CN115151536A

CN115151536A - 抗病毒化合物、组合物及使用方法

Info

Publication number: CN115151536A
Application number: CN202080097082.XA
Authority: CN
Inventors: 大卫·斯科特·格里尔森; 玛丽亚姆·扎米里; 彼得·K·张; 贝诺伊特·夏博特; 艾伦·沃尔特·科克伦
Original assignee: Sokopha Applied Research Products Commercialization Corp Health And Human Sciences Sec; University of British Columbia; University of Toronto
Current assignee: Sokopha Applied Research Products Commercialization Corp Health And Human Sciences Sec; University of British Columbia; University of Toronto
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2022-10-04
Also published as: EP4077320A1; JP2023506860A; WO2021119808A1; EP4077320A4; US20230105935A1; CA3162227A1

Abstract

本文提供了用于治疗病毒感染的具有式(I)结构的抗病毒化合物及其组合物。特别地，式(I)的化合物能够干扰病毒mRNA加工的输出，这反映在病毒RNA同种型的积累改变，以及从细胞核到细胞质的转运。此类化合物显示出HIV、腺病毒和冠状病毒感染细胞的减少。本发明提供了可适用于治疗HIV AIDS的化合物。(式(I))

Description

抗病毒化合物、组合物及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年12月16日提交的题为“ANTIVIRAL COMPOUNDS,COMPOSITIONSAND METHODS OF USE”的美国临时专利申请序列号62/948,672的权益。

技术领域

本发明涉及治疗性化合物、它们的用途和治疗病毒感染的方法。病毒感染可以是逆转录病毒感染或复制依赖于宿主细胞RNA加工因子的病毒感染(例如，腺病毒、疱疹、流感、SARS、冠状病毒)。该化合物显示出干扰HIV-1和腺病毒的RNA加工，如通过病毒RNA剪接形式的积累变化和参与调节RNA加工的细胞蛋白的修饰所证明的。本发明提供了取决于修饰的RNA加工因子的活性可适用于治疗HIV AIDS以及其它病毒感染(腺病毒、流感、乙型肝炎、疱疹、冠状病毒)的化合物。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的免疫系统疾病。HIV病毒是逆转录病毒，它是将其基因组的拷贝插入感染的宿主细胞的DNA中以改变宿主细胞的基因组的一种RNA病毒。一旦在宿主细胞的细胞质内，病毒使用逆转录酶从其RNA基因组逆转录DNA。然后通过整合酶将病毒DNA整合到宿主细胞基因组以形成前病毒。逆转录酶和整合酶均构成HIV病毒体的一部分。当宿主细胞转录并翻译其自身的基因组DNA时，前病毒的病毒基因被制成适于装配成新病毒的病毒蛋白。

发现HIV是两种慢病毒：HIV-1和HIV-2。每种类型可以通过直接接触HIV感染的体液传播。HIV病毒可有效破坏人免疫系统。HIV的具体靶标是辅助T细胞(特别是CD4+T细胞)、巨噬细胞和树突细胞。在宿主感染之后，CD4+T细胞的水平通常降低至临界水平以下，由此细胞介导的免疫丧失，并且身体逐渐变得更易感于机会性感染和癌症。为了诊断AIDS，具有HIV的人必须具有AIDS定义的病症或具有小于200个细胞/mm³的CD4计数。

高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)(有时也称为联合抗逆转录病毒疗法(cART)或抗逆转录病毒疗法(ART))靶向多种病毒蛋白或过程，包括：病毒进入；逆转录；整合；转录；以及病毒装配和生产。HAART能够将病毒载量降低至低于50个拷贝并补充CD4+T细胞的数量。然而，尽管存活率增加，但AIDS现在是慢性病症，长期HAART会导致并发症(即脂质代谢紊乱)。尽管HAART具有明显的益处，但该治疗具有低特异性、高毒性且昂贵。此外，HAART被认为促进对HAART不太敏感的病毒突变体的选择。最后，HARRT没有解决HIV储库的问题，其中休眠病毒可能存在于静息的T细胞中。

最近，已经确定，基于芪的化合物2-(2-(5-硝基-2-噻吩基)乙烯基)喹诺酮(称为5350150)通过参与干扰HIV mRNA从细胞核到细胞质的输出的作用模式来阻断HIV复制(Wong,Balachandran et al.2013)。尽管5350150在低于其毒性阈值的浓度下表现出其活性，但相关噻吩取代的芪化合物的已知的光不稳定性/毒性强烈地表明，利用该体系的抗HIV性质的任何努力将必须以替代中心芪双键开始。

发明内容

本发明部分地基于本文所述的化合物调节病毒感染的发现。偶然地，发现本文所述的化合物能够干扰病毒mRNA从细胞核到细胞质的加工和输出。这种化合物在进入后显示出对HIV、腺病毒和冠状病毒复制的抑制。本发明提供了可适用于治疗HIV AIDS和其它病毒疾病的化合物。

在第一方面，提供了具有式I的结构的化合物：

其中，X¹可以选自S、O和N-J¹；X²可以选自S、O和N-J²；Z¹可以选自CH、N和CE；Z²可以选自CH、N和CR⁴；Z³可以选自CH、N和CR³；E可以选自其中任选地一个或多个碳被N或O或两者取代的任选取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、任选取代的芳基、任选取代的吡啶、CH₂OH、CH₂CH₂OJ³和CH₂CH₂-Q，其中所述任选取代的烷基、芳基和吡啶具有一个或多个独立地被OH、CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃、CH₂CH(CH₃)CH₃、CH(CH₃)CH₃、OCH₃、OCH₂CH₃、OCH₂CH₂CH₃、OCH₂CH(CH₃)CH₃、OCH(CH₃)CH₃、CN、F、Cl、Br、I和CF₃取代的H原子；T¹可以选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代并且其中一个或多个烷基氢任选地被J⁸取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂OJ⁴、CH₂CH₂OJ⁴、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁴、CONH(J⁴)、CON(J⁴)₂、NO₂、CN、CF₃、OCF₃、SO₂NH(J⁴)、SO₂N(J⁴)₂和NJ⁴J⁴；T²可以选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代并且其中一个或多个烷基氢任选地被J⁹取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、NO₂、CF₃、OCF₃、CN、CH₂OH、CH₂OJ⁵、CH₂CH₂OJ⁵、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁵、CONH(J⁵)、CON(J⁵)₂、SO₂NH(J⁵)、SO₂N(J⁵)₂和NJ⁵J⁵；M可以选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代并且其中一个或多个烷基氢任选地被J¹⁰取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OH、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、NHCH₂CH₂Q、NH(J⁶)、N(J⁶)₂、CH₂CH₂OJ⁶、CO₂J和CON(J⁶)₂；Q可以选自

R¹可以选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OJ⁷、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷、SO₂N(J⁷)₂、NJ⁷J⁷和N₃；R²可以选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OJ⁷、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷、SO₂N(J⁷)₂、NJ⁷J⁷和N₃；J¹可以选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；J²可以选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；J³可以选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；J⁴可以选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；J⁵可以选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；J⁶可以选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；J⁷可以选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；J⁸可以选自1-4个碳的直链或支链烷基、1-4个碳的直链或支链O-烷基、OH、CH₂OH、CH₂OJ⁴、CH₂CH₂OJ⁴、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁴、CONH(J⁴)、CON(J⁴)₂、SO₂NH(J⁴)、SO₂N(J⁴)₂、NO₂、CN、NH₂、NJ⁴J⁴、F、CF₃和OCF₃；J⁹可以选自1-4个碳的直链或支链烷基、1-4个碳的直链或支链O-烷基、OH、CH₂OH、CH₂OJ⁵、CH₂CH₂OJ⁵、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁵、CONH(J⁵)、CON(J⁵)₂、SO₂NH(J⁵)、SO₂N(J⁵)₂、NO₂、CN、NH₂、NJ⁵J⁵、F、CF₃和OCF₃；以及J¹⁰可以选自1-4个碳的直链或支链烷基、1-4个碳的直链或支链O-烷基、OH、CH₂OH、CN、NH₂、NJ⁶J⁶和CF₃。

在另一方面，提供了具有式II的结构的化合物：

其中，X¹可以选自S、O和N-J¹；X²可以选自S、O和N-J²；Z¹可以选自CH、N和CE；E可以选自其中任选地一个或多个碳被N或O或两者取代的任选取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、任选取代的芳基、任选取代的吡啶、CH₂OH、CH₂CH₂OJ³和CH₂CH₂-Q，其中所述任选取代的烷基、芳基和吡啶具有一个或多个独立地被OH、CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃、CH₂CH(CH₃)CH₃、CH(CH₃)CH₃、OCH₃、OCH₂CH₃、OCH₂CH₂CH₃、OCH₂CH(CH₃)CH₃、OCH(CH₃)CH₃、CN、F、Cl、Br、I和CF₃取代的H原子；T¹可以选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代并且其中一个或多个烷基氢任选地被J⁸取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂OJ⁴、CH₂CH₂OJ⁴、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁴、CONH(J⁴)、CON(J⁴)₂、NO₂、CN、CF₃、OCF₃、SO₂NH(J⁴)、SO₂N(J⁴)₂和NJ⁴J⁴；T²可以选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代并且其中一个或多个烷基氢任选地被J⁹取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、NO₂、CF₃、OCF₃、CN、CH₂OH、CH₂OJ⁵、CH₂CH₂OJ⁵、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁵、CONH(J⁵)、CON(J⁵)₂、SO₂NH(J⁵)、SO₂N(J⁵)₂和NJ⁵J⁵；M可以选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代并且其中一个或多个烷基氢任选地被J¹⁰取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OH、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、NHCH₂CH₂Q、NH(J⁶)、N(J⁶)₂、CH₂CH₂OJ⁶、CO₂J和CON(J⁶)₂；Q可以选自

R¹可以选自H、其中一个或多个碳被N或O或两者取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OJ⁷、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷、SO₂N(J⁷)₂、NJ⁷J⁷和N₃；R²可以选自H、其中一个或多个碳被N或O或两者取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OJ⁷、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷、SO₂N(J⁷)₂、NJ⁷J⁷和N₃；R³可以选自H、其中一个或多个碳被N或O或两者取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OJ⁷、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷、SO₂N(J⁷)₂、NJ⁷J⁷和N₃；R⁴可以选自H、其中一个或多个碳被N或O或两者取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OJ⁷、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷、SO₂N(J⁷)₂、NJ⁷J⁷和N₃；J¹可以选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；J²可以选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；J³可以选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢可以任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；J⁴可以选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；J⁵可以选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢可以任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；J⁶可以选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢可以任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；J⁷可以选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢可以任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；J⁸可以选自1-4个碳的直链或支链烷基、1-4个碳的直链或支链O-烷基、OH、CH₂OH、CH₂OJ⁴、CH₂CH₂OJ⁴、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁴、CONH(J⁴)、CON(J⁴)₂、SO₂NH(J⁴)、SO₂N(J⁴)₂、NO₂、CN、NH₂、NJ⁴J⁴、F、CF₃和OCF₃；J⁹可以选自1-4个碳的直链或支链烷基、1-4个碳的直链或支链O-烷基、OH、CH₂OH、CH₂OJ⁵、CH₂CH₂OJ⁵、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁵、CONH(J⁵)、CON(J⁵)₂、SO₂NH(J⁵)、SO₂N(J⁵)₂、NO₂、CN、NH₂、NJ⁵J⁵、F、CF₃和OCF₃；以及J¹⁰可以选自1-4个碳的直链或支链烷基、1-4个碳的直链或支链O-烷基、OH、CH₂OH、CN、NH₂、NJ⁶J⁶和CF₃。

在另一方面，提供了用于治疗病毒感染的药物组合物，其包含本文所述的化合物和药物可接受的载体。

在另一方面，提供了本文所述的化合物用于治疗病毒感染的用途。

在另一方面，提供了本文所述的化合物在制造用于治疗病毒感染的药物中的用途。

在另一方面，提供了治疗病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的个体施用本文所述的化合物或其药物组合物。

X¹可以选自S和O；X²可以选自S和O；并且Z¹可以选自CH和N。X¹可以选自S和O。X²可以选自S和O。Z¹可以选自CH和N。T¹可以选自H或1-6个碳的直链、支链或环状烷基；并且T²可以选自H、NO₂、CF₃ CN、或者1-6个碳的直链、支链或环状烷基。T¹可以选自H或1-6个碳的直链、支链或环状烷基。T²可以选自H、NO₂、CF₃CN、或者1-6个碳的直链、支链或环状烷基。M可以选自H或CH₃。R¹可以选自H、CH₃、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷和N₃；R²可以选自H、CH₃、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃和N₃；R³可以选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃和N₃；并且R⁴可以选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃和N₃。R¹可以选自H、CH₃、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷和N₃。R²可以选自H、CH₃、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃和N₃。R³可以选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃和N₃。R⁴可以选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃和N₃。替代地，T²可以选自H、NO₂、CF₃、CO₂J⁵、CN、或者1-6个碳的直链、支链或环状烷基。

