ES2711313T3 - Método de regulación de la fosforilación de la proteína SR y agentes antivirales que comprenden el regulador de la actividad de la proteína SR como ingrediente activo - Google Patents

Método de regulación de la fosforilación de la proteína SR y agentes antivirales que comprenden el regulador de la actividad de la proteína SR como ingrediente activo Download PDF

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ES2711313T3 ES13001724T ES13001724T ES2711313T3 ES 2711313 T3 ES2711313 T3 ES 2711313T3 ES 13001724 T ES13001724 T ES 13001724T ES 13001724 T ES13001724 T ES 13001724T ES 2711313 T3 ES2711313 T3 ES 2711313T3
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Abstract

Un compuesto representado por la siguiente fórmula (I):**Fórmula** en donde R1 es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1-6 que puede tener sustituyentes, o un átomo de halógeno; R2 es un átomo de hidrógeno; R3 es un grupo 4-piridilo; R4 es un átomo de hidrógeno; Q es -C(O)-, -C(S)-, -SO2-, -C(S)NHC(O)-, -C(O)NHC(O)- o -C(O)NHC(S)-; y W es un grupo representado por la siguiente fórmula (II):**Fórmula** en donde R5 y R6, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forman un heterociclo que puede tener un sustituyente.

Description

DESCRIPCION
Metodo de regulacion de la fosforilacion de la protema SR y agentes antivirales que comprenden el regulador de la actividad de la protema SR como ingrediente activo
Campo tecnico de la invencion
La presente invencion se refiere al control de la fosforilacion de la protema SR, que estan implicada en el empalme de reacciones en el proceso de expresion genica. Ademas, la presente invencion tambien se refiere a compuestos utiles para controlar la actividad de la protema SR y a tratamientos antivirales, y usos de los mismos.
La presente invencion esta mas espedficamente relacionada con un derivado de la anilina; y una composicion farmaceutica que comprende dicho derivado de la anilina para uso en el tratamiento de infecciones vmcas.
Antecedentes de la tecnica
Muchos de los agentes antivirales descritos hasta la fecha como inhibidores de la replicacion vmca estan dirigidos a proteasas vmcas o transcriptasas inversas de virus, y asf sucesivamente.
Por ejemplo, en el caso del virus del VIH, se utilizan metodos dirigidos a las caractensticas del genoma del VIH. El genoma de ARN del VIH se convierte en ADN (provirus) por la transcriptasa inversa, y luego se integra en los cromosomas del huesped. Luego, los mecanismos de transcripcion y traduccion de las celulas huesped producen protemas vmcas a partir del ADN provmico. Estas protemas se expresan como grandes precursores de poliprotemas. Los precursores se escinden en las protemas mediante las proteasas, y luego el virus VIH se reconstituye y madura. Por lo tanto, se han estudiados y desarrollado inhibidores del VIH dirigidos a cada paso en este proceso de maduracion del VIH; dichos inhibidores incluyen (1) AZT y similares, que estan dirigidos a las transcriptasas inversas caractensticas de los retrovirus (Documento 1 no de patente) y (2), inhibidores de las proteasas, que inhiben las proteasas (Documento 2 no de patente).
Sin embargo, todos estos son agentes antivirales dirigidos individualmente que atacan espedficamente el proceso de propagacion de los distintos virus.
Documento 1 no de patente: Proc Natl Acad Sci USA Vol. 86, N° 21, paginas 8333-7
Documento 2 no de patente: Antimicrob Agents Chemother. Julio de 1995; 39 (7): 1559-64
El documento de patente europea EP 0952832 A1 se refiere a las quinolinas, su formulacion y uso como productos farmaceuticos.
El documento de patente internacional WO 02/02524 A1 se refiere a los derivados del pirrol, las composiciones farmaceuticas que los comprenden y su uso en medicina, especialmente en el tratamiento de las enfermedades vmcas. El documento de patente internacional WO 93/17027 A1 se refiere al uso terapeutico de los derivados de piridilpirrolotiazolcarboxamida.
El documento de patente europea EP 0315 017 A2 se refiere al uso de 2-hidroximetilen-3,4,5-trihidroxipiperidinas como agentes antivirales.
Kuczynski L et al., (Kuczynski L et al., Polish Journal of Pharmacology and Pharmacy, vol 36, N° 5, 1 de Enero de 1984, paginas 484-491) informan sobre la smtesis de isotiazoles 4 y 5 disustituidos.
El documento de patente internacional WO 99/65874 A1 se refiere a derivados de benzalinida y composiciones farmaceuticas que comprenden los mismos.
Fadeicheva A G et al. (Fadeicheva A G et al., Pharmaceutical Chemistry Journal, vol. 8, N° 8, 1 de Agosto de 1974, paginas 469-471) informan sobre la smtesis y actividad fisiologica de derivados de fluor de amidas de los acidos nicotmico e isonicotmico.
Daub H et al. (Daub H et al., Journal of Virology, vol. 76, N° 16, 1 de Enero de 2002, paginas 8124-8137) informan sobre la identificacion de SRPK1 y SRPK2 como las proteinoquinasas celulares mas importantes que fosforilan la protema del nucleo del virus de la hepatitis B.
Divulgacion de la invencion
Problemas que resolver por la invencion
Dado que la tasa natural de mutacion es mayor en los virus, y en los virus de ARN en particular, los agentes antivirales desarrollados hasta ahora, que se dirigen a las proteasas vmcas o transcriptasas inversas de virus, etc., a menudo pierden rapidamente su eficacia. Por lo tanto, se desea el desarrollo de agentes antivirales mas eficaces.
Espedficamente, de acuerdo con la reciente aparicion de varios virus nuevos, incluido el SARS, es un objetivo de la presente invencion desarrollar agentes antivirales de amplio espectro de larga duracion que tambien sean aplicables a los nuevos virus.
Medios para resolver los problemas
El problema subyacente de la presente invencion se resuelve con el material de las reivindicaciones independientes adjuntas; las realizaciones preferidas pueden tomarse de las reivindicaciones dependientes adjuntas.
Mas espedficamente, el problema subyacente de la presente invencion se resuelve en un primer aspecto con un compuesto representado por la formula (I):
Figure imgf000003_0002
en donde, R1 es un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo C1-6 que puede tener sustituyentes, o un atomo de halogeno;
R2 es un atomo de hidrogeno;
R3 es un grupo 4-piridilo;
R4 es un atomo de hidrogeno;
Q es -C(O)-, -C(S)-, -SO2-, -C(S)NHC(O)-, -C(O)NHC(O)-, o -C(O)NHC(S)-; y W es un grupo representado por la siguiente formula (II):
Figure imgf000003_0001
en donde, R5 y R6 junto con el atomo de nitrogeno adyacente forman un heterociclo que puede tener un sustituyente.
En una realizacion del primer aspecto, R1 es un atomo de fluor;
y
W es un grupo piperidinilo o un grupo perhidroazepina que puede tener un grupo alquilo C1-6 como sustituyente. El problema subyacente de la presente invencion se resuelve en un segundo aspecto con una composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de infecciones vmcas en un sujeto con necesidad del mismo, que comprende el compuesto segun el primer aspecto, incluyendo cualquier realizacion del mismo, o una sal o hidrato del mismo farmaceuticamente aceptable.
En una realizacion del segundo aspecto, la infeccion vmca esta causada por:
(1) cualquiera de los siguientes virus de ARN: el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), smdrome respiratorio agudo severo (SRAS), poliovirus, rinovirus humano, virus de leucemia de celulas T en adultos (HTLV-I), virus de la hepatitis A, C, D, y E, virus vaccinia, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, coronavirus humano, virus del Ebola, virus de la gripe o virus sindbis, o
(2) cualquiera de los siguientes virus de ADN: el virus del herpes simple, adenovirus humano, virus de la hepatitis B, citomegalovirus, virus EB, virus del herpes, virus del herpes humano, virus de la viruela, virus de la polioma o virus del papiloma humano.
En una realizacion del segundo aspecto, la infeccion vmca esta causada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
En una realizacion del segundo aspecto, la infeccion vmca esta causada por el virus del herpes simple.
En una realizacion del segundo aspecto, la infeccion vmca esta causada por el adenovirus humano.
En una realizacion del segundo aspecto, la infeccion vmca esta causada por el citomegalovirus.
Los presentes inventores han estudiado previamente la fosforilacion de protemas SR, que estan involucradas en sistemas de expresion de genes. En particular, los presentes inventores fueron los primeros en el mundo en clonar SRPK2, una enzima que fosforila las protemas SR (Biochem. Biophys. Res. Commun. 242, 357-364), SPK1, un homologo de SRPK de nematodos, (Mech. Dev. 99, 51-64), hPRP4 (J. Biol. Chem. 277, 44220-44228), y CLASP, un factor regulador de la protema quinasa SR Clk4 (J. Biol. chem. 276, 32247-32256).
Las protemas SR son protemas de union a ARN ricas en serina y arginina. Las protemas SR suelen compartir uno o dos motivos de reconocimiento de ARN (RRM) y un dominio RS (rico en arginina/serina) que es rico en secuencias RS consecutivas. Las protemas desempenan un papel importante en el procesamiento del ARN eucariotico, y en el empalme del pre-ARNm en particular.
Se ha informado sobre los siguientes diez tipos de protemas de union a ARN que pertenecen a la familia de protemas SR de mairnfero: X16/SRp20, SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, 9G8, HRS/SRp40, SRp46, SRp55, SRp75, y p54. Se ha demostrado que la mayona de las protemas SR estan fosforiladas en las celulas. En particular, el analisis de mapeo de peptidos ha revelado que SF2/ASF, una protema SR, se fosforila en multiples sitios dentro del dominio SR (J. Cell. Biol. (1991) 115: 587-596). Ademas, se sabe que la fosforilacion potencia la capacidad de SF2/ASF para unirse selectivamente a UlsnRNP (Genes & Dev. (1997) 11: 334-344). La fosforilacion y la desfosforilacion de los dominios SR se requieren para la formacion y reordenamiento del espliceosoma. Cuando se inhibe esta fosforilacion y desfosforilacion, el procesamiento del ARNm se vuelve anormal. Los dominios SR se encuentran no solo en las protemas de union al ARN, como se describio anteriormente, sino tambien en varias protemas funcionales que se cree que funcionan en el nucleo. Estas protemas se han denominado "familia de protemas relacionadas con el SR" (Biochem. Cell Biol. (1999) 77: 277-291).
Mientras se estudiaba los estados de fosforilacion de protemas de la familia SR en celulas infectadas por virus, los presentes inventores descubrieron inesperadamente que en las celulas infectadas por virus la fosforilacion de las protemas SR estaba inhibida, y estas protemas se degradaban a traves de la ruta de ubiquitina-proteosoma. Tambien descubrieron un fenomeno por el cual, a la inversa, las protemas SR se estabilizaban y la produccion de virus aumentaba con la expresion forzada de una protema SR, tal como SRp40 o SRp75, o una protema quinasa SR, tal como SRPK1 o SRPK2. Esto sugiere que las protemas SR desempenan un papel importante en la replicacion vmca y que la desfosforilacion de las protemas SR funciona como un sistema de defensa contra la invasion vmca del cuerpo.
Las protemas SR se unen a U1snRNP o U2AF, y se requieren para la formacion del espliceosoma; se cree que los dominios RS desempenan un papel importante en esa interaccion protema-protema. Ademas, las protemas SR influyen en la seleccion del sitio de empalme, promoviendo la seleccion de sitios de empalme 3' proximos a un intron. Al contrario, las ribonucleoprotemas heteronucleares (hnRNPs), tales como hnRNP A1, A2 y B1, promueven la seleccion de sitios de empalme 3' distales. Por lo tanto, la seleccion del sitio de empalme puede depender de la proporcion intracelular de la protema SR y de la protema hnRNP.
Los presentes inventores por lo tanto han desarrollado y proporcionado agentes antivirales dirigidos a las protemas SR, que se encontro que desempenaban un papel importante en la replicacion vmca.
Espedficamente, primero, los inventores trataron de inhibir las protemas SR mediante la inhibicion de la protema quinasa SR.
Puesto que no habfa compuestos de bajo peso molecular conocidos que inhibieran la actividad SRPK, los presentes inventores buscaron compuestos de bajo peso molecular dirigidos a SRPK. Como resultado, descubrieron que SRPIN-1 (inhibidor 1 de la fosforilacion de la protema SR; tambien denominado Compuesto N° 340) tema la actividad de inhibir la quinasa, SRPK; SRPIN-1 esta representado por la siguiente formula:
Figure imgf000004_0001
Los presentes inventores por lo tanto especularon que la replicacion vmca de VIH podna ser inhibida como resultado de la inhibicion de la fosforilacion de protemas SR utilizando SRPIN-1 para inhibir la actividad enzimatica de las SRPKs. Usando varias concentraciones de SRPIN-1, probaron si la replicacion vmca podna inhibirse en experimented de infeccion usando celulas MT-4 y VIH. As^ descubrieron que SRPIN-1 inhida notablemente la replicacion del VIH.
Ademas, los presentes inventores sintetizaron varios analogos de SRPIN-1 y se probaron sus efectos. Al igual que SRPIN-1, se encontro que los analogos mostraban actividad inhibidora de SRPK y actividad antivmca. Por lo tanto, SRPIN-1 y sus analogos son utiles como inhibidores de SRPK, y tambien pueden usarse como agentes antivirales.
Espedficamente, la presente invencion como se define en las reivindicaciones se refiere a agentes antivirales cuyos ingredientes activos comprenden agentes con actividad de control de SR que controlan la actividad de las protemas SR, compuestos con la actividad de inhibicion de SRPK, usos de los mismos, y tales. Mas espedficamente, la presente invencion se refiere a:
[1] un agente antiviral que comprende como ingrediente activo un agente que controla la actividad SR que controla una actividad de una protema SR;
[2] el agente antiviral de [1], en donde la protema SR es cualquiera de SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, HRS/SRp40, SRp46, o SRp75;
[3] el agente antiviral de [1] o [2], en donde el agente que controla la actividad SR es una sustancia o composicion que mejora la desfosforilacion de una protema SR;
[4] el agente antiviral de [3], que es un activador que activa la fosfatasa 2A;
[5] el agente antiviral de [4], que es un vector de expresion para terapia genica, que porta un gen tat del VIH, un gen E4-ORF4 de adenovirus o un gen VH1 del virus de la vaccinia;
[6] el agente antiviral de [1] o [2], en donde el agente que controla la actividad SR es una sustancia que inhibe una SRPK;
[7] el agente antiviral de [6], en donde la SRPK es una SRPK 1 o SRPK 2;
[8] el agente antiviral de [1] o [2], en donde el agente que controla la actividad SR es un inhibidor de la expresion del gen SRPK;
[9] el agente antiviral de [8], en donde el inhibidor de la expresion del gen SRPK es un ARNmi, ARNsi, o un oligomero morfolino que se dirige a una SRPK, o un vector de expresion para el ARNmi o ARNsi;
[10] el agente antiviral de [1] o [2], en donde el agente que controla la actividad SR es una sustancia que tiene la actividad de antagonizar una protema SR;
[11] el agente antiviral de [10], en el que la sustancia que tiene la actividad de antagonizar una protema SR es un vector de expresion para hnRNPA1;
[12] El agente antiviral de cualquiera de [1] a [11], en donde el virus es: (1) un virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), smdrome respiratorio agudo severo (SARS), poliovirus, rinovirus humano, virus de leucemia de celulas T en adultos (HTLV-I), virus de la hepatitis A, C, D, y E, virus de la vaccinia, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, coronavirus humano, virus del Ebola, virus de la gripe o virus sindbis, o (2) cualquiera de los siguientes virus de ADN: el virus del herpes simple, adenovirus humano, virus de la hepatitis B, citomegalovirus, virus EB, virus del herpes, virus del herpes humano, virus de la viruela, virus de la polioma o virus del papiloma humano, tambien se ha divulgado;
[13] un metodo para detectar un agente antiviral, que comprende las etapas de: hacer reaccionar un compuesto de prueba con una SRPK, probar la capacidad de la SRPK para fosforilar una protema SR y seleccionar un compuesto que inhiba esa capacidad;
[14] el metodo de seleccion de [13], que comprende la etapa de probar la habilidad de una SRPK para fosforilar una protema SR utilizando, como sustrato, una protema SR o un peptido con dos o mas Arg-Ser consecutivos (RS) o Ser-Arg (SR);
[15] un metodo para producir agentes antivirales, que comprende la etapa de formular un compuesto obtenido por el metodo de [13] o [14];
[16] un derivado de anilina representado por la siguiente formula (I):
Figure imgf000006_0001
o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo;
en donde, R1 representa un grupo alquenilo C2-6 que puede tener un sustituyente, un grupo alquinilo C2-6 que puede tener un sustituyente, un grupo arilo C6-10 que puede tener un sustituyente, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo azida, un grupo hidroxi, un grupo alcoxi C -6 que puede tener un sustituyente, un grupo alquiltio C1-6 que puede tener un sustituyente, un grupo alquilsulfonilo C1-6 que puede tener un sustituyente, un grupo carboxilo, un grupo formilo, un grupo alcoxicarbonilo C1-6 que puede tener un sustituyente, un grupo acilo, un grupo acilamino o un grupo sulfamoilo;
R2 representa un grupo alquilo C1-6 que puede tener un sustituyente, o un grupo arilo que puede tener un sustituyente;
R3 representa un grupo alquilo C1-6 que puede tener un sustituyente, un grupo alquenilo C2-6 que puede tener un sustituyente, un grupo arilo C6-10 que puede tener un sustituyente, un heterociclo que contiene nitrogeno diferente de un grupo 4-piridilo que puede tener un sustituyente, o un heterociclo aromatico condensado que puede tener un sustituyente;
R4 representa un atomo de halogeno;
Q es diferente de -C(O)-, -C(S)-, -SO2-, -C(S)NHC(O)-, -C(O)NHC(O)-, o -C(O)NHC(S)-;
W representa un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo C1-6 que puede tener un sustituyente, un grupo arilo C6-10 que puede tener un sustituyente, un atomo de halogeno, un grupo hidroxi, un grupo alcoxi Ci-6 que puede tener un sustituyente, un grupo alquiltio C1-6 que puede tener un sustituyente, un heterociclo que contiene nitrogeno que puede tener un sustituyente, un heterociclo aromatico condensado que puede tener un sustituyente o un grupo representado por la siguiente formula (II):
Figure imgf000006_0002
en donde, R5 y R6 son iguales o diferentes y cada uno representa un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo C1-6 que puede tener un sustituyente, un heterociclo que contiene nitrogeno que puede tener un sustituyente, un heterociclo aromatico condensado que puede tener un sustituyente, un grupo acilo o un grupo acilamino;
los anteriores R5 y R6 juntos pueden ser un grupo cicloalquilidenamino, que puede tener un sustituyente, o un grupo cicloalquilideno aromatico condensado que puede tener un sustituyente;
[18] el derivado de anilina de [16], o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde el R2 anterior es un grupo alquilo C1-6;
[19] el derivado de anilina de cualquiera de [16] a [18], o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde el R3 anterior es un grupo arilo C6-10 que puede tener un sustituyente, o un grupo heteroarilo de 5 a 10 miembros que contiene nitrogeno diferente del grupo 4-piridilo, que puede tener un sustituyente;
[21] el derivado de anilina de uno cualquiera de [16] a [19], o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde el W anterior representa un atomo de hidrogeno, un atomo de halogeno o un grupo representado por la siguiente formula (II):
Figure imgf000006_0003
en donde, R5 y R6 son iguales o diferentes y cada uno representa un grupo alquilo C1-6 que puede tener un sustituyente;
[22] un inhibidor de SRPK que comprende como ingrediente activo uno cualquiera de los derivados de anilina de [16] a [21], o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de los mismos; y
[23] un agente antiviral que comprende como ingrediente activo uno cualquiera de los derivados de anilina de [16] a [21], o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de los mismos.
A continuacion, se definen los terminos, los sfmbolos y tales como se usan en este documento, y la presente invencion se explicara con mas detalle.
En este documento, un "grupo alquilo C1-6" se refiere a un grupo alquilo lineal o ramificado que comprende de uno a seis atomos de carbono, que es un grupo monovalente derivado de la eliminacion de un atomo de hidrogeno arbitrario de un hidrocarburo alifatico que consta de uno a seis carbonos. Espedficamente, el grupo alquilo C1-6 incluye, por ejemplo, un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo 1 -propilo, un grupo 2-propilo, un grupo 2-metil-1 -propilo, un grupo 2-metil-2-propilo, un grupo 1-butilo, un grupo 2-butilo, un grupo 1 -pentilo, un grupo 2-pentilo, un grupo 3-pentilo, un grupo 2-metil-1 -butilo, un grupo 3-metil-1 -butilo, un grupo 2-metil-2-butilo, un grupo 3-metil-2-butilo, un grupo 2,2-dimetil-1-propilo, un grupo 1-hexilo, un grupo 2-hexilo, un grupo 3-hexilo, un grupo 2-metil-1 -pentilo, un grupo 3-metil-1 -pentilo, un grupo 4-metil-1 -pentilo, un grupo 2-metil-2-pentilo, un grupo 3-metil-2-pentilo, un grupo 4-metil-2-pentilo, un grupo 2-metil-3-pentilo, un grupo 3-metil-3-pentilo, un grupo 2,3-dimetil-1 -butilo, un grupo 3,3-dimetil-1 -butilo, un grupo 2,2-dimetil-1-butilo, un grupo 2-etil-1-butilo, un grupo 3,3-dimetil-2-butilo y un grupo 2,3-dimetil-2-butilo.
En este documento, un "grupo alquenilo C2-6" se refiere a un grupo alquenilo lineal o ramificado que comprende de dos a seis atomos de carbono. Espedficamente, el grupo alquenilo C2-6 incluye, por ejemplo, un grupo vinilo, un grupo alilo, un grupo 1-propenilo, un grupo 2-propenilo, un grupo 1 -butenilo, un grupo 2-butenilo, un grupo 3-butenilo, un grupo pentenilo y un grupo hexenilo.
En este documento, un "grupo alquinilo C2-6" se refiere a un grupo alquinilo lineal o ramificado que comprende de dos a seis carbonos. Espedficamente, el grupo alquinilo C2-6 incluye, por ejemplo, un grupo etinilo, un grupo 1 -propinilo, un grupo 2-propinilo, un grupo butinilo, un grupo pentinilo y un grupo hexinilo.
En este documento, un "grupo alcoxi C1-6" se refiere a un grupo oxi al que esta enlazado el "grupo alquilo C1-6" definido anteriormente. Espedficamente, el grupo alcoxi C1-6 incluye, por ejemplo, un grupo metoxi, un grupo etoxi, un grupo 1 -propiloxi, un grupo 2-propiloxi, un grupo 2-metil-1 -propiloxi, un grupo 2-metil-2 propiloxi, un grupo 1 -butiloxi, un grupo 2-butiloxi, un grupo 1 -pentiloxi, un grupo 2-pentiloxi, un grupo 3-pentiloxi, un grupo 2-metil-1 -butiloxi, un grupo 3-metil-1 -butiloxi, un grupo 2-metil-2-butiloxi, un grupo 3-metil-2-butiloxi, un grupo 2,2-dimetil-1 -propiloxi, un grupo 1 -hexiloxi, un grupo 2-hexiloxi, un grupo 3-hexiloxi, un grupo 2-metil-1 -pentiloxi, un grupo 3-metil-1-pentiloxi, un grupo 4-metil-1-pentiloxi, un grupo 2-metil-2-pentiloxi, un grupo 3-metil-2-pentiloxi, un grupo 4-metil-2-pentiloxi, un grupo 2-metil-3-pentiloxi, un grupo 3-metil-3-pentiloxi, un grupo 2,3-dimetil-1 -butiloxi, un grupo 3,3-dimetil-1-butiloxi, un grupo 2,2-dimetil-1-butiloxi, un grupo 2-etil-1-butiloxi, un grupo 3,3-dimetil-2-butiloxi y un grupo 2,3-dimetil-2-butiloxi.
En este documento, un "grupo alquiltio C1-6" se refiere a un grupo tio al que esta enlazado el "grupo alquilo C1-6" definido anteriormente. Espedficamente, el "grupo alquiltio C1-6" incluye, por ejemplo, un grupo metiltio, un grupo etiltio, un grupo 1 -propiltio, un grupo 2-propiltio, un grupo butiltio y un grupo pentiltio.
En este documento, un "grupo alcoxicarbonilo C1-6" se refiere a un grupo carbonilo al que esta enlazado el "grupo alcoxi C1-6" definido anteriormente. Espedficamente, el grupo alcoxicarbonilo C1-6 incluye, por ejemplo, un grupo metoxicarbonilo, un grupo etoxicarbonilo, un grupo 1-propiloxicarbonilo y un grupo 2-propiloxicarbonilo.
