CN1921885B - 苯胺衍生物或其可药用的盐在制备用于治疗患者病毒感染的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供(1)降低或抑制SR蛋白质的活性的抗病毒剂、更具体地(i)促进SR蛋白质的脱磷酸化的抗病毒剂、以及(ii)抑制磷酸化SR蛋白质的蛋白质的抗病毒剂;(2)抑制SR蛋白质表达的抗病毒剂;以及(3)活化具有与SR蛋白质相反功能的蛋白质的抗病毒剂。另外本发明提供抑制使SR蛋白质磷酸化的SRPK的化合物。这些化合物抑制SR蛋白质的活性,显示抗病毒作用。
Description
技术领域
本发明涉及参与基因表达过程中的剪接反应的SR蛋白质的磷酸化控制。进一步涉及对由病毒等感染导致的慢性或急性疾病的治疗和预防有用的SR蛋白质的活性控制、表达控制和稳定化控制方法,以及以SR蛋白质的活性控制剂为有效成分的抗病毒剂。本发明还涉及对SR蛋白质的活性控制和抗病毒疗法有用的化合物和它们的用途。
背景技术
迄今所报道的抑制病毒复制的很多抗病毒剂是以病毒蛋白酶或病毒所具有的逆转录酶等为目标的。
例如,就HIV病毒而言,使用以HIV基因组的特性为目标的方法。HIV通过逆转录酶将HIV的RNA基因组转化为DNA(原病毒),并整合入宿主染色体,接着,利用宿主细胞的转录、翻译系统由原病毒DNA生产病毒的蛋白质,这些蛋白质是作为大的多蛋白前体转录的,通过蛋白酶的蛋白分解才重新构成病毒,并成熟。因此,对于HIV的抑制剂,以所述HIV成熟过程的各个阶段为目标,研究开发了(1)以逆转录病毒特有的逆转录酶为目标的AZT等(非专利文献1)、(2)抑制蛋白酶的蛋白酶抑制剂(非专利文献2)。
但是,这些都是特异地攻击各种病毒增殖过程的个别对应的抗病毒剂。
非专利文献1:Proc Natl Acad Sci USA Vol.86,No.21,pp.8333-7
非专利文献2:Antimicrob Agents Chemother.1995 Jul;39(7):1559-64
发明内容
发明要解决的问题
病毒特别是RNA病毒由于突变速度快,迄今开发的以病毒蛋白酶或病毒所具有的逆转录酶等为目标的抗病毒剂失效也很快,希望开发 更有效的抗病毒剂。
特别是伴随着以SARS为代表的各种新病毒的出现,亟待开发出即使是新病毒也可以对应的、适用性广且持续性高的抗病毒剂。
解决问题的方法
本发明人一直对与基因表达系统相关的SR蛋白质的磷酸化进行研究。本发明人在世界上率先克隆了将SR蛋白质磷酸化的酶SRPK2(Biochem.Biophys.Res.Commun.242,357-364)、线虫的SRPK同源分子SPKL1(Mech.Dev..99,51-64)、hPRP1(J.Biol.Chem.277,44220-44228)以及SR蛋白质磷酸化酶Clk4的控制因子CLASP(J.Biol.Chem.276,32247-32256)。
SR蛋白质是富含丝氨酸和精氨酸的RNA结合蛋白质,通常同时具有1或2处RNA识别基元(RNA-recognition motifs;RRM)和RS的连续序列所共通富含的RS(Arginine/Serine-rich)区域,在真核生物的RNA加工、特别是pre-mRNA的剪接中具有重要作用。
作为哺乳类的SR蛋白质家族,报道了X16/SRp20、SF2/ASF/SRp30a、SC35/PR264/SRp30b、SRp30c、9G8、HRS/SRp40、SRp46、SRp55、SRp75、p54的10种RNA结合蛋白。多数SR蛋白质在细胞内被磷酸化,特别是将SR蛋白质之一的SF2/ASF通过肽图谱分析,确定RS结构域内的多个部位被磷酸化(J.Cell.Biol.(1991)115:587-596)。另外,已知SF2/ASF与U1snRNP的选择结合能因磷酸化而提高(Genes & Dev.(1997)11:334-344)。Rs结构域的磷酸化与脱磷酸化是剪接体的形成和重组所必须的,如将其抑制,则导致mRNA的加工异常。如上所述,不仅在RNA结合蛋白中发现RS结构域,在各种被认为在核内发挥功能的功能蛋白质中也发现了RS结构域,它们被称作SR相关蛋白家族(SR-related protein family)(Biochem.Cell Biol.(1999)77:277-291)。
本发明人在感染了病毒的细胞中的SR家族蛋白质的磷酸化状态的研究中偶然发现,在感染了病毒的细胞中,SR蛋白质的磷酸化被抑制,并经泛素蛋白酶体途径分解。相反,在强制表达SRp40或SRp75等SR蛋白质、或SR蛋白质磷酸化酶SRPK1或SRPK2时,发现SR蛋白质被稳定化、病毒产生增加的现象。由此表明,SR蛋白质在病毒复制中具有重要的作用,SR蛋白质的脱磷酸化为对抗病毒侵入体内的 防御系统。
SR蛋白与U1snRNP、U2AF结合对剪接体的形成是必要的,但认为RS结构域在该蛋白相互作用中发挥着重要的作用。另外,SR蛋白影响剪接部位的选择,促进内含子近位的3′剪接部位的选择,相反hnRNP A1、A2、B1等核内部不一核糖核蛋白(hnRNP)促进远位的3′剪接部位的选择。因此,有通过细胞内的SR蛋白和hnRNP蛋白的量比确定剪接部位的可能性。
因此,本发明人开发并提供已知对病毒的复制具有重要作用的SR蛋白质为对象的抗病毒剂。
具体地,首先尝试了通过抑制SR蛋白质的磷酸化酶抑制SR蛋白质。
在至今抑制SRPK活性的低分子量化合物还是未知的情况下,进行了以SRPK为目标的低分子量化合物的筛选,结果发现下式表示的SRPIN-1(SR蛋白质磷酸化抑制剂1,SRprotein phosphorylationinhibitor1)(也表示为化合物编号340)具有抑制磷酸化酶SRPK的活性。
(IV)
因此,推测可通过用SRPIN-1抑制SRPK的酶活性来抑制SR蛋白质的磷酸化,从而抑制HIV病毒复制。在使用MT-4细胞和HIV病毒的感染实验中,研究改变SRPIN-1的浓度是否可抑制病毒复制时发现,SRPIN-1显著抑制HIV病毒复制。
进一步,本发明人合成多种SRPIN-1类似物,在研究其效果时发现,它们与SRPIN-1同样显示了SRPK抑制活性和抗病毒作用。因此,SRPIN-1及其类似物可用作SRPK抑制剂,进一步还可用作抗病毒剂。
即,本发明涉及含有控制SR蛋白质活性的SR活性控制剂作为有效成分的抗病毒剂、抗病毒剂的筛选方法以及具有SRPK抑制活性的化合物及其用途等,更具体地涉及各项权利要求中所述的发明。即,本发明涉及:
抗病毒剂,其含有控制SR蛋白质活性的SR活性控制剂作为有效成分,
上述[1]所述的抗病毒剂,其中SR蛋白质为SF2/ASF/SRp30a、SC35/PR264/SRp30b、SRp30c、HRS/SRp40、SRp46或SRp75的任意一种,
上述[1]或[2]所述的抗病毒剂,其中SR活性控制剂为促进SR蛋白质脱磷酸化的物质或组合物,
上述[3]所述的抗病毒剂,其是活化磷酸酶2A(phosphatase 2A)的活化剂,
上述[4]所述的抗病毒剂,其是载有HIV的tat基因、腺病毒的E4-ORF4基因或牛痘病毒的VH1基因的基因治疗用表达载体,
上述[1]或[2]所述的抗病毒剂,其中SR活性控制剂为抑制SRPK的物质,
上述[6]所述的抗病毒剂,其中SRPK为SRPK1或SRPK2,
上述[1]或[2]所述的抗病毒剂,其中,SR活性控制剂为SRPK基因的表达抑制剂,
上述[8]所述的抗病毒剂,其中SRPK基因的表达抑制剂为针对SRPK的miRNA、siRNA或吗林代低聚物(morpholino oligo)、或该miRNA或siRNA的表达载体,
上述[1]或[2]所述的抗病毒剂,其中,SR活性控制剂为具有与SR蛋白质活性相反活性的物质,
上述[10]所述的抗病毒剂,其中具有与SR蛋白质活性相反活性的物质为hnRNPA1表达载体,
上述[1]~[11]任意一项所述的抗病毒剂,其中,病毒为(1)人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸道综合症(SARS)、脊髓灰质炎病毒、人类鼻病毒、成人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、甲型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒、牛痘病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、人冠状病毒、Ebola出血热病毒、流感病毒、或辛德比斯病毒(Sindbis virus) 中的任意一种RNA病毒;或者(2)包括单纯疱疹病毒、人腺病毒的、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒、疱疹病毒、人疱疹病毒、天花病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒中的任意一种DNA型病毒,
抗病毒剂的筛选方法,其包括使试验化合物作用于SRPK的步骤、检测SRPK磷酸化SR蛋白质能力的步骤以及筛选抑制该能力的化合物,
上述[13]所述的筛选方法,其包括将SR蛋白质,或者2个或2个以上的Arg-Ser(RS)或Ser-Arg(SR)的肽作为SRPK的基质,检测磷酸化SR蛋白质的能力的步骤,
抗病毒剂的制备方法,其包括将由上述[13]或[14]的方法得到的化合物制剂化的步骤,
下述通式(I)表示的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物,
(I)
(式中,R1表示氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基、可以具有取代基的C2-6烯基、可以具有取代基的C2-6炔基、可以具有取代基的C6-10芳基、卤原子、硝基、氰基、叠氮基、羟基、可以具有取代基的C1-6烷氧基、可以具有取代基的C1-6烷硫基、可以具有取代基的C1-6烷基磺酰基、羧基、甲酰基、可以具有取代基的C1-6烷氧基羰基、酰基、酰基氨基、或氨磺酰基;
R2表示氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基或可以具有取代基的芳基;
R3表示可以具有取代基的C1-6烷基、可以具有取代基的C2-6烯基、可以具有取代基的C6-10芳基、可以具有取代基的含氮杂环或可以具有取代基的稠合芳杂环;
R4表示氢原子或卤原子;
Q表示-C(O)-、-C(S)-、-SO2-、-C(S)NHC(O)-、-C(O)NHC(O)-或-C(O)NHC(S)-;
W表示氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基、可以具有取代基的C6-10芳基、卤原子、羟基、可以具有取代基的C1-6烷氧基、可以具有取代基的C1-6烷硫基、可以具有取代基的含氮杂环、可以具有取代基的稠合芳杂环或下述通式(II)
(II)
(式中,R5和R6相同或不同,表示氢原子、可以具有取代基的C1-6 烷基、可以具有取代基的含氮杂环、可以具有取代基的稠合芳杂环、酰基或酰基氨基;而且
上述R5和R6可以与相邻的氮原子连接形成可以具有取代基的杂环,该杂环也可以是可以具有取代基的稠合芳杂环;
上述R5和R6也可以是可以具有取代基的环亚烷基氨基或可以具有取代基的芳环稠合环亚烷基),
上述[16]所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物,其中,上述R1为氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基或卤原子,
上述[16]或[17]所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物,其中,上述R2为氢原子或C1-6烷基,
上述[16]~[18]任意一项所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物,其中,上述R3为可以具有取代基的C6-10芳基或可以具有取代基的5~10元含氮杂芳基,
上述[16]~[19]任意一项所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物,其中,上述R4为氢原子,
上述[16]~[20]任意一项所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物,其中,上述W为氢原子、卤原子或由下述通式(II)表示,
(II)
(式中,R5和R6相同或不同,表示可以具有取代基的C1-6烷基;而且上述R5和R6可以与相邻的氮原子连接,形成可以具有取代基的杂环基,该杂环基也可以是可以具有取代基的稠合芳杂环基),
SRPK抑制剂,其含有上述[16]~[21]任意一项所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物作为有效成分,
抗病毒剂,其含有上述[16]~[21]任何一项所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物作为有效成分。引用同一权利要求的权利要求所述的发明的一个或多个的组合构成的发明已经包括在这些权利要求项所述的发现中。
以下,说明本说明书中记载的术语、符号等的意义,详细说明本发明。
本说明书中“C1-6烷基”是指从碳原子数为1~6的脂肪烃中除去任何一个氢原子而衍生的一价基团,表示碳原子数为1~6的直链或支链烷基,具体地可列举甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、1-丁基、2-丁基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2-甲基-3-戊基、3-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2,2-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、2,3-二甲基-2-丁基等。
本说明书中的“C2-6烯基”是指碳原子数为2~6的直链或支链烯基,具体地可列举例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、戊烯基、己烯基等。
本说明书中的“C2-6炔基”是指碳原子数为2~6的直链或支链炔基,具体地可列举例如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。
本说明书中的“C1-6烷氧基”是指结合于上述定义的“C1-6烷基”的氧基,具体地可列举例如甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、2- 甲基-1-丙氧基、2-甲基-2-丙氧基、1-丁氧基、2-丁氧基、1-戊氧基、2-戊氧基、3-戊氧基、2-甲基-1-丁氧基、3-甲基-1-丁氧基、2-甲基-2-丁氧基、3-甲基-2-丁氧基、2,2-二甲基-1-丙氧基、1-己氧基、2-己氧基、3-己氧基、2-甲基-1-戊氧基、3-甲基-1-戊氧基、4-甲基-1-戊氧基、2-甲基-2-戊氧基、3-甲基-2-戊氧基、4-甲基-2-戊氧基、2-甲基-3-戊氧基、3-甲基-3-戊氧基、2,3-二甲基-1-丁氧基、3,3-二甲基-1-丁氧基、2,2-二甲基-1-丁氧基、2-乙基-1-丁氧基、3,3-二甲基-2-丁氧基、2,3-二甲基-2-丁氧基等。
本说明书中的“C1-6烷硫基”是指结合于上述定义的“C1-6烷基”的硫基,具体地可列举例如甲硫基、乙硫基、1-丙硫基、2-丙硫基、丁硫基、戊硫基等。
本说明书中的“C1-6烷氧基羰基”是指结合于上述定义的“C1-6烷氧基”的羰基,具体地可列举例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、1-丙氧基羰基、2-丙氧基羰基等。
本说明书中的“C1-6烷基磺酰基”是指结合于上述定义的“C1-6烷基”的磺酰基,具体地可列举例如甲磺酰基、乙磺酰基、1-丙磺酰基、2-丙磺酰基等。
本说明书中的“卤原子”是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
本说明书中的“C6-10芳基”是指碳原子数为6~10的芳香族环烃基,具体地可列举例如苯基、1-萘基、2-萘基等。
本说明书中的“杂环”是指构成环的原子中含有1~2个杂原子的、环中也可以含有双键的非芳香性环或芳香性环。
本说明书中的“含氮杂环”是指构成环的原子中含有1~2个氮原子的、环中也可以含有双键的非芳香性环或芳香性环。
本说明书中的“杂原子”是指硫原子、氧原子或氮原子。
本说明书中的“510元含氮芳杂环”是指构成环的原子数为5~10,构成环的原子中至少含有1个氮原子、另外还含有1或多个氮原子以外的杂原子的芳香性环。
具体地可列举例如吡啶环、吡咯环、唑环、异唑环、噻唑环、异噻唑环、吲哚环、异吲哚环、咪唑环、三唑环、吡唑环、哒嗪环、嘧啶环、吡嗪环、喹啉环、异喹啉环、苯并咪唑环等。
该“5~10元芳杂环”中可优选列举吡啶环、吡咯环、咪唑环,更 优选列举吡啶环。
本说明书中的“5~10元含氮芳杂环”是指除去1或2个“5~10元芳杂环”任意位的氢原子而衍生的一价或二价基团。具体地可列举例如吡啶基、吡咯基、唑基、异唑基、噻唑基、异噻唑基、吲哚基、异吲哚基、咪唑基、三唑基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基等。
本说明书中的“4~8元杂环”是指:
1.构成环的原子数位4~8,
2.构成环的原子中含有1~2个杂原子,
3.环中也可以含有1~2个双键,
4.环中也可以含有1~3个羰基,
5.单环式的非芳香性环。
作为4~8元杂环,优选含有氮原子作为杂原子的4~8元含氮杂环。
作为4~8元杂环,具体地可列举例如氮杂环丁烷环、吡咯烷环、哌啶环、azepane环、azocine环、四氢吡喃环、吗啉环、硫代吗啉环、哌嗪环、噻唑烷环、二烷环、咪唑啉环、噻唑啉环等。在该“4~8元杂环”中,优选吡咯烷环、哌啶环、吗啉环、哌嗪环。
本说明书中的“4~8元杂环基”是指从上述“4~8元杂环”除去1或2个任意位的氢原子而衍生的一价或二价基团。作为该4~8元杂环基,具体地可列举例如氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、azepanyl基、azocanyl基、四氢吡喃基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、噻唑烷基、二烷基、咪唑啉基、噻唑啉基等。
本说明书中的“稠合芳杂环”是指该杂环部分与苯环等芳香环邻位稠合的环状结构,杂环部分为上述定义的杂环。
本说明书中的“稠合芳杂环基”是指该杂环与苯环等芳香环邻位稠合的环状结构,杂环部分为上述定义的杂环基。
可列举例如吲哚基、异吲哚基、1,2,3,4-四氢喹啉等。
本说明书中的“卤代C1-6烷基”是指将上述定义的“C1-6烷基”中的任意的至少一个氢原子用上述定义的“卤原子”取代而得到的基团。可列举例如三氟甲基、二氟甲基、单氟甲基等。
本说明书中的“任选被取代”是指在可取代的位置上可以任意组合具有1或多个取代基。该取代基具体可列举例如选自下述取代基A 的基团。
[取代基A]
卤原子、羟基、巯基、硝基、氰基、甲酰基、羧基、三氟甲基、三氟甲氧基、氨基、氧基、亚氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基
本说明书中的“盐”只要与本发明的化合物形成盐,且为可药用的即没有特别限制,例如可列举无机酸盐、有机酸盐、无机碱盐、有机碱盐、酸性或碱性氨基酸盐等。
作为无机酸盐的优选例子,可列举例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等,作为有机酸盐的优选例子,可列举例如乙酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、硬脂酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等。
作为无机碱盐的优选例子,可列举例如钠盐、钾盐等碱金属盐;钙盐、镁盐等碱土金属盐;铝盐、铵盐等,作为有机碱盐的优选例子,可列举例如二乙胺盐、二乙醇胺盐、葡甲胺(meglumine)盐、N,N′-二苄基乙二胺盐等。
作为酸性氨基酸盐的优选例子,可列举例如天冬氨酸盐、谷氨酸盐等,作为碱性氨基酸的优选例子,可列举例如精氨酸盐、赖氨酸盐、鸟氨酸盐等。
另外,将本发明的化合物置于大气中,会吸收水分,有时会附着有吸附水或形成水合物,本发明也包括这样的水合物。
进一步,本发明的化合物有时会吸收其它种的溶剂,成为溶剂合物,本发明也包括这样的盐。
另外,本发明中的“基因”是指有义或反义地编码转录单元的DNA或RNA。转录单元是指连续转录的序列。编码某种蛋白质的核酸(DNA或RNA)在本发明中称为该蛋白质的基因。
