DE69119700T2

DE69119700T2 - Verwendung von Xanthinen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Hemmung der Vermehrung menschlicher Retroviren

Info

Publication number: DE69119700T2
Application number: DE69119700T
Authority: DE
Inventors: Bruce J Dezube; William J Novick; Arthur B Pardee; Ruth M Ruprecht
Original assignee: Hoechst Roussel Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1990-11-07
Filing date: 1991-10-28
Publication date: 1996-11-07
Anticipated expiration: 2011-10-29
Also published as: DK0484785T3; DE69119700D1; CA2055041A1; EP0484785A2; ES2087205T3; IE913879A1; TW209169B; JPH054922A; EP0484785A3; IL99966A0; KR920009397A; AU649278B2; HU913502D0; PT99434A; ATE138266T1; ZA918801B; EP0484785B1; AU8699891A; GR3020017T3; HUT61468A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Xanthinverbindungen der Formel (II) zur Herstellung eines Medikamentes zum Inhibieren der Replikation von menschlichen Retroviren, wie des Human-Immundefizienz-Virus vom Typ 1 (HIV- 1). Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung von Xanthinverbindungen der Formel (II) zur Herstellung eines Medikamentes zum Inhibieren der Proliferation von menschlichen Retroviren, gemessen durch Verminderung der Aktivität der Umkehr-Transkriptase.
Das erworbene Immundefizienz-Syndrom ist ein Zustand, der zur Zeit in Nordamerika, Europa und Zentralafrika von höchster Bedeutung ist. Man nimmt an, daß das AIDS auslösende Mittel ein Retrovirus, nämlich HIV-1, ist. Jüngsten Schätzungen zufolge wird vermutet, daß mindestens 1,5 Millionen Amerikaner vom sogenannten HIV-1 AIDS-Virus betroffen sein könnten und daß bis 1991 15 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten mit dem Virus infiziert worden sein könnten. Die betroffenen Individuen weisen schwere Immunsuppressionen auf, denen degenerative und sogar tödliche Krankheiten folgen können.
Die Isolierung und Charakterisierung des ersten als LAV bekannten und später als HIV-1LAV bezeichneten AIDS-Retrovirus wurde in einer Arbeit von F. Barre-Sinoussi et al., Science, 220:868-871 (1983), offenbart. Die Verwendung von einigen Extrakten dieses Virus und einigen seiner Proteine zur Auffindung von Antikörpern gegen das Virus wird in der US-Patentschrift Nr. 4 708 818 beschrieben.
Verschiedene Isolate des AIDS-Retrovirus wurden in der Folge von verschiedenen Forschern erwähnt, und die Isolate wurden in der Literatur unter verschiedenen Bezeichnungen geführt. Es wird nun allgemein anerkannt, daß Viren, die früher als Lymphadenopathie verbundenes Virus (LAV), Immundefizienz verbundenes Virus (IDAV 1 und IDAV 2), menschliches T-lymphotropes Virus Typ III (HTLV-III) und AIDS verwandtes Virus (ARV) allesamt Varianten des gleichen Retrovirus sind. Siehe beispielsweise Nature, 313.636-637 (1985).
Ein vom Internationalen Komitee für die Taxonomie von Viren bevollmächtigtes Unterkomitee machte den Vorschlag, die AIDS-Retroviren offiziell als Itmenschliche Imundefizienz-Viren" ("Human Immunodeficiency Viruses", abgekürzt "HIV") zu bezeichnen. Isolate von menschlichen Retroviren mit klarer, jedoch begrenzter Verwandtschaft mit Isolaten von HIV (beispielsweise mehr als 20 %, jedoch weniger als 50 % Nukleinsäuresequenzidentität) sollen nicht als HIV bezeichnet werden, wenn nicht zwingende biologische und strukturelle Ähnlichkeiten mit bestehenden Mitgliedern dieser Gruppe vorhanden sind. Science, 232:697 (1986).
Ein weiteres, HIV-2 (früher LAV-2) genanntes, pathogenes menschliches Retrovirus wurde von westafrikanischen AIDS-Patienten gewonnen. Clavel et al., Science, 233:343-346 (1986). Eine HIV-2-Infektion ist mit einem Immundefizienzsyndrom verbunden, das von dem vom AIDS-Prototypusvirus verursachten HIV- 1-Syndrom klinisch nicht unterscheidbar ist. HIV-2 steht in Beziehung zu HIV-1 und dem dadurch ausgelösten Immundefizienzsyndrom, unterscheidet sich jedoch von diesem durch eine deutlich niedrigere Häufigkeit. Guyader et al., Nature, 326:662-669 (1987).
Genetisch verwandte und dem HIV biologisch ähnliche Retroviren wurden aus subhumanen Primaten isoliert. Diese Retroviren werden als immundefiziente Viren der jeweiligen Wirtsspezies bezeichnet, wie das Simian-Immundefizienzvirus (SIV). Das SIV wurde erstmals von in Gefangenschaft gehaltenen Rhesusaffen (Macaca mulatta) am New England Regional Primate Research Center (NERPRC) isoliert. Kanki et al., Science 228:1199 (1985). Darauffolgte bald der Bericht über die Isolierung eines als STLV-III bezeichneten SIV von afrikanischen Meerkatzen. Kanki et al., Science 230:951 (1985). Es herrscht eine umfassende serologische Kreuzreaktivität zwischen HIV-2 und SIV.
Die HIV-Übertragung erfolgt häufig durch Sexualkontakt, obgleich auch Menschen, die Narkotika intravenös nehmen, gleichfalls eine stark gefährdete Gruppe darstellen. Eine große Zahl von Menschen wurde auch nach der Verabreichung von kontaminiertem Blut oder Blutprodukten mit HIV infiziert. Außerdem wurden HIV-infizierten Müttern HIV-infizierte Kinder geboren.
Man glaubt, daß das Virus von den infizierten Müttern auf ihre Föten übertragen wird.
Das Auftreten von multiplen Human-Immundefizienz-Viren, wie HIV-1 und HIV-2, stellt ein komplexes epidemiologisches Bild dar. Die HIV-Infektion stellt zur Zeit die Nummer Eins der öffentlichen Gesundheitsgefährdung in den Vereinigten Staaten und eine Haupttodesursache in bestimmten stark bevölkerten Gebieten dar. Es ist bekannt, daß Pentoxifyllin die Entstehung des Lipopolysaccharid-induzierten Monocyten-derivierten Tumornekrosefaktors (Biochem. Biophys. Res. Communication, 155 (3), (1988), Seiten 1230 - 1236) unterdrückt und daß der Tumornekrosefaktor und der Überstand von Lipopolysaccharid-stimulierten Monocyten potente Aktivatoren der HIV-Produktion sind (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989), Seiten 5974 - 5978).
Die EP 0 305 743 offenbart die Verwendung von Pentoxifyllin in einem kombinierten Präparat mit sulfatierten Polysacchariden für die Behandlung von Retroviruserkrankungen.
EP 0 232 438 offenbart die Verwendung von Xanthinderivaten für die Herstellung eines Medikamentes, das die Aktivität aufweist, den Wirtsverteidigungsmechanismus einem Trauma gegenüber zu verbessern.
Man ist allgemein der Meinung, daß ein wirksamer Impfstoff oder eine wirksame pharmazeutische Zusammensetzung gegen eine HIV-Infektion entwickelt werden muß, um gegen die Verbreitung dieser Retroviren anzukämpfen. Die Arbeit an der Entwicklung eines Impfstoffes macht Fortschritte, ein wirksames Mittel wurde jedoch noch nicht gefunden. Es besteht daher in der Technik ein Bedarf an einer Methode zur Hemmung der Aktivität von Human-Retroviren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung hilft bei der Befriedigung dieser Bedürfnisse in der Technik. Im spezielleren schafft die vorliegende Erfindung eine Verwendung von Xanthinverbindungen der Formel (II) zur Herstellung eines Medikamentes zum Inhibieren der Replikation von Retroviren, wie das Human-Immundefizienzvirus (HIV). Die Verwendung umfaßt eine Verabreichung eines Xanthins an einen menschlichen Wirt, das befähigt ist, eine Schutzwirkung auszuüben oder eine retrovirale Replikation zu verhüten.
Die vorliegende Erfindung liefert die Verwendung einer kombinierten Menge von
A) einer Verbindung der Formel II
worin
a) einer der Reste R¹ und R³ eine verzweigte Hydroxyalkylgruppe mit der Formel
darstellt, worin R&sup4; für eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen steht und n eine ganze Zahl von 2 bis 5 bedeutet, während die andere Gruppe R¹ oder R³ ein Wasserstoffatom oder eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, deren Kohlenstoffkette durch bis zu 2 Sauerstoffatome unterbrochen sein kann oder durch eine Hydroxy- oder Oxogruppe substituiert sein kann, oder
b) einer der Reste R¹ und R³ eine Oxoalkylgruppe mit der Formel
darstellt, worin R&sup5; für C&sub1;-C&sub6;-Alkyl steht und p den Wert 2, 3 oder 4 aufweist, während der andere Rest R¹ oder R³ ein Wasserstoffatom oder eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, deren Kohlenstoffkette durch bis zu 2 Sauerstoffatome unterbrochen sein kann oder durch eine Hydroxy- oder Oxogruppe substituiert sein kann, oder
c) R¹ und R³
1) eine verzweigte Hydroxyalkylgruppe der Formel
worin R&sup4; wie oben definiert ist, oder II) eine Oxoalkylgruppe mit der Formel
bedeuten, worin R&sup5; wie oben definiert ist; und R² eine C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe darstellt; und
B) einem antiviralen Mittel, ausgewählt aus der aus 3'- Azido-2',3'-dideoxythymidin (AZT); 2',3'-Dideoxycytidin (ddc); 2',3'-Dideoxyadenosin (ddA); und 2',3'-Dideoxyinosin (ddI); oder Kombinationen dieser Mittel bestehenden Gruppe;
für die Herstellung eines zum Inhibieren der Replikation eines Human-Immundefizienz-Virus wirksamen Medikamentes.
Das Xanthin der Formel (II) wird in einer Menge verwendet, die bei der Hemmung der Replikation der Retroviren wirksam ist. Die bekannte pharmazeutische Verbindung Pentoxifyllin ist ein Beispiel einer Verbindung innerhalb der allgemeinen Formel (II). Pentoxifyllin ist im Handel unter der Handelsmarke Trental in der Form von Tabletten zur oralen Verabreichung erhältlich. Obgleich diese Verbindung als ein Pharmazeutikum zur Verbesserung der Fließeigenschaften von Blut (klinische Versuche im Jahr 1971) verwendet worden sind, wurde nichts über eine Wirksamkeit als Inhibitor einer retroviralen Replikation berichtet.