En este documento, un "grupo alquilsulfonilo C1-6" se refiere a un grupo sulfonilo al que esta enlazado el "grupo alquilo C1-6" definido anteriormente. Espedficamente, el grupo alquilsulfonilo C1-6 incluye, por ejemplo, un grupo metilsulfonilo, un grupo etilsulfonilo, un grupo 1 -propilsulfonilo y un grupo 2-propilsulfonilo.
En este documento, un "atomo de halogeno" se refiere a un atomo de fluor, un atomo de cloro, un atomo de bromo y un atomo de yodo.
En este documento, un "grupo arilo C6-10" se refiere a un grupo hidrocarburo aromatico dclico que comprende de seis a diez atomos de carbono. Espedficamente, el grupo arilo C6-10 incluye, por ejemplo, un grupo fenilo, un grupo 1-naftilo y un grupo 2-naftilo.
En este documento, un "heterociclo" se refiere a un anillo aromatico o no aromatico que puede comprender dobles enlaces dentro del anillo, en donde uno o dos de los atomos que constituyen el anillo son heteroatomos.
En este documento, un "heterociclo que contiene nitrogeno" se refiere a un anillo aromatico o no aromatico que puede comprender dobles enlaces dentro del anillo, en donde uno o dos de los atomos que constituyen el anillo son atomos de nitrogeno.
En este documento, un "heteroatomo" se refiere a un atomo de azufre, un atomo de oxfgeno o un atomo de nitrogeno.
En este documento, un "anillo heteroarilo de 5 a 10 miembros que contiene nitrogeno" se refiere a un anillo aromatico en el que de cinco a diez atomos constituyen el anillo, en donde al menos uno de los atomos que constituyen el anillo es un atomo de nitrogeno, y uno o mas heteroatomos distintos de los atomos de nitrogeno pueden ademas estar comprendidos.
Espedficamente, el anillo heteroarilo de 5 a 10 miembros que contiene nitrogeno incluye, por ejemplo, un anillo de piridina, un anillo de pirrol, un anillo de oxazol, un anillo de isoxazol, un anillo de tiazol, un anillo de isotiazol, un anillo de indol, un anillo de isoindol, un anillo de imidazol, un anillo de triazol, un anillo de pirazol, un anillo de piridazina, un anillo de pirimidina, un anillo de pirazina, un anillo de quinolina, un anillo de isoquinolina y un anillo de bencimidazol.
El "anillo de heteroarilo de 5 a 10 miembros" incluye preferiblemente un anillo de piridina, un anillo de pirrol y un anillo de imidazol, y mas preferiblemente incluye un anillo de piridina.
En este documento, un "grupo heteroarilo de 5 y 10 miembros que contiene nitrogeno" se refiere a un grupo mono o divalente derivado de la eliminacion de uno o dos atomos de hidrogeno arbitrarios del "anillo heteroarilo de 5 y 10 miembros" definido anteriormente. Espedficamente, el grupo heteroarilo de 5 y 10 miembros que contiene nitrogeno incluye, por ejemplo, un grupo piridilo, un grupo pirrolilo, un grupo oxazolilo, un grupo isoxazolilo, un grupo tiazolilo, un grupo isotiazolilo, un grupo indolilo, un grupo isoindolilo, un grupo imidazolilo, un grupo triazolilo, un grupo pirazolilo, un grupo piridazinilo, un grupo pirimidinilo, un grupo pirazinilo, un grupo quinolilo, un grupo isoquinolilo y un grupo bencimidazolilo.
En este documento, un "anillo heterodclico de 4 a 8 miembros" se refiere a un anillo no aromatico que cumple con la siguiente definicion:
1. constituyen el anillo de cuatro a ocho atomos;
2. uno o dos de los atomos que constituyen el anillo son heteroatomos;
3. uno o dos enlaces dobles pueden estar comprendidos en el anillo;
4. de uno a tres grupos carbonilo pueden estar comprendidos en el anillo; y
5. El grupo es monodclico.
El anillo heterodclico de 4 a 8 miembros es preferiblemente un anillo heterodclico de 4 a 8 miembros que contiene nitrogeno que contiene atomos de nitrogeno como heteroatomos.
Espedficamente, el anillo heterodclico de 4 a 8 miembros incluye, por ejemplo, un anillo de azetidina, un anillo de pirrolidina, un anillo de piperidina, un anillo de azepano, un anillo de azocina, un anillo de tetrahidropirano, un anillo de morfolina, un anillo de tiomorfolina, un anillo de piperazina, un anillo de tiazolidina, un anillo de dioxano, un anillo de imidazolina y un anillo de tiazolina. El "anillo heterodclico de 4 a 8 miembros" incluye preferiblemente un anillo de pirrolidina, un anillo de piperidina, un anillo de morfolina y un anillo de piperazina.
En este documento, un "grupo heterodclico de 4 a 8 miembros" se refiere a un grupo mono- o divalente derivado al eliminar uno o dos atomos de hidrogeno arbitrarios del "anillo heterodclico de 4 a 8 miembros" definido anteriormente. Espedficamente, el grupo heterociclo de 4 a 8 miembros incluye, por ejemplo, un grupo azetidinilo, un grupo pirrolidinilo, un grupo piperidinilo, un grupo azepanilo, un grupo azocanilo, un grupo tetrahidropiranilo, un grupo morfolinilo, un grupo tioimorfolinilo, un grupo piperazinilo, un grupo tiazolidinilo, un grupo dioxanilo, un grupo imidazolilo y un grupo tiazolilo.
En este documento, un "heterociclo aromatico condensado" se refiere a una estructura de anillo en la que el resto heterodclico esta condensado en orto con un anillo aromatico, tal como un anillo de benceno. El resto heterodclico es un heterociclo definido anteriormente.
En este documento, un "grupo heterodclico aromatico condensado" se refiere a una estructura de anillo en la que el resto heterodclico esta condensado en orto con un anillo aromatico, tal como un anillo de benceno. El resto heterodclico es un grupo heterodclico definido anteriormente.
El grupo heterodclico aromatico condensado incluye, por ejemplo, un grupo indolinilo, un grupo isoindolinilo y una 1,2,3,4-tetrahidroquinolina.
En este documento, un "grupo alquilo C1-6 halogenado" se refiere a un grupo en el que al menos un atomo de hidrogeno arbitrario en el "grupo alquilo C1-6" definido anteriormente se reemplaza con un "atomo de halogeno" definido anteriormente. El grupo alquilo C1-6 halogenado incluye, por ejemplo, un grupo trifluorometilo, un grupo difluorometilo y un grupo monofluorometilo.
En este documento, la frase "puede tener sustituyentes" significa que cierto compuesto puede tener una combinacion arbitraria de uno o mas sustituyentes en posiciones sustituibles. Espedficamente, los sustituyentes incluyen, por ejemplo, grupos seleccionados del siguiente Grupo A de sustituyentes:
Grupo A de sustituyentes
un atomo de halogeno, un grupo hidroxi, un grupo mercapto, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo formilo, un grupo carboxilo, un grupo trifluorometilo, un grupo trifluorometoxi, un grupo amino, un grupo oxo, un grupo imino, un grupo alquilo C1-6, un grupo alcoxi C1-6.
En este documento, la "sal" no esta particularmente limitada, siempre que sea una sal farmaceuticamente aceptable que se forme con un compuesto segun la presente invencion. Dichas sales incluyen, por ejemplo, sales de acidos inorganicos, sales organicas, sales de bases inorganicas, sales de bases organicas y sales de aminoacidos acidos o basicos.
Ejemplos de sales de acidos inorganicos preferidas incluyen: un clorhidrato, hidrobromato, sulfato, nitrato y fosfato. Ejemplos de sales organicas preferidas incluyen: un acetato, succinato, fumarato, maleato, tartrato, citrato, lactato, estearato, benzoato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato.
Ejemplos de sales de bases inorganicas preferidas incluyen: sales de metales alcalinos, tales como sales de sodio y sales de potasio; sales de metales alcalinoterreos, tales como sales de calcio y sales de magnesio; sales de aluminio; y sales de amonio. Ejemplos de sales de bases organicas preferidas incluyen: sales de dietilamina, sales de dietanolamina, sales de meglumina y sales de N,N'-dibenciletilendiamina.
Ejemplos de sales de aminoacidos acidos preferidas incluyen: aspartato y glutamato. Ejemplos de sales de aminoacidos basicos preferidas incluyen: sales de arginina, sales de lisina y sales de ornitina.
Cuando se dejan al aire, los compuestos de la presente invencion a veces absorben la humedad y algunas veces estan adheridos a agua absorbida o se convierten en hidratos. Tales hidratos tambien estan incluidos en la presente invencion.
Ademas, los compuestos de la presente invencion a veces se convierten en solvatos, absorbiendo algunos otros disolventes. Tales sales tambien estan incluidas en la presente invencion.
En este documento, "gen" se refiere a ADNs o ARNs que codifican unidades transcripcionales en una orientacion de sentido o antisentido. Las unidades transcripcionales se refieren a secuencias que se transcriben continuamente. En este documento, un acido nucleico (ADN o ARN) que codifica una protema tambien se conoce como un "gen para esa protema".
En este documento, el termino "o" se usa de forma no exclusiva. Por ejemplo, la frase "A, B o C" significa que al menos cualquiera de los elementos de A, B y C esta comprendido, y por lo tanto la frase tambien incluye cosas que comprenden dos o mas de, o los tres de A, B, y C, y cosas que comprenden otros elementos.
En este documento, los compuestos mostrados en las Tablas 1 a 3 se refieren a veces por numero de compuesto. Estos compuestos a veces se muestran como "GIF-", citando un numero de compuesto.
Efectos de la invencion
La presente invencion revelo que SRPIN-1 (inhibidor de la fosforilacion de la protema SR 1) y sus analogos teman la actividad de inhibir las SRPKs, que son quinasas. Se encontro que las protemas SR fosforiladas por SRPK existen de manera estable en las celulas; sin embargo, la fosforilacion de la protema SR se inhibe cuando la actividad de la enzima SRPK es inhibida por el SRPIN-1 o sus analogos, lo que conduce a la degradacion de las protemas SR a traves de la v^a de la ubiquitina-proteosoma.
A continuacion, los inventores inhibieron las SRPKs al agregar SRPIN-1 o sus analogos, y asf descubrieron que estos compuestos teman la actividad antivmca de inhibir la replicacion vmca en los experimentos de infeccion por VIH.
La presente invencion tambien es beneficiosa porque proporciona agentes antivirales que controlan la actividad de las protemas SR y, por el mismo mecanismo, son eficaces contra una amplia gama de virus.
Breve descripcion de los dibujos
Fig. 1A: Fosforilacion de la protema SR en celulas infectadas por VIH. El genoma pNL4-3 se introdujo en las celulas Flp-In-293. La fosforilacion de la protema SR en estas celulas Flp-In-293 se evaluo mediante analisis de Western utilizando el anticuerpo monoclonal de la protema SR antifosforilada de raton (Mab104), el anticuerpo anti-SC35 de raton y el anticuerpo anti-SF2 de raton.
Fig. 1B: Degradacion de la protema SR. Los plasmidos para los genes SRp75, SRp55 y SRp40 se fusionaron con la etiqueta HA y se introdujeron en las celulas Flp-In-293. Se anadio MG132 (474790; adquirido a CALBIOCHEM) a las celulas a una concentracion final de 10 |jM. Las celulas se lisaron y se desnaturalizaron por calor. La muestra de protema resultante se separo mediante s DS-PAGE, seguido de un analisis Western utilizando un anticuerpo de conejo anti-HA como el anticuerpo primario y un anticuerpo de burro anti-conejo IgG como el anticuerpo secundario.
Fig. 2A: Fosforilacion de la protema SR en celulas que expresan de forma estable SRPK2. Se introdujo el gen SRPK2 de raton en las celulas Flp-In-293 para preparar celulas que expresaran establemente SRPK2 (SRPK2-2). Se introdujo pNL4-3 en estas celulas SRPK2-2 y en celulas de la lmea celular parental Flp-In-293 (simulacro). Despues de cuatro d^as, la cinetica de la protema SR endogena durante la infeccion por VIH se evaluo mediante analisis de Western de la misma manera que en la Fig. 1A.
Fig. 2B: Existencia de protema SR en celulas que expresan SRPK2 de forma estable. El genoma y plasmidos de HIVpNL4-3 para los genes SRp75, SRp55 y SRp40 fusionados con la etiqueta HA se introdujeron en las celulas simuladas y en celulas SRPK2-2, preparadas como en la Fig. 2A. Las muestras se recogieron despues de 36 horas y se analizaron mediante transferencia Western.
Fig. 2C: Medicion de la cantidad de VIH producido. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo obtenidos como se describe en la Fig. 2A y se determino la cantidad de VIH producido.
Fig. 3A: Evaluacion de la protema SR que contribuye a la produccion de VIH in vivo. Se introdujeron el plasmido simulado y los plasmidos de expresion SC35, SF2, SRp40, SRp55 y SRp75 en celulas Flp-In293. Despues de 36 horas, se recogieron los sobrenadantes del cultivo y se determino la cantidad de HIVp24 usando el sistema de ELISA Lumipulse.
Fig. 3B: Evaluacion del efecto de hnRNPAI en la produccion de VIH in vivo. La transferencia de genes a celulas Flp-In293 se llevo a cabo utilizando una cantidad fija (500 ng) de un plasmido de expresion SRp40 o SRp75, asf como un plasmido de expresion hnRNPAI, cuya cantidad se incremento por etapas. Despues de 36 horas, se recogieron los sobrenadantes de cultivo y se determino la cantidad de HIVp24 usando el sistema de ELISA Lumipulse.
Fig. 4A: Busqueda de inhibidores de SRPK para inhibir la fosforilacion de la protema SR intracelular. Formula estructural de SRPIN-1 (Inhibidor 1 de SRPK).
Fig. 4B: Evaluacion de la inhibicion de la actividad de fosforilacion de SRPK1 por SRPIN-1. Se disolvio un peptido RS correspondiente al dominio RS de SF2 en Tris-HCl 10 mM hasta una concentracion de 1 mg/ml (pH 7,5). El peptido se incubo durante diez minutos con 1 |jg de protema SRPK1 en un tampon de reaccion (MgCh 250 jM , ATP 0,25 mM, 1 mCi de [y-32P]ATP, y SRPIN-1 (concentracion final: 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 o 10,0 jM ) en un bano de agua a 30° C. La mezcla de reaccion se dejo caer sobre una membrana de fosfocelulosa P81 (P81; Whatman), y luego la membrana se lavo con una solucion de acido fosforico al 5%. Despues del lavado, se determino la radioactividad de 32P en la membrana P81 en un contador de centelleo lfquido.
Fig. 4C: Evaluacion de la inhibicion in vivo de la fosforilacion de la protema SR utilizando SRPIN-1, y evaluacion de la induccion de la degradacion de la protema SR acompanante. Se introdujo el plasmido HA-SRp75 en celulas Flp-In293. Despues de 36 horas, se agregaron a las celulas Mg 132 (concentracion final: 10 jM ) y s Rp IN-1 (10 , 20 o 50 jM ). Las celulas se incubaron durante 15 horas y luego se lisaron. Despues de SDS-PAGE, las muestras se analizaron mediante transferencia de Western usando un anticuerpo anti-HA. El analisis de Western tambien se llevo a cabo utilizando un anticuerpo contra la actina beta como una cantidad de protema de control.
Fig. 4D: Evaluacion de la inhibicion de la infeccion por VIH despues de la adicion de SRPIN-1. Se preparo el virion del VIH usando celulas T 293 y luego se agrego a las celulas MT-4 junto con SRPIN-1 (concentracion final: 0,5, 10 o 20 jM ). Despues de dos horas de incubacion a 37° C bajo 5% de CO2, las celulas se centrifugaron para cambiar el medio de cultivo. El sobrenadante del cultivo se recogio despues de 48 horas, y la cantidad de HIVp24 se determino mediante el sistema de ELISA Lumipulse.
Fig. 5A: Evaluacion de las actividades inhibidoras de SRPK de SRPIN-1 y sus analogos. Se determinaron los efectos inhibidores de SRPIN-1 (Compuesto N°. 340) y sus analogos (Compuestos N°s. 341 a 349, y 608 a 626) sobre las actividades de fosforilacion de SRPK1 y SRPk2.
Fig. 5B: Efecto de SRPIN-1 y sus analogos en la inhibicion de la replicacion del HIV. Esta figura muestra los resultados del ensayo del efecto de SRPIN-1 y sus analogos en la inhibicion de la replicacion del VIH en celulas MT-4.
Fig. 5C: Efecto de SRPIN-1 y sus analogos en la inhibicion de la replicacion del HIV. Al igual que en la Fig. 5B, esta figura muestra los resultados del analisis del efecto de SRPIN-1 y sus analogos en la inhibicion de la replicacion del VIH en celulas Jurkat.
Fig. 6A: Actividad antivmica de SRPIN-1 contra el virus sindbis. Esta figura muestra imagenes microscopicas de contraste de fase de celulas infectadas con el virus sindbis. Se encontro un dano celular marcado causado por la propagacion del virus sindbis en celulas a las que no se habfa administrado SRPIN-1, mientras que el dano celular se inhibio dramaticamente al administrar SRPIN-1.
Fig. 6B: Actividad antivmca de SRPIN-1 contra el virus sindbis. Esta figura muestra los resultados de un ensayo de placa para celulas infectadas con el virus sindbis. SRPIN-1 inhibio significativamente la propagacion del virus sindbis en una forma dependiente de la concentracion cuando su concentracion fue de 5 jM o superior.
Fig. 7: Actividad antivmca de SRPIN-1 y analogos del mismo contra el citomegalovirus. Esta figura muestra imagenes microscopicas de contraste de fase de celulas infectadas con citomegalovirus. Las alteraciones morfologicas caractensticas de la infeccion por citomegalovirus y la muerte celular se encontraron con frecuencia en las celulas del grupo de control (1 y 2 en esta figura). Por el contrario, las alteraciones morfologicas anormales y la muerte celular causada por la infeccion por citomegalovirus fueron inhibidas en celulas a las que se agregaron 20 pl de SRPIN-1 o un analogo del mismo (Compuesto N°. 349) (3 y 5 en esta figura).
Fig. 8: Actividades antivmcas de SRPIN-1 y sus analogos contra el virus del SARS. Esta figura muestra los resultados de los analisis de placa para las celulas infectadas con el virus del SARS. Se determino el numero de placas en las que la infeccion por el virus del SARS dio lugar a la muerte celular para evaluar la actividad antivmca de SRPIN-1 y sus analogos (ensayo de placa). Como resultado, SRPIN-1 40 pM y sus compuestos analogos (Compuesto N° 349) inhibieron significativamente la propagacion del virus SARS, como se muestra en la Fig. 8A. Ademas, como se muestra en la Fig. 8B, se encontro que SRPIN-1 inhibe la propagacion del virus SARS de una manera dependiente de la concentracion dentro de un rango de concentracion de 1 a 40 pM.
Mejor modo de llevar a cabo la invencion
Los presentes inventores investigaron si los agentes antivirales contra una amplia gama de virus podnan proporcionarse aplicando ampliamente el fenomeno en el que la replicacion del VIH puede inhibirse mediante la inhibicion de las enzimas SRPK, que fosforilan las protemas Sr .
I. Protemas SR
Reduccion de su actividad: degradacion y estabilizacion
(1) Los presentes inventores investigaron la relacion entre la infeccion de las celulas con el virus del VIH y el estado de fosforilacion de la protema SR y la presencia de la protema SR en las celulas. Espedficamente, las celulas 293 se infectaron con el virus del VIH tipo NL4-3 y luego se midieron las cantidades totales de protema SR en las celulas y la protema fosforilada en las celulas usando anticuerpos contra la protema SR y contra la protema SR fosforilada.
Ademas, los presentes inventores tambien investigaron la relacion entre la infeccion por VIH de celulas forzadas a expresar SRPK, que fosforila la protema SR, y el estado de fosforilacion de la protema SR y la existencia de protema SR en estas mismas celulas. Espedficamente, de forma similar a la anterior, las celulas 293 forzadas a expresar SRPK-2 se infectaron con el virus del VIH tipo NL4-3. Las cantidades totales de protema SR en las celulas y la protema fosforilada en las celulas se midieron luego utilizando anticuerpos contra la protema SR y contra la protema SR fosforilada.
Los resultados descritos anteriormente muestran que la protema SR fosforilada se estabiliza en las celulas, pero la protema SR se puede degradar cuando se desfosforila.
Ademas, para confirmar la conclusion anterior, los presentes inventores expresaron la protema de fusion SR-HA en celulas 293 y midieron la intensidad de la senal de la fusion SR-HA cuando reacciono con un anticuerpo anti-HA en ausencia o presencia de MG132, un inhibidor de ubiquitina-proteosoma. Los inventores encontraron que MG132 inhibio la degradacion de la protema y que, por lo tanto, la protema SR se degradaba a traves de la v^ a de la ubiquitinaproteasoma.
Espedficamente, los presentes inventores especularon que los hospedadores degradan la protema SR como un mecanismo de defensa en respuesta a una infeccion vmca. Sin embargo, cuando la protema quinasa SR se expreso de manera forzada, la protema SR no se degrado, sino que se estabilizo mediante la fosforilacion. Se encontro que esta estabilizacion anula el mecanismo de defensa, lo que contribuye a mejorar la produccion vmca.
Espedficamente, los presentes inventores encontraron que la protema SR se degradaba por la ubiquitina-proteasoma cuando se desfosforilaba. Dado que la protema SR es esencial para la transcripcion de genes, la desfosforilacion de la protema SR puede inhibir la propagacion vmca.
(2) Los presentes inventores investigaron a continuacion la inhibicion de la protema quinasa SR. Se cree que la SRPK1/2, la familia quinasa Clk/Sty, PRP4, ADN topoisomerasa I y otras son quinasas candidatas responsables de la fosforilacion de las protemas SR, pero no se sabe mucho sobre sus diferencias funcionales en terminos de empalme. Por lo tanto, los presentes inventores investigaron la produccion vmca en celulas infectadas con virus cuando SRPK fue inhibida utilizando SRPIN-1, un inhibidor de SRPK. Se encontro que la inhibicion de SRPK por SRPIN-1 induce la degradacion activa de la protema SR.
(3) Las celulas se infectaron nuevamente con el VIH y, al mismo tiempo, se forzaron a expresar hnRNPA1, que se sabe que antagoniza la protema SR in vitro, lo que promueve el empalme. Como resultado, los presentes inventores descubrieron por primera vez que hnRNPA1 inhida la produccion de VIH in vivo en una manera dependiente de la dosis, mientras que SRp40 y SRp75 promovfan aun mas la produccion de VIH.
Como se describio anteriormente, la desfosforilacion de la protema SR es una reaccion de defensa biologica contra los virus (en el cuerpo humano). Se hada confirmado previamente que la protema SR era desfosforilada en celulas animales despues de la infeccion con adenovirus o virus vaccinia (Nature Vol. 393, paginas 185-187, EMBO Rep Vol.
3, paginas 1088-1093). Por lo tanto, como se describio anteriormente, se piensa que tras la desfosforilacion, la protema SR se degrada rapidamente y, por lo tanto, no esta disponible para la expresion del gen vmco. Como resultado, los virus no pueden propagarse.
Los presentes inventores confirmaron que la inhibicion de la actividad de la protema SR por los inhibidores de SRPK dio como resultado la inhibicion de la propagacion no solo del VIH sino tambien del virus sindbis, el citomegalovirus y el coronavirus SARS, que son virus diferentes del VIH. Por lo tanto, se puede concluir que la accion antivmca generada al controlar la actividad de la protema SR es eficaz contra una amplia gama de virus.
II.
La presente invencion como se define en las reivindicaciones comprende agentes antivirales que controlan la actividad de las protemas SR. La presente invencion como se define en las reivindicaciones comprende agentes antivirales cuyos ingredientes activos comprenden agentes que controlan la actividad de las protemas SR. El control de la actividad de las protemas SR tambien comprende el control de la expresion y la estabilizacion. Por ejemplo, la actividad de las protemas SR puede reducirse inhibiendo la transcripcion o traduccion de las protemas SR, o reduciendo la estabilidad de las protemas SR o los ARNm que codifican las protemas SR. Preferiblemente, cuando se controla la actividad de las protemas SR segun la presente invencion, los inhibidores de la actividad de las protemas SR reducen directa o indirectamente la actividad o el nivel de expresion de las protemas SR. Para reducir la actividad o el nivel de expresion de una protema SR, por ejemplo, ademas de usar la protema SR como una diana directa, es tambien preferible inhibir la fosforilacion de la protema SR por SRPKs y/o mejorar la desfosforilacion. La desfosforilacion de las protemas SR se promueve, por ejemplo, activando la protema fosfatasa 2A (tambien denominada fosfatasa 2A). Por lo tanto, la propagacion vmca se puede inhibir usando un compuesto que aumenta la expresion y/o la actividad de la protema fosfatasa 2A. La fosforilacion de las protemas SR tambien se puede inhibir al inhibir la expresion y/o la actividad de las SRPKs. Por lo tanto, los inhibidores de SRPK son agentes antivirales preferidos de la presente invencion.