另外,在本说明书中,“或”这一用语是非排他性的。例如“A、B或C”不仅指至少含有A、B或C中的任何一个要素,还包括含有A、B和C中的2个或3个的情况,且含有其它要素的情况也包括在内。
另外,本说明书中表1至表3所示的化合物有时用编号表示。这些化合物有时引用化合物编号记做“GIF-”。
发明效果
本发明明确了SRPIN-1(SR蛋白质磷酸化抑制剂1)及其类似物具有抑制磷酸化酶SRPK的活性。SR蛋白质通过SRPK被磷酸化,由此在细胞中稳定存在,但如用SRPIN-1及其类似物抑制SRPK的酶活性,则SR蛋白质的磷酸化受到抑制,经泛素蛋白酶体途径分解。于是,在HIV感染实验中尝试添加SRPIN-1及其类似物抑制SRPK,发现这些化合物抑制病毒复制,具有抗病毒作用。
进一步,本发明具有下述效果,即提供通过抑制SR蛋白质活性,通过同一机理对广泛的病毒有效的抗病毒剂。
附图说明
[图1A]“HIV感染细胞的SR蛋白质的磷酸化”用抗磷酸化SR蛋白质小鼠单克隆抗体(Mab104)、抗SC35小鼠抗体以及抗SF2小鼠抗体通过蛋白印记分析研究导入了HIVpNL4-3基因组的Flp-In-293细胞中的磷酸化SR蛋白质。
[图1B]“SR蛋白质的分解”向Flp-In-293细胞中导入融合了HA标记的SRp75、SRp55、SRp40基因的质粒,加入终浓度(10μM)的MG132(474790;由CALBIOCHEM购入)。将细胞溶解,进行热变性,作为蛋白质样品,进行SDS-PAGE,将兔抗HA抗体作为第一抗体、驴抗兔IgG抗体作为第二抗体进行蛋白印记分析。
[图2A]“SRPK2稳定表达细胞中SR蛋白质的磷酸化”向在Flp-In-293细胞中导入小鼠SRPK2基因的SRPK2稳定表达细胞(SRPK2-2)和亲代Flp-In-293(mock)的2种细胞中导入pNL4-3基因,4天后通过与图1A同样的蛋白印迹分析研究HIV感染相关的内在性SR蛋白质的动态。
[图2B]“SRPK2稳定表达细胞中SR蛋白质的存在”与图2A同样,向mock和SRPK2-2中导入HIVpNL4-3基因组、融合了HA标记的SRp75、SRp55、SRp40基因的质粒,36小时后回收样品,进行蛋白印迹分析。
[图2C]“HIV产生量的测定”回收上述图2A的情况下的培养上清,测定HIV产生量。
[图3A]“参与体内HIV产生的SR蛋白质的研究”将mock质粒、 SC35、SF2、SRp40、SRp55、SRp75表达质粒分别导入Flp-In293细胞,36小时后回收培养上清,用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量。
[图3B]“hnRNPA1对体内HIV产生的效果的研究”加入一定量——500ng)的SRp40、SRp75表达质粒,梯度增加hnRNPA1表达质粒的量,导入Flp-In293细胞,36小时后回收培养上清,用lumipulseELISA系统测定HIVp24的量。
[图4A]“用于抑制细胞内SR蛋白质磷酸化的SRPK抑制剂的探索”SRPIN-1“SRPK Inhibitor-1”的结构式
图4B]“使用SRPIN-1的SRPK1的磷酸化活性抑制的研究”用10mM Tris-HCl(pH7.5)溶解相当于SF2的RS结构域的RS肽,使成为1mg/ml。用1μg SRPK1蛋白质,在反应缓冲液(250μM MgCl2、0.25mM ATP、1mCi[γ-32P]ATP、SRPIN-1终浓度0.1、0.3、1.0、3.0、10.0μM)中在30℃的水浴中温育10分钟,将反应液滴至P81磷酸纤维素薄膜(P81;Whatman),用5%磷酸溶液洗涤。洗涤后,通过液体闪烁计数器测定P81薄膜的32P的放射活性。
[图4C]“对使用SRPIN-1的体内SR蛋白质磷酸化的抑制、以及相伴的SR蛋白质分解诱导的研究”向Flp-In293细胞中导入HA-SRp75质粒,36小时后分别添加MG132(终浓度10μM)、SRPIN-1(10、20、50μM)培养15小时。然后,溶解细胞,进行SDS-PAGE,用抗HA抗体进行蛋白印迹分析。另外使用抗β-肌动蛋白抗体作为蛋白质量的对照进行蛋白印迹分析。
[图4D]“SRPIN-1的添加对HIV感染的抑制的研究”向MT-4细胞中添加用293T细胞制备的HIV病毒颗粒,同时,添加SRPIN-1(终浓度0.5、10、20μM)。在2小时、37℃、5%CO2的培养条件下培养后,离心细胞,更换新的培养液后,48小时后回收培养上清,用lumipulseELISA系统测定HIVp24的量。
[图5A]“使用SRPIN-1及其类似物的SRPK的抑制活性的研究”定量了SRPIN-1(化合物编号340)及其类似物(化合物编号341~349、608~626)对SRPK1和SRPK2的磷酸化活性的抑制效果。
[图5B]“SRPIN-1及其类似物对HIV复制的抑制效果”显示了用MT-4细胞分析SRPIN-1及其类似物对HIV复制的抑制效果的结 果。
[图5C]“SRPIN-1及其类似物对HIV复制的抑制效果”显示了用Jurkat细胞与图5B同样测定了SRPIN-1及其类似物对HIV复制的抑制效果的结果。
[图6A]“SRPIN-1对辛德比斯病毒的抗病毒作用”显示了感染辛德比斯病毒的细胞的位相差显微图像。在未施用SRPIN-1的细胞明显看到因辛德比斯病毒增殖而导致的细胞损伤,但通过施用SRPIN-1抑制了细胞损伤。
[图6B]“SRPIN-1对辛德比斯病毒的抗病毒作用”显示了感染辛德比斯病毒的细胞的空斑试验结果。5μM以上的SRPIN-1显著且浓度依赖性地抑制辛德比斯病毒的增殖。
[图7]“SRPIN-1及其类似物对巨细胞病毒的抗病毒作用”显示了感染巨细胞病毒的细胞的位相差显微图像。对照组的HFL1细胞(图中的1和2)观察到巨细胞病毒感染特有的形态变化和细胞死亡,与此相对,添加了(20μl)SRPIN-1及其类似物(化合物编号349)的细胞(图中的3和5)抑制了巨细胞病毒感染引起的异常形态变化或细胞死亡。
[图8]“SRPIN-1及其类似物对SARS病毒的抗病毒作用”显示了感染SARS病毒的细胞的空斑试验结果。数出SARS病毒感染导致的细胞死亡的空斑数,研究SRPIN-1及其类似物的抗病毒作用(空斑试验)。结果,如图8A所示,40μM的SRPIN-1及其类似物(化合物编号349)显著抑制了SARS病毒的增殖。另外,如图8B所示,SRPIN-1在1μM到40μM的浓度范围浓度依赖性地抑制SARS病毒的增殖。
具体实施方式
通过抑制SR蛋白质磷酸化的SRPK酶可抑制HIV的复制,由此本发明人对是否可广泛应用该现象提供相对于广泛的病毒的抗病毒剂进行了研究。
I.SR蛋白质活性的降低:分解和稳定化
(1)本发明人研究了细胞的HIV病毒感染与SR蛋白质的磷酸化状态以及细胞中是否存在SR蛋白质的关系。具体而言,使NL4-3型HIV病毒感染293细胞后,利用SR蛋白质的抗体和磷酸化的SR蛋白质的 抗体研究了细胞中的磷酸化蛋白质和细胞中的SR蛋白质(总量)。
另外,研究了强制表达了磷酸化SR蛋白质的SRPK的细胞的HIV病毒感染与同细胞内SR蛋白质的磷酸化状态和细胞中是否存在SR蛋白质的关系。具体而言,同上,NL4-3型HIV病毒感染强制表达SRPK-2的293细胞后,利用SR蛋白质的抗体和磷酸化SR蛋白质的抗体研究同细胞中的磷酸化蛋白质和细胞中SR蛋白质(总量)。
由上述结果可知,SR蛋白质由于被磷酸化而在细胞中稳定化,相反,通过将SR蛋白质脱磷酸化,可使SR蛋白质分解。
为了验证,本发明人使SR-HA融合蛋白质在293细胞内表达,通过作为泛素、蛋白酶体抑制剂的MG132的添加与否,测定与抗HA-抗体反应的融合SR-HA的信号强度,发现蛋白质分解被MG132抑制,因此,可知SR蛋白质经泛素、蛋白酶体途径分解。
即推测对应于病毒感染,宿主作为防御机构进行SR蛋白质的分解。但是,在SR蛋白质的磷酸化酶强制表达的状态下,SR蛋白质由于被磷酸化而不分解,被稳定化,破坏了防御机构,促进了病毒的产生。
即,可知SR蛋白质由于被脱磷酸化而经泛素、蛋白酶体途径分解。SR蛋白质对基因转录是不可缺少的,因此通过将SR蛋白质脱磷酸化,可抑制病毒增殖。
(2)下面研究SR蛋白质磷酸化酶的抑制。作为磷酸化SR蛋白质的磷酸化酶,可考虑SRPK1/2、Clk/Sty家族激酶、PRP4、DNA拓扑异构酶I等,对各自在剪接中的功能差异还有很多不明了之处。因此,本发明人通过使用作为SRPK抑制剂的SRPIN-1研究了抑制SRPK导致的病毒感染细胞的病毒产生状态。
于是,发现利用SRPIN-1抑制SRPK引起积极的SR蛋白质分解。
(3)进一步,感染HIV的同时,使促进剪接的SR蛋白质和已知在体外具有拮抗剪接作用的hnRNPA1在细胞中强制表达,首次发现SRp40和SRp75在体内进一步使HIV产生亢进,并且hnRNPA1的量依赖性地抑制HIV产生。
由以上可知,SR蛋白质的脱磷酸化是生物体(人体)对病毒的防御反应,已经证实腺病毒和牛痘病毒感染动物细胞后,该动物细胞内的SR蛋白质发生脱磷酸化(Nature Vol.393pp.185-187,EMBO Rep Vol.3 pp.1088-1093),如上所述,如SR蛋白质脱磷酸化则会迅速分解,从而不能用于病毒基因的表达,结果这些病毒也不能增殖。
本发明人还发现,对于与HIV不同的病毒的辛德比斯病毒、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)以及SARS冠状病毒,也与HIV同样,通过SRPK抑制剂抑制SR蛋白质的活性可抑制病毒增殖。因此,可以说利用控制SR蛋白质的活性的抗病毒作用对广泛的病毒有效。
II.本申请发明包括通过抑制SR蛋白质的活性的抗病毒剂、病毒产生抑制方法以及病毒病治疗方法。本发明包括含有SR蛋白质活性控制剂作为有效成分的抗病毒剂。在此,SR蛋白质活性控制包括表达控制和稳定化控制。例如,通过抑制SR蛋白质的转录或翻译,或者降低编码SR蛋白质的mRNA的稳定性或SR蛋白质的稳定性,来降低SR蛋白质活性。在本发明的SR蛋白质活性控制中,优选使用直接或间接降低SR蛋白质活性或表达量的SR蛋白质活性抑制剂。为了降低SR蛋白质活性或表达量,除了将SR蛋白质作为直接目标以外,优选例如通过SRPK抑制SR蛋白质的磷酸化和/或促进脱磷酸化。例如,通过活化蛋白质磷酸酶2A(也记作磷酸酶2A)促进SR蛋白质的脱磷酸化。因此,可用提高蛋白质磷酸酶2A的表达和/或活性的化合物抑制病毒的增殖。另外,通过抑制SRPK的表达和/或活性可抑制SR蛋白质的磷酸化。因此,SRPK抑制剂是本发明优选的抗病毒剂。
[控制对象SR蛋白质]
在本申请发明中要降低或抑制其活性的SR蛋白质包括任意的SR蛋白质,即X16/SRp20、SF2/ASF/SRp30a、SC35/PR264/SRp30b、SRp30c、9G8、HRS/SRp40、SRp46、SRp55、SRp75和p54,优选SF2/ASF/SRp30a、SC35/PR264/SRp30b、SRp30c、HRS/SRp40、SRp46和SRp75,特别优选SRp40和SRp75。以下在提到SR蛋白质时,是指SF2/ASF/SRp30a、SC35/PR264/SRp30b、SRp30c、HRS/SRp40、SRp46或SRp75。
编码X16/SRp20的基因序列示于例如登录号L10838的1-492中。另外,X16/SRp20的氨基酸序列示于登录号NP_003008、AAA36648(Zahler,A.等人,1992,SR proteins:a conserved family ofpre-mRNA splicing factors,Genes Dev.6:837-847)。编码SF2/ASF/SRp30a的基因序列示于例如登录号NM_006924的91-834 中。另外,SF2/ASF/SRp30a的氨基酸序列示于登录号NP_008855、Q07955(Ge,H.等人,Cell 66,373-382(1991))。编码SC35/PR264/SRp30b的基因序列示于例如登录号M90104的156-818中。另外,SC35/PR264/SRp30b的氨基酸序列示于登录号AAA60306、Q01130(Fu,X.D.and Maniatis,T.Science 256,535-538(1992))。编码SRp30c的基因序列示于例如登录号U30825的53-715、NM_003769的147-809中。另外,SRp30c的氨基酸序列示于登录号AAA93069、Q13242、NP_003760(Screaton,G.R.等人,EMBO J.14,4336-4349(1995))。编码9G8的基因序列示于例如登录号NM_006276的54-464中。另外,9G8的氨基酸序列示于登录号NP_006267、Q16629等中(Lejeune,F.等人,J.Biol.Chem.276,7850-7858(2001);Popielarz,M.等人,J.Biol.Chem.270,17830-17835(1995);Cavaloc,Y.等人,EMBOJ.13,2639-2649(1994))。编码HRS/SRp40的基因序列示于例如登录号AF020307中(join(2406-2531,2864-2925,3049-3147,3433-3503,4740-4812,5269-5382,5472-5492)),氨基酸序列示于登录号AAC39543、Q13243等(Du,K.And Taub,R.,Gene 204(1-2),243-249(1997);Screaton,G.R.等人,EMBO J.14,4336-4349(1995))。编码SRp46的基因序列示于例如登录号AF031166的1-816中。另外,SRp46的氨基酸序列示于登录号AAK54351等(Soret,J.等人,Mol.Cell.Biol.18,4924-4934(1998))。编码SRp55的基因序列示于例如登录号U30883的106-1137中。另外,SRp55的氨基酸序列示于登录号AAA93073、Q13247等(Screaton,G.R.等人,EMBO J.14,4336-4349(1995);Zahler,A.M.等人,Gene Dev.6,837-847(1992);Barnard,D.C.andPatton,J.G.,Mol.Cell.Biol.20,3049-3057(2000))。编码SRp75的基因序列示于例如登录号BC002781的98-1579、NM_005626的98-1579中。另外,SRp75的氨基酸序列示于登录号AAH02781、NP-005617、Q08170等(Zahler,A.M.等人,Mol.Cell.Biol.13,4023-4028(1993))。编码p54的基因序列示于例如登录号M74002的84-1535中。另外,p54的氨基酸序列示于登录号AAA35554、Q05519等(Chaudhary,N.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88,8189-8193(1991))。
[对象病毒]
本发明的抗病毒剂特别适合于抑制HIV的增殖,但不限于人免疫 缺陷病毒(HIV),对包括属于RNA病毒的严重急性呼吸道综合症(SARS)、脊髓灰质炎病毒、人类鼻病毒、成人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、甲型、丙型、丁型或戊型等乙型以外的肝炎病毒、牛痘病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、人冠状病毒、Ebola出血热病毒、流感病毒、辛德比斯病毒也由同样的效果。要说明的是,人冠状病毒包括SARS冠状病毒(SARS-associated coronavirus或SARS病毒)。
另外也报道了感染了作为DNA病毒的单纯疱疹病毒、人腺病毒的宿主的防御机构的SR蛋白质的脱磷酸化,因此,SRPIN-1的效果对包括单纯疱疹病毒、人腺病毒,对乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒、疱疹病毒、人疱疹病毒、天花病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒也具有同样的活性。
在本发明中,作为特别优选的目标病毒,可列举逆转录病毒科病毒(Retroviridae;包括慢病毒属病毒)、披膜病毒科病毒(披盖病毒;包括甲病毒属病毒)、疱疹科病毒(Herpesviridae;包括巨细胞病毒属病毒)、冠状病毒科病毒(Coronaviridae,包括冠状病毒属病毒)。
[抗病毒剂]
本发明包括(1)降低或抑制SR蛋白质的活性的抗病毒剂、更具体地包括(i)促进SR蛋白质脱磷酸化的抗病毒剂、以及(ii)抗病毒剂,其抑制磷酸化SR蛋白质的蛋白质。
进一步,本发明包括(2)抑制SR蛋白质的表达的抗病毒剂、以及(3)活化具有与SR蛋白质相反功能的蛋白质的抗病毒剂。
特别是,本发明涉及包括抑制SRPK的活性和/或表达的化合物的抗病毒剂。通过抑制SRPK的活性和/或表达,抑制有利于SR蛋白质稳定化的磷酸化,结果促进SR蛋白质分解,降低了SR蛋白质的活性。因此,SRPK(SRPK1和/或SRPK2)是本发明的特别优选的抑制目标。
[病毒产生抑制方法]
另外,本发明中包括(1)降低或抑制SR蛋白质的活性的病毒产生抑制方法、更具体地包括(i)促进SR蛋白质的脱磷酸化的病毒产生抑制方法、以及(ii)抑制磷酸化SR蛋白质的蛋白质的病毒产生抑制方法。特别是,本发明涉及包括抑制SRPK的活性和/或表达步骤的病毒产生抑制方法。通过抑制SRPK,抑制了SR蛋白质的磷酸化,SR蛋白质水平降低,SR蛋白质的活性降低。
进一步,本发明包括(2)抑制SR蛋白质的表达的病毒产生抑制方法、以及(3)活化具有与SR蛋白质相反功能的蛋白质的病毒产生抑制方法。
即,本发明包括下述发明:
[M1]抑制病毒增殖的方法,其包括降低SR蛋白质的活性或表达量的步骤,
[M2][M1]所述的方法,其中,SR蛋白质为SF2/ASF/SRp30a、SC35/PR264/SRp30b、SRp30c、HRS/SRp40、SRp46或SRp75,
[M3][M1]或[M2]所述的方法,其中,降低SR蛋白质的活性或表达量的步骤为抑制SR蛋白质的磷酸化或促进脱磷酸化的步骤,
[M4][M3]所述的方法,其中,抑制SR蛋白质的磷酸化或促进脱磷酸化的步骤为提高蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A)活性的步骤,
[M5][M4]所述的方法,其中,提高蛋白磷酸酶2A活性的步骤为将选自HIV的tat基因、腺病毒的E4-ORF4基因以及牛痘病毒的VH1基因中的1种或以上基因导入表达载体的步骤。
[M6][M3]所述的方法,其中,抑制SR蛋白质的磷酸化或促进脱磷酸化的步骤为抑制SRPK的表达或活性的步骤。
[M7][M6]所述的方法,其中,SRPK为SRPK1或SRPK2。
[M8][M6]或[M7]所述的方法,其中,抑制SRPK的表达或活性的步骤为施用下述通式表示的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水和物的步骤,
(I)
上式中的R1、R2、R3、R4、Q和W与本说明书上述[16]相同。
[M9][M8]所述的方法,其中,上述R1为氢原子、可以具有取代基 的C1-6烷基或卤原子。
[M10][M8]或[M9]所述的方法,其中,上述R2为氢原子或C1-6烷基。
[M11][M8]~[M11]任意一项所述的方法,其中,上述R3为可以具有取代基的C6-10芳基或可以具有取代基的5~10元含氮杂芳基。
[M12][M8]~[M11]任意一项所述的方法,其中,上述R4为氢原子。
[M13][M8]~[M12]任意一项所述的方法,其中,上述W为氢原子、卤原子或下述通式(II)
(II)
(式中,R5和R6同上)。
[M14][M8]所述的方法,其中,[M8]所述的苯胺衍生物选自本说明书所述的化合物编号为340、348、613、616、618、622、624。
[M15][M6]所述的方法,其中,抑制SRPK的表达或活性的步骤是导入SRPK的miRNA或siRNA或吗林代低聚物、或该miRNA或siRNA的表达载体的步骤,
[M16][M1]或[M2]所述的方法,其中,降低SR蛋白质的活性或表达量的步骤为施用具有与SR蛋白质相反活性的物质的步骤。
[M17][M16]所述的方法,其中,具有与SR蛋白质相反活性的物质为hnRNP A1表达载体,
