DE69709857T2

DE69709857T2 - Acridonderivate als antineoplastische-und antiretrovirale mittel

Info

Publication number: DE69709857T2
Application number: DE69709857T
Authority: DE
Inventors: W. Cholody; J. Michejda; G. Rice; A. Turpin
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1996-04-12
Filing date: 1997-04-09
Publication date: 2002-08-29
Anticipated expiration: 2017-04-10
Also published as: US6541483B2; DK0892801T3; US6187775B1; EP0892801B1; PT892801E; ES2171260T3; JP4121151B2; EP0892801A1; AU2815797A; DE69709857D1; JP2000508662A; AU725629B2; WO1997038999A1; US20010009914A1; ATE211471T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft von Acridon abgeleitete Verbindungen, welche Bisimidazoacridone, Bistriazoloacridone und Hybridmoleküle sind, die sowohl Imidazoacridon- als auch Triazoloacridoneinheiten aufweisen. Diese Verbindungen sind als antineoplastische und antiretrovirale Mittei geeignet.
Eine Anzahl von Verbindungen auf Acridinbasis, die eine starke Antitumoraktivität haben, wurde kürzlich beschrieben. W.M. Cholody et al. beschreiben 5-[(Aminoalkyl)amino]- imidazo[4,5,1-de]acridin-6-one als neue Klasse antineoplastischer Mittel (J. Med. Chem., 33, 49-52 (1990)). 8-substituierte 5-[(Aminoalkyl)amino]-6H-v-triazolo[4,5,1-de]acridin-6-one wurden auch als potentielle antineoplastische Mittel beschrieben (J. Med. Chem., 33, 2852- 2856 (1990)). Die Synthese von chromophob modifizierten antineoplastischen Imidazoacridone und deren Aktivität gegen Mäuse-Leukämie wurde beschrieben (J. Med. Chem., 35, 378-382 (1992)). D.B. Capps et al. haben 2-(Aminoalkyl)-5-nitropyrazolo[3,4,5- kl]acridone als neue Klasse von Antikrebsmitteln beschrieben (J. Med. Chem., 35, 4770- 4778 (1992)).
Die WO 95/25093 beschreibt Verbindungen mit Strukturen, die denen der allgemeinen Formel (II) der vorliegenden Erfindung ähnlich sind. Von diesen Verbindungen wird gesagt, dass sie geeignete antineoplastische Mittel sind. Cholody et al. J. Med. Chem., 38, 3043- 3052 (1995) beschreiben die Synthese von Verbindungen mit Strukturen, die denen der allgemeinen Formel (II) der vorliegenden Erfindung ähnlich sind. Von diesen Verbindungen wird gesagt, dass sie als antineoplastische Mittel mit hoher Selektivität gegen Kolontumor geeignet sind. Hernandez et al., Cancer Res., 55, 2338-2345 (1995) beschreiben Verbindungen mit Strukturen, die denen der Formel (II) ähnlich sind. Von diesen Verbindungen wird gesagt, dass sie wirksame und selektive Antikolon-Krebsmittel sind. Folglich beschreiben diese Dokumente Verbindungen, die denen der allgemeinen Formel (II) ähnlich sind, mit antineoplastischer Aktivität. Es wird jedoch keinerlei Effekt auf Retroviren erwähnt.
Die vorstehenden Verbindungen haben ein tetracyclisches planares Chromophor, das eine Seitenkette trägt, die einen (Aminoalkyl)aminorest als gemeinsames Strukturmerkmal enthält. Es wird angenommen, dass DNA das primäre Ziel für diese Verbindungen ist und dass sie an DNA durch Interkalation binden.
Bifunktionelle Verbindungen wurden auch als potentielle Antitumormittel studiert, und zwar auf der Basis der Fähigkeit von Acridonen und anderen planaren aromatischen Verbindungen zur Wechselwirkung mit DNA durch Interkalation. T.K. Chen et al. (1978) haben Diacridine als bifunktionelle Interkalatoren studiert (J. Med. Chem., 21, 868-874 (1978)). B. Gaugain et al. (1978) haben die Synthese und die Konformationseigenschaften eines Ethidium-Homodimeren und eines Acridin-Ethidium-Heterodimers beschrieben (Biochemistry 17, 5071-5078 (1978)). B.K. Sinha et al. haben die Synthese und die Antitumoreigenschaften von Bis(chinaldin)derivaten beschrieben (J. Med. Chem., 20, 1528- 1531 (1977)). B.P. Roques et al. (1979) haben die antileukämische Wirkung von Pyridocarbazoldimeren beschrieben (Biochem. Pharmacol., 28, 1811-1815 (1979)). D. Pelaprat et al. (1980) haben 7H-Pyridocarbazoldimere als potentielle Antitumormittel beschrieben (J. Med. Chem., 23, 1336-1343 (1980)). M.F. Brana et al. (1993) haben Bis- Naphihalimide als einel Klasse von Antitumormitteln beschrieben (Anti-Cancer Drug Design, 8, 257-268 (1993)).
Die Gründe für die starke Bindung von bifunktionellen Interkalatoren, die zwei aromatische Ringssysteme enthalten, die durch einen geeigneten Linker mit Nucleinsäuren verbunden sind, wurden vorgestellt (E. S. Canellakis et al., Biochem. Biophys. Acta, 418, 277-283 (1976)). Es wurde gefunden, dass diese starke Bindung mit DNA durch Interkalation im Allgemeinen nicht mit der Antitumoraktivität zusammenhängt, obwohl die Verbindungen eine hohe Affinität für DNA aufweisen.
Viele Faktoren, wie z. B. die physikochemischen Eigenschaften der planaren Chromophore die Natur der verbindenden Kette (ihre Länge, Starrheit und ihr Ionisationszustand), die Position der Bindung und andere Faktoren beeinflussen stark die Bindung mit DNA und die biologische Wirkung dieser Verbindungen. Zusätzlich wurde gefunden, dass es keine direkte Korrelation zwischen der DNA-Bindungsaffinität und der Cytotoxizität gibt.
Da die Struktur-Wirkungs-Beziehungen in der Gruppe bifunktioneller Interkalatoren bezüglich ihrer in vivo Antitumorwirkung unklar bleibt, ist es nicht möglich, Strukturen vorherzusagen, die eine solche Wirkung zeigen werden. Kleine strukturelle Modifikationen können die biologischen Eigenschaften des Mittels drastisch verändern. Demgemäß ist es ein Ziel, andere Verbindungen mit hoher antineoplastischer Aktivität und insbesondere Selektivität zu finden, die gegen spezielle Tumore gerichtet sind.
Es wurde bisher beschrieben, dass bestimmte Bisimidazoacridone, die nahe verwandten Bistriazoloacridone und Hybridmoleküle, die sowohl die Imidaxoacridon- als auch die Triazoloacridon-Einheit enthalten, wirksame und auch selektive Antitumormittel sind (US-PS 5,508,289).
Diese Erfindung betrifft eine neue Klasse von Verbindungen auf Acridinbasis und deren Verwendung als antineoplastische Mittel und antiretrovirale Mittel. Es wurde ferner gefunden, dass die Bisimidazoacridone, die Bistriazoloacridone und Hybridmoleküle, die in der US-PS 5,508,289 beschrieben sind, als antiretrovirale Mittel geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
worin
R&sub1; und R&sub2; unabhängig -H, -OH, Amino-, C&sub1;-C&sub8; Alkylamino-, C&sub1;-C&sub8; Dialkylamino-, C&sub1;- C&sub8; Alkoxy-, C&sub1;-C&sub8; Alkyl-, C,-Ce Halogenalkylgruppen oder Halogenatome sind;
n einen Wert von 2 bis 6 hati;
X und X' unabhängig -N oder -NO&sub2; sind;
