JPWO2005063293A1 - Ｓｒ蛋白質のリン酸化制御方法、および、ｓｒ蛋白質の活性制御剤を有効成分とする抗ウイルス剤 - Google Patents

Ｓｒ蛋白質のリン酸化制御方法、および、ｓｒ蛋白質の活性制御剤を有効成分とする抗ウイルス剤 Download PDF

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Abstract

本願発明は、（１）ＳＲ蛋白質の活性を低減又は阻害することによる抗ウイルス剤、より具体的には、（i）ＳＲ蛋白質の脱リン酸化を促進させることによる抗ウイルス剤、及び（ii）ＳＲ蛋白質をリン酸化させる蛋白質を阻害することによる抗ウイルス剤、更に（２）ＳＲ蛋白質の発現を阻害することによる抗ウイルス剤、並びに、（３）ＳＲ蛋白質と逆の機能をする蛋白質を活性化することによる抗ウイルス剤を提供する。また本発明は、ＳＲ蛋白質をリン酸化させるＳＲＰＫを阻害する化合物を提供する。これらの化合物は、ＳＲ蛋白質の活性を阻害し抗ウイルス作用を示す。本発明は、ＳＡＲＳをはじめ、種々の新規なウイルスの出現に伴い、新規なウイルスにも対応できる、適用性が広く、しかも、持続性の高い抗ウイルス剤を提供する。

Description

本発明は、遺伝子発現過程におけるスプライシング反応に関与しているSR蛋白質のリン酸化制御に関する。さらにウイルス等の感染による慢性および急性疾患の治療及び予防に有用なSR蛋白質の活性制御、発現制御および安定化制御方法並びにＳＲ蛋白質の活性制御剤を有効成分とする抗ウイルス剤に関する。さらに本発明は、SR蛋白質の活性制御および抗ウイルス療法に有用な化合物およびそれらの利用に関する。
これまでウイルスの複製を阻害すると報告されている数多くの抗ウイルス剤は、ウイルスプロテアーゼやウイルスの持つ逆転写酵素などを標的としたものであった。
例えば、HIVウイルスについて言えば、ＨＩＶのゲノムの特性をターゲットにする手法が用いられている。ＨＩＶは、逆転写酵素によりＨＩＶのＲＮＡゲノムがＤＮＡ（プロウイルス）に変換されて宿主染色体に組み込まれ、次に、プロウイルスＤＮＡから宿主細胞の転写、翻訳機構によりウイルスのタンパク質が生産され、これらのタンパク質は大きなポリプロテイン前駆体として転写され、プロテアーゼにより蛋白分解されてはじめて、ウイルスが再構成され、成熟する。そこでＨＩＶの阻害剤については、このようなＨＩＶの成熟過程のそれぞれをターゲットに、（１）レトロウイルス特有の逆転写酵素をターゲットとするＡＺＴ等（非特許文献１）、（２）プロテアーゼを阻害するプロテアーゼ阻害剤（非特許文献２）が研究開発されてきた。
しかしながら、いずれも種々のウイルスの増殖過程を特異的に攻撃する個別的に対応の抗ウイルス剤であった。
Proc Natl Acad Sci USA Vol.86, No.21, pp.8333-7 Antimicrob Agents Chemother. 1995 Jul;39(7):1559-64
ウイルス特にＲＮＡウイルスは、突然変異速度が速いため、これまで開発されたウイルスプロテアーゼやウイルスの持つ逆転写酵素などを標的とした抗ウイルス剤は、有効性が失われることも早く、更なる、効果的な抗ウイルス剤の開発が望まれてきた。
特に、最近、ＳＡＲＳをはじめ、種々の新規なウイルスの出現に伴い、新規なウイルスにも対応できる、適用性が広く、しかも、持続性の高い抗ウイルス剤の開発を課題とする。
本発明者らは、従来から、遺伝子発現系に関与するＳＲタンパク質のリン酸化に関する研究を行ってきた。特にＳＲタンパク質をリン酸化する酵素である、SRPK2（Biochem. Biophys. Res. Commun. 242, 357-364）、線虫のSRPK相同分子であるSPK1（Mech. Dev.. 99, 51-64）、ｈPRP4（J. Biol. Chem. 277, 44220-44228）、およびＳＲタンパク質リン酸化酵素Clk4の制御因子CLASP（J. Biol. Chem. 276, 32247-32256）は本発明者が世界で初めてクローニングしたものである。
ＳＲ蛋白質は、SerineとArginineに富むRNA結合蛋白質で、通常１ないし２ケ所のRNA認識モチーフ(RNA-recognition motifs; RRM)とRSの連続配列に富むRS(Arginine/Serine-rich)ドメインを共通に持ち、真核生物におけるRNAプロセッシング、特に、pre-mRNAのスプライシングに重要な役割を果たしている。
哺乳類のSR蛋白ファミリーとして、X16/SRp20, SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, 9G8, HRS/SRp40, SRp46, SRp55, SRp75, p54の１０種類のRNA結合蛋白が報告されている。SR タンパク質の多くが細胞内でリン酸化を受けていることが示されており、特にSR タンパク質のひとつである SF2/ASF は、ペプチドマッピングによる解析から、RSドメイン内の複数の部位でリン酸化されている（J. Cell. Biol.(1991) 115: 587-596）ことが確認されている。また SF2/ASFのU1snRNPへの選択的結合能は、リン酸化によって高まる（Genes & Dev. (1997) 11: 334-344）ことが知られている。RSドメインのリン酸化と脱リン酸化が、スプライソゾームの形成と組み換えに必要で、これを阻害すると、mRNAのプロセシングに異常を来す。上述したように、RSドメインはRNA結合蛋白のみならず、核内で機能すると目される様々な機能蛋白に見い出され、それらはSR関連蛋白ファミリー(SR-related protein family)と名付けられている（Biochem. Cell Biol. (1999) 77: 277-291）。
本発明者らは、ウイルスに感染した細胞中のＳＲファミリータンパク質のリン酸化状態を研究中に偶然にも、ウイルス感染した細胞中ではＳＲタンパク質のリン酸化が抑えられ、ユビキチン・プロテアソーム経路を介して分解されることを発見した。逆に、SRp４０又はSRp７５などのＳＲタンパク質、又はＳＲタンパク質リン酸化酵素のSRPK1又はSRPK2を強制的に発現させたところ、ＳＲタンパク質が安定化されウイルス産生が増加するという現象を見出した。このことは、ＳＲタンパク質がウイルス複製に重要な役割を担っており、ＳＲタンパク質の脱リン酸化は、生体内のウイルス侵入に対する防御システムであることを示している。
SR蛋白はU1snRNPやU2AFと結合しスプライソゾームの形成に必要だが、その蛋白間相互作用にRSドメインが大きな役割を果たしていると考えられている。また、SR蛋白（はスプライス部位の選択に影響を与え、イントロンに近位の3’スプライス部位の選択を促進するのに対し、逆にhnRNP A1、 A2、 B1などのheteronuclear ribonucleoproteins (hnRNPs)は遠位の3’スプライス部位の選択を促す。従って細胞内のSR蛋白とhnRNP蛋白の量比によって、スプライス部位が決められている可能性がある。
そこで、本発明者らは、ウイルスの複製に重要な役割を果たしていることが分かったＳＲタンパク質を対象とした抗ウイルス剤を開発し、提供したものである。
具体的には、まず、ＳＲ蛋白質のリン酸化酵素を阻害することによるＳＲ蛋白質の阻害を試みた。
これまでSRPKの活性を阻害する低分子量化合物は知られていなかったところ、SRPKを標的とした低分子量化合物のスクリーニングを行い、結果として下記の式で表されるSRPIN-1（SR protein phosphorylation inhibitor 1）(化合物番号340とも表す) がリン酸化酵素SRPKの阻害活性を有することを見出した。
（ＩＶ）
そこで、SRPIN-1を用いてSRPKの酵素活性を阻害することで、SR蛋白質のリン酸化を阻害し、結果としてHIVのウイルス複製を阻害できると推測した。MT-4細胞とHIVウイルスを用いた感染実験において、SRPIN-1の濃度を変えてウイルス複製を抑制できるか検討したところ、SRPIN-1は顕著にHIVウイルスの複製を抑制することを見出した。
さらに本発明者らは、複数のSRPIN-1類縁体を合成し、その効果を調べたところ、SRPIN-1と同様にSRPK阻害活性および抗ウイルス作用を示すことが示された。従って、SRPIN-1およびそれらの類縁体はSRPK阻害剤として有用であり、さらに抗ウイルス剤として用いることができる。
すなわち本発明は、SR蛋白質の活性を制御するSR活性制御剤を有効成分として含有する抗ウイルス剤、抗ウイルス剤のスクリーニング方法、およびSRPKを阻害する活性を有する化合物、およびその利用などに関し、より具体的には請求項の各項に記載の発明に関する。すなわち本発明は、
〔１〕ＳＲ蛋白質の活性を制御するＳＲ活性制御剤を有効成分として含有する抗ウイルス剤、
〔２〕ＳＲ蛋白質が、SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, HRS/SRp40, SRp46, 又はSRp75のいずれかである、前記〔１〕に記載の抗ウイルス剤、
〔３〕ＳＲ活性制御剤がＳＲ蛋白質の脱リン酸化を促進する物質又は組成物である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の抗ウイルス剤、
〔４〕フォスファターゼ２Ａ（Phosphatase 2A）を活性化する活性化剤である、前記〔３〕に記載の抗ウイルス剤、
〔５〕HIVのtat遺伝子又はアデノウイルスのE4-ORF4遺伝子又はワクシニアウイルスのＶＨ１遺伝子を載せた遺伝子治療用の発現ベクターである、前記〔４〕に記載の抗ウイルス剤、
〔６〕ＳＲ活性制御剤がＳＲＰＫを阻害する物質である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の抗ウイルス剤、
〔７〕ＳＲＰＫがＳＲＰＫ１またはＳＲＰＫ２である、前記〔６〕に記載の抗ウイルス剤、
〔８〕ＳＲ活性制御剤がＳＲＰＫ遺伝子の発現阻害剤である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の抗ウイルス剤、
〔９〕ＳＲＰＫ遺伝子の発現阻害剤が、ＳＲＰＫに対するmiRNA又はsiRNA又はモルフォリノオリゴ、あるいは該miRNAまたはsiRMAの発現ベクターである、前記〔８〕に記載の抗ウイルス剤、
〔１０〕ＳＲ活性制御剤がＳＲ蛋白質の活性と逆の活性を有する物質である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の抗ウイルス剤、
〔１１〕ＳＲ蛋白質の活性と逆の活性を有する物質がhnRNPA1発現ベクターである、前記〔１０〕に記載の抗ウイルス剤、
〔１２〕ウイルスが、（１）ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、重症急性呼吸器症候群（SARS）、ポリオウイルス、ヒトライノウイルス、成人T細胞白血病ウイルス（HTLV-I）、Ａ型、Ｃ型、Ｄ型又はＥ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、ヒトコロナウイルス、エボラ出血熱ウイルス、インフルエンザウイルス、若しくはシンドビスウイルスのいずれかのＲＮＡ型ウイルス、又は（２）単純ヘルペスウイルス、ヒトアデノウイルスを含め、B型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス、天然痘ウイルス、ポリオーマウイルス、若しくはヒトパピローマウイルスのいずれかのDNA型ウイルスである、前記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の抗ウイルス剤、
〔１３〕試験化合物をＳＲＰＫに作用させる工程、及びＳＲＰＫのＳＲ蛋白質をリン酸化する能力を検定する工程、および該能力を阻害する化合物を選抜することを含む、抗ウイルス剤のスクリーニング方法、
〔１４〕SR タンパク質又はArg-Ser（RS）若しくはSer-Arg（SR）の２回以上連続するペプチドをSRPKの基質としてＳＲ蛋白質をリン酸化する能力を検定する工程を含む、前記〔１３〕に記載のスクリーニング方法、
〔１５〕前記〔１３〕又は〔１４〕の方法により得られた化合物を製剤化する工程を含む、抗ウイルス剤の製造方法、
〔１６〕下記一般式（Ｉ）
（Ｉ）
（式中、Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ2-6アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アジド基、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキルチオ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキルスルホニル基、カルボキシル基、ホルミル基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルコキシカルボニル基、アシル基、アシルアミノ基、またはスルファモイル基を示し；
Ｒ2は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、または置換基を有していてもよいアリール基を示し；
Ｒ3は、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、置換基を有していてもよい含窒素複素環、または置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環を示し；
Ｒ4は、水素原子又はハロゲン原子を示し；
Ｑは、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＳＯ2−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｓ）−を示し；
Ｗは、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキルチオ基、置換基を有していてもよい含窒素複素環、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環、または下記一般式（ＩＩ）
（ＩＩ）
（式中、Ｒ5およびＲ6は、互いに同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよい含窒素複素環、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環、アシル基、もしくはアシルアミノ基を示し；または、
前記Ｒ5およびＲ6は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換基を有していてもよい複素環を形成していてもよく、該複素環は、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環であってもよく；
前記Ｒ5およびＲ6は、置換基を有していてもよいシクロアルキリデンアミノ基または置換基を有していてもよい芳香族環縮合シクロアルキリデン基であってもよい、）で表されるアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物、
〔１７〕前記Ｒ1が、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、またはハロゲン原子である、前記〔１６〕に記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物、
〔１８〕前記Ｒ2が、水素原子またはＣ1-6アルキル基である、前記〔１６〕または〔１７〕に記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物、
〔１９〕前記Ｒ3が、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、または置換基を有していてもよい５〜１０員含窒素ヘテロアリール基である、前記〔１６〕〜〔１８〕のいずれかに記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物、
〔２０〕前記Ｒ4が、水素原子である、前記〔１６〕〜〔１９〕のいずれかに記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物、
〔２１〕前記Ｗが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式（ＩＩ）
（ＩＩ）
（式中、Ｒ5およびＲ6は、互いに同一又は異なって、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基を示し；または、
前記Ｒ5およびＲ6は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換基を有していてもよいヘテロ環式基を形成していてもよく、該ヘテロ環式基は、置換基を有していてもよい縮合芳香族ヘテロ環式基であってもよい、）で表される、前記〔１６〕〜〔２０〕のいずれかに記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物、
〔２２〕前記〔１６〕〜〔２１〕のいずれかに記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物を有効成分として含有する、ＳＲＰＫ阻害剤、
〔２３〕前記〔１６〕〜〔２１〕のいずれかに記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物を有効成分として含有する、抗ウイルス剤、に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の１つまたは複数の組み合わせからなる発明は、それらの請求項に記載の発現に既に意図されている。
以下に、本明細書において記載する用語、記号等の意義を説明し、本発明を詳細に説明する。
本明細書における「Ｃ１−６アルキル基」とは、炭素数１〜６個の脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される一価の基である、炭素数１〜６個の直鎖状または分枝鎖状のアルキル基を意味し、具体的には例えば、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基、２−メチル−１−プロピル基、２−メチル−２−プロピル基、１−ブチル基、２−ブチル基、１−ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、２−メチル−１−ブチル基、３−メチル−１−ブチル基、２−メチル−２−ブチル基、３−メチル−２−ブチル基、２，２−ジメチル−１−プロピル基、１−へキシル基、２−へキシル基、３−へキシル基、２−メチル−１−ペンチル基、３−メチル−１−ペンチル基、４−メチル−１−ペンチル基、２−メチル−２−ペンチル基、３−メチル−２−ペンチル基、４−メチル−２−ペンチル基、２−メチル−３−ペンチル基、３−メチル−３−ペンチル基、２，３−ジメチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−１−ブチル基、２，２−ジメチル−１−ブチル基、２−エチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−２−ブチル基、２，３−ジメチル−２−ブチル基等があげられる。
本明細書における「Ｃ２−６アルケニル基」とは、炭素数２〜６個の直鎖状または分枝鎖状のアルケニル基を意味し、具体的には例えば、ビニル基、アリル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等があげられる。
本明細書における「Ｃ２−６アルキニル基」とは、炭素数２〜６個の直鎖状または分枝鎖状のアルキニル基を意味し、具体的には例えば、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等があげられる。
本明細書における「Ｃ１−６アルコキシ基」とは前記定義の「Ｃ１−６アルキル基」が結合したオキシ基であることを意味し、具体的には例えば、メトキシ基、エトキシ基、１−プロピルオキシ基、２−プロピルオキシ基、２−メチル−１−プロピルオキシ基、２−メチル−２−プロピルオキシ基、１−ブチルオキシ基、２−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、２−ペンチルオキシ基、３−ペンチルオキシ基、２−メチル−１−ブチルオキシ基、３−メチル−１−ブチルオキシ基、２−メチル−２−ブチルオキシ基、３−メチル−２−ブチルオキシ基、２，２−ジメチル−１−プロピルオキシ基、１−へキシルオキシ基、２−へキシルオキシ基、３−へキシルオキシ基、２−メチル−１−ペンチルオキシ基、３−メチル−１−ペンチルオキシ基、４−メチル−１−ペンチルオキシ基、２−メチル−２−ペンチルオキシ基、３−メチル−２−ペンチルオキシ基、４−メチル−２−ペンチルオキシ基、２−メチル−３−ペンチルオキシ基、３−メチル−３−ペンチルオキシ基、２，３−ジメチル−１−ブチルオキシ基、３，３−ジメチル−１−ブチルオキシ基、２，２−ジメチル−１−ブチルオキシ基、２−エチル−１−ブチルオキシ基、３，３−ジメチル−２−ブチルオキシ基、２，３−ジメチル−２−ブチルオキシ基等があげられる。
本明細書における「Ｃ１−６アルキルチオ基」とは前記定義の「Ｃ１−６アルキル基」が結合したチオ基であることを意味し、具体的には例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、１−プロピルチオ基、２−プロピルチオ基、ブチルチオ基、ペンチルチオ基等があげられる。
本明細書における「Ｃ１−６アルコキシカルボニル基」とは前記定義の「Ｃ１−６アルコキシ基」が結合したカルボニル基であることを意味し、具体的には例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、１−プロピルオキシカルボニル基、２−プロピルオキシカルボニル基等があげられる。
本明細書における「Ｃ１−６アルキルスルホニル基」とは前記定義の「Ｃ１−６アルキル基」が結合したスルホニル基であることを意味し、具体的には例えば、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基、１−プロピルスルホニル基、２−プロピルスルホニル基等があげられる。
本明細書における「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味する。
本明細書中における「Ｃ６−１０アリール基」とは、炭素数６〜１０の芳香族性の炭化水素環式基をいい、具体的には例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基などが挙げられる。
本明細書中における「複素環」とは、環を構成する原子中に１〜２個のヘテロ原子を含有し、環中に二重結合を含んでいてもよく、非芳香族性の環または芳香族性の環を意味する。
本明細書中における「含窒素複素環」とは、環を構成する原子中に１〜２個の窒素原子を含有し、環中に二重結合を含んでいてもよく、非芳香族性の環または芳香族性の環を意味する。
本明細書における「ヘテロ原子」とは、硫黄原子、酸素原子または窒素原子を意味する。
本明細書における「５〜１０員含窒素ヘテロアリール環」とは、環を構成する原子の数が５ないし１０であり、環を構成する原子中に少なくとも１個の窒素原子を含み、さらに１または複数個の窒素原子以外のヘテロ原子を含有してもよい、芳香族性の環を意味する。
具体的には例えば、ピリジン環、ピロール環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、インドール環、イソインドール環、イミダゾール環、トリアゾール環、ピラゾール環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環、キノリン環、イソキノリン環、ベンズイミダゾール環などがあげられる。
当該「５〜１０員ヘテロアリール環」において好ましくは、ピリジン環、ピロール環、イミダゾール環をあげることができ、より好ましくはピリジン環をあげることができる。
本明細書における「５〜１０員含窒素ヘテロアリール基」とは、前記「５〜１０員ヘテロアリール環」から任意の位置の水素原子を１または２個除いて誘導される一価または二価の基を意味する。具体的には、ピリジル基、ピロリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、ピラゾリル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、ベンズイミダゾリル基が挙げられる。
本明細書における「４〜８員ヘテロ環」とは、
１．環を構成する原子の数が４ないし８であり、
２．環を構成する原子中に１〜２個のヘテロ原子を含有し、
３．環中に二重結合を１〜２個含んでいてもよく、
４．環中にカルボニル基を１〜３個含んでいてもよい、
５．単環式である非芳香族性の環を意味する。
４〜８員ヘテロ環としては、ヘテロ原子として窒素原子を含有する４〜８員含窒素ヘテロ環が好ましい。
４〜８員ヘテロ環として具体的には例えば、アゼチジン環、ピロリジン環、ピペリジン環、アゼパン環、アゾカン環、テトラヒドロピラン環、モルホリン環、チオモルホリン環、ピペラジン環、チアゾリジン環、ジオキサン環、イミダゾリン環、チアゾリン環などが挙げられる。当該「４〜８員ヘテロ環」において好ましくは、ピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、ピペラジン環が挙げられる。
本明細書における「４〜８員ヘテロ環式基」とは、前記「４〜８員ヘテロ環」から任意の位置の水素原子を１または２個除いて誘導される一価または二価の基を意味する。４〜８員ヘテロ環式基としては、具体的には例えば、アゼチジニル基、ピロリジニル基、ピペリジニル基、アゼパニル基、アゾカニル基、テトラヒドロピラニル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、ピペラジニル基、チアゾリジニル基、ジオキサニル基、イミダゾリル基、チアゾリル基などが挙げられる。
本明細書における「縮合芳香族複素環」とは、その複素環部がベンゼン環などの芳香族環とオルソ縮合している環状構造を意味し、複素環部は上記定義の複素環である。
本明細書における「縮合芳香族ヘテロ環式基」とは、そのヘテロ環式部がベンゼン環などの芳香族環とオルソ縮合している環状構造を意味し、ヘテロ環式部は上記定義のヘテロ環式基である。
たとえば、インドリニル基、イソインドリニル基、１，２，３，４−テトラヒドロキノリンなどが挙げられる。
本明細書における「ハロゲン化Ｃ１−６アルキル基」とは前記定義「Ｃ１−６アルキル基」中の任意の少なくとも１つの水素原子を、前記定義「ハロゲン原子」で置換した基を意味する。たとえば、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基などが挙げられる。
本明細書における「置換基を有していてもよい」とは、置換可能な部位に、任意に組み合わせて１または複数個の置換基を有してもよいことを意味する。当該置換基とは具体的には例えば、以下の置換基Ａ群から選ばれる基をあげることができる。
[置換基Ａ群]
ハロゲン原子、水酸基、メルカプト基、ニトロ基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、オキソ基、イミノ基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基
本明細書における「塩」とは、本発明に係る化合物と塩を形成し、かつ薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩などがあげられる。
無機酸塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などがあげられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などがあげられる。
無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられ、有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩などがあげられる。
酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられ、塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などがあげられる。
また、本発明の化合物は、大気中に放置しておくことにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となったりする場合があり、そのような水和物も本発明に包含される。
さらに、本発明の化合物は、他のある種の溶媒を吸収し、溶媒和物となる場合があるが、そのような塩も本発明に包含される。
また本発明において「遺伝子」とは、転写単位をセンスまたはアンチセンスにコードするDNAまたはRNAを言う。転写単位とは、一続きに転写される配列を言う。ある蛋白質をコードする核酸（DNAまたはRNA）は、本発明においてその蛋白質の遺伝子とも言う。
また、本明細書において、「または」という用語は非排他的に用いられる。例えば「A、B、またはC」は、A、B、またはCのいずれかの要素を少なくとも含むことを意味しているに過ぎず、A、B、およびCの2つ以上または3つ全てを含むもの、およびそれ以外の要素を含むものも含まれる。
また本明細書において表１から表３に示した化合物は、化合物番号で表わす場合もある。これらの化合物は、化合物番号を引用して「GIF-」として表記されることもある。