[M18][M1]或[M17]的任意一项所述的方法,其中,病毒为(1)人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸道综合症(SARS)、脊髓灰质炎病毒、人类鼻病毒、成人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、甲型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒、牛痘病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、人冠状病毒、Ebola出血热病毒、流感病毒、或辛德比斯病毒中的任意一种RNA病毒、或者(2)单纯疱疹病毒、人腺病毒、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒、疱疹病毒、人疱疹病毒、天花病毒、多瘤病毒、或人乳头瘤病毒中的任意一种DNA型病毒。
[M19]抑制SRPK的方法,其中包括施用[M8]所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水和物的步骤,
[M20][M19]所述的方法,其中,SRPK为SRPK1或SRPK2。
[M21][M19]或[M20]所述的方法,其中,上述R1为氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基或卤原子。
[M22][M19]~[M21]任意一项所述的方法,其中,上述R2为氢原子或C1-6烷基。
[M23][M19]~[M22]任意一项所述的方法,其中,上述R3为可以具有取代基的C6-10芳基或可以具有取代基的5~10元含氮杂芳基。
[M24][M19]~[M23]任意一项所述的方法,其中,上述R4为氢原子。
[M25][M19]~[M24]任意一项所述的方法,其中,上述W为氢原子、卤原子或下述通式(II)表示的结构,
(II)
(式中,R5和R6同上)。
[M26][M19]所述的方法,其中,[M8]所述的苯胺衍生物选自本说明书所述的化合物编号为340、348、613、616、618、622、624的化合物、其可药用的盐或它们的水和物。
另外,本发明还涉及降低SR蛋白质表达和/或活性的化合物在抑制病毒增殖中的用途,以及在制备抗病毒剂(用于抑制病毒增殖的试剂和/或药物)中的用途,具体而言,本发明涉及以下发明:
[U1]降低SR蛋白质的活性或表达量的化合物在抑制病毒增殖的用途、或在制备抗病毒剂中的用途。
[U2][U1]所述的用途,其中,SR蛋白质为SF2/ASF/SRp30a、SC/35/PR264/SRp30b、SRp30c、HRS/SRp40、SRp46或SRp75,
[U3][U1]或[U2]所述的用途,其中,降低SR蛋白质的活性或表达量的化合物为抑制SR蛋白质磷酸化或促进SR蛋白质脱磷酸化的化合物,
[U4][U3]所述的用途,其中,抑制SR蛋白质磷酸化或促进SR蛋 白质脱磷酸化的化合物为提高蛋白磷酸酶2A活性的化合物,
[U5][U4]所述的用途,其中,提高蛋白磷酸酶2A活性的化合物为选自表达HIV的tat基因、腺病毒的E4-ORF4基因以及牛痘病毒的VH1基因中的1种或以上的基因的载体。
[U6][U3]所述的用途,其中,抑制SR蛋白质磷酸化或促进SR蛋白质脱磷酸化的化合物为抑制SRPK表达或活性的化合物。
[U7][U6]所述的用途,其中,SRPK为SRPK1或SRPK2。
[U8][U6]所述的用途,其中,抑制SRPK表达或活性的化合物是下述通式表示的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水和物,
(I)
上式中的R1、R2、R3、R4、Q和W与本说明书上述[16]相同。
[U9][U8]所述的用途,其中,上述R1为氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基或卤原子。
[U10][U8]或[U9]所述的用途,其中,上述R2为氢原子或C1-6烷基。
[U11][U8]~[U10]任意一项所述的方法,其中,上述R3为可以具有取代基的C6-10芳基或可以具有取代基的5~10元含氮杂芳基。
[U12][U8]~[U11]任意一项所述的用途,其中,上述R4为氢原子。
[U13][U8]~[U12]任意一项所述的用途,其中,上述W为氢原子、卤原子或用下述通式(II)表示,
(II)
(式中,R5和R6同上)。
[U14][U8]所述的用途,其中,[U8]所述的苯胺衍生物选自本说明书所述化合物编号340、348、613、616、618、622、624的化合物。
[U15][U6]所述的用途,其中,抑制SRPK表达或活性的化合物为针对SRPK的miRNA或siRNA或吗林代低聚物、或该miRNA或siRNA的表达载体,
[U16][U1]或[U2]所述的用途,其中,降低SR蛋白质的活性或表达量的步骤为施用具有与SR蛋白质相反活性的物质的步骤。
[U17][U16]所述的用途,其中,具有与SR蛋白质相反活性的物质为hnRNP A1表达载体。
[U18][U1]1~[U17]的任意一项所述的用途,其中,病毒为(1)人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸道综合症(SARS)、脊髓灰质炎病毒、人类鼻病毒、成人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、甲型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒、牛痘病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、人冠状病毒、Ebola出血热病毒、流感病毒、或辛德比斯病毒中的任意一种RNA病毒、或者(2)单纯疱疹病毒、人腺病毒、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒、疱疹病毒、人疱疹病毒、天花病毒、多瘤病毒、或人乳头瘤病毒中的任意一种DNA型病毒。
[U19][U8]所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水和物在抑制SRPK中的用途、或在制备SRPK抑制剂中的用途,
[U20][U19]所述的用途,其中,SRPK为SRPK1或SRPK2。
[U21][U19]或[U20]所述的用途,其中,上述R1为氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基或卤原子。
[U22][U19]~[U21]任意一项所述的用途,其中,上述R2为氢原子或C1-6烷基。
[U23][U19]~[U22]任意一项所述的用途,其中,上述R3为可以具有取代基的C6-10芳基或可以具有取代基的5~10元含氮杂芳基。
[U24][U19]~[U23]任意一项所述的用途,其中,上述R4为氢原子。
[U25][U19]~[U24]任意一项所述的用途,其中,上述W为氢原子、卤原子或下述通式(II)表示的结构,
(II)
(式中,R5和R6同上)。
[U26][U19]所述的用途,其中,[U8]所述的苯胺衍生物为选自本说明书所述的化合物编号为340、348、613、616、618、622、624的化合物、其可药用的盐或它们的水和物。
[治疗方法]
本发明包括(1)降低或抑制SR蛋白质活性的病毒病的治疗或预防方法、更具体地包括(i)通过使SR蛋白质脱磷酸化治疗或预防病毒病的方法、以及(ii)通过抑制使SR蛋白质磷酸化的蛋白质的治疗或预防病毒病方法。特别是,本发明涉及包括抑制SRPK的活性和/或表达步骤的病毒病的治疗或预防方法。通过抑制SRPK,抑制了SR蛋白质的磷酸化,SR蛋白质水平降低,从而抑制病毒增殖。
进一步,本发明包括(2)抑制SR蛋白质的表达的病毒治疗或预防方法、以及(3)活化具有与SR蛋白质相反功能的蛋白质的病毒治疗或预防方法。
III.本申请还包括抗病毒剂的筛选方法以及SRPK酶抑制剂的利用。
[抗病毒剂的筛选方法]
本申请还包括(1)SR蛋白质或2个或2个以上的RS或SR的肽作为SRPK的基质的SRPK酶抑制剂的筛选方法。
[SRPK酶抑制剂及其利用]
本发明还包括(1)含有SRPIN-1或其类似物作为有效成分的SRPK酶抑制剂、(2)含有SRPIN-1或其类似物作为有效成分的病毒增殖抑制剂以及(3)含有SRPIN-1或其类似物作为有效成分的抗病毒治疗药。
IV.本发明的具体公开
(1)降低或抑制SR蛋白质活性的抗病毒剂
(i)使SR蛋白质脱磷酸化的抗病毒剂
作为使SR蛋白质脱磷酸化的抗病毒剂,包括活化磷酸酶 2A(Mumby,M.C.and Walter,G.(1993)Physiol.Rev.73,673-680;Lechward,K.,Awotunde,O.S.,Swiatek,W.and Muszynska,G.(2001)Acta Biochem.Pol.48,921-933;Cohen,P.(1989)The structure andregulation of protein phosphatases.Annu.Rev.Biochem.58,453-508;Janssens,V.and Goris,J.(2001)Buochem.J.353,417-39)的活化剂,具体而言,编码HIV的tat基因的多肽(例如,登录号AAK08486)、编码腺病毒的E4-ORF4的多肽(例如,登录号AAB37507)、或编码牛痘病毒的VH1基因的多肽(例如,登录号AAV38329)。还包括载有HIV的tat基因、腺病毒的E4-ORF4基因或牛痘病毒的VH1基因的基因治疗用的表达载体。作为tat基因,可列举登录号AF324493的CDS(5830-6044和8369-8411),作为E4-ORF4,可列举登录号S82508的CDS(1634-1993),作为牛痘病毒的VH1,可列举登录号BT019522的CDS(1-555)。
(ii)SR蛋白质的磷酸化酶抑制剂
(ii-1)作为磷酸化SR蛋白质的酶,已知各种磷酸化酶,这些酶的RS结构域的磷酸化部位不同,这些RS磷酸化酶中,作为可进行有助于SR蛋白质稳定化的特定的磷酸化的酶,本发明人发现仅为SRPK。因此,为了防止SR蛋白质因磷酸化而被稳定化,作为磷酸化目标SR蛋白质的酶,可特别列举SR蛋白质磷酸化酶中的SRPK。作为SRPK,可列举SRPK1(Nature(1994)Vol.369,pp.678-682)和SRPK2(Biochem.Biophys.Res.Commun.(1998)Vol.242:pp.357-364;Wang,H.Y.等人,J.Cell.Biol.1998,140:737-750)二者。SRPK1的碱基序列可参照登录号NM-003137的124-2088、U09564的109-2073,AJ318054的10-2487、NM 016795的43-1986等,氨基酸序列可参照NP_003128、AAA20530、CAC39299、CAA11833、NP_058075等。另外,SRPK2基因的碱基序列可参照登录号U88666的188-2245,NM_009274的208-2253等,氨基酸序列可参照AAC05299、NP_033300等(Nikolakaki,E.等人,J.Biol.Chem.276,40175-40182(2001);Papoutsopoulou,S.,等人,Nucleic AcidsRes.27,2972-2980(1999);Wang,H.Y.等人,Genomics 57,310-315(1999);Gui,J.F.等人,Nature 369,678-682(1994);Wang,H.Y.等人,J.Cell Biol.140,737-750(1998);Papoutsopoulou,S.,等人,Nucleic AcidsRes.27,2972-2980(1999);Kuroyanagi,N.等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.242,357-364(1998);Bedfbrd,M.T.等人,EMBO J.16,2376- 2383(1997))。SRPK1中还包括SRPK1a。
作为在本发明的方法忠使用的具有抑制磷酸化酶(SRPK)功能的物质,可使用下述通式表示的化合物(包括SRPIN-1及其类似物)、以及它们可药用的盐和水和物。
(I)
(式中,R1表示氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基、可以具有取代基的C2-6烯基、可以具有取代基的C2-6炔基、可以具有取代基的C6-10芳基、卤原子、硝基、氰基、叠氮基、羟基、可以具有取代基的C1-6烷氧基、可以具有取代基的C1-6烷硫基、可以具有取代基的C1-6烷基磺酰基、羧基、甲酰基、可以具有取代基的C1-6烷氧基羰基、酰基、酰基氨基、或氨磺酰基;
R2表示氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基或可以具有取代基的芳基;
R3表示可以具有取代基的C1-6烷基、可以具有取代基的C2-6烯基、可以具有取代基的C6-10芳基、可以具有取代基的含氮杂环或可以具有取代基的稠合芳杂环;
R4表示氢原子或卤原子;
Q表示-C(O)-、-C(S)-、-SO2-、-C(s)NHC(O)-、-C(O)NHC(O)-或-C(O)NHC(S)-;
W表示氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基、可以具有取代基的C6-10芳基、卤原子、羟基、可以具有取代基的C1-6烷氧基、可以具有取代基的C1-6烷硫基、可以具有取代基的含氮杂环或可以具有取代基的稠合芳杂环、或下述通式(II)
(II)
(式中,R5和R6相同或不同,表示氢原子、可以具有取代基的C1-6 烷基、可以具有取代基的含氮杂环、可以具有取代基的稠合芳杂环、酰基或酰基氨基;而且
上述R5和R6可以与相邻的氮原子连接,形成可以具有取代基的杂环,该杂环可以是可以具有取代基的稠合芳杂环;
上述R5和R6也可以是可以具有取代基的环亚烷基氨基或可以具有取代基的芳环稠合环亚烷基),
作为上述化合物的一例,可列举以下化合物:
(III)
作为X,可列举F、Cl、Br、I或At。
具体地可列举下面的SRPIN-1:
(IV)
本发明的SRPIN-1可从Maybridge公司(Trevillett,Tintagel,Cornwall PL34 OHW,England)和Ambinter公司(46 quai Louis Bleriot,Paris,F-75016 France)得到,大致可如下进行化学合成。
(ii-2)利用针对SRPK1基因和SRPK2基因的RNAi的抗病毒剂
在细胞内,可利用siRNA、吗啉代低聚物或miRNA降低编码SRPK1和SRPK2的基因的表达水平。
可使用公知的方法设计siRNA,例如可用下述方法。
(ii-2-1)作为siRNA的靶序列,可避开5′端和3′端的UTR(非翻译区)或起始密码子,使用距起始密码子50碱基以上的下游的、OFR中从AA或NA开始的19~21碱基(一般为19碱基),CG含量为50%左右的,并且向5′和3′的偏嗜或重复序列尽可能少的序列。
siRNA从AA开始时,可用dTdT或UU2碱基的突出端,从NA开始的靶序列时,可用dTdN、dTdT或UU进行制备。
为了防止与目标靶序列以外的序列发生交叉反应,影响目标以外的蛋白质的表达,用BLAST检索等确认选出的序列与其它RNA序列的同源性。
要说明的是,使用将设计的siRNA在细胞内表达而制备的siRNA表达载体的方案也包括在本发明中。
吗啉代低聚物是指多个具有碱基的吗啉代亚单位连成链状的化合物,含有吗啉环和非离子性磷酸二酰胺化物(phosphorodiamidate)的亚单位键合的结构(US Patents 5,142,047,5,185,444)。细胞内的稳定性高,对mRNA亲和性高,因此吗啉代反义低聚可适用于抑制目标基因的表达(Summerton JE.,Ann NY Acad Sci 2003;1002:189)。有效的吗啉代低聚物的设计方法是已知的(参照Summerton,1989,In:Discoveries in Antisense Nuleic acids;Ed.:C.Brakel;Pub.:ThePortfolio Publishing Co.,Woodlands,Texas;pages 71-80;Summerton&Weller,1997,Antisense Nuc.Acid Drug Dev.7,187;以及Gene Tools 公司网站)。吗啉代低聚物可从Gene Tools公司(Gene Tools,LLC,Philomath,OR)得到。
(2)抑制编码SR蛋白质的基因表达的抗病毒剂包括例如:siRNA、吗啉代低聚物或miRNA。
(2-1)siRNA
siRNA的设计可适用上述(ii-2)的方法。
(3)活化具有与SR蛋白质相反功能的蛋白质或活化该蛋白质的抗病毒剂
(3-1)与SR蛋白质相反的功能是指例如在剪接中,促进选择内含子远位的3′剪接部位的功能。即,用与促进选择内含子近位的3′剪接部位的SR蛋白质相反的剪接调节因子,可抵消SR蛋白质的活性。具体而言,作为发挥与SR蛋白质相反功能的蛋白质,可列举hnRNP A1、A2以及B1等的核内不均一核糖核蛋白(hnRNP),可优选列举hnRNPA1。更优选包含载有编码hnRNP A1的基因的基因治疗用表达载体的抗病毒剂。编码hnRNP A1的基因序列示于例如登录号NM_002136的105-1064、NM_031157的105-1220。另外,hnRNP A1的氨基酸序列示于登录号NP_002127、NP_112420等(Expert-Bezan,Sureau,A.等人,J.Biol.Chem.279,38249-38259(2004);Zahler,A.M.等人,J.Biol.Chem.279,10077-10084(2004);Marchand,V.etal.,J.Mol.Biol.323,629-652(2002);Buvoli,M.等人,EMBO J.9,1229-1235(1990);Biamonti,G.等人,J,Mol.Biol.207,491-503(1989);Buvoli,M.等人,Nucleic Acids Res.16,3751-3770(1988);Michael,W.M.等人,Cell 83,415-422(1995))。编码hnRNP A2/B1的基因序列示于例如登录号NM_002137的170-1192、NM_031243的170-1228。另外,hnRNP A2/B1的氨基酸序列示于登录号NP_002128、NP_112533等(Kozu,T.,等人,Genomics 25,365-371(1995);Biamonti,G.等人,Nucleic Acids Res.22,1996-2002(1994);Burd,C.G.等人,Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A.86,9788-9792(1989);Kumar,A.等人,J.Biol.Chem.261,11266-11273(1986))。
(4)通过筛选抑制SRPK的物质来筛选抗病毒剂的方法。
本发明的抗病毒剂的筛选方法例如为包括筛选SRPK抑制剂的方法,筛选SRPK抑制剂包括使试验化合物作用于SRPK的步骤、以及检测SRPK的磷酸化SR蛋白质能力的步骤。降低该能力的化合物 (SRPK抑制剂)可用作抗病毒剂。特别是,本发明中还包括抗病毒剂的筛选方法,该方法将以SRPK1和SRPK2为靶的各种化合物,SR蛋白质,或者2个或2个以上连续的RS或SR的肽作为SRPK的基质筛选SRPK抑制剂。利用2个或以上重复的Arg-Ser(RS)或Ser-Arg(SR)的肽作为SRPK的基质,通过选择使磷酸化该基质的能力降低的化合物(SRPK抑制剂),可有效选择抑制SRPK的SR蛋白质磷酸化活性的化合物。
更具体地,本发明的筛选包括以下步骤:
(a)在被检化合物存在下,使SRPK与其基质接触的步骤,
(b)检测该基质的磷酸化的步骤
(c)选择与不存在被检化合物或被检化合物用量少的情况相比,磷酸化降低的化合物。
作为基质,可使用上述SR蛋白质、含有RS结构域的部分肽,或者2个或2个以上连续的RS或SR的肽(参照实施例)。作为SRPK,只要可维持野生型SRPK1或SRPK2、或磷酸化活性,也可以是加有标记肽的融合蛋白质或其它蛋白质。在本发明中,只要可维持对SR蛋白质的磷酸化活性,具有变异的SRPK等也称为SRPK。