Y und Y' unabhängig -N oder -CH oder -H sind, wobei eine gestrichelte Doppellinie eine Doppelbindung oder keine Bindung darstellt, und zwar derart, dass dann, wenn X oder X' -N ist, Y oder Y' -CH oder -N und die gestrichelte Doppellinie eine Doppelbindung ist, und dann, wenn X oder X' -NO&sub2; ist, Y oder Y' -H und die gestrichelte Doppellinie keine Bindung ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die mindestens eine der vorstehenden Verbindungen und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung der vorstehenden Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines neoplastischen Zellwachstums in einem Lebewesen bereit, das einer solchen Behandlung bedarf, welche die Verabreichung einer Menge der vorstehenden pharmazeutischen Zusammensetzung an das Lebewesen umfasst, die zur Behandlung des neoplastischen Zellwachstums wirksam ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung der vorstehenden Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von retroviralen Infektionen in einer Population von Zellen bereit, einschließlich menschlichen Zellen, welche das In-Kontakt- Bringen der Zellpopulation oder das Verabreichen an ein Lebewesen mit retroviral infizierten Zellen einer wirksamen Menge mindestens einer Verbindung der Formel (I) umfasst.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der vorstehenden Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zum Schutz einer Population von Zellen, einschließlich menschlichen Zellen gegen eine retrovirale Pathogenese, umfassend das In-Kontakt- Bringen oder das Behandeln der Zellen mit einer antiretroviral wirksamen Menge mindestens einer Verbindung der Formel (I).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt die Verwendung von Verbindungen der Formel (II) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung retroviraler Infektionen in einer Population von Zellen, einschließlich menschlicher Zellen bereit, welche das Verabreichen und/oder In-Kontakt-Bringen der Zellen eines Lebewesens, das retroviral infizierte Zellen aufweist, einer wirksamen Menge mindestens einer Verbindung der Formel (II) umfasst:
worin R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;-C&sub8; Alkylgruppe ist; R&sub1; und R&sub2; unabhängig -H, - OH, Amino-, C&sub1;-C&sub8; Alkylamino-, C&sub1;-C&sub8; Dialkylamino-, C&sub1;-C&sub8; Alkoxy-, C&sub1;-C&sub8; Alkyl-, C&sub1;-C&sub8; Halogenalkylgruppen oder Halogenatome sind; n einen Wert von 2 bis 6 hat; X und X' -N sind; Y und Y' unabhängig -N oder -CH sind, wobei eine gestrichelte Doppellinie eine Doppelbindung darstellt, und zwar derart, dass dann, wenn X oder X -N ist, Y oder Y' -CH oder -N und die gestrichelte Doppellinie eine Doppelbindung ist.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung, welche die Herstellung einer symmetrischen Verbindung zeigt.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung, welche die Herstellung einer Bistriazoloacridonverbindung zeigt.
Fig. 3 zeigt die Antitumorwirkung gegen menschliche Xenotransplantate in vitro.
Fig. 4 zeigt die cytoprotektive Wirkung von WMC-26.
Fig. 5 zeigt die cytoprotektive Wirkung von WMC-42.
Fig. 6 zeigt ein Parallelexperiment mit nichtinfizierten Zellen (WMC-26).
Fig. 7 zeigt ein Parallelexperiment mit nichtinfizierten Zellen (WMG-42).
Fig. 8 zeigt die Inhibierung der HIV-Replikation (NSC-682404).
Fig. 9 zeigt die Inhibierung der HIV-Replikation (NSC-682405).
Fig. 10 zeigt das Unvermögen von NSC 682405 ("Temacrazin"), die Bildung von proviraler DNA durch reverse Transkription zu verhindern.
Fig. 11 zeigt die Wirkungen von Temacrazin in dem U1-Test.
Fig. 12 zeigt die Wirkung von Temacrazin auf die Produktion und die Prozessierung von viralen Proteinen.
Fig. 13 zeigt die Temacrazin-Inaktivierung des infektiösen Titers von intakten HIV-1- Virionen.
Fig. 14 zeigt das Unvermögen von Temacrazin, die HIV-1-LTR-gerichtete Transkription nicht-spezifisch zu inhibieren.
Fig. 15 zeigt die Wirkung von Temacrazin auf die mRNA-Expression und das Spleißen in HIV-1-infizierten Zellen.
Fig. 16 zeigt die Inhibierung von HIV-1-spezifischer mRNA unter Bildung einer Art "revunabhängigen" Phanotyps durch Temacrazin.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Alkyl", allein oder in Kombination, einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele für solche Reste umfassen Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, sec-Butyl-, tert-Butyl-, Amyl-, Isoamyl-, Hexyl-, Octylreste und dergleichen. Der Begriff "Alkoxy" bedeutet allein oder in Kombination einen Alkyletherrest, wobei der Begriff Alkyl die vorstehend angegebene Bedeutung hat. Beispiele für geeignete Alkyletherreste umfassen Methoxy-, Ethoxy-, n-Propoxy-, Isopropoxy-, n-Butoxy-, Isobutoxy-, sec-Butoxy-, tert-Butoxyreste und dergleichen.
Der Begriff "Halogen" oder "Halo" bedeutet Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
Der Begriff "Haloalkyl" steht für einen Alkylrest mit der vorstehend angegebenen Bedeutung, bei dem ein oder mehrere Wasserstoffatom(e) durch ein Halogen ersetzt ist/sind. Beispiele für solche Haloalkylreste umfassen Chlormethyl-, 1-Bromethyl-, Fluormethyl-, Difluormethyl-, Trifluormethyl-, 1,1,1-Trifluorethylreste und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig -H, -OH, Amino-, C&sub1;-C&sub8; Alkylamino-, C&sub1;-C&sub8; Dialkylamino-, C&sub1;-C&sub8; Alkoxy-, C&sub1;-C&sub8; Alkyl-, C&sub1;-C&sub8; Halogenalkylgruppen oder Halogenatome sind; n einen Wert von 2 bis 6 hat; X und X' unabhängig -N oder -NO&sub2; sind; Y und Y' unabhängig -N oder -CH oder -H sind, wobei eine gestrichelte Doppellinie eine Doppelbindung oder keine Bindung darstellt, und zwar derart, dass dann, Wert X oder X' -N ist, Y oder Y' -CH oder-N und die gestrichelte Doppellinie eine Doppelbindung ist, und dann, wenn X oder X' -NO&sub2; ist, Y oder Y' -H und dis gestrichelte Doppellinie keine Bindung ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig -H, -OH, NH&sub2;-, C&sub1;- C&sub6; Alkylamino-, C&sub1;-C&sub6; Dialkylamino-, C&sub1;-C&sub6; Alkylgruppen, Fluor-, Chlor- oder Bromatome. Eine mehr bevorzugte Ausführungsform umfasst Verbindungen, bei welchen n = 3, Y und Y' -N sind, X und X' -CH sind, R&sub1; und R&sub2; H sind und die gestrichelte Doppellinie eine Doppelbindung ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form der freien Basen oder pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalze davon verwendet werden. Beispiele für geeignete Säuren zur Salzbildung sind Methansulfon-, Schwefel-, Chlorwasserstoff-, Phosphor-, Essig-, Zitronen-, Milch-, Ascorbin-, Maleinsäure und dergleichen. In der bevorzugten Ausführungsform liegen die erfindungsgemäßen Verbindungen in Form von Methansulfonaten, wie z. B. Dimethansulfonat, oder anderen Salzen vor, wie z. B. als Dihydrochlorid, die in verschiedenem Maß hydratisiert sein können.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens eine Verbindung der Formel (I) und/oder Formel (II) und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Der Träger muss in dem Sinne "verträglich" sein, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und gegenüber dem Rezipienten der Formulierung nicht schädlich ist. Die Verbindung kann mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Verdünnungmittel(n) oder Träger(n) und gegebenenfalls mit anderen Bestandteilen formuliert werden, die per se therapeutisch sind und die mit der erfindungsgemäßen Verbindung synergistisch sind. Die Konzentration der in der Formulierung vorliegenden Verbindung wird von der Auswahl des Trägers sowie von den gewünschten Ergebnissen abhängen.
Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger umfassen Lactose, Saccharose, Stärke, Talk, Magnesiumstearat, kristalline Cellulose, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Glycerin, Natriumalginat, Gummi Arabicum, Pulver, Kochsalzlösung, Wasser, usw. Die Auswahl des Trägers wird von dem Verabreichungsweg abhängen. Die Formulierungen können zweckmäßig in einer Einheitsdosierungsform vorliegen und können mit auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Verfahren hergestellt werden, und zwar durch Zusammenbringen des Wirkstoffs mit einem Träger oder Verdünnungsmittel als Suspension oder Lösung und gegebenenfalls mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen, wie z. B. Puffern, Geschmacksstoffen, Tensiden und dergleichen.
Zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen oder intraperitonealen Verabreichung wird die Verbindung mit einer sterilen wässrigen Lösung kombiniert, die vorzugsweise mit dem Blut des Rezipienten isotonisch ist. Solche Formulierungen können durch Auflösen des festen Wirkstoffs in Wasser, das physiologisch kompatible Substanzen wie Natriumchlorid, Glycin und dergleichen enthält und das einen gepufferten pH-Wert aufweist, der mit physiologischen Bedingungen kompatibel ist, wobei eine wässrige Lösung erhalten wird, und Sterilisieren der Lösung hergestellt werden. Die Formulierungen können in Einheits- oder Mehrfachdosierungsbehältern wie verschlossenen Ampullen oder Gefäßen vorliegen.
Für die orale Verabreichung kann die Formulierung als Kapsel, Tablette, Pulver, Granulat oder Suspension mit herkömmlichen Additiven wie Lactose, Mannit, Maisstärke oder Kartoffelstärke, mit Bindemitteln wie kristalliner Cellulose, Cellulosederivaten, Akaziengummi, Maisstärke oder Gelatine, mit Sprengmitteln wie Maisstärke, Kartoffelstärke oder Natriumcarboxymethylcellulose und mit Schmiermitteln wie Talk oder Magnesiumstearat bereitgestellt werden.
Formulierungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen zweckmäßig eine sterile wässrige Zubereitung der Wirkstoffe, die vorzugsweise isotonisch gemacht wird. Zubereitungen für Injektionen können auch durch Suspendieren oder Emulgieren der Verbindungen in einem nicht-wässrigen Lösungsmittel wie z. B. Pflanzenöl, synthetischen aliphatischen Säureglyceriden, Estern von höheren aliphatischen Säuren oder Propylenglycol formuliert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung der vorstehenden Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines neoplastischen Zellwachstums in einem Lebewesen bereit, das einer solchen Behandlung bedarf, welche die Verabreichung einer Menge der vorstehenden pharmazeutischen Zusammensetzung an das Lebewesen umfasst, die zur Behandlung des neoplastischen Zellwachstums wirksam ist.
Der Begriff "Behandlung" umfasst die partielle oder vollständige Inhibierung des neoplastischen Zellwachstums oder des retroviralen Wachstums, der Proliferation und/oder Ausbreitung, sowie die partielle oder vollständige Zerstörung der neoplastischen Zellen oder Retroviren und/oder der retroviral infizierten Zellen. Der Begriff "Lebewesen" umfasst einen Menschen oder ein Tier, bei dem Krebs oder eine retrovirale Infektion diagnostiziert worden ist.
Die Verabreichung kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden, wie z. B. oral, rektral, lokal, intravenös, subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal.
Die Dosierungsform und -menge kann im Hinblick auf bekannte antineoplastische Behandlungen oder prophylaktische Maßnahmen einfach ermittelt werden. Im Allgemeinen wird die Dosierung der Verbindung jedoch im Bereich von etwa 0,1 ug/kg bis etwa 100 mg/kg liegen. Die tatsächliche Dosis wird von dem Verabreichungsweg, den pharmakokinetischen und toxikologischen Eigenschaften der einzelnen Verbindung sowie von den gewünschten Ergebnissen abhängen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I und II sind zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von retroviralen Infektionen in einer Zeilpopulation, einschließlich menschlichen und tierischen Zellen geeignet, wobei die Behandlung das In- Kontakt-Bringen der Zellpopulation oder die Verabreichung an ein Lebewesen mit retroviral infizierten Zellen einer wirksamen Menge mindestens einer Verbindung der Formeln 1 und/oder II umfasst.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I und II können in vielen retroviralen Systemen dahingehend wirken, dass sie die Ausbreitung des infektiösen Virus einschränken. Andere Retroviren, die durch die erfindungsgemäßen Verbindungen inhibiert werden können, umfassen unter anderem HTLV-I, HTLV-II, BLV, EIAV, FIV, SIV, STLV und Visna-Virus.
Erste Experimente mit Verbindungen der Formeln I und II zeigten, dass diese Substanzen sowohl die Integrations- als auch die Disintegrationsschritte in einem in vitro-Experiment inhibierten, bei dem die gereinigte HIV-1-Integrase mit voller Länge verwendet wurde. Diese Verbindungen und verschiedene andere wurden in einem antiviralen Test geprüft, der periphere Blutlymphozyten umfasste, die mit HIV-1 infiziert worden sind.
Obwohl die hier beschriebenen Verbindungen wirksame und relativ sichere Medikamente zur Behandlung von HIV-Infektionen sind, ist die mögliche gleichzeitige Verabreichung dieser Formulierungen mit anderen antiviralen Medikamenten oder Mitteln, um günstige Ergebnisse zu erhalten, nicht ausgeschlossen. Solche anderen antiviralen Medikamente oder Mittel umfassen lösliches CD4, Thalidomid, Didesoxyinosin, Didesoxythymin, Zidovudin, Didesoxycytidin, Gancyclovir, Acyclovir, Phosphonoformiat, Amatradin, Ribavarin, antivirale Interferone (z. B. α-Interferon, α-Interferon oder Interleukin-2) oder Aerosol-Pentamidin und andere Substanzen, die bei der Anti-HIV-Therapie verwendet werden.
Die Behandlung infizierter Zellen zur Inhibierung der Virusaktivität kann einen spezifischen Zeitraum umfassen oder kontinuierlich sein. Die Virusaktivität kann durch Überwachen der Virusproteinkonzentrationen, wie z. B. von p24, durch Messen der Konzentration der reversen Transkriptase, durch Überwachen der Virusprotein-Aktivität durch ³&sup5;S-met-Puls- Chase-Markierung und Immunpräzipitationsexperimente oder durch andere dem Fachmann bekannte Verfahren gemessen werden (S. Kayeyama et al., AIDS Res. and Human Retroviruses, 10, 735-745 (1994)).
Die vorliegende Erfindung wird in dem nachstehenden experimentellen Teil beschrieben, in dem spezielle Beispiele erläutert werden, die dem Verständnis der Erfindung dienen und nicht beschränkend aufzufassen sind.