本発明により、SRPIN-1（SR protein phosphorylation inhibitor 1）およびその類縁体がリン酸化酵素SRPKの阻害活性を有することが明らかにされた。SR蛋白質はSRPKによるリン酸化によって細胞中で安定に存在しているが、SRPIN-1またはその類縁体等によってSRPKの酵素活性を阻害すると、SR蛋白質のリン酸化が阻害され、ユビキチン・プロテアソーム経路を介して分解されることを見出した。そこでSRPIN-1およびその類縁体を添加してSRPKの阻害を試みたところ、HIV感染実験ではこれらの化合物にウイルス複製を抑制する抗ウイルス作用を有することを見出した。
更に、本発明は、ＳＲ蛋白質の活性を制御することにより、同一のメカニズムで、広範囲なウイルスに対して有効な抗ウイルス剤を提供するという効果を奏するものである。
「ＨＩＶ感染細胞におけるＳＲ蛋白質のリン酸化」 ｐＮＬ４−３ゲノムを遺伝子導入したFlp-In-293細胞中のリン酸化ＳＲ蛋白質を、抗リン酸化ＳＲ蛋白質マウスモノクロナール抗体（Mab104）、抗ＳＣ３５マウス抗体、及び抗ＳＦ２マウス抗体を用いたウエスタン解析より調べた。 「ＳＲ蛋白質の分解」 Flp-In-293細胞に、HAタグを融合したSRp75, SRp55, SRp40遺伝子のプラスミド遺伝子導入し、MG132(474790; CALBIOCHEMより購入)を終濃度(10μM)で加えた。細胞を溶解して熱変性を行い、蛋白質サンプルとしSDS-PAGEを行い、ウサギ抗HA抗体を一次抗体、ロバ抗ウサギIgG抗体を二次抗体としてウエスタン解析した。 「SRPK2安定的発現細胞におけるＳＲ蛋白質のリン酸化」 Flp-In-293細胞にマウスSRPK2遺伝子を導入したSRPK2安定的発現細胞（SRPK2-2）及び親株Flp-In293（mock）の2つの細胞にpNL4-3を遺伝子導入して、4日後にHIV感染における内在性SR蛋白質の動態を図1Aと同様にウエスタン解析により調べた。 「SRPK2安定的発現細胞におけるＳＲ蛋白質の存在」 図２Ａと同じmockとSRPK2-2細胞に、HIVpNL4-3ゲノムと、HAタグを融合したSRp75, SRp55, SRp40遺伝子のプラスミドを遺伝子導入し、36時間後にサンプルを回収して、ウエスタン解析を行った。 「HIVの産生量を測定」 上記図2Aの場合の培養上清を回収してHIVの産生量を測定した。 「in vivoでのHIVの産生に寄与するSR蛋白質の検討」 Mock、SC35、SF2、SRp40、SRp55、SRp75発現プラスミドを各々Flp-In293細胞に遺伝子導入し、36時間後に培養上清を回収し、ルミパルスELISAシステムを用いてHIVp24の量を測定した。 「hnRNPA1を用いた、in vivoにおけるHIV産生への効果の検討」 一定量(500ng)のSRp40、SRp75発現プラスミドに加えて、hnRNPA1発現プラスミドの量を段階的に増やしてFlp-In293細胞へ遺伝子導入を行った。36時間後に培養上清を回収し、ルミパルスELISAシステムを用いてHIVp24の量を測定した。 「細胞内SR蛋白質のリン酸化を阻害するための、SRPKの阻害剤の探索」 SRPIN-1(SRPk Inhibitor-1)の構造式 「SRPIN-1を用いたSRPK1のリン酸化活性の阻害の検討」 SF2のRSドメインに相当するRSペプチドを、10mM Tris-HCl(pH 7.5)で1mg/mlになるように溶解した。SRPK1蛋白質を1μg用いて、反応バッファー（250μM MgCl2、0.25mM ATP、1 mCi [γ-32P] ATP、SRPIN-1終濃度0.1、0.3、1.0、3.0、10.0μM）中で30℃の湯浴で10分間インキュベートし、反応液をP81フォスフォセルロースメンブレン（P81; Whatman）に滴下し、５％リン酸溶液で洗浄した。洗浄後、P81メンブレンの32Pについての放射活性を液体シンチレーションカウンターによって測定した。 「SRPIN-1を用いたin vivoにおけるSR蛋白質のリン酸化阻害と、それに伴うSR蛋白質分解の誘導の検討」 Flp-In293細胞にHA-SRp75プラスミドを遺伝子導入して、36時間後にMG132(終濃度10μM)、SRPIN-1(10、20、50μM)をそれぞれ添加して15時間インキュベートした。その後、細胞を溶解して、SDS-PAGEして、抗HA抗体を用いたウエスタン解析を行った。また蛋白質量のコントロールとして抗βアクチン抗体を用いてウエスタン解析を行った。 「SRPIN-1の添加による、HIV感染の阻害の検討」 MT-4細胞に、293T細胞で調製したHIVビリオンを添加すると同時に、SRPIN-1（終濃度0.5、10、20μM）を添加した。2時間37℃5% CO2の培養条件下でインキュベートした後、細胞を遠心して培養液に交換後、48時間後に培養上清を回収してルミパルスELISAシステムによってHIVp24の量を測定した。 「SRPIN-1およびその類縁体によるSRPK阻害活性の検討」 SRPIN-1（化合物番号340）およびその類縁体（化合物番号341〜349、608〜626）のSRPK1およびSRPK2のリン酸化活性に対する阻害効果を定量した。 「SRPIN-1およびその類縁体によるHIV複製の抑制効果」 HIV複製に対するSRPIN-1およびその類縁体の抑制効果を、MT-4細胞でアッセイした結果を示す。 「SRPIN-1およびその類縁体によるHIV複製の抑制効果」 Jurkat細胞を用いて、図５Ｂと同様にHIV複製に対するSRPIN-1およびその類縁体の抑制効果を測定した結果を示す。 「シンドビスウイルスに対するSRPIN-1の抗ウイルス作用」 シンドビスウイルスを感染させた細胞の位相差顕微鏡像を示した。SRPIN-1非投与の細胞では、シンドビスウイルスの増殖による細胞傷害が顕著に認められたが、SRPIN-1の投与により細胞傷害は劇的に抑制された。 「シンドビスウイルスに対するSRPIN-1の抗ウイルス作用」 シンドビスウイルスを感染させた細胞のプラークアッセイの結果を示した。5μM以上のSRPIN-1はシンドビスウイルスの増殖を有意かつ濃度依存的に抑制した。 「サイトメガロウイルスに対するSRPIN-1およびその類縁体の抗ウイルス作用」 サイトメガロウイルスを感染させた細胞の位相差顕微鏡像を示した。対照群の細胞(図中の1および２)はサイトメガロウイルス感染に特有の形態変化と細胞死が高率に観察されたのに対し、SRPIN-1またはその類縁体 (化合物番号349) を添加 (20μl) した細胞(図中の3および5)においては、サイトメガロウイルス感染による異常な形態変化や細胞死は抑制された。 「SARSウイルスに対するSRPIN-1およびその類縁体の抗ウイルス作用」 SARSウイルスを感染させた細胞のプラークアッセイの結果を示した。SARSウイルスの感染により細胞死したプラーク数をカウントし、SRPIN-1およびその類縁体の抗ウイルス作用を検討した（プラークアッセイ）。その結果、図８Ａに示したように、40μMのSRPIN-1およびその類縁化合物(化合物番号349)はSARSウイルスの増殖を有意に抑制した。また図８Ｂに示したように、SRPIN-1は1μMから40μMの濃度範囲において濃度依存的にSARSウイルスの増殖を抑制することが判明した。
本願発明者等は、ＳＲ蛋白質をリン酸化するＳＲＰＫ酵素を阻害することにより、ＨＩＶの複製を阻害することができることから、この現象を広く応用することにより、広範なウイルスに対して、抗ウイルス剤を提供できるかを検討した。
Ｉ．ＳＲ蛋白質 活性の低減：分解と安定化
（１）本願発明者等は、細胞のＨＩＶウイルスによる感染とＳＲ蛋白質のリン酸化状態及びＳＲ蛋白質の細胞での存在の有無の関係について調べた。具体的には、NL4-3タイプのHIVウイルスを293細胞に感染させた後、ＳＲ蛋白質に対する抗体及びリン酸化されたＳＲ蛋白質に対する抗体によって、細胞中のリン酸化された蛋白質と細胞中でのＳＲ蛋白質（全量）を調べた。
また、ＳＲ蛋白質をリン酸化するＳＲＰＫを強制的に発現させた細胞へのＨＩＶウイルスによる感染と同細胞内のＳＲ蛋白質のリン酸化状態及びＳＲ蛋白質の細胞での存在の有無の関係についても調べた。具体的には、上記と同様に、NL4-3タイプのHIVウイルスをＳＲＰＫ−２を強制的に発現させた293細胞に感染させた後、ＳＲ蛋白質に対する抗体及びリン酸化されたＳＲ蛋白質に対する抗体によって、同細胞中のリン酸化された蛋白質と細胞中でのＳＲ蛋白質（全量）を調べた。
上記の結果から、ＳＲ蛋白質はリン酸化されることで細胞中で安定化するが、逆に、ＳＲ蛋白質を脱リン酸化させることにより、ＳＲ蛋白質を分解させることができることが分かった。
さらに、検証のため、本願発明者等は、ＳＲ−ＨＡ融合蛋白質を２９３細胞内に発現させ、ユビキチン・プロテアソーム阻害剤であるMG132の添加の有無により、抗ＨＡー抗体に反応する融合ＳＲ−ＨＡのシグナル強度を測定したところ、ＭＧ１３２により、蛋白質分解が抑制されていることが見られたので、SR蛋白質は、ユビキチン・プロテアソーム経路を介して分解されることがわかった。
すなわちウイルス感染に応答して、宿主は防御機構としてSR蛋白質の分解を行うと推測された。しかしSR蛋白質のリン酸化酵素を強制発現した状態では、SR蛋白質はリン酸化されることで分解されずに安定化され、防御機構を破綻してウイルス産生の昂進に寄与することを見出した。
つまり、ＳＲ蛋白質は、脱リン酸化されることで、ユビキチン・プロテアソーム経由で分解されてしまうことが分かった。ＳＲ蛋白質は、遺伝子転写に必須であるから、ＳＲ蛋白質を脱リン酸化することにより、ウイルスの増殖阻害ができることが分かった。
（２） 次に、ＳＲ蛋白質のリン酸化酵素の阻害を検討した。 SR蛋白質のリン酸化を担うリン酸化酵素としてはSRPK1/2、Clk/Sty family kinase、PRP4、DNA topoisomerase I などが候補と考えられているが、スプライシングにおける各々の機能差については不明な点が多い。そこで、本願発明者等は、ＳＲＰＫを阻害することによる、ウイルス感染細胞からのウイルス産生状態を、ＳＲＰＫ阻害剤であるSRPIN-1を用いて調べた。
すると、SRPIN-1によるSRPKの阻害が、積極的なSR蛋白質の分解を引き起こすことを見出した。
（３） 更に、またHIVの感染と同時に、スプライシングを促進するSR蛋白質と、in vitroでは拮抗して働くことが知られているhnRNPA1を細胞に強制発現させたところ、SRp40とSRp75はHIV産生を更に昂進させ、hnRNPA1の量依存的にHIV産生を抑制することを初めてin vivo で見出した。
以上のように、ＳＲ蛋白質の脱リン酸化は、生体（人体）のウイルスに対する防御反応であり、既に、アデノウイルス及びワクシニアウイルスについては、動物細胞に感染後、当該動物細胞内でのＳＲ蛋白質が脱リン酸化されることは確かめられており（Nature Vol.393,pp.185-187, EMBO Rep Vol.3,pp.1088-1093）、上記のように脱リン酸化されると、ＳＲ蛋白質は速やかに分解され、ウイルスの遺伝子の発現に利用できなくなり、結局これらのウイルスも、増殖できないものと考えられる。
本発明者らは、HIVとは異なるウイルスであるシンドビスウイルス、サイトメガロウイルス、およびSARSコロナウイルスにおいても、SRPK阻害剤によるSR蛋白質の活性抑制が、HIVと同様にウイルス増殖を抑制することを確認した。従って、ＳＲ蛋白質の活性を制御することによる抗ウイルス作用は、広範なウイルスに対して有効であるといえる。
II.本願発明には、ＳＲ蛋白質の活性を制御することによる、抗ウイルス剤、ウイルス産生阻害方法、及びウイルス病治療方法が包含される。本願発明には、ＳＲ蛋白質活性制御剤を有効成分として含む抗ウイルス剤が包含される。ここで、ＳＲ蛋白質の活性の制御には、発現制御および安定化制御も含まれる。例えば、SR蛋白質の転写または翻訳を抑制したり、あるいはSR蛋白質をコードするmRNAの安定性またはSR蛋白質の安定性を低下させることにより、SR蛋白質の活性を低下させることができる。好ましくは、本発明におけるSR蛋白質の活性の制御においては、SR蛋白質の活性または発現量を直接または間接に低下させるSR蛋白質の活性抑制剤が用いられる。SR蛋白質の活性または発現量を低下させるためには、SR蛋白質を直接標的とする以外に、例えばSRPKによるSR蛋白質のリン酸化を抑制および/または脱リン酸化を促進することも好ましい。例えばプロテインフォスファターゼ2A（フォスファターゼ2Aとも記す）を活性化することにより、SR蛋白質の脱リン酸化が促進される。従って、プロテインフォスファターゼ2Aの発現および/または活性を上昇させる化合物を用いてウイルスの増殖を抑制することができる。また、SRPKの発現および/または活性を阻害することにより、SR蛋白質のリン酸化を阻害することができる。従ってSRPKの阻害剤は、本発明における好適な抗ウイルス剤となる。
［制御対象ＳＲ蛋白質］
なお、本願発明で活性を低減又は阻害させるべきＳＲ蛋白質は、任意のＳＲ蛋白質、すなわち、X16/SRp20, SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, 9G8, HRS/SRp40, SRp46, SRp55, SRp75, 及びp54が含まれるが、好適には、SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, HRS/SRp40, SRp46, 及び SRp75,であり、特に好適には、ＳＲｐ４０及びＳＲｐ７５である。以下でＳＲ蛋白質というときは、SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, HRS/SRp40, SRp46, 又はSRp75を意味する。
X16/SRp20をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number L10838 の1-492に示されている。またX16/SRp20のアミノ酸配列は、Accession number NP_003008、AAA36648 に示されている（Zahler, A. et al., 1992, SR proteins: a conserved family of pre-mRNA splicing factors, Genes Dev. 6:837-847）。SF2/ASF/SRp30aをコードする遺伝子配列は、例えば Accession number NM_006924 の91-834に示されている。またSF2/ASF/SRp30aのアミノ酸配列は、Accession number NP_008855、Q07955 に示されている（Ge, H. et al., Cell 66, 373-382 (1991)）。SC35/PR264/SRp30bをコードする遺伝子配列は、例えば Accession number M90104 の156-818に示されている。またSC35/PR264/SRp30bのアミノ酸配列は、Accession number AAA60306、Q01130 に示されている（Fu, X.D. and Maniatis, T. Science 256, 535-538 (1992)）。SRp30cをコードする遺伝子配列は、例えば Accession number U30825 の53-715、NM_003769の147-809に示されている。またSRp30cのアミノ酸配列は、Accession number AAA93069、Q13242、NP_003760 に示されている（Screaton, G. R. et al., EMBO J. 14, 4336-4349 (1995)）。9G8をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number NM_006276の54-464に示されている。また9G8のアミノ酸配列は、Accession number NP_006267、Q16629等に示されている（Lejeune, F. et al., J. Biol. Chem. 276, 7850-7858 (2001); Popielarz, M. et al., J. Biol. Chem. 270, 17830-17835 (1995); Cavaloc, Y. et al., EMBO J. 13, 2639-2649 (1994)）。HRS/SRp40をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number AF020307（join(2406-2531, 2864-2925, 3049-3147, 3433-3503, 4740-4812, 5269-5382, 5472-5492)）、アミノ酸配列は、Accession number AAC39543、Q13243等に示されている（Du, K. and Taub, R., Gene 204 (1-2), 243-249 (1997); Screaton, G.R. et al., EMBO J. 14, 4336-4349 (1995)）。SRp46をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number AF031166の1-816に示されている。またSRp46のアミノ酸配列は、Accession number AAK54351等に示されている（Soret, J. et al., Mol. Cell. Biol. 18, 4924-4934 (1998)）。SRp55をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number U30883の106-1137に示されている。またSRp55のアミノ酸配列は、Accession number AAA93073, Q13247等に示されている（Screaton, G.R. et al., EMBO J. 14, 4336-4349 (1995); Zahler,A.M. et al., Genes Dev. 6, 837-847 (1992); Barnard, D.C. and Patton,J.G., Mol. Cell. Biol. 20, 3049-3057 (2000)）。SRp75をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number BC002781の98-1579、NM_005626の98-1579に示されている。またSRp75のアミノ酸配列は、Accession number AAH02781、NP_005617、Q08170等に示されている（Zahler, A.M. et al., Mol. Cell. Biol. 13, 4023-4028 (1993)）。p54をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number M74002の84-1535に示されている。またp54のアミノ酸配列は、Accession number AAA35554、Q05519等に示されている（Chaudhary,N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 8189-8193 (1991)）。
［対象ウイルス］
本発明の抗ウイルス剤は、特にHIVの増殖阻害に好適であるが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に限らず、RNA型ウイルスに属する重症急性呼吸器症候群（SARS）、ポリオウイルス、ヒトライノウイルス、成人T細胞白血病ウイルス（HTLV-I）、Ａ型、Ｃ型、Ｄ型又はＥ型等のＢ型以外の肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、ヒトコロナウイルス、エボラ出血熱ウイルス、インフルエンザウイルス、シンドビスウイルスを含めたウイルスについても、同様の効果を有する。なお、ヒトコロナウイルスには、SARSコロナウイルス（SARS-associated coronavirusまたはSARSウイルスとも言う）が含まれる。
またDNA型ウイルスである単純ヘルペスウイルス、ヒトアデノウイルスについても感染にともなう宿主の防御機構としてSR蛋白質の脱リン酸化が報告されていることから、SRPIN-1の効果は単純ヘルペスウイルス、ヒトアデノウイルスを含め、B型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス、天然痘ウイルス、ポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルスについても、同様の抗ウイルス活性を有する。
本発明において、特に好適な標的となるウイルスとしては、レトロウイルス科ウイルス（Retroviridae；レンチウイルス属ウイルスを含む）、トガウイルス科ウイルス（Togaviridae；アルファウイルス属ウイルスを含む）、ヘルペスウイルス科ウイルス（Herpesviridae；サイトメガロウイルスを含む）、コロナウイルス科ウイルス（Coronaviridae；コロナウイルス属ウイルスを含む）が挙げられる。
［抗ウイルス剤］
本願発明には、（１）ＳＲ蛋白質の活性を低減又は阻害することによる抗ウイルス剤、より具体的には、（i）ＳＲ蛋白質の脱リン酸化を促進させることによる抗ウイルス剤、及び（ii）ＳＲ蛋白質をリン酸化させる蛋白質を阻害することによる抗ウイルス剤が包含される。
更に、本願発明には、（２）ＳＲ蛋白質の発現を阻害することによる抗ウイルス剤、並びに、（３）ＳＲ蛋白質と逆の機能をする蛋白質を活性化することによる抗ウイルス剤が包含される。
特に本発明は、SRPKの活性および/または発現を阻害する化合物を含む抗ウイルス剤に関する。SRPKを活性および/または発現を阻害することにより、SR蛋白質の安定化に貢献するリン酸化を抑制し、結果としてSR蛋白質の分解を促進してSR蛋白質の活性を低下させる。従って、SRPK（SRPK1および/またはSRPK2）は、本発明において特に好適な阻害の標的である。
［ウイルス産生阻害方法］
また、本願発明には、（１）ＳＲ蛋白質の活性を低減又は阻害することによるウイルスの産生阻害方法、より具体的には、（i）ＳＲ蛋白質の脱リン酸化を促進させることによるウイルスの産生阻害方法、及び（ii）ＳＲ蛋白質をリン酸化させる蛋白質を阻害することによるウイルスの産生阻害方法が包含される。特に本発明は、SRPKの活性および/または発現を阻害する工程を含むウイルスの産生阻害方法に関する。SRPKを阻害することにより、SR蛋白質のリン酸化が阻害され、SR蛋白質レベルが低下しSR蛋白質の活性は低下する。
更に、本願発明には、（２）ＳＲ蛋白質の発現を阻害することによるウイルスの産生阻害方法、並びに、（３）ＳＲ蛋白質と逆の機能をする蛋白質を活性化することによるウイルスの産生阻害方法が包含される。
すなわち本発明は、以下の発明も包含する。
〔M1〕SR蛋白質の活性または発現量を低下させる工程を含む、ウイルス増殖を抑制する方法。
〔M2〕SR蛋白質が、SF2/ASF/SRp30a、SC35/PR264/SRp30b、SRp30c、HRS/SRp40、SRp46、またはSRp75である、〔M1〕に記載の方法。
〔M3〕SR蛋白質の活性または発現量の低下させる工程が、SR蛋白質のリン酸化を抑制または脱リン酸化を促進する工程である、〔M1〕または〔M2〕に記載の方法。
〔M4〕SR蛋白質のリン酸化を抑制または脱リン酸化を促進する工程が、プロテインフォスファターゼ2A（Protein Phophatase 2A）の活性を上昇させる工程である、〔M3〕に記載の方法。
〔M5〕プロテインフォスファターゼ2A（Protein Phophatase 2A）の活性を上昇させる工程が、HIVのtat遺伝子、アデノウイルスのE4-ORF4遺伝子、およびワクシニアウイルスのVH1遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を発現するベクターを導入する工程である〔M4〕に記載の方法。
〔M6〕SR蛋白質のリン酸化を抑制または脱リン酸化を促進する工程が、SRPKの発現または活性を阻害する工程である、〔M3〕に記載の方法。
〔M7〕SRPKがSRPK1またはSRPK2である、〔M6〕に記載の方法。
〔M8〕SRPKの発現または活性を阻害する工程が、下記一般式で表されるアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物を投与する工程である、〔M6〕または〔M7〕に記載の方法。
（Ｉ）
上記式中、R1、R2、R3、R4、Q、およびWは、本明細書上記〔１６〕の通りである。
〔M9〕前記R1が、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、またはハロゲン原子である、〔M8〕に記載の方法。
〔M10〕前記R2が、水素原子またはＣ1-6アルキル基である、〔M8〕または〔M9〕に記載の方法。
〔M11〕前記R3が、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、または置換基を有していてもよい５〜１０員含窒素ヘテロアリール基である、〔M8〕から〔M10〕のいずれかに記載の方法。
〔M12〕前記R4が、水素原子である、〔M8〕から〔M11〕のいずれかに記載の方法。
〔M13〕前記Wが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式（ＩＩ）
（ＩＩ）
（式中、R5およびR6は、上記の通り）で表される、〔M8〕から〔M12〕のいずれかに記載の方法。
〔M14〕〔M8〕に記載のアニリン誘導体が、本明細書に記載の化合物番号３４０、３４８、６１３、６１６、６１８、６２２、６２４からなる群より選択される、〔M8〕に記載の方法。
〔M15〕SRPKの発現または活性を阻害する工程が、SRPKに対するmiRNA、siRNA、モルフォリノオリゴ、または該miRNAまたはsiRMAの発現ベクターを導入する工程である、〔M6〕に記載の方法。
〔M16〕SR蛋白質の活性または発現量を低下させる工程が、SR蛋白質と逆の活性を有する物質を投与する工程である、〔M1〕または〔M2〕に記載の方法。
〔M17〕SR蛋白質の活性と逆の活性を有する物質が、hnRNP A1発現ベクターである、〔M16〕に記載の方法。
〔M18〕ウイルスが、（１）ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、重症急性呼吸器症候群（SARS）、ポリオウイルス、ヒトライノウイルス、成人T細胞白血病ウイルス（HTLV-I）、Ａ型、Ｃ型、Ｄ型又はＥ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、ヒトコロナウイルス、エボラ出血熱ウイルス、インフルエンザウイルス、若しくはシンドビスウイルスのいずれかのＲＮＡ型ウイルス、又は（２）単純ヘルペスウイルス、ヒトアデノウイルスを含め、B型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス、天然痘ウイルス、ポリオーマウイルス、若しくはヒトパピローマウイルスのいずれかのDNA型ウイルスである、〔M1〕から〔M17〕のいずれかに記載の方法。
〔M19〕〔M8〕に記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物を投与する工程を含む、SRPKを阻害する方法。
〔M20〕SRPKがSRPK1またはSRPK2である、〔M19〕に記載の方法。
〔M21〕前記R1が、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、またはハロゲン原子である、〔M19〕または〔M20〕に記載の方法。
〔M22〕前記R2が、水素原子またはＣ1-6アルキル基である、〔M19〕から〔M21〕のいずれかに記載の方法。
〔M23〕前記R3が、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、または置換基を有していてもよい５〜１０員含窒素ヘテロアリール基である、〔M19〕から〔M22〕のいずれかに記載の方法。
〔M24〕前記R4が、水素原子である、〔M19〕から〔M23〕のいずれかに記載の方法。
〔M25〕前記Wが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式（ＩＩ）
（ＩＩ）
（式中、R5およびR6は、上記の通り）で表される、〔M19〕から〔M24〕のいずれかに記載の方法。
〔M26〕〔M8〕に記載のアニリン誘導体が、本明細書に記載の化合物番号３４０、３４８、６１３、６１６、６１８、６２２、６２４からなる群より選択される化合物、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物である、〔M19〕に記載の方法。
さらに本発明は、SR蛋白質の発現および/または活性を低下させる化合物の、ウイルス増殖の阻害のための使用、および抗ウイルス剤（ウイルス増殖を抑制するための試薬および/または医薬）の製造における使用にも関する。具体的には本発明は、以下の発明にも関する。
〔U1〕SR蛋白質の活性または発現量を低下させる化合物の、ウイルス増殖を抑制するための使用、または抗ウイルス剤の製造における使用。
〔U2〕SR蛋白質が、SF2/ASF/SRp30a、SC35/PR264/SRp30b、SRp30c、HRS/SRp40、SRp46、またはSRp75である、〔U1〕に記載の使用。
〔U3〕SR蛋白質の活性または発現量の低下させる化合物が、SR蛋白質のリン酸化を抑制または脱リン酸化を促進する化合物である、〔U1〕または〔U2〕に記載の使用。
〔U4〕SR蛋白質のリン酸化を抑制または脱リン酸化を促進する化合物が、プロテインフォスファターゼ2A（Protein Phophatase 2A）の活性を上昇させる化合物である、〔U3〕に記載の使用。
〔U5〕プロテインフォスファターゼ2A（Protein Phophatase 2A）の活性を上昇させる化合物が、HIVのtat遺伝子、アデノウイルスのE4-ORF4遺伝子、およびワクシニアウイルスのVH1遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を発現するベクターである、〔U4〕に記載の使用。
〔U6〕SR蛋白質のリン酸化を抑制または脱リン酸化を促進する化合物が、SRPKの発現または活性を阻害する化合物である、〔U3〕に記載の使用。
〔U7〕SRPKがSRPK1またはSRPK2である、〔U6〕に記載の使用。