更具体地,在本发明中,SRPK1包括(a)含有登录号NP-003128、AAA20530、CAC39299、CAA11833或NP_058075中所示的氨基酸序列的蛋白质、(b)与该氨基酸序列具有80%或以上、优选85%或以上、进一步优选90%、更优选95%以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质,并且是具有磷酸化活性的蛋白质、(c)或与含有登录号NM-003137的124-2088、U09564的109-2073、AJ318054的10-2487、NM_016795的43-1986的一部分或全部的核酸的互补链在严格条件下杂交的核酸所编码的蛋白质,并具有磷酸化活性的蛋白质。另外,本发明中,SRPK2包括(a)含有登录号AAC05299或NP_033300中所述的氨基酸序列的蛋白质、(b)与该氨基酸序列具有80%或以上、优选85%或以上、进一步优选90%、更优选95%以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质,并且是具有磷酸化活性的蛋白质、(c)或与含有登录号U88666的188-2245、NM_009274的208-2253的一部分或全部的核酸的互补链在严格条件下杂交的核酸所编码的蛋白质,并具有磷酸化活性的蛋白质。在此,一部分是指例如连续20个碱基或以上、优选25个碱基或以上、更优选 30个碱基或以上、40个碱基或以上、45个碱基或以上、50个碱基或以上。
氨基酸序列的同源性可利用例如BLAST程序(Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410)确定。例如,在NCBI(National Center forBiothchnology Information)的BLAST的网页中将Low complexity的滤过器全部设为OFF状态,用默认的参数进行检索(Altschul,S.F.等人(1993)Nature Genet.3:266-272;Madden,T.L.等人(1996)Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul,S.F.等人(1997)NucleicAcids Res.25:3389-3402;Zhang,J.& Madden,T.L.(1997)GenomeRes.7:649-656)。参数的设定如下:open gap的值为11,extend gap的值为1,wordsize为2、Dropoff(X)for blast extension in bits为7、XDropoff value for gapped alignment(in bits)为15、final X dropoff valuefor gapped alignment(in bits)为25。作为score的matrix使用BLOSUM62。例如进行2个序列的比对,可通过blast2 sequences程序(Tatiana A等人(1999)FEMS Microbiol Lett.174:247-250)做成2序列的排列,确定序列的同源性。GAP与错配同样处理,计算相对于上述登录号所示的野生型蛋白质的氨基酸序列整体(例如序列号:2或4的全长)的同源性值。可忽略排列中的野生型蛋白质的氨基酸序列外侧的gap计算同源性值。另外,在杂交中,制备含有野生型蛋白质的编码序列(例如序列编号:1或3)的核酸、或从杂交对象核酸的一部分制备探针,检测其是否与其它核酸杂交,由此进行鉴定。严格的杂交条件为例如在含有5xSSC(1×SSC含有150mM NaCl,15mM柠檬酸钠)、7%(W/V)SDS、10μg/ml变性鲑精子DNA、5xDenhardt试剂(1×Denhardt试剂含有0.2%聚乙烯吡咯烷酮、0.2%牛血清蛋白以及0.2%的Ficoll)的溶液中,在48℃下、优选50℃下、更优选52℃下进行杂交,然后,在与杂交相同的温度下、更优选60℃下、进一步优选65℃下、最优选在68℃下在2xSSC中、优选在1xSSC、更优选在0.5xSSC中、更优选在0.1xSSC中边振荡边洗涤2小时。
SRPK的磷酸化活性例如可用标记的ATP进行SRPK和基质的反应,通过定量标记的基质来检测。具体而言,可按照实施例4B的方法。
所得化合物进一步通过下述步骤检测抗病毒作用,再进一步筛选出抗病毒作用显著的化合物。
(d)在筛选的被检化合物的存在下,检测病毒增殖或病毒基因表达的步骤,
(e)选择与不存在该化合物或该化合物用量少的情况相比,使该病毒增殖或病毒基因表达降低的化合物的步骤。
病毒增殖或病毒基因的表达如实施例所示,可通过检测导入病毒基因的细胞的病毒蛋白质的产生等测定。
本发明涉及含有利用本发明的上述筛选方法选择的化合物的SRPK抑制剂和抗病毒剂。另外,本发明涉及利用本发明的上述筛选方法选择的化合物在制备SRPK抑制剂和/或抗病毒剂中的用途以及利用SRPK抑制和/或抗病毒进行治疗的用途。例如,选自CAS RegistryNos.218156-96-8、674360-18-0、494830-83-0、672919-05-0、54231-51-5、10338-55-3、1692-79-1、1496-40-81、496012-09-0、445406-05-3、445412-62-4以及388071-30-5的化合物作为SRPK抑制和/或抗病毒剂是有用的。
另外,本发明还包括将上述抗病毒剂用作病毒增殖抑制剂或抗病毒治疗药。例如,将SRPIN-1用作抗病毒剂时,可添加SRPIN-1以外的公知的制药辅料,例如,可添加AZT、或蛋白水解酶抑制剂。
本发明的病毒增殖抑制剂或抗病毒治疗药可间歇或持续地经口、经皮、粘膜下、皮下、肌肉内、血管内、脑内或腹腔内给药,使体内浓度达到100nM-1mM之间的任意值。
以下详细说明本发明的SRPIN-1类似物。本发明涉及具有下述结构的化合物及其用途。
本发明的化合物为下述通式(I)表示的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物,
(I)
(式中,R1表示氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基、可以具有取代基的C2-6烯基、可以具有取代基的C2-6炔基、可以具有取代基的C6-10芳基、卤原子、硝基、氰基、叠氮基、羟基、可以具有取代基的C1-6烷氧基、可以具有取代基的C1-6烷硫基、可以具有取代基的C1-6烷基磺酰基、羧基、甲酰基、可以具有取代基的C1-6烷氧基羰基、酰基、酰基氨基、或氨磺酰基;
R2表示氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基或可以具有取代基的芳基;
R3表示可以具有取代基的C1-6烷基、可以具有取代基的C2-6烯基、可以具有取代基的C6-10芳基、可以具有取代基的含氮杂环或可以具有取代基的稠合芳杂环;
R4表示氢原子或卤原子;
Q表示-C(O)-、-C(S)-、-SO2-、-C(S)NHC(O)-、-C(O)NHC(O)-或-C(O)NHC(S)-;
W表示氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基、可以具有取代基的C6-10芳基、卤原子、羟基、可以具有取代基的C1-6烷氧基、可以具有取代基的C1-6烷硫基、可以具有取代基的含氮杂环或可以具有取代基的稠合芳杂环、或下述通式(II)
(II)
(式中,R5和R6相同或不同,表示氢原子、可以具有取代基的C1-6 烷基、可以具有取代基的含氮杂环、可以具有取代基的稠合芳杂环、酰基或酰基氨基;而且
上述R5和R6可以与相邻的氮原子连接,形成可以具有取代基的杂环,该杂环可以是可以具有取代基的稠合芳杂环;
上述R5和R6也可以是可以具有取代基的环亚烷基氨基或可以具有取代基的芳环稠合环亚烷基),
在这些通式(I)表示的化合物中,作为优选的化合物,可列举例如以下化合物:
(1)上述R1为氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基或卤原子的化合物,
(2)上述R1为氢原子、C1-6烷基、卤代C1-6烷基或卤原子的化合物,
(3)上述R1为氢原子、甲基、三氟甲基、氯原子或氟原子的化合物,
(4)上述R1为氢原子或三氟甲基的化合物,
(5)上述R2为氢原子或C1-6烷基的化合物,
(6)上述R2为氢原子或甲基的化合物,
(7)上述R2为氢原子的化合物,
(8)上述R3为可以具有取代基的C6-10芳基、可以具有取代基的5~10元含氮杂芳环的化合物,
(9)上述R3为苯基;具有C1-6烷基、C1-6烷氧基或硝基作为取代基的C6-10芳基;或5~10元含氮杂芳基的化合物,
(10)上述R3为苯基;具有C1-6烷基、C1-6烷氧基或硝基作为取代基的C6-10苯基;或吡啶基的化合物,
(11)上述R3为苯基、甲苯基、甲氧基苯基或硝基苯基或吡啶基的化合物,
(12)上述R3为甲苯基或吡啶基的化合物。
(13)上述R3为4-吡啶基的化合物
(14)上述R4为氢原子的化合物,
(15)上述Q为-C(O)-或-C(O)NHC(S)-的化合物。在此,C(O)表示氧原子通过双键与碳原子键合,C(S)表示硫原子通过双键与碳原子键合。
(16)上述Q为-C(O)-化合物。
(17)上述W为氢原子、卤原子或下述通式(II)表示结构的化合物,
(II)
(式中,R5和R6相同或不同,表示可以具有取代基的C1-6烷基;而且上述R5和R6可以与相邻的氮原子连接,形成可以具有取代基的杂环基,该杂环基可以是可以具有取代基的稠合芳杂环基)。
(18)上述W为可以具有C1-6烷基作为取代基的含有1个氮原子的4~8元杂环基、可以具有C1-6烷基作为取代基的含有1个氮原子和1个氧原子的4~8元杂环基、稠和了苯基的含有1个氮原子的4~8元杂环基的化合物。
(19)上述W为可以具有C1-6烷基作为取代基的含有1个氮原子的4~8元杂环基的化合物。
(20)上述W为可以具有C1-6烷基作为取代基的哌啶基或全氢氮杂 (perhydroazopine)的化合物。
(21)上述W为氢原子、卤原子、二乙基氨基、吡咯烷基、哌啶基、2-甲基哌啶基、全氢氮杂、吲哚基、异吲哚基或1,2,3,4-四氢喹啉基的化合物。
其中,关于R1,(1)-(4)中,更优选(4)。关于R2,(5)-(7)中,更优选(7)。关于R3,(8)-(13)中,更优选(13)。关于Q,(15)-(16)中,更优选(16)。关于W,(17)-(20)中,更优选(20)。另外还优选(21)。
关于上述通式(I)表示的化合物,更优选选择(1)-(4)、(5)-(7)、(8)-(13)、(14)、(15)-(16)、(17)-(21)的各个取代基中优选的方式,并将它们任意组合而成的化合物。
以下,作为通式(I)表示的具体化合物,列举如下,但本发明并不限于以下列举的化合物。
[表1]
[表2]
[表3]
本发明涉及以上列举的任意化合物,但这些列举的化合物中,优选列举上述列举的化合物编号为340、341、342、343、344、345、346、347、348、608、613、615、616、618、619、620、622、623、624、625、626的化合物,进一步优选上述列举的化合物编号为340、348、613、616、618、622、624的化合物、更优选列举化合物编号为340、348、613、618、624的化合物。
本发明涉及以上列举的任意化合物。特别是,本发明涉及选自列举的化合物编号为341、342、346、347、348、349、612、613、614、616、617、618、619、620、621、622和624的新化合物。
这些化合物(苯胺衍生物)、其可药用的盐或它们的水合物作为SRPK抑制剂是有效的。
另外,这些化合物(苯胺衍生物)、其可药用的盐或它们的水合物作为抗病毒剂是有效的。
本发明的上式(Ⅰ)表示的化合物代表性的制备方法如下:
以下,R1、R2、R3、R4、R5、R6、Q和W定义同上。室温是指20~30℃左右的温度。
制备方法A
步骤1
是化合物1a和化合物2a反应生成化合物3a的步骤。原料硝基苯衍生物1a可购买市售品或导入适当官能团得到。X=F,Cl,Br,I,OMs,OTs,OTf。化合物2a为含有引入的NR5R6的试剂。化合物2a优选使用1-2当量。反应可在碱存在下在溶剂中进行。
作为碱,可使用三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、4-(二甲基氨基)吡啶等。优选使用1~5当量碱。另外,可使用过量的(1~5当量)H-NR5R6作为碱。
作为溶剂,可列举例如二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二噁烷、四氢呋喃、甲苯等。
反应可在反应温度为0℃~150℃下进行,可优选在室温下进行。
步骤2
是将化合物3a的硝基还原为氨基,得到化合物4a的步骤。
作为还原方法,可以在溶剂中,在氯化锡等存在下,与浓盐酸等接触进行。另外,也可以利用接触氢化等一般的还原反应。
作为反应溶剂,可以用甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、1,4-二噁烷、水或者它们的混合溶剂。
优选使用以质量比计为1~20当量的量的还原剂氯化锡。反应温度可在0℃~100℃进行。
如果可以得到化合物3a和4a的市售品,使用市售品也可。特别是通式(I)的W为氢或者卤原子时,基本上都可以得到市售品。例如,本说明书的化合物编号为608、612、623~626等就属于此。
步骤3a
是化合物4a和化合物5a反应得到化和物6a的步骤。L为卤原子等。
反应可在溶剂中,在碱存在下,根据需要添加催化剂进行。此时,优选使用1~3当量的化合物5a。
反应溶剂可以使用二氯甲烷、氯坊、1,4-二噁烷、四氢呋喃、甲苯、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等。
作为碱,可以使用三乙基胺、二异丙基乙胺、吡啶、4-(二甲氨基)吡啶等。
另外,可以利用L为羟基时的使用缩合剂的一般的叠氮键形成反应等;也可以利用L为琥珀酰亚胺基或咪唑基等离去基团时的一般的叠氮键形成反应。
作为催化剂可列举4-(二甲氨基)吡啶等。
反应可在反应温度为0℃~100℃进行。
步骤3b
是化合物4a和化合物5b反应得到化和物6b的步骤。
反应可在溶剂中,在碱存在下使酰基异硫氰酸盐作用而进行。酰基异硫氰酸盐可以使用市售品或者直接使用将合适的酰卤和硫氰酸盐在反应溶液中制备得到的物质。优选使用1~5当量酰基异硫氰酸盐。作为硫氰酸盐,可以使用硫氰酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸铵等,优选使用1~5当量。
作为溶剂,可列举例如乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、1,4-二噁烷等。
作为碱,可以使用例如三乙基胺、二异丙基乙胺、吡啶、4-(二甲氨基)吡啶等。优选使用1~5当量碱。
反应可在反应温度为0℃~150℃进行。
工程4a
是将化合物6a的叠氮基部分烷基化(R2)得到化合物7a的步骤。
反应可在溶剂中、在碱存在下使用烷基化试剂(R2-X)进行。X为作为离去基团的卤原子或者磺酸酯。烷基化试剂(R2-X)优选使用1~5当量。
作为溶剂,可列举例如N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、1,4-二噁烷、乙腈、醚等。
作为碱,可使用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、丁基锂、甲基锂、苯基锂、二异丙基氨基锂等。碱优选使用1~5当量。
反应可在反应温度为0℃~100℃下进行。
工程4b
是将化合物6a的酰胺键的羰基变成硫羰基得到化合物7b的步骤。
反应在溶剂中使用硫羰化试剂进行。
作为硫羰化试剂,可以使用例如Lawesson’s试剂(2,4-双(4-甲氧基苯基)-1,3,2,4-二硫杂二磷杂环丁烷(diphosphetane)2,4-二硫化物)、五硫化二磷(十硫化四磷、P4S10)等。优选使用1~5当量硫羰化试剂。
反应可在反应温度为0℃~200℃下进行。
以上为本发明的化合物(I)的制备方法的代表例,本发明化合物的制备中的原料化合物、各种试剂也可以形成盐、水合物或溶剂和物,均因起始原料、使用的溶剂等而不同,只要不妨碍反应,没有特别限制。所使用的溶剂也因起始原料、试剂等而不同,而且只要不妨碍反应,某种程度溶解起始物质则没有特别限制。本发明的化合物(I)作为游离体得到时,可按照常法转变为上述的化合物(I)可以形成的盐、或者它们的水合物的状态。
本发明的化合物(I)作为化合物(I)的盐或者化合物(I)的水合物得到时,可按照常法转变为上述化合物(I)的游离体。
另外,对于得到的本发明化合物(I)的各种异构体(例如几何异构体、以手性碳为基础的光学异构体、旋转异构体、立体异构体、互变异构体等)可通过通常的分离方法,例如重结晶、成非对映异构体盐法、酶分离法、各种色谱法(例如薄层色谱、柱色谱、气相色谱等)进行纯化、分离。
在本发明中,SRPIN-1类似物可用于抑制SRPK的活性。即,通过施用本说明书所述的SRPIN-1类似物,可抑制SRPK1和/或SRPK2的磷酸化活性。本发明涉及SRPIN-1类似物在SRPK活性抑制中的用途。另外,本发明涉及含有SRPIN-1类似物的SRPK抑制剂。另外,本发明涉及SRPIN-1类似物在SRPK抑制剂制备中的用途。另外,本发明涉及包括使SRPIN-1类似物与SRPK接触步骤的抑制SRPK活性的方法。在此,与SRPK接触可以是在体内或体外向表达SRPK的细胞、组织和/或个体施用SRPIN-1类似物。
另外,在本发明中,SRPIN-1类似物可用于抑制病毒的增殖。即,通过施用本说明书所述的SRPIN-1类似物,抑制SRPK1和/或SRPK2的磷酸化活性,从而抑制病毒增殖。本发明涉及SRPIN-1类似物在病毒增殖抑制中的用途。另外,本发明涉及含有SRPIN-1类似物的抗病毒剂。另外,本发明涉及SRPIN-1类似物在制备抗病毒剂中的用途。进一步本发明涉及包括使SRPIN-1类似物与SRPK接触的步骤的抑制病毒增殖的方法。在此,与SRPK接触可以是在体内或体外向表达SRPK的细胞、组织和/或个体施用SRPIN-1类似物。
另外,本发明提供一种药盒(package),其是含有上述SRPIN-1类似物、其可药用盐、或者它们的水合物的药盒,该化合物具有SRPK抑制活性和/或抗病毒作用记载在该药盒或该药盒的内容物中。在此,药盒是指含有该SRPIN-1类似物、其可药用盐、或者它们的水合物的包装物,可以含有用于装入该SRPIN-1类似物、其可药用盐、或者它们的水合物的容器,还可以包括收容该容器的袋子或外箱等。
另外,本发明提供一种药盒,其是含有使SR蛋白质活性或表达量降低的化合物的药盒,该化合物具有抗病毒作用记载在该药盒或该药盒的内容物中。特别是本发明提供一种药盒,该化合物为具有抑制SRPK表达和/或活性的活性的化合物。
本发明的化合物可与可药用的载体一起制成组合物。例如,可采用公知的制剂技术,做成医药组合物。将本发明的医药组合物用作SRPK抑制剂、或抗病毒剂(即病毒疾病的预防剂或治疗剂)或其他医药时,其给药形态可以列举通过例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、锭剂或糖浆剂等经口给药;或通过注射剂、气雾剂、栓剂、贴剂、糊剂、溶液剂、擦剂、软膏剂或滴眼剂等非经口给药。这些制剂可用赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、矫味矫臭剂、稀释剂等添加剂通过公知的方法制备。
作为赋形剂,可列举例如淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉等淀粉、乳糖、结晶纤维素、磷酸氢钙等。
作为包衣剂,可列举例如乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、虫胶、滑石、巴西棕榈蜡、石蜡等。
作为粘合剂,可列举例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和与上述赋形剂相同的化合物。
作为崩解剂,可列举例如与上述赋形剂相同的化合物和交联羧甲基纤维素钠(croscarmellose Sodium)、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮等经化学修饰的淀粉·纤维素类。
作为稳定剂,可列举例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸酯类;氯丁醇、苄基醇、苯乙醇等醇类;苯扎氯铵、苯酚、甲酚等酚类;硫柳汞、脱氢乙酸;以及山梨酸等
作为矫味矫臭剂,可列举例如通常使用的甜味剂、酸味剂、芳香剂等。
另外,作为制备液体制剂的溶剂,可列举乙醇、苯酚、氯甲酚、纯化水、蒸馏水等。
作为表面活性剂或乳化剂,可列举例如聚山梨酯80、硬脂酸聚烃氧酯40、聚月桂乙二醇等。
本发明的医药组合物用作SRPK抑制剂或抗病毒剂时,本发明的化合物或其可药用盐的用量因症状、年龄、给药方法等而有所不同。例如,口服时,优选根据症状对患者(恒温动物、特别是人)每天一次或者分数次给药,下限为(0.01)mg(优选为(0.1)mg),上限为(2000)mg(优选为(500)mg,更优选为(100)mg)。静脉给药时,成人每天一次或者分数次,下限为(0.001)mg(优选为(0.01)mg),上限为(500)mg(优选为(50)mg)。