Protemas SR como dianas para el control
Las protemas SR cuya actividad debe reducirse o inhibirse segun la presente invencion pueden ser protemas SR arbitrarias, e incluyen espedficamente X16/SRp20, SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, 9G8, HRS/SRp40, SRp46, SRp55, SRp75, y p54. Las protemas SR preferidas son SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp3ob, SRp30c, HRS/SRp40, SRp46 y SRp75, y las protemas SR particularmente preferidas son SRp40 y SRp75. De aqu en adelante, la protema SR se refiere a SF2/ASF/SRp30a, Sc35/PR264/SRp30b, SRp30c, HRS/SRp40, SRp46 o SRp75.
La secuencia del gen que codifica X16/SRp20 se expone, por ejemplo, en los nucleotidos 1-492 del numero de acceso L10838. La secuencia de aminoacidos de X16/SRp2o se expone en los numeros de acceso NP_003008 y AAA36648 (Zahler, A. et al., 1992, SR proteins: a conserved family of pre-mRNA splicing factors, Genes Dev. 6: 837-847). La secuencia del gen que codifica SF2/ASF/SRp30a se expone, por ejemplo, en los nucleotidos 91-834 del numero de acceso NM_006924. La secuencia de aminoacidos de SF2/ASF/SRp30a se expone en los numeros de acceso NP_008855 y Q07955 (Ge, H. et al., Cell 66, 373-382 (1991)). La secuencia del gen que codifica SC35/PR264/SRp30b se expone, por ejemplo, en los nucleotidos 156-818 del numero de acceso M90104. La secuencia de aminoacidos de SC35/PR264/SRp30b se expone en los numeros de acceso AAA60306 y Q01130 (Fu, X.D. y Maniatis, T. Science 256, 535-538 (1992)). La secuencia del gen que codifica SRp30c se expone, por ejemplo, en los nucleotidos 53-715 y en los nucleotidos 147-809 de los numeros de acceso U30825 y NM_003769, respectivamente. La secuencia de aminoacidos de SRp30c se expone en los numeros de acceso AAA93069, Q13242 y NP_003760 (Screaton, G.R. et al., EMBO J. 14, 4336-4349 (1995)). La secuencia de genes que codifica 9G8 se expone, por ejemplo, en los nucleotidos 54-464 del numero de acceso NM_006276. La secuencia de aminoacidos de 9G8 se expone en los numeros de acceso NP_006267, Q16629 y similares (Lejeune, F. et al., J. Biol. Chem. 276, 7850-7858 (2001); Popielarz, M. et al., J. Biol. Chem. 270, 17830-17835 (1995); Cavaloc, Y. et al., EMBO J. 13, 2639-2649 (1994)). La secuencia del gen que codifica HRS/SRp40 se expone, por ejemplo, en el numero de acceso AF020307 (unir (2406­ 2531, 2864-2925, 3049-3147, 3433-3503, 4740-4812, 5269-5382, 5472-5492)), y la secuencia de aminoacidos se expone en los numeros de acceso AAC39543 y Q13243, y otros (Du, K. y Taub, R., Gene 204 (1-2), 243-249 (1997); Screaton, G.R. et al., EMBO J. 14, 4336-4349 (1995)). La secuencia del gen que codifica SRp46 se expone, por ejemplo, en los nucleotidos 1-816 del numero de acceso AF031166. La secuencia de aminoacidos de SRp46 se expone en el numero de acceso AAK54351 y otros (Soret, J. et al., Mol. Cell. Biol. 18, 4924-4934 (1998)). La secuencia del gen que codifica SRp55 se expone, por ejemplo, en los nucleotidos 106-1137 del numero de acceso U30883. La secuencia de aminoacidos de SRp55 se expone en los numeros de acceso AAA93073 y Q13247, y otros (Screaton, G.R. et al., EMBO J. 14, 4336-4349 (1995); Zahler, A.M. et al., Genes Dev. 6, 837-847 (1992); Barnard, D.C. y Patton, J.G., Mol. Cell. Biol. 20, 3049-3057 (2000)). La secuencia del gen que codifica SRp75 se expone, por ejemplo, en los nucleotidos 98-1579 y los nucleotidos 98-1579 de los numeros de acceso BC002781 y NM_005626, respectivamente. La secuencia de aminoacidos de SRp75 se expone en los numeros de acceso AAH02781, NP_005617 y Q08170, y otros (Zahler, A.M. et al., Mol. Cell. Biol. 13, 4023-4028 (1993)). La secuencia del gen que codifica p54 se expone, por ejemplo, en los nucleotidos 84-1535 del numero de acceso M74002. La secuencia de aminoacidos de p54 se expone en los numeros de acceso AAA35554 y Q05519, y otros (Chaudhary, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 8189­ 8193 (1991)).
Virus dianas
Los agentes antivirales de la presente invencion como se definen en las reivindicaciones particularmente preferiblemente inhiben la propagacion del VIH, pero no estan limitados al virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y tambien tienen un efecto similar sobre otros virus, incluidos los virus de ARN, como el del smdrome respiratorio agudo severo (SARS), poliovirus, rinovirus humano, virus de leucemia de celulas T adultas (HTLV-I), virus de la hepatitis A, C, D y E (excluyendo el virus de la hepatitis B), virus de la vaccinia, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, coronavirus humanos, virus del Ebola, virus de la gripe, y los virus sindbis. Los coronavirus humanos incluyen los coronavirus del SARS (tambien conocidos como coronavirus o virus del SARS asociados con el SARS).
Dado que la desfosforilacion de la protema SR se ha informado como un mecanismo de defensa del huesped en la infeccion de los virus del herpes simple y los adenovirus humanos, que son virus de ADN, el SRPIN-1 afecta a los virus del herpes simple y los adenovirus humanos, y tambien tiene un efecto similar en los virus de la hepatitis B, citomegalovirus, virus e B, virus del herpes, virus del herpes humano, virus de la viruela, virus del polioma y virus del papiloma humano.
Los virus diana particularmente preferidos de la presente invencion incluyen los virus de la familia de retrovirus (Retroviridae; incluyendo los virus del genero lentivirus), familia de togavirus (Togaviridae; incluyendo virus del genero alfavirus), familia de herpesvirus (Herpesviridae; incluyendo familia de citomegalovirus) y virus de la familia coronavirus (Coronaviridae; incluidos los virus del genero coronavirus).
Agentes antivirales
La presente invencion incluye: (1) agentes antivirales que actuan mediante la reduccion o inhibicion de la actividad de la protema SR, mas espedficamente, agentes antivirales que actuan aumentando la desfosforilacion de las protemas SR, e (ii) agentes antivirales que actuan inhibiendo las protemas que fosforilan a las protemas SR.
La presente invencion como se define en las reivindicaciones tambien incluye: (2) agentes antivirales que actuan inhibiendo la expresion de la protema SR, y (3) agentes antivirales que actuan activando la funcion de protemas que antagonizan las protemas SR.
En particular, la presente invencion como se define en las reivindicaciones se refiere a agentes antivirales que comprenden compuestos que inhiben la actividad y/o la expresion de SRPK. La fosforilacion que contribuye a la estabilizacion de la protema SR se inhibe al inhibir la actividad y/o la expresion de SRPK. Como resultado, se promueve la degradacion de la protema SR y se reduce la actividad de la protema SR. Por lo tanto, SRPK (SRPK1 y/o SRPK2) es una diana de inhibicion particularmente preferida de la presente invencion.
Metodos para inhibir la produccion vmca
La presente divulgacion tambien incluye: (1) metodos para inhibir la produccion vmca mediante la reduccion o inhibicion de la actividad de la protema SR, mas espedficamente, la presente invencion incluye (i) metodos para inhibir la produccion de virus mediante el aumento de la fosforilacion de la protema SR, y (ii) metodos para inhibir la produccion de virus mediante la inhibicion de protemas que fosforilan a la protema Sr . En particular, la presente invencion se refiere a metodos para inhibir la produccion vmca, que comprenden la etapa de inhibir la actividad y/o la expresion de SRPK. Cuando se inhibe la SRPK, se inhibe la fosforilacion de la protema SR y se reduce la concentracion de protema SR, lo que reduce la actividad de la protema SR.
La presente divulgacion tambien incluye: (2) metodos para inhibir la produccion vmca mediante la inhibicion de la expresion de la protema SR, y (3) metodos para inhibir la produccion vmca mediante la activacion de la funcion de protemas que antagonizan la protema SR.
Espedficamente, la presente invencion tambien incluye las siguientes invenciones:
[M1] Metodo de inhibicion de la propagacion de un virus, que comprende la etapa de reducir la actividad o el nivel de expresion de una protema SR;
[M2] el metodo de [M1], en el que la protema SR es SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, HRS/SRp40, SRp46 o SRp75;
[M3] el metodo de [M1] o [M2], en el que la etapa de reduccion de la actividad o el nivel de expresion de una protema SR es la etapa de inhibicion de la fosforilacion de una protema SR o de la mejora de su desfosforilacion;
[M4] el metodo de [M3], en el que la etapa de inhibicion de la fosforilacion de una protema SR o de aumento de su desfosforilacion es la etapa de aumento de la actividad de la protema fosfatasa 2A;
[M5] el metodo de [M4], en el que la etapa de aumento de la actividad de la protema fosfatasa 2A es la etapa de la introduccion de un vector de expresion para uno o mas genes seleccionados del grupo que consiste en: un gen tat del VIH, gen del adenovirus E4-ORF4 y gen del virus vaccinia VH1;
[M6] el metodo de [M3], en el que la etapa de la inhibicion de la fosforilacion de la protema SR o del aumento de su desfosforilacion es la etapa de inhibicion de la expresion o actividad de una SRPK;
[M7] el metodo de [M6], en el que la SRPK es SRPK1 o SRPK2;
[M8] el metodo de [M6] o [M7], en el que la etapa de la inhibicion de la expresion o actividad de una SRPK es la etapa de administracion de un derivado de anilina representado por la siguiente formula:
Figure imgf000014_0001
o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo;
en donde R1, R2, R3, R4, Q y W son como se definieron en [16] en este documento anteriormente;
[M9] el metodo de [M8], en el que el anterior R1 es un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo Ci-6 que puede tener un sustituyente, o un atomo de halogeno;
[M10] el metodo de [M8] o [M9], en el que el R2 anterior es un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo Ci-6;
[M11] el metodo de cualquiera de [M8] a [M10], en el que el R3 anterior es un grupo arilo C6-10 que puede tener un sustituyente, o un grupo heteroarilo de 5 a 10 miembros que contiene nitrogeno que puede tener un sustituyente;
[M12] el metodo de cualquiera de [M8] a [M11], en el que el R4 anterior es un atomo de hidrogeno;
[M13] el metodo de cualquiera de [M8] a [M12], en el que el W anterior es un atomo de hidrogeno, un atomo de halogeno o un grupo representado por la siguiente formula (II):
Figure imgf000014_0002
en donde, R5 y R6 se definen anteriormente;
[M14] el metodo de [M8], en el cual el derivado de anilina de [M8] se selecciona del grupo que consiste en compuestos de los Compuestos Nos: 340, 348, 613, 616, 618, 622 y 624 descritos en este documento; [M15] el metodo de [M6], en el que el paso de inhibir una expresion o actividad de una SRPK es el paso de introducir un ARNmi de SRPK, ARNsi de SRPK u oligomero de morfolino de SRPK, o introducir un vector de expresion de ARNmi o ARNsi;
[M16] el metodo de [M1] o [M2], en el que el paso de reducir una actividad o nivel deexpresion de una protema SR es el paso de administrar una sustancia que tiene la actividad de antagonizar una protema SR;
[M17] el metodo de [M16], en el que la sustancia que tiene una actividad de antagonizacion de una protema SR es un vector de expresion hnRNP A1;
[M18] el metodo de uno cualquiera de [M1] a [M17], en el que el virus es: uno cualquiera de (1) un virus de ARN: un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), smdrome respiratorio agudo severo (SARS), poliovirus, rinovirus humano, virus de la leucemia de celulas T adultas (HTLV-I), virus de la hepatitis A, C, D y E, virus de la vaccinia, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, coronavirus humano, virus del Ebola, virus de la gripe y virus sindbis, y (2) un virus de ADN: un virus del herpes simple, un adenovirus humano, un virus de la hepatitis B, un citomegalovirus, un virus EB, un virus del herpes, un virus de la viruela, un virus de polioma y un virus del papiloma humano.
[M19] el metodo para inhibir una SRPK, que comprende el paso de administrar el derivado de anilina de [M8], o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo;
[M20] el metodo de [M19], en el que la SRPK es SRPK1 o SRPK2;
[M21] el metodo de [M19] o [M20], en el que el R1 anterior es un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo C1-6 que puede tener un sustituyente, o un atomo de halogeno;
[M22] el metodo de uno cualquiera de [M19] a [M21], en el que el R2 anterior es un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo C1-6;
[M23] el metodo de uno cualquiera de [M19] a [M22], en el que el R3 anterior es un grupo arilo C6-10 que puede tener un sustituyente, o un grupo heteroarilo de 5 a 10 miembros que contiene nitrogeno que puede tener un sustituyente;
[M24] el metodo de uno cualquiera de [M19] a [M23], en el que el R4 anterior es un atomo de hidrogeno; [M25] el metodo de uno cualquiera de [M19] a [M24], en el que el W anterior es un atomo de hidrogeno, un atomo de halogeno o un grupo representado por la siguiente formula (II):
I N
R5 R 6
(II)
en donde, R5 y R6 se definen anteriormente; y
[M26] el metodo de [M19], en el que el derivado de anilina de [M8] es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos de los Nos de compuestos: 340, 348, 613, 616, 618, 622 y 624 descritos en este documento, o una de sus sales o hidratos farmaceuticamente aceptables.
La presente divulgacion se refiere ademas a los usos de los compuestos que reducen la expresion y/o la actividad de la protema SR para inhibir la propagacion vmca y para producir agentes antivirales (reactivos y/o productos farmaceuticos para inhibir la propagacion vmca). Espedficamente, la presente divulgacion tambien se refiere a las siguientes invenciones:
[U1] el uso de un compuesto que reduce la actividad o el nivel de expresion de una prota'na SR para inhibir la propagacion de un virus o para producir un agente antiviral;
[U2] el uso de [U1], en el que la protema SR es SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, HRS/SRp40, SRp46 o SRp75;
[U3] el uso de [U1] o [U2], en el que el compuesto que reduce la actividad o el nivel de expresion de una protema SR es un compuesto que inhibe la fosforilacion de una protema SR o aumenta su desfosforilacion;
[U4] el uso de [U3], en el que el compuesto que inhibe la fosforilacion de una protema SR o aumenta su desfosforilacion es un compuesto que aumenta la actividad de la protema fosfatasa 2A;
[U5] el uso de [U4], en el que el compuesto que aumenta la actividad de la protema fosfatasa 2A es un vector de expresion para uno o mas genes seleccionados del grupo que consiste en: un gen tat del VIH, gen E4-ORF4 de adenovirus, y gen VH1 del virus vaccinia;
[U6] el uso de [U3], en el que el compuesto que inhibe la fosforilacion de una protema SR o aumenta su desfosforilacion es un compuesto que inhibe una expresion o actividad de una SRPK;
[U7] el uso de [U6], en el que la SRPK es SRPK1 o SRPK2;
[U8] el uso de [U6], en el que el compuesto que inhibe una expresion o actividad de una SRPK es un derivado de anilina representado por la siguiente formula:
Figure imgf000016_0001
o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo;
en donde, R1, R2, R3, R4, Q y W se definen en [16] anteriormente en este documento;
[U9]
[U10] el uso de [U8] o [U9], en el que el R2 anterior es un grupo alquilo C1-6;
[U11] el uso de uno cualquiera de [U8] a [U10], en el que el R3 anterior es un grupo arilo C6-10 que puede tener un sustituyente;
[U12]
[U13] el uso de uno cualquiera de [U8] a [U12], en el que el W anterior es un atomo de hidrogeno, un atomo de halogeno,
[U14]
[U15] el uso de [U6], en el que el compuesto que inhibe una expresion o actividad de una SRPK es un ARNmi de SRPK, ARNsi de SRPK u oligomero de morfolino de SRpK, o es un vector de expresion de ARNmi o ARNsi;
[U16] el uso de [U1] o [U2], en el que el compuesto que reduce la actividad o el nivel de expresion de una protema SR es una sustancia que tiene la actividad de antagonizar una protema SR;
[U17] el uso de [U16], en el que la sustancia que tiene la actividad de antagonizar una protema SR es un vector de expresion hnRNP a 1;
[U18] el uso de uno cualquiera de [U1] a [U17], en el que el virus es: uno cualquiera de (1) un virus de ARN: un virus de inmunodeficiencia humana (VIH), smdrome respiratorio agudo severo (SARS), poliovirus, rinovirus humano, virus de la leucemia de celulas T adultas (HTLV-I), virus de la hepatitis A, C, D y E, virus de la vaccinia, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, coronavirus humano, virus del Ebola, virus de la influenza y virus sindbis, y (2) un virus de ADN: un virus del herpes simple, un adenovirus humano, un virus de la hepatitis B, un citomegalovirus, un virus EB, un virus del herpes humano, un virus de la viruela, un virus de la polioma y un virus del papiloma humano.
[U19] el uso del derivado de anilina de [U8], o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo para inhibir una SRPK o para producir un inhibidor de SRPK;
[U20] el uso de [U19], en el que la SRPK es SRPK1 o SRPK2;
[U21] el uso de [U19] o [U20], en el que el anterior R1 es un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo C1-6 que puede tener un sustituyente, o un atomo de halogeno;
[U22] el uso de uno cualquiera de [U19] a [U21], en el que el R2 anterior es un grupo alquilo C1-6;
[U23] el uso de uno cualquiera de [U19] a [U22], en el que el R3 anterior es un grupo arilo C6-10 que puede tener un sustituyente,
[U24]
[U25] el uso de uno cualquiera de [U19] a [U24], en el que el W anterior es un atomo de hidrogeno, un atomo de halogeno, y
[U26]
Metodos terapeuticos
La presente divulgacion incluye: (1) metodos para tratar o prevenir enfermedades vmcas mediante la reduccion o inhibicion de la actividad de la protema SR, mas espedficamente, (i) metodos para tratar o prevenir enfermedades vmcas mediante la desfosforilacion de la protema SR, e (ii) metodos para tratar enfermedades vmcas mediante la inhibicion de las protemas que fosforilan la protema SR. En particular, la presente invencion se refiere a metodos para tratar o prevenir enfermedades vmcas, que comprenden la etapa de inhibir la actividad y/o la expresion de SRPK. La inhibicion de SRPK da como resultado la inhibicion de la fosforilacion de la protema Sr , lo que reduce el nivel de protema SR y, por lo tanto, inhibe la propagacion vmca.
La presente divulgacion tambien incluye: (2) metodos para tratar o prevenir enfermedades vmcas mediante la inhibicion de la expresion de la protema SR, y (3) metodos para tratar o prevenir enfermedades vmcas mediante la activacion de la funcion de protemas que antagonizan a la protema SR.
III.
La presente divulgacion tambien incluye metodos para la deteccion de agentes antivirales y usos de inhibidores de SRPK.
Metodos para la deteccion de agentes antivirales
La presente divulgacion tambien incluye: (1) metodos para seleccionar inhibidores de SRPK utilizando protemas o peptidos SR con dos o mas unidades consecutivas de Rs o SR como sustratos de SRPK.
Inhibidores de SRPK y uso de los mismos
La presente invencion como se define en las reivindicaciones tambien incluye: (1) inhibidores de SRPK que comprenden SRPIN-1 o un analogo del mismo como ingrediente activo, (2) inhibidores de la propagacion vmca que comprenden SRPIN-1 o un analogo del mismo como ingrediente activo, y (3) agentes terapeuticos antivirales que comprenden SRPIN-1 o un analogo del mismo como ingrediente activo.
IV. Divulgaciones espedficas de la presente invencion
(1) Agentes antivirales que reducen o inhiben la actividad de las protemas SR
(i) Agentes antivirales que actuan desfosforilando las protemas SR
Los agentes antivirales que actuan desfosforilando las protemas SR incluyen activadores que activan la fosfatasa 2A (Mumby, M.C. y Walter, G. (1993) Physiol. Rev. 73, 673-680; Lechward, K., Awotunde, O.S., Swiatek, W. y Muszynska, G. (20O1 ) Acta Biochim. Pol. 48, 921-933; Cohen, P. (1989) The structure and regulation of protein phosphatases. Annu. Rev. Biochem. 58, 453-508; Janssens, V. y Goris, J. (2001) Biochem. J. 353, 417-39). Espedficamente, dichos agentes antivirales incluyen polipeptidos codificados por el gen tat del VIH (por ejemplo, numero de acceso AAK08486), polipeptidos codificados por el adenovirus E4-ORF4 (por ejemplo, numero de acceso AAB37507), o polipeptidos codificados por el virus VH1 de Vaccinia (por ejemplo, numero de acceso AAV38329). Ademas, dichos agentes antivirales tambien incluyen vectores de expresion para la terapia genica, que llevan un gen tat del VIH, el gen E4-ORF4 del adenovirus o el gen VH1 del virus de la vaccinia. Un gen tat esta disponible, por ejemplo, como CDS (nucleotidos 5830-6044 mas nucleotidos 8369-8411) con el numero de acceso AF324493; E4-ORF4 esta disponible, por ejemplo, como CDS (nucleotidos 1634-1993) con el numero de acceso S82508; el virus VH1 de vaccinia esta disponible, por ejemplo, como CDS (nucleotidos 1-555) con el numero de acceso BT019522.
(ii) inhibidores de la protema quinasa SR
(ii-1)
Existen varias quinasas ya conocidas como enzimas que fosforilan las protemas SR, pero se cree que estas enzimas fosforilan los dominios RS en diferentes sitios. Los presentes inventores descubrieron que las SRPKs son las unicas quinasas RS que logran la fosforilacion espedfica que contribuye a la estabilizacion de la protema SR. Por lo tanto, para prevenir la estabilizacion de las protemas SR a traves de la fosforilacion, las protemas quinasas SR diana incluyen particularmente las SRPKs. Las SRPKs incluyen tanto SRPK1 (Nature (1994) Vol. 369, paginas 678-682) como Sr Pk2 (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) Vol. 242: paginas 357-364; Wang, H.Y. et al., J. Cell. Biol. 1998, 140: 737­ 750). La secuencia de nucleotidos del gen SRPK1 se expone, por ejemplo, en los nucleotidos 124-2088, nucleotidos 109-2073, nucleotidos 10-2487 y nucleotidos 43-1986 de los numeros de acceso NMR_003137, U09564, AJ318054 y NM_016795, respectivamente. La secuencia de aminoacidos se expone, por ejemplo, en los numeros de acceso NP_003128, AAA20530, CAC39299, CAA11833 y NP_058075. Mientras tanto, la secuencia de nucleotidos del gen SRPK2 se expone, por ejemplo, en los nucleotidos 188-2245 y los nucleotidos 208-2253 de los numeros de acceso U88666 y n M_009274, respectivamente. La secuencia de aminoacidos se expone, por ejemplo, en AAC05299 y NP_033300 (Nikolakaki, E. et al., J. Biol. Chem. 276, 40175-40182 (2001); Papoutsopoulou, S., et al., Nucleic Acids Res. 27, 2972-2980 (1999); Wang, H.Y. et al., Genomics 57, 310-315 (1999); Gui, J.F. et al., Nature 369, 678-682 (1994); Wang, H.Y. et al., J. Cell Biol. 140, 737-750 (1998); Papoutsopoulou, S. et al., Nucleic Acids Res. 27, 2972­ 2980 (1999); Kuroyanagi, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 242, 357-364 (1998); Bedford, M.T. et al., EMBO J. 16, 2376-2383 (1997)). Las SRPK1s tambien incluyen las especies a las que se hace referencia como "SRPK1a".