Das ausweichende Verhalten und die Verschiedenartigkeit von HIV haben eine definitive Behandlung schwierig gemacht. Hier werden ein Mittel und eine Ahwendung präsentiert, die befähigt sind, bei der Verhütung der Verbreitung einer HIV-Infektion und bei der Behandlung einer derartigen Infektion durch Verabreichung des Xanthins in einer Kombination mit einem antiviralen Mittel an einen Menschen in einer ausreichenden Menge, daß eine Replikation von HIV in vivo verhütet oder wenigstens inhibiert wird, zu helfen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Bestimmte Xanthine werden gemäß der vorliegenden Erfindung zur Hemmung der Replikation eines menschlichen Retrovirus verwendet. Die Beschaffenheit der in der vorliegenden Erfindung ursprünglich involvierten biologischen Prozesse wird beschrieben. Danach folgt eine detaillierte Beschreibung der Xanthine und der Methoden zur Herstellung der Xanthine. Die durch In-vitro-Tests erhaltenen Ergebnisse werden dann angefuhrt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung kann zum Inhibieren der Replikation eines Human-Retrovirus eingesetzt werden, welches ein umhüllter Einzelstrang-RNA-Virus ist. Das Virus enthält Umkehrtranskriptase (RT), welche verwendet wird, um die Transkription des RNA-Genoms des Virus in die als das Provirus bekannte DNA-Form zu katalysieren. Die DNA-Form läßt sich in die Wirts-DNA-Zelle eingliedern. Vorzugsweise werden die Xanthine, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, zum Inhibieren der Aktivität des Human-Immundefizienzvirus (HIV) einschließlich HIV-1 und HIV-2 verwendet.
Die vorliegende Erfindung ist für die Behandlung von entweder mit HIV infizierten oder für eine HIV-Infektion anfälligen Menschen nützlich. Die Erfindung ist im speziellen zum Inhibieren der Aktivität von HIV-1 oder HIV-2 in hiemit infizierten Menschen nützlich. Während die vorliegende Erfindung unter Hinweis auf in der Literatur als LAV-I, HTLV-III und LAV- II identifizierte Humanisolate beschrieben wird, ist es selbstverständlich, daß die vorliegende Erfindung sich auf die gleichen oder äquivalente Retroviren erstreckt. Von diesen Retroviren wird vermutet, daß sie auslösende Mittel von AIDS sind.
Zum Zwecke der vorliegenden Offenbarung wird ein Virus als dem LAV/HTLV-III gleich oder äquivalent angenommen, wenn es im wesentlichen die folgenden Kriterien erfüllt:
(a) Das Virus is trophisch für T-Lymphocyten, im speziellen für T-Helferzellen (CD4&spplus;);
(b) Das Virus ist cytopathisch für infizierte CD4&spplus;-Zellen;
(c) Das Virus kodiert für eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (Umkehrtranskriptase), welche Mg&spplus;&spplus;-abhängig ist und Poly(A)nOligo(dt)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Templat/Primer für die Umkehrtranskription verwenden kann;
(d) Das Virus ist im wesentlichen mit den durch die gag- und env-Bereiche von LAV/HTLV-III kodierten Proteinen kreuzweise reaktiv; und
(e) Das Virus teilt im wesentlichen eine Nukleotidhomologie (etwa 75-100 %) und eine Aminosäuresequenzhomologie (etwa 75-100 %) mit LAV oder HTLV-III.
Der in der Methode der Erfindung verwendete pharmazeutisch aktive Hauptbestandteil ist ein Xanthin. Der hierin verwendete Ausdruck "Xanthin" bezieht sich auf Verbindungen der Formel (II), die eine (prophylaktische) Schutzwirkung gegen eine HIV- Infektion, eine (therapeutische) Heilwirkung gegen eine HIV-Infektion haben oder die übertragung von HIV in Menschen verhindern. Der Ausdruck "Xanthine" bezieht sich auf Verbindungen der Formel (II), die vor dem Auftreten oder dem Erkennbarwerden einer HIV-Infektion mit dem Ziel der Verhütung oder Reduzierung des Auftretens einer Infektion verwendet werden. Der Ausdruck "Xanthine" bezieht sich auch auf Verbindungen der Formel (II) die therapeutisch wegen ihrer Wirkung auf eine etablierte HIV- Infektion verwendet werden. Weiters bezieht sich der Ausdruck "Xanthine" auf Verbindungen der Formel (II), die für die Verhütung einer Infektion von Menschen durch HIV-Vektoren nützlich sind, einschließlich der Xanthine der Formel (II), welche in den HIV-Replikationszyklus in einem menschlichen Wirt eingreifen oder diesen stören.
Der Mechanismus, nach dem die Xanthine der vorliegenden Erfindung die Replikation von HIV in vivo inhibieren, ist nicht vollkommen aufgeklärt. Es wurde gezeigt, daß die Xanthine der Formel (II) die HIV-1-Replikation hemmen, gemessen als RT-Aktivität der Überstände von infizierten Kulturen. Nichtsdestoweniger kann der Hemmungsmechanismus der Aktivität von Human- Retroviren auf einen Faktor oder auf eine Kombination von Faktoren zurückgehen, wie eine Veränderung einer oder mehrerer genotypischer oder phänotypischer Eigenschaften des Retrovirus oder eine Veränderung von viralen oder zellularen Prozessen. Außerdem gibt es Beweise, daß das Retrovirus in die Zelle eindringt; das Xanthin kann den Eintrittsvorgang ändern. Weiters können die Genomelemente, die die Expression der für die virale Replikation notwendigen Produkte regeln, geändert werden oder ihr Funktionieren kann durch das Xanthin beeinflußt werden. Das Xanthin kann daher beispielsweise die Beschaffenheit des Hüllenglycoproteins des Retrovirus verändern oder die Expression von verschiedenen Genen inhibieren. Die Xanthine können auch durch Mediieren der Funktionsweise des Reticuloendothelialsystems arbeiten, entweder vor oder nach dem Auftreten der HIV-Infektion. Die Xanthine können auch die Proliferation von HIV in infizierten phagocytischen Zellen hemmen. Es versteht sich, daß die Xanthine der Formel (II) auf jede dieser Arten oder in Kombinationen hievon oder auf andere, bisher noch nicht bekannte Arten funktionieren können. Auf jeden Fall können die Xanthine der Formel (II) an den Patienten in ausreichenden Mengen verabreicht werden, um eine oder mehrere dieser Wirkungen zu erzielen.
Die Anwendung der Xanthine gemäß der vorliegenden Erfindung in Patienten mit AIDS beruht auf der Hemmung einer HIV-Replikation, welche zu einer gewissen Regenerierung des Wirts führt und zumindestens eine weitere Verschlechterung des Immunsystems des Wirtes reduziert. Die Wirksamkeit der Xanthine bei der Verhütung oder Hemmung einer viralen Replikation und Infektion von Zellen kann unter Verwendung von Standard-in-vitro-Assays dargestellt werden. Beispielsweise kann die Hemmwirkung der Xanthine auf eine HIV-Infektion oder -Replikation durch Kultivieren des Virus oder der virusinfizierten Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit des Xanthins und anschließendes Vergleichen der Ergebnisse demonstriert werden.
Die Fähigkeit der Xanthine, die Replikation eines Human- Retrovirus zu inhibieren, kann in vitro durch Messen der Umkehrtranskriptaseaktivität demonstriert werden. Beispielsweise können konditionierte Medien aus mit Retroviren infizierten Zellen durch Ausfällen mit Polyethylenglykol oder durch Zentrifugieren konzentriert werden. Synthetische Templatprimer mit einem Gehalt an 12 bis 18 Basen eines DNA-Primers können an 300 Basen eines RNA Templats aneliert werden. Virionen mit einem Gehalt an RT können durch ein Reinigungsmittel aufgebrochen werden, wie Triton X-100. In Gegenwart eines entsprechend markierten Nukleosidtriphosphats, wie radioaktiv markierten Guanosintriphosphats, eines zweiwertigen Kations (üblicherweise Mg&spplus;&spplus;) und Kalium, kann die RT in wirksamer Weise das markierte Nukleotid in den DNA-Strang einarbeiten, wie durch die Nukleotidsequenz des RNA-Stranges vorgegeben. Dies führt zu einem durch Säure fällbaren, radioaktiv markierten RNA:DNA-Hybrid. Dieses Produkt kann in einem Flüssigkeitsscintillationszähler analysiert werden, und die Ergebnisse können als Picomole von Nukleosidmonophosphat, das je Zeiteinheit aufgenommen wird, oder - wenn die Ergebnisse mit einem Standard verglichen werden - als RT-Einheiten ausgedrückt werden. Zwei spezielle synthetische Templatprimer werden routinemäßig in diesem Assay verwendet: Poly(A)nOligo(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; und Poly(C)nOligo(dG). Der Templat/Primer Poly(C)nOligo(dG)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; ist Retrovirus-spezifisch und wird in wirksamer Weise durch humane retrovirale Umkehrtranskriptase in Gegenwart von Mg&spplus;&spplus; benutzt.
Die Hemmung einer HIV-1-Replikation kann auch unter Verwendung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern in einem Immunoassay festgestellt werden. Im spezielleren können bestimmte Immunoassays zum Screenen der Xanthine der vorliegenden Erfindung auf Wirksamkeit in in vitro- und in vivo-Studien verwendet werden. Die Assays umfassen den kompetitiven enzymverknüpften Immunosorbensassay (ELISA) und Antigeneinfangassays.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) kann ebenfalls als ein Assay zum Testen der Hemmung einer HIV-1-Replikation durch die in vitro Enzymvermehrung von kleinen Bereichen der Human- Retroviren, z. B. der RT- oder gag-Bereiche, verwendet werden. Da die für RT kodierende Nukcleotidsequenz für Human-Retroviren bekannt ist, kann die Sequenzinformation verwendet werden, um Oligonukleotide von 20 bis 30 Basen zur Verwendung als Primer in der DNA-Synthese in der PCR zu synthetisieren. Die DNA aus den in Untersuchung befindlichen Zellen kann zu den Primerohgonukleotiden in Gegenwart von allen vier Nukleosidtriphosphaten, einer hitzebeständigen DNA-abhängigen DNA-Polymerase und einem geeigneten Puffer zugesetzt werden. Das Reaktionsgemisch kann dann das konventionelle Dreistufenvermehrungsverfahren durchlaufen, das ein Hitzedenaturieren der DNA, ein Anelieren der Primer an die sich bildende Einzelstrang-DNA und eine Primerextension zur Ausbildung von Mehrfachkopien der Targetsequenz umfaßt. Mit jedem Zyklus erfolgt eine Verdoppelung der Target-DNA, was zu einer geometrischen Vermehrung der Targetsequenz führt.