实施例
以下,根据实施例更详细地说明本发明,他们仅作为示例,本发明并不限于这些实施例。要说明的是,本说明书中引用的文献均作为本说明书的一部分。
以下,柱色谱使用硅胶(MERCK 9385-5B,70-230目)进行。薄层色谱(TLC)使用预先涂布了硅胶的玻璃板(MERCK5715,silical gel60F254)进行。熔点使用Yanaco公司生产的微熔点测定装置YANACOMP-500D测定。1H-NMR谱用日本电子(JEOL)公司生产的JNMAL-400核磁共振装置测定。NMR谱测定用溶剂使用CDCl3或CD3OD(ISOTEC公司产)。化学位移以四甲基硅烷((CH3)4Si)为内标(0ppm)的相对值表示,偶合常数(J)以Hz表示。符号s、d、t、m以及br分别表示单峰、双峰、三重峰、四重峰、多重峰以及宽峰。
[参考例1]SRPIN-1的合成
SRPIN-1(编号GIF-0340)的代表的合成方法如下。
[参考例1-1A]
在室温下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(427mg,2.04mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(1mL)溶液中依次添加哌啶(piperidine)(220μL,2.22mnol)和N,N-二异丙基乙胺(N,N-diisopropylethylamine)(220μL,2.40mmol)。将混合物搅拌1小时。向其中添加水,用乙醚(×3)萃取混合物。用盐水洗涤萃取得到的有机层,在Na2SO4上干燥,过滤,在减压下浓缩。
残渣用硅胶柱色谱(40g,己烷/乙酸乙酯-10/1)纯化,得到1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]哌啶(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)piperidine(561mg,2.04mmol,quant.)的橙色固体。
TLC和1H NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下:TLC Rf0.47(己烷/丙酮=16/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.61-1.68(m,2H,CH2),1.72(tt,4H,J=5.3,5.3Hz,2CH2),3.13(t,4H,J=5.3Hz,2CH2),7.13(d,1H,J=8.8Hz,芳香性)7.61(dd,1H,J=2.0,8.8Hz,芳香性),8.03(d,1H,J=2.0Hz,芳香性).
[参考例1-2A]
在0℃下向参考例1-1A得到的1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]哌啶(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)piperidine(559mg,2.03mmol)的甲醇(10mL)溶液中依次添加浓盐酸(2.00mL,24.0mmol)和无水二氯化锡(2.50g,13.1mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌17.5小时。向其中添加碳酸氢钠的饱和水溶液。用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用盐水洗涤得到的有机层,在Na2SO4上干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色 谱(50g,己烷/乙酸乙酯=14/1)纯化,得到2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(448mg,1.83mmol,90.4%)的淡黄色固体。
TLC和1H NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下:TLC Rf 0.30(己烷/丙酮=18/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.59-1.60(m,2H,CH 2),1.71(tt,4H,J=5.4,5.4Hz,2CH2),2.85(brs,4H,2CH2),4.09(brs,2H,NH2),6.92(d,1H,J=1.9Hz,芳香性),6.97(dd,1H,J=1.9,8.4Hz,芳香性),7.01(d,1H,J=8.4Hz,芳香性).
[参考例1-3A]
在0℃下向参考例1-2A得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(173mg,0.708mm0l)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(151mg,0.850mmol,商品名)、三乙基胺(triethylamine)(450μL,3.23mm0l)和催化量的4-(二甲基氨基)吡啶(4-(dimethylamino)pyridine)。将混合物恢复至室温,搅拌19.5小时。向其中添加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用碳酸氢钠饱和水溶液洗涤得到的有机层,在Na2SO4上干燥,过滤,然后减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(10g,己烷/乙酸乙酯=1.5/1)和重结晶(己烷)纯化,得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(SRPIN-1,编号GIF-0340)(83.3mg,0.240mmol,33.9%)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点96-98℃;TLC Rf0.40(己烷/乙酸乙酯=1/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.67-1.68(m,2H,CH2),1.78(tt,4H,J=5.5,5.5Hz,2CH2),2.88(t,4H,J=5.5Hz,2CH2),7.29(d,1H,J=8.2Hz,芳香性),7.40(dd,1H,J=1.8,8.2Hz,芳香性),7.76(dd,2H,J=2.0,4.4Hz,芳香性),8.86(dd,2H,J=2.0,4.4Hz,芳香性),8.87(d,1H,J=1.8Hz,芳香性),9.53(s,1H,NH).
[参考例1-1B]
在0℃下向1-氯-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-chloro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(5.00g,22.4mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(7mL)溶液中添加哌啶(piperidine)(5.50mL,55.5mmol,商品名),将混合物搅拌40分钟。向其中添加水后,用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用元水硫酸钠干燥,过滤,减压下浓缩。残渣用硅胶柱色谱(200g,己烷/乙酸乙酯=8/1)纯化,得到1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]哌啶(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)piperidine(6.13g,quant.)的橙色固体。
[参考例1-2B]
在0℃下向参考例1-1B得到的1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]哌啶(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)piperidine(6.13g,22.4mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)溶液中依次添加浓盐酸(12.2mL,146mmol)和无水二氯化锡(12.7g,67.2mmol),将混合物搅拌7小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(200g,己烷/乙酸乙酯=15/1)纯化,得到2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(4.55g,83.0%)的淡黄色固体。
[参考例1-3B]
在0℃下向参考例1-2B得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(4.45g,18.2mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(6.48g,36.4mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(5.57mL,54.6mol)。将混合物搅拌0.5小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(200g,己烷/乙酸乙酯=1/1)和重结晶(己烷)纯化,得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5- (trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(SRPIN-1,编号GIF-0340)(5.49g,86.3%)的无色固体。
[参考例2]编号GIF-0613的合成
[参考例2-1]
在室温下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(211mg,1.00mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylfbrmamide(DMF))(0.5mL)溶液中依次添加(S)-2-甲基哌啶((S)-2-methylpiperidine)(270μL,2.24mmol,商品名),将混合物搅拌2小时。向其中加水后,用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=12/1)纯化,得到(S)-1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]-2-甲基哌啶((S)-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)-2-methylpiperidine(286mg,99.2%)的橙色油状物质。
TLC Rf 0.44(己烷/乙酸乙酯=16/1)。
[参考例2-2]
在0℃下向[参考例2-1]得到的(S)-1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]-2-甲基哌啶((S)-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)-2-methylpiperidine(275mg,0.953mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.00mL,12.0mmol)和无水二氯化锡(903mg,4.76mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌17小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层后,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g,己烷/乙酸乙酯=12/1)纯化,得到(S)-2-(2-甲基-1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(S)-(2-(2-methyl-1- piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(233mg,94.6%)的无色油状物质。
TLC Rf 0.38(己烷/乙酸乙酯=16/1)。
[参考例2-3]
在0℃下向[参考例2-2]得到的(S)-2-(2-甲基-1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺((S)-(2-(2-methyl-1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(233mg,0.863mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(466mg,2.61mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(600μL,4.30mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌19.5小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(25g,己烷/乙酸乙酯=1.5/1)纯化,得到(S)-N-[2-(2-甲基-1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺((S)-N-[2-(2-methyl-1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(编号GIF-0613)(293mg,93.4%)的无色油状物质。
TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
TLC Rf 0.40(己烷/乙酸乙酯=l/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ0.84(d,3H,J=6.4Hz,CH3),1.39-1.69(m,3H,CH2,CH),1.82-1.86(m,1H,CH),1.92-1.95(m,2H,CH2),2.65-2.72(m,1H,CH),2.89-2.92(m,1H,CH),2.98-3.02(m,1H,CH),7.35(d,1H,J=8.4Hz,芳香性),7.40(dd,1H,J=2.2,8.4Hz,芳香性),7.75(dd,2H,J=1.8,4.4Hz,芳香性),8.86(dd,2H,J=1.8,4.4Hz,芳香性),8.93(d,1H,J=1.8Hz,芳香性),10.1(s,1H,NH)。
[参考例3]编号GIF-0617的合成。
[参考例3-1]
在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(1.02g,4.89mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(4mL)溶液中添加吡咯烷(pyrrolidine)(983μL,12.0mmol,商品名)。将混合物恢复至室温,搅拌4.5小时。向其中加水后,用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g,己烷/乙酸乙酯=5/1)纯化,得到1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]吡咯烷(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)pyrrolidine(1.26g,99.3%)的橙色固体。
TLC Rf 0.45(己烷/乙酸乙酯=5/1)。
[参考例3-2]
在0℃下向参考例3-1得到的1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]吡咯烷(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)pyrrolidine(606mg,2.33mmol)的甲醇(4mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.36mL,16.3mmol)和无水二氯化锡(1.55g,8.16mmol),将混合物搅拌4小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g,己烷/乙酸乙酯=15/1)纯化,得到1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]吡咯烷(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]pyrrolidine)(550mg,quant.)的橙红色油状物质。
TLC Rf 0.63(己烷/乙酸乙酯=1/1)。
[参考例3-3]
在0℃下向参考例3-2得到的1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]吡咯烷(1-[2=amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]pyrrolidine)(516mg,2.24mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(705mg,3.96mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(823μL,5.94mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌5小时。向其中加水,用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(25g,己烷/乙酸乙酯=1/2)纯化,得到N-[2-(1-吡咯烷基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-pyrrolidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0617)(734mg,97.8%)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点134-135℃;TLC Rf 0.29(己烷/乙酸乙酯=1/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ2.01(tt,4H,J=3.2Hz,6.4Hz,2CH2),3.15(t,4H,J=6.4Hz,2CH2 ),7.19(d,1H,J=8.5Hz,芳香性),7.38(dd,1H,J=2.2,8.5Hz,芳香性),7.71(dd,2H,J=1.6,4.4Hz,芳香性),8.53(d,1H,J=2.2,Hz,芳香性),8.79(s,1H,NH),8.83(dd,2H,J=1.6,4.4Hz,芳香性)。
[参考例4]编号GIF-0618的合成
[参考例4-1]
在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro=2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(506mg,2.42mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(2mL)溶液中依次添加六氢-1H-氮杂(hexahydro-1H-azepine)(682μL,6.05mmol,商品名)。将混合物恢 复至室温,搅拌1小时。向其中加水后,用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=7/1)纯化,得到六氢-1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]-1H-氮杂(hexahydro-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1H-azepine)(680mg,97.5%)的橙色固体.
TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
TLC Rf0.49(己烷/乙酸乙酯=5/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.57-1.63(m,4H,2CH2),1.79-1.83(m,4H,2CH2),3.31(t,4H,J=5.5Hz,2CH2),7.11(d,1H,J=9.1Hz,芳香性)7.53(dd,1H,J=2.0,9.1Hz,芳香性),7.99(d,1H,J=2.0Hz,芳香性)。
[参考例4-2]
在0℃下向参考例4-1得到的六氢-1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]-1H-氮杂(hexahydro-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1H-azepine)(675mg,2.34mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.27mL,15.2mmol)和无水二氯化锡(1.43g,7.54mmol),将混合物搅拌2小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(30g,己烷/乙酸乙酯=20/1)纯化,得到1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]-六氢-1H-氮杂(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-hexahydro-1H-azepine(522mg,86.3%)的无色固体。
TLC和tH-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
TLC Rf 0.81(己烷/乙酸乙酯=3/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.70-1.84(m,8H,4CH2),3.04(t,4H,J=5.4,Hz,2CH2),4.10(brs,2H,NH2),6.92(d,1H,J=1.2Hz,芳香性),6.94(dd,1H,J=1.2,7.9Hz,芳香性),7.05(d,1H,J=7.9Hz,芳香性)。
[参考例4-3]
在0℃下向参考例4-2得到的1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]-六氢-1H-氮杂(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-hexahydro-1H-azepine(512mg,1.98mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(6mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(704mg,3.95mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(823μL,5.94mol),将混合物搅拌1.5小时。向其中加水,用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g,己烷/乙酸乙酯=2/1)纯化,得到N-[2-(1-六氢-1H-氮杂基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-hexahydro-1H-azepinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0618)(697mg,97.0%)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点138-139℃;TLC Rf 0.40(己烷/乙酸乙酯=1/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.79(br,8H,4CH2),3.06-3.10(m,4H,2CH2),7.31(d,1H,J=8.2Hz,芳香性),7.37(dd,1H,J=1.6,8.2Hz,芳香性),7.76(dd,2H,J=2.0,6.0Hz,芳香性),8.85(m,3H,芳香性),9.66(s,1H,NH)。
[参考例5]编号GIF-0346的合成
[参考例5-1]
在室温下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(209mg,1.00mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中依次添加吗啉(morpholine)(190μL,2.17mmol,商品名),将混合物搅拌3小时。向其中加水后,用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有 机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=3/1)纯化,得到4-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]吗啉(4-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine)(270mg,97.7%)的橙色油状物质。
TLC Rf 0.27(己烷/乙酸乙酯=3/1)。
[参考例5-2]
在0℃下向参考例5-1得到的4-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]吗啉(4-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine)(263mg,0.952mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.00mL,12.0mmol)和无水二氯化锡(905mg,4.77mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌20小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=2/1)纯化,得到4-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]吗啉(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine(214mg,91.2%)的无色固体。
TLC Rf 0.31(己烷/乙酸乙酯=3/1)。
[参考例5-3]
在0℃下向参考例5-2得到的4-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]吗啉(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine(196mg,0.796mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(320mg,1.80mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(480μL,3.44mol)。将混合物恢复至室温,搅拌60小时。向其中加水,用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g,己烷/乙酸乙酯=2/1)纯化,得到N-[2-(4-吗啉基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(4-morpholinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0346)(65.1mg,23.2%)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点172-173℃;TLC Rf 0.23(己烷/乙酸乙酯=1/3);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ2.96(t,4H,J=4.4Hz,2CH2),3.92(t,4H,J=4.4Hz,2CH2),7.34(d,1H,J=8.4Hz,芳香性),7.44(dd,1H,J=1.6,8.4Hz,芳香性),7.75(dd,1H,J=1.6,4.4Hz,芳香性),8.87-8.88(m,3H,芳香性)9.48(s,1H,NH)。
[参考例6]编号GIF-0347的合成
[参考例6-1]
在室温下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(211mg,1.01mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中添加二乙胺(diethylamine)(230μL,2.22mmol,商品名),将混合物搅拌3小时。向其中加水后,用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=8/1)纯化,得到1-二乙基氨基-2-硝基-4-(三氟甲基)苯基(1-diethylamino-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(258mg,98.3%)的橙色油状物质。
TLC Rf 0.37(己烷/乙酸乙酯/乙醚=16/1/1)。
[参考例6-2]
在0℃下向参考例6-1得到的1-二乙基氨基-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-diethylamino-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(251mg,0.957mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.00mL,12.0mmol)和无水二氯化锡(908mg,4.78mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌22小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。 残渣用硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=20/1~10/1)纯化,得到2-氨基-1-二乙氨基-4-(三氟甲基)苯(2-amino-1-diethylamino-4-(trifluoromethyl)benzene)(144mg,64.7%)的无色油状物质。
TLC Rf 0.22(己烷/乙酸乙酯=30/1)。
[参考例6-3]
在0℃下向参考例6-2得到的2-氨基-1-二乙氨基-4-(三氟甲基)苯(2-amino-1-diethylamino-4-(trifluoromethyl)benzene)(103mg,0.443mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(3mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(88.2mg,0.495mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(140μL,1.00mol)。将混合物恢复至室温,搅拌1.5小时。向其中加水,用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g,己烷/乙酸乙酯=2/1)纯化,得到N-[2-二乙基氨基-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-diethylamino-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0347)(51.0mg,34.1%)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点78-80℃;TLC Rf 0.31(己烷/乙酸乙酯=1/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.01(t,6H,J=7.1Hz,2CH3),3.04(q,4H,J=7.1Hz,2CH2),7.33(d,1H,J=8.2Hz,芳香性),7.41(dd,1H,J=1.8,8.2Hz,芳香性),7.73(dd,2H,J=1.8,4.4Hz,芳香性),8.60(d,1H,J=2.6Hz,芳香性),8.85(dd,2H,J=1.8,4.4Hz,芳香性),8.91(d,1H,J=1.8Hz,芳香性)9.90(s,1H,NH)。
[参考例7]编号GIF-0343的合成
在0℃下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(152mg,0.662mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoy]chloride hydrochloride)(122mg,0.685mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(250μL,1.79mol)。将混合物恢复至室温,搅拌16.5小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(15g,己烷/乙酸乙酯=1.5/1)纯化,得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0343)(98.4mg,45.3%)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点145-146℃;TLC Rf 0.40(己烷/乙酸乙酯=1/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.62-1.69(m,2H,CH2),1.79(tt,4H,J=5.8,5.8Hz,2CH2),2.88(t,4H,J=5.8Hz,2CH2),7.29(d,1H,J=8.4Hz,芳香性),7.39(dd,1H,J=2.0,8.4Hz,芳香性),7.51(dd,1H,J=4.8,8.0Hz,芳香性),8.30(ddd,1H,J=1.6,2.4,8.0Hz,芳香性),8.82(dd,1H,J=1.6,4.8Hz,芳香性),8.87(d,1H,J=2.0Hz,芳香性),9.16(d,1H,J=2.4Hz,芳香性),9.53(s,1H,NH)。
[参考例8]编号GIF-0344的合成
在0℃下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(102mg,0.417mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(3mL)溶液中依次添加苯甲酰氯(benzoylchloride)(50.0μL,0.430mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(170μL,1.21mol)。将混合物恢复至室温,搅拌18小时。向其中加水,用 乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=10/1)纯化,得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]benzamide)(GIF-0344)(126mg,86.7%)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点128-129℃、TLC Rf 0.46(己烷/乙酸乙酯=4/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.62-1.70(m,2H,CH2),1.78(tt,4H,J=5.2,5.2Hz,2CH2),2.88(t,4H,J=5.2Hz,2CH2),7.26(d,1H,J=8.6Hz,芳香性),7.35(d,1H,J=0.8,8.6Hz,芳香性),7.52-7.61(m,1H,芳香性),8.10(m,2H,芳香性),7.94(m,2H,芳香性),8.91(d,1H,J=0.8Hz,芳香性),9.44(s,1H,NH)。
[参考例9]编号GIF-0345
在0℃下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(51.2mg,0.209mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(2mL)溶液中依次添加4-硝基苯甲酰氯(4-nitrobenzoyl chloride)(64.2mg,0.345mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(120μL,0.859mol)。将混合物恢复至室温,搅拌60小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g,己烷/乙酸乙酯=8/1~6/1)纯化,得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]-4-硝基苯甲酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]-4-nitrobenzamide)(GIF-0345)(46.3mg,56.3%)的黄色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点125-136℃;TLC Rf 0.33(己烷/乙酸乙酯=4/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.62-1.70(m,2H,CH2),1.77(tt,4H,J=5.0,5.0Hz,2CH2),2.88(t,4H,J=5.0Hz,2CH2),7.30(d,1H,J=8.0Hz,芳香性),7.40(dd,1H,J=1.6,8.2Hz,芳香性),8.10(dd,2H,J=1.8,6.8Hz,芳香性),8.41(d,2H,J=1.8,6.8Hz,芳香性),8.86(d,1H,J=2.0Hz,芳香性),9.54(s,1H,NH)。
[参考例10]编号GIF-0615的合成
在0℃下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(147mg,0.602mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(4mL)溶液中依次添加4-甲氧基苯甲酰氯(4-methoxybenzoyl chloride)(250mg,1.47mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(254μL,1.83mol)。将混合物恢复至室温,搅拌17小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=5/1)纯化,得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]-4-甲氧基苯甲酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]-4-methoxybenzamide)(GIF-0615)(240mg,quant.)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点111-114℃;TLC Rf0.33(己烷/乙酸乙酯=4/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.64-1.68(m,2H,CH2),1.78(tt,4H,J=5.4,5.4Hz,2CH2),1.60-1.70(m,2H,CH2),2.39-2.41(m,2H,CH2),2.87(t,4H,J=5.4Hz,2CH2),3.89(s,3H,CH3),7.03(dd,2H,J=2.0,7.0Hz,芳香性),7.23(d,1H,J=8.0Hz,芳香性),7.32(dd,1H,J=1.6,8.0Hz,芳香性),7.91(dd,2H,J=2.0,7.0Hz,芳香性),8.88(d,1H,J=1.6Hz,芳香性),9.34(s,1H,NH)。
[参考例11]编号GIF-0622的合成
在室温下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(149mg,0.610mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加对甲苯磺酰氯(p-toluenesulfonyl chloride)(233g,1.22mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(254μL,1.83mol),将混合物搅拌60小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=10/1)纯化,得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]-对甲苯磺酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl)-p-toluenesulfonamide)(GIF-0622)(243mg,quant)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点117-134℃;TLC Rf0.49(己烷/乙酸乙酯=5/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.55-1.60(m,2H,CH2),1.66(tt,4H,J=5.2,5.2Hz,2CH2),2.36(s,3H,CH3),2.51(t,4H,J=5.2Hz,2CH2),7.11(d,1H,J=8.0Hz,芳香性),7.22-7.28(m,3H,芳香性),7.71(dd,2H,J=1.8,8.6Hz,芳香性),7.85(d,1H,J=2.0Hz,芳香性),7.94(s,1H,NH)。
[参考例12]编号GIF-0624的合成
在70℃下将硫氰化钾(potassium thiocyanate,商品名)(119mg,1.22mmol)和烟酰氯盐酸盐(nicotinoyl chloride hydroehloride)(352mg,1.97mmol)的乙腈(15mL)溶液搅拌40分钟。恢复至室温后,向其中依次添加参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(244mg,1.00mmol)的乙腈(5mL)溶液和三乙基胺(triethylamine)(278μL,2.00mmol),将混合物在50℃搅拌1小时。向其中加水,用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(25g,己烷/乙酸乙酯=4/1~1/1)纯化,得到1-烟酰基-3-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]磺脲(1-nicotinoyl-3-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]thiourea)(GIF-0624)(383mg,93.7%)的淡黄色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点142-144℃;TLC Rf0.26(己烷/乙酸乙酯=1/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.58-1.67(m,2H.CH2),1.75-1.85(m,4H,2CH2),2.89-2.95(m,4H,2CH2),7.33-7.40(m,1H,芳香性),7.44-7.48(m,1H,芳香性),7.60-7.65(m,1H,芳香性),8.76-8.78(m,1H,芳香性),9.05(s,0.6H,芳香性),9.09-9.14(m,1H,芳香性),8.37-8.39(m,1H,芳香性),8.49(s,0.4H,芳香性)。
[参考例13]编号GIF-0614的合成
在0℃下向参考例1-3得到的N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(SRPIN-l,GIF-0340)(121mg,0.496mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中添加氢氧化钠(60%w/w油混合物)(200mg,0.500mmol),将混合物搅拌1小时。在0℃下向其中添加碘代甲烷的N,N-二甲基甲酰胺溶液(N,N-dimethylformamide(DMF))(0.8M,0.62mL,0.496mmol),再将混合物搅拌3小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(12g,己烷/乙酸乙酯=1/1)纯化,得到N-甲基-N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-methyl-N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0614)(65.9mg,51.5%)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点119-121℃;TLC Rf 0.36(己烷/乙酸乙酯=1/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.50-1.60(m,2H,CH2),1.60-1.70(m,2H,CH2),1.60-1.70(m,2H,CH2),2.39-2.41(m,2H,CH2),2.80-2.82(m,2H,CH2),3.20(s,3H,CH3),6.86(d,1H,J=8.3Hz,芳香性),7.15(d,2H,J=4.4Hz,芳香性),7.41(d,2H,J=8.3Hz,芳香性),7.48(s,1H,芳香性),8.44(d,2H,J=4.4Hz,芳香性)。