Materialien und Verfahren

Alle verwendeten Lösungsmittel waren analysenrein. Alle Reagenzien wurden entweder von Aldrich Chemicals oder von Fluka erworben und wurden im Lieferzustand verwendet. Die Schmelzpunkte wurden mit einer Elektrothermal-Kapillarschmelzpunktsapparatur gemessen und wurden nicht korrigiert.

Chemische Synthese

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen beide Chromophore identisch sind, wurden gemäß dem in Fig. 1 gezeigten Weg hergestellt. Das Zwischenprodukt Chlornitroacridon 1 wurde gemäß bekannter Verfahren hergestellt (D. B. Capps et al., J. Med. Chem., 35, 4770- 4778 (1992); K. Lehmstedt et al., Chem. Berichte, 70, 1526-1538 (1937)) oder mit dazu analogen Verfahren hergestellt. Das Acridon wird mit einer äquivalenten Menge eines geeigneten Piperidinderivats 2 umgesetzt, wobei das Bisnitroacridon 3 erhalten wird, das dann mit Ameisensäure und Zinn(II)-chlorid umgesetzt wird, wobei die Endverbindung Bisimidazoacridon 4 erhalten wird.
Symmetrische Arzneistoffe der Triazolo-Reihe wurden gemäß Fig. 2 hergestellt. Ein Acridon wird mit einem Überschuss eines Piperazinderivats derart umgesetzt, dass das Produkt 7 gebildet wurde.
Eine detaillierte Diskussion der Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen ist nachstehend angegeben.

Beispiel 1

1,4-Bis[3[(4-nitro(10H)-9-oxo-acridin-1-yl)amino]propyl]piperazin (3)

Ein Gemisch aus 1-Chlor-4-nitro-9(10H)-acridinon (1) (2,75 g, 0,01 mol), 50 mL DMSO, 1,4- Bis(3-aminopropyl)piperazin (2) (1,002 g, 0,005 mol) und Diisopropylethylamin (1,95 g, 0,015 mol) wurde 8 Stunden bei 80ºC gerührt. Dem Reaktionsgemisch wurden 100 mL einer 1 %igen wässrigen Natriumhydroxidlösung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 min gerührt und über Nacht in einem Kühlschrank aufbewahrt. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und aus DMA kristallisiert, wobei 2,74 g (81%) gelbes (3) erhalten wurden. Schmp.: 274-279ºC (Zersetzung). Anal. (C&sub3;&sub6;H&sub3;&sub6;N&sub8;O&sub6;·H&sub2;O) C, H, N.

1,4-Bis[3[(6-oxo-6H-imidazo[4,5,1-de]-acridin-5-yl)amino]propyl]piperazin (4)

2,03 g (0,003 mol) (3) wurden in 50 mL 85%iger Ameisensäure gelöst. Der Lösung wurde eine Lösung von 5,7 g (0,03 mol) SnCl&sub2; in 6 mL konzentrierter Chlorwasserstoffsäure zugesetzt und das Gemisch wurde unter Rückfluss 36 Stunden gerührt. Nach dem Abkühlen wurde der Niederschlag abfiltriert, mit 50 mL Methanol gewaschen, in 300 mL Wasser überführt und mit 10%igem wässrigem Natriumhydroxid alkalisch gemacht. 30 mL Chloroform-Methanol-Gemisch (10 : 1) wurden zugesetzt und das Gemisch wurde 2 Stunden heftig gerührt. Ungelöstes Material wurde abfiltriert und die Chloroformschicht wurde abgetrennt. 2 g Silicagel wurden dem Extrakt zugesetzt und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Das Gel wurde dann auf eine Silicagelsäule aufgegeben und mit Chloroform-Methanol (10 : 1) eluiert. Die Hauptfraktion wurde gesammelt und nach dem Verdampfen der Lösungsmittel wurden 1,05 g (55%) gelbes (4) erhalten. Schmp.: 289- 293ºC (Zersetzung). Anal. (C&sub3;&sub8;H&sub3;&sub6;N&sub8;O&sub2;·H&sub2;O) C, H, N.

1,4-Bis[3-[(6-oxo-6H-v-triazolo[4,5]de]-acridin-5-yl)amino]propyl]piperazin (6)

Ein Gemisch aus 5-Chlor-6H-v-triazolo[4,5]-de]-acridin-6-on (5) (5,12 g, 0,02 mol), 60 mL DMSO, 1,4-Bis(3-aminopropyl)piperazin (2) (2,003 g, 0,01 mol) und Diisopropylethylamin (2,6 g, 0,02 mol) wurde 20 Stunden bei 100ºC gerührt. Dem Reaktionsgemisch wurden 150 mL einer 2%igen wässrigen Natriumhydroxidlösung zugesetzt, das Gemisch wurde 10 min gründlich gerührt und über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Der Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt, mit Wasser gewaschen, in 200 mL einer 1%igen wässrigen Lösung von Methansulfonsäure überführt und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Ungelöstes Material wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde mit einer wässrigen Natriumhydroxidlösung alkalisch gemacht. Der Niederschlag der freien Base wurde durch Filtration abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann zweimal aus siedendem DMA kristallisiert, wobei 3,84 g (60%) gelbes (6) erhalten wurden. Schmp.: 242-245ºC. Anal. (C&sub3;&sub8;H&sub3;&sub4;N&sub1;&sub0;O&sub2;·H&sub2;O) C, H, N. Die Struktur von (6) wurde durch eine Einkristall- Röntgenstrukturanalyse bestätigt. Für biologische Tests wurden die freien Basen von (4) und (6) in die wasserlöslichen Salze überführt, wie z. B. das Methansulfonat oder das Hydrochlorid.