Es gibt verschiedene Methoden, um die vermehrten Produkte zu quantifizieren. Für Primerpaare, bei welchen es eine minimale DNA-Synthese in Normalproben gibt, ist es möglich, radioaktiv markierte Nukleosidtriphosphate als Substrate zu verwenden, das vermehrte Produkt mit Säure auszufällen und das Produkt in einem Flüssigkeitsscintillationszähler zu analysieren. Läuft eine signifikante DNA-Synthese in Normal-DNA für ein gegebenes Primerpaar ab, kann das Produkt auf einer Minisäule fraktioniert und spezifische Bänder unter Verwendung eines Densitometers quantifiziert werden. In ähnlicher Weise können Spotblots oder Southern Blots an dem Vermehrungsprodukt durchgeführt werden, und die Menge an hybridisiertem Detektor kann quantifiziert werden.
Eine weitere Methode zur Darstellung der Wirksamkeit der Xanthine beim Inhibieren einer Retrovirus-Replikation gemäß der vorliegenden Erfindung beruht auf der Züchtung von normalen peripheren mononuklearen Blutzellen oder anderen gezüchteten Zellen, die dem Virus ausgesetzt werden. Der Test auf Infektiosität kann entweder freies Virus oder virusinfizierte Zellen verwenden, die zusammen mit einer sensitiven Indikatorzelle gezüchtet werden. Das Virus vermehrt sich in der Empfängerindikatorzelle. Durch Vergleich einer Virus- Replikation in Abwesenheit des Xanthins mit der Virus-Replikation in Anwesenheit des Wirkstoffes kann der Inhibierungseffekt des Xanthins auf HIV gezeigt werden.
Die Hemmung einer Retrovirus-Replikation gemäß der Erfindung kann auch durch Überprüfen der Virusproduktion, bestimmt durch den elektronenmikroskopischen Nachweis von Viruspartikeln und von von RT unterschiedlichen viralen Proteinen, veranschaulicht werden. Verschiedene Feststellungsprotokolle für virale Proteine machen Gebrauch von Standardantikörpern, die gegen das Virus in vielen Tierarten ausgebildet wurden. Die Immunfluoreszenz kann virale Proteine rasch detektieren, und empfindliche Hyperimmunseren können hergestellt werden. Radioimmun- und ELISA-Assays können ebenfalls verwendet werden, um das Vorhandensein von viralen Proteinen in Konkurrenz in einem System zu messen, in dem ein radiomarkiertes oder kolonmetrisch identifizierbares Antigen-Antikörpersystem durch Zugabe von reaktivem Antigen gestort wird.
Ein weiterer Zugang zum Demonstrieren der Wirksamkeit der Xanthine gemäß der Erfindung umfaßt die Detektion des Virus durch Detektieren nichtintegrierter und integrierter Virus-DNA sowie von Virus-mRNA. Nature, 312:166-169(1984). Im spezielleren werden in einem typischen Experiment Zellen zellfreien Virionen bei einer Multiplizität von Virusteilchen je Zelle ausgesetzt und in Gegenwart oder in Abwesenheit von Xanthinen gezüchtet. DNA mit einem hohen Molekulargewicht wird zu verschiedenen Zeiten extrahiert und unter Verwendung einer radiomarkierten HIV-Probe auf ihren Gehalt an Virus-DNA untersucht. In Abwesenheit von Xanthinen unter den Kulturbedingungen wird Virus-DNA detektiert. Hingegen wird in DNA aus Zellen, die zur Gänze durch Xanthine geschützt worden waren, weder nichtintegrierte noch integrierte DNA festgestellt.
Southern und Northern Blot-Hybridisierungstechniken sind bei der Bestimmung der relativen Mengen von Virus-DNA und RNA der Viren aufnehmenden Zellen und Gewebe nützlich. Science, 227:177-182 (1985). Unter Verwendung einer molekulargeklonten, markierten, proviralen DNA kann eine Probe für ein integriertes Provirus konstruiert werden, und dann kann man in einem DNA- Transferexperiment bestimmen, ob es ein provirales Genom gibt, das durch Hybridisierung in zelluläre DNA integriert ist. Wenn nur einige wenige Zellen das Provirus enthalten, kann eine in situ-Hybridisierung versucht werden. Diese Techniken können verwendet werden, um die Wirkung der Xanthine auf die Replikation der Retroviren zu zeigen.
Es ist auch möglich, die Virus-Replikation zu verfolgen, indem man bestimmt, ob die virale DNA in Target-T-Zellen exprimiert wird, die dem Virus ausgesetzt und mit oder ohne Xanthine gezüchtet worden sind. In diesem Experiment werden Zellen dem HIV ausgesetzt und RNA wird aus den Zellen extrahiert. Extrahierte RNA wird dann auf den Gehalt an viraler mRNA mittels Northern Blot-Hybridisierung unter Verwendung einer radiomarkierten HIV-Antisense-RNA-Probe untersucht. Science, 227: 177-182 (1985). In Abwesenheit von Inhibitor ist virale mRNA feststellbar. Wenn diese Kulturen für ausgedehnte Zeiträume in Gegenwart von Xanthinen gehalten werden, wird eine Virus-RNA-Expression in den Zellen nicht detektiert, oder wenn sie festgestellt wird, liegt sie nur in reduziertem Ausmaß vor. Dieses Assaysystem ermöglicht die Bewertung des Vermögens der Xanthine zur Hemmung der HIV-Nukleotidsynthese und der mRNA-Expression in T-Zellen, die dem Virus ausgesetzt wurden.
Außerdem sind die HIV-1-infizierten Zellinien MT2 und MT 4 gegenüber der cytopathischen Wirkung des Virus empfindlich. Daher können diese Zellen in plaquebildenden Assays verwendet werden, um die Hemmwirkung der Xanthine auf eine HIV-Infektion oder Proliferation zu demonstrieren. Science, 229:563-566 (1985).
Die Wirksamkeit der Xanthine beim Hemmen einer HIV-Infektion oder HIV-Replikation kann auch in vitro durch Feststellen der Hemmwirkung der Wirkstoffe auf die virale p24 gag Protein- Expression in H9-Zellen, die gegen den cytopathischen Effekt von HIV partiell resistent sind, gezeigt werden. M. Popovic et al., Science, 224:497-500 (1984). Eine Anti-HIV-Wirkung kann auch durch Aufzeigen der Hemmwirkung der Xanthine auf den cytopathischen Effekt von HIV nachgewiesen werden. M. Hiroaki et al., Science, 240:646-649 (1988).
Schließlich kann die Aktivität der Xanthine in normalen T- Zellen in vitro nachgewiesen werden. In diesem Assay werden normale geklonte Helfer-Inducer-T-Zellen, wie normalgeklonte Tetanustoxoidspezifische Helfer/Inducer-T- Zellen (TMII-Zellen), zum Verfolgen der Wirkung der Xanthine auf eine Antigen-induzierte proliferative Antwort verwendet. Details dieser Technik werden von H. Mitsuya et al., Science, 240:646-649 (1988) beschrieben.
Die Wirksamkeit der Xanthine beim Verhindern oder Hemmen einer HIV-Infektion oder -Replikation kann in vivo mit einem Schimpansen oder in chimären SCID-Mäusen, die mit Zellen aus dem menschlichen Immunsystem rekonstituiert wurden, bestätigt werden. Eine persistente Infektion durch HIV wird mit diesem Primaten nachgewiesen, obgleich sich keine AIDS-ähnliche Erkrankung zeigt. Die Wirksamkeit der Xanthine kann durch Vergleichen von behandelten und unbehandelten Schimpansen hinsichtlich einer Serumumwandlung zu HIV-Antigenen, durch Reisolieren von infektiösem Virus aus den Tieren, durch eine nachweisliche Lymphadenopathie, durch Veränderungen der T4- oder T8-Lymphozytengehalte oder durch Kombinationen dieser Maßnahmen nachgewiesen werden.
Das zur Durchführung dieser Assays benötigte HIV kann von konventionellen Quellen unter Verwendung bekannter Techniken erhalten werden. Beispielsweise können mononukleare, aus penpherem Blut hergestellte Zellen, Knochenmark und andere Gewebe von Patienten und Spendern mit einem Mitogen (Phytohämagglutinin-PHA) während 48 bis 72 Stunden stimuliert und in der Zellkultur unter Anwendung eines mit dem T-Zellen- Wachstumsfaktor (TCGF) ergänzten Wachstumsmediums etabliert werden. Das Virus kann detektiert werden durch: (1) Überwachen der Flüssigkeitsüberstände auf eine Aktivität von Virus-Umkehrtranskriptase; (2) übertragen des Virus auffrische, normale menschliche T-Lymphozyten (z. B. Blut der Nabelschnur, peripheres Blut von Erwachsenen oder Knochenmarkleukozyten) oder auf etablierte T-Zellinien; M. Popovic et al., Science, 224:497 (1984); (3) elektronenmikriskopische Beobachtung von fixierten und sektionierten Zellen; und (4) Testen auf eine Antigenexpression durch indirekte Immunofluoreszenz oder Western Blot- Vorgangsweisen unter Verwendung eines Serums von serumpositiven Spendern. Die Detektion von viruspositiven Zellen und die Charakterisierung und der Vergleich von Virusisolaten kann unter Verwendung von HIV-spezifischen Immunreagenzien und Nukleinsäureproben ausgeführt werden. F. Barre-Sinoussi et al., Science, 220:868-871 (1983); R.C. Gallo et al., Science, 220:865-867 (1983).
Viele etablierte Zellinien wurden als mögliche Ziele für eine HIV-I-Infektion getestet. Diese Zellinien können auch dazu verwendet werden, die Wirksamkeit der Xanthine in den oben beschriebenen Assays nachzuweisen. Eine von einem Erwachsenen mit Lymphoid-Leukämie stammende und mit HT bezeichnete neoplastische aneuploide T-Zellinie ist anfällig für eine Infektion durch HTLV-III. HT-Zellen produzieren kontinuierlich HTLV-III, nachdem Elternzellen wiederholt konzentrierten Zellkulturflüssigkeiten ausgesetzt wurden, die aus kurzzeitig gezüchteten T- Zellen (in TCGF vermehrt) geerntet wurden, welche von Patienten mit einem Lymphknotensyndrom oder AIDS stammen. Wenn die Zellproliferation abnimmt, üblicherweise 10 bis 20 Tage nach dem Einwirken der Kulturflüssigkeit, werden die frischen (nichtinfizierten) HT-Elternzellen den Kulturen zugegeben. Zur Verbesserung der Permissivität für HIV und zur Beibehaltung eines permanenten Wachstums und einer kontinuierlichen Produktion des Virus wurde die HT-Zellenpopulation umfassend geklont. Mehrere dieser Klone von HT-Zellen wurden in Zellkulturen gehalten.
Zusätzlich zu HT gibt es mehrere andere T- oder Prä-T-Humanzellinien, die mit HIV infiziert werden können und dieses weiterproduzieren. Beispiele für diese Zellinien sind H4, H9, HUT 78, CEM, Molt 3 und Ti7.4. Gallo et al., US Patent 4 652 599. Außerdem können auch einige B-Lymphoblastenzellinien produktiv durch HIV infiziert werden. Montagnier et al., Science, 225:63-66 (1984).
Zusammenfassend sind die zuvor genannten Vorgangsweisen Beispiele für Techniken, die verwendet werden können, um die Wirksamkeit der Xanthine beim Hemmen der Replikation eines Human-Retrovirus nachzuweisen. Spezifische Beispiele der Hemmung einer Retrovirus-Replikation durch die Xanthine sind hier enthalten, siehe unten.