〔U8〕SRPKの発現または活性を阻害する化合物が、下記一般式で表されるアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物である、〔U6〕に記載の使用。
（Ｉ）
上記式中、R1、R2、R3、R4、Q、およびWは、本明細書上記〔１６〕の通りである。
〔U9〕前記R1が、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、またはハロゲン原子である、〔U8〕に記載の使用。
〔U10〕前記R2が、水素原子またはＣ1-6アルキル基である、〔U8〕または〔U9〕に記載の使用。
〔U11〕前記R3が、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、または置換基を有していてもよい５〜１０員含窒素ヘテロアリール基である、〔U8〕から〔U10〕のいずれかに記載の使用。
〔U12〕前記R4が、水素原子である、〔U8〕から〔U11〕のいずれかに記載の使用。
〔U13〕前記Wが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式（ＩＩ）
（ＩＩ）
（式中、R5およびR6は、上記の通り）で表される、〔U8〕から〔U12〕のいずれかに記載の使用。
〔U14〕〔U8〕に記載のアニリン誘導体が、本明細書に記載の化合物番号３４０、３４８、６１３、６１６、６１８、６２２、６２４からなる群より選択される、〔U8〕に記載の使用。
〔U15〕SRPKの発現または活性を阻害する化合物が、SRPKに対するmiRNA、siRNA、モルフォリノオリゴ、または該miRNAまたはsiRMAの発現ベクターである、〔U6〕に記載の使用。
〔U16〕SR蛋白質の活性または発現量を低下させる化合物が、SR蛋白質と逆の活性を有する物質である、〔U1〕または〔U2〕に記載の使用。
〔U17〕SR蛋白質の活性と逆の活性を有する物質が、hnRNP A1発現ベクターである、〔U16〕に記載の使用。
〔U18〕ウイルスが、（１）ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、重症急性呼吸器症候群（SARS）、ポリオウイルス、ヒトライノウイルス、成人T細胞白血病ウイルス（HTLV-I）、Ａ型、Ｃ型、Ｄ型又はＥ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、ヒトコロナウイルス、エボラ出血熱ウイルス、インフルエンザウイルス、若しくはシンドビスウイルスのいずれかのＲＮＡ型ウイルス、又は（２）単純ヘルペスウイルス、ヒトアデノウイルスを含め、B型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス、天然痘ウイルス、ポリオーマウイルス、若しくはヒトパピローマウイルスのいずれかのDNA型ウイルスである、〔U1〕〜〔U17〕のいずれかに記載の使用。
〔U19〕〔U8〕に記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物の、SRPKを阻害するための使用、またはSRPK阻害剤の製造における使用。
〔U20〕SRPKがSRPK1またはSRPK2である、〔U19〕に記載の使用。
〔U21〕前記R1が、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、またはハロゲン原子である、〔U19〕または〔U20〕に記載の使用。
〔U22〕前記R2が、水素原子またはＣ1-6アルキル基である、〔U19〕から〔U21〕のいずれかに記載の使用。
〔U23〕前記R3が、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、または置換基を有していてもよい５〜１０員含窒素ヘテロアリール基である、〔U19〕から〔U22〕のいずれかに記載の使用。
〔U24〕前記R4が、水素原子である、〔U19〕から〔U23〕のいずれかに記載の使用。
〔U25〕前記Wが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式（ＩＩ）
（ＩＩ）
（式中、R5およびR6は、上記の通り）で表される、〔U19〕から〔U24〕のいずれかに記載の使用。
〔U26〕〔U8〕に記載のアニリン誘導体が、本明細書に記載の化合物番号３４０、３４８、６１３、６１６、６１８、６２２、６２４からなる群より選択される化合物、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物である、〔U19〕に記載の方法。
［治療方法］
本願発明には、（１）ＳＲ蛋白質の活性を低減又は阻害することによるウイルス病の治療又は予防方法、より具体的には、（i）ＳＲ蛋白質を脱リン酸化させることによるウイルス病の治療又は予防方法、及び（ii）ＳＲ蛋白質をリン酸化させる蛋白質を阻害することによるウイルス病の治療方法が包含される。特に本発明は、SRPKの活性および/または発現を阻害する工程を含むウイルス病の治療又は予防方法に関する。SRPKを阻害することにより、SR蛋白質のリン酸化が阻害され、SR蛋白質レベルが低下することによりウイルス増殖が抑制される。
更に、本願発明には、（２）ＳＲ蛋白質の発現を阻害することによるウイルス病治療又は予防方法、並びに、（３）ＳＲ蛋白質と逆の機能をする蛋白質を活性化することによるウイルス病治療又は予防方法が包含される。
III.更に本願発明には、抗ウイルス剤のスクリーニング方法、並びにＳＲＰＫ酵素阻害剤の利用が含まれる。
［抗ウイルス剤のスクリーニング方法］
更に本願発明には、（１）SR タンパク質若しくはRS又はSRの２回以上連続するペプチドをSRPKの基質としてSRPK阻害剤をスクリーングする方法が包含される。
［ＳＲＰＫ酵素阻害剤及びその利用］
更に、本願発明には、（１）SRPIN-1またはその類縁体を有効成分として含むＳＲＰＫ酵素阻害剤、（２）SRPIN-1またはその類縁体を有効成分として含むウイルス増殖阻害剤、及び（３）SRPIN-1またはその類縁体を有効成分として含む抗ウイルス治療薬が包含される。
IV.本願発明の具体的開示
（１）ＳＲ蛋白質の活性を低減又は阻害する抗ウイルス剤
(i)ＳＲ蛋白質を脱リン酸化させることによる抗ウイルス剤
ＳＲ蛋白質を脱リン酸化させることによる抗ウイルス剤としては、Phosphatase 2A（Mumby, M.C. and Walter, G. (1993) Physiol. Rev. 73, 673-680; Lechward, K., Awotunde, O. S., Swiatek, W. and Muszynska, G. (2001) Acta Biochim. Pol. 48, 921-933; Cohen, P. (1989) The structure and regulation of protein phosphatases. Annu. Rev. Biochem. 58, 453-508; Janssens, V. and Goris, J. (2001) Biochem. J. 353, 417-39）を活性化する活性化剤が含まれ、具体的には、HIVのtat遺伝子がコードするポリペプチド（例えば、Accession number AAK08486）、又はアデノウイルスのE4-ORF4がコードするポリペプチド（例えば、Accession number AAB37507）、又はワクシニアウイルスのＶＨ１がコードするポリペプチド（例えば、Accession number AAV38329）が含まれる。さらに、HIVのtat遺伝子又アデノウイルスのE4-ORF4遺伝子又はワクシニアウイルスのＶＨ１遺伝子を載せた遺伝子治療用の発現ベクターが含まれる。tat遺伝子としては、Accession number AF324493のCDS (5830-6044 プラス 8369-8411)、E4-ORF4としては、Accession number S82508のCDS（1634-1993）、ワクシニアウイルスVH1としては、Accession number BT019522のCDS（1-555）が例示できる。
(ii)ＳＲ蛋白質のリン酸化酵素阻害剤
（ii−１）ＳＲ蛋白質をリン酸化する酵素としては、既に種々のリン酸化酵素が知られているが、これらの酵素は、ＲＳドメインのリン酸化部位が異なると考えられており、これらＲＳリン酸化酵素のうち、ＳＲ蛋白質の安定化に寄与する特定のリン酸化を行いうる酵素としては、ＳＲＰＫのみであることを本発明者らは発見した。そこで、ＳＲ蛋白質のリン酸化による安定化を防ぐために、標的とするＳＲ蛋白質をリン酸化する酵素としては、ＳＲ蛋白質のリン酸化酵素の内、特に、ＳＲＰＫがあげられ、ＳＲＰＫとしては、ＳＲＰＫ１（Nature(1994) Vol.369,pp.678-682）及びＳＲＰＫ２(Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) Vol.242:pp.357-364; Wang, H.Y. et al., J. Cell. Biol. 1998, 140:737-750)の両者を挙げることができる。SRPK1遺伝子の塩基配列は、Accession number NM_003137の124-2088、U09564の109-2073、AJ318054の10-2487、NM_016795の43-1986等を、アミノ酸配列はNP_003128、AAA20530、CAC39299、CAA11833、NP_058075等を参照することができる。またSRPK2遺伝子の塩基配列は、Accession number U88666の188-2245、NM_009274の208-2253等を、アミノ酸配列はAAC05299、NP_033300等を参照することができる（Nikolakaki,E. et al., J. Biol. Chem. 276, 40175-40182 (2001); Papoutsopoulou,S., et al., Nucleic Acids Res. 27, 2972-2980 (1999); Wang,H.Y. et al., Genomics 57, 310-315 (1999); Gui,J.F. et al., Nature 369, 678-682 (1994); Wang,H.Y.et al., J. Cell Biol. 140, 737-750 (1998); Papoutsopoulou,S. et al., Nucleic Acids Res. 27, 2972-2980 (1999); Kuroyanagi,N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 242, 357-364 (1998); Bedford,M.T. et al., EMBO J. 16, 2376-2383 (1997)）。SRPK1には、SRPK1aと表記されるものも含む。
本願発明の方法で用いるリン酸化酵素（ＳＲＰＫ）を阻害する機能を有する物質としては、次の一般式で示される化合物（ＳＲＰＩＮ−１及びその類縁体を含む）、およびそれらの医薬上許容される塩および水和物を用いることができる。
（Ｉ）
（式中、R1は、水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、置換基を有していてもよいC2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいC2-6アルキニル基、置換基を有していてもよいC6-10アリール基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アジド基、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよいC1-6アルコキシ基、置換基を有していてもよいC1-6アルキルチオ基、置換基を有していてもよいC1-6アルキルスルホニル基、カルボキシル基、ホルミル基、置換基を有していてもよいC1-6アルコキシカルボニル基、アシル基、アシルアミノ基、またはスルファモイル基を示し；
R2は、水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、または置換基を有していてもよいアリール基を示し；
R3は、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、置換基を有していてもよいC2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいC6-10アリール基、置換基を有していてもよい含窒素複素環、または置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環を示し；
R4は、水素原子又はハロゲン原子を示し；
Qは、−C(O)−、−C(S)−、−SO2−、−C(S)NHC(O)−、−C(O)NHC(O)−、または−C(O)NHC(S)−を示し；
Wは、水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、置換基を有していてもよいC6-10アリール基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよいC1-6アルコキシ基、置換基を有していてもよいC1-6アルキルチオ基、置換基を有していてもよい含窒素複素環、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環、または下記一般式（ＩＩ）
（ＩＩ）
（式中、R5およびR6は、互いに同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、置換基を有していてもよい含窒素複素環、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環、アシル基、もしくはアシルアミノ基を示し；または、
前記R5およびR6は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換基を有していてもよい複素環を形成していてもよく、該複素環は、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環であってもよく；
前記R5およびR6は、置換基を有していてもよいシクロアルキリデンアミノ基または置換基を有していてもよい芳香族環縮合シクロアルキリデン基であってもよい。）。
上記化合物の一例としては、以下の化合物が例示できる。
（ＩＩＩ）
Ｘとしては、F、Cl、Br、I又はAtを挙げることができる。
具体的には、下記のSRPIN-1を挙げることができる。
（ＩＶ）
本発明のSRPIN-1は、Maybridge社（Trevillett, Tintagel, Cornwall PL34 OHW, England）およびAmbinter社（46 quai Louis Bleriot, Paris, F-75016 France）より入手できるが、概略次のように化学合成することができる。
（ii−２）ＳＲＰＫ１遺伝子及びＳＲＰＫ２遺伝子に対するRNAｉを利用する抗ウイルス剤
細胞内でのＳＲＰＫ１をコードする遺伝子及びＳＲＰＫ２をコードする遺伝子の発現を低下させるために、siRNA、モルフォリノオリゴ、又はmiRNAを用いることができる。
siＲＮＡの設計には、周知の方法を用いることができるが、例えば、次のような方法で設計することができる。
（ii−２−１）siRNAのターゲット配列としては、5'側や3'側のＵＴＲ（非翻訳領域）やスタートコドン付近を避け、スタートコドンより50塩基以上下流であって、ORF中で、ＡＡから始まる又はＮＡから始まる19〜21塩基（19塩基が最も一般的）でＣＧ含量が50％前後で、可能な限り5'や3'への偏りや繰り返し配列が少ない配列を用いることができる。
siRNAは、ＡＡから始まる場合は、ｄＴｄＴまたはUU2塩基のオーバーハング、ＮＡから始まるターゲット配列の場合にはdTdN、dTdT、またはUUをつけて調製することができる。
なお、目的とするターゲット配列以外と交差反応を起こし、目的以外のタンパク質の発現に影響を及ぼすことを防ぐため、選び出した配列はBLASTサーチ等を用いて他のRNA配列との類似性を確認する。
なお設計されたsiRNAを細胞内で発現するように調製した、siRNA発現ベクターを用いる態様も本発明に含まれる。
モルフォリノオリゴとは、塩基を有するモルフォリノサブユニットが鎖状に複数つながった化合物であり、モルフォリン環および非イオン性ホスフォロージアミデート (phosphorodiamidate) のサブユニット間結合構造を含む（US Patents 5,142,047, 5,185,444）。細胞内の安定性が高く、mRNAに対して高い親和性を有することから、モルフォリノアンチセンスオリゴは標的遺伝子の発現抑制のために好適に使用できる（Summerton JE., Ann NY Acad Sci 2003; 1002: 189）。効果的なモルフォリノオリゴの設計方法は既に知られている（Summerton, 1989, In: Discoveries in Antisense Nucleic Acids; Ed.: C. Brakel; Pub.: The Portfolio Publishing Co., Woodlands, Texas; pages 71-80; Summerton & Weller, 1997, Antisense Nuc. Acid Drug Dev. 7, 187; およびGene Tools社のウェブサイトを参照）。モルフォリノオリゴは、Gene Tools社（Gene Tools, LLC, Philomath, OR）において入手することができる。
（２）ＳＲ蛋白質をコードする遺伝子の発現を阻害することによる抗ウイルス剤には、例えば、siRNA、モルフォリノオリゴ、又はmiRNAが包含される。
（２−１）siRNA、
siＲＮＡの設計には、上記（ii−２）の方法を用いることができる。
（３）ＳＲ蛋白質と逆の機能をする蛋白質又は該蛋白質を活性化することによる抗ウイルス剤
（３−１）SR蛋白質と逆の機能とは、例えばスプライシングにおいて、イントロンに遠位の3'スプライス部位の選択を促進する機能を言う。すなわち、イントロンに近位の3'スプライス部位の選択を促進するSR蛋白質とは逆のスプライシング調節因子を用いて、SR蛋白質の活性をキャンセルすることができる。具体的には、ＳＲ蛋白質と逆の機能をする蛋白質としては、hnRNP A1、 A2、及び B1などのheteronuclear ribonucleoproteins (hnRNPs)を挙げることができるが、好適には、hnRNP A1を挙げることができる。更に好適には、hnRNP A1をコードする遺伝子を遺伝子治療用発現ベクターに載せた抗ウイルス剤が挙げられる。hnRNP A1をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number NM_002136 の105-1064、NM_031157の105-1220に示されている。またhnRNP A1のアミノ酸配列は、Accession number NP_002127、NP_112420等に示されている（Expert-Bezan, Sureau,A. et al., J. Biol. Chem. 279, 38249-38259 (2004); Zahler,A.M. et al., J. Biol. Chem. 279, 10077-10084 (2004); Marchand,V. et al., J. Mol. Biol. 323, 629-652 (2002); Buvoli,M. et al., EMBO J. 9, 1229-1235 (1990); Biamonti,G. et al., J. Mol. Biol. 207, 491-503 (1989); Buvoli,M. et al., Nucleic Acids Res. 16, 3751-3770 (1988); Michael,W.M. et al., Cell 83, 415-422 (1995)）。hnRNP A2/B1をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number NM_002137 の170-1192、NM_031243の170-1228に示されている。またhnRNP A2/B1のアミノ酸配列は、Accession number NP_002128、NP_112533等に示されている（Kozu,T., et al., Genomics 25, 365-371 (1995); Biamonti,G. et al., Nucleic Acids Res. 22, 1996-2002 (1994); Burd,C.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 9788-9792 (1989); Kumar,A. et al., J. Biol. Chem. 261, 11266-11273 (1986)）。
（４）ＳＲＰＫを阻害する物質をスクリーニングすることによる抗ウイルス剤のスクリーニング方法。
本発明の抗ウイルス剤のスクリーニング方法は、例えば、試験化合物をSRPKに作用させる工程、及びSRPKのSR蛋白質をリン酸化する能力を検定する工程を含むSRPK阻害剤を選抜することを含む方法である。該能力を低下させる化合物（SRPK阻害剤）は、抗ウイルス剤として有用である。特に本願発明には、ＳＲＰＫ1若しくはＳＲＰＫ２をターゲットとする種々の化合物を、SR タンパク質若しくはRS又はSRの２回以上連続するペプチドをSRPKの基質としてSRPK阻害剤をスクリーングすることを含む抗ウイルス剤のスクリーング方法も包含する。Arg-Ser（RS）若しくはSer-Arg（SR）の２回以上連続するペプチドをSRPKの基質として利用し、この基質をリン酸化する能力を低下させる化合物（SRPK阻害剤）を選抜することで、効率的にSRPKのSR蛋白質リン酸化活性を阻害する化合物を選択することができる。
より具体的には、本発明のスクリーニングは以下の工程を含む。
（ａ）被験化合物の存在下で、SRPKとその基質を接触させる工程、
（ｂ）該基質のリン酸化を検出する工程、
（ｃ）被験化合物の非存在下または低用量の存在下に比べ、該リン酸化を低下させる化合物を選択する工程。
基質としては、上記のようにSR蛋白質、RSドメインを含むその部分ポリペプチド、あるいはRSまたはSRが２回以上連続して繰り返したポリペプチドを用いることができる（実施例参照）。SRPKとしては、野生型SRPK1またはSRPK2、あるいはリン酸化活性を維持する限り、タグペプチドが付加された融合蛋白質やその他の改変蛋白質であってもよい。本発明においては、SR蛋白質に対するリン酸化活性を維持する限り、変異を有するSRPKなどもSRPKと呼ぶ。
より具体的には、本発明においてSRPK1とは、（ａ）Accession number NP_003128、AAA20530、CAC39299、CAA11833、または NP_058075 に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、（ｂ）該アミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%、さらに好ましくは90%、より好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質であってリン酸化活性を有する蛋白質、（ｃ）Accession number NM_003137の124-2088、U09564の109-2073、AJ318054の10-2487、または NM_016795の43-1986の一部または全部を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であってリン酸化活性を有する蛋白質が含まれる。また本発明においてSRPK2とは、（ａ）Accession number AAC05299またはNP_033300に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、（ｂ）該アミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%、さらに好ましくは90%、より好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質であってリン酸化活性を有する蛋白質、（ｃ）Accession number U88666の188-2245、またはNM_009274の208-2253の一部または全部を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であってリン酸化活性を有する蛋白質が含まれる。ここで一部とは、例えば連続する20塩基以上、好ましくは25塩基以上、より好ましくは30塩基以上、40塩基以上、45塩基以上、50塩基以上を言う。
アミノ酸配列の同一性は、例えばBLASTPプログラム（Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410）を用いて決定することができる。例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいてLow complexityを含むフィルターは全てOFFにして、デフォルトのパラメータを用いて検索を行う（Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649-656）。パラメータの設定は、例えばopen gapのコストは11、extend gapのコストは1、wordsizeは2、Dropoff (X) for blast extensions in bitsは7、X dropoff value for gapped alignment (in bits)は15、final X dropoff value for gapped alignment (in bits)は25にする。スコアのためのマトリックスとしてBLOSUM62を用いる。例えば２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、上記のAccession numberで示した野生型蛋白質のアミノ酸配列全体（例えば配列番号：2または4の全長）に対する同一性の値を計算する。アライメントにおける野生型蛋白質のアミノ酸配列の外側のギャップは無視して同一性の値を計算すればよい。また、ハイブリダイゼーションにおいては、野生型蛋白質のコード配列（例えば配列番号：1または3）を含む核酸、またはハイブリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダイズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5xSSC (1×SSC は 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrateを含む)、7%(W/V) SDS、10μg/ml 変性サケ精子DNA、5xデンハルト液（１xデンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、48℃、好ましくは50℃、より好ましくは52℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度、より好ましくは60℃、さらにこの好ましくは65℃、最も好ましくは68℃で2xSSC中、好ましくは1xSSC中、より好ましくは0.5xSSC中、より好ましくは0.1xSSC中で、振蘯しながら2時間洗浄する条件である。
SRPKのリン酸化活性は、例えば標識したATPを用いてSRPKと基質との反応を行い、標識された基質を定量することにより検出することが可能である。具体的には、実施例４Ｂに記載の方法に従えばよい。
得られた化合物は、さらに以下の工程により抗ウイルス作用を検出し、顕著な抗ウイルス作用を示すものをさらに選別してもよい。
（ｄ）選択された被験化合物の存在下で、ウイルス増殖またはウイルス遺伝子の発現を検出する工程、
（ｅ）該化合物の非存在下または低用量の存在下に比べ、該ウイルス増殖またはウイルス遺伝子の発現を低下させる化合物を選択する工程。
ウイルス増殖またはウイルス遺伝子の発現は、実施例に例示したように、ウイルスゲノムを導入した細胞におけるウイルス蛋白質の産生を検出することなどにより測定することができる。
また本発明は、本発明の上記スクリーニング方法により選択された化合物を含むSRPK阻害剤および抗ウイルス剤に関する。また本発明は、本発明の上記スクリーニング方法により得られた化合物の、SRPK阻害剤および／または抗ウイルス剤の製造のための使用、ならびにSRPK阻害および／または抗ウイルス処置のための使用に関する。例えば、CAS Registry Nos. 218156-96-8、674360-18-0、494830-83-0、672919-05-0、54231-51-5、10338-55-3、1692-79-1、1496-40-81、496012-09-0、445406-05-3、445412-62-4、および 388071-30-5 からなる群より選択される化合物は、SRPK阻害剤および／または抗ウイルス剤として有用である。
更に、本願発明には、上記抗ウイルス剤をウイルス増殖阻害剤又は抗ウイルス治療薬として用いることも包含される。例えば、抗ウイルス剤としてSRPIN-1を用いる場合、SRPIN-1以外に周知の製薬助剤を添加することができ、例えば、AZTやプロテアーゼ阻害剤を添加することができる。
本発明のウイルス増殖阻害剤又は抗ウイルス治療薬は、例えば、体内濃度が100nM-1mMの間にいずれかになるように、間歇的若しくは持続的に、経口、経皮、粘膜下、皮下、筋肉内、血管内、脳内、又は腹腔内に投与することができる。
本発明のSRPIN-1類縁体化合物について、以下にさらに詳細に記載する。本発明は、以下の構造を有する化合物およびその利用に関する。
本発明に係る化合物は、下記一般式（Ｉ）で表されるアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物である。
（Ｉ）
