間分布を模式的に示す図である。 図６Ｃは、蛍光の２次の周波数成分の空間分布を模式的に示す図である。 図７は、高次の周波数成分を検出した場合の光学伝達関数を模式的に示す図である。

符号の説明

１０ 光源
１１ レンズ
１２ ダイクロイックミラー
１３ 対物レンズ
１４ 試料
１５ ステージ
１６ 変調器
２１ ピンホール
２２ 検出器
２３ ロックインアンプ
２４ 処理装置

以下に、本発明を適用可能な実施の形態が説明される。以下の説明は、本発明の実施形態を説明するものであり、本発明が以下の実施形態に限定されるものではない。説明の明確化のため、以下の記載は、適宜、省略及び簡略化がなされている。又、当業者であれば、以下の実施形態の各要素を、本発明の範囲において容易に変更、追加、変換することが可能であろう。尚、各図において同一の符号を付されたものは同様の要素を示しており、適宜、説明が省略される。

発明の実施の形態１．
本発明の実施の形態１にかかる蛍光顕微鏡は共焦点顕微鏡であり、レーザ走査方式の顕微鏡である。本発明では蛍光の飽和を利用して、空間分解能を向上している。すなわち、蛍光の飽和成分について観察することにより、空間分解能を向上している。この蛍光顕微鏡について図１を用いて説明する。図１は本発明にかかる蛍光顕微鏡の構成を模式的に示す図である。１０は光源、１１はレンズ、１２はダイクロイックミラー、１３は対物レンズ、１４は試料、１５はステージ、１６は変調器、２１はピンホール、２２は検出器、２３はロックインアンプ、２４は処理装置である。

光源１０は励起光を連続発振するレーザ光源であり、例えば、連続発振Ａｒイオンレーザ又は、可視域の波長を持つ半導体イオンレーザを用いることができる。ここで、光源１０の波長は、蛍光物質の励起に必要な波長とする。この励起光となるレーザ光は変調器１６によって強度変調され、周波数ｆの周期関数となる。ここでは、レーザ光の強度がコサイン関数となるように変調する。すなわち、強度変調の角周波数をω（＝２πｆ）、時間をｔとすると、励起光強度は１＋ｃｏｓ（ωｔ）に比例する。強度変調された励起光強度はωｔ＝２ｎπで最大となり、ωｔ＝（２ｎ＋１）πで最小となる（ｎは任意の自然数）。なお、初期位相は０としている。ここでは例えば、ｆ＝１００ｋＨｚで変調している。変調器１６には電気光学変調器や音響光学変調器等を用いることができる。

変調された励起光はレンズ１１で屈折され、ダイクロイックミラー１２に入射する。ダイクロイックミラー１２は特定の波長域の光のみを反射し、それ以外の波長の光を透過する。ここでは、レーザ光の波長の光を透過し、試料１４からの蛍光の波長の光を反射する。これにより、励起光と蛍光とが波長の差に基づいて分離される。一般に、蛍光はストークスシフトにより、励起光に比べて波長が長いため、ダイクロイックミラー１２を用いることにより、効率よく励起光と蛍光を分離することができる。もちろん、ダイクロイックミラー以外の光分離手段を用いて蛍光と励起光とを分離してもよい。例えば、フィルタとビームスプリッタとを組み合わせて用いることなどにより、蛍光と励起光とを分離することができる。

ダイクロイックミラー１２を透過した励起光は対物レンズ１３に入射する。対物レンズ１３は試料上あるいは試料内で結像するよう励起光を集光し、試料１４に入射させる。試料１４には例えば、免疫染色法により染色した生物試料を用いることができる。励起光が入射されると、その励起光に基づいて蛍光が発生する。ここで、蛍光の強度は励起光の強度に基づいたものとなる。蛍光は対物レンズ１３により屈折され、ダイクロイックミラー１２に入射する。ダイクロイックミラー１２では上述のように波長に応じて光を反射するため、試料１４で反射したレーザ光を反射し、蛍光のみを反射する。これにより、試料１４で反射された励起光と蛍光とを分離することができる。

ダイクロイックミラー１２で反射された蛍光はピンホール２１を通過して、検出器２２に入射する。なお、蛍光はピンホール２１で結像するよう、対物レンズ１３で屈折されている。検出器２２に入射する蛍光は、変調された励起光に基づくものとなる。検出器２２は光電子増倍管などのポイントセンサである。この検出器２２は受光した光の強度に応じた検出信号をロックインアンプ２３に出力する。ロックインアンプ２３は所定の繰り返し周波数をロックインして、検出器２２からの信号をロックイン検出する。ここで、ロックインアンプ２３には変調器１６からの参照信号が入力されており、変調器１６での変調周波数ｆのｎ倍（ｎは２以上の整数）の周波数で信号を検出する。例えば、変調周波数を１００ｋＨｚとした場合、２００ｋＨｚ、３００ｋＨｚ・・・の繰り返し周波数で検出が行われる。これにより、高次の周波数成分を抜き出して検出することができる。