2. Verabreichung der Xanthine an menschliche Patienten

Ein Xanthin oder ein Gemisch aus den Xanthinen kann in Kombination mit bestimmten antiviralen Mitteln an ein menschliches Wesen, das einer Therapie bedarf, in einer Menge verabreicht werden, die ausreicht, um die Replikation eines Human- Retrovirus zu vermindern. Wenngleich die Gemische von Xanthinen verwendet werden können, wurde kein besonderer Vorteil bei der Anwendung der Gemische beobachtet.
Die Xanthine und deren pharmazeutisch annehmbare Salze können bei der Therapie von Säugetieren, einschließlich des Menschen, jedoch ohne Beschränkung hierauf, in Form von Pillen, Tabletten, Pastillen, Kapseln, Zäpfchen, Lösungen zum Injizieren oder Einnehmen und dgl., und bei der Behandlung von Menschen und anfälligen nicht-menschlichen Primaten, die aufgrund von Funktionsstörungen des Immunsystems notwendig werden, angewendet werden.
Die Xanthine, obgleich als solche wirksam, können in Form ihrer pharmazeutisch annehmbaren Additionssalze aus Gründen der Stabilität, der leichteren Kristallisation, der gesteigerten Löslichkeit und dgl. formuliert und verabreicht werden. Bevorzugte pharmazeutisch annehmbare Additionssalze umfassen Salze von Mineralsäuren, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und dgl.; Salze von einbasischen Carbonsäuren, wie beispielsweise Essigsäure, Propionsäure und dgl.; Salze von zweibasischen Carbonsäuren, wie Maleinsäure, Fumarsäure, Oxalsäure und dgl.; und Salze von dreibasischen Carbonsäuren, wie Carboxybernsteinsäure, Zitronensäure und dgl.
Die Xanthine können oral verabreicht werden, beispielsweise mit einem inerten Verdünnungsmittel oder mit einem eßbaren Träger. Sie können in Gelatinkapseln eingeschlossen oder zu Tabletten gepreßt werden. Zum Zwecke der therapeutischen oralen Verabreichung können die Verbindungen in Arzneistoffträger eingearbeitet und in Form von Tabletten, Pastillen, Kapseln, Ehxiren, Suspensionen, Sirupen, Waffeln, Kaugummis und dgl. verwendet werden. Diese Präparate sollten wenigstens 0,5 % der aktiven Verbindung enthalten, die Menge kann jedoch in Abhängigkeit von der besonderen Form abgeändert werden und kann zweckmäßigerweise zwischen 4,0 % und etwa 70 % des Gewichts der Einheit betragen. Die Xanthinmenge in solchen Zusammensetzungen ist so groß, daß eine geeignete Dosis erhalten wird. Bevorzugte Zusammensetzungen und Präparate gemäß der vorliegenden Erfindung werden so hergestellt, daß eine orale Dosiseinheitsform von etwa 0,1 mg bis etwa 400 mg der aktiven Verbindung enthält.
Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dgl. können die folgenden Bestandteile enthalten: ein Bindemittel, wie mikrokristalline Zellulose, Tragacanthgummi oder Gelatine; einen Arzneistoffträger, wie Stärke oder Lactose; ein Sprengmittel, wie Alginsäure, Primogel, Maisstärke und dgl.; ein Schmiermittel, wie Magnesiumstearat oder Sterotex; ein Gleitmittel, wie kolbidales Siliciumdioxid; ein Süßungsmittel, wie Saccharose oder Saccharin; oder ein Aromamittel, wie Pfefferminz, Methylsalicylat oder Orangenaroma. Wenn die Einheitsdosisform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu dem Material vom obigen Typus einen flüssigen Träger, wie ein fettes Öl, enthalten.
Andere Einheitsdosisformen können andere Materialien enthalten, die die physikalische Form der Dosiseinheit modifizieren, beispielsweise als Überzüge. Daher können Tabletten oder Pillen mit Zucker, Schellack oder anderen darmlöslichen Überzugsmitteln überzogen werden. Ein Sirup kann zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Saccharose als Süßungsmittel und Konservierungsmittel, Farbstoffe, Färbemittel und Aromastoffe enthalten. Zur Herstellung dieser Zusammensetzungen verwendete Materialien sollten in den verwendeten Mengen pharmazeutisch rein und nichttoxisch sein.
Für die Zwecke der parenteralen therapeutischen Verabreichung, wie durch intravenöse oder intramuskulare Injektion, können die Xanthine in eine Lösung oder Suspension eingearbeitet werden. Diese Präparate sollten wenigstens 0,1 % der zuvor genannten Verbindung enthalten, können jedoch zwischen 0,5 % und etwa 50 % ihres Gewichtes variiert werden. Die Menge der aktiven Verbindung in einer solchen Zusammensetzung ist eine solche, daß eine geeignete Dosis erhalten wird. Bevorzugte Zusammensetzungen und Präparate gemäß der vorliegenden Erfindung werden so hergestellt, daß eine parenterale Dosiseinheit 0,5 mg bis 100 mg der aktiven Verbindung enthält.
Lösungen oder Suspensionen der Xanthine können auch die folgenden Komponenten umfassen: ein steriles Verdünnungsmittel, wie Wasser für Injektionszwecke, eine Salzlösung, Öle, Polyethylenglykole, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel, wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien, wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatisierungsmittel, wie Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie Acetate, Citrate oder Phosphate; und Mittel zur Einstellung der Tonizität, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Das parenterale Präparat kann in Ampullen, Einmalspritzen oder Mehrfachdosisampullen aus Glas oder Kunststoff eingeschlossen werden.
Während die Dosiswerte variieren, werden gute Ergebnisse erzielt, wenn die Xanthine der Formel (I) oder der Formel (II) einem Patienten verabreicht werden, der eine solche Behandlung als eine wirksame orale, parenterale oder intravenöse Dosis von 0,1 bis 25 mg/kg Körpergewicht pro Tag benotigt. Eine besonders bevorzugte wirksame Menge beträgt etwa 1,0 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Im allgemeinen variiert die tägliche Dosis von 10-5000 mg, vorzugsweise von 1600-3200 mg pro Tag.
Es versteht sich jedoch, daß für jeden beliebigen Einzelpatienten die spezifischen Dosisvorschreibungen dem individuellen Bedarf und der professionellen Beurteilung der Person angepaßt werden sollten, die die Verabreichung der Xanthine vornimmt oder überwacht. Es ist weiters selbstverständlich, daß die hier vorgesehenen Dosierungen nur beispielhaft sind und keinesfalls den Umfang oder die Praxis der Erfindung einschränken.
Die Xanthine werden vor, nach oder gleichzeitig mit anderen Behandlungen verwendet, die die retrovirale Aktivität hemmen. Im Falle von HIV werden die Xanthine mit 3'-Azido-2',3'- dideoxythymidin (AZT), 2', 3'-Dideoxycytidin (ddC), 2', 3'-Dideoxyadenosin (ddA), 2',3'-Dideoxyinosin (ddI) oder Kombinationen dieser Wirkstoffe verwendet. Zusätzlich zu den Dideoxynukleosiden können eine Anzahl anderer Mittel in Kombination mit den Xanthinen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Xanthine können beispielsweise in Verbindung mit Therapien, basierend auf der Verwendung der Verbindungen HPA 23, Phosphonoformiat (Foscarnet), Ribavirin und Rifabutin verabreicht werden. In ähnlicher Weise können die Xanthine der vorliegenden Erfindung mit Kolonie stimulierenden Faktoren, wie einem Granulocytenkolonie stimulierenden Faktor (G-CSF), einem Granulocytenmacrophagenkolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF) oder Kombinationen dieser Wirkstoffe verwendet werden. Die Xanthine können auch gemäß der Erfindung mit anderen Wirkstoffen, wie Acyclovir, α-Interferon oder Kombinationen dieser Wirkstoffe mit einem Dideoxynukleosid wie AZT verwendet werden. Die hierin beschriebenen antiviralen Therapien können auch in Kombination mit Therapien zur Stärkung des Immunsystems eines Patienten verwendet werden. Beispielsweise kann durch eine Knochenmarkstransplantation, die Verwendung des Wirkstoffs Ampligen oder durch die Verabreichung von Interleukin-2 an einen menschlichen Patienten eine Immunstimulation oder Immunrekonstitution erreicht werden. Weiters können die Xanthine mit anderen Kombinationstherapien wie AZT in Kombination mit Ampligen, ddC oder GM-CSF verwendet werden. Die Xanthine können auch mit Peptiden verwendet werden, die eingesetzt werden, um eine HIV-Infektion oder -Replikation zu verhindern oder zu hemmen.
Die vorliegende Erfindung kann zur Behandlung einer Retrovirus-Infektion in einem menschlichen Patienten oder als eine Prophylaxe gegen eine solche Infektion verwendet werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Verbesserung des Zustandes oder des Wohlbefindens eines Patienten durch eine Hemmung der Retrovirusreplikation. Damit erreicht man eine höhere überlebenschance für den Patienten.

