JP4121151B2

JP4121151B2 - 抗新生物薬および抗レトロウイルス薬として有用なアクリドンから誘導された化合物

Info

Publication number: JP4121151B2
Application number: JP53745697A
Authority: JP
Inventors: ミシェジャ，クリストファー・ジェイ; チョロディ，マレック・ダブリュー; ライス，ウィリアム・ジー; ターピン，ジェイムズ・エイ
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 1996-04-12
Filing date: 1997-04-09
Publication date: 2008-07-23
Anticipated expiration: 2017-04-09
Also published as: DE69709857T2; US6541483B2; DK0892801T3; US6187775B1; EP0892801B1; PT892801E; ES2171260T3; EP0892801A1; AU2815797A; DE69709857D1; JP2000508662A; AU725629B2; WO1997038999A1; US20010009914A1; ATE211471T1

Description

発明の分野
本発明は、アクリドンから誘導された化合物であるビスイミダゾアクリドン類、ビストリアゾロアクリドン類、ならびにイミダゾアクリドン部分およびトリアゾロアクリドン部分の両方を含むハイブリッド分子に関する。これらの化合物は抗新生物薬および抗レトロウイルス薬として有用である。
発明の背景
高い抗腫瘍活性を示す多数のアクリジン系化合物が最近報告された。Cholody W.M.ら（1990）は、５−［（アミノアルキル）アミノ］イミダゾ［４，５，１−ｄｅ］アクリジン−６−オンを新規な一群の抗新生物薬として記載している（J.Med.Chem.33:49-52（1990））。８−置換された５−［（アミノアルキル）アミノ］−６Ｈ−ｖ−トリアゾロ［４，５，１−ｄｅ］アクリジン−６−オンも有効な抗新生物薬として記載されている（J.Med.Chem.33:2852-2856（1990））。発色団修飾された抗新生物薬イミダゾアクリドンの合成、およびそれらがネズミ白血病に有効であることが記載されている（J.Med.Chem.35:378-382（1992））。Capps,D.B.らは、２−（アミノアルキル）−５−ニトロピラゾロ［３，４，５−ｋｌ］アクリドンを新規な一群の抗癌薬として記載している（J.Med.Chem.35:4770-4778（1992））。
上記の化合物は、共通の構造特色として（アミノアルキル）アミノ残基を含む側鎖１個を保有する四環式平面発色団をもつ。これらの化合物の主な標的はＤＮＡであり、それらはインターカレーションによりＤＮＡに結合すると考えられている。
アクリドンその他の平面状芳香族化合物がインターカレーションによりＤＮＡと相互作用しうることに基づいて、二官能性化合物も有効な抗腫瘍薬として研究されている。Chen,T.K.ら（1978）は、二官能性インターカレーターとしてジアクリジン類を研究した（J.Med.Chem.21:868-874（1978））。Gaugain,B.ら（1978）は、エチジウムホモ二量体およびアクリジンエチジウムヘテロ二量体の合成および立体配座特性につき記載している（Biochemistry 17:5071-5078（1978））。Sinha,B.K.ら（Biochemistry 17:5071-5078（1977））は、ビス（キナルジン）誘導体の合成および抗腫瘍性につき記載している（J.Med.Chem.20:1528-1531（1977））。Roques,B.P.ら（1979）は、ピリドカルバゾール二量体の抗白血病活性につき記載している（Biochem.Pharmacol 28:1811-1815（1979））。Pelaprat,D.ら（1980）は、７Ｈ−ピリドカルバゾール二量体を有効な抗腫瘍薬として記載している（J.Med.Chem.23:1336-1343（1980））。Brana,M.F.ら（1993）は、一群の抗腫瘍薬としてのビス−ナフタルイミドを記載している（Anti-Cancer Drug Design 8:257-268（1993））。
適切なリンカーにより連結した２つの芳香環系を含む二官能性インターカレーターが核酸に強く結合することに関して、論理的根拠が提唱された（Canellakis,E.S.,et al.,Biochem.Biophys.Acta 418:277-283（1976））。このような化合物はＤＮＡに高い親和性を示すが、このインターカレーションによるＤＮＡとの強い結合は一般に抗腫瘍活性とは無関係であることが見出された。
平面状発色団の物理化学的特性、連結鎖の性質（その長さ、堅固さ、およびイオン化状態）、結合位置、その他の要因を含めた多数の要因が、これらの化合物とＤＮＡの結合および生物学的作用に強く影響を与える。さらに、ＤＮＡ結合親和性と細胞毒性の間に直接的関係はないことが見出された。
二官能性インターカレーター群のインビボ抗腫瘍作用に関するそれらの構造−活性関係は依然として分からないので、そのような活性を示す構造を推定することができない。わずかな構造修飾がその薬剤の生物学的特性を著しく変化させる可能性がある。したがって、高い抗新生物活性、特に特定の腫瘍に選択的に向けられた活性をもつ他の化合物を見出すという目標がある。
特定のビスイミダゾアクリドン類、近縁のビストリアゾロアクリドン類、ならびにイミダゾアクリドン部分およびトリアゾロアクリドン部分の両方を含むハイブリッド分子が有効かつ選択的な抗腫瘍薬であることは、先に開示されている（米国特許第5,508,289号）。
本発明は、新規な一群のアクリジン系化合物、ならびに抗新生物薬および抗レトロウイルス薬としてのそれらの使用に関する。米国特許第5,508,289号に開示されるビスイミダゾアクリドン類、ビストリアゾロアクリドン類およびハイブリッド分子が抗レトロウイルス薬として有用であることがさらに見出された。
発明の概要
本発明は、下記一般式（Ｉ）の化合物：