ステージ１５は駆動機構を備えたＸＹＺステージであり、３次元方向に移動することができる。すなわち、ステージ１５は水平方向（ＸＹ方向）及び垂直方向（Ｚ方向）に移動可能に設けられている。このステージ１５を移動させながら、蛍光の検出を行う。例えば、試料１４にレーザ光を照射しながらステージ１５を一定速度で移動させ、試料１４と励起光の相対位置を変化させる。そして、試料１４の全面の走査を行う。処理装置２４はパーソナルコンピュータ等の処理装置であり、ステージ１５の移動を制御している。例えば、ステージ１５をＸ方向に移動させ、試料１４の一端から他端まで走査する。そして、Ｙ方向にステージをずらし、同様にＸ方向の走査を行う。これを繰り返し、試料１４内の１平面を走査したら、Ｚ方向にステージを移動させ、同様にＸＹ方向の走査を行う。すなわち、ステージ１５をＺ方向に移動させ、焦点位置を光軸方向にずらす。これにより、試料中の焦点位置が光軸方向に沿って移動し、試料の３次元観察が可能になる。このように、ステージ１５を駆動して、対物レンズ１３とステージ１５との間の距離を変えることによって、焦点位置を光軸に沿って変化させることができる。もちろん、ステージ１５ではなく、対物レンズ１３をＺ方向に移動してもよい。すなわち、対物レンズ１３とステージ１５の間の距離を遠ざける又は近づけることによって、焦点位置を光軸に沿って変化させることができる。このように、ＸＹ方向及びＺ方向の走査を繰り返し、試料１４の全体又は一部を３次元的に走査する。さらにＸＹ方向の走査は、ステージ１５の駆動に限らず、ガルバノミラーや音響光学素子などのビーム偏向装置でもよい。

また、処理装置２４は試料１４が走査されている間、ロックイン検出を行うようステージ１５及びロックインアンプ２３を制御する。さらに処理装置２４はロックインアンプから出力された信号に基づいて蛍光像を形成する。すなわち、試料１４が走査されている間検出された信号に基づいて蛍光像を形成する。処理装置２４で所定の操作を行うことにより、蛍光像を画面上に表示させたり、蛍光像のデータを記憶することができる。これにより、像の観察、撮像を行うことができる。

本実施の形態にかかる蛍光顕微鏡は共焦点顕微鏡を構成している。すなわち、点光源である光源１０と試料１４とが共役な結像関係になるように配置され、かつ試料１４とピンホール２１とが共役な結像関係となるように配置されている。これにより、共焦点光学系を介して蛍光を検出することができる。よって、空間分解能を向上することができる。

次に蛍光の飽和を利用した高分解能検出の原理について図２〜図４を用いて説明する。図２はレーザ光（励起光）及び蛍光の強度の空間分布を示す図である。図２において横軸は位置、縦軸は光の強度を示している。図３Ａ及び図３Ｂは変調したレーザ光（励起光）の強度及び蛍光の時間変化を示す図である。図３Ａ及び図３Ｂにおいて横軸は時間、縦軸は光の強度を示している。また、図２、図３Ａ及び図３Ｂにおいて、実線が励起光強度を示しており、破線が蛍光強度を示している。説明の明確化のため、図２、図３Ａ及び図３Ｂでは、蛍光の飽和が無い状態で、励起光と蛍光の強度が一致するものとして図示している。図４は励起光強度と蛍光強度の関係を示す図である。図４において、横軸は励起光強度、縦軸は蛍光強度を示している。

図２に示すようにレーザ光の強度はスポット中央（ｘ＝ａの位置）でピークとなり、スポット中央から離れるにしたがって強度が弱くなる。本実施の形態では、レーザ光を強度変調している。従って、ｘ＝ａの部位でのレーザ光強度の時間変化は図３Ａに示すようになり、ｘ＝ｂの部位でのレーザ光強度の時間変化は図３Ｂに示すようになる。すなわち、励起光が変調されているため、いずれの位置においても励起光はコサイン関数に応じて変化する。ここで、ｘ＝ａはピーク位置であり、ｘ＝ｂはピーク位置からずれた位置である。そのため、どのタイミングにおいてもｘ＝ａでの励起光強度はｘ＝ｂでの励起光強度よりも強くなる。