3. Beschreibung und Herstellung der Xanthine der Formel (II)

Eine Hemmung der Human-Retrovirusaktivität kann durch Verabreichung bestimmter Antivirusmittel in Kombination mit einem Xanthin der Formel
an einen menschlichen Patienten erreicht werden, in welchem Xanthin wenigstens einer der Reste R¹ und R³ entweder
a) eine verzweigte Hydroxyalkylgruppe mit der Formel
mit einer tertiären Alkoholfunktion darstellt, worin R&sup4; für eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen steht und n eine ganze Zahl von 2 bis 5 bedeutet, während die andere Gruppe R¹ oder R³ ein Wasserstoffatom oder eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe R&sup5; mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, deren Kohlenstoffkette durch bis zu 2 Sauerstoffatome unterbrochen sein kann oder durch eine Hydroxy- oder Oxogruppe substituiert sein kann, oder
b) wenigstens einer der Reste R¹ und R³ eine Oxoalkylgruppe mit der Formel
darstellt, worin R&sup6; für C&sub1;-C&sub6;-Alkyl steht und p den Wert 2, 3 oder 4 aufweist, während der andere Rest R¹ oder R³ wie oben definiert wird und R² eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet. Das Xanthin der Formel (II) wird in einer Menge verwendet, die zum Inhibieren der Retrovirusaktivität wirksam ist. Zu diesen Verbindungen gehört die im Handel erhältliche Verbindung Pentoxifyllin (Trental ). Eine Reihe anderer Verbindungen innerhalb der allgemeinen Formel (II) kann zum Hemmen der Aktivität von menschlichen Retroviren verwendet werden. Unter diesen Verbindungen sind die nachstehend angegebenen. RETROVIRUSAKTIVITÄT INHIBIERENDE VERBINDUNG DER FORMEL (II) Verbindung Nummer
Die Verbindung 7-Ethoxymethyl-1-(5-hydroxy-5-methylhexyl)- 3-methylxanthin, d.h. die Verbindung Nr. 11, wird zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Die Verbindungen der Formel (II) können gemäß der Offenbarung von US-Patent 3 737 433 und dem belgischen Patent 831 051 (worin R¹/R³ Oxoallyl sind) hergestellt werden. Für den Fall, in dem wenigstens einer der Reste R¹/R³ ein tertiärer Alkohol ist, kann auf die am 8. Juli 1986 eingereichte, die deutsche Priorität vom 8. Juli 1985 beanspruchende internationale Anmeldung PCT/EP 86/00401, verwiesen werden. Diese Anmeldung beschäftigt sich als Erfindung mit einer Vielzahl von Ausführungsformen von Synthesewegen für die Xanthine von Formel (II), die in der vorliegenden Erfindung umfaßt werden.
Ein Beispiel einer Ausführungsform besteht aus
a) der Umsetzung von 3-Alkylxanthinen der Formel (VII)
worin der Rest R³ ein Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen darstellt, mit Alkylierungsmitteln der Formel (VIII)
worin X for ein Halogen, vorzugsweise Chlor, Brom oder Iod oder eine Sulfonsäureestergruppe oder eine Phosphorsäureestergruppe steht, und worin R&sup4; und n die oben angeführten Bedeutungen haben, um Verbindungen der Formel (IX)
mit einer tertiären Hydroxyalkylgruppe in der Position von R³ und einem Wasserstoff in der Position von R¹ zu erhalten, und
a&sub1;) deren Alkylierung mit dem gleichen oder einem anderen Alkylierungsmittel der Formel (VIII), um erfindungsgemäße Verbindungen der Formel (X) zu erhalten
mit zwei identen oder unterschiedlichen tertiären Hydroxyalkylgruppen in den Positionen R¹ und R³ zu erhalten oder
a&sub2;) deren Umwandeln mit einer Verbindung der Formel
R&sup5;-X (Xa),
worin X die in Formel (VIII) angegebenene Bedeutung und R&sup5; die oben angeführte Bedeutung hat, zu Verbindungen der Formel (XI)
wobei in allen Fällen bevorzugt in Gegenwart von basischen Medien oder unter Verwendung der Xanthine in Form ihrer Salze gearbeitet wird.
Eine weitere Ausführungsform besteht aus
b) dem Substituieren von 1,3-dialkylierten Xanthinen der Formel
in der Position 7, vorzugsweise in Gegenwart von basischen Medien oder in Form ihrer Salze, durch eine einstufige Umsetzung mit einer Verbindung der Formel (VIII), um Verbindungen der Formel (XI) zu erhalten.
Eine weitere Ausführungsform besteht aus
c) einem ersten Umsetzen der 3-Alkylxanthine der Formel (VII), ebenfalls bevorzugt in Gegenwart von basischen Medien oder in Form ihrer Salze, mit einer Verbindung der Formel
R¹&sup5;-X (XIII)
mit der Ausbildung der 3,7-disubstituierten Xanthine der Formel
worin R¹&sup5; die für R&sup5; angegebene Bedeutung hat oder für Benzyloder Diphenylmethyl steht, und einem anschließenden Substituieren von diesen in der Position 1, wieder bevorzugt in Gegenwart von basischen Medien oder in Form ihrer Salze, mit einer Verbindung der Formel (VIII). Verbindungen der Formel (XV) werden erhalten
worin R¹&sup5; eine Benzyl- oder Diphenylmethylgruppe darstellt, worauf die Verbindungen der Formel (XV), worin R¹&sup5; eine Benzylder Diphenylmethylgruppe oder eine Alkoxymethyl- oder Alkoxyalkoxymethylgruppe darstellt, unter reduzierenden oder hydrolytischen Bedingungen in Verbindungen entsprechend der Erfindung von Formel (XVI)
umgewandelt werden, die in der Folge neuerlich gewünschtenfalls mit einer Verbindung der Formel (VIII) oder (Xa) umgesetzt werden, um Verbindungen entsprechend der Erfindung von Formel (X) oder (XV) zu erhalten.
Eine weitere Ausführungsform besteht aus
d) einem Reduzieren der Verbindungen der Formel (XI) oder (XV) entsprechend der Erfindung, worin R&sup5; oder R¹&sup5; für eine Oxoalkylgruppe steht, mit konventionellen Reduktionsmitteln für die Ketogruppe, um die entsprechenden hydroxyalkylierten Xanthine entsprechend der Erfindung zu erhalten.
Die hierin als Ausgangsmaterialien verwendeten 3-Alkyloder 1,3-Dialkylxanthine der Formel (VII) oder (XII) und die "Alkylierungsmittel" der Formeln (VIII), (Xa) und (XIII) sind größtenteils bekannt oder können leicht nach in der Literatur beschriebenen Methoden hergestellt werden. Daher können die tertiären Alkohole der Formel (VIII) beispielsweise durch Organometalisynthese durch Umsetzen der sterisch unbehinderten Halogenketone der Formel
Hal- (CH&sub2;)nCO-CH&sub3; (XVII)
in der sogenannten synthetischen Reaktion mit einer reduktiven Alkylierung der Carbonylgruppe mit den Alkylmetailverbindungen R&sup4;-M, im speziellen von Magnesium, Zink oder Lithium, beispielsweise in Form von Alkylmagnesiumhalogeniden R&sup4;-MgHal (Grignard-Verbindungen) oder der Alkyllithiumverbindungen R&sup4;- Li, unter den üblichen Bedingungen (siehe beispielsweise Houben-Weyl, Bd.VI/1a, Teil 2 (1980), SS.928-40, im speziellen SS.1021 ff. und 1104-1121) erhalten werden. In gleicher Weise führt eine Umsetzung der Halogenketone mit der Formel
Hal-(CH&sub2;)n-CO-R&sup4; (XVIII)
mit Methylmagnesiumhalogeniden oder Methyllithium ebenfalls zum Ziel.
Die Hydroxyketone entsprechend den Formeln (XIII) und (XVIII) können auch glatt mit den Alkylmetailverbindungen in der üblichen Weise entweder direkt oder durch temporäres Maskieren der Hydroxygruppe, beispielsweise durch Acetalbildung mit 5,6-Dihydro-4H-pyran, in Diole umgewandelt werden (siehe beispielsweise Houben-Weyl, Bd.VI/1a, Teil 2 (1980), SS.1113- 1124), woraus Verbindungen der Formel (VIII) durch selektive Veresterung der endständigen primären Hydroxylgruppen mit Sulfonyl- oder Phosphorhalogeniden oder -anhydriden, vorteilhafterweise in Gegenwart von basischen Medien, ausgebildet werden.
Andere Möglichkeiten zur Synthese der tertiären Alkoholderivate der Formel (VIII) bestehen in der Monometallierung von ω-Chlor-1-bromoalkanen, um ω-Chloralkylmetallverbindungen zu erhalten (Houben-Weyl, Bd. XIII/2a (1973), SS.102 und 319) und ihrer darauffolgenden Reaktion mit den Ketonen R&sup4;-CO-CH&sub3;, wobei das Ausmaß der Nebenproduktbildung aus den Alkanolaten, die als Zwischenprodukte wegen ihrer Tendenz zum Ringschluß unter Eliminierung von Metallsalz gebildet werden, durch eine entsprechende Temperaturregelung minimiert wird, oder unter Verwendung von ω-Halogen-1-alkanolen als Ausgangsmaterialien, welche in der üblichen Weise metalliert werden, vorzugsweise in Form des Tetrahydropyranyl- (2) ethers oder nach der Alkanolatausbildung der Hydroxygruppe (MO-CH&sub2;)n-Hal) mit jeder beliebigen gewünschten Alkylmetailverbindung (siehe beispielsweise Houben-Weyl, Bd. XIII/2a (1973), S.113), ihrem anschließenden Umsetzen mit den Ketonen R&sup4;-CO-0H&sub3;, um die im vorherigen Absatz erwähnten Diole zu erhalten (Houben-Weyl, Bd. VI/1a, Teil 2 (1980), S. 1029) und anschließendes selektives Verestern der primären Hydroxygruppe mit geeigneten Sulfon- oder Phosphorsäurederivaten.
Ein bequemer Zugang zu Verbindungen der Formel (VIII), in welchen R&sup4; eine Methylgruppe darstellt, steht auch über die Umsetzung von ω-Halogenalkansäurealkylestern (Hal-(CH&sub2;) n-COO-alkyl) mit zwei Äquivalenten einer Methylmetaliverbindung zur Verfügung, wobei die Ester über das Keton reagieren, um den tertiären Alkohol mit der Einführung von zwei Methylgruppen (Houben-Weyl, Bd. VI/1a, Teil 2 (1980), SS. 1171-1174) zu produzieren. In gleicher Weise können die ω-Hydroxycarbonsäureester zu Diolen mit Methylmetallverbindungen mit oder ohne Schutz der Hydroxygruppe umgewandelt werden, beispielsweise in Form von Tetrahydropyranyl-(2) oder Methoxymethylester, oder gegebenenfalls in Form von Lactonen als cyklische Ester (siehe beispielsweise Houben-weyl, Bd. VI/1a, Teil 2 (1980), SS.1174- 1179) woraus wiederum aktive Alkylierungsmittel der Formel (VIII) durch selektive Veresterung der primären Hydroxylgruppe mit Sulfon- oder Phosphorsäurehalogeniden oder -anhydriden erhalten werden können.
Geeignete Verbindungen der Formel (VIII), die nach den oben beschriebenen Methoden hergestellt werden können, sind also die [(ω-1)-Hydroxy-(ω-1)-methyl]butyl-, -pentyl-, -hexylund -heptyl-, [(ω-2)-Hydroxy-(ω-2)-methyl]pentyl-, -hexyl-, - heptyl- und -octyl- und [(ω-3)-Hydroxy-(ω-3)-methyl)hexyl-, - heptyl-, -octyl- und -nonylchloride, -bromide, -iodide, -sulfonate und -phosphate.