（式中、Ｒ₁およびＲ₂は独立して−Ｈ、−ＯＨ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ、アルキル、ハロアルキルまたはハロゲンであり；ｎは２〜６であり；ＸおよびＸ′は独立して−Ｎまたは−ＮＯ₂であり；ＹおよびＹ′は独立して−Ｎまたは−ＣＨまたは−Ｈであり；二重破線は二重結合または結合なしを表し；したがって、ＸまたはＸ′が−Ｎであり、ＹまたはＹ′が−ＣＨまたは−Ｎである場合、二重破線は二重結合であり、ＸまたはＸ′が−ＮＯ₂であり、ＹまたはＹ′が−Ｈである場合、二重破線は結合なしである）に関する。
本発明は、少なくとも１種類の上記化合物、および薬剤学的に許容しうるキャリヤーを含む、薬剤組成物をも提供する。
本発明はさらに、新生物細胞増殖の処置を必要とする対象においてそれを処置する方法であって、対象に新生物細胞増殖の処置に有効な量の前記薬剤組成物を投与することを含む方法を提供する。
本発明はさらに、ヒト細胞を含めた細胞の集団においてレトロウイルス感染を処置する方法であって、有効量の少なくとも１種類の式（Ｉ）の化合物を該細胞集団と接触させるか、またはレトロウイルス感染細胞を有する対象に投与することを含む方法を提供する。
本発明の範囲には、ヒト細胞を含めた細胞の集団をレトロウイルスによる発病に対し保護する方法であって、細胞を抗レトロウイルスに有効な量の少なくとも１種類の式（Ｉ）の化合物と接触させるか、またはそれで処置することを含む方法も含まれる。
本発明のさらに他の態様は、ヒト細胞を含めた細胞の集団においてレトロウイルス感染を処置する方法であって、レトロウイルス感染細胞を有する対象の細胞に、有効量の少なくとも１種類の式（ＩＩ）の化合物：

（式中、ＲはＨ、アルキル、または化合物をプロドラッグとして機能させる基であり；ｎは２〜６であり；Ｒ₁、Ｒ₂、Ｘ、Ｙ、Ｘ′またはＹ′および二重破線は式（Ｉ）につき前記に定義したとおりである）を投与し、および／または接触させることを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１．対称的化合物の製造を示す模式図。
図２．ビストリアゾロアクリドン化合物の製造を示す模式図。
図３．インビトロでのヒト異種移植片に対する抗腫瘍活性。
図４．ＷＭＣ−２６の細胞保護活性。
図５．ＷＭＣ−４２の細胞保護活性。
図６．非感染細胞との平行実験（ＷＭＣ−２６）。
図７．非感染細胞との平行実験（ＷＭＣ−４２）。
図８．ＨＩＶ複製の阻害（ＮＳＣ−６８２４０４）。
図９．ＨＩＶ複製の阻害（ＮＳＣ−６８２４０５）。
図１０．ＮＳＣ−６８２４０５（“テマクラジン（temacrazine）”）は逆転写によるプロウイルスＤＮＡ形成を阻止する効力をもたない。
図１１．Ｕ１アッセイにおけるテマクラジンの作用。
図１２．テマクラジンがウイルスタンパク質の産生およびプロセシングに与える影響。
図１３．テマクラジンによる、感染力価をもつ無傷ＨＩＶ−１ビリオンの不活性化。
図１４．テマクラジンはＨＩＶ−１ＬＴＲ指向性転写を非特異的に阻害しない。
図１５．テマクラジンがＨＩＶ−１感染細胞におけるｍＲＮＡ発現およびスプライシングに与える影響。
図１６．テマクラジンはＨＩＶ−１特異性ｍＲＮＡを阻害して、“ｒｅｖ非依存性に類似する”表現型を形成する。
発明の詳細な記述
本明細書中で用いる単独または組み合わせた“アルキル”という用語は、１〜約８個、好ましくは１〜約６個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキル基を意味する。そのような基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、アミル、イソアミル、ヘキシル、オクチルなどが含まれる。アルキル基は、所望により後記に述べる置換基で置換されていてもよい。単独または組み合わせた“アルコキシ”という用語はアルキルエーテル基を意味し、ここでアルキルという用語は前記に定義したとおりである。適したアルキルエーテル基の例には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシなどが含まれる。
“ハロゲン”または“ハロ”という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
“ハロアルキル”という用語は、前記に定義した意味をもつアルキル基において１個またはそれ以上の水素がハロゲンで置換されたものを意味する。そのようなハロアルキル基の例には、クロロメチル、１−ブロモエチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、１，１，１−トリフルオロエチルなどが含まれる。
上記の全般的記載において述べた、所望により存在しうる置換基には、少なくとも１個のアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アルカリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロアルキルが含まれ、これらの任意置換基も所望により置換されていてもよく、所望により置換された基は同一または異なる任意置換基１個または複数個で置換されていてもよい。
本発明は、一般式（Ｉ）の化合物：