一般に、励起光の強度が大きくなると、蛍光の飽和が発生する。すなわち、図４に示すように励起光強度が弱いときは、励起光と蛍光が比例するが、励起光強度が強くなっていくと、励起光と蛍光とが比例しなくなる。これは、励起可能な分子数が限られており、吸収飽和のため、蛍光強度は頭打ちとなるからである。このように、励起光強度を大きくしても、得られる蛍光は比例して大きくならず、飽和するようになる。すなわち、蛍光の飽和が無ければ、図４の破線に示すように励起光強度に比例して蛍光強度が大きくなっていくが、実際には実線のように、ある励起光強度から飽和が発生し、頭打ちとなる。なお、本明細書において、蛍光の飽和とは励起光の強度と蛍光の強度との関係が線形の関係から離れることをいう。すなわち、図４において破線と実線とが離れる程度の励起光強度であれば蛍光の飽和が発生する。換言すると、蛍光の飽和が発生する飽和領域は、レーザ光の強度に対する励起光の強度の関係が非線形となる非線形領域となる。

このような蛍光の飽和は、励起光強度が大きいほど発生しやすい。さらに、励起光強度が大きいほど飽和の度合いが大きくなる。従って、図２に示す空間分布を有する励起光では、ピーク位置（ｘ＝ａ）に近いほど飽和しやすく、ピーク位置で蛍光が最も飽和の度合いが大きい。また、図３Ａ及び図３Ｂに示すようなコサイン関数に変調された励起光では、ピークとなる時間（ωｔ＝２ｎπ）に近いほど飽和しやすく、ピークとなる時間で蛍光が最も飽和しの度合いが大きい。

ここで、ｘ＝ｂの部位ではいずれの時間においても蛍光の飽和が発生せず、ピーク位置（ｘ＝ａ）の周辺で蛍光の飽和が発生する程度の強度を持つ励起光を試料１４に照射したものとする。これにより、図２に示す破線で示されるような強度分布となる蛍光が発生する。すなわち、図２では、ピーク位置（ｘ＝ａ）の近傍において、励起光と蛍光とで強度に差が生じ、ピーク位置から離れると励起光と蛍光とが略一致する。

さらに、変調された励起光に対する蛍光の強度は図３Ａの破線で示されたものとなる。すなわち、ｘ＝ａの部位では励起光が強いため、蛍光が飽和する。そして、図３Ａに示すように、蛍光の飽和はピークとなる時間（ωｔ＝２ｎπ）の周辺で発生し、ピークとピークの間の時間（ωｔ＝（２ｎ＋１）π）の周辺では発生しない。すなわち、図３Ａでは、ピークとなる時間の近傍において、励起光と蛍光とで強度に差が生じ、ピークとなる時間から離れると励起光と蛍光とが一致する。一方、ｘ＝ｂの部位では励起光が弱いため、いずれの時間においても蛍光の飽和が発生しない。そのため、蛍光強度と励起光強度が比例しており、図３Ｂではこれらが一致して図示されている。。

ｘ＝ｂの部位では蛍光強度が１＋ｃｏｓ（ωｔ）に比例したものとなる。一方、ｘ＝ａの部位では、蛍光の飽和により蛍光強度がピークとなる時間の周辺で弱くなっているため、１＋ｃｏｓ（ωｔ）に比例したものにはならない。すなわち、ｘ＝ａの部位では、蛍光強度に２次、３次、・・・の高調波成分が表れる。これらを検出することで、レーザ光のスポット中心部のみの情報を取り出すことが可能になる。すなわち、高周波成分にはレーザ光のスポット中心の情報が含まれている。

ところで、飽和が無い場合の蛍光の強度は、一般に、量子収率、検出系の検出感度、吸収断面積、励起光強度に比例する。よって、量子収率及び検出系の検出感度に基づく比例定数をＡ、吸収断面積をσ、自然放出係数をＣ、励起光強度をＢ_ｔとすると、蛍光の飽和を考慮したときの蛍光強度Ｉ_ｆは数式１で表される。

ここで励起光強度はコサイン関数となるよう変調されている。従って、励起光強度の最大値（励起光強度の振幅）をＢとすると、Ｂ_ｔ＝Ｂ（１＋ｃｏｓ（ωｔ））となる。よって、蛍光強度Ｉ_ｆは数式２のようになる。

ここで、数式２をテイラー展開すると数式３のようになる。

このように、Ｉ_ｆ＝はべき級数で表される。（１＋ｃｏｓ（ωｔ））^２にはｃｏｓ（２ωｔ）の項が、（１＋ｃｏｓ（ωｔ））^３にはｃｏｓ（３ωｔ）の項が表れる。従って、蛍光には（１＋ｃｏｓ（ωｔ））^ｎの項すなわち、ｃｏｓ（ｎωｔ）の高調波成分が表れる。よって、高次の変調周波数成分は励起光強度の振幅Ｂのべき乗に比例して得られることが分かる。

ここで、図３Ａの破線に示す蛍光強度をフーリエ変換して角周波数ωに対するスペクトルを求めると、その振幅スペクトルは図５に示すようになる。図５は蛍光の角周波数ωに対する振幅スペクトルを模式的に示す図である。蛍光は式３に示すように周期関数となるので、そのスペクトルは所定の角周波数にピークを持つ線スペクトルとなる。