X¹可以是S；X²可以选自S和O；并且Z¹可以选自CH和N。X¹可以是S。X²可以是S。X²可以是O。Z¹可以是N。Z¹可以是CH。T²可以选自CF₃和CN。T¹可以是H。T²可以是CF₃。T²可以是CN。M可以是H。R¹可以选自H、CO₂J⁷、NO₂、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷和N₃。R²可以是H。R²可以是Cl。R³可以是H。R³可以是Br。R⁴可以是H。R¹可以选自H、CH₃、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷和N₃。R²可以选自H、CH₃、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃和N₃。R³可以选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃和N₃。R⁴可以选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃和N₃。

化合物可以选自以下的一种或多种：

替代地，化合物可以选自以下的一种或多种：

化合物可以是

病毒感染可以选自以下的一种或多种：HIV和腺病毒。替代地，感染可以是冠状病毒感染。

附图说明

图1：(A)第一组GPS化合物(387-434)对抗HIV-1活性的初步评价；(B)第二组GPS化合物(435-495)对抗HIV-1活性的初步评价。

图2：显示递增浓度的GPS475(5d)(图2A)、GPS477(5i)(图2B)、GPS484(5h)(图2C)、GPS 389(5a)(图2D)、GPS428(5c)(图2E)、GPS472(8d)(图2F)、GPS504(8e)(图2G)和GPS505(8f)(图2H)对HIV野生型B亚型(NL4-3WT和HIV-1BaL)的抗HIV活性(柱状图)和针对CEM-GXR细胞的细胞毒性(线图)。

图3：(A)在CEM-GXR细胞中递增浓度的GPS491(12c)对野生型亚型A(N54 WT亚型A)和亚型B(NL4-3 WT亚型B)的抗HIV-1活性的图；(B)在CEM-GXR细胞中递增浓度的GPS488(12a)针对野生型亚型A(N54 WT亚型A)和亚型BNL4-3 WT亚型B)的抗HIV-1活性的图。

图4：(A)对于三种单独的PBMC供体，不同浓度的GPS491(12c)针对HIV-1BaL病毒的抗病毒作用。(B)对于三种单独的PBMC供体，不同浓度的GPS491(12c)针对HIV-1IIIB病毒的抗病毒作用。在感染后11天，通过细胞培养基中的p24病毒蛋白的浓度确定病毒感染的水平。将三种PBMC供体细胞标记为PBMC-HD01、HD02和HD03。

图5：(A)对于三种单独的PBMC供体，不同浓度的GPS488(12a)针对HIV-1BaL病毒的抗病毒作用。(B)对于三种单独的PBMC供体，不同浓度的GPS488(12a)针对HIV-1IIIB病毒的抗病毒作用。在感染后11天，通过细胞培养基中的p24病毒蛋白的浓度确定病毒感染的水平。将三种PBMC供体细胞标记为PBMC-HD01、HD02和HD03。

图6：(A)显示对来自用HIV-1BaL病毒感染的三种单独供体的PBMC作为对照的依曲他滨(FTC)的抗病毒作用；(B)显示对来自用HIV-1IIIB病毒感染的三个单独供体的PBMC作为对照的依曲他滨(FTC)的抗病毒作用。在感染后11天，通过细胞培养基中的p24病毒蛋白的浓度确定病毒感染的水平，其中将三种PBMC供体细胞标记为PBMC-HD01、HD02和HD03。

图7：(A)评估与不同浓度的GPS491(12c)孵育1、4、7或11天后的存活率；(B)评估与不同浓度的GPS488(12a)孵育1、4、7或11天后的PBMC存活率；(C)评估与FTC孵育4、7或11天后的PBMC存活率；(D)评估与不同浓度的GPS519(12e)孵育4、7或11天后的PBMC存活率。通过Guava ViaCount测定(来自3种PBMC供体的数据)测量存活率数据。

图8：(A)GPS488(12a)针对多药耐药性临床分离物的抗HIV-1活性的图；E00443RTI对应于(N)NRTI耐药性分离物，而2948PI对应于PI耐药性分离物。(B)GPS488(12a)针对多药耐药性临床分离物的抗HIV-1活性的图；11845INI耐药性对应于INI-耐药性分离物，而MVCres entry对应于马拉韦罗耐药性R5毒株。

图9：显示GPS491(12c)针对多药耐药性临床分离物的抗HIV-1活性的一系列图；E00443RTI对应于(N)NRTI耐药性分离物，而2918PI对应于PI耐药性分离物。(N)NRTI耐药性分离物和PI耐药性分离物。(B)显示GPS491(12c)针对多药耐药性临床分离物的抗HIV-1活性的一系列图；INI耐药性分离物，MVC耐药性R5毒株。

图10:(A)显示用于产生主要HIV mRNA的供体和受体剪接位点的图谱(SS-单剪接；US-未剪接；MS-多剪接)。(B)显示来自HeLa B2细胞的定量RT-qPCR测定，所述HeLa B2细胞用不同浓度的GPS491(14c)处理或未处理(DMSO(-)Dox)或用作为阳性对照的强力霉素((+)Dox DMSO)处理以在HeLa B2细胞中诱导原病毒。误差条表示标准偏差，并且(*)表示P<0.001。N＝3。(C)显示来自用10μM的GPS化合物(GPS389(5a)、GPS428(5c)、GPS440(8a))或1.25μM GPS491(12c)处理或未处理(无)或用作为阳性对照的强力霉素(Dox)处理的HeLa-HIV细胞的终点RT-qPCR测定。将GPS431作为来自文库的无活性化合物包括在测定中用于比较。

图11:显示GPS491(12c)降低B2 HeLa细胞中的病毒蛋白水平。(A)用相对于强力霉素阳性对照的平均蛋白水平(Gag、Env和Tat)以图形形式显示蛋白质印迹数据，误差条是标准偏差。(*)表示P<0.001，N＝3。将HeLa细胞B2暴露于强力霉素^TM(Dox)或仅用DMSO保持未处理，并暴露于递增浓度的具有强力霉素的GPS491(250nm至2.5μM)。将相对Gag、Env和Tat水平归一化至总蛋白上样对照。使用BioRad^TM免染凝胶系统定量总蛋白水平。(B)显示将Tat蛋白水平归一化至通过在Hela细胞B2中的蛋白质印迹而获得的GAPDH上样对照，所述HeLa细胞B2暴露于Dox或仅用DMSO保持未处理并暴露于不同浓度的具有Dox的GPS491(12c)(250nm至2.5μM)。使用Dox在HeLa B2细胞中诱导原病毒。

图12：显示递增浓度的选定GPS化合物(GPS428(5c)、GPS440(8a)、GPS491(12c))对HeLa HIVΔmls rtA细胞中HIV-1蛋白表达的影响，其中将HeLa HIV-1细胞用DMSO或测试化合物处理4小时，然后与强力霉素(dox)孵育24小时以诱导原病毒表达，然后收获细胞用于病毒蛋白，并且评估病毒蛋白水平。(A)显示通过HIVGag(p24)ELISA评估的HIV Gag(GFP)的相对表达。(B)显示暴露于递增浓度的GPS428(5c)、GPS440(8a)、GPS491(12c)、GPS431的HeLa HIV-1细胞的由阿尔玛蓝评估的相对细胞存活率，所述GPS431是来自文库的无活性化合物，其被包括在测定中用于比较。

图13：GPS 491(12c)改变了选定SR蛋白的表达和磷酸化。用DMSO或GPS491+强力霉素处理HeLa rtTA HIVΔmls细胞24小时。然后将细胞收获在含有磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中，并将裂解物在StainFree SDS-PAGE凝胶上分级。(A)显示了每种SR蛋白的代表性蛋白质印迹，其中总结了来自三个独立样品组的蛋白质印迹，测量了GPS491相对于DMSO处理的细胞对SR蛋白水平的影响。(B)将细胞裂解物模拟处理或用碱性磷酸酶(PPase)处理，然后加载到免染细胞上。在转移到PVDF上之后，对印迹进行SRSF4探测。印迹代表n>3的独立测定。

图14：(A)GPS 491(12c)抑制A549细胞中的腺病毒(Ad5)复制。T0(虚线)是在1小时吸附期后立即收获的样品以测量接种物的残余病毒。数据点代表一式两份样本的平均值。误差条代表三个实验的标准偏差。(B)在递增浓度的化合物下，GPS491(12c)在A549细胞中诱导最小毒性。

图15：(A)在感染后8小时、16小时和24小时，在RIPA缓冲液中收获用2.5μM的GPS491(12c)化合物或DMSO处理的HAdV-C5感染的A549细胞，以检查六邻体蛋白表达。(B)用单独的DMSO、2.5μM的GPS 491(12c)化合物或未感染的对照处理HAdV-C5感染的A549细胞，并且在感染后8小时用4％PFA固定，并且通过细胞的免疫荧光成像分析，并且染色以检测腺病毒六邻体或E1A蛋白。(C)在感染后8小时和16小时，在RIPA缓冲液中收获HAdV-C5感染的A549细胞，以检测E1A蛋白表达。

图16：(A)显示描绘Bcl-x pre-mRNA和Bcl-x小基因x2.13以及用于RT-PCR的引物的位置的图；(B)用10μM的GPS488处理的293细胞，其共转染了携带Bcl-x小基因x2.13的质粒和含有驱动任一myc、SRSF2、SRSF3、SRSF4、Tra2a、Tra2b、SRSF10或SRSF7表达的CMV启动子的质粒；(C)显示对应于(B)中的直方图的RT-PCR数据，显示xS和xL转录物剪接变体的相对丰度。

图17：(A)用10μM的GPS491(12c)处理的293细胞，其共转染了携带Bcl-x小基因x2.13的质粒和含有驱动任一myc、SRSF2、SRSF3、SRSF4、Tra2a、Tra2b、SRSF10或SRSF7表达的CMV启动子的质粒；(B)显示对应于(A)中的直方图的RT-PCR数据，显示xS和xL转录物剪接变体的相对丰度。

图18：(A)显示Bcl-x ENDO构建体的图谱，其具有用于检测xL和xS剪接变体转录物的引物。(B)用10μM的GPS491(12c)化合物处理用Bcl-X endo报道基因和SRSF10构建体共转染的293细胞显示xS剪接变体转录物的产生中的变化。(C)用20μM的GPS491(12c)化合物处理用Bcl-X endo报道基因和SRSF10构建体共转染的293细胞显示xS剪接变体转录物的产生中的变化。

图19：与DMSO对照相比，添加10μM的GPS488(12a)(A)或10μM的GPS491(12c)(B)不改变由SRSF1或SRSF9的过度表达诱导的剪接位点使用的变化。

图20：(A)显示描绘产生13S、12S或9S剪接变体的E1A RNA加工事件的图谱，其中箭头显示引物的位置，(B)用HAdV-C5感染A549细胞1小时，然后用单独的DMSO、2.5μM的GPS491(12c)化合物或5μM的GPS491(12c)化合物处理HAdV-C5感染的A549细胞。在感染后8小时、16小时和24小时，通过RT-PCR分析E1A RNA同种型(13S、12S和9S)的水平。(C)用单独的DMSO、2.5μM的GPS491(12c)化合物处理的HAdV-C5感染的A549细胞，并且在感染后0小时、16小时、20小时和24小时，分析病毒DNA复制水平。

图21：(A)显示了冠状病毒亚科成员的概述和实验测定设计，以研究GPS491(12c)化合物对用229E冠状病毒(α冠状病毒属)和OC43冠状病毒(β冠状病毒属)感染的Huh7细胞的影响；(B)显示RT-qPCR结果，显示用229E冠状病毒(灰条)或OC43冠状病毒(影线条)感染的Huh7细胞的病毒RNA水平(灰条)。还显示通过免疫荧光(229E S蛋白显示为黑条，OC43 N蛋白显示为白条)定量感染细胞中的病毒蛋白；以及(C)显示用递增浓度的GPS491(12c)化合物处理对229E病毒RNA(菱形、黑线)和病毒刺突蛋白水平(圆圈、黑线)的剂量响应效应。Huh7细胞(右侧y轴)的细胞存活率(灰线、圆圈)通过阿尔玛蓝测定。(D)显示从用229E冠状病毒或OC43冠状病毒感染，随后用不同剂量的GPS491(12c)化合物处理的Huh7细胞释放到培养基中的病毒RNA水平的RT-qPCR结果，显示的数据来自一式两份地进行的2个独立的测定；(E)显示与未感染的Huh7细胞对照相比，来自用DMSO或递增浓度的GPS491(12c)化合物处理的SARS-CoV2感染的Huh7细胞的N蛋白和S蛋白的表达的免疫荧光结果，显示的数据来自一式三份地进行的一个实验；(F)显示从用SARS-CoV2感染，随后用递增剂量的GPS491(12c)化合物处理的Huh7细胞释放到培养基中的病毒RNA水平的RT-qPCR结果，显示的数据来自一式三份地进行的一个实验。

具体实施方式

当结合附图阅读时，将更好地理解以下的详细描述。为了说明本发明，附图例示出本发明的实施方案。然而，本发明不限于所示的精确布置、实例和手段。

本文未直接定义的任何术语应被理解为具有在本发明领域内理解的通常相关的含义。

本领域技术人员应理解，COOH和NR₂可以分别包括相应的离子，例如羧酸根离子和铵离子。替代地，在显示离子的情况下，本领域技术人员应理解，也可以存在反离子。

本领域技术人员应理解，如本文所述的部分与化合物的共价连接点可以例如但不限于在特定条件下裂解。特定条件可以包括，例如但不限于，体内酶促或非酶促方式。部分的裂解可以，例如但不限于，自发地发生，或者它可以被催化，由其它试剂或者物理参数或环境参数(例如酶、光、酸、温度或pH)的变化诱导。该部分可以是，例如但不限于，用于遮盖官能团的保护基团，用作一种或多种主动或被动转运机制的底物的基团，或者用于赋予或增强化合物性质(例如，溶解度、生物利用度或局域化)的基团。