Beispiel 2

Dihydrochlorid von 6

6 (1,2 g, 0,002 mol) wurde in einem siedenden Gemisch von 10% Methanol in Chloroform (400 mL) gelöst. Der heißen Lösung wurden 10 ml 0,4 M Chlorwasserstoffsäure in Methanol (erzeugt durch Auflösen von Acetylchlorid in Methanol) zugesetzt und es wurde einige Minuten gerührt. Die Lösung wurde durch Verdampfen auf etwa 100 mL eingeengt. Es wurden 100 mL Ether zugesetzt und der gelbe Niederschlag des Salzes wurde durch Filtration abgetrennt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute 100%, Schmp. > 300ºC (Zersetzung). Anal. (C&sub3;&sub6;H&sub3;&sub4;N&sub1;&sub0;O&sub2;·2HCl·H&sub2;O) C, H, N.
Die Wirkung der Verbindung (4) wurde gegen verschiedene Tumor-Xenotransplantate in vitro getestet. Die Experimente wurden mit Zelllinien durchgeführt, die von diesen Tumoren abgeleitet waren, und zwar unter Verwendung eines Standard-Klonagen-Testprotokolls. Der Mittelwert IC&sub7;&sub0; (d. h. die Konzentration der Chemikalie, dis zur Abtötung von 70% der Tumorzellen geführt hat) betrug für alle getestete Linien 2,3 ug/mL. Der Magenkrebs GFX (251/14) war bei der mittleren Dosis empfindlich. Der Brusttumor MACL (MCF7X/13) erforderte jedoch die zweifache mittlere Dosis. Das Melanom MEXF (514/12) sowie das Nierenkarzinom RXF (1220/5) waren gegenüber dem Arzneistoff vollständig unempfindlich. Die Prostatakrebs-Zelllinien PRXF (PX2M/27 und DU145X/2) waren gegenüber dem Arzneistoff sehr empfindlich, insbesondere gegenüber PC3M, bei dem weniger als 1 ng/mL erforderlich waren, um 1070 zu erreichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.
Es wurden Experimente mit verschiedenen Verbindungen durchgeführt. Diese Verbindungen mit ihren verschiedenen Bezeichnungen haben die folgenden Formeln:
Experimente mit WMC-26 und WMC-42 zeigen, dass diese Verbindungen sowohl die Integrations- als auch die Disintegrationsschritte in einem in vitro-Experiment inhibierten, bei dem eine gereinigte HIV-1-Integrase mit voller Länge eingesetzt wurde. Diese Verbindungen und verschiedene andere wurden dann in einem Cytoprotektionstest untersucht, bei dem periphere Blutlymphozyten beteiligt waren, die mit HIV-1 infiziert worden sind.
Kurz gesagt werden die infizierten Zellen in Kultur durch das Virus abgetötet und die Cytotoxizität wird durch die Bildung einer Farbe aufgrund der Oxidation eines Formazan- Farbstoffs (XTT) durch Enzyme nachgewiesen, die von den sterbenden Zellen abgegeben werden (Weislow et al., J. Natl. Cancer Inst., 81, 577-586, 1989). Ein wirksamer antiviraler Arzneistoff kann die infizierten Zellen vor Cytotoxizität durch Inhibierung einiger vitaler Funktionen des Virus schützen. Folglich hängt eine in vitro-Demonstration der antiviralen Wirkung von dem dosisabhängigen Schutz der cytopathischen Effekte des Virus durch die potentiellen Arzneistoffe ab. Die Fig. 4 und 5 zeigen die cytoprotektive Wirkung von WMC-26 und WMC-42. Da viele Arzneistoffe als solche toxisch für Zellen sein können, wird ein Parallelexperiment durchgeführt, bei dem nicht-infizierte Zellen mit den Arzneistoffen bis zu einer Konzentration behandelt werden, bei der die Zellen durch die Einwirkung des Arzneistoffs abgetötet werden. Diese Daten sind in den Fig. 6 und 7 angegeben. Es zeigt sich klar, dass beide Arzneistoffe die infizierten Lymphozyten bei Konzentrationen schützen konnten, die weit niedriger sind als diejenigen, bei denen eine durch den Arzneistoff ausgelöste Abtötung auftrat. Dies bedeutet, dass die Verbindungen bei diesem Test sehr gute therapeutische Indizes aufwiesen.
Als Folge dieser vorläufigen Daten wurden zusätzliche Experimente durchgeführt, um die antivirale Wirkung in anderen Zelllinien unter Verwendung verschiedener Protokolle zu ermitteln. Die vorläufigen Experimente in Lymphozyten wurden unter Verwendung von infizierten Makrophagen bestätigt. Viel ausführlichere Experimente wurden in HIV-1- infizierten CEM SS Leukämiezellen durchgeführt. Leider sind Verbindungen wie WMC-26 gegenüber Leukämie sehr (in nanomolarer Konzentration) cytotoxisch (Cholody et al., J. Med. Chem., 55, 2338-2245 (1995)) und es konnte nicht gezeigt werden, dass sie in diesem cytoprotektiv wirken. Es wurden jedoch zwei Derivate gefunden, die eine geringe antileukämische Wirkung hatten, während sie eine starke antivirale Wirkung aufrechterhielten. Die Fig. 8 und 9 zeigen die cytoprotektive Wirkung von WMC-50 bzw. WMC-70 in dieser Zelllinie. Während beide Verbindungen bei sehr niedrigen Konzentrationen eindeutig cytoprotektiv wirken, ist klar, dass WMC-70 wahrscheinlich ein besserer Arzneistoff ist, und zwar aufgrund seines überlegenen therapeutischen Index. Während folglich die Konzentration, bei der WMC-70 den cytotoxischen Effekt des Virus zu 50% inhibiert (der EC&sub5;&sub0;-Wert), weniger als 1 nM beträgt, tötet der Arzneistoff 50% der Zellen bei mehr als mikromolaren Konzentrationen. Dies ergibt einen therpeutischen Index von mehr als 3 Größenordnungen. Der entsprechende therapeutische Index für WMC50 liegt bei etwa 100 bis 200, was relativ akzeptabel ist. Zusätzliche Experimente wurden mit WMC-70 durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass der Arzneistoff weder die HIV-Protease noch deren reverse Transkriptase hemmte, zwei weitere wichtige Enzyme, die bei der viralen Replikation beteiligt sind. WMC-70 beschädigte auch nicht den gag-Protein-Zinkfinger, ein weiteres strukturelles Merkmal in dem Virus, von angenommen wird, dass es für die virale Replikation entscheidend ist. Interessanterweise schien die Behandlung des HIV-1-Virus selbst mit dem Arzneistoff seine Fähigkeit zur Infektion von CEM-Zellen zu verhindern. Ferner scheint WMC-70 die Posttranskriptionsvorgänge in dem Virus zu beeinflussen. Die Behandlung von Zellen, bei denen das gesamte Virus durch den Arzneistoff integriert worden ist, zeigt, dass das scheinbar normale virale gag p55-Polyprotein gebildet wird, dass dieses jedoch nicht weiter verarbeitet wird, d. h. es kann kein p24 nachgewiesen werden. Während die Inhibierung der Integration der prinzipielle Mechanismus zu sein scheint, durch den diese Verbindung ihre antivirale Wirkung ausübt, gibt es möglicherweise andere Mechanismen, die auch an der therpeutischen Wirkung dieses Arzneistoffs beteiligt sind, und auch bei anderen antiviralen Arzneistoffen dieser Klasse.
Die Verbindungen WMC-26, WMC-42, WMC-50 und WMC-70 sind wirksame antivirale Mittel, die eine potentielle Wirkung gegen HIV-Infektionen und gegen AIDS haben. ("WMC- 70" wird hier auch als "NSC 682405" oder "Temacrazin" bezeichnet.)