Unter den Verbindungen der Formel R&sup5;-X (Xa) oder R¹&sup5;-X (XIII), die zur Einführung von R&sup5; in die Position 1 oder 7 und von R¹&sup5; in die Position 7 des Xanthingerüsts geeignet sind, nehmen die Alkoxymethyl und Alkoxyalkoxymethylderivate eine spezielle Stellung ein, da ihre Halogenide tatsächlich erfolgreich als Reaktanten verwendet werden können, es können aber toxikologische Probleme entstehen, zumindestens bei Verwendung in großem Umfang. Aus diesem Grund wird die Verwendung der entsprechenden Sulfonate in diesem speziellen Fall bevorzugt, welche leicht verfügbar sind, beispielsweise durch Umsetzen von gemischten Anhydriden von aliphatischen Carbonsäuren und ahphatischen oder aromatischen Sulfonsäuren (M.H. Karger et al., J. Org. Chem. 36 (1971), SS. 528-531) mit den Formaldehyddialkylacetalen oder -dialkoxyalkylacetalen in einer glatten und beinahe quantitativen Reaktion (M.H. Karger et al., J. Amer. Chem. Soc. 91 (1969), SS. 5663/5665:
In dieser Gleichung steht R&sup7; für eine aliphatische Gruppe wie Methyl, Ethyl oder Trifluormethyl, oder eine aromatische Gruppe, beispielsweise Phenyl, 4-Tolyl oder 4-Bromphenyl, jedoch vorzugsweise Methyl oder 4-Tolyl, und R&sup8; stellt eine Alkyl- oder Alkoxyalkylgruppe dar, die unter die Definition von R&sup5; oder R¹&sup5; fällt.
Die Umsetzung kann entweder in der Masse oder in einem wasserfreien aprotischen Lösungsmittel, das gegenüber den Reaktanten inert ist, bei Temperaturen von -20ºC bis +40ºC, vorzugsweise zwischen 0ºC und 20º0, ausgeführt werden. Es ist keine Zwischenisolierung der hochreaktiven Sulfonate, welche hydrolyseempfindlich und hitzeläbil sind, notwendig; sie werden vorzugsweise sofort als Rohprodukte für die Substituierung am Stickstoff der Xanthine verwendet, wobei die übliche Zugabe eines basischen Kondensationsmittels unnötig ist.
Die Umsetzung der mono- oder disubstituierten Xanthinderivate (IX), (XVI), (VII), (VIII) oder (Xa) oder (XIII) erfolgt gewöhnlich in einem Verteilungsmittel oder Lösungsmittel, das gegenüber den Reaktanten inert ist. Praktische Repräsentanten sind im speziellen dipolare, aprotische Lösungsmittel, beispielsweise Formamid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon, Tetramethylharnstoff, Hexamethylphosphorsäuretriamid, Dimethylsulfoxid, Aceton oder Butanon; Alkohole wie Methanol, Ethylenglykol und deren Mono- oder Dialkylether, wobei die Alkylgruppe 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist, beide zusammen jedoch ein Maximum von 5 Kohlenstoffatomen haben, Ethanol, Propanol, Isopropanol und die verschiedenen Butanole; Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol oder Xylene; halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Chloroform; Pyridin und Gemische der erwähnten Lösungsmittel oder deren Gemische mit Wasser können jedoch ebenfalls verwendet werden.
Die "Alkylierungsreaktionen" werden geeigneterweise in Gegenwart eines basischen Kondensationsmittels durchgeführt. Beispiele für Materialien, die hiefür geeignet sind, sind Alkalimetall- oder Erdalkalihydroxide, -carbonate, -hydride, -alkoholate und organische Basen wie Trialkylamine (beispielsweise Triethyl- oder Tributylamin), quaternäre Ammonium- oder Phosphoniumhydroxide und vernetze Harze mit fixierten, gegebenenfalls substituierten Ammonium- oder Phosphoniumgruppen. Die Xanthinderivate können auch in der Alkylierungsreaktion direkt in Form ihrer getrennt hergestellten Salze verwendet werden, wie Alkalimetall-, Erdalkalimetall- oder gegebenenfalls substituierte Ammonium- oder Phosphoniumsalze. Die mono- und disubstituierten Xanthinderivate können auch entweder in Gegenwert der zuvor erwähnten anorganischen Kondensationsmittel oder in Form ihrer Alkalimetall- oder Erdalkalimetailsalze mit Hilfe der sogenannten Phasentransferkatalysatoren, beispielsweise tertiäre Amine, quaternäre Ammonium- oder Phosphoniumsalze oder Kronenether, vorzugsweise in einem 2-Phasensystem unter den Bedingungen einer Phasentransferkatalyse alkyliert werden. Unter den geeigneten Phasentransferkatalysatoren, die im allgemeinen im Handel erhältlich sind, befinden sich Tetra(C&sub1;- C&sub4;) alkyl- und Methyltrimethylammonium- und -phosphoniumsalze, Methyl-, Myristyl-, Phenyl- und Benzyltri(C&sub1;-C&sub4;)alkyl- und - cetyltrimethylammonium- sowie (C&sub1;-C&sub1;&sub2;)Alkyl- und -benzyltriphenylphosphoniumsalze, wobei die Verbindungen, die das größere und stärker symmetrisch strukturierte Kation haben, sich im allgemeinen als wirksamer erweisen
Die Einführung der Gruppen Ia, R&sup5; und R¹&sup5; durch die oben beschriebenen Vorgangsweisen wird im allgemeinen bei einer Reaktionstemperatur zwischen 0ºC und dem Siedepunkt des speziellen verwendeten Reaktionsmediums durchgeführt, vorzugsweise zwischen 20ºC und 130ºC, gegebenenfalls bei erhöhtem oder reduziertem Druck, wofür die Reaktionszeit weniger als 1 Stunde oder bis zu mehrere Stunde betragen kann.
Die Umsetzung der 3-Alkylxanthine (VIII) zur Herstellung der Verbindungen entsprechend der Erfindung von Formel (X) erfordert die Einführung von zwei tertiären Hydroxyalkylgruppen. Entweder idente oder unterschiedliche Substituenten können mit dem Xanthingerüst nacheinander verknüpft werden, oder zwei idente Hydroxyalkylgruppen können ohne Isolierung der Zwischenprodukte in einer Eintopfreaktion verknüpft werden.
Die reduktive Abspaltung der Benzyl- und Diphenylmethylgruppe aus den Verbindungen der Formel (XV) mit der Ausbildung des Xanthinatoms in der Position 7 wird unter Standardbedingungen ausgeführt, die im speziellen im Rahmen der Schutzgruppentechnik in Alkaloid- und Peptidsynthesen entwickelt wurden und von denen daher angenommen werden kann&sub1; daß sie allseits bekannt sind. Neben der chemischen Reduktion, im speziellen der Benzylverbindungen mit Natrium in flüssigem Ammoniak (Houben- Weyl, Bd. XI/1 (1975), SS.974-975), ist auch die Eliminierung der beiden zuvorgenannten Aralkylgruppen durch katalytische Hydrogenolyse unter Verwendung eines Edelmetallkatalysators besonders praktisch (Houben-Weyl, Bd. XI/1 (1957), 55. 968-971 und Band IV/1c, Teil 1 (1980), SS.400-404). Ein niederer Alkohol wird hier gewöhnlich als Reaktionsmedium verwendet (gegebenenfalls mit dem Zusatz von Ameisensäure oder Ammoniak), oder ein geeignetes Lösungsmittel wie Dimethylformamid oder im speziellen Eisessig; ihre Gemische mit Wasser können jedoch gleichfalls verwendet werden. Besonders geeignete Hydrierkatalysatoren sind Palladiummohr und Palladium-auf-Aktivkohle oder Banumsulfat, während andere Edelmetalle wie Platin, Rhodium und Ruthenium aufgrund der kompetitiven Ringhydrierung häufig zu Nebenreaktionen führen und daher nur bedingt verwendbar sind. Die Hydrogenolyse wird vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 20ºC und 100ºC und bei Atmosphärendruck oder vorzugsweise leichtem überdruck bis zu etwa 10 bar durchgeführt, wobei im allgemeinen Reaktionszeiten von einigen wenigen Minuten bis zu mehreren Stunden benötigt werden.
Die 1,3,7-trisubstituierten Xanthine der Formel (XV), die eine Alkoxymethyl- oder Alkoxyalkoxymethylgruppe in der Position von R¹&sup5; aufweisen, stellen O,N-Acetale dar. Folglich können ihre Substituenten in der Position 7 unter den üblichen Bedingungen einer Säurehydrolyse (siehe Houben-Weyl, Bd. VI/I b (1984), SS. 741-745) abgespalten werden, wobei die 7H-Verbindungen der Formel (XVI) gleichfalls ausgebildet werden. Beispiele für bevorzugte Gruppen, die hydrolytisch abgespalten werden können, sind die Methoxy-, Ethoxy- und Propoxymethylgruppen sowie die Methoxyethoxy- und Ethoxyethoxymethylgruppen. Die Reaktion wird vorteilhafterweise durch Erhitzen in verdünnten Mineralsäuren wie Ohlorwasserstoff- oder Schwefelsäure, gegebenenfalls unter Zugabe von Eisessig, Dioxan, Tetrahydrofuran oder einem niedrigen Alkohol als Lösungspromoter, durchgeführt. Gleichfalls nützlich sind Perchlorsäure oder organische Säuren, wie Trifloressig-, Ameisen- und Essigsäure in Kombination mit katalytischen Mengen Mineralsäuren. Die Alkoxyalkoxymethylverbindungen im speziellen können auch unter Verwendung von Lewis-Säuren, wie Zinkbromid und Titantetrachlond in einem wasserfreien Medium, vorzugsweise in Dichlormethan oder Chloroform, gespalten werden, wobei die als Zwischenprodukte gebildeten 7-Brommethyl- oder 7-Bromzinkderivate spontan während der wäßrigen Aufarbeitung hydrolysieren. Bei der Spaltung in einer Mineralsäurelösung muß die Reaktionstemperatur so gewählt werden, daß keine wesentliche Dehydratisierung der tertiären Hydroxyalkylgruppe in der Position 1 erfolgt; sie sollte daher in der Regel unter 100ºC liegen.
Die Reduktion der Xanthine der Formeln (XI) und (XV) mit einer Oxoalkylgruppe in der Position R&sup5; oder R¹&sup5; zu den entsprechenden Hydroxyalkylverbindungen kann im Prinzip tatsächlich entweder mit Grundmetallen oder durch katalytische Hydrierung stattfinden, die bevorzugte Methode besteht jedoch aus einer Reaktion, die unter den sehr milden Bedingungen und mit hohen Ausbeuten mit einfachen Metailhydriden (MHn), komplexen Metailhydriden (M¹[M²Hn]m) oder Organometallhydriden (Houben- Weyl, Bd. IV/1 d (1981), SS. 267-282 und Bd. VI/1 b (1984), SS. 41-155) abläuft. Von den zahlreichen komplexen Metailhydriden, die zur Reduktion von Ketonen verwendet werden können, können die am häufigsten verwendeten erwähnt werden, beispielsweise Lithiumalanat, Lithiumborhydrid und im speziellen Natriumborhydrid, das aufgrund seiner geringen Reaktivität leichter zu handhaben ist und vor allem ein Arbeiten mit alkoholischen, alkoholisch-wäßrigen und reinen wäßrigen Lösungen oder Suspensionen ermöglicht. Zusätzlich zu den sonst üblichen inerten Lösungsmitteln wie Ether (beispielsweise Diethylether, Tetrahydrofuran, 1,2-Dimethoxyethan) können auch Kohlenwasserstoffe und Pyridin, Nitrile wie Acetonitril, als Reaktionsmedium verwendet werden. Die Hydrierung, welche in geeigneter Weise bei Temperaturen zwischen 0ºC und dem Siedepunkt des speziellen Lösungsmittels, jedoch vorzugsweise bei Raumtemperatur ausgeführt wird, erfolgt im allgemeinen rasch und ist innerhalb einiger Minuten bis zu wenigen Stunden abgeschlossen.
Die tertiären Hydroxyalkylxanthine der Formel (II) können auch durch Umsetzen von substituierten Xanthinen der Formel
e) wobei das Xanthin zwei idente oder unterschiedliche Gruppen der Formeln oder nur einen Substituenten der Formel (XX) oder (XXI) und Wasserstoff oder die Gruppe R&sup5;oder R¹&sup5; in den Positionen von R&sup9; und R¹&sup0; enthält, mit (C&sub1;-C&sub3;)Alkyl- oder Methylmetailverbindungen mit einer reduktiven Italkylierungil der Carbonylgruppen hergestellt werden, um die Xanthine entsprechend der Erfindung der Formeln (IX) bis (XVI) zu erhalten, oder durch