在一些实施方案中，如本文所述的化合物可用于治疗病毒感染。替代地，如本文所述的化合物可用于干扰病毒RNA加工，包括剪接、聚腺苷酸化和向细胞质的输出。替代地，可适用于治疗HIV AIDS的化合物。

如本文所述的化合物可以呈游离形式或其盐的形式。在一些实施方案中，如本文所述的化合物可以是本领域已知的药物可接受的盐的形式(Berge S.M.等人，J.Pharm.Sci.(1977)66(1):1-19)。如本文所用的药物可接受的盐包括例如具有母体化合物的所需药理学活性的盐(保留母体化合物的生物有效性和/或性质并且在生物学和/或其它方面不是不希望的盐)。本文所述的具有一个或多个能够形成盐的官能团的化合物可以例如形成药物可接受的盐。含有一个或多个碱性官能团的化合物能够与例如药物可接受的有机或无机酸形成药物可接受的盐。药物可接受的盐可以衍生自，例如但不限于，乙酸、己二酸、海藻酸、天冬氨酸、抗坏血酸、苯甲酸、苯磺酸、丁酸、肉桂酸、柠檬酸、樟脑酸、樟脑磺酸、环戊烷丙酸、二乙基乙酸、二葡糖酸、十二烷基磺酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、葡庚酸、葡糖酸、甘油磷酸、乙醇酸、半磺酸、庚酸、己酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、2-羟基乙磺酸、异烟酸、乳酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、对甲苯磺酸、烟酸、硝酸、草酸、扑酸、果胶酸、3-苯基丙酸、磷酸、苦味酸、庚二酸、新戊酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、琥珀酸、硫酸、氨基磺酸、酒石酸、硫氰酸或十一烷酸。含有一个或多个酸性官能团的化合物可以能够与药物可接受的碱形成药物可接受的盐，所述碱例如但不限于基于碱金属或碱土金属的无机碱或者诸如伯胺化合物、仲胺化合物、叔胺化合物、季铵化合物、取代的胺、天然存在的取代的胺、环胺或碱性离子交换树脂的有机碱。药物可接受的盐可以衍生自例如但不限于诸如铵、钠、钾、锂、钙、镁、铁、锌、铜、锰或铝的药物可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，氨、苄星、葡甲胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、异丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、普鲁卡因、N-乙基哌啶、可可碱、四甲基铵化合物、四乙基铵化合物、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、吗啉、N-甲基吗啉、N-乙基吗啉、二环己胺、二苄胺、N,N-二苄基苯乙胺、1-二苯羟甲胺、N,N'-二苄基乙二胺或多胺树脂。在一些实施方案中，如本文所述的化合物可以含有酸性和碱性基团，并且可以呈内盐或两性离子的形式，例如但不限于甜菜碱。如本文所述的盐可以通过本领域技术人员已知的常规方法制备，例如但不限于，通过使游离形式与有机酸或无机酸或碱反应，或通过与其它盐的阴离子交换或阳离子交换。本领域技术人员应理解，盐的制备可以在化合物的分离和纯化期间原位进行，或者盐的制备可以通过使分离和纯化的化合物单独反应来进行。

在一些实施方案中，如本文所述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、多晶型物、异构形式)可以呈溶剂加成形式，例如溶剂化物。溶剂化物含有与化合物或其盐物理缔合的化学计量或非化学计量量的溶剂。溶剂可以是，例如但不限于，药物可接受的溶剂。例如，当溶剂是水时形成水合物，或者当溶剂是醇时形成醇化物。

在一些实施方案中，如本文所述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、溶剂化物、异构形式)可以包括结晶和无定形形式，例如多晶型物、假多晶型物、构象多晶型物、无定形形式或其组合。多晶型物包括化合物的相同元素组成的不同晶体堆积排列。多晶型物通常具有不同的X-射线衍射图、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光学和电学性质、稳定性和/或溶解性。本领域技术人员应理解，包括重结晶溶剂、结晶速率和储存温度的各种因素可以导致单晶形式占优势。

在一些实施方案中，如本文所述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、溶剂化物、多晶型物)包括异构体，例如几何异构体、基于不对称碳的光学异构体、立体异构体、互变异构体、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、外消旋体、非对映异构体混合物及其组合，并且不受为方便起见而例示的式的描述所限制。

在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物可以包含此类化合物的盐，优选药物或生理可接受的盐。药物制剂将通常包含一种或多种制剂给药方式可接受的载体、赋形剂或稀释剂，无论是通过注射、吸入、局部给药、灌洗或适于所选治疗的其它方式。合适的载体、赋形剂或稀释剂(本文可互换使用)是本领域已知的用于此类给药模式的那些。

合适的药物组合物可以通过本领域已知的方法以及它们的给药方式和由熟练的从业者确定的剂量来配制。对于肠胃外给药，可以将化合物溶于无菌水或盐水或用于施用非水溶性化合物的药物可接受的媒介物，例如用于维生素K的那些。对于肠内给药，可以将化合物以片剂、胶囊剂或溶解成液体形式给药。片剂或胶囊剂可以是肠溶包衣的，或呈用于持续释放的制剂。许多合适的制剂是已知的，包括包封待释放的化合物的聚合物或蛋白质微粒、软膏、糊剂、凝胶、水凝胶或可用于局部或局部施用化合物的溶液。持续释放贴剂或植入物可用于在延长的时间段内提供释放。本领域技术人员已知的许多技术描述于Remington:the Science&Practice of Pharmacy by Alfonso Gennaro，第20版,Lippencott Williams&Wilkins,(2000)。用于肠胃外给药的制剂可以例如含有赋形剂、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油或氢化萘。生物相容的可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。用于调节化合物的其它潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。用于吸入的制剂可以含有赋形剂，例如乳糖，或者可以是含有例如聚氧乙烯9月桂基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或者可以是用于以滴鼻剂形式或凝胶形式给药的油性溶液。

如本文所述或用于如本文所述的用途的化合物或药物组合物可以通过诸如植入物、移植物、假体、支架等的医疗装置或器具施用。此外，可以设计旨在包含和释放此类化合物或组合物的植入物。实例是由适于在一定时间段内释放化合物的聚合材料制成的植入物。

如本文所述的药物组合物的“有效量”包括治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是指在需要的剂量和时间段下有效实现所需治疗结果(例如减小肿瘤大小、增加寿命或增加预期寿命)的量。化合物的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及化合物在个体中引起所需反应的能力等因素而变化。可以调节剂量方案以提供最佳治疗反应。治疗有效量也是其中化合物的治疗有益作用超过任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”是指在需要的剂量和时间段下有效实现所需预防结果(例如较小的肿瘤、增加的寿命、增加的预期寿命或预防前列腺癌发展成雄激素非依赖性型)的量。通常，在疾病之前或在疾病的早期阶段，在个体中使用预防剂量，使得预防有效量可以小于治疗有效量。

应注意，剂量值可以随需要减缓的病况的严重程度而变化。对于任何特定的个体，可以根据个体需要和施用或指导组合物的施用的人员的专业判断随时间调整具体的剂量方案。本文阐述的剂量范围仅是示例性的，并不限制医学从业者可以选择的剂量范围。组合物中的活性化合物的量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而变化。可以调节剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可以施用单次推注，可以在一定时间内施用几个分开的剂量，或者可以如治疗情况的紧急程度所示成比例地减少或增加剂量。将肠胃外组合物配制成剂量单位形式可能是有利的，以便于给药和剂量的均一性。

通常，应使用如本文所述的化合物而不引起大量毒性。如本文所述的化合物的毒性可以使用标准技术测定，例如，通过在细胞培养物或实验动物中测试并测定治疗指数，即LD₅₀(群体的50％致死的剂量)与LD₁₀₀(群体的100％致死的剂量)之间的比率。然而，在一些情况下，例如在严重疾病的情况下，施用大量过量的组合物可能是合适的。如本文所述的一些化合物可以在一些浓度下是毒性的。滴定研究可用于测定毒性和无毒浓度。如果化合物对其它组织有任何影响，动物研究可用于提供指示。

如本文所述的化合物可以施用于个体。如本文所用，“个体”可以是人、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等。个体可能被怀疑或有风险患有病毒感染，例如HIV AIDS和腺病毒感染。替代地，感染可以是冠状病毒感染。用于各种病毒感染的诊断方法是本领域普通技术人员已知的。

本文描述了各种替代实施方案和实施例。这些实施方案和实施例是说明性的并且不应被解释为限制本发明的范围。

材料和方法

细胞系和病毒

指示细胞系CEM-GXR获得自Dr.Mark Brockman(Simon Fraser University)。(N)NRTI-耐药性病毒(E00443)获得自Dr.Zabrina Brumme(Simon Fraser University)。HIV-1CXCR4-tropic实验室适应株NL4-3和IIIB、HIV-1CCR5-tropic BaL、整合酶抑制剂耐药性病毒(cat.#.11845)、蛋白酶抑制剂耐药性病毒(cat.#.2948)和HIV-1亚型A(cat.#.4114)通过美国国立卫生院艾滋病研究和参考试剂项目，AIDS、NIAID、NIH部门(NIH AIDSResearch and Reference reagent program,Division of AIDS,NIAID,NIH)获得。腺病毒C5(HAdV-C5)和A549细胞获得自Dr.M.Brown(University of Toronto)。冠状病毒毒株229E和OC43、HEK293和Huh7细胞系获得自ATCC。先前描述了HeLa B2细胞(HeLa rtTA HIV-1Δmls)(Wong,Balachandran等人，2011)。

化合物的合成和表征

所有化学品均购自Sigma-Aldrich^TM或Oakwood Chemicals^TM，并且除非提及，否则它们无需纯化即可使用。所有溶剂干燥并保持在N₂下。¹H、¹³C和¹⁹F NMR光谱分别在400、100和400MHz下在Bruker AC 400Ultrashield^TM 10分光光度计上记录。化学位移以ppm(δ标度)表示。当报告峰多重性时，使用以下缩写：s(单峰),d(双峰),dd(双重双峰),ddd(双重双重双峰),t(三峰)td(双重三峰),q(四峰),m(多峰)。偶合常数以Hz报告。在ThermoScientific^TM Q Exactive Orbitrap^TM高分辨率质谱仪上记录所有高分辨率质谱。快速柱色谱使用硅胶(Silicycle^TM、Siliaflash^TM F60、40-63μm、230-400目)或在BiotageIsolera^TM纯化系统(PartnerTechAtvidaberg^TM AB)上使用预填充硅胶柱(Biotage^TM，产品型号FSKO-1107-0010、FSKO-1107-0025或FSKO-1107-0050)进行。

抗HIV-1测定

化合物的抗HIV活性通过基于CEM-GXR细胞的人T-细胞报告基因测定来测量。由于HIV-1感染后tat依赖性启动子的活化，这些细胞表达GFP，并且使用流式细胞仪分析(guavaSoft 2.2^TM软件，Guava HT8,Millipore^TM)监测感染的水平。在测量在含有1％HIV-1感染(GFP阳性)细胞的CEM-GXR细胞的共培养物中HIV-1扩散的抑制的测定中评价抗病毒活性。在含有连续稀释的测试化合物的96孔板中进行感染，并且在第3天测定半数有效浓度(EC₅₀)。

PBMC和感染HIV

遵循书面知情同意书，外周血单核细胞(PBMC)获得自健康HIV阴性供体，并且维持在补充有50U/mL人IL-2的R10+中。研究方案由英国哥伦比亚大学普罗维登斯医疗保健研究所的机构审查委员会批准。用5μg/ml PHA活化PBMC，3天后用病毒储备液以0.01的感染复数(MOI)感染。在感染后6小时，洗涤细胞，并在作为对照化合物的GPS分子或FTC的存在下，在补充有50U/ml的IL-2的R10+培养基中再悬浮11天。在第11天，使用酶联免疫吸附测定(ELISA；使用Xpress Bio^TM)对培养上清液中量化p24Gag的积累，并将p24Gag值的增加用作病毒复制的量度。

腺病毒感染测定

将A549细胞以500,000个细胞/孔的密度接种在6孔板中，并在接种后24小时以100-400μl的HAdV-C5的输入MOI进行感染。在37℃下吸附1小时后，去除接种物并更换为含有DMSO或GPS491的培养基。在感染后24小时一起收获细胞和培养基，用于HEK293细胞的终点稀释以定量感染性病毒的产生。阿尔玛蓝(Alamar Blue)^TM测定用于测定GPS491化合物对A549细胞的毒性。在96孔板中接种后24小时，用GPS491化合物或作为对照的DMSO处理A549细胞，持续24小时孵育期。根据制造商的指示通过阿尔玛蓝^TM测量细胞代谢率。通过台盼蓝排阻测试测量细胞存活率；用2mM EDTA抬起细胞，并与等体积的0.3％台盼蓝混合。用含有10个栅格的塑料一次性血细胞计数器计数细胞；超过95％的细胞不含染料。将代谢率和存活率与作为对照的DMSO处理的细胞进行比较。所有三个子图中的误差条代表三个实验的标准偏差。