Beispiel 3

Antivirale Eigenschaften der Testverbindungen

Die antiviralen Eigenschaften der WMC-Reihe der Verbindungen wurden bewertet. Zunächst wurden alle Verbindungen mit dem XTT-Cytoprotektionstest hinsichtlich ihres Vermögens getestet, die HIV-1-Replikation in einer Zellkultur zu inhibieren. Dieser Test bestimmt die konzentrationsabhängige Fähigkeit der Verbindungen, die CEM-SS-Zellen vor den cytopathischen Effekten von HIV-1RF zu schützen. Die Konzentration der Verbindung, die 50 % Schutz bietet, ist der antivirale EC&sub5;&sub0;-Wert, während die Konzentration der Verbindung, die zu einem 50%igen Zelltod führt, der IC&sub5;&sub0;-Toxizitätswert ist. Wie es in Tabelle 1 gezeigt ist, waren die Verbindungen NSC 682401 bis 682403 inaktiv, was zeigt, dass bei fehlender Toxizität kein antiviraler Effekt beobachtet werden konnte. NSC 682404 hatte einen EC&sub5;&sub0;- Wert von 0,41 nM und einen IC&sub5;&sub0;-Wert von 158 nM, während Temacrazin einen EC&sub5;&sub0;-Wert von 1,1 nM und einen IC&sub5;&sub0;-Wert von 2,77 uM hatte (vgl. auch die Fig. 8 und 9). Folglich war Temacrazin die wirksamste Verbindung in dem XTT-Cytoprotektionstest. Diese Schlussfolgerung ergab sich auch, wenn die Verbindungen hinsichtlich einer anti-HIV-1- Wirkung gegen HIV-1ADA in menschlichen Monocyten/Makrophagen-Kulturen getestet wurden (Tabelle 1).

Beispiel 4

Mechanistische Eigenschaften der Testverbindungen

Daten von mechanistischen Studien gegenüber den bekannten antiviralen Zielen von HIV-1 sind auch in Tabelle 1 gezeigt. Die Verbindungen inhibierten nicht die Bindung von HIV-1 an Wirtszellen, die enzymatischen Aktivitäten von HIV-1-reverse Transkriptase oder -Protease oder die p7-Nucleocapsid-Proteinzinkfinger. Auf der Basis dieser Erkenntnisse haben sich unsere bisherigen Bemühungen auf die biologischen Tests der Temacrazin-Verbindung konzentriert. In einem Zeitverlaufstest verhinderte Temacrazin nicht die Bildung von proviraler DNA, die während der reversen Transkription auftritt, wie es durch die amplifizierte LTR/gag-Region der proviralen DNA gezeigt ist (Fig. 10). Temacrazin inhibierte die 3'- Prozessierung und die Strangtransferaktivität in einem in vitro-Test unter Verwendung von gereinigten Oligomeren und rekombinanter HIV-1-Integrase in einer konzentrationsabhängigen Weise mit einem EC&sub5;&sub0;-Wert zwischen 10 und 100 nM (Tabelle 1A).
Diese Erkenntnisse sind konsistent mit der Temacrazin-Wirkung als Inhibitor der HIV-1- Integrase, da die provirale DNA-Bildung vor dem Integrationsvorgang während des HIV-1- Replikationszyklus abgeschlossen ist. Experimentelle Verbindungen, welche die Virusbindung und -fusion inhibieren (z. B. Dextransulfat) und Verbindungen, welche die reverse Transkription hemmen (DDC, AZT, Nevirapin, usw.) verhindern die Bildung von proviraler DNA in dem Zeitverlaufstest. Tabelle 1
a XTT-Cytoprotektion bezieht sich auf Daten von dem Screening-Test.
b Die mechanistischen Studien für die Virionbindung, RT und Protease wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die Werte geben ID&sub5;&sub0;S wieder, welche die Konzentration wiederspiegeln, die die angegebene Aktivität um 50% inhibierte.
c Mit dem p7NC ZF-Test wurde die prozentuale Verminderung der relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) des Zinkfingers nach der Behandlung des p7NC-Proteins mit 25 uM jeder Verbindung für 10 min gemessen.
d "Inaktiv" zeigt an, dass die Verbindung bei dem Screening keine Wirkung zeigte.
e "NI" zeigt an, dass bei der angegebenen hohen Testkonzentration keine Inhibierung der Aktivität auftrat. Tabelle 1A: Wirkmechanismus-Studien für Temacrazin
¹ I&sub5;&sub0; sind die Arzneistoffkonzentrationen, die 50% der angegebenen Aktivität inhibieren.
² Positivkontrollen für einzelne Tests waren: Bindung: Farmatalia IC&sub5;&sub0; 1,1 uM (D.J. Clanton et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 5, 771 (1992)), Reverse Transkriptase-Inhibierung: rAdT-Templat/Primer-AZTTP 27 nM, rCdG-Templat/Primer-UC38 6 nM (J.P. Bader et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 88, 6740 (1991)), Protease-Inhibierung (HPLC-Nachweis der Spaltung von Ala-Ser-Glu-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Glu-Amidsubstrat): KNI-272 3 nM (S. Kageyama et al., Antimicrob. Agents Chemother., 37, 810 (1993)); Integrase-Inhibitor, ISIS 5320 (R.W. Buckheit Jr. et al., AIDS Res. Hum. Retrovir., 10, 1497 (1994)) und NCp7 Zn²&spplus; Ausstoß NSC 625151 (Dithian) (W. G. Rice et al., Antimicrob. Agents and Chemother., 41, im Druck (1997)).
³ Bindung von HIV-1RF an CEM-SS-Zellen, wobei die Bindung durch Bestimmung der Menge an Zell-gebundenem p24 durch einen p24-ELISA-Test von zellulären Lysaten bestimmt worden ist.
&sup4; NI steht für fehlende Inhibierung bei hoher Testkonzentration.
&sup5; Änderungen werden als relative Fluoreszenzeinheiten pro Zeiteinheit ausgedrückt.