Las sustancias que tienen la funcion de inhibir las quinasas (SRPKs), quese utilizan en los metodos de la presente invencion, incluyen compuestos (incluidos SRPIN-1 y sus analogos) representados por la siguiente formula:
Figure imgf000018_0001
y sus sales e hidratos farmaceuticamente aceptables;
donde R1 representa un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo Ci-a que puede tener sustituyentes, un grupo alquenilo C2-6 que puede tener sustituyentes, un grupo alquinilo C2-a que puede tener sustituyentes, un grupo arilo Ca-10 que puede tener sustituyentes, un atomo de halogeno, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo azida, un grupo hidroxi, un grupo alcoxi Ci-a que puede tener sustituyentes, un grupo alquiltio Ci-a que puede tener sustituyentes, un grupo alquilsulfonilo Ci-a que puede tener sustituyentes, un grupo carboxilo, un grupo formilo, un grupo alcoxicarbonilo Ci-a que puede tener sustituyentes, un grupo acilo, un grupo acilamino o un grupo sulfamoilo;
R2 representa un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo Ci-a que puede tener sustituyentes o un grupo arilo que puede tener sustituyentes;
R3 representa un grupo alquilo Ci-a que puede tener sustituyentes, un grupo alquenilo C2-a que puede tener sustituyentes, un grupo arilo Ca-io que puede tener sustituyentes, un heterociclo que contiene nitrogeno que puede tener sustituyentes, o un heterociclo aromatico condensado que puede tener sustituyentes;
R4 representa un atomo de hidrogeno o un atomo de halogeno;
Q representa -C(O)-, -C(S)-, -SO2 -, -C(S)NHC(O)-, -C(O)NHC(O)-, o -C(O)NHC(S)-;
W representa un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo Ci-a que puede tener sustituyentes, un grupo arilo Ca-io que puede tener sustituyentes, un atomo de halogeno, un grupo hidroxi, un grupo alcoxi Ci-a que puede tener sustituyentes, un grupo alquiltio Ci-a que puede tener sustituyentes, un heterociclo que contiene nitrogeno que puede tener sustituyentes, un heterociclo aromatico condensado que puede tener sustituyentes, o un grupo representado por la siguiente formula (II);
Figure imgf000018_0002
en donde R5 y Ra son iguales o diferentes y cada uno representa un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo Ci-a que puede tener sustituyentes, un heterociclo que contiene nitrogeno que puede tener sustituyentes, un heterociclo aromatico condensado que puede tener sustituyentes, un grupo acilo, o un grupo acilamino; o
los anteriores R5 y Ra, junto con el atomo de nitrogeno adyacente, pueden formar un heterociclo que puede tener sustituyentes, y el heterociclo puede ser un heterociclo aromatico condensado que puede tener sustituyentes;
los anteriores R5 y Ra pueden ser un grupo cicloalquilidenamino que puede tener sustituyentes o un grupo cicloalquilideno aromatico condensado que puede tener sustituyentes.
i8
Ejemplos de los compuestos descritos anteriormente incluyen los compuestos representados por la siguiente formula:
Figure imgf000019_0001
X incluye F, Cl, Br, I y At.
Espedficamente, dichos compuestos incluyen SRPIN-1, representado por la siguiente formula:
Figure imgf000019_0002
El SRPIN-1 de la presente invencion esta disponible de Maybridge (Trevillett, Tintagel, Cornwall PL34 OHW, Inglaterra) y Ambinter (46 Quai Louis Bleriot, Paris, F-75016 Francia); Sin embargo, lo siguiente resume su smtesis qmmica:
Figure imgf000019_0003
(ii-2) Agentes antivirales que utilizan ARNi dirigido al gen SRPK1 y al gen SRPK2
Se pueden usar celulas internas, ARNsi, oligomeros de morfolino o ARNmi para reducir el nivel de expresion de los genes que codifican SRPK1 y SRPK2.
Se pueden utilizar metodos conocidos para disenar los ARNsi. Los ARNs pueden disenarse, por ejemplo, mediante los siguientes metodos:
(ii-2- 1 )
X = FoCl as que pueden usarse como dianas de ARNsi evitan las regiones UTR 5' y 3' (region no traducida) y las secuencias adyacentes al codon de inicio; son 50 nucleotidos o mas corriente abajo del codon de inicio; estan dentro del ORF y comienzan desde AA o NA; comprenden de 19 a 21 nucleotidos (lo mas tipicamente 19 nucleotidos) cuyo contenido de CG es aproximadamente el 50%; y sesgos de secuencia mmimos y repeticiones en los extremos 5' y 3'. Cuando la secuencia diana comienza con AA, pueden prepararse ARNssi que comprendan un saliente dinucleotido de dTdT o UU. Alternativamente, cuando la secuencia diana comienza con NA, pueden prepararse ARNssi que comprendan dTdN, dTdT o UU.
Para evitar que las reacciones cruzadas con secuencias distintas de la secuencia diana afecten a la expresion de protemas distintas de la protema diana, una busqueda BLAST o similar confirmara si la secuencia seleccionada tiene homolog^a con otras secuencias de ARN.
La presente divulgacion tambien incluye realizaciones que usan vectores de expresion de ARNsi, construidos para permitir la expresion intracelular de los ARNssi designados.
Los oligomeros de morfolino son compuestos en los que multiples subunidades de morfolino que comprenden nucleotidos estan unidas en una cadena que comprende estructuras que unen el anillo de morfolina y subunidades de fosforodiamidato no ionicas (documentos de patente de Estados Unidos Nos 5.142.047; 5.185.444). Dado que los oligomeros de morfolino antisentido son muy estables en las celulas y tienen mucha afinidad por los ARNm, se pueden usar por lo tanto preferiblemente para inhibir la expresion de genes diana (Summerton JE., Ann NY Acad Sci 2003; 1002: 189). Ya se conocen metodos para disenar oligomeros de morfolino eficaces (vease Summerton, 1989, en: Discoveries in Antisense Nucleic Acids; editor: C. Brakel; publicado por: The Portfolio Publishing Co., Woodlands, Tejas; paginas 71-80; Summerton & Weller, 1997, Antisense Nuc. Acid Drug Dev. 7, 187; y el sitio web Gene Tools). Los oligomeros de morfolino estan disponibles en Gene Tools (Gene Tools, LLC, Philomath, OR).
(2) Los agentes antivirales que actuan inhibiendo la expresion de los genes que codifican las protemas SR incluyen, por ejemplo, ARNssi, oligomeros de morfolino y ARNsmi.
(2-1) ARNssi
Los ARNssi se pueden disenar utilizando los metodos descritos anteriormente en (ii-2).
(3) Agentes antivirales que comprenden protemas que antagonizan las protemas SR o que actuan activando estas protemas
(3-1)
La frase "que antagonizan la protema SR" significa promover, por ejemplo, la seleccion de un sitio de empalme 3' distal a un intron en el empalme. Espedficamente, la actividad de las protemas SR se puede cancelar utilizando un factor regulador de empalme que antagoniza las protemas SR, que promueve la seleccion de sitios de empalme 3' proximales a un intron. Espedficamente, dichas protemas que antagonizan las protemas SR incluyen ribonucleoprotemas heteronucleares (hnRNPs), tales como hnRNP A1, A2 y B1, pero es preferida la hnRNP A1. Mas preferidos son los agentes antivirales que son vectores de expresion de terapia genica que llevan un gen que codifica hnRNP A1. La secuencia del gen que codifica hnRNP A1 se expone, por ejemplo, en los nucleotidos 105-1064 y los nucleotidos 105-1220 de los numeros de acceso NM_002136 y n M_031157, respectivamente. La secuencia de aminoacidos de hnRNP A1 se expone en los numeros de acceso NP_002127 y NP_112420, y otros (Expert-Bezan, Sureau, A. et al., J. Biol. Chem. 279, 38249-38259 (2004); Zahler, A.M. et al., J. Biol. Chem. 279, 10077-10084 (2004); Marchand, V. et al., J. Mol. Biol. 323, 629-652 (2002); Buvoli, M. et al., EMBO J. 9, 1229-1235 (1990); Biamonti, G. et al., J. Mol. Biol. 207, 491-503 (1989); Buvoli, M. et al., Nucleic Acids Res. 16, 3751-3770 (1988); Michael, W.M. et al., Cell 83, 415-422 (1995)). La secuencia del gen que codifica hnRNP A2/B1 se expone, por ejemplo, en los nucleotidos 170-1192 y los nucleotidos 170-1228 de los numeros de acceso NM_002137 y NM_031243, respectivamente. La secuencia de aminoacidos de hnRNP A2/B1 se expone en los numeros de acceso NP_002128 y n P_112533, y otros (Kozu, T., et al., Genomics 25, 365-371 (1995); Biamonti, G. et al., Nucleic Acids Res. 22, 1996-2002 (1994); Burd, C.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9788-9792 (1989); Kumar, A. et al., J. Biol. Chem. 261, 11266-11273 (1986)).
(4) Metodos para el cribado de agentes antivirales, que comprenden la deteccion de sustancias que inhiben las SRPKs.
Los metodos para cribar agentes antivirales de la presente invencion son, por ejemplo, metodos que comprenden la seleccion de inhibidores de SRPKs, que comprenden las etapas de hacer reaccionar los compuestos de prueba con SRPKs y la capacidad de las protemas SRPk para fosforilar SR. Los compuestos que deterioran esta capacidad (inhibidores de SRPK) son utiles como agentes antivirales. En particular, la presente invencion tambien incluye metodos para detectar agentes antivirales, que comprenden la seleccion de diversos compuestos que se dirigen a SRPK1 o SRPK2 en busca de inhibidores de SRPK, utilizando protemas o peptidos SR con dos o mas unidades consecutivas de RS o SR como sustratos de las SRPKs. Los compuestos que inhiben la actividad de fosforilacion de la protema SR de las SRPKs se pueden seleccionar de manera eficiente mediante el uso de peptidos con dos o mas unidades consecutivas de Arg-Ser (RS) o Ser-Arg (SR) como sustratos de SRPK, y seleccionando compuestos que deterioren la capacidad de SRPK para fosforilar los sustratos (inhibidores de SRPK).
Mas espedficamente, el cribado de la presente invencion comprenden los pasos de:
(a) poner en contacto una SRPK con un sustrato en presencia de un compuesto de prueba;
(b) detectar la fosforilacion del sustrato; y
(c) seleccionar compuestos que deterioran la fosforilacion en comparacion con cuando el compuesto de prueba esta ausente o presente en pequenas cantidades.
Como se describio anteriormente, los sustratos incluyen protemas SR, polipeptidos parciales de las mismas que comprenden dominios RS, y polipeptidos con dos o mas unidades consecutivas de RS o SR (vease los Ejemplos). Las SRPKs pueden ser SRPK1 o SRPK2 de tipo silvestre. Alternativamente, las SRPKs pueden ser protemas de fusion que comprenden peptidos etiqueta u otras protemas modificadas, siempre que retengan la actividad de fosforilacion. En este documento, las SRPKs que comprenden mutaciones o similares tambien se denominan "SRPK", siempre que retengan la actividad de fosforilar las protemas SR.
Mas espedficamente, en este documento, SRPK1 incluye:
(a) una protema que comprende una secuencia de aminoacidos de numeros de acceso NP_003128, AAA20530, CAC39299, CAA11833 o NP_058075;
(b) una protema con actividad de fosforilacion que comprende una secuencia de aminoacidos que muestra una identidad de secuencia del 80% o mas, preferiblemente una identidad de secuencia del 85% o mas, mas preferiblemente una identidad de secuencia del 90% o mas, aun mas preferiblemente una identidad de secuencia del 95% o mas a esta secuencia de aminoacidos;
(c) una protema con actividad de fosforilacion que esta codificada por un acido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas a una cadena complementaria de un acido nucleico que comprende la totalidad o una porcion de los nucleotidos 124-2088 del numero de acceso NM_003137, nucleotidos 109-2073 del numero de acceso U09564, nucleotidos 10-2487 del numero de acceso AJ318054, o nucleotidos 43-1986 del numero de acceso NM_016795. En este documento, SRPK2 incluye:
(a) una protema que comprende una secuencia de aminoacidos de los numeros de acceso AAC05299 o NP_033300;
(b) una protema con actividad de fosforilacion que comprende una secuencia de aminoacidos que muestra una identidad de secuencia del 80% o mas, preferiblemente una identidad de secuencia del 85% o mas, mas preferiblemente una identidad de secuencia del 90% o mas, aun mas preferiblemente una identidad de secuencia del 95% o mas para esta secuencia de aminoacidos;
(c) una protema con actividad de fosforilacion que esta codificada por un acido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas a una cadena complementaria de un acido nucleico que comprende la totalidad o una porcion de los nucleotidos 188-2245 del numero de acceso U88666, o los nucleotidos 208-2253 del numero de acceso NM_009274. La “porcion” significa, por ejemplo, 20 o mas nucleotidos consecutivos, preferiblemente 25 o mas nucleotidos, mas preferiblemente 30 o mas nucleotidos, 40 o mas nucleotidos, 45 o mas nucleotidos, 50 o mas nucleotidos.
La identidad de la secuencia de aminoacidos se puede determinar, por ejemplo, utilizando el programa BLASTP (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410). Por ejemplo, las busquedas de homologfa se llevan a cabo en la pagina web de BLAST del NCBI (National Center for Biotechnology Information) utilizando parametros predeterminados con todos los filtros, incluido el de baja complejidad, apagados (Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3: 266 -272; Madden, T.L. et al., (1996) Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; Zhang, J. y Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7: 649-656). Los parametros se pueden establecer, por ejemplo, como sigue: costo de apertura de espacio = 11 , costo de extension de espacio = 1 , tamano de palabra = 2, cafda (X) para extensiones de voladura en bits = 7, valor de cafda de X para alineacion con espacios (en bits) = 15, el valor final de cafda de X para la alineacion con huecos (en bits) = 25. BLOSUM62 se utiliza como una matriz de puntuacion. La identidad de la secuencia se puede determinar, por ejemplo, alineando dos secuencias utilizando el programa de secuencias blast2, que compara dos secuencias (Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174: 247­ 250). Los huecos se tratan de la misma manera que los desajustes. Se calcula una puntuacion de identidad para la secuencia de aminoacidos completa de la protema de tipo silvestre, que se expone en los numeros de acceso anteriores (por ejemplo, la secuencia completa de la SEC ID NO: 2 o 4). Las puntuaciones de identidad pueden calcularse sin tener en cuenta los huecos fuera de la secuencia de aminoacidos de la protema de tipo silvestre en la alineacion. Para la hibridacion, se prepara una sonda a partir de un acido nucleico que comprende la secuencia de codificacion de la protema de tipo silvestre (por ejemplo, SEC ID NO: 1 o 3) o un acido nucleico diana en la hibridacion, y si la sonda hibridara o no a otros acidos nucleicos se puede identificar por deteccion. Las condiciones de hibridacion rigurosas incluyen, por ejemplo, condiciones en las que la hibridacion se lleva a cabo utilizando una solucion que contiene 5x SSC (1x SSC comprende 150 mM NaCl y 15 mM de citrato de sodio), 7% (p/v) SDS, 10 pg/ml de ADN de esperma de salmon desnaturalizado, y 5x de solucion de Denhardt (1x la solucion de Denhardt contiene 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de albumina de suero bovino y 0,2% de Ficoll) a 48° C, preferiblemente a 50° C, y mas preferiblemente a 52° C, y donde se realiza el lavado de posthibridacion durante dos horas a la misma temperatura que en la hibridacion, mas preferiblemente a 60° C, aun mas preferiblemente a 65° C, e incluso mas preferiblemente a 68° C usando 2x SSC, preferiblemente 1x SSC, mas preferiblemente 0,5x SSC, y aun mas preferiblemente 0,1x SSC, con agitacion.
La actividad de fosforilacion de las SRPKs se puede detectar, por ejemplo, realizando una reaccion entre una SRPK y un sustrato utilizando ATP marcado, y cuantificando el sustrato marcado. Espedficamente, se pueden seguir los metodos descritos en el Ejemplo 4B.
Los compuestos que muestran una actividad antivmica marcada pueden seleccionarse adicionalmente de los compuestos producidos detectando la actividad antivmica a traves de los pasos adicionales de:
(d) detectar la propagacion vmca o la expresion de un gen vmico en presencia de un compuesto de prueba seleccionado; y
(e) seleccionar un compuesto que reduzca la propagacion vmca o la expresion genica vmca en comparacion con cuando el compuesto esta ausente o presente en pequenas cantidades.
Como se describe en los Ejemplos, la propagacion vmca o la expresion genica vmca se pueden evaluar, por ejemplo, detectando la produccion de protemas vmcas en celulas introducidas con el genoma v'rico.
La presente divulgacion tambien se refiere a inhibidores de SRPK y agentes antivirales que comprenden los compuestos seleccionados mediante los metodos de cribado de la presente invencion descritos anteriormente. La presente invencion tambien se refiere a los usos de los compuestos obtenidos por los metodos de cribado descritos anteriormente de la presente divulgacion para producir inhibidores de SRPK y/o agentes antivirales, y usos de los mismos en la inhibicion de SRPK y/o tratamientos antivirales. Por ejemplo, los compuestos seleccionados del grupo que consiste en los compuestos del Registro CAS Nos. 218156-96-8, 674360-18-0, 494830-83-0, 672919-05-0, 54231­ 51-5, 10338-55-3, 1692-79-1, 1496-40-81, 496012-09-0, 445406-05-3, 445412-62-4, y 388071-30-5 son utiles como inhibidores de SRPK y/o agentes antivirales.
La presente divulgacion tambien incluye usos de los agentes antivirales anteriores como inhibidores de la propagacion vmca o agentes terapeuticos antivirales. Por ejemplo, cuando se usa SRPIN-1 como agente antiviral, ademas de SRPIN-1, se pueden agregar adyuvantes farmaceuticos conocidos, por ejemplo, AZT e inhibidores de las proteasas.
Los inhibidores de la propagacion vmca o los agentes terapeuticos antivirales de la presente invencion como se definen en las reivindicaciones pueden administrarse, por ejemplo, por via oral, percutanea, submucosa, subcutanea, intramuscular, intravascular, intracerebral o intraperitoneal, intermitente o continuamente de manera que su concentracion en el cuerpo se encuentre dentro del rango de 100 nM a 1 mM.
Los compuestos analogos de SRPIN-1 de la presente invencion como se definen en las reivindicaciones se describen con mas detalle a continuacion. La presente invencion como se define en las reivindicaciones se refiere a compuestos con la estructura indicada a continuacion, y a usos de los mismos.
Los compuestos de la presente invencion como se definen en las reivindicaciones son derivados de anilina representados por la siguiente formula (I):
Figure imgf000022_0001
o sales o hidratos farmaceuticamente aceptables de los mismos;
en donde R1 representa un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo C|.6 que puede tener sustituyentes o un atomo de halogeno
R2 representa un atomo de hidrogeno;
R3 representa un grupo 4-piridilo
R4 representa un atomo de hidrogeno
Q representa -C(O)-, -C(S)-, -SO2-, -C(S)NHC(O)-, -C(O)NHC(O)-, o -C(O)NHC(S)-;
W representa o un grupo representado por la siguiente formula (II):
Figure imgf000022_0002
en donde R5 y R6, junto con el atomo de nitrogeno adyacente, forman un heterociclo que puede tener sustituyentes. Entre tales compuestos representados por la formula (I), los compuestos preferidos incluyen, por ejemplo, los siguientes compuestos:
(1) compuestos en los que el anterior R1 es un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo C1-6 que puede tener sustituyentes, o un atomo de halogeno;
(2) compuestos en los que el anterior R1 es un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo Ci-6, un grupo alquilo Ci-6 halogenado, o un atomo de halogeno;
(3) compuestos en los que el anterior R1 es un atomo de hidrogeno, un grupo metilo, un grupo trifluorometilo, un atomo de cloro, o un atomo de fluor;
(4) compuestos en los que el anterior R1 es un atomo de hidrogeno o un grupo trifluorometilo;
(5)
(6)
(7) compuestos en los que el anterior R2 es un atomo de hidrogeno;
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13) compuestos en los que el anterior R3 es un grupo 4-piridilo;
(14)
(15) compuestos en los que el Q anterior es -C(O)- o -C(O)NHC(S)-, donde C(O) significa que un atomo de oxfgeno esta unido a un atomo de carbono a traves de un doble enlace, y C(S) significa que un atomo de azufre esta unido a un atomo de carbono a traves de un doble enlace;
(16) compuestos en los que el Q anterior es -C(O)-;
(17) compuestos en los que el W anterior es un grupo representado por la siguiente formula (II):
I N
R5 R 6
(ID
en donde, R5 y R6, junto con el atomo de nitrogeno adyacente, pueden formar un grupo heterodclico que puede tener sustituyentes;
(18) compuestos en los que el W anterior es un grupo heterodclico de 4 a 8 miembros que tiene un atomo de nitrogeno, que puede tener un grupo alquilo C1-6 como sustituyente, un grupo heterodclico de 4 a 8 miembros que comprende un atomo de nitrogeno y un atomo de oxfgeno, que puede tener un grupo alquilo C1-6 como sustituyente, o un grupo heterodclico de 4 a 8 miembros que se condensa con un grupo fenilo y comprende un atomo de nitrogeno;
(19) compuestos en los que el W anterior es un grupo heterodclico de 4 a 8 miembros que comprende un atomo de nitrogeno, que puede tener un grupo alquilo C1-6 como sustituyente;
(20) compuestos en los que el W anterior es un grupo piperidinilo o un grupo perhidroazepina, que puede tener un grupo alquilo C1-6 como sustituyente; y
(21) compuestos en los que el W anterior es un grupo pirrolidinilo, un grupo piperidinilo, un grupo 2-metilpiperidinilo, un grupo perhidroazepina, un grupo indolinilo, un grupo isoindolinilo.
En los compuestos descritos anteriormente, R1 se prefiere en el orden de (1) a (4), con (4) mas preferido. Q es mas preferido en el orden de (15) a (16), con (16) el mas preferido. W es mas preferido en el orden de (17) a (20), con (20) el mas preferido. Tambien se prefiere W definido en (21).
Los compuestos espedficos representados por la formula (I), se muestran a continuacion en este documento, pero la presente invencion no debe interpretarse como limitada a los mismos.
Tabla 1
Figure imgf000024_0001
Tabla 2
Figure imgf000025_0001
Tabla 3
Figure imgf000026_0001
La presente invencion se refiere a cualquiera de los compuestos mostrados en los ejemplos anteriores, pero de estos compuestos, los compuestos preferidos son los compuestos numerados 340, 341, 342, 346, 347, 348, 613, 616, 618, 619, 620, y 621; mas preferidos son los compuestos de No de compuesto 340, 341, 342, 347, 348, 613, 616, 618, 619, y 620; aun mas preferidos son los compuestos de No de compuesto 340, 348, 613, 616, y 618; y los mas preferidos son los compuestos de No de compuesto 340, 348, 613, y 618. En particular, la presente invencion tambien se refiere a nuevos compuestos seleccionados del grupo que consiste en los compuestos de No de compuesto 341, 342, 346, 347, 348, 349, 613, 616, 617, 618, 619, 620, y 621, que se muestran anteriormente como ejemplos.
Estos compuestos (derivados de la anilina), o sus sales o hidratos farmaceuticamente aceptables, son eficaces como inhibidores de SRPK.
Los compuestos (derivados de la anilina), o sales o hidratos farmaceuticamente aceptables de los mismos, tambien son utiles como agentes antivirales.
Los metodos representativos para producir los compuestos, representados por la formula (I) anterior, se describen a continuacion.
El R1, R2, R3, R4, R5, R6, Q y W a continuacion se definen como anteriormente. Latemperatura ambiente significa una temperatura que oscila entre aproximadamente 20 a 30° C.
Metodo de produccion A
Figure imgf000027_0001
Paso 1
En este paso, el compuesto 1a se hace reaccionar con el compuesto 2a para dar el compuesto 3a. El material "derivado de nitrobenceno 1a" puede estar disponible comercialmente o se induce apropiadamente los grupos funcionales. X del compuesto 1a es un atomo de F, Cl o I o un grupo OMs, OTs o OTf utilizado como grupo saliente. El compuesto 2a es un reactivo que comprende el -NR5R6 que se va a introducir. Es preferible usar uno o dos equivalentes del compuesto 2a. La reaccion se puede llevar a cabo en un disolvente en presencia de una base.
Es posible usar trietilamina, diisopropiletilamina, piridina, 4-(dimetilamino)piridina, o tal como la base. Es preferible usar de uno a cinco equivalentes de base. Alternativamente, se puede usar una cantidad en exceso (de uno a cinco equivalentes) de H-NR4R5 como la base.
Los disolventes incluyen, por ejemplo, dimetilsulfoxido, N,N-dimetilformamida, N-metilpirrolidona, dioxano, tetrahidrofurano y tolueno.
La temperatura de la reaccion oscila entre 0° C a 150° C. Sin embargo, la temperatura ambiente es preferible.
Paso 2
En este paso, el grupo nitro del compuesto 3a se reduce a un grupo amino para dar el compuesto 4a.
El metodo de reduccion puede ser poner el compuesto en contacto con acido clortndrico concentrado o similar en presencia de cloruro de estano o similar en el disolvente. Alternativamente, tambien se pueden usar reacciones de reduccion estandar, tales como la hidrogenacion catalftica.
Los disolventes de la reaccion incluyen metanol, etanol, N,N-dimetilformamida, tetrahidrofurano, 1,2-dimetoxietano, 1,4-dioxano y agua, y disolventes mixtos que comprenden combinaciones de los mismos.
Es preferible usar una relacion de masa de 1 a 20 equivalentes de cloruro de estano o similar, como agente reductor. La reaccion se puede llevar a cabo a una temperatura que oscila entre 0° C y 100° C.
Los compuestos 3a y 4a a veces pueden estar disponibles comercialmente, y en este caso se pueden usar productos disponibles comercialmente. En particular, cuando W en la formula (I) es hidrogeno o un halogeno, el compuesto generalmente esta disponible comercialmente. Por ejemplo, los compuestos numerados Compuesto 608, 612 y 623 a 626 mostrados en este documento se incluyen en dichos compuestos.