腺病毒蛋白表达检测

根据制造商的方案，通过10％无染色凝胶分析蛋白质裂解物(McDonald等人，2008)，并使用Bio-Rad TurboBlot^TM系统转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。E1A和六邻体印迹在室温下用稀释在0.05％Tween20的1×PBS(PBS-T)中的5％脱脂牛奶封闭1小时，然后与第一抗体在4℃孵育过夜。在三次PBS-T洗涤后，将膜与第二抗体在室温下孵育1小时。对于E1A分析，用多克隆E1A第一抗体(Santa Cruz^TM,sc-430)和与辣根过氧化物酶缀合的第二抗兔抗体(HRP，在PBS-T中使用1:5000稀释)探测印迹。对于六邻体分析，用来自2Hx-2细胞的未稀释的培养液探测印迹，所述培养液含有小鼠抗六邻体抗体和与辣根过氧化物酶缀合的第二抗小鼠抗体(在PBS-T中1:5000稀释)。对于病毒蛋白的免疫荧光检测，将细胞用4％多聚甲醛固定15分钟，用0.1％Triton X-100的PBS(PBT)透化，然后在室温下用5％牛血清白蛋白(BSA)的PBT(BSA-PBT)封闭45分钟。将细胞与第一抗体在37℃孵育45分钟，用PBS洗涤三次，然后与第二抗体孵育45分钟。将染色的盖玻片用PBT洗涤两次并用PBS洗涤两次，然后固定在含有0.25μg/mL的DAPI(4',6'-二脒基-2-苯基吲哚)的PBS中，并在4℃下储存。

ViaCount存活率测定

根据制造商(Guava Technologies^TM,Inc.,Hayward,CA,USA)的使用手册，用GuavaeasyCyte 8HT^TM流式细胞分析仪进行ViaCount^TM测定。简而言之，在不存在或存在各种浓度的化合物的情况下，将CEM-GXR细胞以80000个细胞/孔接种在96孔板中。在24小时后，将25μL的细胞悬浮液与225μL的Guava ViaCount^TM试剂混合，并将混合物在室温下孵育5分钟。使用ViaCount^TM软件模块选择EasyFit^TM分析特征进行样品采集和数据分析。

化合物对HeLa B2细胞中通过qRT-PCR的HIV转录物的选择性剪接的影响

如前所述，使用位于内含子或位于外显子/内含子连接侧翼的三组不同引物进行定量RT-PCR分析以监测HIV基因组表达(US、SS、MS引物对)(Duffy 2012)。

GPS491化合物对A549细胞中通过RT-PCR的E1A转录物的选择性剪接的影响

用腺病毒-C5以100的MOI感染A549细胞1小时，之后去除病毒并更换为含有DMSO或GPS491(2.5μM或5μM)的培养基。在病毒感染后8小时、16小时或24小时提取总RNA。在cDNA产生后，使用E1A特异性引物进行RT-PCR。

GPS491化合物对A549细胞中的腺病毒DNA复制的影响

对于腺病毒DNA分析，将细胞以1×10⁶个细胞/板的密度接种在6cm板上。第二天，用HAdV-C5(MOI 100)感染细胞1小时，去除接种物并更换为含有DMSO或GPS491(2.5μM)的培养基。在感染后的指定时间，收集细胞并在1×PBS中洗涤。使用200μL裂解缓冲液(10mMTris-HCl[pH 8.0],75mM NaCl,0.1％SDS,0.5％NP-40,0.5％Tween 20,0.5mg/ml蛋白酶K)在56℃下裂解细胞4至5小时，并将混合物煮沸15分钟。样品以13000x g离心并收集上清液。同时处理来自给定实验的所有样品。如前在Grosso F.等人，(2017).J Virol.91(3):e01623-16中详述通过qPCR测定腺病毒DNA水平。

冠状病毒感染测定

用冠状病毒的229E(MOI 0.1)或OC43(MOI 1)毒株感染Huh7细胞。在37℃下吸附1小时后，去除接种物并更换为含有DMSO或10μM GPS491的培养基。在2天(229E感染的细胞)或4天(OC43感染的细胞)后，收获培养基用于通过RT-qPCR定量病毒RNA，并固定感染的细胞以通过免疫荧光显微镜测量病毒蛋白(229E的刺突蛋白和OC43的核衣壳蛋白)的存在。为了测量GPS491对229E冠状病毒的剂量反应效果，用229E以0.1的M.O.I感染Huh7细胞1小时。去除病毒接种物并加入含有1％DMSO或不同剂量的GPS491的新鲜培养基。在2天后，收获培养基以定量病毒RNA细胞，固定细胞并通过免疫荧光测量229E S表达。所有值相对于在单独用DMSO处理的病毒感染样品中检测到的值表示。在一些实验中，用229E、OC43或SARS-COV2毒株以1的MOI感染Huh7细胞。用病毒感染细胞1小时，然后去除培养基，并更换为含有递增浓度的DMSO或GPS491的培养基。在感染后4天(OC43)或2天(229E、SARS-CoV2)，收获培养基以测量病毒RNA的水平，在SARS-CoV2的情况下，固定细胞并染色以通过免疫荧光显微镜检测病毒抗原(N和S蛋白)。

化合物对HeLa B2细胞中病毒蛋白水平和HeLa B2细胞中SR蛋白水平的影响

在DMSO或指定浓度的GPS491的存在下孵育HeLa B2细胞，并通过添加2μg/ml强力霉素诱导原病毒表达。在处理24小时后，将细胞收获在1×PBS,2mM EDTA中，并将细胞沉淀物重悬于RIPA缓冲液中。使用针对HIV-1Gag(抗p24)、Env(抗gp120)或Tat的抗体通过蛋白质印迹检测蛋白质水平。为了评估对SR蛋白表达的影响，将细胞收获在含有磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中，并将裂解物在StainFree^TM SDS-PAGE凝胶上分级。蛋白质印迹用以下中的一种或多种抗体探测：小鼠α-SRSF1(Life Technologies^TM,Cat:32-4500)、兔α-SRSF2(BDPharmingen^TM,Cat:556363)、小鼠α-SRSF3(Life Technologies^TM,Cat:33-4200)、兔α-SRSF4(Novus Biologicals^TM,Cat:2-04144)、兔α-SRSF5(MBL,RN082PW)、兔α-SRSF6(NovusBiologicals^TM,Cat:NBP2-04142)、兔α-SRSF7(Abcam^TM,Cat:ab137247)、以及兔α-SRSF9(MBL,Cat:RN081PW)、兔α-Tra2β(Abcam^TM,Cat:ab31353)和兔α-GAPDH(Sigma^TM,Cat:G9545)。使用以下第二抗体：α-小鼠、辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的IgG(JacksonImmunoresearch Laboratories^TM,Cat:715-036-150)或α-兔、HRP-缀合的IgG(JacksonImmunoresearch Laboratories^TM,Cat:711-036-152)。为了测试蛋白质迁移的变化是否归因于改变的磷酸化，在跑胶之前用λ磷酸酶(New England Biolabs,Cat:P0753S)处理提取物。用适当的第二抗体孵育后，通过ECL(Perkin-Elmer)、ECL Plus(Perkin-Elmer)或Clarity Western ECL底物(BioRad)显现印迹。用BioRad ChemiDoc成像系统对化学荧光进行成像。随后检测印迹的微管蛋白或GAPDH作为上样对照。使用ImageLab软件对检测条带的相对强度进行定量，并将其归一化为上样对照(GAPDH、微管蛋白或总蛋白)的相应条带。

反应方案和实验程序

1.由5-硝基噻吩-2-甲酸2制备二杂芳基酰胺5a-1：化合物5a-1的合成涉及5-硝基噻吩-2-甲酸2(本身可通过82％的醛1的重铬酸盐氧化获得)通过与TFFH-CsF反应转化成酰基氟3，并且该中间体与必需的N-TMS取代的2-氨基苯并噻唑4a-1在TBAF的存在下反应(Zamiri和Grierson 2017)。由于它们在己烷中的溶解度，分离酰基氟2与氟化反应副产物N,N,N,N-四甲基脲的1:1的混合物。然而，由于使用乙腈作为偶联步骤的溶剂有利于所需酰胺产物5a-i的沉淀，因此通过简单的真空过滤容易地将非极性脲污染物和其它杂质与目标酰胺分离。除了化合物5b(其分离需要进一步的柱色谱操作)之外，真空过滤足以获得纯度>95％的酰胺5a和5c-1。

方案1

反应方案1.试剂和条件：i)K₂Cr₂O₇,5N H₂SO₄,100℃,2小时；ii)TFFH,CsF,MeCN,r.t.,12小时；iii)MeCN,TBAF(cat),50℃,12小时。

制备5-硝基噻吩-2-甲酸2：

向重铬酸钾(2.8g，11.5mmol)的5N H₂SO₄(40mL)搅拌溶液中添加5-硝基-2-噻吩甲醛1(4g，25.5mmol)，并且在100℃下反应小时。然后将混合物在冰浴中冷却并用水(40mL)稀释。通过抽滤收集所得沉淀，用冰水(5×20mL)洗涤，并在高真空下干燥，得到呈绿色固体的2(3.6g，20.8mmol，82％产率)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝13.9(s,1H),8.12(d,J＝4.1Hz,1H),7.74(d,J＝4.1Hz,1H)。

制备5-硝基噻吩-2-碳酰氟3

将噻吩-2-甲酸2(800mg，4.64mmol)、TFFH(1.22g，4.64mmol)和CsF(1.36g，8.96mmol)的MeCN(24mL)混合物在室温下搅拌12小时。然后将产物混合物在减压下浓缩，溶解在己烷中并过滤以去除铯盐。浓缩滤液，得到淡黄色油状物，将其在高真空下干燥5小时。基于其¹H NMR光谱，分离的物质对应于酰基氟3和1,1,3,3-四甲基脲副产物的1:1混合物。还观察到痕量的未鉴定材料的峰。估计产物混合物含有714mg(4.08mmol，88％转化率)的酰基氟3。

¹H NMR(400MHz,CD₃CN):δ＝8.01(m,1H),7.94(m,1H),2.73(s,12H,NMe)。

¹⁹F NMR(400MHz,CD₃CN):δ＝23.74^；19F NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝25.55。

用于制备N-TS-胺4a-1的一般程序

N-三甲基甲硅烷基化的胺4a-1通过其相应的杂芳香族胺前体(0.5mmol)(在使用前在高真空下干燥12小时)在纯TMSCN(0.5mL)中在氮气下在70℃下搅拌指定的时间的反应来制备。在高真空下去除过量的TMSCN，并且将衍生的N-甲硅烷基化胺不经纯化用于酰胺键形成反应。每种胺向其N-甲硅烷基化衍生物的转化百分比通过在CDCl₃中的¹H NMR分析(在使用前通过碱性氧化铝柱)测定。

4-氯-N-(三甲基甲硅烷基)苯并[d]噻唑-2-胺(4a)

由4-氯苯并[d]噻唑-2-胺制备。加热30分钟(黄色油状物；100％转化率)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝7.37(d,J＝7.7Hz,1H),7.23(d,J＝7.8Hz,1H),6.92(t,J＝7.7Hz,1H),5.22(s,1H),0.30(s,9H)。

6-(三氟甲氧基)-N-(三甲基甲硅烷基)苯并[d]噻唑-2-胺(4b)

加热14小时；棕色油状物；95％转化率。

1H NMR(CD3CN):δ＝7.59(d,4J＝2.2Hz,1H),7.43(d,3J＝8.8Hz,1H),7.16–7.19(dd,3J＝8.6Hz,4J＝2.4Hz,1H),5.97(s,1H),0.33(s,9H)。

6-硝基-N-(三甲基甲硅烷基)苯并[d]噻唑-2-胺(4c)

由6-硝基苯并[d]噻唑-2-胺制备。加热12小时；黄色油状物；100％转化率。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝8.41(s,1H),8.11(d,J＝9.0Hz,1H),7.46(d,J＝8.9Hz,1H),5.28(s,1H),0.34(s,9H)。

6-氯-N-(三甲基甲硅烷基)苯并[d]噻唑-2-胺(4d)

加热14小时；灰白色固体；100％转化率。

1H NMR(CD3CN):δ＝7.62(d,4J＝2.2Hz,1H),7.36(d,3J＝8.5Hz,1H),7.21–7.24(dd,3J＝8.4Hz,4J＝2.1Hz,1H),5.94(s,1H),0.32(s,9H)。

4,6-二氯-N,N-双(三甲基甲硅烷基)苯并[d]噻唑-2-胺(4e)

加热12小时；橘色油状物；100％转化率。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝7.36(d,J＝2.1Hz,1H),7.24(d,J＝2.0Hz,1H),5.16(s,1H),0.31(s,18H)。

5-溴-N-(三甲基甲硅烷基)苯并[d]噻唑-2-胺(4f)

加热14小时；白色固体；95％转化率。

1H NMR(CD₃CN):δ＝7.58(d,4J＝2.0Hz,1H),7.52(d,3J＝8.4Hz,1H),7.18–7.21(dd,3J＝8.3Hz,4J＝2.0Hz,1H),6.03(s,1H),0.32(s,9H)。