（式中、Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ2-6アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アジド基、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキルチオ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキルスルホニル基、カルボキシル基、ホルミル基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルコキシカルボニル基、アシル基、アシルアミノ基、またはスルファモイル基を示し；
Ｒ2は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、または置換基を有していてもよいアリール基を示し；
Ｒ3は、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、置換基を有していてもよい含窒素複素環、または置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環を示し；
Ｒ4は、水素原子又はハロゲン原子を示し；
Ｑは、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＳＯ2−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｓ）−を示し；
Ｗは、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキルチオ基、置換基を有していてもよい含窒素複素環、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環、または下記一般式（ＩＩ）
（ＩＩ）
（式中、Ｒ5およびＲ6は、互いに同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよい含窒素複素環、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環、アシル基、もしくはアシルアミノ基を示し；または、
前記Ｒ5およびＲ6は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換基を有していてもよい複素環を形成していてもよく、該複素環は、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環であってもよく；
前記Ｒ5およびＲ6は、置換基を有していてもよいシクロアルキリデンアミノ基または置換基を有していてもよい芳香族環縮合シクロアルキリデン基であってもよい。）。
このような一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、好ましい化合物としては、たとえば、下記の化合物が挙げられる。
（１）前記Ｒ1が、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、またはハロゲン原子である化合物。
（２）前記Ｒ1が、水素原子、Ｃ1-6アルキル基、ハロゲン化Ｃ1-6アルキル基またはハロゲン原子である化合物。
（３）前記Ｒ1が、水素原子、メチル基、トリフルオロメチル基、塩素原子またはフッ素原子である化合物。
（４）前記Ｒ1が、水素原子またはトリフルオロメチル基である化合物。
（５）前記Ｒ2が、水素原子またはＣ1-6アルキル基である化合物。
（６）前記Ｒ2が、水素原子またはメチル基である化合物。
（７）前記Ｒ2が、水素原子である化合物。
（８）前記Ｒ3が、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、または置換基を有していてもよい５〜１０員含窒素ヘテロアリール環である化合物。
（９）前記Ｒ3が、フェニル基；Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基またはニトロ基を置換基に有するＣ6-10アリール基；または５〜１０員含窒素ヘテロアリール基である化合物。
（１０）前記Ｒ3が、フェニル基；Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、またはニトロ基を置換基に有しているフェニル基；またはピリジル基である化合物。
（１１）前記Ｒ3が、フェニル基、トリル基、メトキシフェニル基、またはニトロフェニル基、またはピリジル基である化合物。
（１２）前記Ｒ3が、トリル基またはピリジル基である化合物。
（１３）前記Ｒ3が、４−ピリジル基である化合物。
（１４）前記Ｒ4が、水素原子である化合物。
（１５）前記Ｑが、−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｓ）−である化合物。ここで、Ｃ（Ｏ）とは、炭素原子に酸素原子が二重結合で結合していることを意味し、Ｃ（Ｓ）とは炭素原子に硫黄原子が二重結合で結合していることを意味する。
（１６）前記Ｑが、−Ｃ（Ｏ）−である化合物。
（１７）前記Ｗが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式（ＩＩ）
（ＩＩ）
（式中、Ｒ5およびＲ6は、互いに同一又は異なって、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基を示し；または、
前記Ｒ5およびＲ6は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換基を有していてもよいヘテロ環式基を形成していてもよく、該ヘテロ環式基は、置換基を有していてもよい縮合芳香族ヘテロ環式基であってもよい。）で表される化合物。
（１８）前記Ｗが、Ｃ1-6アルキル基を置換基に有していてもよい１の窒素原子を含有する４〜８員ヘテロ環式基、Ｃ1-6アルキル基を置換基に有していてもよい１の窒素原子および１の酸素原子を含有する４〜８員ヘテロ環式基、フェニル基が縮合した１の窒素原子を含有する４〜８員ヘテロ環式基である化合物。
（１９）前記Ｗが、Ｃ1-6アルキル基を置換基に有していてもよい１の窒素原子を含有する４〜８員ヘテロ環式基である化合物。
（２０）前記Ｗが、Ｃ1-6アルキル基を置換基に有していてもよいピペリジニル基またはパーヒドロアゼピン基である化合物。
（２１）前記Ｗは、水素原子、ハロゲン原子、ジエチルアミノ基、ピロリジニル基、ピペリジニル基、２−メチルピペリジニル基、パーヒドロアゼピン基、インドリニル基、イソインドリニル基、または1,2,3,4-テトラヒドロキノリル基である化合物であってもよい。
このうち、Ｒ1に関しては、（１）〜（４）の順で、（４）がより好ましい。Ｒ2に関しては、（５）〜（７）の順で、（７）がより好ましい。Ｒ3に関しては、（８）〜（１３）の順で、（１３）がより好ましい。Ｑに関しては、（１５）〜（１６）の順で、（１６）がより好ましい。Ｗに関しては、（１７）〜（２０）の順で、（２０）がより好ましい。また（２１）も好ましい。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物について、（１）〜（４）、（５）〜（７）、（８）〜（１３）、（１４）、（１５）〜（１６）、（１７）〜（２１）からなる群から、それぞれの置換基における好ましい態様を選択し、それらを任意に組み合わせた化合物はより好ましい。
以下、一般式（Ｉ）で表される具体的な化合物について、下記に挙げることができるが、本発明は、以下に列挙された化合物に限定されるものではない。
[表１]
[表２]
[表３]
本発明は、上記に例示した任意の化合物に関するが、これらの例示化合物のうち、好ましくは、上記例示化合物番号340、341、342、343、344、345、346、347、348、608、613、615、616、618、619、620、621、622、623、624、625、626の化合物が挙げられ、より好ましくは、340、341、342、343、345、347、348、608、613、615、616、618、619、620、622、623、624、625、626の化合物が挙げられ、さらに好ましくは、上記例示化合物番号３４０、３４８、６１３、６１６、６１８、６２２、６２４の化合物が挙げられ、さらに好ましくは、例示化合物番号３４０、３４８、６１３、６１８、６２４が挙げられる。
また本発明は、上記に例示した任意の化合物にも関する。特に本発明は、記例示化合物番号341、342、346、347、348、349、612、613、614、616、617、618、619、620、621、622、および624からなる群より選択される新規化合物にも関する。
これらの化合物（アニリン誘導体）、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物は、ＳＲＰＫ阻害剤として有効である。
また、これらの化合物（アニリン誘導体）、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物は、抗ウイルス剤として有用である。
本発明に係る前記式（Ｉ）で表される化合物の代表的な製造方法について以下に記す。
以下、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｑ、Ｗは前記定義と同意義である。室温とは、２０〜３０℃程度の温度を意味する。
製造方法Ａ
工程１
化合物１ａと化合物２ａとを反応させ、化合物３ａを得る工程である。原料のニトロベンゼン誘導体１ａは、市販品または適宜官能基を誘導して入手する。Ｈａｌは、脱離基となるハロゲン原子である。化合物２ａは導入する−ＮＲ5Ｒ6を含む試薬であり、Ｘは水素原子などである。化合物２ａは、１〜２当量用いることが好ましい。反応は、溶媒中、塩基の存在下で行うことができる。
塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン等を用いることができる。塩基は１〜５当量用いることが好ましい。また、塩基として過剰量（１から５当量）のＸ-ＮＲ5Ｒ6を代わりに用いることができる。
溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、トルエン等をあげることができる。
反応温度は、０℃から１５０℃で反応を行うことができるが、好ましくは室温で行うことができる。
工程２
化合物３ａのニトロ基をアミノ基に還元し、化合物４ａを得る工程である。
還元方法としては、溶媒中、塩化スズ等の存在下、濃塩酸等を接触させて行うことができる。その他、接触水素化などの一般的な還元反応も利用可能である。
反応溶媒としてはメタノール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン、１，４−ジオキサン、水、またはこれらの混合溶媒を用いることができる。
還元剤となる塩化スズ等は質量比で１〜２０当量の量を用いることが好ましい。反応温度は０℃から１００℃で反応を行うことができる。
なお化合物３ａおよび４ａは市販品を入手できる場合もあり、その場合は市販品を用いればよい。特に一般式（Ｉ）のＷが水素またはハロゲンの場合は、多くの場合、市販品を入手可能である。例えば、本明細書の化合物番号608、612、623〜626などがこれに該当する。
工程３ａ
化合物４ａと化合物５ａを反応させ、化合物６ａを得る工程である。Ｌはハロゲン原子などである。
反応は、溶媒中、塩基の存在下、必要に応じ触媒を添加して行うことができる。この場合、化合物５ａを１〜３当量用いることが好ましい。
反応溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、トルエン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどを用いることができる。
塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン等を用いることができる。
その他、Ｌが水酸基である場合に縮合剤を用いる一般的なアミド結合形成反応などや、Ｌとしてスクシンイミジル基やイミダゾイル基などの脱離基である場合の一般的なアミド結合形成反応も利用可能である。
触媒としては、４−（ジメチルアミノ）ピリジンなどが挙げられる。
反応温度は０℃から１００℃で反応を行うことができる。
工程３ｂ
化合物４aと化合物５bとを反応させ、化合物６bを得る工程である。
反応は、溶媒中、塩基の存在下でアシルイソチオシアナートを作用させて行うことができる。アシルイソチオシアナートは、市販品、または適宜アシルハライドとチオシアン酸塩とから反応溶液中で調製したものをそのまま用いることができる。アシルイソチオシアナートは、１〜５当量用いることが好ましい。チオシアン酸塩としては、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム等を用いることができ、１〜５当量用いることが好ましい。
溶媒としては、例えばアセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールジメチルエーテル、１，４−ジオキサン等をあげることができる。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ピリジン、４-（ジメチルアミノ）ピリジン等を用いることができる。塩基は、１〜５当量用いることが好ましい。
反応温度は、0℃から150℃で反応を行うことができる。
工程４ａ
化合物６aのアミド基部分をアルキル化（Ｒ２化）し、化合物７aを得る工程である。
反応は、溶媒中、塩基の存在下でアルキル化試薬（Ｒ２-X）を用いて行うことができる。Xは、脱離基となるハロゲン原子またはスルホン酸エステルである。アルキル化試薬（Ｒ２-X）は、１〜５当量用いることが好ましい。
溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールジメチルエーテル、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、エーテル等をあげることができる。
塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化リチウム、ブチルリチウム、メチルリチウム、フェニルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド等を用いることができる。塩基は、１〜５当量用いることが好ましい。
反応温度は、0℃から150℃で反応を行うことができる。
工程４ｂ
化合物６aのアミド結合のカルボニル基をチオカルボニル基へと変換し、化合物７bを得る工程である。
反応は、溶媒中、チオカルボニル化試薬を用いて行う。
チオカルボニル化試薬としては、例えばLawesson's試薬（2,4-bis(4-methoxyphenyl)-1,3,2,4-dithiadiphosphetane 2,4-disulfide）、五硫化二リン（十硫化四リン、P4S10）等を用いることができる。チオカルボニル化試薬は、１〜５当量用いることが好ましい。
溶媒としては、例えばトルエン、ベンゼン、クロロベンゼン、キシレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、エチレングリコールジメチルエーテル、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン等をあげることができる。
反応温度は、0℃から200℃で反応を行うことができる。
以上が本発明にかかる化合物（Ｉ）の製造方法の代表例であるが、本発明化合物の製造における原料化合物・各種試薬は、塩や水和物あるいは溶媒和物を形成していてもよく、いずれも出発原料、使用する溶媒等により異なり、また反応を阻害しない限りにおいて特に限定されない。用いる溶媒についても、出発原料、試薬等により異なり、また反応を阻害せず出発物質をある程度溶解するものであれば特に限定されないことは言うまでもない。本発明に係る化合物（Ｉ）がフリー体として得られる場合、前記の化合物（Ｉ）が形成していてもよい塩またはそれらの水和物の状態に常法に従って変換することができる。
本発明に係る化合物（Ｉ）が化合物（Ｉ）の塩または化合物（Ｉ）の水和物として得られる場合、前記の化合物（Ｉ）のフリー体に常法に従って変換することができる。
また、本発明に係る化合物（Ｉ）について得られる種々の異性体（例えば幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、回転異性体、立体異性体、互変異性体、等）は、通常の分離手段、例えば再結晶、ジアステレオマー塩法、酵素分割法、種々のクロマトグラフィー（例えば薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、等）を用いることにより精製し、単離することができる。
本発明において、SRPIN-1類縁体は、SRPKの活性を阻害するために用いることができる。すなわち、本明細書に記載のSRPIN-1類縁体を投与することにより、SRPK1および/またはSRPK2のリン酸化活性を阻害することができる。本発明は、SRPK活性の阻害における、SRPIN-1類縁体の使用に関する。また本発明は、SRPIN-1類縁体を含むSRPK阻害剤に関する。また本発明は、SRPK阻害剤の製造における、SRPIN-1類縁体の使用に関する。さらに本発明は、SRPIN-1類縁体をSRPKに接触させる工程を含む、SRPK活性を阻害する方法に関する。ここでSRPKに接触させるとは、SRPKを発現する細胞、組織、および/または個体にインビボまたはインビトロでSRPIN-1類縁体を投与することであってもよい。
また本発明において、SRPIN-1類縁体は、ウイルスの増殖を抑制するために用いることができる。すなわち、本明細書に記載のSRPIN-1類縁体を投与することにより、SRPK1および/またはSRPK2のリン酸化活性を阻害することを通して、ウイルス増殖が抑制される。本発明は、ウイルス増殖の抑制における、SRPIN-1類縁体の使用に関する。また本発明は、SRPIN-1類縁体を含む抗ウイルス剤に関する。また本発明は、抗ウイルス剤の製造における、SRPIN-1類縁体の使用に関する。さらに本発明は、SRPIN-1類縁体をSRPKに接触させる工程を含む、ウイルス増殖を抑制する方法に関する。ここでSRPKに接触させるとは、SRPKを発現する細胞、組織、および/または個体にインビボまたはインビトロでSRPIN-1類縁体を投与することであってもよい。
また本発明は、上記SRPIN-1類縁体もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物を含むパッケージであって、該化合物がSRPK阻害活性および/または抗ウイルス作用を有することが、該パッケージまたは該パッケージの内容物中に記載されている、パッケージを提供する。ここでパッケージとは、該SRPIN-1類縁体もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物を含む包装物のことであり、該SRPIN-1類縁体もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物を入れるための容器を含んでいてよく、さらに該容器を収納するバッグまたは外箱等を含んでもよい。
また本発明は、SR蛋白質の活性または発現量を低下させる化合物を含むパッケージであって、該化合物が抗ウイルス作用を有することが、該パッケージまたは該パッケージの内容物中に記載されている、パッケージを提供する。特に本発明は、該化合物がSRPKの発現および/または活性を阻害する活性を有する化合物であるパッケージを提供する。
本発明の化合物は、薬学的に許容される担体と共に組成物とすることができる。例えば、周知の製剤技術を適用して、医薬組成物としてよい。本発明の医薬組成物を、ＳＲＰＫ阻害剤、または抗ウイルス剤（すなわち、ウイルス疾患の予防剤または治療剤）、あるいはその他の医薬として使用する場合、その投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤もしくはシロップ剤等による経口投与、又は注射剤、エアゾール剤、座剤、貼布剤、パップ剤、ローション剤、リニメント剤、軟膏剤、若しくは点眼剤等による非経口投与を挙げることができる。これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。
例えば、賦形剤としては、デンプン、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。
コーティング剤としては、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。
結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。
崩壊剤としては、例えば前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。
安定剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェエノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。
矯味矯臭剤としては、例えば通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。
また、液剤を製造するための溶媒としては、エタノール、フェノール、クロロクレゾール、精製水、蒸留水等を使用することができる。
界面活性剤又は乳化剤としては、例えば、ポリソルベート８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
本発明の医薬組成物を、ＳＲＰＫ阻害剤または抗ウイルス剤として使用する場合、本発明の化合物又はその薬理上許容される塩の使用量は症状、年齢、投与方法等により異なる。例えば経口投与の場合、患者（温血動物、特に人間）に対して１日あたり、下限として（０．０１）ｍｇ（好ましくは（０.１）ｍｇ）、上限として、（２０００）ｍｇ（好ましくは（５００）ｍｇ、より好ましくは（１００）ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。静脈内投与の場合には、成人に対して１日当たり、下限として（０．００１）ｍｇ（好ましくは（０．０１）ｍｇ）、上限として、（５００）ｍｇ（好ましくは（５０）ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
下記で、カラムクロマトグラフィーはシリカゲル（MERCK 9385-5B, 70-230 mesh）を用いて行った。薄層クロマトグラフィー（TLC）は、あらかじめシリカゲルが塗布されたガラスプレート（MERCK 5715, silica gel 60 F254）を用いて行った。融点は、ヤナコ社製微量融点測定装置YANACO MP-500Dを用いて測定した。1H NMR スペクトルは日本電子（JEOL）社製JNM AL-400核磁気共鳴装置を用いて測定した。NMRスペクトル測定用溶媒には、CDCl3またはCD3OD（ISOTEC社製）を使用した。化学シフトはテトラメチルシラン（(CH3)4Si）を内部標準（0 ppm）として相対的な値として表し、結合定数（Ｊ）はHzで示した。略号s、d、t、m、およびbrはそれぞれ単重線、二重線、三重線、四重線、多重線、およびブロードピークを表す。
［参考例１］ SRPIN-１の合成
SRPIN-1(code name GIF-0340)の代表的な合成法は以下の通りである。
[参考例１−１Ａ]
１−フルオロ−２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene ）(427 mg, 2.04 mmol、商用品) の N,N-ジメチルフォルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)） (1 mL) 溶液に順次、 ピペリジン（piperidine） (220 μL, 2.22 mnol) 及び N,N-ジイソプロピルエチルアミン（N,N-diisopropylethylamine ）(220 μl, 2.40 mmol) が室温で添加された。混合物は、１時間撹拌された。 これに、水が添加され、混合物はエーテル（ｘ３）で抽出された。抽出された有機層は、ブラインで洗浄、 Na2SO4上で乾燥 、フィルターにかけ、減圧下で濃縮された。
残査は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (40 g, hexane/ethyl acetate = 10/1) で精製され、 １−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピペリジン（1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]piperidine） (561 mg, 2.04 mmol, quant.)をオレンジ色の固体として得た。
ＴＬＣ及び1H NMR (CDCl3, 400 MHz)の結果は次の通りである。: TLC Rf 0.47 (hexane/acetone = 16/1); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.61-1.68 (m, 2H, CH2), 1.72 (tt, 4H, J = 5.3, 5.3 Hz, 2CH2), 3.13 (t, 4H, J = 5.3 Hz, 2CH2), 7.13 (d, 1H, J = 8.8 Hz, aromatic) 7.61 (dd, 1H, J = 2.0, 8.8 Hz, aromatic), 8.03 (d, 1H, J = 2.0 Hz, aromatic).
[参考例１−２Ａ]
参考例１−１Ａで得られた１−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピペリジン（1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]piperidine ）(559 mg, 2.03 mmol) の methanol (10 mL)溶液に順次、濃塩酸 (2.00 mL, 24.0 mmol)および無水二塩化スズ (2.50 g, 13.1 mmol) が 0℃で添加された。混合物は、室温に戻され、１７．５時間撹拌された。これに重炭酸ナトリウムの飽和水溶液が添加された。混合物は酢酸エチル（ｘ３）で抽出された。得られた有機層はブラインで洗浄されNa2SO4上で乾燥され、 濾過され、減圧濃縮された。 残査はシリカゲルカラムクロマトグラフィー(50 g, hexane/ethyl acetate = 14/1) で精製され、２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）アニリン（2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline）(448 mg, 1.83 mmol, 90.4%) を淡黄色の固体として得た。
ＴＬＣおよび 1H NMR (CDCl3, 400 MHz)の結果は次の通りである。TLC Rf 0.30(hexane/acetone = 18/1); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.59-1.60 (m, 2H, CH2), 1.71 (tt, 4H, J = 5.4, 5.4 Hz, 2CH2), 2.85 (brs, 4H, 2CH2), 4.09 (brs, 2H, NH2), 6.92 (d, 1H, J = 1.9 Hz, aromatic), 6.97 (dd, 1H, J = 1.9, 8.4 Hz, aromatic), 7.01 (d, 1H, J = 8.4 Hz, aromatic).
[参考例１−３Ａ]
参考例１−２Ａで得られた２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）アニリン（2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline）(173 mg, 0.708 mmol) のジクロロメタン（dichloromethane） (5 mL)溶液に順次、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride） (151 mg, 0.850 mmol、商用品), トリエチルアミン（triethylamine ）(450μL, 3.23 mmol), 及び触媒量の４−（ジメチルアミノ）ピリジン（4-(dimethylamino)pyridine ）が０℃で添加された。混合物は室温に戻され、１９時間半撹拌された。これに水が添加され、混合物は、酢酸エチル(ｘ３)で抽出された。得られた有機層は重炭酸ナトリウム飽和水溶液で洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、濾過され、そして減圧濃縮された。残査はシリカゲルカラムクロマトグラフィー (10 g, hexane/ethyl acetate = 1.5/1)および再結晶（ヘキサン）にて精製され、N-［２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide） (SRPIN-1、code name GIF-0340) (83.8 mg, 0.240 mmol, 33.9%) を無色の固体として得た。
融点、ＴＬＣ及び 1H NMR (CDCl3, 400 MHz)の結果は次の通りである。