Paso 3a
En este paso, el compuesto 4a se hace reaccionar con el compuesto 5a para dar el compuesto 6a. L representa un atomo de halogeno o similar. La reaccion se puede llevar a cabo en un disolvente en presencia de una base, y en presencia de un catalizador si es necesario. Es preferible usar de uno a tres equivalentes de compuesto 5a en esta reaccion.
Los disolventes de reaccion incluyen diclorometano, cloroformo, 1,4-dioxano, tetrahidrofurano, tolueno, piridina, N,N-dimetilformamida, N-metilpirrolidona y similares.
Como base se pueden usar trietilamina, diisopropiletilamina, piridina, 4-(dimetilamino)piridina, y similares.
Se pueden usar reacciones de formacion de enlaces amida estandar usando agentes condensantes cuando L es un grupo hidroxi, y tambien se pueden usar reacciones de formacion de enlaces amida cuando L es un grupo saliente, tal como un grupo succinimidilo o un grupo imidazol.
Los catalizadores incluyen 4-(dimetilamino)piridina y similares.
La temperatura de reaccion puede oscilar entre 0° C y 100° C.
Paso 3b
En este paso, el compuesto 4a se hace reaccionar con el compuesto 5b para dar el compuesto 6b.
La reaccion se puede llevar a cabo utilizando acilisotiocianato en un disolvente en presencia de una base. El acilisotiocianato puede estar disponible comercialmente, o puede prepararse mediante la reaccion de un haluro de acilo apropiado y tiocianato en solucion, y luego se usa tal como esta. Es preferible usar de uno a cinco equivalentes de acilisotiocianato. Los tiocianatos que pueden usarse incluyen tiocianato de potasio, tiocianato de sodio y tiocianato de amonio. Se usan preferiblemente de uno a cinco equivalentes de tiocianato.
Los disolventes incluyen, por ejemplo, acetonitrilo, N,N-dimetilformamida, N-metilpirrolidona, tetrahidrofurano, eter dimetilico de etilenglicol y 1,4-dioxano.
Las bases incluyen, por ejemplo, trietilamina, diisopropiletilamina, piridina y 4-(dimetilamino)piridina. Es preferible utilizar de uno a cinco equivalentes de la base.
La reaccion se puede realizar a una temperatura que oscila entre 0° C y 150° C.
Paso 4a
En este paso, el grupo amida del compuesto 6a se alquila (se convierte en R2) para dar el compuesto 7a.
La reaccion puede llevarse a cabo en un disolvente utilizando un agente alquilante (R2-X) en presencia de una base. X es un atomo de halogeno o sulfonato que sirve como grupo saliente. Se usan preferiblemente de uno a cinco equivalentes del agente alquilante (R2-X).
Los disolventes incluyen, por ejemplo, N,N-dimetilformamida, N-metilpirrolidona, tetrahidrofurano, eter dimetilico de etilenglicol, 1,4-dioxano, acetonitrilo y eter.
Las bases incluyen hidruro de sodio, hidruro de potasio, hidruro de litio, butil-litio, metil-litio, fenil-litio, y la diisopropilamida de litio. Se usan preferiblemente de uno a cinco equivalentes de base.
La reaccion puede realizarse a una temperatura que oscila entre 0° C y 150° C.
Paso 4b
En este paso, el grupo carbonilo en un enlace de amida en el compuesto 6a se convierte en un grupo tiocarbonilo para dar el compuesto 7b.
La reaccion se lleva a cabo usando un agente de tiocarbonilacion en un disolvente. Los agentes de tiocarbonilacion incluyen, por ejemplo, el reactivo de Lawesson (2,4-bis(4-metoxifenil)-1,3,2,4-ditiodifosfetano 2,4-disulfuro) y pentasulfuro de fosforo (decasulfuro de fosforo, P4 S10). Es preferible utilizar de uno a cinco equivalentes de agente de tiocarbonilacion.
Los disolventes incluyen, por ejemplo, tolueno, benceno, clorobenceno, xileno, N,N-dimetilformamida, N-metilpirrolidona, eter dimetflico de etilenglicol, 1,4-dioxano, y tetrahidrofurano.
La reaccion puede realizarse a una temperatura que oscila entre 0° C y 200° C.
Los anteriores son metodos representativos para la produccion del compuesto (I). Los compuestos y diversos reactivos utilizados para producir los compuestos de la presente invencion pueden formar sales, hidratos o solvatos de los mismos, y cada uno vana dependiendo del tipo de materiales de partida o disolventes y similares que se usen; no estan particularmente limitados siempre y cuando no inhiban la reaccion. Los tipos de disolventes utilizados vanan con los tipos de materiales de partida y reactivos y similares. Por supuesto, los disolventes no estan particularmente limitados siempre que disuelvan el material de partida hasta cierto punto y no inhiban la reaccion. Cuando el compuesto (I) se obtiene en forma libre, se puede convertir segun metodos convencionales en una sal o hidrato del mismo que puede ser formado con el compuesto (I).
Cuando el compuesto (I) se obtiene como una sal o un hidrato del mismo, se puede convertir en una forma libre del compuesto anterior (I) segun metodos convencionales.
Varios isomeros (por ejemplo, isomeros geometricos, isomeros opticos basados en carbonos asimetricos, isomeros rotacionales, estereoisomeros y tautomeros) del compuesto (I) se pueden purificar y aislar usando medios de aislamiento convencionales, por ejemplo, recristalizacion, metodos de sal de diastereomero, metodos de resolucion basados en enzimas, diversos metodos cromatograficos (por ejemplo, cromatograffa de capa fina, cromatograffa en columna y cromatograffa de gases).
Los analogos de SRPIN-1 pueden usarse para inhibir la actividad de las SRPKs. Espedficamente, la actividad de fosforilacion de SRPK1 y/o SRPK2 se puede inhibir administrando los analogos de SRPIN-1 descritos en este documento. La presente divulgacion se refiere a usos de analogos de SRPIN-1 para inhibir la actividad de SRPK. La presente invencion como se define en las reivindicaciones tambien se refiere a inhibidores de SRPK que comprenden analogos de SRPIN-1. La presente divulgacion tambien se refiere a usos de analogos de SRPIN-1 para producir inhibidores de SRPK. Ademas, la presente divulgacion tambien se refiere a metodos para inhibir la actividad de SRPK, que comprenden el paso de poner en contacto un analogo de SRPIN-1 con una SRPK. La frase "poner en contacto con SRPK" puede significar que un analogo de SRPIN-1 se administra in vitro o in vivo a las celulas, tejidos y/o individuos que expresan SRPK.
En la presente invencion como se define en las reivindicaciones, los analogos de SRPIN-1 pueden utilizarse tambien para inhibir la propagacion vmca. Espedficamente, la propagacion vmca se inhibe cuando la actividad de fosforilacion de SRPK1 y/o SRPK2 se inhibe mediante la administracion de los analogos de SRPIN-1 descritos en este documento. La presente divulgacion se refiere a usos de analogos de SRPIN-1 para inhibir la propagacion vmca. La presente divulgacion tambien se refiere a agentes antivirales que comprenden analogos de SRPIN-1. La presente divulgacion tambien se refiere a usos de analogos de SRPIN-1 para producir agentes antivirales. La presente divulgacion tambien se refiere a metodos para inhibir la propagacion vmca, que comprenden el paso de poner en contacto un analogo de SRPIN-1 con una SRPK. La frase "poner en contacto con SRPK" puede significar que un analogo de SRPIN-1 se administra in vitro o in vivo a celulas, tejidos y/o individuos que expresan SRPK.
La presente divulgacion tambien proporciona paquetes que comprenden los analogos de SRPIN-1 anteriormente descritos o sales farmaceuticamente aceptables o hidratos de los mismos, donde el hecho de que los compuestos tengan actividad inhibidora de SRPK y/o actividad antivmica se graba en el contenido del paquete o paquetes. En este documento, un paquete se refiere a un paquete que contiene un analogo de SRPIN-1, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo. Los paquetes pueden incluir un recipiente para el analogo de SRPIN-1 o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo, y pueden incluir ademas una bolsa o caja exterior o similar para contener el recipiente.
La presente divulgacion tambien proporciona paquetes que comprenden compuestos que reducen el nivel de actividad o expresion de las protemas SR, en donde el hecho de que los compuestos tengan actividad antivffica se graba en el contenido del paquete o paquetes. En particular, la presente divulgacion proporciona paquetes en los que el compuesto es un compuesto que tiene la actividad de inhibir la expresion y/o la actividad de una SRPK.
Los compuestos de la presente invencion como se define en las reivindicaciones se pueden formular en composiciones en combinacion con vehmulos farmaceuticamente aceptables. Por ejemplo, los compuestos pueden formularse en composiciones farmaceuticas usando tecnicas de preparacion conocidas. Cuando las composiciones farmaceuticas de la presente invencion como se definen en las reivindicaciones se usan como inhibidores de SRPK, los agentes antivirales (espedficamente, los agentes preventivos o terapeuticos para enfermedades vfficas) u otros productos farmaceuticos, se pueden administrar, por ejemplo, oralmente en formas de dosificacion, tales como comprimidos, capsulas, granulos, polvos, pfldoras, trociscos o jarabes, o parenteralmente en formas de dosificacion, tales como inyecciones, aerosoles, supositorios, parches, cataplasmas, lociones, linimentos, pomadas o gotas para los ojos. Dichas preparaciones se producen mediante metodos conocidos que usan aditivos, tales como excipientes, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes, estabilizantes, agentes aromatizantes y diluyentes.
Los excipientes incluyen, por ejemplo, almidones, tales como almidon, almidon de patata y almidon de mafz; lactato; celulosa cristalina; y bicarbonato de calcio.
Los agentes de revestimiento incluyen, por ejemplo, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, goma laca, talco, cera de carnauba y parafina.
Los aglutinantes incluyen, por ejemplo, polivinilpirrolidona, macrogol y los mismos compuestos descritos anteriormente para los excipientes.
Los agentes disgregantes incluyen, por ejemplo, los mismos compuestos descritos anteriormente para los excipientes; y almidones y celulosas modificadas qmmicamente, tales como croscarmelosa de sodio, almidon carboximefflico de sodio y polivinilpirrolidona reticulada.
Los estabilizantes incluyen, por ejemplo, paraoxibenzoatos tales como metilparabeno y propilparabeno; alcoholes tales como clorobutanol, alcohol bendlico y alcohol fenilefflico; cloruro de benzalconio; fenoles tales como fenol y cresol; timerosal; acido deshidroacetico; y acido sorbico.
Los agentes aromatizantes incluyen, por ejemplo, edulcorantes, acidulantes y especias usados generalmente.
Los disolventes usados para producir soluciones incluyen el etanol, fenol, clorocresol, agua purificada, y agua destilada.
Los detergentes y emulsionantes incluyen, por ejemplo, polisorbato 80, estearato de polioxilo 40 y lauromacrogol.
Cuando las composiciones farmaceuticas de la presente invencion como se definen en las reivindicaciones se usan como inhibidores de SRPK o agentes antivirales, las dosis del compuesto de la presente invencion como se define en las reivindicaciones o las sales farmaceuticas aceptables del mismo son variadas dependiendo delos smtomas, la edad, el tipo de procedimiento de administracion, y similares. Por ejemplo, dependiendo de los smtomas, cuando se administran por via oral, los compuestos se administran preferiblemente a una dosis diaria de 0,01 mg (preferiblemente 0,1 mg) (ffmite inferior) a 2000 mg (preferiblemente 500 mg, mas preferiblemente 100 mg) (ffmite superior) por paciente (animales de sangre caliente, seres humanos en particular), administrados de una vez o divididos en varias veces. Cuando se administran por via intravenosa, los compuestos se administran preferiblemente a una dosis diaria de 0,001 mg (preferiblemente 0,01 mg) (ffmite inferior) a 500 mg (preferiblemente 50 mg) (limite superior) por adulto, administrados de una vez o divididos en varias veces, dependiendo de los smtomas.
Ejemplos
Gel de silice (Merck 9385-5B, malla de 70-230) fue utilizada en la cromatograffa en columna como se describe a continuacion. La cromatograffa de capa fina (CCF) se llevo a cabo utilizando placas de vidrio previamente lecubiertas con gel de sflice (MERCK 5715, gel de sffice 60 F254). Los puntos de fusion se midieron utilizando un aparato de micro punto de fusion Yanaco MP-500D, fabricado por Yanaco Analytical Instruments Corp. Los espectros de 1H RMN se midieron utilizando un espectrometro de RMN JNM AL-400 fabricado por JEOL Ltd. Se uso como disolvente en la medicion de los espectros de RMN CDCh o CD3OD (ISOTEC). El desplazamiento qmmico se expresa como un valor relativo cuando se usa tetrametilsilano ((CH3)4 Si) como estandar interno (0 ppm). La constante de acoplamiento (J) se muestra en Hz. Los sfmbolos, s, d, t, m y br, representan singlete, doblete, triplete, cualtete, multiplete y picoancho, respectivamente.
Ejemplo de referencia 1 Smtesis de SRPIN-1
Los métodos de síntesis representativos para SRPIN-1 (nombre de código GIF-0340) se describen a continuación.
Figure imgf000030_0001
Ejemplo de referencia 1-1a Se anadio secuencial mente piperidina (220 pl, 2,22 mmoles) y N,N-diisopropiletilamina (220 pl, 2,40 mmoles) a temperatura ambiente a una solucion de N,N-dimetilformamida (DMF; 1 ml) de 1-fluoro-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (427 mg, 2,04 mmoles, producto comercialmente disponible). La mezcla resultante se agito durante una hora. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con eter. La capa organica extrafda se lavo con salmuera, se seco sobre Na2SO4, se filtro, y se concentro bajo presion reducida.
El residuo se purifico por cromatograffa en columna de gel de silice (40 g, hexano/acetato de etilo = 10/1). De este modo, se obtuvo 1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]piperidina (561 mg, 2,04 mmoles, cuantitativo) como un solido de color naranja.
Los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh, 400 MHz) son los siguientes: CCF Rf 0,47 (hexano/acetona = 16/1); 1H RMN (CDCl3 ,400 MHz) 81,61-1,68 (m, 2H, CH2), 1,72 (tt, 4H, J = 5,3, 5,3 Hz, 2 CH2), 3,13 (t, 4H, J = 5,3 Hz, 2CH2), 7,13 (d, 1H, J = 8,8 Hz, aromatico), 7,61 (dd, 1H, J = 2,0, 8,8 Hz, aromatico), 8,03 (d, 1H, J = 2,0 Hz, aromatico).
Ejemplo de referencia 1-2A
Se anadio secuencialmente acido clortffdrico concentrado (2,00 ml, 24,0 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (2,50 g, 13,1 mmoles) a 0° C a una solucion de metanol (10 ml) de 1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]piperidina (559 mg, 2,03 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de Referencia 1-1A. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y luego se agito durante 17,5 horas. Se anadio una solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla. La mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con salmuera, se seco sobre Na2SO4, se filtro, y se concentro bajo presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de s^lice (50 g, hexano/acetato de etilo = 14/1)). De este modo se obtuvo, 2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)anilina (448 mg, 1,83 mmoles, 90,4%) como un solido amarillo palido.
Los resultados de CCF y 1H RMN (CDCl3 ,400 MHz) son los siguientes: CCF Rf 0,30 (hexano/acetona = 18/1); 1H RMN (CDCl3, 400 MHz) 81,59-1,60 (m, 2H, CH2), 1,71 (tt, 4H, J = 5,4, 5,4 Hz, 2CH2), 2,85 (s br, 4H, 2CH2), 4,09 (br, 2H, NH2), 6,92 (d, 1H, J = 1,9 Hz, aromatico), 6,97 (dd, 1H, J = 1,9, 8,4 Hz, aromatico), 7,01 (d, 1H, J = 8,4 Hz, aromatico).
Ejemplo de referencia 1-3A
Se anadio secuencialmente clorhidrato de cloruro de isonicotinoflo (151 mg, 0,850 mmoles, producto comercialmente disponible), trietilamina (450 pl, 3,23 mmoles) y una cantidad catafftica de 4-(dimetilamino)piridina a 0° C a una solucion en diclorometano (5 ml) de 2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)anilina (173 mg, 0,708 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 1-2a . La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 19,5 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio, se seco sobre Na2SO4, se filtro, y se concentro bajo presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (10 g, hexano/acetato de etilo = 1,5/1) y recristalizacion (hexano). De este modo se obtuvo la N-[2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (Sr PIN-1, nombre de codigo GIF-0340) (83,8 mg, 0,240 mmoles, 33,9%) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh, 400 MHz), son los siguientes: pf 96-98° C; CCF Rf 0,40 (hexano/acetato de etilo = 1/1); 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 8 1,67-1,68 (m, 2H, CH2), 1,78 (tt, 4H, J = 5,5, 5,5 Hz, 2CH2), 2,88 (t, 4H, J = 5,5 Hz, 2CH2), 7,29 (d, 1H, J = 8,2 Hz, aromatico), 7,40 (dd, 1H, J = 1,8, 8,2 Hz, aromatico), 7,76 (dd, 2H, J = 2,0, 4,4 Hz, aromatico), 8,86 (dd, 2H, J = 2,0, 4,4 Hz, aromatico), 8,87 (d, 1H, J = 1,8 Hz, aromatico), 9,53 (s, 1H, NH).
Ejemplo de referencia 1-1B
Se anadio piperidina (5,50 ml, 55,5 mmoles, producto disponible comercialmente) a 0° C a una solucion de N,N-dimetilformamida (DMF; 7 ml) de 1-cloro-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (5,00 g, 22,4 mmoles, producto comercialmente disponible). La mezcla resultante se agito durante 40 minutos. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (200 g, hexano/acetato de etilo = 8/1). De este modo se obtuvo la 1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]piperidina (6,13 g, cuantitativo) como un solido de color naranja.
Ejemplo de referencia 1-2B
Se anadio secuencialmente, acido clorhffdrico concentrado (12,2 ml, 146 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (12,7 g, 67,2 mmoles) a 0° C a una solucion de diclorometano (10 ml) de 1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]piperidina (6,13 g, 22,4 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de Referencia 1-1B. La mezcla resultante se agito durante siete horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo.
La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro, y se concentro bajo presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (200 g, hexano/acetato de etilo = 15/1). De este modo se obtuvo, 2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)anilina (4,55 g, 83,0%) como un solido amarillo palido.
Ejemplo de referencia 1-3B
Se anadio secuencialmente clorhidrato de cloruro de isonicotinoflo (6,48 g, 36,4 mmoles, producto comercialmente disponible) y trietilamina (5,57 ml, 54,6 mmoles) a 0° C a una solucion de diclorometano (10 ml) de 2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)anilina (4,45 g, 18,2 mmoles) obtenida como se describe en el Ejemplo de Referencia 1-2B. La mezcla se agito durante media hora. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (200 g, hexano/acetato de etilo = 1/1) y recristalizacion. De este modo se obtuvo la N-[2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (SRPIN-1, GIF-0340) (5,49 g, 86,3%) como un solido incoloro.
Ejemplo de referencia 2 Smtesis del nombre de codigo GIF-0613
Figure imgf000032_0001
Ejemplo de referencia 2-1
Se anadio (S)-2-metilpiperidina (270 pl, 2,24 mmoles, producto comercialmente disponible) a temperature ambiente a una solucion de N-N-dimetilformamida (DMF; 0,5 ml) de 1-fluoro-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (211 mg, 1,00 mmoles, producto comercialmente disponible). La mezcla resultante se agito durante dos horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 12/1). De este modo se obtuvo la (S)-1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]-2-metilpiperidina (286 mg, 99,2%) como un material oleoso de color naranja.
CCF Rf 0,44 (hexano/acetato de etilo = 16/1).
Ejemplo de referencia 2-2
Se anadio secuencialmente acido clorhffdrico concentrado (1,00 ml, 12,0 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (903 mg, 4,76 mmoles) a 0° C a una solucion en metanol (5 ml) de (S)-1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]-2-metilpiperidina (275 mg, 0,953 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 2-1. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 17 horas. Se anadio una solucion saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla, y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (50 g, hexano/acetato de etilo = 12/1). De este modo se obtuvo la (S)-2-(2-metil-1-piperidinil)-5-(trifluorometil)anilina (233 mg, 94,6%) como un material oleoso incoloro.
CCF Rf 0,38 (hexano/acetato de etilo = 16/1).
Ejemplo de referencia 2-3
Se anadio secuencialmente clorhidrato de cloruro de isonicotinoMo (466 mg, 2,61 mmoles, producto comercialmente disponible) y trietilamina (600 pl, 4,30 mmoles) a 0° C a una solucion de diclorometano (5 ml) de (S)-2-(2-metil-1-piperidinil)-5-(trifluorometil)anilina (223 mg, 0,863 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 2­ 2. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 19,5 horas. Se anadio agua a la mezcla, y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (25 g, hexano/acetato de etilo = 1,5/1). De este modo se obtuvo la (S)-N-[2-(2-metil-1-piperidinil)-5-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (GIF-0613) (293 mg, 93,4%) como un material oleoso incoloro.
Los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh, 400 MHz) son los siguientes: CCF Rf 0,40 (hexano/acetato de etilo = 1/1); 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 80,84 (d, 3H, J = 6,4 Hz, CH3), 1,39-1,69 (m, 3H, CH2, CH), 1,82-1,86 (m, 1H, CH), 1,92­ 1,95 (m, 2H, CH2), 2,65-2,72 (m, 1H, CH), 2,89-2,92 (m, 1H, CH), 2,98-3,02 (m, 1H, CH), 7,35 (d, 1H, J = 8,4 Hz, aromatico), 7,40 (dd, 1H, J = 2,2, 8,4 Hz, aromatico), 7,75 (dd, 2H, J = 1,8, 4,4 Hz, aromatico), 8,86 (dd, 2H, J = 1,8, 4,4 Hz, aromatico), 8,93 (d, 1H, J = 1,8 Hz, aromatico), 10,1 (s, 1H, NH).
Ejemplo de referencia 3 Smtesis del nombre de codigo GIF-0617
Figure imgf000033_0001
Ejemplo de referencia 3-1
Se anadio pirrolidina (983 pl, 12,0 mmoles, producto comercialmente disponible) a 0° C, a una solucion de N,N-dimetilformamida (DMF 4 ml) de 1-fluoro-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (1,02 g, 4,89 mmoles, producto comercialmente disponible). La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 4,5 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por cromatograffa en columna de gel de sflice (50 g, hexano/acetato de etilo = 5/1). De este modo se obtuvo 1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]pirrolidina (1,26 g, 99,3%) como un solido de color naranja.
CCF Rf 0,45 (hexano/acetato de etilo = 5/1).
Ejemplo de referencia 3-2
Se anadio secuencialmente acido clorhffdrico concentrado (1,36 ml, 16,3 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (1,55 g, 8,16 mmoles) a 0° C a una solucion en metanol (4 ml) de 1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]pirrolidina (606 mg, 2,33 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 3-1. La mezcla resultante se agito durante cuatro horas. Se anadio una solucion saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla, y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (50 g, hexano/acetato de etilo = 15/1). De este modo se obtuvo la 1-[2-amino-4-(trifluorometil)fenil]pirrolidina (550 mg, cuantitativo) como un material oleoso de color rojo-naranja.
CCF Rf 0,63 (hexano/acetato de etilo = 1/1).
Ejemplo de referencia 3-3
Se anadio secuencialmente clorhidrato de cloruro de isonicotinoMo (705 mg, 3,96 mmoles, producto comercialmente disponible) y trietilamina (823 pl, 5,94 mmoles) a 0° C a una solucion en diclorometano (10 ml) de 1-[2-amino-4-(trifluorometil)fenil]pirrolidina (516 mg, 2,24 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 3-2. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante cinco horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con diclorometano. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (25 g, hexano/acetato de etilo = 1/2). De este modo, se obtuvo la N-[2-(1-pirrolidinil)-5-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (GIF-0617) (734 mg, 97,8%) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh, 400 MHz), son los siguientes: pf 134-135° C; CCF Rf 0,29 (hexano/acetato de etilo = 1/1); 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 82,01 (tt, 4H, J = 3,2 Hz, 6,4 Hz, 2CH2), 3,15 (t, 4H, J = 6,4 Hz, 2CH2), 7,19 (d, 1H, J = 8,5 Hz, aromatico), 7,38 (dd, 1H, J = 2,2, 8,5 Hz, aromatico), 7,71 (dd, 2H, J = 1,6, 4,4 Hz, aromatico), 8,53 (d, 1H, J = 2,2, Hz, aromatico), 8,79 (s, 1H, NH), 8,83 (dd, 2H, J = 1,6, 4,4 Hz, aromatico).