N-(三甲基甲硅烷基)苯并[d]噻唑-2-胺(4g)

由苯并[d]噻唑-2-胺制备。加热30分钟(黄色油状物；100％转化率)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝7.41(s,2H),7.13(s,1H),6.93(s,1H),4.91(s,1H),0.21(s,9H)。

6-(三氟甲基)-N-(三甲基甲硅烷基)苯并[d]噻唑-2-胺(4h)

加热14小时；棕色油状物；100％转化率。

1H NMR(CD₃CN):δ＝7.96(d,4J＝1.8Hz,1H),7.54–7.56(dd,3J＝8.5Hz,4J＝1.8Hz,1H),7.47(d,3J＝8.2Hz,1H),6.13(s,1H),0.34(s,9H)。

2-((三甲基甲硅烷基)氨基)苯并[d]噻唑-6-甲酸乙酯(4i)

加热12小时；棕色固体；100％转化率。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝8.22(s,1H),7.92(d,J＝7.2Hz,1H),7.46(d,J＝7.4Hz,1H),5.29(bs,1H),4.30(bs,2H),1.33(bs,3H),0.31(s,9H)。

6-氟-N-(三甲基甲硅烷基)苯并[d]噻唑-2-胺(4j)

加热14小时；白色固体；95％转化率。

1H NMR(CD₃CN):δ＝7.36–7.41(m,2H),7.00–7.05(ddd,3J＝9.4Hz,3J＝8.9Hz,4J＝2.6Hz,1H),5.84(s,1H),0.32(s,9H)。

6-溴-N-(三甲基甲硅烷基)苯并[d]噻唑-2-胺(4k)

加热14小时；白色固体；95％转化率。

1H NMR(CD₃CN):δ＝7.75(d,4J＝2.0Hz,1H),7.35–7.38(dd,3J＝8.3Hz,4J＝2.0Hz,1H),7.30(d,3J＝8.5Hz,1H),5.95(s,1H),0.32(s,9H)。

6-(甲基磺酰基)-N-(三甲基甲硅烷基)苯并[d]噻唑-2-胺(4l)

加热20小时；棕色固体；100％转化率。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝8.10(s,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,1H),7.55(d,J＝8.0Hz,1H),5.42(s,1H),3.01(s,3H),0.32(s,9H)。

经由N-TMS胺4a-1与5-硝基噻吩-2-羰基氟3的偶联来制备二(杂)芳基酰胺5a-5l的一般程序：

对于偶联实验，将含有4.08mmol的3的酰基氟3-脲混合物溶解在MeCN(6mL)中。然后该储备溶液(含有179mg,1.02mmol,1.28当量的3)的将等分试样(1.5mL)加入到一系列反应容器中，每个反应容器含有不同的TMS-胺4(0.8mmol)。随后快速地向每个反应容器中加入1M TBAF的THF(10μL，0.01mmol)。将所得混合物在50℃下搅拌12小时。从反应中沉淀出所需的酰胺产物5a-I，并且除了5b之外，通过简单的真空过滤分离纯的酰胺产物。

N-(4-氯苯并[d]噻唑-2-基)-5-硝基噻吩-2-甲酰胺(5a):

由N-TMS胺4a。将沉淀的产物用MeCN洗涤，然后用己烷洗涤，得到为黄色固体的5a；40％(108mg，0.32mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.73(s,1H),8.32(d,J＝4.2Hz,1H),8.20(d,J＝4.2Hz,1H),8.02(d,J＝8.0Hz,1H),7.57(d,J＝7.8Hz,1H),7.34(t,J＝7.9Hz,1H)。

¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝154.7,133.3,130.6,130.2,126.5,124.9,121.0(少了5个碳)。

DEPT 135NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝130.6,130.2,126.5,124.9,121.0

HRMS(HESI):m/z[M-H]^-C₁₂H₅ClN₃O₃S₂的计算值：337.94663；实测值：337.94647。

5-硝基-N-(6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-基)噻吩-2-甲酰胺(5b):

由N-TMS胺4b。通过快速柱色谱(EtOAc/MeOH 9:1)进一步纯化沉淀的产物以去除少量杂质。获得为黄色固体的化合物5b；22％(70mg，0.18mmol)。

¹H NMR(400Mhz,丙酮-d₆):δ＝8.19(d,J＝4.2Hz,1H),8.11(d,J＝4.3Hz,1H),8.04(s,1H),7.83(d,J＝8.8Hz,1H),7.45(d,J＝8.8Hz,1H)。

¹³C NMR(100Mhz,丙酮-d₆):δ＝162.4,162.3,156.1,146.2,145.7,144.7,133.3,130.7,130.2,121.6(q,J＝255.0Hz),121.3,116.0。

¹⁹F NMR(400Mhz,丙酮-d₆):δ＝-58.86。

5-硝基-N-(6-硝基苯并[d]噻唑-2-基)噻吩-2-甲酰胺(5c):

由N-TMS胺4c。将沉淀的产物用MeCN洗涤，然后用己烷洗涤，得到为黄色固体的5c；45％(126mg，0.36mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.91(s,1H),9.07(s,1H),8.30(dd,J＝2.4,9.0Hz,1H),8.22(m,2H),7.90(dd,J＝8.8Hz,1H)。

¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝154.6,143.3,130.8,130.2,122.2,119.4,(少了6个碳)。

DEPT 90NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝130.8,130.2,122.2,119.4。

HRMS(HESI):m/z[M-H]^-C₁₂H₅N₄O₅S₂的计算值：348.97068；实测值：348.97015。

N-(6-氯苯并[d]噻唑-2-基)-5-硝基噻吩-2-甲酰胺(5d):

由N-TMS胺4d。将沉淀的产物用MeCN洗涤，然后用己烷洗涤，得到为黄色固体的5d；80％(218mg，0.64mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.60(s,1H),8.13-8.18(m,3H),7.70-7.72(m,1H),7.50(dd,J＝2.21,8.59Hz,1H)。

¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝154.3,130.3,130.2,128.2,128.0,127.0,121.9,(少了5个碳)。

DEPT 90NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝130.3,130.2,127.0,121.9。

N-(4,6-二氯苯并[d]噻唑-2-基)-5-硝基噻吩-2-甲酰胺(5e):

由4e。将沉淀的产物用MeCN洗涤，然后用己烷洗涤，得到为青黄色固体的5e；70％(210mg，0.56mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.82(s,1H),8.15-8.38(m,3H),7.72(s,1H)。

N-(5-溴苯并[d]噻唑-2-基)-5-硝基噻吩-2-甲酰胺(5f):

由4f。将沉淀的产物用MeCN洗涤，然后用己烷洗涤，得到为黄色固体的5f；54％(164mg，0.43mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.66(s,1H),8.17-8.21(m,2H),8.01(d,J＝8.4Hz,1H),7.93(s,1H),7.52(dd,J＝2.1,8.5Hz,1H)。

¹³C DEPT90 NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝130.2,126.6,124.0。

N-(苯并[d]噻唑-2-基)-5-硝基噻吩-2-甲酰胺(5g):

由4g。将沉淀的产物用MeCN洗涤，然后用己烷洗涤，得到为黄色固体的5g；55％(133mg，0.44mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.61(s,1H),7.98-8.18(m,3H),7.69(s,1H),7.49(t,J＝7.6Hz,1H),7.36(t,J＝7.6Hz,1H)。

¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝154.0,130.2,130.1,126.9,124.1,122.4,(少了6个碳)。

DEPT 135NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝130.2,130.1,126.8,124.1,122.4。

5-硝基-N-(6-(三氟甲基)苯并[d]噻唑-2-基)噻吩-2-甲酰胺(5h):

由4h。将沉淀的产物用MeCN洗涤，然后用己烷洗涤，得到为黄色固体的5h；60％(180mg，0.48mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.77(s,1H),8.51(s,1H),8.18(d,J＝4.2Hz,1H),8.16(bs,1H),7.88(m,1H),7.78(dd,J＝8.6,1.7Hz,1H)。

¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝154.4,130.5,130.2,128.5,125.8,124.5(q,J＝270.4Hz),124.2(q,J＝32.1Hz),123.4,120.3,(少了4个碳)。

DEPT 90NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝130.5,130.2,123.4,120.3。

¹⁹F NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝-59.62。

2-(5-硝基噻吩-2-甲酰胺基)苯并[d]噻唑-6-甲酸乙酯(5i):

由4i。将沉淀的产物用MeCN洗涤，然后用己烷洗涤，得到为青黄色固体的5i；88％(264mg，0.70mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.72(s,1H),8.60(s,1H),8.00-8.16(m,3H),7.75(m,1H),4.32(q,J＝7.1Hz,2H),1.34(t,J＝7.1Hz,3H)。

¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝165.3,154.2,130.4,130.2,127.6,125.3,124.1,60.9,14.2,(少了6个碳)。

DEPT 135NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝130.4,130.1,127.6,124.1,60.9,14.2。

N-(6-氟苯并[d]噻唑-2-基)-5-硝基噻吩-2-甲酰胺(5j)

由4j。将沉淀的产物用MeCN洗涤，然后用己烷洗涤，得到为黄色固体的5j；79％(205mg，0.63mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.55(s,1H),8.10-8.18(m,2H),7.92(dd,J＝2.7,8.7Hz,1H),7.74(bs,1H),7.33(td,J＝2.8,9.1Hz,1H)。

¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝168.3,160.1,157.7,154.3,147.4,130.3,130.2,114.9,114.7,108.5,(少了2个碳)。

DEPT 90NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝130.3,130.2,114.9,114.7。

¹⁹F NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝-117.57。

N-(6-溴苯并[d]噻唑-2-基)-5-硝基噻吩-2-甲酰胺(5k)

由4k。将沉淀的产物用MeCN洗涤，然后用己烷洗涤，得到为黄色固体的5k；45％(138mg，0.36mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.60(s,1H),8.18-8.28(m,3H),7.60-7.6(m,2H)。

¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝154.3,130.4,130.2,129.7,124.7,116.1,(少了6个碳)。

DEPT 135NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝130.3,130.2,129.6,124.7。

N-(6-(甲基磺酰基)苯并[d]噻唑-2-基)-5-硝基噻吩-2-甲酰胺(5l–GPS427)

由4l。将沉淀的产物用MeCN洗涤，然后用己烷洗涤，得到为黄色固体的5l；74％(226mg，0.59mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.84(s,1H),8.69(s,1H),8.22(m,2H),8.00(dd,J＝1.8,8.5Hz,1H),7.95(d,J＝8.2Hz,1H),3.26(s,3H)。

¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝154.5,135.9,130.6,130.2,125.4,122.5,44.0,(少了6个碳)。

DEPT 135NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝130.6,130.2,125.4,122.5。

2.由5-三氟甲基噻吩-2-甲酸制备酰胺8a-c:为了获得目标酰胺8a-c，改进制备化合物5a-i的方法，使得N-TMS胺4a、4b和4h与原位生成的酰基氟7反应。此外，在该“一锅”操作中，反应介质中CsF的存在消除了加入TBAF引发偶联反应的需要。

方案2

试剂和条件：i))TFFH,CsF,MeCN,r.t.,12小时；iii)MeCN,TBAF(cat),50℃,12小时。

N-(4-氯苯并[d]噻唑-2-基)-5-(三氟甲基)噻吩-2-甲酰胺(8a):

将5-三氟甲基噻吩-2-甲酸6a(115mg，0.6mmol)、TFFH(160mg，0.6mmol)和CsF(160mg，1.05mmol)的MeCN(3mL)混合物在室温下搅拌12小时。向含有原位产生的酰基氟7a的混合物中加入TMS-胺4a(0.4mmol)的MeCN(3mL)溶液。将得到的混合物在50℃下搅拌48小时。然后将其在减压下浓缩，并且将获得的固体进行硅胶快速柱色谱(0-100％EtOAc/Hex)，得到66％的为浅粉色固体的8a(95mg，0.26mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.62(s,1H),8.40(s,1H),8.02(d,J＝7.9Hz,1H),7.90(d,J＝4.1Hz,1H),7.57(d,J＝7.8Hz,1H),7.34(t,J＝7.9Hz,1H)。

¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝159.7,159.2,145.4,141.2,134.7(q,J＝37.8Hz),133.3,131.3,126.4,124.8,124.6,121.9(q,J＝271.2Hz),121.0,(少了一个碳)。

DEPT 135 ¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝131.3,126.4,124.8,121.0。

¹⁹F NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝-54.73。

N-(6-硝基苯并[d]噻唑-2-基)-5-(三氟甲基)噻吩-2-甲酰胺(8b):

将甲酸6a(115mg，0.6mmol)、TFFH(160mg，0.6mmol)和CsF(300mg，2.00mmol)在MeCN(3mL)中的混合物在室温下搅拌12小时。向含有原位产生的酰基氟7a的混合物中加入TMS-胺4b(0.4mmol)的MeCN(3mL)溶液。将得到的混合物在50℃下搅拌48小时。然后将其在减压下浓缩，并且将获得的固体进行硅胶快速柱色谱(Hex/EtOAc 7:3)，得到16％的为浅黄色固体的8b(23.5mg，0.06mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.78(s,1H),9.10(s,1H),8.30-8.34(m,2H),7.91-7.94(m,2H)。