融点96-98 ℃；TLC Rf 0.40 (hexane/ethyl acetate = 1/1); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.67-1.68 (m, 2H, CH2), 1.78 (tt, 4H, J = 5.5, 5.5 Hz, 2CH2), 2.88 (t, 4H, J = 5.5 Hz, 2CH2), 7.29 (d, 1H, J = 8.2 Hz, aromatic), 7.40 (dd, 1H, J = 1.8, 8.2 Hz, aromatic), 7.76 (dd, 2H, J = 2.0, 4.4 Hz, aromatic), 8.86 (dd, 2H, J = 2.0, 4.4 Hz, aromatic), 8.87 (d, 1H, J = 1.8 Hz, aromatic), 9.53 (s, 1H, NH).
［参考例１−１Ｂ］
１−クロロ−２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（1-chloro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene）（5.00 g, 22.4 mmol、商用品）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（7 mL）溶液に、ピペリジン（piperidine）（5.50 mL, 55.5 mmol、商用品）を0 ℃にて加え、混合物を40分間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸エチルで抽出した（ｘ３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（200 g, ヘキサン／酢酸エチル＝8／1）にて精製し、１−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピペリジン（1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]piperidine）（6.13 g, quant.）をオレンジ色の固体として得た。
［参考例１−２Ｂ］
参考例１−１Ｂで得られた１−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピペリジン（1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]piperidine）（6.13 g, 22.4 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（10 mL）溶液に、濃塩酸（12.2 mL, 146 mmol）および無水二塩化スズ（12.7 g, 67.2 mmol）を0 ℃にて順次加え、混合物を7時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（200 g, ヘキサン／酢酸エチル＝15／1）にて精製し、２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）アニリン（2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline）（4.55 g, 83.0%）を淡黄色の固体として得た。
［参考例１−３Ｂ］
参考例１−２Ｂで得られた２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）アニリン（2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline）（4.45 g, 18.2 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（10 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（6.48 g, 36.4 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（5.57 mL, 54.6 mmol）、を0 ℃にて順次加え、混合物を0.5時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（200 g, ヘキサン／酢酸エチル＝1／1）および再結晶（ヘキサン）にて精製し、N−［２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（SRPIN-1, GIF-0340）（5.49 g, 86.3%）を無色の固体として得た。
［参考例２］ code name GIF-0613の合成
［参考例２−１］
１−フルオロ−２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene）（211 mg, 1.00 mmol、商用品）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（0.5 mL）溶液に、（Ｓ）-２-メチルピペリジン（(S)-2-methylpiperidine）（270 μL, 2.24 mmol、商用品）を室温にて加え、混合物を2時間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸エチルで抽出した（ｘ３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝12／1）にて精製し、（Ｓ）-１−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−２−メチルピペリジン（(S)-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-2-methylpiperidine）（286 mg, 99.2%）をオレンジ色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.44 (ヘキサン／酢酸エチル＝16／1)。
［参考例２−２］
［参考例２−１］で得られた（Ｓ）-１−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−２−メチルピペリジン（(S)-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-2-methylpiperidine）（275 mg, 0.953 mmol）のメタノール（5 mL）溶液に、濃塩酸（1.00 mL, 12.0 mmol）および無水二塩化スズ（903 mg, 4.76 mmol） を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、17時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（50 g, ヘキサン／酢酸エチル＝12／1）にて精製し、（Ｓ）-２−（２−メチル−１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）アニリン（(S)-2-(2-methyl-1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline）（233 mg, 94.6%）を無色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.38 (ヘキサン／酢酸エチル＝16／1)。
［参考例２−３］
［参考例２−２］で得られた（Ｓ）-２−（２−メチル−１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）アニリン（(S)-2-(2-methyl-1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline）（223 mg, 0.863 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（5 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（466 mg, 2.61 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（600 μL, 4.30 mmol）を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、19時間半撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（25 g, ヘキサン／酢酸エチル＝1.5／1）にて精製し、（Ｓ）-N−［２−（２−メチル−１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸アミド（(S)-N-[2-(2-methyl-1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0613）（293 mg, 93.4%）を無色の油状物質として得た。
TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
TLC Rf 0.40 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.84 (d, 3H, J = 6.4 Hz, CH3), 1.39-1.69 (m, 3H, CH2, CH), 1.82-1.86 (m, 1H, CH), 1.92-1.95 (m, 2H, CH2), 2.65-2.72 (m, 1H, CH), 2.89-2.92 (m, 1H, CH), 2.98-3.02 (m, 1H, CH), 7.35 (d, 1H, J = 8.4 Hz, aromatic), 7.40 (dd, 1H, J = 2.2, 8.4 Hz, aromatic), 7.75 (dd, 2H, J = 1.8, 4.4 Hz, aromatic), 8.86 (dd, 2H , J = 1.8, 4.4 Hz, aromatic), 8.93 (d, 1H , J = 1.8 Hz, aromatic), 10.1 (s, 1H, NH)。
［参考例３］ code name GIF-0617の合成
［参考例３−１］
１−フルオロ−２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene）（1.02 g, 4.89 mmol、商用品）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（4 mL）溶液に、ピロリジン（pyrrolidine）（983 μL, 12.0 mmol、商用品）を0 ℃にて加えた。混合物を室温に戻し、4.5時間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸エチルで抽出した（ｘ３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（50 g, ヘキサン／酢酸エチル＝5／1）にて精製し、１-［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピロリジン（1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]pyrrolidine）（1.26 g, 99.3%）をオレンジ色の固体として得た。
TLC Rf 0.45 (ヘキサン／酢酸エチル＝5／1)。
［参考例３−２］
参考例３−１で得られた１-［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピロリジン（1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]pyrrolidine）（606 mg, 2.33 mmol）のメタノール（4 mL）溶液に、濃塩酸（1.36 mL, 16.3 mmol）および無水二塩化スズ（1.55 g, 8.16 mmol） を0 ℃にて順次加え、混合物を4時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（50 g, ヘキサン／酢酸エチル＝15／1）にて精製し、１−［２−アミノ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピロリジン（1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]pyrrolidine）（550 mg, quant.）を赤橙色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.63 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)。
［参考例３−３］
参考例３−２で得られた１−［２−アミノ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピロリジン（1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]pyrrolidine）（516 mg, 2.24 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（10 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（705 mg, 3.96 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（823 μL, 5.94 mmol）を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、5時間撹拌した。これに水を加え、混合物をジクロロメタン（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（25 g, ヘキサン／酢酸エチル＝1／2）にて精製し、N−［２−（１−ピロリジニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[2-(1-pyrrolidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0617）（734 mg, 97.8%）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点134-135 ℃；TLC Rf 0.29 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.01 (tt, 4H, J = 3.2 Hz, 6.4 Hz, 2CH2), 3.15 (t, 4H, J = 6.4 Hz, 2CH2), 7.19 (d, 1H, J = 8.5 Hz, aromatic), 7.38 (dd, 1H, J = 2.2, 8.5 Hz, aromatic), 7.71 (dd, 2H, J = 1.6, 4.4 Hz, aromatic), 8.53 (d, 1H, J = 2.2, Hz, aromatic), 8.79 (s, 1H, NH), 8.83 (dd, 2H, J = 1.6, 4.4 Hz, aromatic)。
［参考例４］ code name GIF-0618の合成
［参考例４−１］
１−フルオロ−２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene）（506 mg, 2.42 mmol、商用品）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（2 mL）溶液に、ヘキサヒドロ-１Ｈ−アゼピン（hexahydro-1H-azepine）（682 μL, 6.05 mmol、商用品）を0 ℃にて加えた。混合物を室温に戻し、1時間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸エチルで抽出した（ｘ３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝7／1）にて精製し、ヘキサヒドロ-１−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−アゼピン（hexahydro-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1H-azepine）（680 mg, 97.5%）をオレンジ色の固体として得た。
TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
TLC Rf 0.49 (ヘキサン／酢酸エチル＝5／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.57-1.63 (m, 4H, 2CH2), 1.79-1.83 (m, 4H, 2CH2), 3.31 (t, 4H, J = 5.5 Hz, 2CH2), 7.11 (d, 1H, J = 9.1 Hz, aromatic) 7.53 (dd, 1H, J = 2.0, 9.1 Hz, aromatic), 7.99 (d, 1H, J = 2.0 Hz, aromatic)。
［参考例４−２］
参考例４−１で得られたヘキサヒドロ-１−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−アゼピン（hexahydro-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1H-azepine）（675 mg, 2.34 mmol）のメタノール（5 mL）溶液に、濃塩酸（1.27 mL, 15.2 mmol）および無水二塩化スズ（1.43 g, 7.54 mmol） を0 ℃にて順次加え、混合物を2時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g, ヘキサン／酢酸エチル＝20／1）にて精製し、１−［２−アミノ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−ヘキサヒドロ-１Ｈ−アゼピン（1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-hexahydro-1H-azepine）（522 mg, 86.3%）を無色の固体として得た。
TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
TLC Rf 0.81 (ヘキサン／酢酸エチル＝3／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.70-1.84 (m, 8H, 4CH2), 3.04 (t, 4H, J = 5.4, Hz, 2CH2), 4.10 (brs, 2H, NH2), 6.92 (d, 1H, J = 1.2 Hz, aromatic), 6.94 (dd, 1H, J = 1.2, 7.9 Hz, aromatic), 7.05 (d, 1H, J = 7.9 Hz, aromatic)。
［参考例４−３］
参考例４−２で得られた１−［２−アミノ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−ヘキサヒドロ-１Ｈ−アゼピン（1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-hexahydro-1H-azepine）（512 mg, 1.98 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（6 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（704 mg, 3.95 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（823 μL, 5.94 mmol）を0 ℃にて順次加え、混合物を1.5時間撹拌した。これに水を加え、混合物をジクロロメタン（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g, ヘキサン／酢酸エチル＝2／1）にて精製し、N−［２−（１−ヘキサヒドロ-１Ｈ−アゼピニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[2-(1-hexahydro-1H-azepinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0618）（697 mg, 97.0%）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点138-139 ℃；TLC Rf 0.40 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.79 (br, 8H, 4CH2), 3.06-3.10 (m, 4H, 2CH2), 7.31 (d, 1H, J = 8.2 Hz, aromatic), 7.37 (dd, 1H, J = 1.6, 8.2 Hz, aromatic), 7.76 (dd, 2H, J = 2.0, 6.0 Hz, aromatic), 8.85 (m, 3H, aromatic), 9.66 (s, 1H, NH)。
［参考例５］ code name GIF-0346の合成
［参考例５−１］
１−フルオロ−２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene）（209 mg, 1.00 mmol、商用品）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（0.5 mL）溶液に、モルホリン（morpholine）（190 μL, 2.17 mmol、商用品）を室温ににて加え、混合物を3時間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸エチルで抽出した（ｘ３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝3／1）にて精製し、４−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］モルホリン（4-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine）（270 mg, 97.7%）をオレンジ色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.27 (ヘキサン／酢酸エチル＝3／1)。
［参考例５−２］
参考例５−１で得られた４−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］モルホリン（4-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine）（263 mg, 0.952 mmol）のメタノール（5 mL）溶液に、濃塩酸（1.00 mL, 12.0 mmol）および無水二塩化スズ（905 mg, 4.77 mmol） を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、20時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝2／1）にて精製し、４−［２−アミノ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］モルホリン（4-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine）（214 mg, 91.2%）を無色の固体として得た。
TLC Rf 0.31 (ヘキサン／酢酸エチル＝3／1)。
［参考例５−３］
参考例５−２で得られた４−［２−アミノ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］モルホリン（4-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine）（196 mg, 0.796 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（5 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（320 mg, 1.80 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（480 μL, 3.44 mmol）を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、60時間撹拌した。これに水を加え、混合物をジクロロメタン（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g, ヘキサン／酢酸エチル＝2／1）にて精製し、N−［２−（４−モルホリンイル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[2-(4-morpholinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0346）（65.1 mg, 23.2%）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点172-173 ℃；TLC Rf 0.23 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／3)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.96 (t, 4H, J = 4.4 Hz, 2CH2), 3.92 (t, 4H, J = 4.4 Hz, 2CH2), 7.34 (d, 1H, J = 8.4 Hz, aromatic), 7.44 (dd, 1H, J = 1.6, 8.4 Hz, aromatic), 7.75 (dd, 1H ,J = 1.6, 4.4 Hz, aromatic), 8.87-8.88 (m, 3H , aromatic) 9.48 (s, 1H, NH)。
［参考例６］ code name GIF-0347の合成
［参考例６−１］
１−フルオロ−２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene）（211 mg, 1.01 mmol、商用品）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（0.5 mL）溶液に、ジエチルアミン（diethylamine）（230 μL, 2.22 mmol、商用品）を室温にて加え、混合物を3時間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸エチルで抽出した（ｘ３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝8／1）にて精製し、１−ジエチルアミノ-２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（1-diethylamino-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene）（258 mg, 98.3%）をオレンジ色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.37 (ヘキサン／酢酸エチル／エーテル＝16／1／1)。
［参考例６−２］
参考例６−１で得られた１−ジエチルアミノ-２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（1-diethylamino-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene）（251 mg, 0.957 mmol）のメタノール（5 mL）溶液に、濃塩酸（1.00 mL, 12.0 mmol）および無水二塩化スズ（908 mg, 4.78 mmol） を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、22時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝20／1〜10／1）にて精製し、２−アミノ−１−ジエチルアミノ-４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（2-amino-1-diethylamino-4-(trifluoromethyl)benzene）（144 mg, 64.7%）を無色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.22 (ヘキサン／酢酸エチル＝30／1)。
［参考例６−３］
参考例６−２で得られた２−アミノ−１−ジエチルアミノ-４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（2-amino-1-diethylamino-4-(trifluoromethyl)benzene）（103 mg, 0.443 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（3 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（88.2 mg, 0.495 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（140 μL, 1.00 mmol）を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、1.5時間撹拌した。これに水を加え、混合物をジクロロメタン（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g, ヘキサン／酢酸エチル＝2／1）にて精製し、N−［２−ジエチルアミノ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[2-diethylamino-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0347）（51.0 mg, 34.1%）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点78-80 ℃；TLC Rf 0.31 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.01 (t, 6H, J = 7.1 Hz, 2CH3), 3.04 (q, 4H, J = 7.1 Hz, 2CH2), 7.33 (d, 1H, J = 8.2 Hz, aromatic), 7.41 (dd, 1H, J = 1.8, 8.2 Hz, aromatic), 7.73 (dd, 2H, J = 1.8, 4.4 Hz, aromatic), 8.60 (d, 1H , J = 2.6 Hz, aromatic), 8.85 (dd, 2H ,J = 1.8, 4.4 Hz, aromatic), 8.91 (d, 1H , J = 1.8 Hz, aromatic) 9.90 (s, 1H, NH)。