Ejemplo de referencia 4 Smtesis del nombre de codigo GIF-0618
Figure imgf000034_0001
Ejemplo de referencia 4-1
Se anadio hexahidro-IH-azepina (682 pl, 6,05 mmoles, producto comercialmente disponible) a 0° C a una solucion de N-N-dimetilformamida (DMF; 2 ml) de 1-fluoro-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (506 mg, 2,42 mmoles, producto disponible comercialmente). La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante una hora. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 7/1). De este modo se obtuvo la hexahidro-1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]-1H-azepina (680 mg, 97,5%) como un solido de color naranja.
Los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh , 400 MHz) son los siguientes: CCF Rf 0,49 (hexano/acetato de etilo = 5/1); 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 81,57-1,63 (m, 4H, 2 CH2), 1,79-1,83 (m, 4H, 2CH2), 3,31 (t, 4H, J = 5,5 Hz, 2CH2), 7,11 (d, 1H, J = 9,1 Hz, aromatico) 7,53 (dd, 1H, J = 2,0, 9,1 Hz, aromatico), 7,99 (d, 1H, J = 2,0 Hz, aromatico).
Ejemplo de referencia 4-2
Se anadio secuencialmente acido clorlffdrico concentrado (1,27 ml, 15,2 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (1,43 g, 7,54 mmoles) a 0° C a una mezcla de metanol (5 ml) de solucion de hexahidro-1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]-1H-azepina (675 mg, 2,34 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 4-1. La mezcla resultante se agito durante dos horas. Se anadio una solucion saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla, y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (30 g, hexano/acetato de etilo = 20/1). De este modo, se obtuvo la 1-[2-amino-4-(trifluorometil)fenil]-hexahidro-1H-azepina (522 mg, 86,3%) como un solido incoloro.
Los resultados de CCF y 1H RMN (CDCl3, 400 MHz) son los siguientes: CCF Rf 0,81 (hexano/acetato de etilo = 3/1); 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 8 1,70-1,84 (m, 8H, 4CH2), 3,04 (t, 4H, J = 5,4, Hz, 2CH2), 4,10 (s br, 2H, NH2), 6,92 (d, 1H, J = 1,2 Hz, aromatico), 6,94 (dd, 1H, J = 1,2, 7,9 Hz, aromatico), 7,05 (d, 1H, J = 7,9 Hz, aromatico).
Ejemplo de referencia 4-3
Se anadio secuencialmente clorhidrato de cloruro de isonicotinoflo (704 mg, 3,95 mmoles, producto comercialmente disponible) y trietilamina (823 pl, 5,94 mmoles) a 0° C a una solucion en diclorometano (6 ml) de 1-[2-amino-4-(trifluorometil)fenil]-hexahidro-1H-azepina (512 mg, 1,98 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 4-2. La mezcla resultante se agito durante una hora y media. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con diclorometano. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (30 g, hexano/acetato de etilo = 2/1). De este modo se obtuvo la N-[2-(1-hexahidro-1H-azepinil)-5-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (GIF-0618) (697 mg, 97,0%) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh, 400 MHz), son los siguientes: pf 138-139° C; CCF Rf 0,40 (hexano/acetato de etilo = 1/1); 1H RMN (CDCh, 400 MHz) 81,79 (br, 8H, 4CH2), 3,06-3,10 (m, 4H, 2 CH2), 7,31 (d, 1H, J = 8,2 Hz, aromatico), 7,37 (dd, 1H, J = 1,6, 8,2 Hz, aromatico), 7,76 (dd, 2H, J = 2,0, 6,0 Hz, aromatico), 8,85 (m, 3H, aromatico), 9,66 (s, 1H, NH).
Ejemplo de referencia 5 Smtesis del nombre de codigo GIF-0346
Figure imgf000035_0001
Ejemplo de referencia 5-1
Se añadió morfolina (190 pl, 2,17 mmoles, producto comercialmente disponible) a temperature ambiente a una solucion de N,N-dimetilformamida (DMF; 0,5 ml) de 1-fluoro-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (209 mg, 1,00 mmoles, producto comercialmente disponible). La mezcla resultante se agito durante tres horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 3/1). De este modo, se obtuvo la 4-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]morfolina (270 mg, 97,7%) como un material oleoso de color naranja.
CCF Rf 0,27 (hexano/acetato de etilo = 3/1).
Ejemplo de referencia 5-2
Se anadio secuencialmente acido clorhffdrico concentrado (1,00 ml, 12,0 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (905 mg, 4,77 mmoles) a 0° C a una solucion de metanol (5 ml) de 4-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]morfolina (263 mg, 0,952 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 5-1. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 20 horas. Se anadio una solucion saturada de bicarbonato sodico a la mezcla, y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 2/1). De este modo, se obtuvo la 4-[2-amino-4-(trifluorometil)fenil]morfolina (214 mg, 91,2%) como un solido incoloro.
CCF Rf 0,31 (hexano/acetato de etilo = 3/1).
Ejemplo de referencia 5-3
Se anadio secuencialmente a 0° C clorhidrato del cloruro de isonicotinoilo (320 mg, 1,80 mmoles, producto comercialmente disponible) y trietilamina (480 pl, 3,44 mmoles) a una solucion de diclorometano (5 ml) de 4-[2-amino-4-(trifluorometil)fenil]morfolina (196 mg, 0,796 mmoles), obtenida como se indica en el Ejemplo de Referencia 5-2. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 60 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con diclorometano. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (30 g, hexano/acetato de etilo = 2/1). De este modo, se obtuvo la N-[2-(4-morfolinil)-5-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (GIF-0346) (65,1 mg, 23,2%) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh, 400 MHz), son los siguientes: pf 172-173° C CCF Rf 0,23 (hexano/acetato de etilo = 1/31H RMN (CDCla 400 MHz) 82,96 (t, 4H, J = 4,4 Hz, 2CH2) 3,92 (t, 4H, J = 4,4 Hz, 2CH2), 7,34 (d, 1H, J = 8,4 Hz, aromatico), 7,44 (dd, 1H, J = 1,6, 8,4 Hz, aromatico), 7,75 (dd, 1H, J = 1,6, 4,4 Hz, aromatico), 8,87-8,88 (m, 3H, aromatico) 9,48 (s, 1h , NH).
Ejemplo de referencia 6 Smtesis del nombre de codigo GIF-0347
Figure imgf000036_0001
Ejemplo de referencia 6-1
Se anadio dietilamina (230 pl, 2,22 mmoles, producto disponible comercialmente) a temperatura ambiente a una solucion de N,N-dimetilformamida (DMF; 0,5 ml) de 1-fluoro-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (211 mg, 1,01 mmoles, producto comercialmente disponible). La mezcla resultante se agito durante tres horas Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 8/1). De este modo, se obtuvo, el 1-dietilamino-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (258 mg, 98,3%) como un material oleoso de color naranja.
CCF Rf 0,37 (hexano/acetato de etilo/eter = 16/1/1).
Ejemplo de referencia 6-2
Se anadio secuencialmente acido clorhffdrico concentrado (1,00 ml, 12,0 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (908 mg, 4,78 mmoles) a 0° C a una solucion de metanol (5 ml) de 1-dietilamino-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (251 mg, 0,957 mmoles), obtenido como se describe en el Ejemplo de referencia 6-1. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 22 horas. Se anadio una solucion saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla, y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 20/1-10/1). De este modo, se obtuvo el 2-amino-1-dietilamino-4-(trifluorometil)benceno (144 mg, 64,7%) como un material oleoso incoloro.
CCF Rf 0,22 (hexano/acetato de etilo = 30/1).
Ejemplo de referencia 6-3
Se anadio secuencialmente a 0° C clorhidrato de cloruro de isonicotinoilo (88,2 mg, 0,495 mmoles, producto comercialmente disponible) y trietilamina (140 pl, 1,00 mmoles) a una solucion de diclorometano (3 ml) de 2-amino-1-dietilamino-4-(trifluorometil)benceno (103 mg, 0,443 mmoles), como se describe en el Ejemplo de referencia 6-2. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante una hora y media. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con diclorometano. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (30 g, hexano/acetato de etilo = 2/1). De este modo, se obtuvo la N-[2-dietilamino-5-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (GIF-0347) (51,0 mg, 34,1%) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh 400 MHz, son los siguientes: pf 78-80° C; CCF Rf 0,31 (hexano/acetato de etilo = 1/1); 1H RMN (CDCla 400 MHz) 8 1,01 (t, 6H, J = 7,1 Hz, 2CH3), 3,04 (q, 4H, J = 7,1 Hz, 2CH2), 7,33 (d, 1H, J = 8,2 Hz, aromatico), 7,41 (dd, 1H, J = 1,8, 8,2 Hz, aromatico), 7,73 (dd, 2H, J = 1,8, 4,4 Hz, aromatico), 8,60 (d, 1H, J = 2,6 Hz, aromatico), 8,85 (dd, 2H, J = 1,8, 4,4 Hz, aromatico ), 8,91 (d, 1H, J = 1,8 Hz, aromatico) 9,90 (s, 1H, NH).
Ejemplo de referencia 7 Smtesis del nombre de codigo GIF-0343
Figure imgf000037_0001
Se anadio secuencialmente clorhidrato de cloruro de nicotinoflo (122 mg, 0,685 mmoles, producto disponible comercialmente) y trietilamina (250 pl, 1,79 mmoles) a 0° C a una solucion en diclorometano (5 ml) de 2-(1 -piperidinil)-5-(trifluorometil)anilina (152 mg, 0,622 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de Referencia 1-2. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 16,5 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (15 g, hexano/acetato de etilo = 1,5/1 -1/1). De este modo, se obtuvo la N-[2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)fenil]nicotinamida (GIF-0343) (98,4 mg, 45,3%) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh 400 MHz), son los siguientes: pf 145-146° C; CCF Rf 0,40 (hexano/acetato de etilo = 1/1); 1H RMN (CDCls, 400 MHz) 81,62-1,69 (m, 2H, CH2), 1,79 (tt, 4H, J = 5,8, 5,8 Hz, 2CH2), 2,88 (t, 4H, J = 5,8 Hz, 2CH2), 7,29 (d, 1H, J = 8,4 Hz, aromatico), 7,39 (dd, 1H, J = 2,0, 8,4 Hz, aromatico), 7,51 (dd, 1H, J = 4,8, 8,0 Hz, aromatico), 8,30 (ddd, 1H, J = 1,6, 2,4, 8,0 Hz, aromatico), 8,82 (dd, 1H, J = 1,6, 4,8 Hz, aromatico), 8,87 (d, 1H, J = 2,0 Hz, aromatico), 9,16 (d, 8,0 Hz aromatico), 8,82 (dd,1H, J = 1,6, 4,8 Hz, aromatico), 8,87 (d, 1H, J = 2,0 Hz aromatico, 9,16 (d, 1H, J = 2,4 Hz, aromatico), 9,53 (s, 1H, NH).
Ejemplo de referencia 8 Smtesis del nombre de codigo GIF-0344
Figure imgf000037_0002
Se anadio secuencialmente a 0° C cloruro de benzoilo (50 pl, 0,430 mmoles, producto comercialmente disponible) y trietilamina (170 pl, 1,21 mmoles) a una solucion de diclorometano (3 ml) de 2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)anilina (102 mg, 0,417 mmoles), obtenida como se describio en el Ejemplo de referencia 1-2. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 18 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (20 g, hexano/acetato de etilo = 10/1).De este modo, se obtuvo la N-[2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)fenilbenzamida (GIF-0344) (126 mg, 86,7%) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCl3400 MHz), son los siguientes: pf 128-129° C; CCF Rf 0,46 (hexano/acetato de etilo = 4/1; 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 81,62-1,70 (m, 2H, CH2), 1,78 (tt, 4H, J = 5,2, 5,2 Hz, 2CH2), 2,88 (t, 4H, J = 5,2 Hz, 2CH2), 7,26 (d, 1H, J = 8,6 Hz, aromatico), 7,35 (d, 1H, J = 0,8, 8,6 Hz, aromatico), 7,52­ 7,61 (m, 1H, aromatico), 8,10 (m, 2 H, aromatico), 7,94 (m, 2H, aromatico), 8,91 (d, 1H, J = 0,8 Hz, aromatico), 9,44 (s, 1H, NH).
Ejemplo de referencia 9 nombre de codigo GIF-0345
Figure imgf000038_0001
Se anadio cloruro de 4-nitrobenzoflo (64,2 mg, 0,345 mmoles, producto comercialmente disponible) y trietilamina (120 pl, 0,859 mmoles) secuencialmente a 0° C a una solucion de diclorometano (2 ml) de 2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)anilina (51,2 mg, 0,209 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 1-2. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 60 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (30 g, hexano/acetato de etilo = 8/1-6/1). De este modo, se obtuvo la N-[2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)fenil]-4-nitrobenzamida (GIF-0345) (46,3 mg, 56,3%) como un solido amarillo.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh 400 MHz), son los siguientes: pf 125-136° C; CCF Rf 0,33 (hexano/acetato de etilo = 4/1); 1H RMN (CDCh 400 MHz) 81,62-1,70 (m, 2H, CH2), 1,77 (tt, 4H, J = 5,0, 5,0 Hz, 2CH2), 2,88 (t, 4H, J = 5,0 Hz, 2 CH2), 7,30 (d, 1H, J = 8,0 Hz, aromatico), 7,40 (dd, 1H, J = 1,6, 8,2 Hz, aromatico), 8,10 (dd, 2H, J = 1,8, 6,8 Hz, aromatico), 8,41 (d, 2H, J = 1,8, 6,8 Hz, aromatico), 8,86 (d, 1H, J = 2,0 Hz, aromatico), 9,54 (s, 1H, NH).
Ejemplo de referencia 10 Smtesis del nombre de codigo GIF-0615
Figure imgf000038_0002
Se anadio secuencialmente cloruro de 4-metoxibenzoilo (250 mg, 1,47 mmoles, producto comercialmente disponible) y trietilamina (254 pl, 1,83 mmoles) a 0° C a una mezcla de solucion de diclorometano (4 ml) de 2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)anilina (147 mg, 0,602 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 1-2. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 17 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 5/1). De este modo, se obtuvo, N-[2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)fenil]-4-metoxibenzamida (GIF-0615) (240 mg, cuantitativo) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCl3400 MHz), son los siguientes: pf 111-114° C; CCF Rf 0,33 (hexano/acetato de etilo = 4/1) 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 81,64-1,68 (m, 2H, CH2) 1,78 (tt, 4H, J = 5,4, 5,4 Hz, CH2), 1,60-1,70 (m, 2H, CH2), 2,39-2,41 (m, 2H, CH2), 2,87 (t, 4H, J = 5,4 Hz, 2CH2), 3,89 (s, 3H, CH3), 7,03 (dd, 2H, J = 2,0, 7,0 Hz, aromatico), 7,23 (d, 1H, J = 8,0 Hz, aromatico), 7,32 (dd, 1H, J = 1,6, 8,0 Hz, aromatco), 7,91 (dd, 2H, J = 2,0, 7,0 Hz, aromatico), 8,88 (d, 1H, J = 1,6 Hz, aromatico), 9,34 (s, 1H, NH).
Ejemplo de referencia 11 Smtesis del nombre de codigo GIF-0622
Figure imgf000039_0002
Se anadio secuencialmente cloruro de p-toluensulfonilo (233 g, 1,22 mmoles, producto comercialmente disponible) y trietilamina (254 pl, 1,83 mmoles) a temperatura ambiente a una solucion de diclorometano (5 ml) de 2-(1 -piperidinil)-5-(trifluorometil)anilina (149 mg, 0,610 mmoles), obtenida como se describio en el Ejemplo de Referencia 1-2. La mezcla resultante se agito durante 60 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 10/1). De este modo se obtuvo la N-[2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)fenil]-p-toluensulfonamida (GIF-0622) (243 mg, cuantitativo) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh 400 MHz), son los siguientes: pf 117-134° C; CCF Rf 0,49 (hexano/acetato de etilo = 5/1) 1H RMN (CDCls 400 MHz) 81,55-1,60 (m, 2H, CH2), 1,66 (tt, 4H, J = 5,2, 5,2 Hz, 2CH2), 2,36 (s, 3H, CH3) 2,51 (t, 4H, J = 5,2 Hz, 2CH2) 7,11 (d, 1H, J = 8,0 Hz, aromatico), 7,22 a 7,28 (m, 3H, aromatico), 7,71 (dd, 2H, J = 1,8, 8,6 Hz, aromatico), 7,85 (d, 1H, J = 2,0 Hz, aromatico), 7,94 (s, 1H, NH).
Ejemplo de referencia 12 Smtesis del nombre de codigo GIF-0624
Figure imgf000039_0001
Se agito acetonitrilo (15 ml) que contema tiocianato de potasio (119 mg, 1,22 mmoles, producto comercialmente disponible) y clorhidrato de cloruro de nicotinoilo (352 mg, 1,97 mmoles, producto comercialmente disponible a 70° C durante 40 minutos. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente y despues se anadio secuencialmente a ella una solucion de acetonitrilo (5 ml) de 2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)anilina (244 mg, 1,00 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 1-2. y trietilamina (278 pl, 2,00 mmoles). La mezcla resultante se agito a 50° C durante una hora. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con diclorometano. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (25 g, hexano/acetato de etilo = 4/1-1/1). De este modo, se obtuvo 1-nicotinoil-3-[2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)fenil]tiourea (GIF-0624) (383 mg, 93,7%) como un solido amarillo palido.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CD3OD 400 MHz), son los siguientes: punto de fusion 142­ 144° C; CCF Rf 0,26 (hexano/acetato de etilo = 1/1) 1H RMN (CDCla 400 MHz) 8 1,58-1,67 (m, 2H, CH2), 1,75-1,85 (m, 4H, 2CH2), 2,89-2,95 (m, 4H, 2CH2), 7,33-7,40 (m, 1H, aromatico), 7,44-7,48 (m, 1H, aromatico), 7,60-7,65 (m, 1H, aromatico), 8,76-8,78 (m, 1H, aromatico), 9,05 (s, 0,6H, aromatico), 9,09-9,14 (m, 1H, aromatico), 8,37-8,39 (m, 1H, aromatico), 8,49 (s, 0,4 H, aromatico).
Ejemplo de referencia 13 Smtesis del nombre de codigo GIF-0614
Figure imgf000040_0002
Se anadio hidruro de sodio (60% (p/p) mezcla de aceite) (200 mg, 0,500 mmoles) a 0° C a una solucion de N,N-dimetilformamida (DMF; 0,5 ml) de N-[2-(1 -piperidinil)-5-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (SRPIN-1, GIF-0340) (121 mg, 0,496 mmoles), obtenido como se describe en el Ejemplo de referencia 1-3. La mezcla resultante se agito durante una hora y se anadio una solucion de N,N-dimetilformamida (DMF) de yoduro de metilo (0,8 M, 0,62 ml, 0,496 mmoles) a 0° C. La mezcla resultante se agito durante tres horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (12 g, hexano/acetato de etilo = 1/1). De este modo, se obtuvo la N-metil-N-[2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (GIF-0614) (65,9 mg, 51,5%) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh 400 MHz), son los siguientes: pf 119-121° C; CCF Rf 0,36 (hexano/acetato de etilo = 1/1); 1H RMN (CDCh 400 MHz) 6 1,50-1,60 (m, 2H, CH2) 1,60-1,70 (m, 2H, CH2), 1,60-1,70 (m, 2H, CH2), 2,39-2,41 (m, 2H, CH2), 2,80-2,82 (m, 2H, CH2), 3,20 (s, 3H, CH3), 6,86 (d, 1H, J = 8,3 Hz, aromatico), 7,15 (d, 2H, J = 4,4 Hz, aromatico), 7,41 (d, 2H, J = 8,3 Hz, aromatico), 7,48 (s,1H, aromatico), 8,44 (d, 2H, J = 4,4 Hz, aromatico).
Ejemplo de referencia 14 Smtesis del nombre de codigo GIF-0616
Figure imgf000040_0001
Se anadio reactivo de Lawesson (328 mg, 0,811 mmoles, producto disponible comercialmente) a una solucion de tolueno (2,5 ml) de N-[2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (SRPIN-1), GIF-0340) (528 mg, 1,51 mmoles), obtenido como se describe en el Ejemplo de referencia 1-3, y la mezcla resultante se agito con reflujo a 100° C durante 12 horas. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente y luego se le anadio una solucion acuosa de hidroxido de sodio 2 M para alcalinizar la solucion. La mezcla se extrajo a contracorriente tres veces con una solucion acuosa de hidroxido de sodio 12 M. Se anadio acido clorhffdrico 2 M a la capa acuosa para acidificar la solucion. Despues, la mezcla resultante se extrajo tres veces con eter. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (50 g, hexano/acetato de etilo = 1/1). De este modo, se obtuvo la N-[2-(1-piperidinil)-5-(trifluorometil)fenil]isonicotiniltioamida (GIF-0616) (186 mg, 33,7%) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCl3400 MHz), son los siguientes: pf 108-109° C; CCF Rf 0,27 (hexano/acetato de etilo = 1/1); 1H RMN (CDCla 400 MHz) 61,61-1,62 (m, 2H, CH2), 1,68 (tt, 4H, J = 5,0, 5,0 Hz, 2CH2), 2,87 (t, 4H, J = 5,0 Hz, 2CH2), 7,32 (d, 1H, J = 7,8 Hz, aromatico), 7,51 (dd, 1H, J = 1,6 Hz, aromatico), 7,71 (dd, 2H, J = 1,6, 6,4 Hz, aromatico), 8,76 (dd, 2H, J = 1,6, 6,4 Hz, aromatico), 9,58 (d, 1H, J = 1,6 Hz, aromatico), 10,5 (s, 1H, NH).
Ejemplo de referencia 15 Smtesis del nombre de codigo GIF-0341
Figure imgf000041_0001
Ejemplo de referencia 15-1
Se anadio piperidina (660 pl, 6,66 mmoles, producto disponible comercialmente) a temperatura ambiente a una solucion de N,N-dimetilformamida (DMF; 1 ml) de 1,4-dicloro-2-nitrobenceno (390 mg, 2,03 mmoles, producto comercialmente disponible). La mezcla resultante se agito durante 18,5 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (30 g, hexano/acetato de etilo = 10/1). Asf, se obtuvo 1-(4-cloro-2-nitrofenil)piperidina (471 mg, 96,4%) como un material oleoso de color naranja.
CCF Rf 0,18 (hexano solo).
Ejemplo de referencia 15-2
Se anadio acido clorhffdrico concentrado (2,00 ml, 24,0 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (1,84 g, 9,70 mmoles) secuencialmente a 0° C a una solucion de metanol (10 ml) de 1-(4-cloro-2-nitrofenil)piperidina (471 mg, 1,95 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 15-1 La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 16 horas. Se anadio una solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla. La mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (30 g, hexano/acetato de etilo = 9/1). De este modo, se obtuvo la 5-cloro-2-(1-piperidinil)anilina (388 mg, 94,3%) como un material oleoso incoloro.
CCF Rf 0,26 (hexano/acetato de etilo = 18/1).
Ejemplo de referencia 15-3
Se anadio secuencialmente clorhidrato de cloruro de isonicotinoflo (350 mg, 1,96 mmoles, producto disponible comercialmente), trietilamina (740 pl, 5,30 mmoles) y una cantidad catafftica de 4- (dimetilamino)piridina a temperatura ambiente a una solucion de diclorometano (10 ml) de 5-cloro-2-(1-piperidinil)anilina (378 mg, 1,79 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 15-2. La mezcla resultante se agito durante 19 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (200 g, hexano/acetato de etilo = 1/1).De este modo, se obtuvo la N-[5-cloro-2-(1-piperidinil)fenil]isonicotinamida (GIF-0341) (180 mg, 31,8%) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh 400 MHz), son los siguientes: pf 141-143° C; CCF Rf 0,32 (hexano/acetato de etilo = 1/1); 1H RMN (CDCla 400 MHz) 81,61-1,62 (m, 2H, CH2), 1,76 (tt, 4H, J = 5,0, 5,0 Hz, 2CH2), 2,82 (t, 4H, J = 5,0 Hz, 2CH2), 7,09 (dd, 1H d, J = 2,6, 8,8 Hz, aromatico), 7,14 (d, 1H, J = 8,8 Hz, aromatico), 7,75 (dd, 2H, J = 1,6, 4,4 Hz, aromatico), 8,60 (d, 1H, J = 2,6 Hz, aromatico), 8,85 (dd, 2H, J = 1,6, 4,4 Hz, aromatico), 9,66 (s, 1H, NH).
Ejemplo de referencia 16 Smtesis del nombre de codigo GIF-0342
Figure imgf000042_0001
Ejemplo de referencia 16-1
Se anadio piperidina (660 pl, 6,66 mmoles, producto disponible comercialmente) a temperatura ambiente a una solucion de N,N-dimetilformamida (DMF; 1 ml) de 4-cloro-3-nitrotolueno (358 mg, 2,08 mmoles, producto disponible comercialmente). La mezcla resultante se agito a 100° C durante 17 horas. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente y luego se le anadio agua. La mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (50 g, hexano/acetato de etilo = 50/1). De este modo se obtuvo la 1-(4-metil-2-nitrofenil)piperidina (212 mg, 46,2%) como un material oleoso incoloro. CCF Rf 0,54 (hexano/acetato de etilo = 10/1).