¹⁹F NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝-54.73。

5-(三氟甲基)-N-(6-(三氟甲基)苯并[d]噻唑-2-基)噻吩-2-甲酰胺(8c):

将甲酸6(115mg，0.6mmol)、TFFH(160mg，0.6mmol)和CsF(500mg，3.30mmol)在MeCN(3mL)中的混合物在室温下搅拌12小时。向含有原位产生的酰基氟7的混合物中加入TMS-胺4h(0.4mmol)的MeCN(3mL)溶液。将得到的混合物在50℃下搅拌48小时。然后将其在减压下浓缩，并且将获得的固体进行硅胶快速柱色谱(Hex/EtOAc 7:3)，得到48％的为浅黄色固体的8c(76mg，0.19mmol)。

¹H NMR(400Mhz,丙酮-d₆):δ＝8.43(bs,1H),8.30(dt,J＝1.4,4.0Hz,1H),7.93(d,J＝8.6Hz,1H),7.79(m,2H)。

¹³C NMR(100Mhz,丙酮-d₆):δ＝162.7,161.6,150.9,142.7,136.8(q,J＝38.2Hz),133.1,131.5,131.3(q,J＝3.6Hz),126.1(q,J＝32.7Hz),125.6(q,J＝271.2Hz),124.1(q,J＝3.1Hz),123.0(q,J＝271.2Hz),121.4,120.5(q,J＝3.9Hz)。

DEPT 135¹³C NMR(100Mhz,丙酮-d₆):δ＝131.5,131.3(q,J＝3.6Hz),124.1(q,J＝3.1Hz),121.4,120.5(q,J＝3.9Hz)。

¹⁹F NMR(400Mhz,丙酮-d₆):δ＝-56.74,-61.64。

5-((6-硝基苯并[d]噻唑-2-基)氨基甲酰基)噻吩-2-甲酸甲酯(8d)

将5-(甲氧基羰基)噻吩-2-甲酸6a(111.6mg，0.6mmol)、TFFH(160mg，0.6mmol)和CsF(160mg，1.05mmol)在MeCN(3mL)中的混合物在室温下搅拌12小时。在室温下将原位产生的酰基氟7b(0.6mmol)一次性加入到含有纯的4b(0.7mmol)的反应容器中。随后快速地加入在THF(10μL，0.01mmol)中的1M TBAF。将反应混合物在50℃下搅拌48小时。通过抽滤分离沉淀的产物并用MeCN和己烷洗涤。获得为非常浅的绿色固体的化合物8d(195mg，77％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.68(s,1H),9.09(s,1H),8.30(m,2H),7.91-7.93(m,2H),3.88(s,3H)。

5-氰基-N-(6-(三氟甲基)苯并[d]噻唑-2-基)噻吩-2-甲酰胺(8e)

将甲酸6c(153mg，1.0mmol)、TFFH(264mg，1.0mmol)和CsF(230mg，1.5mmol)在MeCN(3mL)中的混合物在室温下搅拌24小时。向含有原位产生的酰基氟7c的混合物中加入TMS-胺4c(145mg，0.67mmol)的MeCN(3mL)溶液。将得到的混合物在50℃下搅拌48小时。然后将其在减压下浓缩，并且将获得的固体进行硅胶快速柱色谱(100％EtOAc)，得到54％的为白色固体的8e(127mg，0.36mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.67(s,1H),8.53(s,1H),8.27(bs,1H),8.09(d,J＝3.8Hz,1H),7.90(bs,1H),7.79(dd,J＝8.3Hz,1H)。

DEPT 135 ¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝139.9,131.1,123.3,120.2。

N-(4-氯苯并[d]噻唑-2-基)-5-氰基噻吩-2-甲酰胺(8f)

将甲酸6c(153mg，1.0mmol)、TFFH(264mg，1.0mmol)和CsF(230mg，1.5mmol)在MeCN(3mL)中的混合物在室温下搅拌24小时。向含有原位产生的酰基氟7c的混合物中加入TMS-胺4a(123mg，0.67mmol)的MeCN(3mL)溶液。将得到的混合物在50℃下搅拌48小时。然后将其在减压下浓缩，并且将获得的固体进行硅胶快速柱色谱(使用EtOAc)，得到56％的为黄色固体的8f(120mg，0.375mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.62(s,1H),8.40(d,J＝3.4Hz,1H),8.09(d,J＝3.8Hz,1H),8.02(d,J＝7.8Hz,1H),7.57(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(dd,J＝7.6,8.2Hz,1H)。

¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝159.3,159.1,145.3,143.6,139.9,133.2,131.1,126.4,124.8,124.6,120.9,114.1,113.6。

DEPT 135 ¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝139.9,131.1,126.4,124.8,120.9。

3.从2-三氟甲基噻唑-5-甲酸制备酰胺12a-c:用于制备酰胺8a-c的方案进一步用于获得基于2-三氟甲基噻唑的酰胺12a-c。

方案3

试剂和条件：i)LiOH,THF/H₂O(5-3),r.t.,2.5小时；ii)TFFH,CsF,MeCN,r.t.,12小时；iii)MeCN,TBAF(cat),50℃,12小时。

2-(三氟甲基)噻唑-5-甲酸(10):

将乙酯9(0.97g，4.31mmol)和LiOH(220mg，9.17mmol)在THF/H₂O(5-3)(80mL)中的混合物在室温下搅拌2.5小时。然后使用浓HCl将混合物酸化至pH 1。将混合物用CH₂CL₂萃取，并将水层用CH₂CL₂(4X，20mL)洗涤。将合并的有机层经Na₂SO₄干燥、过滤并浓缩，获得93％的为黄色固体的10(790mg，4.01mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.61(s,1H)。

¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝161.1,157.5(q,J＝40.0Hz),148.3,135.6,119.2(q,J＝272.6Hz)。

¹⁹F NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝-60.66。

N-(4-氯苯并[d]噻唑-2-基)-2-(三氟甲基)噻唑-5-甲酰胺(12a):

将甲酸10(300mg，1.5mmol)、TFFH(400mg，1.5mmol)和CsF(340mg，2.25mmol)在MeCN(8mL)中的混合物在室温下搅拌12小时。向含有原位产生的酰基氟11的混合物中加入TMS-胺4a(1mmol)的MeCN(8mL)溶液。将得到的混合物在50℃下搅拌12小时。然后将其在减压下浓缩，并且将获得的固体进行硅胶快速柱色谱(Hex/EtOAc 7:3)，得到58％的为白色固体的12a(210mg，0.58mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.84(s,1H),9.10(s,1H),8.03(d,J＝7.9Hz,1H),7.58(d,J＝7.7Hz,1H),7.36(t,J＝7.9Hz,1H)。

¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝159.0,158.6,158.0(q,J＝40.0Hz),146.5,145.3,137.9,133.2,126.5,125.0,124.6,121.0,119.2(q,J＝273.3Hz)。

DEPT 135¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝146.5,126.5,125.0,121.1。

¹⁹F NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝-60.57。

N-(6-硝基苯并[d]噻唑-2-基)-2-(三氟甲基)噻唑-5-甲酰胺(12b):

将甲酸10(267mg，1.35mmol)、TFFH(362mg，1.37mmol)和CsF(500mg，3.31mmol)在MeCN(6mL)中的混合物在室温下搅拌27小时。向含有原位产生的酰基氟的混合物中加入TMS-胺4c(0.85mmol)的MeCN(6mL)溶液。将得到的混合物在50℃下搅拌48小时。然后将其在减压下浓缩，得到119％的为黄色固体的纯形式的12b(380mg，1.01mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝11.84(s,1H),8.67(d,J＝2.5Hz,1H),8.41(s,1H),8.11(dd,J＝2.5,8.9Hz,1H),7.55(d,J＝8.9Hz,1H)。

¹⁹F NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝-60.24

2-(三氟甲基)-N-(6-(三氟甲基)苯并[d]噻唑-2-基)噻唑-5-甲酰胺

(12c):

将甲酸10(250mg，1.27mmol)、TFFH(340mg，1.28mmol)和CsF(600mg，3.95mmol)的MeCN(6mL)混合物在室温下搅拌12小时。向含有原位产生的酰基氟11的混合物中加入TMS-胺4h(0.85mmol)的MeCN(6mL)溶液。将得到的混合物在50℃下搅拌12小时。然后将其在减压下浓缩，并且将获得的固体进行硅胶快速柱色谱(100％EtOAc)，然后在EtOAc中重结晶，得到55％的为白色固体的12c(184mg，0.46mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.87(s,1H),8.95(s,1H),8.52(s,1H),7.89(d,J＝8.2Hz,1H),7.78(d,J＝8.7Hz,1H)。

¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝157.7(q,J＝40.1Hz),146.5,138.7,131.1,124.5(q,J＝272.7Hz),124.2(q,J＝32.1Hz),123.5(2XCH),120.3,119.2(q,J＝271.9Hz),(少了3个碳)。

DEPT 135¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝146.5,123.5,120.3.s

¹⁹F NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝-60.59,-59.63。

4.制备N-(6-氨基苯并[d]噻唑-2-基)-2-(三氟甲基)噻唑-5-甲酰胺(12d)以及其向N-(6-叠氮基苯并[d]噻唑-2-基)-2-(三氟甲基)噻唑-5-甲酰胺(12e)的转化率:

反应方案：试剂和条件：i)SnCl₂,SnCl₄,HCl,r.t.,4小时；ii)NaNO₂,HCl,NaN₃,H₂O,0℃,2h,r.t.,1小时

N-(6-氨基苯并[d]噻唑-2-基)-2-(三氟甲基)噻唑-5-甲酰胺(12d)

将N-(6-硝基苯并[d]噻唑-2-基)-2-(三氟甲基)噻唑-5-甲酰胺12b(377mg，1mmol)加入到1M SnCl₄在DCM(1.75mL，1.75mmol)和浓HCl(0.9mL)中的冷却溶液中。将所得溶液在0℃下搅拌10分钟，然后在0℃下滴加SnCl₂(682mg，3.6mmol在0.5mL浓HCl中)(历时30分钟)。将所得混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌45分钟。然后将反应混合物用Et₂O稀释并过滤。使分离的产物通过短硅胶柱并使用100％MeOH作为洗脱剂。浓缩分离的产物后，将其溶解在EtOAc中，然后用H₂O洗涤，得到12d，产率28％(95mg，0.28mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.97(bs,1H),8.03(s,1H),7.83(bs,1H),7.46(dd,J＝2.1,8.6Hz,1H)

¹⁹F NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝-60.44

N-(6-叠氮基苯并[d]噻唑-2-基)-2-(三氟甲基)噻唑-5-甲酰胺(12e)

将N-(6-氨基苯并[d]噻唑-2-基)-2-(三氟甲基)噻唑-5-甲酰胺(12d)(75mg，0.20mmol)溶解在2.36N盐酸(0.7mL)中并在冰浴中冷却至0℃。向该搅拌的混合物中加入NaNO₂(16mg，40mmol)的1.1mL水溶液并在室温下搅拌30分钟。之后，用乙酸钠将反应混合物逐渐中和至pH6.0-7.0。然后，逐渐加入叠氮化钠的水溶液(0.26mmol的1.1mL水溶液)，并将混合物在-5℃下搅拌30分钟。然后将反应混合物用EtOAc(4.5mL)稀释并用EtOAc(5mL×3)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并减压浓缩。将分离的粗产物通过柱色谱法(100％EtOAc)纯化，得到12e，产率3％(3mg，0.008mmol)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝13.68(s,1H),8.94(bs,1H),7.89(s,1H),7.75(bs,1H),7.23(dd,J＝2.5,8.6Hz,1H)

¹⁹F NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝-60.51

实施例

实施例1-基于5350150化合物的化合物文库的构建和评价。

符合以下通式的分子的所选实例是：

为了确定5350150中的中心双键被酰胺交换是否会对生物活性具有负面影响，以及如果具有负面影响，右侧上的什么替代基序将恢复活性，使用酰氟-TMS胺缩合方案制备5350150-酰胺类似物的探索性文库。

如前所述，使用基于细胞的筛选进行该文库的抗HIV活性的初步评价(Cheung,Horhant等人，2016)。简而言之，CEM-GXR细胞是永生化的CD4+T淋巴细胞系，其由于HIV-1感染后tat依赖性启动子的活化而表达GFP(Brockman,Tanzi等人，2006)。在测定开始时(第0天)，通过与1％HIV-1NL4-3感染的(GFP阳性)细胞共培养来感染报道CEM-GXR细胞。在感染细胞接种后立即向每个微孔板孔中的培养物中加入不同浓度的来自所述文库的各化合物的DMSO溶液。最终文库化合物浓度范围为1.25-10μM，并且最终DMSO浓度小于0.1％。在第3天通过流式细胞术使用GFP表达作为读数测定培养物中感染细胞的百分比。在图1A和图1B中报道了选择一系列化合物所确定的结果。