（式中、Ｒ₁およびＲ₂はそれぞれ独立して−Ｈ、−ＯＨ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ、アルキル、ハロアルキルまたはハロゲン原子であり；ｎは２〜６であり；ＸおよびＸおよびＸ′は独立して−Ｎまたは−ＮＯ₂であり；ＹおよびＹ′は独立して−Ｎまたは−ＣＨまたは−Ｈであり；二重破線は二重結合または結合なしを表し；したがって、ＸまたはＸ′が−Ｎであり、ＹまたはＹ′が−ＣＨまたは−Ｎである場合、二重破線は二重結合であり、ＸまたはＸ′が−ＮＯ₂であり、ＹまたはＹ′が−Ｈである場合、二重破線は結合なしである）に関する。
好ましい態様において、Ｒ₁およびＲ₂はそれぞれ独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ₂、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₆ジアルキルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル、フッ素、塩素または臭素である。より好ましい態様には、ｎ＝３であり、ＹおよびＹ′が−Ｎであり、ＸおよびＸ′が−ＣＨであり、Ｒ₁およびＲ₂がＨであり、かつ二重破線が二重結合である化合物が含まれる。
本発明化合物は、遊離塩基またはその薬剤学的に許容しうる酸付加塩の形で使用できる。塩形成に適した酸の例は、メタンスルホン酸、硫酸、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸などである。好ましい態様において、本発明化合物はメタンスルホン酸塩、たとえばジメタンスルホン酸塩、または他の塩類、たとえばジ塩酸塩の形で存在し、これらは変動可能な程度に水和されていてもよい。さらに、式ＩおよびＩＩの化合物をプロドラッグ形態でも使用できる。プロドラッグ形態は当業者に知られており、そのような最も有効な形態は当業者が判定できる。
本発明はまた、式（Ｉ）および／または（ＩＩ）のうち少なくとも１種類、ならびに薬剤学的に許容しうるキャリヤーを含む、薬剤組成物に関する。キャリヤーは、配合物の他の成分と相溶性であり、かつそのレシピエントにとって有害でないという意味で、“許容しうる”ものでなければならない。上記化合物を薬剤学的に許容しうる１種類またはそれ以上の希釈剤またはキャリヤー、および所望により、それ自体が療法薬（本発明化合物と相乗性である）であってもよい他のいずれかの成分と配合することができる。配合物中に存在する本発明化合物の濃度は、選択したキャリヤーおよび目的とする結果に依存するであろう。
適した薬剤用キャリヤーの例には、特にラクトース、スクロース、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶質セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、粉末（powders）、食塩液、水が含まれる。キャリヤーの選択は投与経路に依存するであろう。配合物を単位剤形で提供するのが好都合であり、これらは製剤技術分野で周知の方法で、有効化合物をキャリヤーまたは希釈剤（懸濁液または溶液として）、および所望により１種類またはそれ以上の補助成分、たとえば緩衝剤、着香剤、界面活性剤などと混和することにより製造できる。
静脈内、筋肉内、皮下または腹腔内投与のためには、本発明化合物を、好ましくはレシピエントの血液と等張である無菌水溶液と混和する。このような配合物は、塩化ナトリウム、グリシンなどの生理学的に適合性の物質を含有しかつ生理学的条件に適合する緩衝化されたｐＨをもつ水に、固体有効成分を溶解して水溶液を調製し、この溶液を無菌にすることにより調製できる。これらの配合物は１回量または多数回量で密封したアンプルまたはバイアルなどの容器内にあってもよい。
経口投与のためには、慣用される添加物、たとえばラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはバレイショデンプン；結合剤、たとえば結晶質セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン；崩壊剤、たとえばコーンスターチ、バレイショデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム；ならびに滑沢剤、たとえばタルクまたはステアリン酸マグネシウムを含むカプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤または懸濁液剤として、配合物を提供できる。
非経口投与に適した配合物は、好ましくは等張にした、有効化合物の無菌水性調製物を含むことが好都合である。注射用製剤は、非水性溶剤、たとえば植物油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールに本発明化合物を懸濁または乳化することによっても配合できる。
本発明はさらに、新生物細胞増殖の処置を必要とする対象においてそれを処置する方法であって、対象に新生物細胞増殖の処置に有効な量の前記薬剤組成物を投与することを含む方法を提供する。
“処置”という用語には、新生物細胞増殖あるいはレトロウイルスの生育、増殖および／または拡散の部分的または完全な阻害、ならびに新生物細胞またはレトロウイルス、および／またはレトロウイルス感染細胞の部分的または完全な破壊が含まれる。“対象”という用語には、癌またはレトロウイルス感染を伴うと診断されたヒトまたは動物の対象が含まれる。
投与は、当業者に知られている手段、たとえば経口、直腸、局所、静脈内、皮下、筋肉内または腹腔内投与経路で行うことができる。
投与の形態および量は、既知の抗新生物治療または予防方式を参照して容易に確立できる。しかし一般に本発明化合物の投与量は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内であろう。実際の用量は、投与経路、個々の化合物の薬物動態および毒物学的特性、ならびに目的とする結果に依存するであろう。
式ＩおよびＩＩの本発明化合物は、ヒトおよび動物の細胞を含めた細胞の集団においてレトロウイルス感染を処置するのに有用であり、その際、有効量の少なくとも１種類の式Ｉおよび／またはＩＩの化合物を、レトロウイルス感染細胞を有する対象の細胞集団に接触、またはその対象に投与することを含む。
式ＩおよびＩＩの化合物を含む本発明化合物は、多くのレトロウイルス系において感染性ウイルスの拡散を阻止する機能をもちうる。本発明化合物により抑制しうる他のレトロウイルスにはＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＢＬＶ、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＳＴＬＶおよびビスナウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
式ＩおよびＩＩの化合物に関連する初期の実験で、精製した全長ＨＩＶ−１インテグラーゼを用いたインビトロ実験においてこれらの物質が組込み（integration）および崩壊（disintegration）の両段階を阻害することが明らかになった。これらの化合物および他の数種類を、ＨＩＶ−１に感染した末梢血リンパ球に関連する抗ウイルスアッセイにおいて試験した。