f) Metallierung der Xanthine der Formel (XIX), die zwei idente oder unterschiedliche Gruppen der Formeln -(CH&sub2;)n-Hal (XVII) aufweisen, wobei Hai vorzugsweise für Chlor oder Brom steht, oder nur eine derartige Gruppe und Wasserstoff oder der Substituenten R&sup5; oder R¹&sup5; in der anderen Position, in der endständigen Position, und anschließende Umsetzung mit Ketonen der Formel
R&sub4;-CO-CH&sub3; (XVIII)
durch eine reduktive Alkylierung der Carbonylgruppe, um die Xanthine der Formeln (IX) bis (XVI) entsprechend der Erfindung zu erhalten, oder durch
g) Umwandeln von Xanthinen der Formel (XIX) mit der Gruppe
-(CH&sub2;)n-CCO-(C&sub1;-C&sub4;)alkyl (XXIV)
in den Positionen R&sup9; und/oder R¹&sup0; und gegebenenfalls Wasserstoff oder der Gruppe R&sup5; oder R¹&sup5; in der anderen Position mit zwei Äquivalenten einer Methylmetailverbindung je Alkoxycarbonylgruppe zu Xanthinen der Formeln (IX) bis (XVI), worin R&sup4; für Methyl steht, oder durch
h) Umwandeln von Xanthinen der Formel (XIX) mit zwei identen oder verschiedenen Gruppen der Formel
oder nur einer derartigen Gruppe und Wasserstoff oder der Gruppe R&sup5; oder R¹&sup5; in den Positionen R&sup9; und R¹&sup0;, worin die Gruppe (XXV) die C=C-Doppelbindung auch in stellungsisomeren Anordnungen an dem verzweigten Kohlenstoffatom enthalten kann, bei spielsweise als -C=CH&sub2;, durch eine der Markownikoff'schen Regel gehorchende säurekatalysierte Hydratation zu Xanthinen der Formeln (IX) bis (XVI) entsprechend der Erfindung, und gewünschtenfalls anschließendes Umwandeln der tertiären Hydroxyalkylxanthine der Formeln Ib', und, wenn sie entsprechend der Erfindung nach den Methoden e) bis h) erhalten wurden, die ein Wasserstoffatom in der Position 1 oder 7 aufweisen, gegebenenfalls in Gegenwart basischer Medien oder in Form ihrer Salze, mit den Alkylierungsmitteln der Formeln (VIII) oder (Xa) oder (XIII) zu den trisubstituierten Verbindungen der Formeln (X) oder (XI) oder (XV), worin R², R&sup4;, R&sup5;, R¹&sup5; und n in den obenstehenden Formeln die angegebenen Bedeutungen haben.
Die 3-alkylierten Mono- oder Dioxoalkyl-(XIXA), -(ω-Habgenalkyl) - (XIXB), - (ω-Alkoxycarbonylalkyl) - (XIXC) und -alkenylxanthine (XIXD), die hierfür als Ausgangsmaterialien benötigt werden, sind entweder bekannt oder können leicht hergestellt werden, beispielsweise aus den 3-Alkyl-xanthinen (VII) und den Sulfonyloxy- oder Halogenketonen (XVII) und (XVIII), ( ω-Halogenalkylsulfonaten oder 1,ω)-Dihalogenalkanen (siehe beispielsweise V.B. Kalcheva et al., Journal für prakt. Chemie 327 (1985) SS. 165-168), ω-Sulfonyloxy- oder ω-Halogencarbonsäurealkylestern oder Sulfonyloxy- oder Halogenalkenen entsprechend Formel (XXV) unter den zuvor im Detail für die Alkyherung von mono- und disubstituierten Xanthinen mit den Verbindungen der Formeln (VIII) und (Xa) beschriebenen Reaktionsbedingungen.
In den in den Gruppen R&sup9; und R¹&sup0; funktionalisierten organometallreaktionen der Xanthine (XIXA) und (XIXC) ist die Vorgangsweise im Prinzip die gleiche wie die, die für die Herstellung der tertiären Alkohole der Formel (VIII) als Alkylierungsmittel verwendet wurde. Daher kann die reduktive Alkylierung der Ketone (XIXA) und der Ester (XIXC) beispielsweise mit Alkylkahum-, -natrium-, -lithium-, -magnesium-, -zink-, -cadmium-, -aluminium- und -zinnverbindungen erfolgen. Die jüngst empfohlenen Alkyltitan- und -zirkoniumverbindungen (D. Seebach et al., Angew. Chem. 95 (1983), SS. 12-26) können auch verwendet werden. Da jedoch die Alkylmetaliverbindungen von Natrium und Kalium aufgrund ihrer hohen Reaktivität eine Tendenz zu Nebenreaktionen haben und jene von Zink und Cadmium ziemlich träge sind, werden gewöhnlich die Alkyllithium- und magnesium (Grignard) verbindungen bevorzugt.
Die stark nukleophilen organometallverbindungen sind sehr empfindlich gegen Hydrolyse und Oxidation. Ihre sichere Handhabung erfordert daher ein Arbeiten in einem wasserfreien Medium, gegebenenfalls unter einer inerten Gasatmosphäre. Die üblichen Lösungsmittel oder Verteilungsmittel sind primär jene, die auch für die Herstellung der Alkylmetallverbindungen geeignet sind. Praktische Beispiele sind im speziellen Ether mit einem oder mehreren Ether-Sauerstoff-Atom(en), beispielsweise Diethyl-, Dipropyl-, Dibutyl- oder Diisoamylether, 1,2-Dimethoxyethan, Tetrahydrofuran, Dioxan, Tetrahydropyran, Furan und Anisol und aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Petrolether, Cyclohexan, Benzol, Toluol, Xylene, Diethylbenzole und Tetrahydronaphthalin; tertiäre Amine, wie Triethylamin, oder dipolare aprotische Lösungsmittel wie Hexamethylphosphortriamid sowie Gemische der genannten Lösungsmittel können jedoch gleichfalls erfolgreich verwendet werden. Die Reaktion der Carbonylverbindungen (XIXa) und (XIXc) mit den Grignard-Verbindungen mit der Formel R&sup4;-MgHal können auch durch Einbringen der Organometallverbindung in einen Ether und tropfenweises Zusetzen des Ketons oder Esters als eine Lösung in Dichlormethan oder 1,2-Dichlorethan nutzbringend ausgeführt werden. Ein Zusatz von Magnesiumbromid wird häufig empfohlen, der befähigt ist, die Nukleophilizität der Organometailverbindung aufgrund seiner Teilnahme an dem komplexen cyklischen Übergangszustand zu steigern.
Das Keton oder der Ester und die Organometallverbindung werden im allgemeinen bei Temperaturen zwischen -20ºC und 100ºC, vorzugsweise zwischen 0ºC und 60ºC oder bei Raumtemperatur ohne Kühlen von außen mit der Alkylmetallverbindung, die gewöhnlich in einem leichten überschuß verwendet wird, vereinigt. Die Reaktion wird dann gewöhnlich durch kurzes Erhitzen unter Rückfluß vollendet, wofür Zeiten von mehreren Minuten bis zu einigen Stunden im allgemeinen üblich sind. Das gebildete Alkanolat wird vorzugsweise mit einer wäßrigen Ammoniumchloridlösung oder verdünnter Essigsäure zersetzt.
Magnesiumetall und Lithiummetall sind in erster Linie für die Metallierung der ω-Halogengenalkylxanthine (XIXb) geeignet. Andererseits spielt der Ersatz des Halogenatoms durch Lithium, der auch unter Verwendung von Organolithiumreagentien, im allgemeinen 1-Butyl-, 2-Butyl-, t-Butyl- oder Phenyllithium, möglich ist, eine untergeordnete Rolle. Es wird jedoch im speziellen von den Grignardverbindungen Gebrauch gemacht, die vorteilhafterweise in den Ethern, Kohlen wasserstoffen, tertiären Ammen oder aprotischen Lösungsmitteln hergestellt werden, die als besonders geeignet für die Reaktion der Xanthine (XIXa) und (XIXc) mit Alkylmetailverbindungen aufgezählt werden, bei Temperaturen zwischen 25ºC und 125ºC, vorzugsweise unter 100ºC. Wenn die Metallierungsreaktion in Kohlenwasserstoffen durchgeführt wird, dann erweist sich die Zugabe eines Ethers, wie Tetrahydrofuran oder eines tertiären Amins wie Triethylamin in einer stöchiometrischen Menge häufig als nützlich. Die Verwendung von Katalysatoren wie Butanol, Aluminiumchlorid, Siliciumtetrachlorid, Tetrachlormethan und Aluminium- oder Magnesiumalkoholaten kann ebenfalls hilfreich sein. Beim Halogen-Metallaustausch reagieren gewöhnlich die Chloride langsamer als die entsprechenden Bromide und Iodide, aber in der Regel liefern sie bessere Ausbeuten an Organometallverbindung. Zur Beschleunigung des Reaktionsbeginns wird häufig der Zusatz von etwas Magnesiumbromid, einigen Körnchen Iod, oder mehreren Tropfen Brom, Tetrachlormethan oder Methyliodid unter leichtem Erhitzen empfohlen. Die erhaltenen Grignard-Verbindungen werden normalerweise nicht isoliert, sondern sofort mit den Ketonen der Formel (XXIII) unter den für die reduktive Alkylierung der Xanthine (XIXa) und (XIXc) beschriebenen Reaktionsbedingungen umgesetzt.
Die Addition von Wasser an die C=C-Doppelbindung der Alkenylxanthine (XIXd) mit dem Strukturelement der Formel (XXV), worin sich die Hydroxygruppe an das Kohlenstoffatom mit den wenigeren Wasserstoffatomen unter Ausbildung von tertiären Alkoholen gemäß der Markownikoff'schen Regel anlagert, erfolgt gewöhnlich in einer wäßrigen Lösung oder Suspension in Gegenwart starker Säuren wie Schwefelsäure, Salpetersäure oder Phosphorsäure. Halogenwasserstoffe und Sulfonsäuren wie Trifluormethansulfonsäure, saure Austauscherharze, Bortrifluoridkomplexe oder Oxalsäure können auch als Katalysatoren verwendet werden. Es wird jedoch ein Arbeiten in Sulfonsäure bevorzugt, wobei eine Säurekonzentration von 50 bis 65 % und Temperaturen von 0º bis 10ºC in der Regel ausreichen. Manchmal können auch eine niedrigere oder eine höhere Konzentration und/oder niedrigere oder höhere Reaktionstemperaturen verwendet werden. Auf jeden Fall sollten die Reaktionstemperaturen so niedrig wie möglich gehalten werden, da die Umkehrreaktion, die Dehydratation zu dem Olefin, über etwa 60ºC in störender Weise bedeutend sein kann.
Die Zugabe eines gegenüber Säuren inerten Lösungsmittels wie 1,4-Dioxan, Benzol oder Toluol bringt manchmal auch Vorteile. Da sich bei der säurekatalysierten Hydratation, im speziellen bei Anwendung von hohen Säurekonzentrationen, Ester als Zwischenprodukte bilden können, wird zum Zwecke der Esterhydrolyse eine Behandlung des Reaktionsansatzes mit einer großen Menge Wasser unter kurzem Erhitzen nach der Einwirkung der Säure empfohlen, oder ein Aufarbeiten des Gemisches im alkalischen Bereich.
Die Versuchsbedingungen für die fakultative Umwandlung der 1- und 7H-Verbindungen (IX) oder (XVI) entsprechend der Erfindung in die trisubstituierten Xanthine der Formeln (X) oder (XV) durch N-Alkylierung mit den Verbindungen (VIII) oder (Xa) oder (XIII) wurden schon oben im Detail beschrieben.
In Abhängigkeit von der Kettenlänge der Alkylgruppe R&sup4; (wenigstens C&sub2;) und/oder der Struktur eines Substituenten R&sup5; (beispielsweise 2-Hydroxypropyl) können die tertiären Hydroxyalkylxanthine der Formel (II) ein oder zwei asymmetrische Kohlenstoffatome haben und können daher in steroisomeren Formen vorliegen. Die Erfindung betrifft daher sowohl die reinen stereoisomeren Verbindungen als auch deren Gemische.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen nun detaillierter beschrieben.