如图1A和图1B所示，发现12个在“右侧”具有官能化的苯并噻唑-2-胺基序的5350150酰胺类似物具有抗HIV活性。这些化合物中的8个5a(GPS389)、5b(GPS426)、5c(GPS428)、5d(GPS475)、5e(GPS476)、5f(GPS478)和5h(GPS484)在初级文库筛选中显示出显著的活性。其它四个基于苯并噻唑的化合物：未取代的苯并噻唑5g(GPS445)、6-氟化合物5j(GPS474)、6-溴化合物5k(GPS473)和6-甲基砜5i(GPS477)显示出中等至弱的抗HIV活性。

通过Guava ViaCount测定确定分子对CEM-GXR细胞存活率的潜在细胞毒性作用。该测定基于其对DNA结合染料的渗透性而区别性地染色活细胞和非活细胞，并使用正向散射(FSC)性质将游离核和细胞碎片与完整的细胞区分开来以定量细胞计数。CEM-GXR细胞与0.5至100μM的浓度的化合物孵育24小时。

6-OCF₃化合物5b(GPS426)、5e(GPS476)和5f(GPS478)在初步筛选中在5μM下显示出毒性(数据未示出)，而对于活性苯并异噻唑化合物5a(GPS389)、5c(GPS428)和5h(GPS484)以及其它活性较低的化合物可以确定毒性遵循活性和选择性指数(毒性/活性的比率)也是低的(数据未示出)。图2示出了从5350150酰胺类似物的文库中选择的化合物的抗HIV活性(柱状图)和针对CEM-GXR细胞的细胞毒性(线图)，其中GPS475(5d)(图2A)、GPS477(5i)(图2B)、GPS484(5h)(图2C)、GPS389(5a)(图2D)、GPS428(5c)(图2E)、GPS 472(8d)(图2F)、GPS504(8e)(图2G)和GPS505(8f)(图2H)作为代表苯并异噻唑化合物的活性化合物。

研究改善基于噻吩的5350150酰胺类似物的活性/毒性(选择性指数)比率的结构变化包括用R1＝H、Me、CF₃、CO₂H、CO₂Me和CN代替噻吩环上的硝基取代基。其中C-2取代基对应于H、Me和CF3的噻吩化合物分别由商购噻吩-2-甲酸、5-甲基噻吩-2-甲酸和5-三氟甲基噻吩甲酸制备。在噻吩环的C-2处具有甲酯官能团的5350150酰胺类似物8d通过将噻吩-2,5-二甲酸16转化为其二甲酯衍生物17，随后水解为单酯酸中间体18来制备(以下方案5)。为了由C-2氰基取代的噻吩-2-甲酸20获得化合物8e和8f，在肽偶联条件下通过与氨反应将单酯18转化成酰胺19，随后通过与POCl₃反应进行CONH₂->CN转化，随后水解酯官能团。

C-2CF₃取代的噻吩类似物8a(GPS440)(4-Cl苯并噻唑基序)、8b(GPS483)(6-硝基苯并噻唑单元)和8c(GPS485)(6-三氟甲基苯并噻唑基序)是最具活性的。然而，噻吩类似物8b(GPS483)和8c(GPS485)在低微摩尔浓度下显示出毒性。

方案5

试剂和条件：i))MeOH–HCl(satd)；ii)NaOHaq().5当量)；iii NH3,DMF,EDC；POCl3,然后NaOHaq。

通过噻唑基序代替5350150酰胺类似物8a-c中的噻吩环以及通过R1＝CF₃和CN代替C-2NO₂基团的研究分别产生化合物12a-f和13a-d的制备(实施例1)。C-2CF₃取代的噻唑化合物12a(GPS488)(4-Cl苯并噻唑单元)、12b(GPS506)(6-NO₂取代基)、12c(GPS491)(6-CF₃取代基)和12e(GPS519)(6-叠氮化物取代基)是该系列中最具活性的5350150酰胺类似物。

在噻唑系列中，研究了进一步的修饰，包括将悬垂的CH₂OMe侧链引入到2-三氟甲基噻唑环的C-4上，如在化合物15a-c(实施例1)中。这些化合物的必需噻唑前体是可商购的，并且可选地可以根据P.Peverallo等人欧洲专利申请3290417(2018)制备。

基于它们的细胞存活率分布，选择两种化合物12a(GPS488)和12c(GPS491)作为我们的先导化合物，用于更详细的生物学研究。

实施例2：T细胞系和PBMC中野生型HIV毒株的EC₅₀的计算。

鉴于抗HIV药物的抗病毒活性由于HIV-1亚型的遗传变异及其共受体的使用而可以显著变化，在使用不同HIV-1亚型和向性的病毒传播的抗HIV筛选测定中评价化合物GPS488(12a)和GPS491(12c)。在实验中，培养物含有最终浓度为100nM至10μM的分子GPS488(12a)和GPS491(12c)的连续稀释液，并且通过非线性回归使用GraphPad Prism^TM软件计算半最大有效浓度(EC₅₀)值。如图3A和图3B中所示，化合物GPS488(12a)和GPS491(12c)显示出抑制HIV-1IIIB(亚型B，X4-向性)和HIV-197USSN54(亚型A，R5-向性)的病毒复制和细胞间扩散的剂量依赖性能力，其中化合物GPS488(12a)(图3B)的EC₅₀为1290nM(WT-亚型B)和955nM(WT亚型A)，而化合物GPS491(12c)(图3A)的EC₅₀为248nM(WT-亚型B)和176nM(WT亚型A)。注意，在这些测定中，化合物GPS491(12c)比GPS488(12a)有效4.5倍。为了验证这些EC₅₀值，抗HIV药物恩曲他滨(FTC)被包括在抗HIV测定中作为阳性对照。测试最终浓度为1nM至10μM的FTC的连续稀释液，并测定EC₅₀值为33.69nM(WT亚型B)和26.28nM(WT亚型A)。

还在来自三个单独供体的外周血单核细胞中评价了GPS488(12a)和GPS491(12c)的抗病毒活性。如图4A和图4B中所示，当针对HIV-1Bal毒株进行测试时，GPS491(12c)表明EC50值为480nM、110nM和211nM，而当针对HIV-1IIIB毒株进行测试时，EC50值为655nM、962nM和921nM。GPS488(12a)化合物还在递增的剂量浓度下进行测试，以检测其在来自三个单独供体的外周血单核细胞中降低HIV感染性的能力。如图5A和图5B中所示，GPS488(12a)当针对HIV-1Bal毒株进行测试时，表现EC50值为335nM、44nM、200nM，而当针对HIV-1IIIB毒株进行测试时，EC50值为155nM、4275nM和3338nM。图6是抗HIV药物恩曲他滨(FTC)的EC50值，其被包括在内作为外周血单核细胞测定中的阳性对照。

为了研究GPS488(12a)、GPS491(12c)和GPS519(12e)对哺乳动物细胞是否表现出任何毒性，在11天期间内使用ViaCount测定在用递增浓度的化合物处理的PBMC中测量细胞存活率。如图7A至图7C中所示，与恩曲他滨(FTC)对照(在图7D中)相比，当细胞暴露在0.1-10μM范围中时，GPS488(12a)和GPS491(12c)显示出一些细胞毒性，但所有三种化合物仅在1μM下显示出最小毒性，并且GPS519(12e)在相同浓度范围内显示出最小的毒性。

实施例3：相对于对目前用于抗逆转录病毒疗法中的四类药物具有耐药性的HIV毒株的EC50的计算。

为了评估对耐药性毒株的能力，测试GPS488(12a)和GPS491(12c)对关键HIV-1毒株的抗逆转录病毒活性，所述关键HIV-1毒株对当前四种主要药物靶标类别((非)-核苷逆转录酶抑制剂(N)NRTI(RTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、整合酶抑制剂(INI)和CCR5共受体抑制剂(MVC))中的至少一种具有耐药性。

针对对NNRTI和NRTI的敏感性大大降低的分离物(E00443)评价化合物GPS488(12a)和GPS491(12c)。实际上，该分离物具有多种突变，包括广泛公认的NNRTI耐药性突变K103N，其赋予对依法韦仑^TM(EFV)和奈韦拉平^TM(NVP)的高水平耐药性。该病毒还携带NRTI-耐药性突变D67N、K70R、Y115F、Q151M、M184V和K219Q，其赋予对拉米夫定(3TC)、阿巴卡韦^TM(ABC)、齐多夫定^TM(AZT)和恩曲他滨^TM(FTC)的高水平耐药性。这种组合降低了对阿扎那韦^TM(ATV)和洛匹那韦^TM(LPV)(目前三种最常开处方的HIV蛋白酶抑制剂中的两种)的敏感性。在测定中，化合物GPS488(12a)和GPS491(12c)保持活性，EC50分别为1157nM和235nM(图8A、图9A)。化合物GPS488(12a)和化合物GPS491(12c)类似地保持其针对PI耐药性分离物(2948)的效力(EC50分别为1168nM和230nM)，所述分离物含有取代G48V和L90M(图8A和图9A)。

为了确定GPS488(12a)和GPS491(12c)是否靶向HIV-1整合酶，针对临床分离物(11845INI)进行测试，所述临床分离物具有G140S和Q148H取代，其将对雷特格韦^TM(RAL)和埃替格韦^TM(EVG)的易感性降低超过100-倍，并且将对度鲁特韦^TM(DTG)的易感性降低高达10-倍。如图8B和图9B中所示，针对11845临床分离物，GPS491(12c)产生了203nM的EC50并且GPS488(12a)产生了951nM的EC50。如图8B和图9B中所示，化合物GPS488(12a)和GPS491(12c)针对HIV-1毒株保持了活性(EC50分别为969nM和216nM)，所述HIV-1毒株对基于进入抑制剂的药物马拉韦罗^TM(MVC)具有耐药性。这种衍生自HIV-1BaL的R5毒株的马拉韦罗耐药性变体在包膜V3环内含有5个突变：A19T、L20F、T22A、E25D和I26V。

实施例4：GPS化合物对HIV转录物剪接和病毒蛋白翻译的影响

如图10A中所示，使用引物(US、SS和MS)，使用终点PCR和定量RT-PCR来监测化合物对HIV转录物的剪接的影响。如图10B中所示，相对于Hela B2细胞中的Dox对照，不同浓度的GPS491(12c)(2.5μM、1.0μM、500nM)导致US和SS转录物水平的降低。对于在HeLa rtTA-HV-δMls(图10C)中用GPS389(5a)、GPS428(5c)、GPS440(8a)、GPS445(5g)和GPS491(12c)处理的细胞，也观察到对US和SS转录物的产生的类似影响，其中GPS431被包括作为用于比较的无活性化合物。接着在Hela B2细胞中测定GPS化合物对病毒蛋白产生的影响。如图11中所示，在增加浓度的GPS491(12c)下观察到Env、Tat和Gag表达降低。图12A显示在具有Gag的HeLa细胞系(其中HIV-1原病毒由强力霉素表达)中，在增加化合物浓度时，GPS化合物的选择影响Gag表达。

实施例5：化合物GPS491和GPS488对宿主蛋白剪接因子表达/修饰的影响

为了确定GPS化合物是否显示对SR蛋白丰度或修饰的任何影响，在HeLa B2细胞中测量多种SR蛋白的水平。简而言之，在SDS-PAGE凝胶上分离用DMSO或GPS491处理24小时的来自HeLa rtTA HIVΔmls细胞的细胞裂解物，并通过蛋白质印迹检测各个因子。如图13(A)中所示，与GPS491(12c)2.5μM孵育选择性地改变SR蛋白丰度，将SRSF5和SRSF9两者的水平增加1.5倍，同时分别将SRSF4和SRSF6丰度降低20％和50％。观察到所检查的其它SR/SR相关因素水平的有限变化。然而，除了SR蛋白丰度的变化之外，我们还注意到SRSF4迁移的变化与其磷酸化程度的增加一致。为了解决这是否确实如此，在SDS-PAGE和蛋白质印迹之前，用或不用碱性磷酸酶处理细胞提取物。如图13(B)中所示，用磷酸酶(PPase)处理增加了所有样品的SRSF4迁移率，并消除了DMSO与GPS491处理的样品之间观察到的迁移率差异，这与由于磷酸化增加而导致的迁移率改变相一致。

为了进一步研究GPS化合物对SR蛋白的影响，我们测试了GPS488(12a)和GPS491(12c)是否影响在Bcl-x转录物的剪接中诱导变化的SR蛋白。简而言之，将表达SRSF2、SRSF3、SRSF4、TRA2a、TRA2b、SRSF7或SRSF10的质粒与X2.13 Bcl-x报告基因小基因(图16A中所示)共转染到293细胞中，并且在用10μM的GPS488(12a)或GPS491(12c)化合物或DMSO对照处理24小时后，通过RT-PCR测量Bcl-xL和Bcl-xS剪接变体转录物的水平。如图16B和图16C中所示，用GPS488(12a)化合物结合SRSF2的存在进行的处理导致Bcl-xS转录物剪接变体的丰度增加，而结合SRSF7蛋白的存在进行的处理导致Bcl-xS转录物剪接变体的丰度降低。如图17A和图17B中所示，用GPS491(12c)化合物结合SRSF10蛋白处理转染的293细胞导致Bcl-x-S剪接变体的减少。如图18中所示，当用10μM或20μM的GPS491(12c)化合物处理细胞时，在Bcl-X内切报告基因中证实了GPS491(12c)化合物对由SRSF10介导的剪接的作用。