［参考例７］ code name GIF-0343の合成
参考例１−２で得られた２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）アニリン（2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline）（152 mg, 0.622 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（5 mL）溶液に、ニコチン酸クロリド塩酸塩（nicotinoyl chloride hydrochloride）（122 mg, 0.685 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（250 μL, 1.79 mmol）、を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、16.5時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（15 g, ヘキサン／酢酸エチル＝1.5／1〜1／1）にて精製し、N−［２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］ニコチン酸アミド（N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]nicotinamide）（GIF-0343）（98.4 mg, 45.3%）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点145-146 ℃；TLC Rf 0.40 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.62-1.69 (m, 2H, CH2), 1.79 (tt, 4H, J = 5.8, 5.8 Hz, 2CH2), 2.88 (t, 4H, J = 5.8 Hz, 2CH2), 7.29 (d, 1H, J = 8.4 Hz, aromatic), 7.39 (dd, 1H, J = 2.0, 8.4 Hz, aromatic), 7.51 (dd, 1H, J = 4.8, 8.0 Hz, aromatic), 8.30 (ddd, 1H, J = 1.6, 2.4, 8.0 Hz, aromatic), 8.82 (dd, 1H, J = 1.6, 4.8 Hz, aromatic), 8.87 (d, 1H , J = 2.0 Hz, aromatic), 9.16 (d, 1H , J = 2.4 Hz, aromatic), 9.53 (s, 1H, NH)。
［参考例８］ code name GIF-0344の合成
参考例１−２で得られた２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）アニリン（2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline）（102 mg, 0.417 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（3 mL）溶液に、塩化ベンゾイル（benzoyl chloride）（50.0 μL, 0.430 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（170 μL, 1.21mmol）、を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、18時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝10／1）にて精製し、N−［２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］安息香酸アミド（N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]benzamide）（GIF-0344）（126 mg, 86.7%）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点128-129 ℃、TLC Rf 0.46 (ヘキサン／酢酸エチル＝4／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.62-1.70 (m, 2H, CH2), 1.78 (tt, 4H, J = 5.2, 5.2 Hz, 2CH2), 2.88 (t, 4H, J = 5.2 Hz, 2CH2), 7.26 (d, 1H, J = 8.6 Hz, aromatic), 7.35 (d, 1H, J = 0.8, 8.6 Hz, aromatic), 7.52-7.61 (m, 1H, aromatic), 8.10 (m, 2H, aromatic), 7.94 (m, 2H, aromatic), 8.91 (d, 1H , J = 0.8 Hz, aromatic), 9.44 (s, 1H, NH)。
［参考例９］ code name GIF-0345
参考例１−２で得られた２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）アニリン（2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline）（51.2 mg, 0.209 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（2 mL）溶液に、塩化４-ニトロベンゾイル（4-nitrobenzoyl chloride）（64.2 mg, 0.345 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（120 μL, 0.859 mmol）、を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、60時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g, ヘキサン／酢酸エチル＝8／1〜6／1）にて精製し、N−［２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］-４-ニトロ安息香酸アミド（N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]-4-nitrobenzamide）（GIF-0345）（46.3 mg, 56.3%）を黄色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点125-136 ℃；TLC Rf 0.33 (ヘキサン／酢酸エチル＝4／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.62-1.70 (m, 2H, CH2), 1.77 (tt, 4H, J = 5.0, 5.0 Hz, 2CH2), 2.88 (t, 4H, J = 5.0 Hz, 2CH2), 7.30 (d, 1H, J = 8.0 Hz, aromatic), 7.40 (dd, 1H, J = 1.6, 8.2 Hz, aromatic), 8.10 (dd, 2H, J = 1.8, 6.8 Hz, aromatic), 8.41 (d, 2H , J = 1.8, 6.8 Hz, aromatic), 8.86 (d, 1H , J = 2.0 Hz, aromatic), 9.54 (s, 1H, NH)。
［参考例１０］ code name GIF-0615の合成
参考例１−２で得られた２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）アニリン（2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline）（147 mg, 0.602 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（4 mL）溶液に、塩化４-メトキシベンゾイル（4-methoxybenzoyl chloride）（250 mg, 1.47 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（254 μL, 1.83 mmol）、を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、17時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝5／1）にて精製し、N−［２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］-４-メトキシ安息香酸アミド（N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]-4-methoxybenzamide）（GIF-0615）（240 mg, quant.）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点111-114 ℃；TLC Rf 0.33 (ヘキサン／酢酸エチル＝4／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.64-1.68 (m, 2H, CH2), 1.78 (tt, 4H, J = 5.4, 5.4 Hz, 2CH2), 1.60-1.70 (m, 2H, CH2), 2.39-2.41 (m, 2H, CH2), 2.87 (t, 4H, J = 5.4 Hz, 2CH2), 3.89 (s, 3H, CH3), 7.03 (dd, 2H, J = 2.0, 7.0 Hz, aromatic), 7.23 (d, 1H, J = 8.0 Hz, aromatic), 7.32 (dd, 1H, J = 1.6, 8.0 Hz, aromatic), 7.91 (dd, 2H, J = 2.0, 7.0 Hz, aromatic), 8.88 (d, 1H, J = 1.6 Hz, aromatic), 9.34 (s, 1H, NH)。
［参考例１１］ code name GIF-0622の合成
参考例１−２で得られた２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）アニリン（2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline）（149 mg, 0.610 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（5 mL）溶液に、p-トルエンスルホン酸クロリド（p-toluenesulfonyl chloride）（233 g, 1.22 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（254 μL, 1.83 mmol）、を室温にて順次加え、混合物を60時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝10／1）にて精製し、N−［２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］-p-トルエンスルホン酸アミド（N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]-p-toluenesulfonamide）（GIF-0622）（243 mg, quant）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点117-134 ℃；TLC Rf 0.49 (ヘキサン／酢酸エチル＝5／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.55-1.60 (m, 2H, CH2), 1.66 (tt, 4H, J = 5.2, 5.2 Hz, 2CH2), 2.36 (s, 3H, CH3), 2.51 (t, 4H, J = 5.2 Hz, 2CH2), 7.11 (d, 1H, J = 8.0 Hz, aromatic), 7.22-7.28 (m, 3H, aromatic), 7.71 (dd, 2H, J = 1.8, 8.6 Hz, aromatic), 7.85 (d, 1H , J = 2.0 Hz, aromatic), 7.94 (s, 1H, NH)。
［参考例１２］ code name GIF-0624の合成
チオシアン酸カリウム（potassium thiocyanate、商用品）（119 mg, 1.22 mmol）およびニコチン酸クロリド塩酸塩（nicotinoyl chloride hydrochloride）（352 mg, 1.97 mmol、商用品）のアセトニトリル（15 mL）溶液を70 ℃にて40分間撹拌した。混合物を室温に戻したのち、これに参考例１-２で得られた２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）アニリン（2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline）（244 mg, 1.00 mmol）のアセトニトリル（5 mL）溶液およびトリエチルアミン（triethylamine）（278 μL, 2.00 mmol）を順次加え、混合物を50 ℃にて1時間撹拌した。これに水を加え、混合物をジクロロメタン（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（25 g, ヘキサン／酢酸エチル＝4／1〜1／1）にて精製し、１-ニコチノイル-３-［２−（１−ピペリジル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］チオウレア（1-nicotinoyl-3-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]thiourea）（GIF-0624）（383 mg, 93.7%）を淡黄色の固体として得た
融点、TLCおよび1H NMR（CD3OD, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点142-144 ℃；TLC Rf 0.26 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.58-1.67 (m, 2H, CH2), 1.75-1.85 (m, 4H, 2CH2), 2.89-2.95 (m, 4H, 2CH2), 7.33-7.40 (m, 1H, aromatic), 7.44-7.48 (m, 1H, aromatic), 7.60-7.65 (m, 1H, aromatic), 8.76-8.78 (m, 1H, aromatic), 9.05 (s, 0.6H, aromatic), 9.09-9.14 (m, 1H, aromatic), 8.37-8.39 (m, 1H, aromatic), 8.49 (s, 0.4H, aromatic)。
［参考例１３］ code name GIF-0614の合成
参考例１−３で得られたN−［２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（SRPIN-1, GIF-0340）（121 mg, 0.496 mmol）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（0.5 mL）溶液に、水素化ナトリウム（60％w/w油混合物）（200 mg, 0.500 mmol）を0 ℃にて加え、混合物を1時間撹拌した。これにヨウ化メチルのN,N-ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）溶液（0.8 M, 0.62 mL, 0.496 mmol）を0 ℃にて加え、混合物をさらに3時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（12 g, ヘキサン／酢酸エチル＝1／1）にて精製し、N−メチル-N−［２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-methyl-N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0614）（65.9 mg, 51.5%）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点119-121 ℃；TLC Rf 0.36 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.50-1.60 (m, 2H, CH2), 1.60-1.70 (m, 2H, CH2), 1.60-1.70 (m, 2H, CH2), 2.39-2.41 (m, 2H, CH2), 2.80-2.82 (m, 2H, CH2), 3.20 (s, 3H, CH3), 6.86 (d, 1H, J = 8.3 Hz, aromatic), 7.15 (d, 2H, J = 4.4 Hz, aromatic), 7.41 (d, 2H, J = 8.3 Hz, aromatic), 7.48 (s, 1H, aromatic), 8.44 (d, 2H, J = 4.4 Hz, aromatic)。
［参考例１４］ code name GIF-0616の合成
参考例１−３で得られたN−［２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（SRPIN-1, GIF-0340）（528 mg, 1.51 mmol）のトルエン（2.5 mL）溶液に、Lawesson’s試薬（328 mg, 0.811 mmol、商用品）を加え、混合物を100 ℃にて12時間還流撹拌した。室温に戻した後、これに2M 水酸化ナトリウム水溶液を加えて溶液をアルカリ性にし、さらに混合物を12M 水酸化ナトリウム水溶液（ｘ３）で逆抽出した。得られた水層に2M 塩酸を加えて溶液を酸性としたのち混合物をエーテル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（50 g, ヘキサン／酢酸エチル＝1／1）にて精製し、N−［２−（１−ピペリジニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸チオアミド（N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinthioamide）（GIF-0616）（186 mg, 33.7%）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点108-109 ℃；TLC Rf 0.27 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.61-1.62 (m, 2H, CH2), 1.68 (tt, 4H, J = 5.0, 5.0 Hz, 2CH2), 2.87 (t, 4H, J = 5.0 Hz, 2CH2), 7.32 (d, 1H, J = 7.8 Hz, aromatic), 7.51 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, aromatic), 7.71 (dd, 2H, J = 1.6, 6.4 Hz, aromatic), 8.76 (dd, 2H , J = 1.6, 6.4 Hz, aromatic), 9.58 (d, 1H , J = 1.6 Hz, aromatic), 10.5 (s, 1H, NH)。
［参考例１５］ code name GIF-0341の合成
［参考例１５−１］
１、４−ジクロロ−２−ニトロベンゼン（1,4-dichloro-2-nitrobenzene）（390 mg, 2.03 mmol、商用品）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（1 mL）溶液に、ピペリジン（piperidine）（660 μL, 6.66 mmol、商用品）を室温にて加え、混合物を18.5時間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸エチルで抽出した（ｘ３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g, ヘキサン／酢酸エチル＝10／1）にて精製し、１−（４−クロロ-２−ニトロフェニル）ピペリジン（1-(4-chloro-2-nitrophenyl)piperidine）（471 mg, 96.4%）をオレンジ色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.18 (ヘキサンのみ)。
［参考例１５−２］
参考例１５−１で得られた１−（４−クロロ-２−ニトロフェニル）ピペリジン（1-(4-chloro-2-nitrophenyl)piperidine）（471 mg, 1.95 mmol）のメタノール（10 mL）溶液に、濃塩酸（2.00 mL, 24.0 mmol）および無水二塩化スズ（1.84 g, 9.70 mmol） を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、16時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g, ヘキサン／酢酸エチル＝9／1）にて精製し、５−クロロ−２−（１−ピペリジニル）アニリン（5-chloro-2-(1-piperidinyl)aniline）（388 mg, 94.3%）を無色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.26 (ヘキサン／酢酸エチル＝18／1)。
［参考例１５−３］
参考例１５−２で得られた５−クロロ−２−（１−ピペリジニル）アニリン（5-chloro-2-(1-piperidinyl)aniline）（378 mg, 1.79 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（10 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（350 mg, 1.96 mmol、商用品）、トリエチルアミン（triethylamine）（740 μL, 5.30 mmol）、および触媒量の４−（ジメチルアミノ）ピリジン（4-(dimethylamino)pyridine）を室温にて順次加え、混合物を19時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（200 g, ヘキサン／酢酸エチル＝1／1）にて精製し、N−［５−クロロ−２−（１−ピペリジニル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[5-chloro-2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0341）（180 mg, 31.8%）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点141-143 ℃；TLC Rf 0.32 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.61-1.62 (m, 2H, CH2), 1.76 (tt, 4H, J = 5.0, 5.0 Hz, 2CH2), 2.82 (t, 4H, J = 5.0 Hz, 2CH2), 7.09 (dd, 1H, J =2.6, 8.8 Hz, aromatic), 7.14 (d, 1H, J = 8.8 Hz, aromatic), 7.75 (dd, 2H, J = 1.6, 4.4 Hz, aromatic), 8.60 (d, 1H , J = 2.6 Hz, aromatic), 8.85 (dd, 2H , J = 1.6, 4.4 Hz, aromatic), 9.66 (s, 1H, NH)。
［参考例１６］ code name GIF-0342の合成
［参考例１６−１］
４-クロロ-３−ニトロトルエン（4-chloro-3-nitrotoluene）（358 mg, 2.08 mmol、商用品）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（1 mL）溶液に、ピペリジン（piperidine）（660 μL, 6.66 mmol、商用品）を室温にて加えたのち、混合物を100 ℃にて17時間撹拌した。室温に戻したのちに、これに水を加え、混合物を酢酸エチルで抽出した（ｘ３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（50 g, ヘキサン／酢酸エチル＝50／1）にて精製し、１−（４−メチル-２−ニトロフェニル）ピペリジン（1-(4-methyl-2-nitrophenyl)piperidine）（212 mg, 46.2%）を無色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.54 (ヘキサン／酢酸エチル＝10／1)。
［参考例１６−２］
参考例１６−１で得られた１−（４−メチル-２−ニトロフェニル）ピペリジン（1-(4-methyl-2-nitrophenyl)piperidine）（212 mg, 0.880 mmol）のメタノール（5 mL）溶液に、濃塩酸（0.70 mL, 8.4 mmol）および無水二塩化スズ（834 mg, 4.39 mmol） を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、16時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝12／1）にて精製し、５−メチル−２−（１−ピペリジニル）アニリン（5-methyl-2-(1-piperidinyl)aniline）（164 mg, 95.0%）を淡黄色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.36 (ヘキサン／酢酸エチル＝10／1)
［参考例１６−３］
参考例１６−２で得られた５−メチル−２−（１−ピペリジニル）アニリン（5-methyl-2-(1-piperidinyl)aniline）（155 mg, 0.815 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（5 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（172 mg, 0.966 mmol、商用品）、トリエチルアミン（triethylamine）（340 μL, 2.44 mmol）、および触媒量の４−（ジメチルアミノ）ピリジン（4-(dimethylamino)pyridine）を室温にて順次加え、混合物を19時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（10 g, ヘキサン／酢酸エチル＝1／1）にて精製し、N−［５−メチル−２−（１−ピペリジニル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[5-methyl-2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0342）（69.5 mg, 28.8%）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点142-144 ℃；TLC Rf 0.35 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.62-1.70 (m, 2H, CH2), 1.75 (tt, 4H, J = 4.9, 4.9 Hz, 2CH2), 2.37 (s, 3H, CH3), 2.82 (t, 4H, J = 4.9 Hz, 2CH2), 6.94 (dd, 1H, J = 1.6, 8.1 Hz, aromatic), 7.12 (d, 1H, J = 8.1 Hz, aromatic), 7.76 (dd, 2H, J = 1.3, 4.5 Hz, aromatic), 8.38 (d, 1H, J = 1.6 Hz, aromatic), 8.84 (dd, 2H , J = 1.3, 4.5 Hz, aromatic), 9.75 (s, 1H, NH)。