[参考例14]编号GIF-0616的合成
向参考例1-3得到的N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(SRPIN-1,GIF-0340)(528mg,1.51mmol)的甲苯(2.5mL)溶液中添加Lawesson’s试剂(328mg,0.811mmol,商品名),将混合物在100℃下回流搅拌12小时。恢复至室温后,向其中加入2M的氢氧化钠水溶液,使成碱性,再用12M的氢氧化钠水溶液(×3)逆萃取混合物。向得到的水层中加入2M盐酸使溶液成酸性,然后用乙醚(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(50g,己烷/乙酸乙酯=1/1)纯化,得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]硫代异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyllisonicotinthioamide)(GIF-0616)(186mg,33.7%)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点108-109℃;TLC Rf0.27(己烷/乙酸乙酯=1/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.61-1.62(m,2H,CH2),1.68(tt,4H,J=5.0,5.0Hz,2CH2),2.87(t,4H,J=5.0Hz,2CH3),7.32(d,1H,J=7.8Hz,芳香性),7.51(dd,1H,J=1.6Hz,芳香性),7.71(dd,2H,J=1.6,6.4Hz,芳香性),8.76(dd,2H,J=1.6,6.4Hz,芳香性),9.58(d,1H,J=1.6Hz,芳香性),10.5(s,1H,NH)。
[参考例15]编号GIF-0341的合成
[参考例15-1]
在室温下向1,4-二氯-2-硝基苯(1,4-dichloro-2-nitrobenzene)(390mg,2.03mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(1mL)溶液中加入哌啶(piperidine)(600μL,6.66mmol,商品名),将混合物搅拌18.5小时。向其中加入水后,用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g,己烷/乙酸乙酯=10/1)纯化,得到1-(4-氯-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-chloro-2-nitrophenyl)piperidine)(471mg,96.4%)的橙色油状物质。
TLC Rf 0.18(己烷)。
[参考例15-2]
在0℃下向参考例15-1得到的1-(4-氯-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-chloro-2-nitrophenyl)piperidine(471mg,1.95mmol)的甲醇(10mL)溶液中依次添加浓盐酸(2.00mL,24.0mmol)和无水二氯化锡(1.84g,9.70mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌16小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(30g,己烷/乙酸乙酯=9/1)纯化,得到5-氯-2-(1-哌啶基)苯胺(5-chloro-2-(1-piperidinyl)aniline)(388mg,94.3%)的无色油状物质。
TLC Rf 0.26(己烷/乙酸乙酯=18/1)。
[参考例15-3]
在室温下向参考例15-2得到的5-氯-2-(1-哌啶基)苯胺(5-chloro-2-(1-piperidinyl)aniline)(378mg,1.79mmol)的二氯甲烷(dichloromethane) (10mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloridehydrochloride)(350mg,1.96mmol,商品名)、三乙基胺(triethylamine)(740μL,5.30mmol)和催化剂量的4-(二甲基氨基)吡啶(4-(dimethylamino)pyridine),搅拌19小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(200g,己烷/乙酸乙酯=1/1)纯化,得到N-[5-氯-2-(1-哌啶基)苯基]异烟酰胺(N-[5-chloro-2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0341)(180mg,31.8%)的无色固体。
TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点141-143℃;TLC Rf0.32(己烷/乙酸乙酯=1/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.61-1.62(m,2H,CH2),1.76(tt,4H,J=5.0,5.0Hz,2CH2),2.82(t,4H,J=5.0Hz,2CH2),7.09(dd,1H,J=2.6,8.8Hz,芳香性),7.14(d,1H,J=8.8Hz,芳香性),7.75(dd,2H,J=1.6,4.4Hz,芳香性),8.60(d,1H,J=2.6Hz,芳香性),8.85(dd,2H,J=1.6,4.4Hz,芳香性),9.66(s,1H,NH)。
[参考例16]编号GIF-0342的合成
[参考例16-1]
在室温下向4-氯-3-硝基甲苯(4-chloro-3-nitrotoluene)(358mg,2.08mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(1mL)溶液中加入哌啶(piperidine)(660μL,6.66mmol,商品名),将混合物在100℃下搅拌17小时。恢复至室温后,向其中加入水,用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色 谱(50g,己烷/乙酸乙酯=50/1)纯化,得到1-(4-甲基-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-methyl-2-nitrophenyl)piperidine(212mg,46.2%)的无色油状物质。
TLC Rf 0.54(己烷/乙酸乙酯-10/1)。
[参考例16-2]
在0℃下向参考例16-1得到的1-(4-甲基-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-methyl-2-nitrophenyl)piperidine)(212mg,0.880mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(0.70mL,8.4mmol)和无水二氯化锡(834mg,4.39mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌16小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=12/1)纯化,得到5-甲基-2-(1-哌啶基)苯胺(5-methyl-2-(1-piperidinyl)aniline)(164mg,95.0%)的淡黄色油状物质。
TLC Rf 0.36(己烷/乙酸乙酯=10/1)。
[参考例16-3]
在室温下向参考例16-2得到的5-甲基-2-(1-哌啶基)苯胺(5-methyl-2-(1-piperidinyl)aniline)(155mg,0.815mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoylchloride hydrochloride)(172mg,0.966mmol,商品名)、三乙基胺(triethylamine)(340μL,2.44mmol)和催化剂量的4-(二甲基氨基)吡啶(4-(dimethylamino)pyridine),将混合物搅拌19小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(10g,己烷/乙酸乙酯=1/1)纯化,得到N-[5-甲基-2-(1-哌啶基)苯基]异烟酰胺(N-[5-methyl-2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0342)(69.5mg,28.8%)的无色固体。
TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点142-144℃;TLC Rf 0.35(己烷/乙酸乙酯=1/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.62-1.70(m,2H,CH2),1.75(tt,4H,J=4.9,4.9Hz,2CH2),2.37(s,3H,CH3),2.82(t,4H,J=4.9Hz,2CH2),6.94(dd,1H,J=1.6,8.1Hz,芳香性),7.12(d,1H,J=8.1Hz,芳香性),7.76(dd,2H,J=1.3,4.5Hz,芳香性),8.38(d,1H,J=1.6Hz,芳香性),8.84(dd,2H,J=1.3,4.5Hz,芳香性),9.75(s,1H,NH)。
[参考例17]编号GIF-0348的合成
[参考例17-1]
在室温下向1,4-二氟-2-硝基苯(1,4-difluoro-2-nitrobenzene)(225mg,1.41mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中加入哌啶(piperidine)(320μL,3.23mmol,商品名),将混合物搅拌2小时。向其中加入水,用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=12/1)纯化,得到1-(4-氟-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-fluoro-2-nitrophenyl)piperidine)(298mg,94.2%)的橙色油状物质。
TLC Rf 0.46(己烷/乙酸乙酯=12/1)。
[参考例17-2]
在0℃下向参考例17-1得到的1-(4-氟-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-fluoro-2-nitrophenyl)piperidine)(289mg,1.28mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.20mL,14.4mmol)和无水二氯化锡(1.22g,6.43mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌21小时。向其中添加饱和碳酸 氢钠水溶液,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(25g,己烷/乙酸乙酯=12/1)纯化,得到5-氟-2-(1-哌啶基)苯胺(5-fluoro-2-(1-piperidinyl)aniline)(250mg,quant.)的无色油状物质。
TLC Rf 0.34(己烷/乙酸乙酯=16/1)。
[参考例17-3]
在0℃下向参考例17-2得到的5-氟-2-(1-哌啶基)苯胺(5-fluoro-2-(1-piperidinyl)aniline)(248mg,1.27mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloridehydrochloride)(454mg,2.55mmol,商品名)、三乙基胺(triethylamine)(385μL,3.83mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌17小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(15g,己烷/乙酸乙酯=1.5/1)纯化,得到N-[5-氟-2-(1-哌啶基)苯基]异烟酰胺(N-[5-fluoro-2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0348)(257mg,67.6%)的无色固体。
TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点115-116℃;TLC Rf 0.40(己烷/乙酸乙酯=1/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.62-1.69(m,2H,CH2),1.76(bs,4H,2CH2),2.82(bs,4H,2CH2),6.81(ddd,1H,J=2.8,8.8,10.8Hz,芳香性),7.18(dd,1H,J=5.6,8.8Hz,芳香性),7.75(dd,2H,J=2.0,4.4Hz,芳香性),8.34(dd,1H,J=2.8,10.8Hz,芳香性),9.16(dd,2H,J=2.0,4.4Hz,芳香性),9.83(s,1H,NH)。
[参考例18]编号GIF-0349的合成
[参考例18-1]
在室温下向2-氟-1-硝基苯(2-fluoro-1-nitrobenzene)(219mg,1.55mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中加入哌啶(piperidine)(338μL,3.41mmol,商品名),将混合物搅拌2小时。向其中加入水,用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=20/1)纯化,得到1-(2-硝基苯基)哌啶(1-(2-nitrophenyl)piperidine)(315mg,98.8%)的无色油状物质。
TLC Rf 0.53(己烷/乙酸乙酯=16/1)。
[参考例18-2]
在0℃下向参考例18-1得到的1-(2-硝基苯基)哌啶(1-(2-nitrophenyl)piperidine)(315mg,1.52mmol)的甲醇(10mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.50mL,18.0mmol)和无水二氯化锡(1.45g,7.64mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌17小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=15/1)纯化,得到2-(1-哌啶基)苯胺(2-(1-piperidinyl)aniline)(238mg,88.8%)的淡黄色油状物质。
TLC Rf 0.19(己烷/乙酸乙酯=18/1)。
[参考例18-3]
在0℃下向参考例18-2得到的2-(1-哌啶基)苯胺(2-(1-piperidinyl)aniline)(203mg,1.15mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloridehydrochloride)(616mg,3.46mmol,商品名)、三乙基胺(triethylamine)(800μL,5.73mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌2小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=1/1)纯化,得到N-[2-(1-哌啶基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF- 0349)(259mg,80.0%)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3,400MHz)的结果如下。
熔点111-113℃;TLC Rf0.35(己烷/乙酸乙酯=1/1);1H NMR(CDCl3,400MHz)δ1.62-1.67(m,2H,CH2),1.76(tt,4H,J=4.8,4.8Hz,2CH2),2.85(t,4H,J=4.8Hz,2CH2),7.13(td,1H,J=1.6,7.8Hz,芳香性),7.21(td,1H,J=1.6,7.8Hz,芳香性),7.24(dd,1H,J=1.6,7.8Hz,芳香性),7.77(dd,2H,J=1.9,4.4Hz,芳香性),8.53(dd,1H,J=1.6,7.8Hz,芳香性),8.84(dd,2H,J=1.9,4.4Hz,芳香性),9.71(s,1H,NH)。
[参考例19]编号GIF-0619的合成
[参考例19-1]
在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(498mg,2.38mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(2mL)溶液中依次加入二氢吲哚(indoline)(402μL,3.59mmol,商品名)和N,N-二异丙基乙胺(N,N-diisopropylethylamine)(619μL,3.59mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌1小时,然后加热至70℃,搅拌5.5小时。将混合物恢复至室温,向其中加入水,然后用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g,己烷/乙酸乙酯=20/1)纯化,得到1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]二氢吲哚(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline(730mg,99.4%)的深红色油状物质。
TLC Rf 0.48(己烷/乙酸乙酯=6/1)。
[参考例19-2]
在0℃下向参考例19-1得到的1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]二氢吲哚(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline)(730mg,2.37mmol)的甲醇(7mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.28mL,15.4mmol)和无水二氯化锡(1.57g,8.30mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌8小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g,己烷/乙酸乙酯=10/1)纯化,得到1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]二氢吲哚(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline)(619mg,93.9%)的橙红色油状物质。
TLC Rf 0.27(己烷/乙酸乙酯=6/1)。
[参考例19-3]
在0℃下向参考例19-2得到的1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]二氢吲哚(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline)(518mg,1.86mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl ehloride hydrochloride)(669mg,3.76mmol,商品名)、三乙基胺(triethylamine)(773μL,5.58mmol)。将混合物恢复至室温,搅拌2.5小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(50g,己烷/乙酸乙酯=1/1)纯化,得到N-[2-(1-二氢吲哚基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-indolinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0619)(643mg,90.1%)的无色固体。
TLC Rf 0.32(己烷/乙酸乙酯=1/1)。
[参考例20]编号GIF-0620的合成
[参考例20-1]
在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(508mg,2.43mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(2mL)溶液中依次加入二氢异吲哚(isoindoline)(679μL,5.98mmol,商品名)。将混合物恢复至室温,搅拌2小时。向其中加入水,然后用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g,己烷/乙酸乙酯=15/1)纯化,得到2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]二氢异吲哚(2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline(749mg,quant.)的黄色固体。
TLC Rf 0.42(己烷/乙酸乙酯=10/1)。
[参考例20-2]
在0℃下向参考例20-1得到的2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]二氢异吲哚(2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline)(641mg,2.08mmol)的甲醇(7mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.13mL,13.5mmol)和无水二氯化锡(1.38g,7.28mmol)。恢复至室温,将混合物搅拌8.5小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(30g,己烷/乙酸乙酯=15/1)纯化,得到2-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]二氢异吲哚(2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline)(225mg,38.9%)的橙红色油状物质。
TLC Rf 0.38(己烷/乙酸乙酯=10/1)。
[参考例20-3]
在0℃下向参考例20-2得到的2-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]二氢异吲哚(2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline)(193mg ,0.694mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(6mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(250mg,1.40mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(287μL,2.07mmol)。恢复至室温,将混合物搅拌3小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减 压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(5g,己烷/乙酸乙酯=1/1)纯化,得到N-[2-(2-二氢异吲哚基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(2-isoindolinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0620)(266mg,quant.)的无色固体。
TLC Rf 0.31(己烷/乙酸乙酯=1/1)。
[参考例21]编号GIF-0621的合成
[参考例21-1]
在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(506g,2.42mmol,商品名)的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide(DMF))(4mL)溶液中依次加入1,2,3,4-四氢异喹啉(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline)(909μL,7.26mmol,商品名)。将混合物恢复至室温,搅拌3.5小时。向其中加入水,然后用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g,己烷/乙酸乙酯=10/1)纯化,得到1,2,3,4-四氢-2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]异喹啉(1,2,3,4-tetrahydro-2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoquinoline(779mg,99.9%)的橙色固体。