已知SRSF1和SRSF9蛋白使Bcl-x剪接变化以利于Bcl-xL转录物变体。如图19中所示，添加10μM的GPS488(12a)(图19A)或10μM的GPS491(12c)(图19B)对Bcl-xL剪接变体的产生没有任何影响。

实施例6：GPS491化合物对腺病毒复制的影响。

如图14A中所示，测试GPS491(12c)化合物抑制A549细胞中腺病毒(Ad5)复制的能力。将Ad5-感染的细胞暴露于递增浓度的GPS491(0μM至20μM)，持续24小时孵育期，此时收集细胞/培养基以确定病毒滴度。GPS491(12c)化合物针对腺病毒的计算IC₅₀为1μM。如通过台盼蓝测试和阿尔玛蓝^TM测定所示，GPS491化合物在24小时期间对A549细胞系显示出最小的毒性(图14B)。接下来，研究GPS491(12c)化合物对腺病毒的病毒蛋白表达的影响。如图15中所示，GPS491(12c)化合物抑制六邻体蛋白的表达并延迟E1A蛋白的表达，如蛋白质印迹所示(图15A和图15C)。通过免疫荧光，GPS491(12c)也影响E1A病毒蛋白和六邻体蛋白的产生(图15B)。

为了评估E1A表达模式的改变是否可以归因于病毒RNA积累或剪接的改变，进行RT-PCR分析。E1A转录物是腺病毒感染后产生的第一种病毒RNA，可以通过交替剪接加工成三种不同的mRNA；指定为13S、12S和9S，如图20(A)所示。不同E1A RNA同种型的丰度在腺病毒感染过程中波动；13S和12S在感染后的早期占优势，而9S在后期是主要E1A RNA。如图20(B)中所示，与有利于产生9S RNA转录物的DMSO对照相比，用两种浓度的GPS491(12c)化合物处理细胞诱导了E1A转录物剪接的改变，这有利于产生13S RNA转录物。24小时内对E1ARNA的分析揭示了在GPS491的存在下E1A RNA积累的显著变化。早至感染后8小时，虽然13S和12S RNA在DMSO和GPS491处理的样品中都是主要的同种型，但GPS491的添加增加了13SRNA的相对丰度。在感染后的后期，虽然DMSO处理的细胞将E1A RNA积累改变为9S RNA，但GPS491处理显著增加13S RNA的优势，该同种型在感染后16小时代表所有E1A RNA的>90％。尽管E1A RNA加工的改变可以解释E1A蛋白表达的改变的动力学，但六邻体丧失的根据仍然不清楚。为了确定六邻体合成的丧失是否可以通过抑制病毒DNA合成来解释，使用qPCR来测量在DMSO或GPS491的存在下腺病毒基因组的丰度。如图20(C)中所示，与后期基因表达的丧失一致，添加GPS491将病毒DNA积累减少到与添加病毒后立即观察到的水平相当的水平。总之，这些观察结果表明GPS491影响病毒基因组复制所必需的腺病毒基因表达的早期事件。

实施例7：GPS491化合物对冠状病毒复制的影响。

GPS491抑制高度不相关的病毒如HIV-1和腺病毒的能力提出了这种化合物针对其复制不直接依赖于宿主RNA剪接机制的病毒，例如冠状病毒，是否具有活性的问题。作为复制周期限于细胞质的正链RNA病毒，对细胞剪接没有已知的依赖性。我们预期冠状病毒不受GPS491的影响。然而，与预期相反，测试GPS491对两种人季节性冠状病毒(229E和OC43)复制的影响显示出对两种病毒的显著抑制。如图21A中所示，测试GPS491(12c)化合物抑制Huh7细胞中冠状病毒α和β属成员复制的能力。将Huh7感染的细胞暴露于递增浓度的GPS491(0μM至20μM)，持续24小时孵育期，此时固定细胞以通过免疫荧光检测病毒蛋白水平并且收集培养基以通过RT-qPCR确定病毒滴度。如图21B中所示，添加GPS491(12c)化合物导致冠状病毒复制的显著降低，这通过细胞中229E刺突(S)/OC43核衣壳(N)蛋白表达的丧失和培养基中病毒基因组RNA的积累(指示病毒颗粒形成)来证明。如图21C和图21D中所示，剂量反应分析显示GPS491是229E和OC43病毒复制的高效抑制剂。对于229E冠状病毒，在Huh7细胞系中观察到GPS491(12c)化合物的EC₅₀为～250nM和50％细胞毒性浓度(CC₅₀)为10μM。如通过阿尔玛蓝测定所示，GPS491化合物在24小时期间对Huh7细胞系显示出最小的毒性(图21C)。还研究了用冠状病毒的SARS-CoV2毒株感染Huh7细胞。将Huh7细胞以1的输入MOI用SARS-CoV2感染1小时吸附期，随后替换补充有DMSO或不同浓度(0.1μM至10μM)的GPS491(12c)化合物的新培养基。在感染后两天，将细胞固定并染色以检测细胞内SARS-CoV2 N和S蛋白的存在，将其归一化至Hoechst^TM染色(图21E)，并收获上覆的培养基以通过RT-qPCR检测病毒RNA水平(图21F)。GPS491抑制几种冠状病毒(229E、OC43和SARS-CoV2)复制的能力表明可能依赖于受GPS491影响的宿主细胞组分。替代地，积累的证据表明SR激酶在病毒核衣壳(N)蛋白的功能中的作用。序列分析表明N蛋白内精氨酸-丝氨酸重复序列的高度保守区(类似于SR蛋白中的保守区)，其被宿主激酶(SRPK1、GSK-3)磷酸化是病毒复制所必需的。

尽管本文公开了本发明的各种实施方案，但根据本领域技术人员的公知常识，可以在本发明的范围内做出许多适应和修改。此类修改包括用已知的等同物替代本发明的任何方面，以便以基本上相同的方式获得相同的结果。数值范围包括限定所述范围的数字。单词“包括”在本文用作开放式术语，基本上等同于短语“包括但不限于”，并且单词“包含”具有相应的含义。如本文使用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述(the)”包括复数个参考物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种东西”包括多于一个的此类东西。本文引用的参考文献并非承认此类参考文献是本发明的实施方案的现有技术。本发明包括基本上如上文所述的并且参考实施例和附图的所有实施方案和变型。

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Claims

1.化合物，所述化合物具有式I的结构：

其中，

X¹选自S、O和N-J¹；

X²选自S、O和N-J²；

Z¹选自CH、N和CE；

Z²选自CH、N和CR⁴；

Z³选自CH、N和CR³；

E选自其中任选地一个或多个碳被N或O或两者取代的任选取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、任选取代的芳基、任选取代的吡啶、CH₂OH、CH₂CH₂OJ³和CH₂CH₂-Q，其中所述任选取代的烷基、芳基和吡啶具有一个或多个独立地被OH、CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃、CH₂CH(CH₃)CH₃、CH(CH₃)CH₃、OCH₃、OCH₂CH₃、OCH₂CH₂CH₃、OCH₂CH(CH₃)CH₃、OCH(CH₃)CH₃、CN、F、Cl、Br、I和CF₃取代的H原子；

T¹选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代并且其中一个或多个烷基氢任选地被J⁸取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂OJ⁴、CH₂CH₂OJ⁴、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁴、CONH(J⁴)、CON(J⁴)₂、NO₂、CN、CF₃、OCF₃、SO₂NH(J⁴)、SO₂N(J⁴)₂和NJ⁴J⁴；

T²选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代，并且其中一个或多个烷基氢任选地被J⁹取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、NO₂、CF₃、OCF₃、CN、CH₂OH、CH₂OJ⁵、CH₂CH₂OJ⁵、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁵、CONH(J⁵)、CON(J⁵)₂、SO₂NH(J⁵)、SO₂N(J⁵)₂和NJ⁵J⁵；

M选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代，并且其中一个或多个烷基氢任选地被J¹⁰取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OH、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、NHCH₂CH₂Q、NH(J⁶)、N(J⁶)₂、CH₂CH₂OJ⁶、CO₂J和CON(J⁶)₂；

Q选自

和

R¹选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OJ⁷、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷、SO₂N(J⁷)₂、NJ⁷J⁷和N₃；

R²选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OJ⁷、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷、SO₂N(J⁷)₂、NJ⁷J⁷和N₃；

J¹选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；

J²选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；

J³选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；

J⁴选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；

J⁵选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；

J⁶选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；

J⁷选自H、其中一个或多个烷基氢任选独立地被NH₂或NH取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基(2-4个碳的直链或支链烷基)、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN、NH₂、Q、OCF₃和CF₃；

J⁸选自1-4个碳的直链或支链烷基、1-4个碳的直链或支链O-烷基、OH、CH₂OH、CH₂OJ⁴、CH₂CH₂OJ⁴、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁴、CONH(J⁴)、CON(J⁴)₂、SO₂NH(J⁴)、SO₂N(J⁴)₂、NO₂、CN、NH₂、NJ⁴J⁴、F、CF₃和OCF₃；

J⁹选自1-4个碳的直链或支链烷基、1-4个碳的直链或支链O-烷基、OH、CH₂OH、CH₂OJ⁵、CH₂CH₂OJ⁵、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁵、CONH(J⁵)、CON(J⁵)₂、SO₂NH(J⁵)、SO₂N(J⁵)₂、NO₂、CN、NH₂、NJ⁵J⁵、F、CF₃和OCF₃；以及

J¹⁰选自1-4个碳的直链或支链烷基、1-4个碳的直链或支链O-烷基、OH、CH₂OH、CN、NH₂、NJ⁶J⁶和CF₃。

2.化合物，所述化合物具有式II的结构：

其中，

X¹选自S、O和N-J¹；

X²选自S、O和N-J²；

Z¹选自CH、N和CE；

T²选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代并且其中一个或多个烷基氢任选地被J⁹取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、NO₂、CF₃、OCF₃、CN、CH₂OH、CH₂OJ⁵、CH₂CH₂OJ⁵、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁵、CONH(J⁵)、CON(J⁵)₂、SO₂NH(J⁵)、SO₂N(J⁵)₂和NJ⁵J⁵；

M选自H、其中一个或多个烷基碳任选地被N或O或两者取代并且其中一个或多个烷基氢任选地被J¹⁰取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OH、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、NHCH₂CH₂Q、NH(J⁶)、N(J⁶)₂、CH₂CH₂OJ⁶、CO₂J和CON(J⁶)₂；

R¹选自H、其中一个或多个碳被N或O或两者取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OJ⁷、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷、SO₂N(J⁷)₂、NJ⁷J⁷和N₃；

R²选自H、其中一个或多个碳被N或O或两者取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OJ⁷、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷、SO₂N(J⁷)₂、NJ⁷J⁷和N₃；

R³选自H、其中一个或多个碳被N或O或两者取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OJ⁷、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷、SO₂N(J⁷)₂、NJ⁷J⁷和N₃；

R⁴选自H、其中一个或多个碳被N或O或两者取代的1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、CH₂CH₂OJ⁷、CH₂CH₂-Q、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷、SO₂N(J⁷)₂、NJ⁷J⁷和N₃；

J¹选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；

J²选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；

J³选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；

J⁴选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；

J⁵选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；

J⁶选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；

J⁷选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂CH₂OH、CH₂CH₂OMe、CN和CF₃，其中一个或多个烷基氢任选地被NH₂、NHJ¹⁰、Q、OCF₃和CF₃取代；

3.如权利要求1或2所述的化合物，其中

X¹选自S和O；

X²选自S和O；以及

Z¹选自CH和N。

4.如权利要求1、2或3所述的化合物，其中

T¹选自H或1-6个碳的直链、支链或环状烷基；以及

T²选自H、NO₂、CF₃ CN、或者1-6个碳的直链、支链或环状烷基。

5.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中M选自H或CH₃。

6.如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中

R¹选自H、CH₃、CO₂J⁷、CON(J⁷)₂、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃、SO₂J⁷和N₃；

R²选自H、CH₃、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃和N₃；

R³选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃和N₃；以及

R⁴选自H、1-6个碳的直链、支链或环状烷基、CH₂OH、NO₂、CN、F、Cl、Br、I、CF₃、OCF₃和N₃。

7.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中所述化合物选自以下中的一种或多种：

8.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中所述化合物选自以下中的一种或多种：

9.如权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中所述化合物是

10.用于治疗病毒感染的药物组合物，其包含权利要求1至9中任一项所述的化合物以及药物可接受的载体。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述病毒感染选自以下中的一种或多种：HIV和腺病毒。

12.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述病毒感染是冠状病毒感染。

13.权利要求1至9中任一项所述的化合物用于治疗病毒感染的用途。

14.权利要求1至9中任一项所述的化合物在制造用于治疗病毒感染的药物中的用途。

15.如权利要求13或14所述的用途，其中所述病毒感染选自以下中的一种或多种：HIV和腺病毒。

16.如权利要求13或14所述的用途，其中所述病毒感染是冠状病毒感染。

17.治疗病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的个体施用权利要求1至9中任一项所述的化合物或其药物组合物。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述病毒感染选自以下中的一种或多种：HIV和腺病毒。

19.如权利要求17所述的方法，其中所述病毒感染是冠状病毒感染。

20.用于治疗有需要的个体的病毒感染的权利要求1至9中任一项所述的化合物。