［参考例１７］ code name GIF-0348の合成
［参考例１７−１］
１、４−ジフルオロ−２−ニトロベンゼン（1,4-difluoro-2-nitrobenzene）（225 mg, 1.41 mmol、商用品）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（0.5 mL）溶液に、ピペリジン（piperidine）（320 μL, 3.23 mmol、商用品）を室温にて加え、混合物を2時間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸エチルで抽出した（ｘ３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝12／1）にて精製し、１−（４−フルオロ-２−ニトロフェニル）ピペリジン（1-(4-fluoro-2-nitrophenyl)piperidine）（298 mg, 94.2%）をオレンジ色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.46 (ヘキサン／酢酸エチル＝12／1)。
［参考例１７−２］
参考例１７−１で得られた１−（４−フルオロ-２−ニトロフェニル）ピペリジン（1-(4-fluoro-2-nitrophenyl)piperidine）（289 mg, 1.28 mmol）のメタノール（5 mL）溶液に、濃塩酸（1.20 mL, 14.4 mmol）および無水二塩化スズ（1.22 g, 6.43 mmol） を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、21時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（25 g, ヘキサン／酢酸エチル＝12／1）にて精製し、５−フルオロ−２−（１−ピペリジニル）アニリン（5-fluoro-2-(1-piperidinyl)aniline）（250 mg, quant.）を無色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.34 (ヘキサン／酢酸エチル＝16／1)
［参考例１７−３］
参考例１７−２で得られた５−フルオロ−２−（１−ピペリジニル）アニリン（5-fluoro-2-(1-piperidinyl)aniline）（248 mg, 1.27 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（10 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（454 mg, 2.55 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（385 μL, 3.83 mmol）、を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、17時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（15 g, ヘキサン／酢酸エチル＝1.5／1）にて精製し、N−［５−フルオロ−２−（１−ピペリジニル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[5-fluoro-2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0348）（257 mg, 67.6%）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点115-116 ℃；TLC Rf 0.40 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.62-1.69 (m, 2H, CH2), 1.76 (bs, 4H, 2CH2), 2.82 (bs, 4H, 2CH2), 6.81 (ddd, 1H, J = 2.8, 8.8, 10.8 Hz, aromatic), 7.18 (dd, 1H, J = 5.6, 8.8 Hz, aromatic), 7.75 (dd, 2H, J = 2.0, 4.4 Hz, aromatic), 8.34 (dd, 1H , J = 2.8, 10.8 Hz, aromatic), 9.16 (dd, 2H , J = 2.0, 4.4 Hz, aromatic), 9.83 (s, 1H, NH)。
［参考例１８］ code name GIF-0349の合成
［参考例１８−１］
２-フルオロ-１−ニトロベンゼン（2-fluoro-2-nitrobenzene）（219 mg, 1.55 mmol、商用品）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（0.5 mL）溶液に、ピペリジン（piperidine）（338 μL, 3.41 mmol、商用品）を室温にて加え、混合物を2時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチルで抽出した（ｘ３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝20／1）にて精製し、１−（２−ニトロフェニル）ピペリジン（1-(2-nitrophenyl)piperidine）（315 mg, 98.8%）を無色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.53 (ヘキサン／酢酸エチル＝16／1)。
［参考例１８−２］
参考例１８−１で得られた１−（２−ニトロフェニル）ピペリジン（1-(2-nitrophenyl)piperidine）（315 mg, 1.52 mmol）のメタノール（10 mL）溶液に、濃塩酸（1.50 mL, 18.0 mmol）および無水二塩化スズ（1.45 g, 7.64 mmol） を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、17時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝15／1）にて精製し、２−（１−ピペリジニル）アニリン（2-(1-piperidinyl)aniline）（238 mg, 88.8%）を淡黄色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.19 (ヘキサン／酢酸エチル＝18／1)
［参考例１８−３］
参考例１８−２で得られた２−（１−ピペリジニル）アニリン（2-(1-piperidinyl)aniline）（203 mg, 1.15 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（5 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（616 mg, 3.46 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（800 μL, 5.73 mmol）を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、2時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝1／1）にて精製し、N−［２−（１−ピペリジニル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0349）（259 mg, 80.0%）を無色の固体として得た。
融点、TLCおよび1H NMR（CDCl3, 400 MHz）の結果は次の通りである。
融点111-113 ℃；TLC Rf 0.35 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)；1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.62-1.67 (m, 2H, CH2), 1.76 (tt, 4H, J = 4.8, 4.8 Hz, 2CH2), 2.85 (t, 4H, J = 4.8 Hz, 2CH2), 7.13 (td, 1H, J = 1.6, 7.8 Hz, aromatic), 7.21 (td, 1H, J =1.6, 7.8 Hz, aromatic), 7.24 (dd, 1H, J = 1.6, 7.8 Hz, aromatic), 7.77 (dd, 2H, J = 1.9, 4.4 Hz, aromatic), 8.53 (dd, 1H , J = 1.6, 7.8 Hz, aromatic), 8.84 (dd, 2H , J = 1.9, 4.4 Hz, aromatic), 9.71 (s, 1H, NH)。
［参考例１９］ code name GIF-0619の合成
［参考例１９−１］
１−フルオロ−２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene）（498 mg, 2.38 mmol、商用品）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（2 mL）溶液に、インドリン（indoline）（402 μL, 3.59 mmol、商用品）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（N,N-diisopropylethylamine）（619μL, 3.59 mmol）を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、1時間撹拌したのち、さらに70 ℃に加熱し、5.5時間撹拌した。混合物を室温に戻し、これに水を加えたのち、混合物を酢酸エチルで抽出した（ｘ３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g, ヘキサン／酢酸エチル＝20／1）にて精製し、１−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］インドリン（1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline）（730 mg, 99.4%）を濃赤色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.48 (ヘキサン／酢酸エチル＝6／1)。
［参考例１９−２］
参考例１９−１で得られた１−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］インドリン（1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline）（730 mg, 2.37 mmol）のメタノール（7 mL）溶液に、濃塩酸（1.28 mL, 15.4 mmol）および無水二塩化スズ（1.57 g, 8.30 mmol） を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、8時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（50 g, ヘキサン／酢酸エチル＝10／1）にて精製し、１−［２−アミノ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］インドリン（1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline）（619 mg, 93.9%）を赤橙色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.27 (ヘキサン／酢酸エチル＝6／1)。
［参考例１９−３］
参考例１９−２で得られた１−［２−アミノ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］インドリン（1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline）（518 mg, 1.86 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（5 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（669 mg, 3.76 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（773 μL, 5.58 mmol）を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、2.5時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（50 g, ヘキサン／酢酸エチル＝1／1）にて精製し、N−［２−（１−インドリニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[2-(1-indolinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0619）（643 mg, 90.1%）を無色の固体として得た。
TLC Rf 0.32 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)。
［参考例２０］ code name GIF-0620の合成
［参考例２０−１］
１−フルオロ−２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene）（508 mg, 2.43 mmol、商用品）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（2 mL）溶液に、イソインドリン（isoindoline）（679 μL, 5.98 mmol、商用品）を0 ℃にて加えた。混合物を室温に戻し、2時間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸エチルで抽出した（ｘ３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g, ヘキサン／酢酸エチル＝15／1）にて精製し、２−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］イソインドリン（2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline）（749 mg, quant.）を黄色の固体として得た。
TLC Rf 0.42 (ヘキサン／酢酸エチル＝10／1)。
［参考例２０−２］
参考例２０−１で得られた２−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］イソインドリン（2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline）（641 mg, 2.08 mmol）のメタノール（7 mL）溶液に、濃塩酸（1.13 mL, 13.5 mmol）および無水二塩化スズ（1.38 g, 7.28 mmol） を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、8.5時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g, ヘキサン／酢酸エチル＝15／1）にて精製し、２−［２−アミノ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］イソインドリン（2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline）（225 mg, 38.9%）を赤橙色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.38 (ヘキサン／酢酸エチル＝10／1)。
［参考例２０−３］
参考例２０−２で得られた２−［２−アミノ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］イソインドリン（2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline）（193 mg, 0.694 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（6 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（250 mg, 1.40 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（287 μL, 2.07 mmol）を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、3時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（5 g, ヘキサン／酢酸エチル＝1／1）にて精製し、N−［２−（２−イソインドリニル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[2-(2-isoindolinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0620）（266 mg, quant.）を無色の固体として得た。
TLC Rf 0.31 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)。
［参考例２１］ code name GIF-0621の合成
［参考例２１−１］
１−フルオロ−２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン（1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene）（506 g, 2.42 mmol、商用品）のN,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide (DMF)）（4 mL）溶液に、１、２、３、４−テトラヒドロイソキノリン（1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline）（909 μL, 7.26 mmol、商用品）を0 ℃にて加えた。混合物を室温に戻し、3.5時間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸エチルで抽出した（ｘ３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g, ヘキサン／酢酸エチル＝10／1）にて精製し、１、２、３、４−テトラヒドロ−２−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］イソキノリン（1,2,3,4-tetrahydro-2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoquinoline）（779 mg, 99.9%）をオレンジ色の固体として得た。
TLC Rf 0.54 (ヘキサン／酢酸エチル＝10／1)。
［参考例２１−２］
参考例２１−１で得られた１、２、３、４−テトラヒドロ−２−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］イソキノリン（1,2,3,4-tetrahydro-2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoquinoline）（658 mg, 2.04 mmol）のメタノール（8 mL）溶液に、濃塩酸（1.11 mL, 13.3 mmol）および無水二塩化スズ（1.35 g, 7.12 mmol） を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、18時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g, ヘキサン／酢酸エチル＝20／1）にて精製し、２−［２−アミノ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１、２、３、４−テトラヒドロイソキノリン（2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline）（426 mg, 71.4%）を赤橙色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.36 (ヘキサン／酢酸エチル＝10／1)。
［参考例２１−３］
参考例２１−２で得られた２−［２−アミノ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１、２、３、４−テトラヒドロイソキノリン（2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline）（315 mg, 1.08 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（5 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（390 mg, 2.19 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（449 μL, 3.24 mmol）を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、0.5時間撹拌した。これに水を加え、混合物をジクロロメタン（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g, ヘキサン／酢酸エチル＝2／1）にて精製し、N−［２−（１、２、３、４−テトラヒドロイソキノリン−２−イル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］イソニコチン酸アミド（N-[2-(1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-2-yl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0621）（418 mg, 97.6%）を無色の固体として得た。
TLC Rf 0.52 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)。
［参考例２２］ code name GIF-0608の合成
３−（トリフルオロメチル）アニリン（3-(trifluoromethyl)aniline、商用品）（208 mg, 1.29 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（5 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（670 mg, 3.76 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（864 μL, 6.20 mmol）、を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、23時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査を再結晶（酢酸エチル）にて精製し、N−［２−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）イソニコチン酸アミド（N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0608）（166 mg, 48.3%）を無色の固体として得た。
TLC Rf 0.26 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／2)。
［参考例２３］ code name GIF-0612の合成
２−ブロモ−５−（トリフルオロメチル）アニリン（2-bromo-5-(trifluoromethyl)aniline、商用品）（480 mg, 2.00 mmol）のジクロロメタン（dichloromethane）（5 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride）（427 mg, 2.39 mmol、商用品）、およびトリエチルアミン（triethylamine）（410 μL, 2.94 mmol）、を0 ℃にて順次加えた。混合物を室温に戻し、24時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残査を再結晶（酢酸エチル）にて精製し、N−［２−（２−ブロモ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）イソニコチン酸アミド（N-[2-bromo-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide）（GIF-0612）（308 mg, 44.8%）を無色の固体として得た。
TLC Rf 0.46 (ヘキサン／酢酸エチル＝1／1)。
［参考例２４］ SRPIN-1の毒性試験
哺乳動物細胞を用いて、SRPIN-1の染色体異常スクリーニング試験を行った。チャイニーズ・ハムスター CHL細胞（大日本製薬株式会社）を用い、染色体異常誘発性を指標としてSRPIN-1の変異原性を検索した。試験は、短時間処理（処理時間：6時間、回復時間：18時間）の代謝活性化法による場合（+S9 mix）、及び代謝活性化系非存在下での連続処理法（24時間処理）について検討した。CHL細胞は、10％牛胎仔血清（ICN Flow）を10％添加したMEMアール液体培地（GIBCO BRL）中、5% CO２、37℃の条件下で培養した。Sprague-Dawley系ラット（雄、日本チャールスリバー、7週齢）にphenobarbitalを1日1回の割合で4日間連続腹腔内投与し（1回目30mg/kg、2〜4回目60mg/kg）、さらに投与3日目に5, 6-benzoflavone 80mg/kgを腹腔内投与した肝臓から調製したS9 fraction（オリエンタル酵母工業；A.T. Natarajan et al., Mutation Res., 37, pp 83-90 (1976)）を、代謝活性化法によるアッセイのために用いた。アッセイに用いるS9 mixの組成は、1 mL中に4μmol HEPES buffer（pH 7.4）、5μmol MgCl2、33μmol KCl、5μmol G6P、4μmol NADP及び0.3 mL S9 fractionとした。
短時間処理法では、CHL細胞（約4×103 cells/mL）を5mLの培養液で60mmシャーレで3日間培養後、シャーレから培養液1.33 mLを抜き取り、S9 mixを0.83 mL加え、直ちに各用量の被験液0.5 mL（最終濃度5、1.58、0.5 mg/mL；0.5％カルボキシメチルセルロースナトリウム（CMC-Na）水溶液に溶解）を加えた。6時間培養した後、PBSで洗浄し新しい培養液5 mLと交換して、さらに18時間培養した。別に陰性対照として0.5%CMC-Na水溶液（0.5 mL）、陽性対照にはdimethylnitrosamine（DMN；最終濃度500μg/mL）を用いて、同様に操作した。連続処理法では、CHL細胞（約4×103 cells/mL）を含む培養液5 mLを60 mmシャーレで3日間培養後、培養液0.5 mLを抜き取り、各用量の被験液0.5 mL（最終濃度5、1.58、0.5 mg/mL）を加え、そのまま24時間（約1.5細胞周期）培養した。別に陰性対照として0.5%CMC-Na水溶液（0.5 mL）、陽性対照にはmitomycin C（MMC；最終濃度0.05μg/mL）を用いて、同様に操作した。
培養終了2時間前に10μg/mLのcolcemid 0.1 mLを加え、0.25% trypsin溶液で処理して細胞を回収し、0.075 M塩化カリウム溶液で低張処理後、methanol：酢酸（3：1）混合液にて固定し、乾燥後、Giemsa染色を施した。各用量あたり50個の良く拡がった分裂中期像を観察し、染色体の構造異常と数的異常の種類及び出現数を計測した。構造異常は染色分体切断（ctb）、染色分体交換（cte）、染色体切断（csb）、染色体交換（cse）、その他（5個以上の異常、断片化、細粉化など）に分類し、異常の種類別に出現数を記録した。また、これらの異常を1個でも有する細胞を異常細胞とした。異常細胞の出現率が5％未満を陰性、5％以上10％未満を疑陽性、10％以上を陽性と判定した。被験物質処理群で染色体異常細胞出現頻度が10％以上の出現頻度となった場合に、被験物質は染色体異常を誘発する物質であると判定した。陽性対照群における染色体構造異常細胞の出現頻度は、DMN 500μg/mL処理群で26個（52.0%）、MMC 0.5μg/mL処理群で24個（48.0%）であり、陰性対照では異常は認められなかったことから、本試験は適切に実施されたと判断された。
試験の結果、SRPIN-1の処理群における染色体構造異常細胞は、短時間処理法、連続処理法ともに、いずれの処理条件においても染色体構造異常及び数的異常細胞の増加は陰性であった。以上の結果、本試験条件下において、当該化合物はほ乳類培養細胞に対し染色体異常誘発性を有さないと考えられた。
［参考例２５］ SRPIN-1のインビボ投与