TLC Rf 0.54(己烷/乙酸乙酯=10/1)。
[参考例21-2]
在0℃下向参考例21-1得到的1,2,3,4-四氢-2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]异喹啉(1,2,3,4-tetrahydro-2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoquinoline(658mg,2.04mmol)的甲醇(8mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.11mL,13.3mmol)和无水二氯化锡(1.35g,7.12mmol)。恢复至室 温,将混合物搅拌18小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(30g,己烷/乙酸乙酯=20/1)纯化,得到2-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]-1,2,3,4-四氢异喹啉(2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline)(426mg,71.4%)的橙红色油状物质。
TLC Rf 0.36(己烷/乙酸乙酯=10/1)。
[参考例21-3]
在0℃下向参考例21-2得到的2-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]-1,2,3,4-四氢异喹啉(2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline)(315mg,1.08mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloridehydrochloride)(390mg,2.19mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(449μL,3.24mmol)。恢复至室温,将混合物搅拌0.5小时。向其中加水,用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g,己烷/乙酸乙酯=2/1)纯化,得到N-[2-(1,2,3,4-四氢异喹啉-2-基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-2-yl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0621)(418mg,97.6%)的无色固体。
TLC Rf 0.52(己烷/乙酸乙酯=1/1)。
[参考例22]编号GIF-0608的合成
在0℃下向3-(三氟甲基)苯胺(3-(trifluoromethyl)aniline,商品名)(208mg,1.29mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(670mg,3.76mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(864μL,6.20mmol)。恢复至室温,将混合物搅拌23小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过重结晶纯化,得到N-[3-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0608)(166mg,48.3%)的无色固体。
TLC Rf 0.26(己烷/乙酸乙酯=1/2)。
[参考例23]编号GIF-0612的合成
在0℃下向2-溴-5-(三氟甲基)苯胺(2-bromo-5-trifluoromethyl)aniline,商品名)(480mg,2.00mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(427mg,2.39mmol,商品名)和三乙基胺(triethylamine)(410μL,2.94mmol)。恢复至室温,将混合物搅拌24小时。向其中加水,用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层,然后用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。残渣通过重结晶纯化,得到N-[2-溴-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-bromo-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0612)(308mg,44.8%)的无色固体。
TLC Rf 0.46(己烷/乙酸乙酯=1/1)。
[参考例24]SRPIN-1的毒性试验
用哺乳动物进行SRPIN-1的染色体变异筛选试验。用中国仓鼠CHL细胞(大日本制药株式会社),以染色体变异诱发性为指标检索SRPIN-1的变异原性。试验研究了利用短时间处理(处理时间:6小时, 恢复时间:18小时)的代谢活性法时(+S9mix)和不存在代谢活性化系统时的连续处理法(24小时处理)。将CHL细胞在添加了10%的10%胎牛血清(ICN Flow)的MEM Earle的液体培养基(GIBCO BRL)中,在5%CO2、37℃的条件下培养。给Sprague-Dawley(雄,日本Charles RiverLaboratories,7周龄)以每天一次的比例连续4天腹腔内投与苯巴比妥(第1次30mg/kg,第2-4次60mg/kg),再于投与第3天腹腔内施用5,6-苯并黄酮80mg/kg,将从这样的肝脏制备的S9fraction(Oriental酵母工业;A.T.Natarajan等人,Mutation Res.,37,pp 83-90(1976))用于利用代谢活性法的分析。分析所用的S9mix的组成为1mL中有4μmolHEPES缓冲液(pH7.4)、5μmol MgCl2、33μmol KCl、5μmol G6P、4μmol NADP和0.3mL S9fraction。
在短时间处理法中,将CHL细胞(约4×103cells/mL)在5mL的培养液中在60mm的玻璃器皿中培养3天后,从玻璃器皿中取出1.33mL培养液,加入0.83mL S9mix,立即加入各用量的被检液0.5mL(终浓度5、1.58、0.5mg/mL;溶解于0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液中)。培养6小时后,用PBS洗涤,更换新的培养液5mL,再培养18小时。另外用0.5%CMC-Na水溶液(0.5mL)作为阴性对照,用二甲基亚硝胺(DMN;终浓度500μg/mL)作为阳性对照,进行同样的操作。在连续处理法中,将含CHL细胞(约4×103cells/mL)的5mL培养液在60mm的玻璃器皿中培养3天后,从玻璃器皿中取出0.5mL培养液,加入各用量的被检液0.5mL(终浓度5、1.58、0.5mg/mL);培养24小时(约1.5细胞周期)。另外用0.5%CMC-Na水溶液(0.5mL)作为阴性对照,用丝裂霉素C(MMC;终浓度0.05μg/mL)作为阳性对照,进行同样的操作。
培养结束2小时前加入10μg/mL的秋水仙酰胺0.1mL,用0.25%胰蛋白酶处理并回收细胞,用0.075M的氯化钾溶液进行低张处理后,用甲醇∶乙酸(3∶1)混合液固定,干燥后,进行吉姆萨染色。每个用量观察50个扩散良好的分裂中期图像,计算染色体结构变异和个数变异的种类和出现的数量。将结构变异分为染色分体切断(ctb)、染色分体交换(cte)、染色体切断(csb)、染色体交换(cse)、其他(5个以上的变异、断片、细粉化等),按照变异种类记录出现数量。将即使具有1个这些异常的细胞也作为变异细胞。变异细胞出现率小于5%为阴性,大于等于5%、且小于10%为疑阳性、10%或以上为阳性。当被检物质处理组的染色体变异细胞出现率为10%或以上时,判定被检物质为诱发染色体变异的物质。对于阳性对照组的染色体结构变异细胞的出现率,DMN 500μg/Ml处理组为26个(52.0%),MMC 0.05μg/Ml处理组为24个(48.0%),阴性对照未见变异,因此判断本试验实施适当。
试验结果如下:SRPIN-1的处理组的染色体结构变异细胞在短时间处理法、连续处理法中,在任何一种处理条件下染色体结构异常和数量异常细胞的增加都为阴性。以上结果说明该化合物对哺乳类培养细胞没有染色体变异诱发性。
[参考例25]SRPIN-1的体内给药
进行了大鼠的SRPIN-1单次经口给药毒性试验。对饲养期间体重增加顺利的一般状态下未见异常的Slc:SD大鼠(5周龄、日本SLC)经口施用125、250、500、1000、2000mg/kg的SRPIN-1,每组雌雄各2只(给药量10mL/kg)。从给药前一天的傍晚到给药后约4小时使动物绝食。给药后2天观察的结果为,雌雄均未见死亡,在一般状态也未见变化。接着将SRPIN-12000mg/kg与上述同样经口施用Slc:SD大鼠(5周龄)雌雄各5只,给药后观察14天,记录肉眼观察到的毒性症状的种类、程度、发现时间、恢复时间和死亡时间。结果,雌雄均未见死亡,一般状态也未见异常。
[实施例1A]HIV感染细胞的SR蛋白质的磷酸化
用9微升基因导入试剂Genejuice(70967-4;从Novagen购入)将3微克HIVpNL4-3基因组(Adachi,A.等人,1986,J.Virol.59:284-289)导入来源于人胎儿肾脏的Flp-In-293细胞(R750-07:从Invitrogen购入)。4天后,向细胞中加入1μLSDS-PAGE上样缓冲液,使其溶解,在95℃下热变性3分钟后,迅速置于冰上,将其作为蛋白质样品。
将该蛋白质用于蛋白印迹分析。将样品通过4-20%的梯度凝胶在40mA、45分钟的条件下通过用Laemmli缓冲液的SDS-PAGE分离。用Broad Range Pre-stained Marker参照物(02525-35;Nacalai)作为参照物检测分子量。接着对PROTRAN硝基纤维素薄膜(BA85;由Schleicher&Schuell BioScience购入)用TransBlot SD细胞(170- 3940;由Bio-rad购入)在160mA,60min的条件下进行半干印迹。印迹结束后将膜用TBS振荡洗涤5分钟,接着用BlockingOne(03953-95;由Nacalai购入)封闭1小时,在室温下进行。再将膜用TBS洗涤,与用TBS稀释的识别磷酸化SR蛋白质的小鼠单克隆抗体104抗体(Mab104;由ATCC购入杂交瘤)、小鼠抗SC35抗体(S4045;由BDTransduction购入)、小鼠单克隆抗SF2抗体(AK103:Dr.AdrianKrainer提供;Hanamura,A.et al.,1998,RNA 4:430-444;Kojima,T.等人,2001,J.Biol.Chem.276:32247-56)在4℃下培养过夜。
将膜在室温下用TBS振荡洗涤10分钟,进行3次。然后,将第二抗体的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体(NA9310;由Amersham购入)用TBS稀释,与膜在室温下培养1小时。将膜在室温下用TBS振荡洗涤10分钟,进行3次。然后,通过利用ECL Detection Reagents(RPN2105;由Amersham购入)的化学发光法用LAS1000CCD相机(LAS1000;富士flim)拍摄。结果如图1A所示。
结果发现,伴随着HIVpNL4-3的感染,未见Mab104抗体、SC35抗体、SF2抗体的蛋白印迹分析的信号,不仅SR蛋白质脱磷酸化,SC35、SF2这些内在性SR蛋白质也分解了。
[实施例1B]SR蛋白质的分解
用Genejuice将1微克融合了HA标记的SRp75、SRp55、SRp40基因的质粒(HA-SRp75、HA-SRp55、HA-SRp40;由Dr.Woan-YuhTARN提供)导入来源于人胎儿肾脏的Flp-In-293细胞,36小时后,加入泛素蛋白酶体抑制剂MG132(474790;由CALBIOCHEM购入)至终浓度(10μM)。10小时后,进一步用SDS-PAGE上样缓冲液将细胞溶解,进行热变性,作为蛋白质样品。将其同样地进行SDS-PAGE,用羊抗HA抗体(H1803;由Santa Cruz购入)作为第一抗体,驴抗兔IgG抗体(NA 9340;由Amersham购入)作为第二抗体进行蛋白印记分析。结果如图1B所示。
结果,添加了MG132的细胞与对照相比得到更强的信号,因此可知通过MG132抑制了SRp75、SRp55、SRp40的蛋白质分解。另外,对于其他蛋白质也可得到同样的结果(数据未列),可知通过MG132,SR蛋白质由泛素蛋白酶体进行分解。
[实施例2A]SRPK2稳定表达细胞中的SR蛋白质的磷酸化
用Flp-In-293细胞建立多株在Flp-In部位导入1个拷贝小鼠SRPK2基因的SRPK2稳定表达细胞。分析中以亲株Flp-In293作为mock,将所建立的多株的SRPK2稳定表达细胞中的SRPK2-2用于实验。将pNL4-3导入这2种细胞,4天后通过蛋白印记分析研究HIV感染的内在性SR蛋白质的动态。
与图1A同样,进行蛋白印记分析时,将HIVpNL4-3基因组导入SRPK2-2细胞时,用Mab104抗体在SRp35、SRp40、SRp55、SRp75的位置观察到信号,由此可知Mab104识别的SR结构域处于磷酸化状态。
进一步,根据使用SC35抗体、SF2抗体的蛋白印记分析,确认导入HIVpNL4-3基因的SRPK2-2细胞见到SC35、SF2的信号。示于图2A。
由这些结果可知,通常伴随着HIV感染,SR蛋白质会分解,但在SRPK2稳定表达细胞中SR蛋白质维持了磷酸化状态,结果稳定了SR蛋白质。由此可知,SRPK2稳定表达细胞中SR蛋白质处于磷酸化状态,不会通过泛素蛋白酶体分解。
[实施例2B]SRPK2稳定表达细胞中SR蛋白质的存在
向在Flp-In部位导入1个拷贝SRPK2基因、稳定表达SRPK2基因的Flp-In-293细胞(SRPK2-2细胞)和亲株Flp-In-293(mock)中,用Genejuice导入1μg HIVpNL4-3基因组和1μg融合了HA标记的SRp75、SRp55和SRp40基因的质粒(HA-SRp75、HA-SRp55、HA-SRp40;由Dr.Woah-Yuh TARN提供),36小时后回收样品,进行蛋白印记分析。结果如图2B所示。结果,随着HIV的感染,在Flp-In-293细胞中,不仅SC35、SF2,SRp75、SRp55、SRp40的抗HA抗体信号也消失或减弱。另外在SRPK2-2细胞中,同样地信号与对照相比减弱了,但与SC35、SF2同样,观察到SRp75、SRp55、SRp40的信号。
这些结果表明,随着HIV的感染,促进了SR蛋白质的分解,但在SRPK2-2细胞中,由于SR蛋白质被磷酸化,SR蛋白质稳定。
[实施例2C]测定HIV的产生量
在实施例2A(图2A)的实验时,回收培养上清测定HIV的产生量。回收导入基因后的培养上清,用lumipulse ELISA系统(Fujirebio)测定培养上清所含的HIV外膜蛋白质p24的量。结果如图2C所示。
结果,与mock的培养上清相比,在SRPK2-2细胞中产生了2.3倍量的HIV。
由上可知,相应于HIV感染,SR蛋白质脱磷酸化,使SR蛋白质恒定地处于磷酸化状态时,应急于感染的SR蛋白质的控制机构不发挥作用,结果HIV产生亢进。
这说明相应于HIV感染的SR蛋白质脱磷酸化发挥着宿主防御机构的功能。
[实施例3A]参与体内HIV产生的SR蛋白质的研究
HIV在其基因表达过程中用宿主的因子进行转录、加工、翻译。特别是,HIV的Tat、Rev具有断裂的外显子,推测对于其基因表达mRNA的剪接是必须的。
如实施例1-2(图1-2)所示,伴随着HIV感染,宿主的防御机构作用,SR蛋白质分解,但对体内参与HIV剪接反应、或参与此的蛋白质还不了解。实际上在细胞内存在多种SR蛋白质,将表达这些SR蛋白质的质粒(0.5μg)与HIVpNL4-3基因组一起导入,研究了其效果。结果如图3A所示。
将表达Mock、SC35、SF2、SRp40、SRp55、SRp75的质粒分别导入Flp-In293细胞内,36小时后回收培养上清,用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量。
结果,与Mock相比,SRp40、SRp75中HIVp24的量增加,确认了SRp40、SRp75中HIV产生亢进的效果。
[实施例3B]用hnRNPA1研究对体内HIV产生的效果
如图3B所示,与HIVpNL4-3基因组(0.5μg)和一定量(500ng)的SRp40、SRp75表达质粒,阶段性地增加hnRNPA1表达质粒的量,向Flp-In293细胞进行基因导入。36小时后回收培养上清,用lumipulseELISA系统测定HIVp24的量。
得到的结果是用lumipulse ELISA系统测定的HIVp24量依赖于hnRNPA1的量减少。即,hnRNPA1相对于SRp40和SRp75竞争性地发挥作用,抑制HIV的产生。
这表明在细胞内HIV的基因表达通过剪接反应控制表达。实际上,由于SRp40、SRp75、hnRNPA1共存于细胞内,伴随HIV感染的SR蛋白质的分解优先于细胞内的hnRNPA1,由此抑制HIV基因表达作为防御机构。
[实施例4A]用于抑制细胞内SR蛋白质磷酸化的SRPK的抑制剂的探索
以磷酸化酶共同具有的ATP结合部位为目标,探索了竞争性结合的抑制剂。筛选结果,选中的化合物为分子量为349.35的Maybridge公司已经在销售的化合物之一(CAS Registry No.218156-96-8)。但是,关于磷酸化酶的抑制至今没有任何报道。我们将其命名为SRPIN-1(SRPK抑制剂-1)。
[实施例4B]使用SRPIN-1的SRPK1的磷酸化活性抑制的研究
合成相当于SF2的RS结构域的RS肽(NH2-RSPSYGRSRSRSRSRSRSRSRSNSRSRSY-OH)(序列号5)。将其用10mM Tris-HCl(pH7.5)溶解,使成为1mg/ml。用1μg在大肠菌中表达纯化的重组SRPK1蛋白质,在反应缓冲液(250μM MgCl2、0.25mMATP、1mCi[γ-32P]ATP、SRPIN-1终浓度0.1、0.3、1.0、3.0、10.0μM)中在30℃的水浴中培养10分钟。该磷酸化酶活性测定的SRPK1和RS肽的量和反应时间的条件是预先研究反应的直线性,选择了直线性成立的条件。
SRPK1和RS肽的反应进行10分钟后,将反应液滴至P81磷酸纤维素薄膜(P81;Whatman),用5%磷酸溶液洗涤。洗涤后,通过液体闪烁计数器测定P81薄膜的32P的放射活性。结果如图4B所示。
结果,SRPIN-1相对于SRPK1的IC50为约400nM。另外通过同样的方法研究了CLK1、CLK2、CLK3、CLK4、SRPK2、PRP4、PKA、PKC,由于即使终浓度为10μM 也未见抑制效果,因此可以说SRPIN-1是SRPK1的特异性酶抑制剂。
[实施例4C]对使用SRPIN-1的体内SR蛋白质磷酸化的抑制、以及伴随其的SR蛋白质分解诱导的研究
向Flp-In293细胞中导入HA-SRp75质粒(1.0μg),36小时后分别添加MG132(终浓度10μM)、SRPIN-1(10、20、50μM)培养15小时。然后,用SDS-PAGE上样缓冲液溶解细胞,作为蛋白质样品。将该样品进行SDS-PAGE,用抗HA抗体进行蛋白印迹分析。作为蛋白质量的对照,使用抗β-肌动蛋白抗体进行蛋白印迹分析。结果示于图4C。
结果,HA抗体信号SRPIN-1浓度依赖性地减弱。这表明内源性的SRPK1活性SRPIN-1依赖性地被抑制,结果分解了SRp75蛋白质。
这说明SRPIN-1对SRPK1的抑制可在体内抑制SR蛋白质的磷酸化,结果使SR蛋白质不稳定,促进了蛋白质分解。
[实施例4D]SRPIN-1的添加对HIV感染的抑制的研究
向MT-4细胞中添加用293T细胞制备的HIV病毒颗粒,进行感染实验。首先,在向MT-4细胞添加病毒制备液的同时,添加SRpIN-1(终浓度0.5、10、20μM)。在2小时、37℃、5%CO2的培养条件下培养后,离心细胞,更换新的培养液。然后,48小时后回收培养上清,用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量。结果示于图4D。
结果,用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量依赖于SRPIN-1的浓度而减少。这说明SRPIN-1可浓度依赖性地抑制HIV的产生。
[实施例5]使用SRPIN-1类似物的SRPK1/2的磷酸化活性的抑制
与实施例4B一样,确认使用SRPIN-1类似物的SRPK1和SRPK2的磷酸化活性的抑制活性。用1μg在大肠菌中表达纯化的重组SRPK1蛋白质和SRPK2蛋白质,在反应缓冲液(400μM HEPE(pH7.5)100μM MgCl2、200μM ATP、1mCi[γ-32P]ATP、RS肽(序列号5)1mg/ml、SRPIN-1类似物各10μM(DMSO中)在30℃的水浴中培养20分钟。
SRPK1或SRPK2和RS肽的反应进行20分钟后,将反应液滴至P81磷酸纤维素薄膜(P81;Whatman),用5%磷酸溶液洗涤(10分钟,3次)。洗涤后,通过液体闪烁计数器测定P81薄膜32P的放射活性。结 果如图5A所示,各SRPIN-1类似物显示了对SRPK1和/或SRPK2的磷酸化活性抑制效果。特别是化合物编号340(SRPIN-1)~348、612、613、615、618、619、621、624、625对SRPK1或SRPK2具有强的抑制效果。
接着,确认了各SRPIN-1类似物对HIV复制的抑制效果。向MT-4细胞(JCRB No.JCRB0135)中添加用293T细胞制备的HIV病毒颗粒,进行感染实验。首先,在向MT-4细胞添加病毒制备液的同时,添加SRPIN-1类似物(终浓度5、10、20μM)。在2小时、37℃、5%CO2 的培养条件下培养后,离心细胞,更换新的培养液。然后,48小时后回收培养上清,用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量。结果图5B所示各SRPIN-1类似物具有抑制HIV复制的活性。特别是化合物编号340、341、342、343、345、347、348、608、613、615、616、618、619、620、622、623、624、625、626对HIV增殖具有强的抑制效果。另外,如图5C所示,在使用其他细胞(Jurkat)的实验中同样也确认了抑制HIV增殖的效果。
[实施例6]对辛德比斯病毒的增殖抑制效果
向Vero细胞(JCRB0111)中加入5μL辛德比斯病毒(4.7×107 PFU/m1),将培养24小时的培养上清制备为病毒储液。将其添加至BHK21Cl3细胞(JCRB9020)中,稀释为102~107PFU,同时添加SRPIN-1(终浓度5、10、20或40μM)。在室温下感染1小时后,加入含有1%甲基纤维素(SIGMA M0512-100G)的培养基,在48小时、37℃、5%CO2的培养条件下静静地培养,在位相差显微镜下观察细胞形态,同时数出因感染辛德比斯病毒而导致细胞死亡的空斑数(空斑试验),计算PFU/ml。
图6A示出了病毒感染20小时后的细胞位相差显微图像。在未施用SRPIN-1的细胞(图中的“+SIN、对照”)明显看到因辛德比斯病毒增殖而导致的细胞损伤,但是通过施用SRPIN-1(40μM)抑制了细胞损伤(图中的“+SIN、40μM(#340)”)。空斑试验的结果也表明5μM以上的SRPIN-1显著且浓度依赖性地抑制辛德比斯病毒的增殖(图6B)。
[实施例7]对巨细胞病毒的增殖抑制效果
向HFL1细胞(IFO50074)添加巨细胞病毒(1×104PFU/ml),同时添加SRPIN-1或其类似物(化合物编号340和349;终浓度20或40μM)。结果,感染7天后,在位相差显微镜下观察巨细胞病毒感染的HFL1细胞时发现,如图7所示,在没有添加SRPIN-1的对照组的HFL1细胞(图中的1和2)观察到巨细胞病毒感染特有的形态变化和细胞死亡,与此相对,添加了SRPIN-1(20μM)的HFL1细胞(图中的3)虽然感染了巨细胞病毒,但未见异常的形态变化或细胞死亡。在添加了高浓度(40μM)的SRPIN-1的HFL1细胞中,观察到认为是由该化合物引起的一部分细胞形态变化。另外,通过向HFL1细胞中添加SRPIN-1的类似物化合物(化合物编号349)20μM或40μM也可抑制巨细胞病毒感染引起的异常形态变化或细胞死亡(图中的5和6)。结果证明,在本试验条件下,SRPIN-1及其类似物可抑制巨细胞病毒感染引起的异常形态变化或细胞死亡。
[实施例8]对SARS病毒的增殖抑制效果
使Vero细胞(JCRB0111)感染SARS病毒(FFM-1)(Yamamoto,N.et.al.,Biochem Biophys Res Commun.318,719-72592004)),同时添加SRPIN-1或其类似物(终浓度5、10、20、40μM)。在室温感染2小时后,加入含有1%甲基纤维素(SIGMA M0512-100G)的D-MEM,在48小时、37℃、5%CO2的培养条件下培养。数出SARS病毒而导致细胞死亡的空斑数(空斑试验),计算PFU/ml。结果,如图8A所示,40μM的SRPIN-1及其类似物(化合物编号349)显著抑制了SARS病毒的增殖。但是,就效果而言,SRPIN-1与类似化合物(化合物编号349)相比,病毒增殖抑制效果更显著。另外,如图8B所示,SRPIN-1在1μM到40μM的浓度范围浓度依赖性地抑制SARS病毒的增殖。
产业实用性
根据本发明,明确了SRPIN-1(SR蛋白质磷酸化抑制剂1,SRprotein phosphorylation inhibitor 1)及其类似物具有抑制磷酸化酶SRPK的活性。发现SR蛋白质因被SRPK磷酸化而在细胞中稳定存在,但如通过这些SRPK抑制剂抑制SRPK的酶活性,则SR蛋白质的磷酸化被抑制,并经泛素蛋白酶体途径分解。因此尝试了添加SRPK 抑制剂来抑制SRPK,在HIV感染实验中发现SRPK抑制剂具有抑制病毒复制的抗病毒作用。
进一步,本发明还有以下效果,即,提供通过控制SR蛋白质的活性以同一机理对广的范围的病毒有效的抗病毒剂。
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