上述のように蛍光には高調波成分が表れるので、ω、２ω、３ω、４ω・・・の位置にピークが表れる。ここで、ｎωの位置のピークの高さはＢ^ｎに比例する。例えば、ωの位置のピークはＢに比例し、２ωの位置のピークはＢ^２に比例する。またｎが大きくなるほど、ピークが低くなる。すなわち、最も高いピークはωの位置にあり、２番目に高いピークは２ωの位置にあり、３番目に高いピークは３ωの位置にある。

このような高調波成分を有する蛍光の空間分布及び高調波成分の空間分布を図６Ａ〜図６Ｃに示す。図６Ａは蛍光の空間分布を示す図であり、図２の破線で示した空間分布と同じものである。また、図６Ｂに蛍光の１次（ω）の周波数成分を示し、図６Ｃに蛍光の２次（２ω）の高調波成分を示している。図６Ｂに示す。図６Ａ〜図６Ｃにおいて、横軸は位置、縦軸は蛍光強度を示している。なお、説明の明確化のため、それぞれの図において、縦軸を異なるスケールで示している。

図６Ｂの空間分布は１次の周波数成分であるため、Ｂに比例する。また図６Ｃに示す空間分布は２次の高調波成分であるためＢ^２に比例する。従って、図６Ｂ及び図６Ｃに示すように２次の高調波成分の空間分布におけるピークの半値幅は１次の周波数成分よりも細くなる。同様にｎ次の高周波成分はＢ^ｎに比例するため、より高次の高調波成分ほど、ピークの半値幅が狭くなる。すなわち、高次の高調波成分ほど、ピークの幅が狭くなり、ピークが急峻になる。よって、より高次の高調波成分を検出すれば、実質的な蛍光スポットは点像分布関数のべき乗で得られ、空間分解能を向上することができる。検出する高調波成分の次数に比例して、空間分解能を向上することができる。なお、１次の周波数成分と全ての高調波成分を足し合わせたものは図６Ａに示すものとなる。また、図６Ｃに示す空間分布はそれぞれ蛍光の飽和成分に基づくものとなる。すなわち、高調波成分は蛍光の飽和成分に基づいてその空間分布が変化する。すなわち、蛍光の飽和成分の強度に応じて、高調波成分の強度が変化する。このように蛍光の飽和成分に基づいて試料を観察することにより、空間分解能を向上することができる。

高次の周波数成分を検出した場合の光学伝達関数の一例を図７に示す。図７に示すように、より高次になるほど空間分解能が向上する。なお、共焦点検出法と組み合わせることにより、さらなる空間分解能の向上が可能である。このように本実施の形態は、３次元の全ての方向に対して空間分解能を向上することができる。なお、本発明の検出方法を用いずに、共焦点検出法あるいは２光子蛍光を用いたものは２ωの光学伝達関数と略同じものとなる。

例えば、２次の高調波成分を検出することにより、１次の周波数成分を検出した場合と比べて２倍の空間分解能で検出することができる。このように２次、３次の高調波成分を検出することにより、空間分解能を２倍、３倍にすることができる。従って、回折限界を超えた空間分解能で検出することが可能になり、従来の蛍光顕微鏡に比べて高分解能で検出することができる。もちろん、ｎ次の高調波成分を検出することにより、空間分解能をｎ倍にすることができる。

上述のようにｎ次（ｎは２以上の自然数）の高調波成分を取り出して検出することにより、空間分解能を向上することができる。従って、ロックインアンプ２３で所定の周波数で固定して、ロックイン検出を行う。このとき、ロックインアンプ２３の検出周波数は、変調周波数のｎ倍（ｎは２以上の自然数）とする。また、励起光がピークとなる位相でロックインして検出を行う。これにより、高感度の検出を行うことができ、より高次の高調波成分を検出することができるようになる。従って、空間分解能をより向上することができる。このように、励起光の変調周波数の整数倍であるので、その周波数帯域を電気的にフィルタリングすれば、非常に高感度に高調波成分を取り出すことが可能になる。なお、ロックイン検出に限らず、ハイパスフィルタを用いて高調波を検出することも可能である。

なお、変調器１６での変調周波数は、試料１４の走査に比べて十分速いものとする。すなわち、蛍光像の１画素分を走査する時間に複数のピークが含まれるよう、変調周波数を高くする。例えば、蛍光像の１画素に対応する走査時間が１ｍｓｅｃとした場合、変調周波数を１００ｋＨｚとする。この場合、１画素を走査する時間内に励起光のピークが１００回出現する。変調周波数を試料の走査に比べて速くすることにより、１画素を走査する時間内に吸収飽和が発生する回数を増やすことができるので、正確に検出を行うことができる。