前記に開示した配合物はＨＩＶ感染症の処置のための有効かつ比較的安全な薬剤であるが、有益な結果を得るためにこれらの配合物と他の抗ウイルス医薬または薬剤を同時投与する可能性を排除しない。このような他の抗ウイルス医薬または薬剤には、可溶性ＣＤ４、サリドマイド、ジデオキシイノシン、ジデオキシチミン、ジドブジン（zidovudine）、ジデオキシシチジン、ガンシクロビル（gancyclovir）、アシクロビル（acyclovir）、ホスホノホルメート、アマトラジン（amatradine）、リババリン（ribavarin）、抗ウイルス性インターフェロン（たとえばα−インターフェロン、α−インターフェロン、またはインターロイキン−２）、またはエーロゾルペンタミジン、そのほか、抗ＨＩＶ−１療法に用いられる物質が含まれる。
感染細胞をウイルス活性阻害のために処置するのは、一定期間であってもよく、連続的であってもよい。ウイルス活性は、ｐ２４などのウイルスタンパク質の量を監視するか、または逆転写酵素量を測定するか、または³⁵Ｓ−ｍｅｔパルスチェイス標識および免疫沈降実験によりウイルスタンパク質の活性を監視するか、または当業者に周知の他の方法により測定できる（Kayeyama,S.,et al.,（1994）,AIDS Res.and Human Retroviruses,10:735-745）。
本発明を以下の実験の詳細の部に記載する。これは本発明の理解を補助するために具体例を述べたものであり、後記の請求の範囲に定めた本発明をいかなる点でも限定するものと解すべきではない。
実験の詳細の部
材料および方法．用いた溶剤はすべて試薬用である。試薬はすべてアルドリッチ・ケミカルズまたはフルカ（Fluka）から入手され、受け取ったままの状態で用いられた。融点はエレクトロサーマル毛管融点測定装置で測定され、未補正である。
化学合成．両方の発色団が等しい本発明化合物は、図１に示した経路で製造された。中間体クロロニトロアクリドン１は従来の記載に従って（Capps,D.B.,et al.,J.Med.Chem.35:4770-4778（1992）;Lehmstedt,K.,et al.,Chem.Berichte 70:1526-1538（1937））、またはそれに類する方法で製造された。このアクリドンを当量の適切なピペリジン誘導体２と反応させて、ビスニトロアクリドン３を得た。これをギ酸および塩化スズ（ＩＩ）と反応させて、最終ビスイミダゾアクリドン４を得た。
トリアゾロ系列の対称的薬物は図２に従って製造された。アクリドンを過剰のピペラジン誘導体と、生成物７が形成されるように反応させる。
本発明化合物の合成に関する詳細な記述は以下のとおりである。
実施例１
１，４−ビス［３−［（４−ニトロ（１０Ｈ）−９−オキソ−アクリジン−１−イル）アミノ］プロピル］ピペラジン（３）
１−クロロ−４−ニトロ−９（１０Ｈ）−アクリジノン（１）（２．７５ｇ，０．０１ｍｏｌ）、５０ｍＬのＤＭＳＯ、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（２）（１．００２ｇ，０．００５ｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（１．９５ｇ，０．０１５ｍｏｌ）の混合物を８０℃で８時間撹拌した。この反応混合物に１００ｍＬの１％水酸化ナトリウム水溶液を添加し、１０分間撹拌し、冷蔵庫内に一夜放置した。沈殿をろ過により採集し、水で洗浄し、ＤＭＡから結晶化して、２．７４ｇ（８１％）の黄色の（３）を得た。融点２７４〜２７９℃（分解）。分析（Ｃ₃₆Ｈ₃₆Ｎ₈Ｏ₆・Ｈ₂Ｏ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
１，４−ビス［３−［（６−オキソ−６Ｈ−イミダゾ［４，５，１−ｄｅ］−アクリジン−５−イル）アミノ］プロピル］ピペラジン（４）
２．０３ｇ（０．００３ｍｏｌ）の（３）を５０ｍＬの８５％ギ酸に溶解した。この溶液に、濃塩酸６ｍＬ中におけるＳｎＣｌ₂５．７ｇ（０．０３ｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物を還流下に３６時間撹拌した。冷却後、沈殿をろ過し、５０ｍＬのメタノールで洗浄し、３００ｍＬの水に移し、１０％水酸化ナトリウム水溶液でアルカリ性にした。３０ｍＬのクロロホルム−メタノール（１０：１）混合物を添加し、２時間激しく撹拌した。溶解しない物質をろ過により除去し、クロロホルム層を分離した。この抽出液に２ｇのシリカゲルを添加し、溶剤を真空下で蒸発させた。次いでこのゲルをシリカゲルカラムに乗せ、クロロホルム−メタノール（１０：１）で溶離した。主画分を採集し、溶剤を蒸発させた後、１．０５ｇ（５５％）の黄色の（４）を得た。融点２８９〜２９３℃（分解）。分析（Ｃ₃₈Ｈ₃₆Ｎ₈Ｏ₂・Ｈ₂Ｏ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
１，４−ビス［３−［（６−オキソ−６Ｈ−ｖ−トリアゾロ［４，５，１−ｄｅ］−アクリジン−５−イル）アミノ］プロピル］ピペラジン（６）
５−クロロ−６Ｈ−ｖ−トリアゾロ［４，５，１−ｄｅ］−アクリジン−６−オン（５）（５．１２ｇ，０．０２ｍｏｌ）、６０ｍＬのＤＭＳＯ、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（２）（２．００３ｇ，０．０１ｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（２．６ｇ，０．０２ｍｏｌ）の混合物を１００℃で２０時間撹拌した。この反応混合物に１５０ｍＬの２％水酸化ナトリウム水溶液を添加し、１０分間十分に撹拌し、冷蔵庫内に一夜放置した。沈殿をろ過により分離し、水で洗浄し、２００ｍＬの１％メタンスルホン酸水溶液に移し、室温で１時間撹拌した。溶解しない物質をろ過により除去した。ろ液を水酸化ナトリウム水溶液でアルカリ性にした。遊離塩基の沈殿をろ過により分離し、水で洗浄し、次いで沸騰ＤＭＡから２回結晶化して、３．８４ｇ（６０％）の黄色の（６）を得た。融点２４２〜２４５℃。分析（Ｃ₃₆Ｈ₃₄Ｎ₁₀Ｏ₂・Ｈ₂Ｏ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。（６）の構造を単結晶Ｘ線構造解析により確認した。生物学的試験のために、（４）および（６）の遊離塩基をメタンスルホン酸塩または塩酸塩などの水溶性塩に変換した。
実施例２
６のジ塩酸塩
６（１．２ｇ，０．００２ｍｏｌ）をクロロホルム中の１０％メタノールの沸騰混合物（４００ｍＬ）に溶解した。この高温溶液に、メタノール中の０．４Ｍ塩酸１０ｍＬ（塩化アセチルをメタノールに溶解することにより調製）を添加し、数分間撹拌した。溶剤を蒸発させることにより約１００ｍＬに濃縮した。エーテル１００ｍＬを添加し、塩の黄色沈殿をろ過により分離し、エーテルで洗浄し、乾燥させた。収率−１００％、融点＞３００℃（分解）。分析（Ｃ₃₆Ｈ₃₄Ｎ₁₀Ｏ₂・２ＨＣｌ・Ｈ₂Ｏ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
インビトロで数種類の腫瘍異種移植片に対する化合物（４）の活性を試験した。これらの腫瘍に由来する細胞系につき、標準クローン原性アッセイ（clonogenic assay）プロトコールを用いて実験を行った。試験したすべての細胞系につき、平均ＩＣ₇₀（すなわち腫瘍細胞を７０％死滅させた化学物質の濃度）は２．３μｇ／ｍＬであった。胃癌ＧＦＸ（２５１／１４）はこの平均用量（median dose）で感受性であったが、乳腫瘍ＭＡＣＬ（ＭＣＦ７Ｘ／１３）には平均用量の２倍以上が必要であった。黒色腫ＭＥＸＦ（５１４／１２）はこの薬物に対し完全に非感受性であり、腎癌ＲＸＦ（１２２０／５）も同様であった。前立腺癌細胞系ＰＲＸＦ（ＰＸ２Ｍ／２７およびＤＵ１４５Ｘ／２）はこの薬物にきわめて感受性であり、特にＰＣ３ＭがＩＣ₇₀を達成するのに要したのは１ナノグラム／ｍＬ未満であった。結果を図３に示す。
種々の化合物に関連する実験を行った。これらの化合物は下記の構造式をもつ（それらの別表示を含む）：