Ejemplo de referencia 16-2
Se anadio secuencialmente acido clorlffdrico concentrado (0,70 ml, 8,4 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (834 mg, 4,39 mmoles) a 0° C a una solucion de metanol (5 ml) de 1-(4-metil-2-nitrofenil)piperidina (212 mg, 0,880 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 16-1. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 16 horas. Se anadio una solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla. La mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 12/1). De este modo, se obtuvo la 5-metil-2-(1-piperidinil)anilina (164 mg, 95,0%) como un material oleoso amarillo palido.
CCF Rf 0,36 (hexano/acetato de etilo = 10/1)
Ejemplo de referencia 16-3
Se anadio secuencialmente clorhidrato de cloruro de isonicotinoilo (172 mg, 0,966 mmoles, producto disponible comercialmente), trietilamina (340 pl, 2,44 mmoles), y una cantidad catalftica de 4-(dimetilamino)piridina a temperatura ambiente a una solucion de diclorometano (5 ml) de 5-metil-2-(1-piperidinil)anilina (155 mg, 0,815 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 16-2. La mezcla resultante se agito durante 19 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (10 g, hexano/acetato de etilo = 1/1). De este modo se obtuvo, N-[5-metil-2-(1-piperidinil)fenil]isonicotinamida (GIF-0342) (69,5 mg, 28,8%) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh 400 MHz), son los siguientes: pf 142-144° C; CCF Rf 0,35 (hexano/acetato de etilo = 1/1. 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 81,62-1,70 (m, 2H, CH2) 1,75 (tt, 4H, J = 4,9, 4,9 Hz, 2CH2), 2,37 (s, 3H, CH3) 2,82 (t, 4H, J = 4,9 Hz, 2CH2), 6,94 (dd, 1H, J = 1,6, 8,1 Hz, aromatico), 7,12 (d, 1H, J = 8,1 Hz, aromatico), 7,76 (dd, 2H, J = 1,3, 4,5 Hz, aromatico), 8,38 (d, 1H, J = 1,6 Hz, aromatico), 8,84 (dd, 2H, J = 1,3, 4,5 Hz, aromatico), 9,75 (s, 1H, NH) .
Ejemplo de referencia 17 Smtesis de nombre de codigo GIF-0348
Figure imgf000042_0002
Ejemplo de referencia 17-1
Se anadio piperidina (320 pl, 3,23 mmoles, producto disponible comercialmente) a temperatura ambiente a una solucion de N,N-dimetilformamida (DMF; 0,5 ml) de 1,4-difluoro-2-nitrobenceno (225 mg, 1,41 mmoles), producto comercialmente disponible). La mezcla resultante se agito durante dos horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 12/1). De este modo se obtuvo, la 1-(4-fluoro-2-nitrofenil)piperidina (298 mg, 94,2%) como un material oleoso de color naranja.
CCF Rf 0,46 (hexano/acetato de etilo = 12/1).
Ejemplo de referencia 17-2
Se anadio acido clorhffdrico concentrado (1,20 ml, 14,4 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (1,22 g, 6,43 mmoles) secuencialmente a 0° C a una mezcla de solucion de metanol (5 ml) de 1-(4-fluoro-2-nitrofenil) piperidina (289 mg, 1,28 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 17-1. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 21 horas. Se anadio una solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla. La mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (25 g, hexano/acetato de etilo = 12/1). De este modo se obtuvo, 5-fluoro-2-(1-piperidinil)anilina (250 mg, cuantitativo) como un material oleoso incoloro.
CCF Rf 0,34 (hexano/acetato de etilo = 16/1)
Ejemplo de referencia 17-3
Se anadieron secuencialmente clorhidrato de cloruro de isonicotinoflo (454 mg, 2,55 mmoles, producto disponible comercialmente) y trietilamina (385 pl, 3,83 mmoles) a 0° C a una solucion de diclorometano (10 ml) de 5-fluoro-2-(1-piperidinil)anilina (248 mg, 1,27 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 17-2. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 17 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (15 g, hexano/acetato de etilo = 1,5/1). De este modo se obtuvo la N-[5-fluoro-2- (1-piperidinil)fenil]isonicotinamida (GIF-0348) (257 mg, 67,6%) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh 400 MHz), son los siguientes: pf 115-116° C; CCF Rf 0,40 (hexano/acetato de etilo = 1/1); 1H RMN (CDCla 400 MHz) 81,62-1,69 (m, 2H, CH2) 1,76 (s br, 4H, 2CH2), 2,82 (s br, 4H, 2CH2), 6,81 (ddd, 1H, J = 2,8, 8,8, 10,8 Hz, aromatico), 7,18 (dd, 1H, J = 5,6, 8,8 Hz, aromatico), 7,75 (dd, 2H, J = 2,0, 4,4 Hz, aromatico), 8,34 (dd, 1H, J = 2,8, 10,8 Hz, aromatico), 9,16 (dd, 2H, J = 2,0, 4,4 Hz, aromatico), 9,83 (s, 1H, NH).
Ejemplo de referencia 18 Smtesis del nombre de codigo GIF-0349
Figure imgf000043_0001
Ejemplo de referencia 18-1
Se anadio piperidina (338 pl, 3,41 mmoles, producto comercialmente disponible) a temperatura ambiente a una solucion de N,N-dimetilformamida (DMF; 0,5 ml) de 2-fluoro-1-nitrobenceno (219 mg, 1,55 mmoles, producto disponible comercialmente). La mezcla resultante se agito durante dos horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 20/1). De este modo se obtuvo, 1-(2-nitrofenil)piperidina (315 mg, 98,8%) como un material oleoso incoloro.
CCF Rf 0,53 (hexano/acetato de etilo = 16/1)
Ejemplo de referencia 18-2
Se anadieron secuencialmente acido clorhndrico concentrado (1,50 ml, 18,0 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (1,45 g, 7,64 mmoles) a 0° C a una solucion de metanol (10 ml) de 1 -(2-nitrofenM) piperidina (315 mg, 1,52 mmoles) obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 18-1. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 17 horas. Se anadio una solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla. La mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 15/1). De este modo se obtuvo, la 2-(1-piperidinil)anilina (238 mg, 88,8%) como un material oleoso amarillo palido.
CCF Rf 0,19 (hexano/acetato de etilo = 18/1)
Ejemplo de referencia 18-3
Se anadio secuencialmente clorhidrato de cloruro de isonicotinoMo (616 mg, 3,46 mmoles, producto comercialmente disponible) y trietilamina (800 pl, 5,73 mmoles) a 0° C a una solucion de diclorometano (5 ml) de 2-(1-piperidinil)anilina (203 mg, 1,15 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 18-2. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante dos horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 1/1). De este modo se obtuvo, la N-[2-(1-piperidinil)fenil] isonicotinamida (GIF-0349) (259 mg, 80,0%) como un solido incoloro.
El punto de fusion, y los resultados de CCF y 1H RMN (CDCh, 400 MHz), son los siguientes: pf 111-113° C.; CCF Rf 0,35 (hexano/acetato de etilo = 1/1); 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 81,62-1,67 (m, 2H, CH2), 1,76 (tt, 4H, J = 4,8, 4,8 Hz, 2CH2), 2,85 (t, 4H, J = 4,8 Hz, 2CH2), 7,13 (td, 1H, J = 1,6, 7,8 Hz, aromatico), 7,21 (td, 1H, J = 1,6, 7,8 Hz, aromatico), 7,24 (dd, 1H, J = 1,6, 7,8 Hz, aromatico), 7,77 (dd, 2H, J = 1,9, 4,4 Hz, aromatico), 8,53 (dd, 1H, J = 1,6, 7,8 Hz, aromatico), 8,84 (dd, 2H, J = 1,9, 4,4 Hz, aromatico), 9,71 (s, 1H, NH).
Ejemplo de referencia 19 Smtesis del nombre de codigo GIF-0619
Figure imgf000044_0001
Ejemplo de referencia 19-1
Se anadio secuencialmente indolina (402 pl, 3,59 mmoles, producto disponible comercialmente) y N,N-diisopropiletilamina (619 pl, 3,59 mmoles) a 0° C a una solucion de N,N-dimetilformamida (DMF; 2 ml) de 1-fluoro-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (498 mg, 2,38 mmoles, producto comercialmente disponible). La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante una hora. Despues, la mezcla se calento a 70° C durante 5,5 horas con agitacion. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (30 g, hexano/acetato de etilo = 20/1). De este modo se obtuvo, la 1-(2-nitro-4-(trifluorometil)fenil)indolina (730 mg, 99,4%) como un material oleoso de color rojo intenso.
CCF Rf 0,48 (hexano/acetato de etilo = 6/1).
Ejemplo de referencia 19-2
Se anadio secuencialmente acido clorhfdrico concentrado (1,28 ml, 15,4 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (1,57 g, 8,30 mmoles) a 0° C a una solucion de metanol (7 ml) de 1-(2-nitro-4-(trifluorometil)fenil)indolina (730 mg, 2,37 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 19-1. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante ocho horas. Se anadio una solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla. La mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (50 g, hexano/acetato de etilo = 10/1). De este modo, se obtuvo, la 1-[2-amino-4-(trifluorometil)fenil]indolina (619 mg, 93,9%) como un material oleoso de color rojo anaranjado.
CCF Rf 0,27 (hexano/acetato de etilo = 6/1).
Ejemplo de referencia 19-3
Se anadio secuencialmente clorhidrato de cloruro de isonicotinoMo (669 mg, 3,76 mmoles, producto comercialmente disponible) y trietilamina (773 pl, 5,58 mmoles) a 0° C a una solucion de diclorometano (5 ml) de 1-[2-amino-4-(trifluorometil)fenil]indolina (518 mg, 1,86 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 19-2. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 2,5 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (50 g, hexano/acetato de etilo = 1/1). De este modo se obtuvo, la N-[2-(1-indolinil)-5-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (GIF-0619) (643 mg, 90,1%) como un solido incoloro.
CCF Rf 0,32 (hexano/acetato de etilo = 1/1).
Ejemplo de referencia 20 Smtesis del nombre de codigo GIF-0620
Figure imgf000045_0001
Ejemplo de referencia 20-1
Se anadio isoindolina (679 pl, 5,98 mmoles, producto disponible comercialmente) a 0° C a una solucion de N,N-dimetilformamida (DMF;2 ml) de 1-fluoro-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (508 mg, 2,43 mmoles, producto disponible comercialmente). La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante dos horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (30 g, hexano/acetato de etilo = 15/1). De este modo se obtuvo, la 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]isoindolina (749 mg, cuantitativo) como un solido amarillo.
CCF Rf 0,42 (hexano/acetato de etilo = 10/1).
Ejemplo de referencia 20-2
Se anadio secuencialmente acido clorhfdrico concentrado (1,13 ml, 13,5 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (1,38 g, 7,28 mmoles) a 0° C a una solucion de metanol (7 ml) de 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]isoindolina (641 mg, 2,08 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 20-1. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 8,5 horas. Se anadio una solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla. La mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (30 g, hexano/acetato de etilo = 15/1). De este modo se obtuvo, la 2-[2-amino-4-(trifluorometil)fenil]isoindolina (225 mg, 38,9%) como un material oleoso de color rojonaranja.
CCF Rf 0,38 (hexano/acetato de etilo = 10/1).
Ejemplo de referencia 20-3
Se anadio clorhidrato de cloruro de isonicotinoflo (250 mg, 1,40 mmoles, producto disponible comercialmente) y trietilamina (287 pl, 2,07 mmoles) secuencialmente a 0° C a una solucion de diclorometano (6 ml) de 2-[2-amino-4-(trifluorometil)fenil]isoindolina (193 mg, 0,694 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 20-2. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante tres horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (5 g, hexano/acetato de etilo = 1/1). De este modo se obtuvo, la N-[2-(2-isoindolinil)-5-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (GIF-0620) (266 mg, cuantivo) como un solido incoloro.
CCF Rf 0,31 (hexano/acetato de etilo = 1/1).
Ejemplo de referencia 21 Smtesis del nombre de codigo GIF-0621
Figure imgf000046_0001
Ejemplo de referencia 21-1
Se anadio 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (909 pl, 7,26 mmoles, producto disponible comercialmente) a 0° C a una solucion de N-N-dimetilformamida (DMF; 4 ml) de 1-fluoro-2-nitro-4-(trifluorometil)benceno (506 g, 2,42 mmoles, producto disponible comercialmente). La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 3,5 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (30 g, hexano/acetato de etilo = 10/1). De este modo se obtuvo, la 1,2,3,4-tetrahidro-2-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]isoquinolina (779 mg, 99,9%) como un solido de color naranja.
TLC Rf 0,54 (hexano/acetato de etilo = 10/1).
Ejemplo de referencia 21-2
Se anadio secuencialmente acido clorhffdrico concentrado (1,11 ml, 13,3 mmoles) y dicloruro de estano anhidro (1,35 g, 7,12 mmoles) a 0° C a una solucion de metanol (8 ml) de 1,2,3,4-tetrahidro-2-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]isoquinolina (658 mg, 2,04 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 21-1. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 18 horas. Se anadio una solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla. La mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (30 g, hexano/acetato de etilo = 20/1). De este modo se obtuvo, la 2-[2-amino-4-(trifluorometil)fenil]-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (426 mg, 71,4%) como un material oleoso de color rojo anaranjado.
CCF Rf 0,36 (hexano/acetato de etilo = 10/1).
Ejemplo de referencia 21-3
Se anadio secuencialmente clorhidrato de cloruro de isonicotinoflo (390 mg, 2,19 mmoles, producto disponible comercialmente) y trietilamina (449 pl, 3,24 mmoles) a 0° C a una solucion de diclorometano (5 ml) de 2-[2-amino-4-(trifluorometil)fenil]-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (315 mg, 1,08 mmoles), obtenida como se describe en el Ejemplo de referencia 21 -2. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante media hora. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con diclorometano. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de silice (20 g, hexano/acetato de etilo = 2/1). De este modo se obtuvo, la N-[2-(1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-2-il)-5-(trifluorometil)fenil isonicotinamida (GIF-0621) (418 mg, 97,6%) como un solido incoloro.
CCF Rf 0,52 (hexano/acetato de etilo = 1/1).
Ejemplo de referencia 22 Smtesis del nombre de codigo GIF-0608
Figure imgf000047_0001
Se anadio secuencialmente clorhidrato de cloruro de isonicotinoflo (670 mg, 3,76 mmoles, producto disponible comercialmente) y trietilamina (864 pl, 6,20 mmoles) a 0° C a una solucion de diclorometano (5 ml) de 3­ (trifluorometil)anilina (208 mg, 1,29 mmoles, producto comercialmente disponible). La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 23 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se seco con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por recristalizacion (acetato de etilo). De este modo se produjo, N-[3-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (GIF-0608) (166 mg, 48,3%) como un solido incoloro.
CCF Rf 0,26 (hexano/acetato de etilo = 1/2).
Ejemplo de referencia 23 Smtesis del nombre de codigo GIF-0612
Figure imgf000047_0002
Se anadio secuencialmente clorhidrato de cloruro de isonicotinoMo (427 mg, 2,39 mmoles, producto disponible comercialmente) y trietilamina (410 pl, 2,94 mmoles) a 0° C a una solucion de diclorometano (5 ml) de 2-bromo-5-(trifluorometil)anilina (480 mg, 2,00 mmoles; producto disponible comercialmente). La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 24 horas. Se anadio agua a la mezcla y la mezcla resultante se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa organica obtenida se lavo con una solucion saturada de cloruro de sodio, se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por recristalizacion (acetato de etilo). De este modo se obtuvo, la N-[2-bromo-5-(trifluorometil)fenil]isonicotinamida (GIF-0612) (308 mg, 44,8%) como un solido incoloro.
CCF Rf 0,46 (hexano/acetato de etilo = 1/1).
Ejemplo de referencia 24 que prueba la toxicidad de SRPIN-1
Las pruebas de cribado cromosomico se llevaron a cabo utilizando celulas de mamnferos para evaluar las anomalfas de SRPIN-1. La mutagenicidad de SRPIN-1 se evaluo utilizando celulas CHL de hamster chino (Dainippon Pharma Co., Ltd) y con la inducibilidad de anomalfas cromosomicas como indicador. Las pruebas utilizaron el metodo de activacion metabolica (mezcla de S9) con un tratamiento corto (seis horas de tratamiento, 18 horas de restauracion) y, en ausencia de un sistema de activacion metabolica, utilizaron un metodo de tratamiento continuo (24 horas de tratamiento). Las celulas CHL se cultivaron en MEM Earle (GIBCO BRL) que contema un 10% de suern de ternera fetal (ICN Flow) en un 5% de CO2 a 37° C. Los ensayos por el metodo de activacion metabolica utilizaron la fraccion S9 (Oriental Yeast Co Ltd.; AT Natarajan et al., Mutation Res, 37, paginas 83-90 (1976)), que se habfa preparado a partir del Imgado de ratas Sprague-Dawley (macho, 7 semanas de edad; Charles River Laboratories Japan, Inc) a las que se administro fenobarbital por via intraperitoneal una vez al dfa durante cuatro dfas consecutivos (30 mg/kg en la primera administracion y 60 mg/kg de la segunda a la cuarta administracion) y en la tercera administracion, se administro 5,6-benzoflavona por via intraperitoneal a una dosis de 80 mg/kg. 1 ml de la mezcla S9 utilizada en este ensayo contema 4 pmoles de tampon HEPES (pH 7,4), 5 pmoles de MgCh, 33 pmoles de KCl, 5 pmoles de G6P, 4 jmoles de NADP y 0,3 ml de fraccion S9.
En el metodo de tratamiento corto, se cultivaron celulas CHL (aproximadamente 4 x 103 celulas/ml) en 5 ml de medio de cultivo utilizando una placa de 60 mm. Despues de tres dfas de cultivo, se extrajo de la placa una almuota de 1,33 ml de medio de cultivo, se le agregaron 0,83 ml de la mezcla S9 y se agregaron inmediatamente 0,5 ml de solucion de prueba a varias concentraciones (concentraciones finales: 5, 1,58 o 0,5 mg/ml, disueltas en una solucion acuosa de carboximetilcelulosa sodica (CMC-Na) al 0,5%). Las celulas se incubaron durante seis horas y luego se lavaron con PBS. Se anadieron 5 ml de medio de cultivo fresco para reemplazar el medio de cultivo. Las celulas se cultivaron adicionalmente durante 18 horas. Se uso una solucion acuosa (0,5 ml) de CMC-Na al 0,5% como control negativo, mientras que se uso dimetilnitrosamina (DMN; una concentracion final de 500 pg/ml) como control positivo; el procedimiento utilizado fue el mismo que el descrito anteriormente. En el metodo con tratamiento continuo, se cultivaron celulas CHL (aproximadamente 4 * 103 celulas/ml) en 5 ml de medio de cultivo en una placa de 60 mm. Despues de tres dfas de cultivo, se extrajeron de la placa 0,5 ml del medio de cultivo. Se agregaron 0,5 ml de soluciones de prueba a varias concentraciones (concentraciones finales: 5, 1,58 o 0,5 mg/ml). Las celulas se incubaron durante 24 horas (aproximadamente 1,5 ciclos celulares) sin tratamiento adicional. Se uso una solucion acuosa (0,5 ml) de 0,5% de CMC-Na como control negativo, mientras que la mitomicina C (MMC; una concentracion final de 0,05 |jg/ml) se uso como control positivo; El procedimiento utilizado fue el mismo que el descrito anteriormente.
Se anadio 0,1 ml de 10 jg/m l de colcemida dos horas antes de terminar el cultivo, y las celulas se recogieron mediante tratamiento con una solucion de tripsina al 0,25%. Despues del tratamiento hipotonico con una solucion de cloruro de potasio 0,075 M, las celulas se fijaron con una solucion mixta de metanol y acido acetico (3:1). Las celulas se secaron, y luego se tineron con Giemsa. Para cada dosis, se extendieron 50 celulas metafasicas para la observacion y se determino el tipo y la frecuencia de anomalfas cromosomicas estructurales y numericas. Las anomalfas estructurales se clasificaron en: rotura de cromatidas (ctb), intercambio de cromatidas (cte), rotura de cromosomas (csb), intercambio de cromosomas (cse) y miscelanea (cinco o mas anomalfas, fragmentaciones, pulverizaciones, etc.). La frecuencia de aparicion se registro para cada categona de anomalfa. Si una celula tema al menos una de estas anomalfas, se consideraba anormal. Cuando la frecuencia de la anomalfa celular fue inferior al 5%, se juzgo que la sustancia de prueba era negativa; cuando la frecuencia era del 5% o mas alta y menos del 10%, se juzgo que la sustancia de prueba era seudo-positiva; y cuando la frecuencia era del 10% o superior, se consideraba que la sustancia era positiva. Cuando se encontro que la frecuencia de aparicion de celulas con cromosomas anormales era del 10% o mas en un grupo tratado con una sustancia de prueba, se concluyo que la sustancia de prueba era una sustancia que indujo anomalfas cromosomicas. En los grupos de control positivo, donde las celulas se trataron con 500 pg/ml de DMN y 0,5 pg/ml de MMC, la frecuencia de aparicion de celulas con anomalfas cromosomicas fue de 26 (52,0%) y 24 celulas (48,0%) respectivamente. No se encontraron anomalfas en el control negativo. Por lo tanto, estas pruebas se juzgaron que fueron adecuadamente realizadas.
Los resultados de la prueba para los grupos tratados con SRPIN-1 mostraron que SRPIN-1 fue negativo en cuanto al aumento en el numero de celulas con anomalfas cromosomicas tanto estructurales como numericas cuando se evaluo mediante los metodos de tratamiento cortos y continuos. Basandose en los resultados anteriores, se concluyo que el compuesto no tema la capacidad de inducir anomalfas cromosomicas en celulas de cultivo de mairnferos en las condiciones experimentales de la presente invencion.
Ejemplo de referencia 25 Administracion in vivo de SRPIN-1
La toxicidad de SRPIN-1 se probo mediante la administracion oral de una dosis unica a ratas. SRPIN-1 se administro por via oral a una dosis de 125, 250, 500, 1000 o 2000 mg/kg (en un volumen de 10 ml por kg) a ratas Slc:SD(cinco semanas de edad; Japan SLC, Inc.) cuyo aumento de peso y condiciones generales fueron normales durante el penodo de aclimatacion. Cada grupo inclrna dos machos y dos hembras. Los animales se mantuvieron en ayunas desde la tarde del dfa anterior a la administracion hasta aproximadamente cuatro horas despues de la administracion. Ninguna de las ratas ni macho ni hembra murio, y no se detectaron cambios en su estado general durante los dos dfas posteriores a la administracion. Despues, SRPIN-1 se administro igualmente por via oral a una dosis de 2000 mg/kg a cinco ratas Slc:SD macho y cinco hembra (cinco semanas de edad). Las ratas se observaron durante 14 dfas despues de la administracion y, segun los examenes visuales, se registro cualquier smtoma toxico, junto con su gravedad y momento, el tiempo necesario para la restauracion y la fecha de muerte. Los resultados mostraron que ninguna de las ratas macho y hembra murio, y que no se detectaron anomalfas en su estado general.
Ejemplo 1A Fosforilacion de protemas SR en celulas infectadas con VIH
Se introdujeron 3 jg de genoma de HIVpNL4-3 (Adachi, A. et al., 1986, J. Virol. 59: 284-289) en celulas Flp-In-293 humanas derivadas de rinon fetal (R750-07; comprado en Invitrogen) usando 9 j l de Genejuice (70967-4; comprado en Novagen), un reactivo de transferencia de genes. Despues de cuatro dfas, las celulas se lisaron con 1 ml de tampon de muestra SDS-PAGE y se desnaturalizaron por calor a 95° C durante tres minutos. El lisado se transfirio inmediatamente a hielo y se uso como una muestra de protema.
La muestra de protema se analizo usando la tecnica de transferencia de Western La muestra se fracciono mediante SDS-PAGE utilizando tampon Laemmli y gel con un gradiente de 4% a 20% a 40 mA durante 45 minutos. Los pesos moleculares se determinaron utilizando un marcador de pretincion de amplio rango (02525-35; Nacalai) como marcador de peso molecular. Luego, la muestra se transfirio a la membrana de nitrocelulosa PROTRAN (BA85; adquirida de Schleicher & Schuell BioScience) mediante transferencia semiseca utilizando TransBlot SD Cell (170­ 3940; adquirida de Bio-Rad) a 160 mA durante 60 minutes. Despues de la transferencia, la membrana se lavo con TBS durante cinco minutos con agitacion. Luego, la membrana se bloqueo con BlockingOne (03953-95; comprado de Nacalai) a temperatura ambiente durante una hora. La membrana se lavo de nuevo con TBS y se incubo a 4° C durante la noche con el anticuerpo monoclonal de raton 104 (Mab104; hibridoma que se adquirio de ATCC), el anticuerpo anti-SC35 de raton (S4045; adquirido de BDTransduction) y el anticuerpo monoclonal anti-SF2 de raton, anticuerpo (AK103: un regalo del Dr. Adrian Krainer; Hanamura, A. et al., 1998, Rn A 4:430-444; Kojima, T. et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:32247-56), que reconocen cada protemas SR fosforilada y se diluyeron con TBS.