本発明では、蛍光が飽和の度合いが大きいほど、飽和を検出しやすくなり分解能を向上することができる。しかし、励起光強度を大きくするためレーザ光の強度（密度）を強くすると、試料の損傷及び蛍光の褪色が発生するおそれがある。この場合、光源にパルスレーザ光源を用いることが好ましい。この場合、例えば、図３の点線に示すコサイン関数が包絡線となり、励起光は、この包絡線に応じたパルス強度となる。パルスレーザ光源を用いることにより、吸収飽和に達する光強度（密度）を実現しながらも、全体の光照射量を低くすることができる。よって、試料の損傷及び蛍光の褪色を防ぐことができる。ここで、パルスレーザ光の繰り返し周波数は、変調周波数に比べて十分高いものとする。すなわち、変調の１周期の間に複数のパルスを含むよう、それぞれの周波数を設定する。例えば、変調周波数１００ｋＨｚの場合、繰り返し周波数８０ＭＨｚのものを用いることができる。この場合、１周期の間に８００パルスが含まれる。このようにパルスレーザ光の繰り返し周波数を変調周波数に比べて高くすることにより、正確に検出を行うことができる。

ここで、パルス幅が蛍光寿命に比べて十分短い場合、蛍光強度Ｉ_ｆは数式４に示すようになる。

ここで、Ｂ_ｔ＝Ｂ（１＋ｃｏｓ（ωｔ））であるため、数式４をテイラー展開すると数式５に示すようになる。

一般的な色素の場合、自然放出係数Ｃ≒１０^８であるため、パルスレーザ光を使用すると効率が増大することがわかる。

また、本発明では、蛍光プローブとして量子ドットを用いることが好適である。量子ドットは褪色に強く、大きな吸収断面積を有している。従って、吸収飽和に達する光強度を実現しつつ、試料の損傷及び蛍光の褪色を防ぐことが容易にできる。このように本発明では量子ドットにより標識することが好適である。なお、レーザ光を変調する関数は周期関数であれば、コサイン関数以外の関数でもよい。ここで、レーザ光の強度が最大となるタイミングでは、レーザ光強度を蛍光の飽和が生じる強度とする。すなわち、レーザ光が最大となるタイミングにおいて、蛍光の飽和が発生し、励起光と蛍光の関係が非線形となる非線形領域で、レーザ光が試料に照射されればよい。図１では落射照明型の蛍光顕微鏡を用いて説明したが、本発明は、透過照明型の蛍光顕微鏡に対して用いることもできる。
また、本実施の形態にかかる蛍光顕微鏡は、コンフォーカル光学系を有していない構成とすることも可能である。すなわち、ピンホール２１を取り除き、コンフォーカル顕微鏡ではない光学顕微鏡とすることも可能である。この場合、焦点位置以外からの蛍光は、レーザ光の密度が低いため蛍光の飽和が小さい。すなわち、焦点位置以外の箇所では、レーザ光強度が低く、蛍光が非線形領域でない線形領域となる。従って、焦点位置以外からの蛍光の、飽和成分が小さくなる。これにより、コンフォーカル光学系を用いない構成でも、Ｚ方向に分解能を向上することができる。すなわち、焦点位置から光軸方向にずれた位置では、蛍光が線形領域となる。そのため、蛍光の飽和が生ぜず、焦点位置及びその近傍のみからの情報を抽出することができる。これにより、コンフォーカル光学系を用いない簡易な構成で、３次元観察が可能になる。もちろん、コンフォーカル光学系を有する蛍光顕微鏡とすることにより、分解能をさらに向上することが可能になる。

発明の実施の形態２．
本実施の形態では実施の形態１と同様の構成の蛍光顕微鏡であるが、光源１０にパルスレーザ光源を用いている。そして、２光子励起光を用いて実施の形態１と同様に観察を行ことにより、空間分解能を向上させている。なお、実施の形態１と同様の構成については説明を省略する。

光源１０には例えば、モードロックチタンサファイアレーザ（波長７５０ｎｍ、パルス幅１００ｆｓ、繰り返し周波数８０ＭＨｚ）を用いている。そして、実施の形態１と同様に変調器１６を用いて強度変調する。変調器には電気光学変調器（ＥＯモジュレータ）を用い、１００ｋＨｚで変調している。実施の形態１で述べたように、パルスレーザ光の繰り返し周波数は、変調周波数に比べて十分高いものとしている。

２光子励起を用いると、光励起自体がレーザ焦点内部に局在化する。そのため、焦点面以外に蛍光発光を考慮する必要がなく、より高感度で吸収飽和を検出することができる。すなわち、２光子励起を用いることにより、観察面以外での光吸収を受けず、かつ１光子励起に比べ光散乱効率が１／１６と低いので光強度の調整を容易に行うことができる。これにより、試料内部を観察する際に、観察部位に到達するまでに光吸収や光散乱を受けることを防ぐことができる。さらに、２光子励起法に限らす２光子以上の多光子励起法を用いても同様の効果を得ることができる。