ＷＭＣ２６およびＷＭＣ４２に関連する実験で、精製した全長ＨＩＶ−１インテグラーゼを用いたインビトロ実験においてこれらの化合物が組込みおよび崩壊の両段階を阻害することが明らかになった。次いでこれらの化合物および他の数種類を、ＨＩＶ−１に感染した末梢血リンパ球に関連する細胞保護アッセイにおいて試験した。
要約すると、感染した培養細胞をウイルスにより死滅させ、死滅しつつある細胞が放出する酵素によるホルマザン色素（ＸＴＴ）の酸化による発色により、細胞毒性を検出する（Weislow et al.,J.Natl.Cancer Inst.81:577-586,1989）。有効な抗ウイルス薬は、ウイルスのある致死機能を阻害することにより、感染細胞を細胞毒性から保護することができる。したがって、抗ウイルス活性のインビトロの証明は、推定薬物によるウイルスの細胞変性作用に対する用量依存性保護に依存する。図４および５は、ＷＭＣ２６およびＷＭＣ４２の細胞保護活性を示す。多くの薬物が本来細胞に対し毒性でもあるので、非感染細胞をそれらの細胞が薬物の作用により死滅する濃度に達するまで薬物で処理する平行実験を行う。これらのデータを図６および７に示す。明らかにこれらの薬物は両方とも、薬物誘導による死滅を生じた濃度よりはるかに低い濃度で感染リンパ球を保護することができた。これは、これらの化合物がこのアッセイ法できわめて良好な療法指数をもつことを意味する。
これらの予備データの結果、他の細胞系における抗ウイルス活性を確認するために、多様なプロトコールを用いてさらに実験を行った。リンパ球での予備実験が感染マクロファージを用いて確認された。ＨＩＶ−１感染ＣＥＭＳＳ白血病細胞で、さらにいっそう広範な実験を行った。残念ながら、ＷＭＣ２６などの化合物は白血病に対しては細胞毒性がきわめて高く（ナノモル量）（Cholody et al.,J.Med.Chem.55:2338-2245,1995）、したがってこのアッセイ法では細胞保護性であることを示せなかった。しかし２種類の誘導体は、高い抗ウイルス活性を維持しながら低い抗白血病活性をもつことが認められた。図８および９は、それぞれこの細胞系におけるＷＭＣ−５０およびＷＨＣ−７０の細胞保護活性を示す。両化合物ともきわめて低い濃度で明らかに細胞保護性であるが、明らかにＷＭＣ−７０はその療法指数が卓越しているのでより良い薬物であると思われる。たとえばＷＭＣ−７０がウイルスの細胞毒性を５０％にまで阻害する濃度（ＥＣ₅₀値）は１ナノモル未満であるが、この薬物が５０％の細胞を死滅させるのはマイクロモルより高い濃度である。これは、３桁以上の療法指数を与える。対応するＷＭＣ−５０の療法指数は約１００〜２００であり、これはかなり許容できる。ＷＭＣ−７０につき他の実験を行った。この薬物は、ウイルス複製に伴う他の２つの重要な酵素であるＨＩＶプロテアーゼまたは逆転写酵素をいずれも阻害しないことが示された。ＷＭＣ−７０は、ウイルス複製にきわめて重要であると考えられるウイルスの構造上の他の特徴であるｇａｇタンパク質ジンクフィンガーにも損傷を与えなかった。興味深いことに、ＨＩＶ−１ウイルス自体をこの薬物で処理すると、ウイルスがＣＥＭ細胞に感染する能力を阻害するように思われた。さらにＷＭＣ−７０は、ウイルスの転写後事象に影響を与えるように思われる。すべてのウイルスが組み込まれた細胞を薬物で処理すると、見かけ上は正常なウイルスｇａｇｐ５５ポリタンパク質が形成されるが、これはそれ以上はプロセシングされない。すなわちｐ２４は検出できないことが明らかになる。この化合物がその抗ウイルス活性を及ぼす主な機構は組込みの阻害であると思われるが、この薬物および拡大するとこの群の他の抗ウイルス薬の療法作用に関係する他の機構もあると思われる。
化合物ＷＣ−２６、ＷＭＣ−４２、ＷＭＣ−５０およびＷＭＣ−７０は、ＨＩＶ感染症およびエイズに対し有効な活性をもつ有効な抗ウイルス薬である。（“ＷＭＣ−７０”を本明細書では“ＮＳＣ６８２４０５”または“テマクラジン”とも呼ぶ。）
実施例３
被験化合物の抗ウイルス性
ＷＭＣ系列の化合物の抗ウイルス性を評価した。まずすべての化合物を、ＸＴＴ細胞保護アッセイ法により、それらが細胞培養物におけるＨＩＶ−１複製を阻害する効力につき試験した。このアッセイ法では、化合物がＣＥＭ−ＳＳ細胞をＨＩＶ−１_RFの細胞変性作用から保護する濃度依存性効力を測定する。５０％の保護を与える化合物濃度がＥＣ₅₀抗ウイルス値であり、一方、細胞を５０％死滅させる化合物濃度はＩＣ₅₀毒性値である。表１に示すように化合物ＮＳＣ６８２４０１〜ＮＳＣ６８２４０３は不活性であり、毒性のない場合は抗ウイルス作用がないことを示す。ＮＳＣ６８２４０４はＥＣ₅₀＝０．４１ｎＭおよびＩＣ₅₀＝１５８ｎＭを示し、一方テマクラジンはＥＣ₅₀＝１．１ｎＭおよびＩＣ₅₀＝２．７７μＭを示した（図８および９も参照）。したがってテマクラジンはＸＴＴ細胞保護アッセイにおいて最も有効な化合物であった。これらの化合物をヒト単球／マクロファージ培養物においてＨＩＶ−１_ADAに対する抗ＨＩＶ−１活性を試験した場合も、この結論に達した（表１）。
実施例４
被験化合物の機械的特性
ＨＩＶ−１の既知の抗ウイルス標的に対する機械的試験で得たデータも表１に示す。これらの化合物は宿主細胞へのＨＩＶ−１の付着、ＨＩＶ−１逆転写酵素もしくはプロテアーゼの酵素活性、またはｐ７ヌクレオキャプシドタンパク質ジンクフィンガーを阻害しなかった。これまでの所見にもとづいて、本発明者はテマクラジン同族体の生物学的アッセイ法に努力を向けた。時間経過アッセイでテマクラジンは、プロウイルスＤＮＡのＬＴＲ／ｇａｇ領域が増幅されたことが示すように、逆転写中に起きるプロウイルスＤＮＡの形成を阻害しなかった（図１０）。テマクラジンは、精製オリゴマーおよび組換えＨＩＶ−１インテグラーゼを用いたインビトロアッセイにおいて、濃度依存性様式でＥＣ₅₀ １０〜１００ｎＭで３′側プロセシングおよび鎖移動活性を阻害した（表１Ａ）。
これらの所見は、テマクラジンがＨＩＶ−１インテグラーゼ阻害薬として作用することと一致する。ＨＩＶ−１複製サイクル中で、プロウイルスＤＮＡ形成は組込み事象の前に完了するからである。ウイルスの付着および融合を阻害する実験化合物（たとえば硫酸デキストラン）、および逆転写を阻害する化合物（ＤＤＣ、ＡＺＴ、ネビラピン（Nevirapine）など）は、時間経過アッセイでプロウイルスＤＮＡの形成を阻害する。