SRPIN-1のラットにおける単回経口投与毒性試験を行った。馴化期間中の体重増加が順調で一般状態にも異常を認めないSlc:SDラット（5週齢、日本エスエルシー）に、125、250、500、1000、2000 mg/kgのSRPIN-1を、1群あたり雌雄各2匹に経口投与した（投与容量 10 mL/kg）。動物は投与前日の夕方より投与後約4時間まで絶食させた。投与後2日間観察した結果、雌雄共に死亡の発現はみられず一般状態にも変化は認められなかった。次にSRPIN-1 2000 mg/kgを、上記と同様にSlc:SDラット（5週齢）雌雄各5匹に経口投与し、投与後14日間にわたって観察し、肉眼による毒性徴候の種類、程度、発現時期、回復時期及び死亡時期を記録した。その結果、雌雄共に死亡は認められず、一般状態にも異常は認められなかった。
［実施例１Ａ］ ＨＩＶ感染細胞におけるＳＲ蛋白質のリン酸化
ヒト胎児腎臓由来のFlp-In-293細胞（R750-07: Invitrogenより購入）に、HIVpNL4-3ゲノム（Adachi, A. et al., 1986, J. Virol. 59:284-289）の3マイクログラムを、遺伝子導入試薬Genejuice（70967-4; Novagenより購入） 9マイクロリットルを用いて遺伝子導入を行った。4日後、細胞にSDS-PAGEサンプルバッファーを１ミリリットル加えて溶解させ、95℃で3分熱変性させた後に、すみやかに氷上において、蛋白質サンプルとした。
この蛋白質サンプルをウエスタン解析に用いた。サンプルは4-20%のグラジエントゲルによって、40mA、45分の条件でLaemini のバッファーを用いたSDS-PAGEにより分離した。マーカーとしてブロードレンジプレステインドマーカー（02525-35; ナカライ）を用いて分子量を検量した。続いてPROTRANニトロセルロースメンブレン（BA85; Schleicher&Schuell BioScienceより購入）にTransBlot SDセル(170-3940; Bio-radより購入)を用いて160mA, 60minの条件でセミドライブロッティングした。ブロッティング終了後、メンブレンはTBSで5分間振盪洗浄し、続けてBlockingOne(03953-95; ナカライより購入)を用いてブロッキングを1時間、室温で行った。メンブレンを再度TBSで洗浄し、TBSで希釈したリン酸化SR蛋白質を認識するマウスモノクローナル104抗体(Mab104; ATCCよりハイブリドーマを購入)、マウス抗SC35抗体（S4045; BDTransductionより購入）、マウスモノクローナル抗SF２抗体（AK103: Dr.Adrian Krainer氏より供与; Hanamura, A. et al., 1998, RNA 4:430-444; Kojima, T. et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:32247-56）と4℃、over nightでインキュベートした。
メンブレンをTBSで室温１０分振盪洗浄し、これを3回行った。その後、二次抗体としてHRP標識されたヒツジ抗マウスIgG抗体（NA9310; アマシャムより購入）をTBSで希釈し、メンブレンと室温で１時間インキュベートした。メンブレンをTBSで室温１０分振盪洗浄し、これを3回行った。その後、ECL Detection Reagents（RPN2105; アマシャムより購入）を用いた化学発光法により、LAS1000CCDカメラ（LAS1000; 富士フィルム）で取り込みを行った。結果を図1Aに示す。
その結果、HIVpNL4-3の感染にともなってMab104抗体、SC35抗体、SF2抗体を用いたウエスタン解析のシグナルは認められなくなり、SR蛋白質が脱リン酸化されているだけでなく、SC35やSF2という内在性のSR蛋白質が分解されていることが明らかとなった。
［実施例１Ｂ］ ＳＲ蛋白質の分解
ヒト胎児腎臓由来のFlp-In-293細胞に、HAタグを融合したSRp75, SRp55, SRp40遺伝子のプラスミド（HA-SRp75, HA-SRp55, HA-SRp40; Dr. Woan-Yuh TARNより供与）1マイクログラムをGenejuiceを用いて遺伝子導入し、36時間後に、ユビキチンプロテアソーム阻害剤であるMG132(474790; CALBIOCHEMより購入)を終濃度(10μM)で加えた。さらに10時間後に、SDS-PAGEサンプルバッファーで細胞を溶解して熱変性を行い、蛋白質サンプルとした。これを同様にSDS-PAGEを行い、ウサギ抗HA抗体（H1803; サンタクルーズより購入）を一次抗体、ロバ抗ウサギIgG抗体（NA9340; アマシャムより購入）を二次抗体としてウエスタン解析した。結果を図１Ｂに示す。
その結果、MG132を添加した細胞では、コントロールに比べて、強いシグナルが得られたことから、MG132によってSR75, SR55, SR40の蛋白質分解が阻害される結果を得た。また、この他のSR蛋白質についても同様のことが解っている（data not shown）ことから、SR蛋白質はMG132によるユビキチンプロテアソームを介して蛋白質分解されていることが明らかとなった。
［実施例２Ａ］SRPK2安定的発現細胞におけるＳＲ蛋白質のリン酸化
Flp-In-293細胞を用いて、マウスSRPK2遺伝子をFlp-In部位に1コピー導入したSRPK2安定的発現細胞を複数株樹立した。解析では親株Flp-In293をmockとして、複数株樹立したSRPK2安定的発現細胞のうちSRPK2-2を実験に用いた。この2つの細胞にpNL4-3を遺伝子導入して、4日後にHIV感染における内在性SR蛋白質の動態をウエスタン解析により調べた。
図１Ａと同様にウエスタン解析を行ったところ、SRPK2-2細胞にHIVpNL4-3ゲノムを遺伝子導入した場合に、Mab104抗体でSRp35、SRp40、SRp55、SRp75の位置にシグナルが認められることから、Mab104で認識されるSRドメインはリン酸化状態にあることが明らかとなった。
さらに、SC35抗体、SF2抗体を用いたウエスタン解析によるとHIVpNL4-3ゲノムを遺伝子導入したSRPK2-2細胞ではSC35、SF2のシグナルが認められた。図２Ａに示す。
これらの結果、通常HIV感染に伴ってSR蛋白質は分解されるが、SRPK2安定的発現細胞ではSR蛋白質のリン酸化状態が維持され、結果としてSR蛋白質が安定化される。このことは、SRPK2安定的発現細胞では、SR蛋白質がリン酸化状態にあり、ユビキチンプロテアソームを介した蛋白質の分解が起きないと考えられる。
［実施例２Ｂ］SRPK2安定的発現細胞におけるＳＲ蛋白質の存在
親株Flp-In293（mock）とSRPK2遺伝子をFlp-In部位に1コピー導入したSRPK2安定的発現Flp-In-293細胞（SRPK2-2細胞）に、HIVpNL4-3ゲノムを1マイクログラムと、HAタグを融合したSRp75, SRp55, 及びSRp40遺伝子のプラスミド（HA-SRp75, HA-SRp55, HA-SRp40; Dr. Woan-Yuh TARNより供与）1マイクログラムをGenejuiceにより遺伝子導入し、36時間後にサンプルを回収して、ウエスタン解析を行った。結果を図２Ｂに示す。その結果、HIV感染に伴ってFlp-In293細胞ではSC35,SF2だけでなく、SRp75、SRp55、SRp40についても、抗HA抗体によるシグナルが無くなるか、または弱くなっていた。またSRPK2-2細胞では、同様にシグナルはコントロールに比べて弱くなっているが、SC35,SF2と同様にSRp75、SRp55、SRp40のシグナルが見られる。
これらの結果は、HIV感染に伴ってSR蛋白質の分解が促進されるが、SRPK2-2細胞ではSR蛋白質をリン酸化するので、SR蛋白質が安定化されていることを意味している。
［実施例２Ｃ］ HIVの産生量を測定
実施例２Ａ（図2A）の実験の際に培養上清を回収してHIVの産生量を測定した。遺伝子導入後の培養上清を回収し、培養上清に含まれるHIV外膜蛋白質であるp24の量を、ルミパルスELISAシステム（富士レビオ）によって測定した。結果を図２Ｃに示す。
その結果、mockの培養上清に比べてSRPK2-2細胞では2.3倍量のHIVが産生されている結果を得た。
以上のことから、HIV感染に応答してSR蛋白質が脱リン酸化されるが、SR蛋白質を恒常的にリン酸化状態にした場合には、感染に応答したSR蛋白質の制御機構が働かないので、結果としてHIV産生を昂進させることが明らかとなった。
このことは、HIV感染に応答したSR蛋白質の脱リン酸化は、宿主の防御機構として機能していることを示唆している。
［実施例３Ａ］ in vivoでのHIVの産生に寄与するSR蛋白質の検討
HIVは、その遺伝子発現過程において宿主の因子を用いて転写、プロセシング、翻訳を行っている。特に、HIVのTat、Revは分断されたエクソンを持ち、その遺伝子発現にはmRNAのスプライシング反応が必須であると想定されている。
実施例１−２（図１−２）で示した様に、HIV感染に伴って宿主の防御機構が作動し、SR蛋白質は分解されることを示したが、in vivoでのHIVのスプライシング反応や、それに寄与するSR蛋白質については不明である。実際、SR蛋白質は細胞内に複数種類が存在しているので、これらのSR蛋白質を発現するプラスミド（0.5μg）をHIVpNL4-3ゲノム（1.0μg）とともに遺伝子導入して、その効果を検討した。結果を図３Ａに示す。
Mock、SC35、SF2、SRp40、SRp55、SRp75発現プラスミドを各々Flp-In293細胞に遺伝子導入し、36時間後に培養上清を回収し、ルミパルスELISAシステムを用いてHIVp24の量を測定した。
その結果、mockに比べてSRp40、SRp75ではHIVp24量は増加していることから、SRp40、SRp75にHIV産生を昂進する効果を認めた。
［実施例３Ｂ］hnRNPA1を用いた、in vivoにおけるHIV産生への効果の検討
図３Ｂに示したように、HIVpNL4-3ゲノム（0.5μg）と共に、一定量(500ng)のSRp40、SRp75発現プラスミドに加えて、hnRNPA1発現プラスミドの量を段階的に増やしてFlp-In293細胞へ遺伝子導入を行った。36時間後に培養上清を回収し、ルミパルスELISAシステムを用いてHIVp24の量を測定した。
その結果、hnRNPA1の量に依存して、ルミパルスELISAシステムにより測定したHIVp24量が減少する結果を得た。すなわちSRp40とSRp75に対して競合的にhnRNPA1が働いて、HIV産生を抑制している。
このことは、細胞内でHIVの遺伝子発現に、スプライシング反応を介して発現制御していることが示唆された。実際、細胞内にはSRp40やSRp75とhnRNPA1が共存しているので、HIV感染にともなう細胞内SR蛋白質の分解は、細胞内におけるhnRNPA1を優位にして、HIVの遺伝子発現を抑制することで防御機構として成立していると考えられる。
［実施例４Ａ］ 細胞内SR蛋白質のリン酸化を阻害するための、SRPKの阻害剤の探索
リン酸化酵素が共通に持つATP結合部位を標的として、競合的に結合する阻害剤を探索した。スクリーニングの結果ヒットした化合物は、分子量349.35のMaybridge社から既に販売されている化合物の一つであった（CAS Registry No. 218156-96-8）。しかしながら、リン酸化酵素の阻害に関しては、これまでいかなる発表もなされていない。我々はこれをSRPIN-1(SRPk Inhibitor-1)と名づけた。
［実施例４Ｂ］ SRPIN-1を用いたSRPK1のリン酸化活性の阻害の検討
SF2のRSドメインに相当するRSペプチド（NH2-RSPSYGRSRSRSRSRSRSRSRSNSRSRSY-OH）(配列番号：5) を合成した。これを10mM Tris-HCl(pH 7.5)で1mg/mlになるように溶解した。大腸菌で発現精製した組み換えSRPK1蛋白質を1μg用いて、反応バッファー（250μM MgCl2、0.25mM ATP、1 mCi [γ-32P] ATP、SRPIN-1終濃度0.1、0.3、1.0、3.0、10.0μM）中で30℃の湯浴で10分間インキュベートした。このリン酸化酵素の活性測定におけるSRPK1とRSペプチドの量、および反応時間の条件は、予め反応の直線性を検討し、直線性が成立する条件を選んでいる。
SRPK1とRSペプチドの反応を10分行った後、反応液をP81フォスフォセルロースメンブレン（P81; Whatman）に滴下し、５％リン酸溶液で洗浄した。洗浄後、P81メンブレンの32Pについての放射活性を液体シンチレーションカウンターによって測定した。結果を図４Ｂに示す。
その結果、SRPIN-1のSRPK1に対するIC50は約400nMである結果を得た。また同様の手法によって検討したCLK1、CLK2、CLK3、CLK4、SRPK2、PRP4、PKA、PKCについては、終濃度10μMでも阻害効果を見出せなかったことから、SRPIN-1はSRPK1の特異的酵素阻害剤と言える。
［実施例４Ｃ］ SRPIN-1を用いたin vivoにおけるSR蛋白質のリン酸化阻害と、それに伴うSR蛋白質分解の誘導の検討
Flp-In293細胞にHA-SRp75プラスミド（1.0μg）を遺伝子導入して、36時間後にMG132(終濃度10μM)、SRPIN-1(10、20、50μM)をそれぞれ添加して15時間インキュベートした。その後、SDS−PAGEサンプルバッファーで細胞を溶解して、蛋白質サンプルとした。このサンプルを、SDS-PAGEして、抗HA抗体を用いたウエスタン解析を行った。また蛋白質量のコントロールとして抗βアクチン抗体を用いてウエスタン解析を行った。結果を図４Ｃに示す。
その結果、SRPIN-1の濃度依存的にHA抗体のシグナルが弱くなる結果を得た。このことは、SRPIN-1依存的に内在性のSRPK1活性が阻害されたことで、結果としてSRp75蛋白質が分解されたことを示している。
このことは、SRPIN-1によるSRPK1の阻害は、in vivoにおいてSR蛋白質のリン酸化を阻害することが可能であり、その結果としてSR蛋白質は不安定化して蛋白質分解が促進されることを意味している。
［実施例４Ｄ］ SRPIN-1の添加による、HIV感染の阻害の検討
MT-4細胞に、293T細胞で調製したHIVビリオンを添加して、感染実験を行った。まずウイルス調製液をMT-4細胞に加えると同時に、SRPIN-1（終濃度0.5、10、20μM）を添加する。2時間37℃5% CO2の培養条件下でインキュベートした後、細胞を遠心して新しい培養液に交換した。その後、48時間後に培養上清を回収してルミパルスELISAシステムによってHIVp24の量を測定した。結果を図４Ｄに示す。
その結果、ルミパルスELISAシステムによって測定したHIVp24の量は、SRPIN-1の濃度に依存して減少する結果を得た。このことは、SRPIN-1がHIV産生を濃度依存的に阻害できることを意味している。
［実施例５］ SRPIN-1類縁体を用いたSRPK1/2のリン酸化活性の阻害
実施例４Ｂと同様に、SRPIN-1類縁体を用いたSRPK1およびSRPK2のリン酸化活性の阻害活性を確認した。大腸菌で発現精製した組み換えSRPK1蛋白質およびSRPK2蛋白質 1μgを用いて、反応バッファー（400μM HEPES (pH 7.5)、100μM MgCl2、200μM ATP、1 mCi [γ-32P] ATP、RSペプチド (配列番号：5) 1 mg/ml、SRPIN-1類縁体各 10μM (DMSO中)）中で30℃の湯浴で20分間インキュベートした。
SRPK1またはSRPK2とRSペプチドの反応を20分行った後、反応液をP81フォスフォセルロースメンブレン（P81; Whatman）に滴下し、５％リン酸溶液で洗浄（10分を3回）した。洗浄後、P81メンブレンの32Pについての放射活性を液体シンチレーションカウンターによって測定した。その結果、図５Ａに示したように、各SRPIN-1類縁体はSRPK1および/またはSRPK2に対するリン酸化活性阻害効果を示した。特に、化合物番号340 (SRPIN-1)〜348、612、613、615、618、619、621、624、625では、SRPK1またはSRPK2に強い阻害効果が認められた。
次に、各SRPIN-1類縁体のHIV複製に対する抑制効果を確認した。MT-4細胞 (JCRB No. JCRB0135) に、293T細胞で調製したHIVビリオンを添加して、感染実験を行った。まずウイルス調製液をMT-4細胞に加えると同時に、SRPIN-1類縁体（終濃度 5、10、20μM）を添加した。2時間37℃、5% CO2の培養条件下でインキュベートした後、細胞を遠心して新しい培養液に交換した。48時間後に培養上清を回収してルミパルスELISAシステムによってHIVp24の量を測定した。その結果、図５Ｂに示した各SRPIN-1類縁体はHIV複製を阻害する活性を有していた。特に化合物番号340、341、342、343、345、347、348、608、613、615、616、618、619、620、622、623、624、625、626では、HIV増殖に対する強い抑制効果が認められた。また、図５Ｃに示したように、他の細胞（Jurkat）を用いた実験でも同様にHIV増殖を抑制する効果が確認された。
［実施例６］ シンドビスウイルスに対する増殖抑制効果
Vero細胞（JCRB0111）にシンドビスウイルス（4.7x107 PFU/ml）を5 microL加え、24時間培養した培養上清をストックウイルスとして調製した。これをBHK21 C13 細胞 (JCRB9020) に、102から107 PFU となるように希釈して添加すると同時に、SRPIN-1（終濃度 5、10、20、または40μM）を添加した。室温で１時間感染させた後、１％メチルセルロース (SIGMA M0512-100G) を含む培地を加え、48時間、37℃、5% CO2の培養条件下で静かに培養し、位相差顕微鏡下で細胞形態を観察するとともに、シンドビスウイルス感染により細胞死したプラーク数をカウントし（プラークアッセイ）、PFU/mlを計算した。
図６Ａに、ウイルス感染の20時間後の細胞の位相差顕微鏡像を示した。SRPIN-1非投与細胞（図中の "+SIN、対照"）では、シンドビスウイルスの増殖による細胞傷害が顕著に認められたが、SRPIN-1（40μM）の投与により細胞傷害は劇的に抑制されることが分かる（図中の "+SIN、40μM (#340)"）。プラークアッセイの結果でも、5μM以上のSRPIN-1はシンドビスウイルスの増殖を有意かつ濃度依存的に抑制することが判明した（図６Ｂ）。
［実施例７］ サイトメガロウイルスに対する増殖抑制効果
HFL1細胞（IFO50074）に、サイトメガロウイルス（1x104 PFU/ml）を添加すると同時に、SRPIN-1またはその類縁体（化合物番号 340および349；終濃度 20または40μM）を添加した。その結果、感染7日後に、位相差顕微鏡下でサイトメガロウイルスの感染したHFL1細胞を観察したところ、図７に示すように、SRPIN-1を添加しなかった対照群のHFL1細胞 (図中の1および２) はサイトメガロウイルス感染に特有の形態変化と細胞死が高率に観察されたのに対し、SRPIN-1 (20μM) を添加したHFL1細胞 (図中の3) においては、サイトメガロウイルスを感染させたにも関わらず、異常な形態変化や細胞死は認められなかった。高濃度 (40μM) のSRPIN-1を添加したHFL1細胞においては一部の当該化合物が惹起したと思われる細胞の形態変化を認めた。またSRPIN-1類縁化合物 (化合物番号349) 20μMあるいは40μMをHFL1細胞に添加することによっても、サイトメガロウイルスの感染による異常な形態変化や細胞死は抑制された (図中の５および６)。この結果、本試験条件下において、SRPIN-1とその類縁化合物はサイトメガロウイルスの感染による細胞の形態変化や細胞死を抑制できることが確認された。
［実施例８］ SARSウイルスに対する増殖抑制効果
Vero細胞 (JCRB0111) に、SARSウイルス (FFM-1) (Yamamoto, N. et. al., Biochem Biophys Res Commun. 318, 719-725 (2004)) を感染させ、同時にSRPIN-1またはその類縁体（終濃度 5、10、20、40μM）を添加した。室温で２時間感染させた後、１％メチルセルロース（SIGMA M0512-100G）を含むD-MEMを加え、48時間、37℃、5% CO2の培養条件下で培養した。その結果、SARSウイルス感染により細胞死したプラーク数をカウントし（プラークアッセイ）、PFU/mlを計算した。その結果、図８Ａに示したように、40μMのSRPIN-1およびその類縁化合物 (化合物番号349) はSARSウイルスの増殖を有意に抑制した。ただし、その効果はSRPIN-1の方が、類縁化合物 (化合物番号349) と比べて、ウイルス増殖抑制効果がより顕著であった。また図８Ｂに示したように、SRPIN-1は1μMから40μMの濃度範囲において濃度依存的にSARSウイルスの増殖を抑制することが判明した。
本発明により、SRPIN-1（SR protein phosphorylation inhibitor 1）およびその類縁体がリン酸化酵素SRPKの阻害活性を有することが明らかにされた。SR蛋白質はSRPKによるリン酸化によって細胞中で安定に存在しているが、これらのSRPK阻害剤によってSRPKの酵素活性を阻害すると、SR蛋白質のリン酸化が阻害され、ユビキチン・プロテアソーム経路を介して分解されることを見出した。そこでSRPK阻害剤を添加してSRPKの阻害を試みたところ、HIV感染実験ではSRPK阻害剤にウイルス複製を抑制する抗ウイルス作用を有することを見出した。
更に、本発明は、ＳＲ蛋白質の活性を制御することにより、同一のメカニズムで、広範囲なウイルスに対して有効な抗ウイルス剤を提供するという効果を奏するものである。

Claims (23)

  1. ＳＲ蛋白質の活性を制御するＳＲ活性制御剤を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
  2. ＳＲ蛋白質が、SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, HRS/SRp40, SRp46, 又はSRp75のいずれかである請求項１記載の抗ウイルス剤。
  3. ＳＲ活性制御剤がＳＲ蛋白質の脱リン酸化を促進する物質又は組成物である請求項１又は２項記載の抗ウイルス剤。
  4. フォスファターゼ２Ａ（Phosphatase 2A）を活性化する活性化剤である請求項３項記載の抗ウイルス剤。
  5. HIVのtat遺伝子又はアデノウイルスのE4-ORF4遺伝子又はワクシニアウイルスのＶＨ１遺伝子を載せた遺伝子治療用の発現ベクターである請求項４記載の抗ウイルス剤。
  6. ＳＲ活性制御剤がＳＲＰＫを阻害する物質である請求項１又は２記載の抗ウイルス剤。
  7. ＳＲＰＫがＳＲＰＫ１またはＳＲＰＫ２である請求項６記載の抗ウイルス剤。
  8. ＳＲ活性制御剤がＳＲＰＫ遺伝子の発現阻害剤である請求項１又は２記載の抗ウイルス剤。
  9. ＳＲＰＫ遺伝子の発現阻害剤が、ＳＲＰＫに対するmiRNA又はsiRNA又はモルフォリノオリゴ、あるいは該miRNAまたはsiRMAの発現ベクターである請求項８記載の抗ウイルス剤。
  10. ＳＲ活性制御剤がＳＲ蛋白質の活性と逆の活性を有する物質である請求項１又は２記載の抗ウイルス剤。
  11. ＳＲ蛋白質の活性と逆の活性を有する物質がhnRNPA1発現ベクターである請求項１０記載の抗ウイルス剤。
  12. ウイルスが、（１）ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、重症急性呼吸器症候群（SARS）、ポリオウイルス、ヒトライノウイルス、成人T細胞白血病ウイルス（HTLV-I）、Ａ型、Ｃ型、Ｄ型又はＥ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、ヒトコロナウイルス、エボラ出血熱ウイルス、インフルエンザウイルス、若しくはシンドビスウイルスのいずれかのＲＮＡ型ウイルス、又は（２）単純ヘルペスウイルス、ヒトアデノウイルスを含め、B型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス、天然痘ウイルス、ポリオーマウイルス、若しくはヒトパピローマウイルスのいずれかのDNA型ウイルスである、請求項１〜１１いずれか１項記載の抗ウイルス剤。
  13. 試験化合物をＳＲＰＫに作用させる工程、及びＳＲＰＫのＳＲ蛋白質をリン酸化する能力を検定する工程、および該能力を阻害する化合物を選抜することを含む、抗ウイルス剤のスクリーニング方法。
  14. SR タンパク質又はArg-Ser（RS）若しくはSer-Arg（SR）の２回以上連続するペプチドをSRPKの基質としてＳＲ蛋白質をリン酸化する能力を検定する工程を含む、請求項１３のスクリーニング方法。
  15. 請求項１３又は請求項１４の方法により得られた化合物を製剤化する工程を含む、抗ウイルス剤の製造方法。
  16. 下記一般式（Ｉ）
    （Ｉ）
    （式中、Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ2-6アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アジド基、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキルチオ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキルスルホニル基、カルボキシル基、ホルミル基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルコキシカルボニル基、アシル基、アシルアミノ基、またはスルファモイル基を示し；
    Ｒ2は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、または置換基を有していてもよいアリール基を示し；
    Ｒ3は、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、置換基を有していてもよい含窒素複素環、または置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環を示し；
    Ｒ4は、水素原子又はハロゲン原子を示し；
    Ｑは、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＳＯ2−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｓ）−を示し；
    Ｗは、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキルチオ基、置換基を有していてもよい含窒素複素環、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環、または下記一般式（ＩＩ）
    （ＩＩ）
    （式中、Ｒ5およびＲ6は、互いに同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよい含窒素複素環、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環、アシル基、もしくはアシルアミノ基を示し；または、
    前記Ｒ5およびＲ6は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換基を有していてもよい複素環を形成していてもよく、該複素環は、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環であってもよく；
    前記Ｒ5およびＲ6は、置換基を有していてもよいシクロアルキリデンアミノ基または置換基を有していてもよい芳香族環縮合シクロアルキリデン基であってもよい。）で表されるアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物。
  17. 前記Ｒ1が、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、またはハロゲン原子である、請求項１６に記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物。
  18. 前記Ｒ2が、水素原子またはＣ1-6アルキル基である、請求項１６または１７に記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物。
  19. 前記Ｒ3が、置換基を有していてもよいＣ6-10アリール基、または置換基を有していてもよい５〜１０員含窒素ヘテロアリール基である、請求項１６〜１８のいずれかに記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物。
  20. 前記Ｒ4が、水素原子である、請求項１６〜１９のいずれかに記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物。
  21. 前記Ｗが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式（ＩＩ）
    （ＩＩ）
    （式中、Ｒ5およびＲ6は、互いに同一又は異なって、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基を示し；または、
    前記Ｒ5およびＲ6は、隣接する窒素原子と一緒になって、置換基を有していてもよいヘテロ環式基を形成していてもよく、該ヘテロ環式基は、置換基を有していてもよい縮合芳香族ヘテロ環式基であってもよい。）で表される、請求項１６〜２０のいずれかに記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物。
  22. 請求項１６〜２１のいずれかに記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物を有効成分として含有する、ＳＲＰＫ阻害剤。
  23. 請求項１６〜２１のいずれかに記載のアニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物を有効成分として含有する、抗ウイルス剤。
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