なお、実施の形態１と同様に量子ドットを蛍光プローブとして用いてもよい。これにより、吸収飽和に達する光強度を実現しつつ、試料の損傷及び蛍光の褪色を防ぐことが容易にできる。なお、本実施の形態にかかる蛍光顕微鏡は実施の形態１と同様に共焦点方式以外の蛍光顕微鏡に用いることも可能である。また、本発明にかかる蛍光顕微鏡において、強度変調及びロックイン検出を行わないようにすれば、通常の蛍光顕微鏡として用いることができる。よって、高分解能検出と、通常の検出との切り替えを容易に行うことができる。

発明の実施の形態３．
本実施の形態にかかる蛍光顕微鏡は、レーザ光を変調せずに、異なる強度のレーザ光を照射して、観察を行うものである。本実施の形態にかかる蛍光顕微鏡の基本的構成は、実施の形態１で示した蛍光顕微鏡と同様の構成を有しているので、説明を省略する。本実施の形態にかかる蛍光顕微鏡は、図１で示した蛍光顕微鏡で用いられている変調器１６が設けられていない構成を有している。そして、光源１０からレーザ光の強度を異なる強度で試料１４に照射する。このとき、異なる強度のレーザ光を試料１４に照射するために、光源１０の出力を変えてもよいし、ＮＤフィルタなどのフィルタを用いてレーザ光の強度を変えてもよい。また、２以上の光源を用いてもよい。さらには、これらを組み合わせて、レーザ光の強度を変えてもよい。なお、異なる強度のレーザ光は略同じ波長とする。

ここで、レーザ光の異なる強度を第１の強度及び第２の強度とする。すなわち、光源１０からのレーザ光は第１の強度及び第２の強度で試料１４に照射される。もちろん、第１の強度及び第２の強度以外の強度で試料１４にレーザ光を照射してもよい。すなわち、３以上の強度で試料１４にレーザ光を照射してもよい。ここで、第１の強度は第２の強度より、強い強度である。そして、少なくとも、第１の強度は蛍光の飽和が生じる強度とする。すなわち、第１の強度が用いられているとき、励起光と蛍光の関係が非線形となる非線形領域で、レーザ光が試料に照射される。もちろん、第２の強度を蛍光の飽和が生じる強度としてもよい。励起光となる光源１０からレーザ光を第１の強度で試料１４に照射したときに、試料１４からの蛍光は飽和が生じている。すなわち、図４に示したように、第１の強度が励起光と蛍光とが比例しなくなるような励起光強度となるように設定する。換言すると、第１の強度は、励起光と蛍光の関係が非線形となる非線形領域に対応する。ここで、第１の強度をＢ_１とし、第２の強度をＢ_２と設定する。そして、第1の強度Ｂ_１及び第２の強度Ｂ_２に対して試料１４の走査を行う。例えば、第１の強度Ｂ_１で試料１４の全体又は一部を走査した後、第２の強度Ｂ_２で試料１４の同じ部分を走査する。もちろん、順番は反対でもよい。これにより、第1の強度Ｂ_１及び第２の強度Ｂ_２のそれぞれについて、蛍光像を撮像することができる。すなわち、第1の強度Ｂ_１での蛍光像と、第２の強度Ｂ_２での蛍光像を撮像することができる。ここで、少なくとも第１の強度Ｂ_１での蛍光には、蛍光の飽和成分が含まれている。

次に、蛍光の飽和成分について解析的に求める方法について説明する。具体的には試料１４の同じ箇所における第１の強度Ｂ_１及び第２の強度Ｂ_２に対応する蛍光の強度に基づいて、その箇所における蛍光の飽和成分を算出する。まず、走査した部分内のある特定の点について考える。ここで、第１の強度Ｂ_１に対応する蛍光強度をＩ_ｆ１とし、第２の強度Ｂ_２に対応する蛍光強度をＩ_ｆ２とする。したがって、図４に示すよう横軸を励起光強度、縦軸を蛍光強度とするグラフにおいて、（Ｂ_１，Ｉ_ｆ１）及び（Ｂ_２，Ｉ_ｆ２）の座標に検出結果が存在する。さらに、励起光強度が０のとき、蛍光強度も０となる。よって、横軸を励起光強度、縦軸を蛍光強度とするグラフにおいて、（０，０）、（Ｂ_１，Ｉ_ｆ１）及び（Ｂ_２，Ｉ_ｆ２）の三点が存在する。この３点から蛍光の飽和成分を算出する。具体的には上記の３点に対して２次関数でフィッティングする。これにより、Ｉ_ｆ＝ｐＢ^２＋ｑＢ＋ｒとして算出される。ここで、２次関数で示されるＩ_ｆは、例えば、図４の実線で示すような関数と近似する。なお、Ｉ_ｆは蛍光強度、Ｂは励起光強度であり、ｐ、ｑ及びｒはフィッティングにより算出される係数である。なお、励起光強度が０のとき、蛍光強度も０となるため、理想的にはｒ＝０である。