Beispiel 5

Effekte von Temacrazin auf die späte Phase des HIV-1-Replikationszyklus

Als Modell für die Vorgänge während der späten Phase des HIV-1-Replikationszyklus wurden U1-Zellen verwendet, die latent mit zwei Kopien der proviralen HIV-1-DNA infiziert worden sind. Die starke Expression der Virusproduktion in diesen U1-Zellen kann durch bestimmte Faktoren stimuliert werden, wie z. B. TNF-α. U1-Zellen wurden mit TNF-α 24 Stunden stimuliert, worauf verschiedene Konzentrationen von Temacrazin zugesetzt wurden. Dann wurden die Kulturen 48 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen hinsichtlich ihrer Lebensfähigkeit und des Ausmaßes der Synthese und der Prozessierung von viralem Protein bewertet, während der zellfreie Überstand hinsichtlich des Gehalts an viralem p24 und des infektiösen Titers der freigesetzten Virionen bewertet wurde. Fig. 11 zeigt, dass die Virusproduktion (p24) bei Konzentrationen unter 4 nM inhibiert wurde und die freigesetzten viralen Partikel nicht-infektiös waren (ausgedrückt als infektiöse Einheiten pro mL, "IU/mL"). Die Lebensfähigkeit der Zellen verminderte sich oberhalb von 30 nM bei diesen U1-Zellen. Iriteressanterweise zeigt die Untersuchung der viralen Proteine durch Western-Blotting mit p7- und p24-Antiseren (Fig. 12), das das Gag-Vorläufer-Polyprotein (Pr55gag) synthetisiert worden ist, jedoch nicht durch die HIV-1-Protease in reife virale Proteine (p24 und p7NC) prozessiert worden ist.
In einer ähnlichen Studie wurden Zellen entweder 24 Stunden mit TNF-α und anschließender Zugabe von Temacrazin behandelt oder Temacrazin und TNF-α wurden gleichzeitig zugegeben oder Temacrazin wurde 24 Stunden nach der TNF-α-Zugabe zugegeben. Nach der TNF-α-Induktion und der Temacrazin-Behandlung wurden die Kulturen 72 Stunden fortgesetzt, worauf Virion-assoziiertes p24 und die Lebensfähigkeit der Zellen (XTT-Farbstoffreduktion) gemessen wurden. Temacrazin war ein effizienter Inhibitor der HIV-1-Virusreplikation in U1 (und auch in der latent infizierten Zelllinie ACH-2) mit einem EC&sub5;&sub0;-Wert im Bereich von 10 bis 100 nM. Darüber hinaus wurde die Temacrazin-vermittelte Virusinhibierung nicht signifikant durch die Zugabereihenfolge von Temacrazin und TNF-α beeinflusst.
Es wurde auch gefunden, dass ein 30-min-Puls von Kulturen mit Temacrazin zu einer anschließenden Produktion von infektiösen Viren nach der Stimulation mit TNF-α führte.

Beispiel 6

Direkte Inaktivierung von HIV-1 durch Temacrazin

Die mechanistischen Studien in Tabelle 1 zeigten, dass die Verbindung die HIV-1- Proteaseaktivität nicht inhibierte. Um jedoch sicherzustellen, dass der Test auf HPLC-Basis (in Tabelle 1 verwendet) genaue Ergebnisse lieferte, wurde die Wirkung von Temacrazin in dem Gag-Prozessierungstest bewertet. Bei diesem Test wurde gereinigtes rekombinantes HIV-1-Proteaseenzym mit dem Testreagenz eine Stunde bei 37ºC vorbehandelt und dann wurde das rekombinante Pr55gag-Vorläufer-Polyprotein dem behandelten Enzym ausgesetzt. Wie es in Fig. 13 gezeigt ist, konnte die Protease allein den Vorläufer effizient prozessieren. Darüber hinaus hatte die Vorbehandlung des Enzyms mit der Verbindung keinen inhibitorischen Effekt. Zusammen zeigen diese Erkenntnisse, dass Temacrazin das HIV-1- Proteaseenzym nicht inhibiert.

Signifikanz der Ergebnisse

Temacrazin zeigte eine starke Anti-HIV-1-Wirkung in Modellen mit akuter Infektion gegen lymphocytotrope HIV-1-Stämme in proliferierenden Zellen und gegen monocytotrope HIV-1- Stämme in nicht-proliferierenden normalen Zellen. Darüber hinaus zeigt die Verbindung eine antivirale Wirkung auf vorher infizierte Zellen. Die genaue Natur des Effekts in der späten Phase wird gegenwärtig untersucht. Auf jeden Fall inhibierte Temacrazin die Produktion neuer infektiöser Viren von vorher infizierten Zellen stark. Dies ist eine sehr wichtige Wirkung der Verbindung, mit der Maßgabe, dass ein beliebiges Mittel zur Verminderung der Virusbelastung in HIV-1-infizierten Personen zu einer Abnahme in anschließenden Infektionszyklen in vivo führt. Darüber hinaus wäre die Fähigkeit der Verbindung, Virionen direkt zu inaktivieren, von großer Bedeutung, da dies den infektiösen Titer in Plasma effektiv vermindern würde und spätere Replikationszyklen und ein späteres Ansiedeln des Virus verhindern würde.

Beispiel 7

Der Start und die Regulation der HIV-1-Transkription erfordert eine komplexe Reihe von Wechselwirkungen mit zellulären Transkriptionsfaktoren, wie NFkB, SP-1 und AP-1, und die Mitwirkung von zellulären Faktoren in dem Transkriptionskomplex. Darüber hinaus erfordert das hier verwendete postintegrative Modell TNF-α-stimulierte U1- und ACH-2-Zellen und nicht nur die Mitwirkung des NFkB-Transkriptionskomplexes, sowie auch Komponenten des TNF-α-Signalgebungswegs. Um auszuschließen, dass Temacrazin die Transkription unspezifisch beeinflusst oder die Replikation durch Störung des TNF-α-Signalgebungswegs nach unten reguliert, wurde die LTR-gerichtete Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) - Aktivität in BF-24-Zellen gemessen. BF-24-Zellen sind von der monocytischen THP-1- Zelllinie abgeleitet und tragen ein stabil integriertes CAT-Gen unter der Transkriptionskontrolle von HIV-1-LTR (S. Schwartz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 7200 (1989); B.K. Felber et al., Science, 239, 184 (1988)). LTR in dieser monocytischen Zeltlinie ist durch IL-6, PMA und TNF-α induzierbar und erzeugt enzymatisch aktive Chloramphenicoltransferase ("CAT"). Die Induktion der CAT-Enzymaktivität durch TNF-α findet in Abwesenheit von viralen Komponenten statt und wird als Folge die Wirkungsmechanismen identifizieren, die von dem regulatorischen Virusprotein unabhängig sind. BF-24-Zellen wurden mit TNF-α stimuliert und 24 Stunden mit Temacrazin behandelt und anschließend wurden zelluläre Proteine zur Bestimmung der CAT-Enzymaktivität gesammelt (Fig. 14).
Die CAT-Aktivität wurde unter Verwendung eines fluoreszierenden Bodipy-konjugierten Chloramphenicols nach 18 Stunden Reaktion mit 50 ug des Proteinextrakts, der Acetyl-CoA enthielt, bestimmt. Fig. 14 zeigt, dass BF-24-Zeilen allein eine niedrige intrinsische CAT- Aktivität aufweisen, die durch TNF-α um mindestens das 20-fache induzierbar ist. Die Behandlung von BF-24-Zellen mit bis zu 5 uM Temacrazin veränderte die CAT-Induktion nicht signifikant. Entsprechend war AZT, das die Temacrazin-Aktivität nicht beeinflusst, da für die CAT-Expression keine reverse Transkription erforderlich ist, inaktiv. Obwohl diese Daten gegen einen unspezifischen Transkriptions/Translationseffekt sprechen, wurden spezifische Experimente durchgeführt, um diese Hypothese zu verifizieren. Der Einbau von ³H-Leucin (zur Messung des Pröteinmetabolismus), ³H-Thymidin (zur Messung der DNA- Replikation) und ³H-Uridin (zur Messung der RNA-Produktion) in CEM-SS-Zellen wurde bestimmt und es wurde gefunden, dass Temacrazin keine Effekt auf diese zellulären Parameter hatte. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass die antivirale Aktivität von Temacrazin nicht auf eine unspezifische Abwärtsregulierung der Transkription zurückzuführen ist und dass sie die Beteiligung eines oder mehrerer viraler Faktoren erfordert.