実施例５
テマクラジンがＨＩＶ−１複製サイクルの後期に与える影響
ＨＩＶ−１複製サイクルの後期事象のモデルとして、２コピーのＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡを潜在感染させたＵ１細胞を用いた。ＴＮＦ−αなど特定の因子により、これらのＵ１細胞におけるウイルス産生の高水準発現を刺激することができる。Ｕ１細胞をＴＮＦ−αで２４時間刺激した後、種々の濃度のテマクラジンを添加し、培養物をさらに４８時間インキュベートした。この時点で、細胞を生存性、ならびにウイルスタンパク質の合成およびプロセシングの含量につき評価し、一方、無細胞上清をウイルスｐ２４含量および放出ビリオンの感染力価につき評価した。図１１は、ウイルス産生（ｐ２４）が４ｎＭ未満で阻害されたこと、および放出ウイルス粒子が非感染性であること（１ｍｌ当たりの感染単位“ＩＵ／ｍｌ”として表す）を示す。これらのＵ１細胞につき３０ｎＭを越えると、細胞生存性が低下した。興味深いことに、ｐ７およびｐ２４抗血清を用いたウェスタンブロット法によるウイルスタンパク質の検査（図１２）で、ｇａｇ前駆物質ポリタンパク質（Ｐｒ５５^gag）は合成されたが、これがＨＩＶ−１プロテアーゼによりプロセシングされて成熟ウイルスタンパク質（ｐ２４およびｐ７ＮＣ）になることはないのが明らかになった。
同様な試験で、細胞をＴＮＦαで２４時間処理した後にテマクラジンを添加するか、またはテマクラジンとＴＮＦαを同時に添加するか、またはテマクラジンをＴＮＦα添加の２４時間後に添加した。ＴＮＦα誘導およびテマクラジン処理の後、培養を７２時間続け、その後ビリオン関連ｐ２４および細胞生存性（ＸＴＴ色素還元）を測定した。テマクラジンは両方のＵ１において（および潜在感染細胞系ＡＣＨ−２においても）ＨＩＶ−１ウイルス複製の有効な阻害薬であり、ＥＣ₅₀は１０〜１００ｎＭであった。さらに、テマクラジン仲介によるウイルス阻害は、テマクラジンとＴＮＦαの添加順序により有意には影響されなかった。
培養物をテマクラジンで３０分間パルスすると、ＴＮＦα刺激後に感染性ウイルスの産生を示すことも認められた。
実施例６
テマクラジンによるＨＩＶ−１の直接不活性化
表１の機械的試験は、本発明化合物がＨＩＶ−１プロテアーゼ活性を阻害しないことを示した。しかしＨＰＬＣによるアッセイ（表１で採用）が正確な所見を与えることを確認するために、Ｇａｇプロセシングアッセイでのテマクラジンの作用を評価した。このアッセイでは、精製した組換えＨＩＶ−１プロテアーゼ酵素を被験物質により３７℃で１時間予備処理し、次いで組換えＰｒ５５^gag前駆物質ポリタンパク質をこの処理酵素に暴露した。図１３に示すように、プロテアーゼ単独では前駆物質を効果的にプロセシングすることができた。さらに、この酵素を本発明化合物で予備処理しても阻害作用がなかった。これらの所見を合わせて、テマクラジンはＨＩＶ−１プロテアーゼ酵素を阻害しないことが証明された。
所見の意義
テマクラジンは、急性感染症モデルにおいて、増殖している細胞におけるリンパ球指向性（lymphocytotropic）ＨＩＶ−１株、および増殖していない正常細胞における単球指向性ＨＩＶ−１株に対し、有効な抗ＨＩＶ−１活性を示した。さらに、本発明化合物は先に感染した細胞に対し抗ウイルス作用を及ぼした。後期作用の厳密な性質については調査中であるが、テマクラジンは先に感染した細胞から新たな感染性ウイルスが産生されるのを有効に阻害した。ＨＩＶ−１感染者においてウイルス負荷を低下させるいかなる手段もインビボで後続の感染周期を低下させる結果になるとすれば、これは本発明化合物のきわめて重要な作用である。さらに、本発明化合物がビリオンを直接に不活性化しうることは、著しく重要である。これにより血漿の感染力価が効果的に低下し、後続周期のウイルス複製および接種が阻止されるからである。
実施例７
ＨＩＶ−１転写の開始および調節には、細胞性転写因子、たとえばＮＦκＢ、ＳＰ−１およびＡＰ−１との複雑な一連の相互作用、ならびに転写複合体への細胞性因子の関与が要求される。さらに、本明細書中で用いた組込み後モデルはＴＮＦα刺激したＵ１およびＡＣＨ−２細胞を必要とし、このモデルはＮＦκＢ転写複合体の関与だけでなく、ＴＮＦαシグナル伝達経路の成分をも必要とする。テマクラジンが非特異的に転写に影響を与えたか、またはＴＮＦαシグナル伝達経路の妨害により複製をダウンレギュレーションしていたということを除外するために、ＢＦ−２４細胞においてＬＴＲ指向性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性を測定した。ＢＦ−２４細胞はＴＨＰ−１単球系に由来し、ＨＩＶ−１ＬＴＲの転写制御下で安定に組み込まれたＣＡＴ遺伝子を保有する（S.Schwartz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:7200（1989）;B.K.Felber et al.,Science 239:184（1988））。ＬＴＲはこの細胞系においてＩＬ−６、ＰＭＡおよびＴＮＦαにより誘導することができ、酵素活性をもつクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（“ＣＡＴ”）を産生する。ＴＮＦαによるＣＡＴ酵素活性の誘導はウイルス成分が存在しなくても起き、したがってウイルス性調節タンパク質に依存しない作用機構が確認されるであろう。ＢＦ−２４細胞をＴＮＦαで刺激し、テマクラジンで２４時間処理し、次いでＣＡＴ酵素活性測定のために細胞タンパク質を採集した（図１４）。