ここで、Ｉ_ｆのうちＢの１乗の成分、すなわち、ｑＢは、蛍光と励起光が比例している成分を示している。具体的には、ｑＢは、図４における破線に基づくものとなる。また、Ｉ_ｆのうちＢの二乗すなわち、ｐＢ^２は、蛍光の飽和成分を示す。具体的には、ｐＢ^２は、図４における破線と実際の蛍光強度である実線との差を示している。より厳密にはｐＢ^２は、図４における破線と実際の蛍光強度である実線との差に基づくものである。すなわち、図４における破線と実際の蛍光強度である実線との差には、次数が３以上の項も含まれる。ここで、少なくとも第１の強度Ｂ_１は蛍光の飽和が生じる強度であるため、ｐ＝０とはならない。

３次元で走査した場合、このようにして算出したそれぞれの係数は（ｘ、ｙ、ｚ）の関数となる。すなわち、２次の係数ｐは蛍光の飽和成分の強度の空間分布を示したものとなる。したがって、蛍光の飽和成分の像はｐ（ｘ、ｙ、ｚ）で示される。すなわち、フィッティングした２次関数の２次の項の係数ｐにより蛍光の飽和成分の像が形成される。ここで、蛍光の飽和成分の像とは、試料１４を走査した場合の蛍光の飽和成分の強度の空間分布である。このようにして、蛍光の飽和成分の像を撮像することができる。この蛍光の飽和成分の像を観察することにより、空間分解能を向上することができる。そして、２次の項の係数に着目することにより２倍の空間分解能で観察することができる。

なお、上述の説明では、第１の強度及び第２の強度のみについて蛍光を検出したが、３以上のレーザ光強度について蛍光を検出してもよい。例えば、３以上のレーザ光強度について蛍光を検出した場合、３次関数でフィッティングを行うことができる。このとき、２次及び３次の項が蛍光の飽和成分を示すものとなる。ここで、３次の項に着目することにより、より空間分解能を向上することができる。すなわち、３次の項の係数に着目することにより、空間分解能を３倍にすることができる。

ｎ個のレーザ光強度で蛍光を検出することにより、ｎ次関数でフィッティングを行うことができる。そして、より高次の項に着目することにより、より空間分解能を向上することができる。すなわち、多項式の係数に着目した場合、多項式の次数に比例して、空間分解能を向上することができる。具体的にはｎ倍の空間分解能にすることができる。なお、この場合、２次以上の項の和が蛍光の飽和成分を示す。より正確に検出を行うには、レーザ光の強度を多数変化させて検出を行うことが好ましい。

なお、本実施の形態では、レーザ光を一定の強度に保った状態で、走査を行ったがこれに限るものではない。例えば、レーザ光の強度を変えながら走査を行ってもよい。この場合でも、２つの異なる強度で蛍光を検出することにより、励起光の強度に応じた蛍光の変化を２次関数でフィッティングすることができる。よって、蛍光の飽和成分に基づいて、試料１４を観察することができる。このように本実施の形態では、試料１４上の各箇所に対して、少なくとも２以上の強度でレーザ光を照射している。そして、２以上の次数の関数でフィッティングを行い、２以上の次数の項の係数を算出する。この係数の空間分布が、蛍光の飽和成分の像となる。これにより、蛍光の飽和成分に基づいて試料１４を観察することができる。

本実施の形態では、実施の形態１と比べて、異なる強度で２回走査を行う必要があるが、変調器やロックインアンプ等を設ける必要がないため、より簡易な構成とすることができる。

このように本発明では、励起光の強度が強くなると蛍光に飽和が生じるという点に着目し、蛍光の飽和成分に基づいて観察を行うことにより、空間分解能を向上することができる。このように、空間分解能を向上させることにより、試料１４内に蛍光物質が近接して存在する場合でも、それらを分離して観察を行うことができる。

本発明によれば、空間分解能を向上することができるため、医学、生物学研究等、様々な分野に適用することができる。

Claims (19)