Beispiel 8

Temacrazin inhibierte die Expression von ungespleißter oder einfach gespleißter mRNA bei 500 und 50 nM, wenn es entweder vor oder 24 Stunden nach der TNF-α-Induktion gegeben wurde. Entsprechende Ergebnisse zeigten sich, wenn Temacrazin und TNF-α gleichzeitig zugegeben wurden. Im Gegensatz dazu hatte Temacrazin die Expression von mehrfach gespleißten HIV-1-Transkripten nicht verändert, wenn RT-PCR-Primer verwendet wurden, die so gestaltet waren, dass sie alle mehrfach gespleißten revunabhängigen mRNA detektieren konnten (Fig. 15).
Als Kontrolle wurde das Haushaltsgen Porphobilinogendeaminase (Hydroxymethylbilansynthase, "PBGD") amplifiziert, um die Einheitlichkeit der Beladung zu bestimmen. Da der Arzneistoff die PBGD-Expression nicht verminderte, zeigt dies, dass Temacrazin die Transkription nicht unspezifisch nach unten reguliert.

Beispiel 9

Um die Möglichkeit zu bewerten, dass Temacrazin die HIV-1-mRNA-Expression reguliert, wurde die Expression der Gesamt- HIV-1-mRNA durch Northern-Blotting untersucht (Fig. 16).
Fig. 16 zeigt, dass nach der Stimulierung mit TNF-α die HIV-1-spezifische mRNA- Expression in U1-Zellen dramatisch zunimmt. Die Behandlung von TNF-α-stimulierten U1- Zellen mit 10 und 100 nM Temacrazin unterdrückte die mRNA-Produktion insgesamt und erzeugte einen Phänotyp, der in seiner Erscheinung dem von unstimulierten U1-Zellen sehr ähnlich ist ("rev"-unabhängiger Phänotyp). Die Behandlung mit 1 nM Temacrazin führte jedoch zu einer Abnahme der einfach gespleißten und ungespleißten mRNA, ohne dass die mehrfach gespleißte mRNA sichtbar abnahm. Diese Muster der RNA-Inhibierung legen nahe, dass Temacrazin die Expression der rev-responsive element (RRE) -enthaltenden mRNA inhibiert oder verändert.

Beispiel 10

In vivo-Daten

Der neue Wirkmechanismus von Temacrazin und dessen breiter Wirkungsbereich gegen HIV-1 und dessen hoher therapeutischer Index führten uns zur Bewertung von dessen in vivo-Eigenschaften und dessen antiviralen Eigenschaften in einem Nacktmaus- Hohlfasermodell der HIV-1-Replikation. Kurz gesagt werden CEM-SS-Zellen mit HIV-1-RF infiziert, in Hohlfasern eingebracht und intraperitoneal oder subkutan in Nacktmäuse implantiert. Temacrazin in einem DMSO-Vehikel wurde intraperitoneal entweder 3x, 2x oder 1x pro Tag mit einer Gesamtdosierung von 25 mg/kg pro Tag für 6 Tage verabreicht. Entsprechend werden die Mäuse durch orale und intravenöse Verabreichung von Temacrazin behandelt. Peritonealspülungen und Serumproben wurden gesammelt und die p24-Expression wurde durch Antigen-Einfang bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die intraperitoneale Verabreichung von Temacrazin verminderte die Menge des nachweisbaren p24 in den Peritonealspülungen um das 5- bis 10-fache, und zwar unabhängig von dem Dosierungsschema. Temacrazin verminderte auch die Menge von p24 im Serum. Folglich vermindert Temacrazin die HIV-1-Replikation in vivo.
Die hier vorgestellten Experimente zeigen, dass Temacrazin durch die Wechselwirkung mit einem postintegrativen Vorgang in dem HIV-Lebenscyclus in infizierten Zellen wirkt. Diese Wechselwirkung führt zu dem Verlust von viralen Transkripten mit einer selektiven Abreicherung von ungespleißten und einfach gespleißten Transkripten. Dieser Arzneistoff wirkt durch einen neuen antiviralen Wirkmechanismus. Die Brauchbarkeit von Temacrazin und dessen verwandten Verbindungen als potenzielle antivirale Mittel wird darüber hinaus weiter durch die Fähigkeit von Temacrazin erhöht, die HIV-1-Replikation in einem in vivo- Modell zu inhibieren. Tabelle 2
Nacktmäusen wurden Mohlfasern implantiert, die HIV-1RF-infizierte einkernige periphere Blutzellen enthielten, und den Nacktmäusen wurden Temacrazin-Dosierungen verabreicht (Gesamtdosis 25 mg/kg).
¹ Student-t-Test.
² Alle Verbindungen wurden intraperitoneal verabreicht.
³ q ist die Dosierungsfrequenz.
&sup4; Gruppen, die sich signifikant von Tieren unterschieden, denen DMSO allein injiziert worden ist.

Claims

1. Eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)

worin

R&sub1; und R&sub2; unabhängig -H, -OH, Amino-, C&sub1;-C&sub8; Alkylamino-, C&sub1;-C&sub8; Dialkylamino-, C&sub1;- C&sub8; Alkoxy-, C&sub1;-C&sub8; Alkyl-, C&sub1;-C&sub8; Halogenalkylgruppen oder Halogenatome sind;

n einen Wert von 2 bis 6 hat;

X und X' unabhängig -N oder -NO&sub2; sind;

Y und Y' unabhängig -N oder -CH oder -H sind, wobei eine gestrichelte Doppellinie eine Doppelbindung oder keine Bindung darstellt, und zwar derart, dass dann, wenn X oder X' -N ist, Y oder Y' -CH oder -N und die gestrichelte Doppellinie eine Doppelbindung ist, und dann, wenn X oder X' -NO&sub2; ist, Y oder Y' -H und die gestrichelte Doppellinie keine Bindung ist.

2. Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (II) zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der viralen Replikation, wobei die Verbindung die Forme

hat,

worin

R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;-C&sub8; Alkylgruppe ist;

n einen Wert von 2 bis 6 hat;

X und X' -N sind;

Y und Y' unabhängig -N oder -CH sind, wobei eine gestrichelte Doppellinie eine Doppelbindung darstellt, und zwar derart, dass dann, wenn X oder X' -N ist, Y oder Y' -CH oder -N und die gestrichelte Doppellinie eine Doppelbindung ist.

3. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der viralen Replikation, wobei die Verbindung die Formel

hat.

4. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der viralen Replikation, wobei die Verbindung die Formel

hat.

5. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der viralen Replikation, wobei die Verbindung die Formel

hat.

6. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Formel

hat.

7. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Formel

hat.

8. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach Anspruch 1, 6 oder 7 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.

9, Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, worin X und X' -N sind, oder nach einem der Ansprüche 2 bis 7, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung als antiretrovirales Mittel und antineoplastisches Mittei.