蛍光性ボディピー（Bodipy）結合クロラムフェニコールを用い、アセチルＣｏＡを含有するタンパク質抽出液５０μｇと１８時間反応させた後、ＣＡＴ活性を測定した。図１４は、ＢＦ−２４細胞単独では固有ＣＡＴ活性が低く、これをＴＮＦαで少なくとも１０倍誘導できることを示す。ＢＦ−２４細胞を最高５μＭのテマクラジンで処理しても、ＣＡＴ誘導は有意には変化しなかった。ＣＡＴ発現には逆転写は必要ないのでテマクラジンの活性に影響を与えないＡＺＴも、不活性であった。これらのデータは非特異的転写／翻訳作用に反論するものであるが、この仮説を証明するために特異的実験を行った。ＣＥＭ−ＳＳ細胞における³Ｈロイシン（タンパク質の代謝を測定するため）、³Ｈチミジン（ＤＮＡの複製を測定するため）、³Ｈウリジン（ＲＮＡの産生を測定するため）の取込みを測定し、テマクラジンがこれらの細胞性パラメーターに影響を与えないことが認められた。これらのデータは、テマクラジンの抗ウイルス活性が転写の非特異的ダウンレギュレーションによるものではなく、ウイルス因子（１またはそれ以上）の関与を必要とすることを強く示唆する。
実施例８
テマクラジンはＴＮＦα誘導の２４時間前または後に投与すると、５００または５０ｎＭで、非スプライスｍＲＮＡまたはシングルスプライスｍＲＮＡの発現を完全に阻害した。テマクラジンとＴＮＦαを同時に添加した場合も同様な結果がみられた。これに対し、すべてのマルチスプライスｒｅｖ非依存性ｍＲＮＡを検出するために設計されたＲＴ−ＰＣＲプライマーを用いた場合、テマクラジンはＨＩＶ−１マルチスプライス転写体の発現を変化させなかった（図１５）。
対照として、ハウスキーピング遺伝子ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ヒドロキシメチルビランシンターゼ、“ＰＢＧＤ”）を増幅して、負荷の均一性を測定した。この薬物はＰＢＧＤ発現を低下させなかったので、これはテマクラジンが転写を非特異的にダウンレギュレーションしないことを証明する。
実施例９
テマクラジンがＨＩＶ−１ｍＲＮＡ発現を調節していたという可能性を評価するために、全ＨＩＶ−１ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット法により調べた（図１６）。
図１６は、ＴＮＦαで刺激するとＵ１細胞におけるＨＩＶ−１特異性ｍＲＮＡの発現が著しく増大することを示す。ＴＮＦα刺激したＵ１細胞を１０および１００ｎＭのテマクラジンで処理すると、ｍＲＮＡの産生が全面的に抑制され、刺激していないＵ１細胞の外観にきわめて近似する外観をもつ表現型（“ｒｅｖ”非依存性表現型）が生じる。しかし１ｎＭテマクラジンによる処理ではシングルスプライスｍＲＮＡおよび非スプライスｍＲＮＡが減少し、マルチスプライスｍＲＮＡは明らかには減少しなかった。これらのＲＮＡ阻害パターンは、テマクラジンがｍＲＮＡを含有するｒｅｖ反応性要素（ＲＲＥ）の発現を阻害または変化させていることを示唆する。
実施例１０
インビボデータ
テマクラジンの新規な作用機構、ならびにＨＩＶ−１に対するその広範な活性および高い療法指数が得られたので、本発明者らはＨＩＶ−１複製のヌードマウス中空繊維モデルにおいてそのインビボおよび抗ウイルス特性を評価することにした。要約すると、ＣＥＭ−ＳＳ細胞をＨＩＶ−１_RFに感染させ、中空繊維に挿入し、ヌードマウスの腹腔内または皮下に移植した。ＤＭＳＯビヒクル中のテマクラジンを１日３回、２回または１回、１日当たりの全投与量２５ｍｇ／ｋｇで６日間腹腔内投与した。同様にマウスをテマクラジンの経口投与および静脈内投与により処置した。腹腔洗浄液および血清の試料を採集し、ｐ２４の発現を抗原捕獲法により測定した。結果を表２に示す。テマクラジンの腹腔内投与では、腹腔洗浄液中の検出可能なｐ２４の量が投与計画に関係なく５〜１０倍減少した。テマクラジンは血清中のｐ２４量も減少させた。したがってテマクラジンはインビボでのＨＩＶ−１複製を低下させる。
ここに提示する実験は、テマクラジンが感染細胞中でＨＩＶ−１生活周期の組込み後事象と相互作用することにより機能することを示す。この相互作用により、非スプライスおよびシングルスプライス転写体が選択的に枯渇して、ウイルス転写体が失われる。この薬物は、新規な抗ウイルス作用機構により機能する。なおかつテマクラジンがインビボモデルでＨＩＶ−１複製を阻害しうることにより、有効な抗ウイルス薬としてのテマクラジンおよびその同族体の有用性はさらに増す。