1. 励起光となるレーザ光を出射するレーザ光源と、
   前記レーザ光を集光して試料に照射する対物レンズと、
   前記レーザ光により前記試料で発生した蛍光を検出する検出器と、
   前記レーザ光と前記試料との相対位置を変化させて走査を行う走査手段とを備え、
   前記レーザ光の強度が最大の時に、蛍光の飽和が生じることによってレーザ光の強度と蛍光の強度との関係が非線形になる非線形領域となるよう前記レーザ光の強度を変化させて試料に照射し、
   前記レーザ光の強度に応じた蛍光を前記検出器で検出し、前記蛍光の飽和成分に基づいて観察を行う蛍光顕微鏡。
2. 前記レーザ光の強度が時間に応じて変化するよう変調する変調器をさらに備え、
   前記レーザ光がピークとなる時間において蛍光が前記非線形領域となる強度で試料に照射され、
   前記変調器で変調しながら走査し、前記試料で発生した蛍光を前記検出器で検出し、
   前記検出器で検出された蛍光から、前記変調器での周波数に対する高調波成分を取り出して観察を行う請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
3. 前記高調波成分がロックインアンプにより取り出されている請求項３に記載の蛍光顕微鏡。
4. 前記レーザ光源にパルスレーザ光源を用いている請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
5. 前記レーザ光を、前記蛍光が前記非線形領域となる第１の強度と、前記第１の強度と異なる第２の強度の少なくとも２つの強度で前記試料に照射し、前記レーザ光が前記第１の強度及び前記第２の強度のそれぞれの強度で前記試料に照射された状態で走査を行い、前記第１の強度での蛍光の強度及び前記第２の強度での蛍光の強度に基づいて前記試料からの蛍光の飽和成分を算出する請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
6. 前記レーザ光源が多光子励起を発生させる多光子励起光源であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
7. 波長の差に基づいて前記レーザ光から蛍光を分離する分離手段をさらに備え、
   前記分離手段により分離された蛍光を前記検出器で検出する請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
8. 前記対物レンズの焦点位置を光軸方向に沿って変化させる焦点位置変化手段をさらに備える請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
9. 前記レーザ光を前記試料に照射することにより発生した蛍光をコンフォーカル光学系を介して前記検出器で検出する請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
10. 励起光であるレーザ光を試料に照射し、前記試料からの蛍光を検出して前記試料を観察する観察方法であって、
    前記レーザ光を集光して、前記試料に照射し、
    前記レーザ光の強度が最大の時に、前記レーザ光が前記試料の照射されて発生する蛍光が飽和してレーザ光の強度と蛍光の強度との関係が非線形になる非線形領域となるよう、前記レーザ光の強度を変化させて、
    前記試料と前記レーザ光との相対位置を変化させるよう走査し、
    前記レーザ光により試料で発生した蛍光をレーザ光と分離し、
    前記レーザ光から分離された蛍光を検出し、
    前記検出された蛍光から蛍光の飽和成分に基づいて観察を行う観察方法。
11. 前記レーザ光を時間に応じて強度が変化するよう変調して、前記レーザ光の強度を変化させ、
    前記変調されたレーザ光がピークとなる時間において蛍光が前記非線形領域となるよう、前記試料にレーザ光を集光して照射し、
    前記レーザ光を変調させている状態で、前記試料と前記レーザ光の相対位置を変化させるよう走査を行う請求項１０に記載の観察方法。
12. 前記検出された蛍光から、変調の周波数に対する高調波成分を取り出して観察を行う請求項１１に観察方法。
13. 前記レーザ光をパルスレーザ光とし、前記パルスレーザ光を強度変調している請求項１０に記載の観察方法。
14. 前記蛍光が前記非線形領域となる第１の強度と、前記第１の強度と異なる第２の強度の少なくとも２つの強度とで前記試料に照射されるよう前記レーザ光の強度を変化させ、
    前記第１の強度及び前記第２の強度のそれぞれの強度に対して、走査を行い、
    前記第１の強度での蛍光の強度及び前記第２の強度での蛍光の強度に基づいて蛍光の飽和成分を算出する請求項１０に記載の観察方法。
15. 多光子励起法により蛍光を検出していることを特徴とする請求項１０に記載の観察方法。
16. 前記試料が量子ドットで標識されている請求項１０に記載の観察方法。
17. 前記試料中における前記レーザ光の焦点位置を光軸方向に沿って変化させて、前記蛍光を検出する請求項１０に記載の観察方法。
18. 前記レーザ光を前記試料に照射することにより発生した前記蛍光をコンフォーカル光学系を介して検出する請求項１０に記載の観察方法。
19. 励起光となるレーザ光を出射するレーザ光源と、
    前記レーザ光を集光して試料に照射する対物レンズと、
    前記レーザ光により前記試料で発生した蛍光を検出する検出器と、
    前記レーザ光と前記試料との相対位置を変化させて走査を行う走査手段とを備え、
    前記レーザ光の強度が最大の時に、蛍光の飽和が生じるよう、前記レーザ光の強度を変化させて試料に照射し、
    前記レーザ光の強度に応じた蛍光を前記検出器で検出し、前記蛍光の飽和成分に基づいて観察を行う蛍光顕微鏡。

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