La membrana se lavo tres veces con TBS a temperatura ambiente durante diez minutos con agitacion. Luego, el anticuerpo IgG anti-raton de oveja marcado con HRP (NA9310; obtenido de Amersham) se diluyo con TBS, y la membrana se incubo con este anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante una hora. La membrana se lavo tres veces con TBS a temperatura ambiente durante diez minutos con agitacion. Luego, la deteccion se llevo a cabo mediante luminiscencia qmmica utilizando reactivos de deteccion ECL (RPN2105; adquiridos de Amersham) y las imagenes se fotografiaron utilizando una camara LAS 1000CCD (LAS 1000; Fuji Film). Los resultados se muestran en la FIG. 1A.
Los resultados mostraron que cuando las celulas se infectaron con HIVpNL4-3, el analisis de Western usando anticuerpos Mab104, SC35 y SF2 no pudo detectar ninguna senal. Por lo tanto, se revelo que no solo la protema SR estaba desfosforilada, sino que las protemas SR endogenas, como SC35 y SF2 tambien estaban degradadas.
Ejemplo 1B Degradacion de protemas SR
Usando Genejuice, 1 |jg de cada uno de los plasmidos para los genes SRp75, SRp55 y SRp40 fusionados con la etiqueta HA (HA-SRp75, HA-SRp55 y HA-SRp40; regalos del Dr. Woan-Yuh TARN) fueron introducido en celulas Flp-In-293 derivadas de rinon fetal humano. Despues de 36 horas, se anadio MG132 (474790; obtenido de Calbiochem), un inhibidor de ubiquitina-proteosoma, a una concentracion final de 10 pM. Despues de diez horas, las celulas se lisaron con tampon de muestra SDS-PAGE y se desnaturalizaron por calor. El lisado resultante se uso como una muestra de protema. Usando los mismos procedimientos descritos anteriormente, la muestra se fracciono mediante SDS-PAGE y se analizo mediante transferencia de Western usando un anticuerpo anti-HA de conejo (H1803; adquirido de Santa Cruz) como un anticuerpo primario y un anticuerpo IgG anti-conejo de burro. (NA9340; comprado de Amersham) como un anticuerpo secundario. Los resultados se muestran en la FlG. 1B.
Las celulas tratadas con MG132 dieron una senal mas fuerte que el control, mostrando que MG132 inhibfa la degradacion de las protemas SR75, SR55 y SR40. Ademas, se obtuvieron resultados similares para otras protemas SR (datos no mostrados). Usando MG132, se revelo que las protemas SR eran degradadas por el ubiquitinaproteosoma.
Ejemplo 2A Fosforilacion de protemas SR en celulas que expresan SRPK2 de forma estable
Se introdujo una copia unica del gen SRPK2 de raton en las celulas Flp-In-293 en el sitio de Flp-In para establecer multiples lmeas celulares que expresan establemente SRPK2. La lmea celular primaria Flp-In-293 se uso como simulacro en el analisis, y para su uso en los experimentos, se selecciono SRPK2-2 entre las multiples lmeas celulares establecidas que expresan establemente SRPK2. Se introdujo pNL4-3 en estas dos lmeas celulares. Despues de cuatro dfas, se investigo la dinamica de la protema SR endogena durante la infeccion por VIH usando un analisis de Western.
El analisis de Western se llevo a cabo de la misma manera que en la FIG. 1A. Cuando se introdujo el genoma de HIVpNL4-3 en las celulas SRPK2-2, el anticuerpo Mab104 detecto senales en las posiciones correspondientes a SRp35, SRp40, SRp55 y SRp75. Se encontro que los dominios SR reconocibles por Mab104 estaban fosforilados.
Ademas, el analisis de Western usando anticuerpos SC35 y SF2 revelo que se observaron senales SC35 y SF2 en celulas SRPK2-2 introducidas con el genoma de HIVpNL4-3. Los resultados se muestran en la FIG. 2A.
Estos resultados mostraron que las protemas SR generalmente se degradan con la infeccion por VIH, pero en las celulas que expresan SRPK2 de manera estable, las protemas SR permanecen fosforiladas y, como resultado, se estabilizan. Esto sugiere que la protema SR esta fosforilada y que la degradacion de la protema a traves de ubiquitinaproteosoma no tiene lugar en las celulas que expresan SRPK2 de manera estable.
Ejemplo 2B Existencia de protemas SR en celulas que expresan SRPK2 de manera estable
Se introdujo 1 jg de genoma de HIVpNL4-3 y 1 jg de cada uno de los plasmidos para los genes SRp75, SRp55 y SRp40 fusionados con la etiqueta h A (HA-SRp75, HA-SRp55, HA-SRp40; regalos del Dr. Woan-Yuh TARN) en las celulas Flp-In-293 que expresan SRPK2 de manera estable, donde se habfa introducido una copia del gen SRPK2 en el sitio Flp-In (celulas SRPK2-2) y la lmea celular parental Flp-In-293 (simulacro) utilizando Genejuice. Las muestras se recogieron despues de 36 horas y se analizaron mediante transferencia Western. Los resultados se muestran en la Fig. 2B. Segun estos resultados, tras la infeccion por VIH de las celulas Flp-In-293, la senal del anticuerpo anti-HA se debilito o desaparecio no solo para SC35 y SF2, sino tambien para SRp75, SRp55 y SRp40. En las celulas SRPK2-2, las senales para SRp75, SRp55 y SRp40, as ^como para SC35 y SF2 fueron detectables, aunque se deterioraron en comparacion con el control.
Estos resultados sugieren que la degradacion de la protema SR se mejora con la infeccion por VIH, pero que la fosforilacion de la protema SR en las celulas SRPK2-2 estabiliza las protemas SR.
Ejemplo 2C Cuantificacion del VIH producido
En el experimento del Ejemplo 2A (FIG. 2A), se recogio el sobrenadante del cultivo y se cuantifico el VIH producido. Despues de la transferencia genica, se recogio el sobrenadante del cultivo y se midio la cantidad de protema de la capside del VIH 'p24' comprendida en el sobrenadante del cultivo utilizando el sistema ELISA de Lumipulse (Fujirebio). Los resultados se muestran en la FIG. 2C.
Estos resultados mostraron que las celulas SRPK2-2 produjeron 2,3 veces mas VIH que el sobrenadante de cultivo simulado.
Estos descubrimientos revelaron que las protemas SR se desfosforilan en respuesta a la infeccion por VIH, pero si las protemas SR permanecen fosforiladas, el mecanismo regulador de las protemas SR en respuesta a la infeccion no funciona y, por lo tanto, la produccion de VIH aumenta.
Esto sugiere que la desfosforilacion de las protemas SR funciona como un mecanismo de defensa del huesped en respuesta a la infeccion por VIH.
Ejemplo 3A Evaluacion de protemas SR que contribuyen a la produccion in vivo de VIH
En el proceso de expresion genica del VIH, el VIH se transcribe, se procesa y se traduce mediante factores derivados del huesped. En particular, se ha especulado que Tat y Rev de VIH tienen exones divididos y, por lo tanto, una reaccion de empalme de ARNm es esencial para la expresion genica.
Como se muestra en los Ejemplos 1-2 (FIGs 1-2), se activa un mecanismo de defensa del huesped en la infeccion por VIH, y las protemas SR se degradan como resultado. Sin embargo, no hay informacion sobre las reacciones de empalme in vivo del VIH, ni la contribucion de la protema SR a estas reacciones. De hecho, existen muchos tipos de protemas SR en las celulas y, por lo tanto, se introdujeron plasmidos de expresion (0,5 |jg) para dichas protemas SR junto con el genoma de HIVpNL4-3 (1,0 jg), y se evaluaron sus efectos. Los resultados se muestran en la FIG. 3A. Cada uno de los plasmidos de expresion para el simulacro, SC35, SF2, SRp40, SRp55 o SRp75 se introdujeron en celulas Flp-In-293. Despues de 36 horas, se recogieron los sobrenadantes del cultivo y se determino la cantidad de HIVp24 usando el sistema ELISA de Lumipulse.
Segun los resultados, se produjo mas HIVp24 para SRp40 y SRp75 que para el simulacro. Por lo tanto, se encontro que SRp40 y SRp75 tienen el efecto de mejorar la produccion de VIH.
[Ejemplo 3B] Evaluacion del efecto del uso de hnRNPAI en la produccion de VIH in vivo
Como se muestra en la FIG. 3B, en combinacion con el genoma de HIVpNL4-3 (0,5 |jg), se introdujo una cantidad fija (500 ng) de plasmido de expresion para SRp40 o SRp75 y cantidades crecientes de un plasmido de expresion para hnRNPAI en celulas Flp-In-293. Despues de 36 horas, se recogio el sobrenadante del cultivo y se determino la cantidad de HIVp24 usando el sistema ELISA de Lumipulse.
Los resultados mostraron que la cantidad de HIVp24 determinada por el sistema ELISA de Lumipulse disminuyo dependiendo de la dosis de hnRNPAI. Espedficamente, hnRNPAI suprime la produccion de VIH, actuando en competencia con SRp40 y SRp75.
Esto sugiere que la expresion del gen del VIH esta regulada por reacciones de empalme en las celulas. En realidad, dado que hnRNPAI coexiste con SRp40 y SRp75 en las celulas, se cree que la degradacion de las protemas SR en las celulas inducida por la infeccion por el VIH funciona como un mecanismo de defensa al permitir que el hnRNPAI domine las celulas y, por lo tanto, suprima la expresion del gen del VIH.
Ejemplo 4A Busqueda de inhibidores de SRPK de la fosforilacion de la protema SR en las celulas
Se buscaron inhibidores que se unen competitivamente al sitio de union de ATP compartido por las quinasas. Se encontro que un compuesto de exito en los resultados de la seleccion estaba disponible comercialmente en Maybridge (peso molecular = 349,35; Registro CAS No. 218156-96-8). Sin embargo, no se ha divulgado informacion sobre la inhibicion de la quinasa previamente. Los presentes inventores nombraron el compuesto "SRPIN-1" (SRPk Inhibidor-1). Ejemplo 4B Evaluacion de la inhibicion de la actividad de fosforilacion de SRPK1 por SRPIN-1
Se sintetizo un peptido RS (NH2-RSPSYGRSRSRSRSRSRSRSRSNSRSRSY-OH; SEQ ID NO: 5) correspondiente al dominio RS de SF2. El peptido se disolvio a una concentracion de 1 mg/ml en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5). Se incubo SRPIN-1 (concentracion final: 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, o 10,0 j M) con 1 |jg de protema purificada SRPK1 recombinante, que hada sido expresada en E. coli, en un tampon de reaccion (250 j M MgCh, 0,25 mM ATP, 1 mCi de [y-32 P] ATP) en un bano de agua a 30° C durante diez minutos. Las cantidades de SRPK1 y peptido RS para el ensayo de actividad quinasa, y las condiciones para el tiempo de reaccion, se probaron por adelantado y se seleccionaron para la linealidad de la reaccion.
SRPK1 y el peptido RS se incubaron juntos durante diez minutos, luego la solucion de reaccion se goteo en una membrana de fosfocelulosa P81 (P81; Whatman) y la membrana se lavo con solucion de acido fosforico al 5%. Despues del lavado, se determino la radioactividad de 32P en la membrana P81 utilizando un contador de centelleo lfquido. Los resultados se muestran en la FIG. 4B.
Los resultados mostraron que la IC50 de SRPIN-1 para SRPK1 fue aproximadamente 400 nM. Cuando se probo con la misma tecnica, CLK1, c Lk2, CLK3, CLK4, SRp K2, PRP4, PKA y PKC no mostraron un efecto inhibitorio, incluso a la concentracion final de 10 jM . Por lo tanto, es seguro concluir que SRPIN-1 es un inhibidor espedfico de SRPK1.
Ejemplo 4C Evaluacion de la inhibicion in vivo de la fosforilacion de la protema SR por SRPIN-1 y la induccion acompanante de la degradacion de la protema SR
Se introdujo el plasmido HA-SRp75 (1,0 jg ) en celulas Flp-In-293. Despues de 36 horas, se agregaron MG132 (concentracion final: 10 j M) y SRPIN-1 (10, 20 o 50 j M), y las celulas se incubaron durante 15 horas. Luego, las celulas se lisaron con tampon de muestra SDS-PAGE. El lisado se utilizo como muestra proteica. La muestra se fracciono mediante SDS-PAGE y se analizo mediante transferencia de Western usando el anticuerpo anti-HA. Ademas, como control de la cantidad de protema, el analisis de Western se llevo a cabo utilizando anticuerpos antiactina beta. Los resultados se muestran en la FIG. 4C.
El resultado mostro que la senal del anticuerpo HA se debilito dependiendo de la concentracion de SRPIN-1. Esto sugiere que la actividad SRPK1 endogena se inhibio de una manera dependiente de SRPIN-1 y, como resultado, se degrado la protema SRp75.
Este descubrimiento muestra que la inhibicion de SRPK1 por SRPIN-1 puede dar como resultado la inhibicion de la fosforilacion de la protema SR in vivo, hacer inestable la protema SR y, asf, aumentar la degradacion de la protema.
Ejemplo 4D Evaluacion de la inhibicion de la infeccion por VIH mediante la adicion de SRPIN-1
Se llevo a cabo un experimento de infeccion anadiendo viriones de VIH, que se prepararon en celulas 293T, a celulas MT-4. Primero, se agregaron simultaneamente un lfquido vmico preparado y SRPIN-1 (concentracion final: 0,5, 10 o 20 j M) a las celulas MT-4. Las celulas se incubaron a 37° C bajo 5% de CO2 durante dos horas, luego se centrifugaron y el medio de cultivo se intercambio por medio fresco. Luego, se recogio el sobrenadante de cultivo despues de 48 horas, y se determino la cantidad de HIVp24 mediante el sistema ELISA de Lumipulse. Los resultados se muestran en la FIG. 4D.
El resultado mostro que la cantidad de HIVp24 determinada por el sistema ELISA de Lumipulse disminuyo de una manera dependiente de la concentracion de SRPIN-1. Esto sugiere que SRPIN-1 puede inhibir la produccion de VIH en una manera dependiente de la concentracion.
Ejemplo 5 Inhibicion de la actividad de fosforilacion de SRPK1 o SRPK2 utilizando analogos de SRPIN-1
El mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 4B se utilizo para determinar si los analogos de SRPIN-1 teman la actividad de inhibir la actividad de fosforilacion de SRPK1 y SRPK2. Cada analogo de SRPIN-1 (10 j M; en DMSO) se incubo con 1 jg de protema SRPK1 o SRPK2 recombinante purificada, que se expreso en E. coli, en un tampon de reaccion (HEPES 400 jM (pH 7,5), MgCh 100 jM ), ATP 200 jM , [y-32P] ATP 1 mCi y 1 mg/ml de peptido RS (SEC ID NO: 5) en un bano de agua a 30° C durante 20 minutos.
Despues de incubar el peptido RS con SRPK1 o SRPK2 durante 20 minutos, la solucion de reaccion se vertio en una membrana de fosfocelulosa P81 (P81; Whatman) y la membrana se lavo tres veces durante diez minutos con una solucion de acido fosforico al 5%. Despues del lavado, se determino la radioactividad de 32P en la membrana P81 utilizando un contador de centelleo lfquido. Como se muestra en la FIG. 5A, cada analogo de SRPIN-1 ejerce un efecto inhibitorio sobre la actividad de fosforilacion de SRPK1 y/o SRPK2. En particular, se encontro que los compuestos de los Nos de Compuestos. 340 (SRPIN-1) a 348, 612, 613, 615, 618, 619, 621, 624 y 625 exhiben un fuerte efecto inhibidor sobre SRPK1 o SRPK2.
Luego, se analizo cada analogo de SRPIN-1 en cuanto a su efecto en la supresion de la replicacion del VIH. Se llevo a cabo un experimento de infeccion anadiendo viriones de VIH, que se prepararon en celulas 293T, a celulas MT-4 (JCRB No. JCRB0135). Primero, se anadio simultaneamente un lfquido vmico preparado y un analogo de SRPIN-1 (concentracion final: 5, 10 o 20 j M) a las celulas MT-4. Las celulas se incubaron a 37° C bajo 5% de CO2 durante dos horas, luego se centrifugaron y el medio de cultivo se intercambio por medio fresco. El sobrenadante de cultivo se recogio despues de 48 horas, y la cantidad de HIVp24 se determino mediante el sistema ELISA de Lumipulse. Los resultados mostraron que cada analogo SRPIN-1 listado en la FIG. 5B tema la actividad de inhibir la replicacion del VIH. En particular, se encontro que los compuestos numerados Compuesto 340, 341, 342, 343, 345, 347, 348, 608, 613, 615, 616, 618, 619, 620, 622, 623, 624, 625 y 626 teman fuertes efectos en la supresion de la propagacion del VIH. Ademas, como se muestra en la FIG. 5C, tambien se encontro que los compuestos teman el efecto de suprimir la propagacion del VIH en experimentos con otras celulas (Jurkat).
Ejemplo 6: Efecto supresor de la propagacion del virus sindbis
Se anadio 5 pl de virus sindbis (4,7 * 107 PFU/ml) a las celulas Vero (JCRB0111) y las celulas se cultivaron durante 24 horas. El sobrenadante de cultivo se recogio como virus de stock, se diluyo de 102 a 107 PFU, luego se anadio a celulas BHK21 C13 (JCRB9020). Tambien se anadio al mismo tiempo SRPIN-1 (concentracion final: 5, 10, 20 o 40 pM). Despues de una hora de infeccion a temperatura ambiente, se anadio un medio que comprendfa 1% de metilcelulosa (SIGMA M0512-100G), y las celulas fueron suavemente cultivadas a 37° C bajo 5% de CO2 durante 48 horas. La morfologfa celular se observo bajo un microscopio de contraste de fase, y se conto el numero de placas formadas por la muerte celular causada por la infeccion del virus sindbis (placa de ensayo) para calcular la PFU/ml.
La FIG. 6A muestra imagenes microscopicas de contraste de fase de celulas 20 horas despues de la infeccion del virus. El dano celular marcado causado por la propagacion del virus sindbis se encontro en aquellas celulas no tratadas con SRPIN-1 ("+SIN, control" en esta figura), mientras que el dano celular se suprimio drasticamente al administrar SRPIN-1 (40 pM) ("+SIN, 40 pM (#340)” en esta figura). Los resultados del ensayo en placa tambien revelaron que una concentracion de 5 pM o mas de SRPIN-1 suprimio significativamente la propagacion del virus sindbis en una manera dependiente de la concentracion (FIG. 6B).
Ejemplo 7: Efecto supresor de la propagacion del citomegalovirus
Citomegalovirus (1 * 104 PFU/ml) y SRPIN-1 o analogos del mismo (Compuesto No. 340 o 349; concentracion final: 20 o 40 pM) se agregaron simultaneamente a las celulas HFL1 (IF050074). Las celulas HFL1 infectadas con citomegalovirus se observaron bajo un microscopio de contraste de fase siete dfas despues de la infeccion. Como se muestra en la FIG. 7, se encontraron cambios morfologicos caractensticos de la infeccion por citomegalovirus y muerte celular con mucha frecuencia en el grupo de control celular en las celulas HFL1 (1 y 2 en esta figura), a las que no se agrego SRPIN-1. Por el contrario, cuando se agrego SRPIN-1 (20 pM) a las celulas HFL1, no se detectaron cambios morfologicos anormales ni muerte celular (3 en esta figura), a pesar de la infeccion por citomegalovirus. Se detectaron cambios morfologicos parciales que se penso que eran inducidos por SRPIN-1 en las celulas HFL1 a las que se agrego SRPIN-1 a una concentracion mas alta (40 pM). Ademas, la adicion de un compuesto analogo de SRPIN-1 (Compuesto No. 349) a 20 o 40 pM a las celulas HFL1 tambien suprimio los cambios morfologicos anormales y la muerte celular causada por la infeccion por citomegalovirus (5 y 6 en esta figura). Por lo tanto, se demostro que bajo estas condiciones de ensayo, SRPIN-1 y sus compuestos analogos podnan suprimir los cambios en la morfologfa celular y la muerte celular causada por la infeccion por citomegalovirus.
Ejemplo 8: Efecto supresor de la propagacion del virus del SARS
Las celulas Vero (JCRB0111) se infectaron con el virus SARS (FFM-1) (Yamamoto, N. et al., Biochem Biophys Res Commun. 318, 719-725 (2004)), y simultaneamente se anadio SRPIN-1 o un analogo del mismo (concentracion final: 5, 10, 20 o 40 pM). Despues de dos horas de infeccion a temperatura ambiente, se anadio D-MEM que contema 1% de metilcelulosa (S iGm A M0512-100G) y se cultivaron las celulas a 37° C bajo 5% de CO2 durante 48 horas. Se conto el numero de placas formadas por la muerte celular causada por la infeccion por el virus SARS (ensayo de placa) para calcular PFU/ml. Como se muestra en la FIG. 8A, 40 pM de SRPIN-1 y un compuesto analogo del mismo (Compuesto No. 349) suprimieron significativamente la propagacion del virus SARS. El efecto supresor de la propagacion vmca de SRPIN-1 fue mas fuerte que el del compuesto analogo (Compuesto No. 349). Ademas, como se ve en la FIG. 8B, se encontro que SRPIN-1 suprime la propagacion del virus SARS de una manera dependiente de la concentracion dentro el intervalo de concentracion de 1 a 40 pM.
Aplicabilidad industrial
La presente invencion ha revelado que SRPIN-1 (inhibidor 1 de la fosforilacion de la protema SR) y sus analogos tienen la actividad de inhibir las quinasas SRPKs. Cuando se fosforilan por SRPKs, las protemas SR son estables en las celulas. Sin embargo, se encontro que las protemas SR se degradaban a traves de la via ubiquitina-proteosoma cuando se inhibfa la fosforilacion de la protema SR mediante el uso de inhibidores de SRPK para inhibir la actividad enzimatica de SRPK. Asf, los inhibidores de SRPK se anadieron para inhibir SRPK en experimentos de infeccion por VIH, y se encontro que teman la actividad antivmica de suprimir la replicacion vmca.
La presente invencion tambien es beneficiosa porque proporciona agentes antivirales que controlan la actividad de las protemas SR y, por lo tanto, por el mismo mecanismo son eficaces contra una amplia gama de virus.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto representado por la siguiente formula (I):
Figure imgf000064_0001
en donde R1 es un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo C1-6 que puede tener sustituyentes, o un atomo de halogeno; R2 es un atomo de hidrogeno;
R3 es un grupo 4-piridilo;
R4 es un atomo de hidrogeno;
Q es -C(O)-, -C(S)-, -SO2-, -C(S)NHC(O)-, -C(O)NHC(O)- o -C(O)NHC(S)-; y W es un grupo representado por la siguiente formula (II):
Figure imgf000064_0002
en donde R5 y R678, junto con el atomo de nitrogeno adyacente, forman un heterociclo que puede tener un sustituyente.
2. El compuesto de la reivindicacion 1, en donde R1 es un atomo de fluor;
y
W es un grupo piperidinilo o un grupo perhidroazepina que puede tener un grupo alquilo C1-6 como un sustituyente.
3. Una composicion farmaceutica para usar en el tratamiento de una infeccion v'rica en un sujeto que lo necesita, que comprende el compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo.
4. La composicion para usar de la reivindicacion 3, en donde la infeccion v'rica esta causada por:
(1) uno cualquiera de los siguientes virus de ARN: el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), s'ndrome respiratorio agudo severo (SARS), poliovirus, rinovirus humano, virus de la leucemia de celulas T adultas (HTLV-1), virus de la hepatitis A, C, D, y E, virus de vaccinia, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, coronavirus humano, virus del Ebola, citomegalovirus, o virus sindbis; o
(2) uno cualquiera de los siguientes virus de ADN: virus del herpes simple, adenovirus humano, virus de la hepatitis B, citomegalovirus, virus de EB, virus del herpes, virus del herpes humano, virus de la viruela, virus de polioma, o virus del papiloma humano.
5. La composicion para usar de la reivindicacion 3, en donde la infeccion v'rica esta causada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
6. La composicion para usar de la reivindicacion 3, en donde la infeccion v'rica esta causada por el virus del herpes simple.
7. La composicion para usar de la reivindicacion 3, en donde la infeccion v'rica esta causada por el adenovirus humano.
8. La composicion para usar de la reivindicacion 3, en donde la infeccion v'rica esta causada por un citomegalovirus.
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