本明細書中で述べた刊行物はすべて、それらの全体が本明細書に参考として含まれる。
以上、本発明を明確にし、理解するために、ある程度詳細に記載したが、当業者はこの開示を読むことにより本発明の真の範囲から逸脱することなく形態および詳細を多様に変更しうることが認識されるであろう。

Claims

下記の一般式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ₁およびＲ₂は独立して−Ｈ、−ＯＨ、アミノ、Ｃ₁−Ｃ₈アルキルアミノ、Ｃ₁−Ｃ₈ジアルキルアミノ、Ｃ₁−Ｃ₈アルコキシ、Ｃ₁−Ｃ₈アルキル、Ｃ₁−Ｃ₈ハロアルキルまたはハロゲンであり；
ｎは２〜６であり；
ＸおよびＸ′は独立して−Ｎまたは−ＮＯ₂であり；
ＹおよびＹ′は独立して−Ｎまたは−ＣＨまたは−Ｈであり；
二重破線は二重結合または結合なしを表し；したがって、ＸまたはＸ′が−Ｎであり、ＹまたはＹ′が−ＣＨまたは−Ｎである場合、二重破線は二重結合であり、ＸまたはＸ′が−ＮＯ₂であり、ＹまたはＹ′が−Ｈである場合、二重破線は結合なしである）で示される化合物又はその薬剤学的に許容しうる酸付加塩。
次式：

（式中、
ＲはＨ、Ｃ₁−Ｃ₈アルキルであり；
Ｒ₁およびＲ₂は独立して−Ｈ、−ＯＨ、アミノ、Ｃ₁−Ｃ₈アルキルアミノ、Ｃ₁−Ｃ₈ジアルキルアミノ、Ｃ₁−Ｃ₈アルコキシ、Ｃ₁−Ｃ₈アルキル、Ｃ₁−Ｃ₈ハロアルキルまたはハロゲンであり；
ｎは２〜６であり；
ＸおよびＸ′は独立して−Ｎまたは−ＮＯ₂であり；
ＹおよびＹ′は独立して−Ｎまたは−ＣＨまたは−Ｈであり；
二重破線は二重結合または結合なしを表し；したがって、ＸまたはＸ′が−Ｎであり、ＹまたはＹ′が−ＣＨまたは−Ｎである場合、二重破線は二重結合であり、ＸまたはＸ′が−ＮＯ₂であり、ＹまたはＹ′が−Ｈである場合、二重破線は結合なしである）の化合物および薬剤学的に許容しうるキャリヤーを含む、ウイルス複製を阻害するための薬剤組成物。
化合物が次式：

を含む、ウイルス複製を阻害するための請求項２記載の薬剤組成物。
化合物が次式：

を含む、ウイルス複製を阻害するための請求項２記載の薬剤組成物。
化合物が次式：

を含む、ウイルス複製を阻害するための請求項２記載の薬剤組成物。
化合物が次式：

を含む、請求項１記載の化合物。
化合物が次式：

を含む、請求項１記載の化合物。
請求項１記載の化合物および薬剤学的に許容しうるキャリヤーを含む、ウイルスの複製を阻害するための薬剤組成物。
請求項１記載の化合物および薬剤学的に許容しうるキャリヤーを含む、新生物細胞増殖を阻害するための薬剤組成物。