BEISPIELE

Zum Beweis der Wirksamkeit der beanspruchten Erfindung wurde eine Verbindung der Formel (II) getestet, um die Hemmung der Retrovirus-Aktivität in vitro darzulegen. Obwohl eine Vielzahl von Verbindungen mit der allgemeinen Formel (II) wirksam ist, werden sie durch Pentoxifyllin als eine bevorzugte Form der Erfindung exemplifiziert.

BEISPIEL 1

Menschliche Jurkatzellen (eine CD4&spplus;-T-Zellenlymphomlinie) wurden in RPMI-1640, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum, Penicillin, Streptomycin und L-Glutamin, gezüchtet. HIV-1 wurde in den Jurkatzellen gebildet. Während der logaritkmischen Wachstumsphase wurde ein zellfreier Überstand geerntet, auf seine RT-Aktivität (gemäß der Methode von Dayton et al., Cell 1986, 44:941-947) getestet und in aliquoten Teilen bei -70ºC bis zur Verwendung eingefroren. Die Jurkatzellen wurden mit Pentoxifyllin in verschiedenen Konzentrationen 4 Stunden lang vorbehandelt, wonach HIV-1 (10&sup4; cpm-Einheiten der RT-Aktivität) den Kulturen zugesetzt wurde. Die Zellen verbleiben während einer Gesamtzeit von 7 Tagen unter der entsprechenden Konzentration von Pentoxifyllin, zu welchem Zeitpunkt die RT-Aktivität in den zelifreien Uberständen gemessen wurde. Parallel dazu wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch Anf ärben der wänrend 7 Tagen mit verschiedenen Konzentrationen von Pentoxifyllin behandelten, nicht-infizierten Jurkatzellen mit Trypanblau überprüft. Die Ergebnisse werden in Prozent der Kontrolle ausgedrückt. Pentoxifyllin (mikromolar) Umkehrtranskriptase (% der Kontrolle)
Die Lebensfähigkeit der Zellen nach 7 Tagen Behandlung mit Pentoxifyllin liegt bei > 95 %.
Pentoxifyllin verminderte die HIV-1-Replikation, bestimmt durch Umkehrtranskriptaseaktivität (ein Marker der HIV-1-Replikation), in akut mit HIV infizierten Jurkatzellen.

BEISPIEL 2

Menschliche periphere mononukleare Blutzellen (PBM) wurden durch eine Ficoll-Hypaque-Gradientzentrifugation von Blut erhalten, das von normalen, HIV-1-serumnegativen Spendern erhalten worden war. PBM wurden in RPMI-1640, ergänzt mit 20 % fetalem Kälberserum, Penicillin, Streptomycin und L-Glutamin, gezüchtet. Nach der Stimulierung der Zellen über Nacht mit 15 µg/ml Concanavalin A wurden sie in 10 Einheiten/ml Interleukin-2 (IL-2) während der Versuchsdauer behalten. Um die Hemmung der HIV-1-Replikation in PBM durch Pentoxifyllin zu testen, wurden PBM mit verschiedenen Konzentrationen von Pentoxifyllin während 4 Stunden vorbehandelt, wonach HIV-1 (10&sup4; cpm-Einheiten der RT- Aktivität) den Kulturen zugesetzt wurden. Die Zellen verblieben während einer Gesamtzeit von 7 Tagen unter den entsprechenden Konzentrationen des Wirkstoffes, zu welchem Zeitpunkt die RT- Aktivität in den zellfreien Überständen gemessen wurde.
Parallel hiezu wurde die Cytotoxizität durch Färben der 7 Tage mit verschiedenen Pentoxifyllinkonzentrationen behandelten nicht-infizierten PBM mit Trypanblau analysiert. Die Ergebnisse werden als Prozent der unbehandelten Kontrollen ausgedrückt. Pentoxifyllin (mikromolar) Umkehrtranskriptase (% der Kontrolle) Lebensfähigkeit (% der Kontrolle) (ND nicht bestimmt)
Pentoxifyllin verminderte die HIV-1-Replikation, bestimmt als Umkehrtranskriptase-Aktivität, in akut mit HIV-1 infizierten peripheren mononuklearen Blutzellen.

BEISPIEL 3

Down-Regulation der durch HIV-1 LTR meduerten Genexpression:
U38-Zellen (Felber BK, Paviakis GN, Science 1988, 239:184- 187) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ng/ml Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) gezüchtet. Die U38-Zellen wurden von der monocytoiden Humanzellenlinie U937 abgeleitet und enthalten integrierte Kopien von an das Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Gen gebundenem HIV-1 LTR. Diese Zellen wurden freundlicherweise von Dr. Barbara Felber (National Cancer Institute, Frederick, Maryland, USA) zur Verfügung gestellt. Zwei Stunden später wurden die Zellen einmal in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) gewaschen und in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von Pentoxifyllin gezüchtet Nach 2 Tagen wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch Anfärben mit Trypanblau getestet, und die CAT-Aktivität wurde wie zuvor beschrieben (Sodroski, J. et al., Science 1985, 227:171-173) nach einem Standardisieren der Zellenextrakte hinsichtlich des Proteingehaltes gemessen. mit Phorbolester stimuliert Pentoxifyllin (mikromolar) CAT-Aktivität nicht mit Phorbolester stimuliert Pentoxifyllin (mikromolar) CAT-Aktivität
Pentoxifyllin verminderte die Chloramphenicoltransacetylaseaktivität (CAT) in U38-Zellen, unabhängig davon, ob sie zuvor mit Phorbolester vorbehandelt wurden oder nicht. Der CAT- Assay wird häufig verwendet, um die Wirkungen der Mittel auf einen Genaktivierungsfaktor, der sich auf die HIV-Langzeitwiederholung (LTR) auswirkt, zu bestimmen.
Zusammenfassend sind, wie hierin beschrieben, Xanthine in Kombination mit antiviralen Mitteln als antivirale Mittel für die therapeutische Behandlung von Menschen besonders nützlich. Die Xanthine sind sowohl zur Prophylaxe als auch zur Behandlung einer Retrovirus-Infektion in Menschen wertvolle therapeutische Mittel. Sie zeigen gegenüber den AIDS-Viren eine antivirale Aktivität, welche höchst unüblich und unerwartet in Anbetracht der sehr begrenzten und spezifischen antiviralen Aktivität der Antivirusmittel nach dem Stand der Technik ist. Die Xanthine können eine Unterdrückung der virusinduzierten Zelischädigung in tierischem und menschlichem Zellgewebe zeigen. Die Xanthine können auch die Sterblichkeits- und Morbiditätserscheinungen bei Menschen verringern, einschließlich einer Senkung des Auftretens von opportunistischen Infektionen, die mit AIDS einhergehen, und einer Senkung der progressiven, degenerativen Wirkungen von HIV auf das Zentralnervensystem.

Claims

1. Verwendung einer kombinierten Menge von

A) einer Verbindung der Formel II

worin

a) einer der Reste R¹ und R³ eine verzweigte Hydroxyalkylgruppe mit der Formel

darstellt, worin R&sup4; für eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen steht und n eine ganze Zahl von 2 bis 5 bedeutet, während die andere Gruppe R¹ oder R³ ein Wasserstoffatom oder eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, deren Kohlenstoffkette durch bis zu 2 Sauerstoffatome unterbrochen sein kann oder durch eine Hydroxy- oder Oxogruppe substituiert sein kann, oder

b) einer der Reste R¹ und R³ eine Oxoalkylgruppe mit der Formel

darstellt, worin R&sup5; für C&sub1;-C&sub6;-Alkyl steht und p den Wert 2, 3 oder 4 aufweist, während der andere Rest R¹ oder R³ ein Wasserstoffatom oder eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, deren Kohlenstoffkette durch bis zu 2 Sauerstoffatome unterbrochen sein kann oder durch eine Hydroxy- oder Oxogruppe substituiert sein kann, oder

c) R¹ und R³

I) eine verzweigte Hydroxyalkylgruppe der Formel

worin R&sup4; wie oben definiert ist, oder

II) eine Oxoalkylgruppe mit der Formel

bedeuten, worin R&sup5; wie oben definiert ist; und R² eine C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe darstellt; und

B) einem antiviralen Mittel, ausgewählt aus der aus 3'- Azido-2',3'-dideoxythymidin (AZT); 2',3'-Dideoxycytidin (ddc); 2',3'-Dideoxyadenosin (ddA); und 2',3'-Dideoxyinosin (ddI); oder Kombinationen dieser Mittel bestehenden Gruppe;

für die Herstellung eines zum Inhibieren der Replikation eines Human-Immundefizienz-Virus wirksamen Medikamentes.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Mensch ein AIDS-Patient ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin eine kombinierte Menge von Pentoxifyllin und AZT an einen Menschen mit AIDS verabreicht wird.

4. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Pentoxifyllin in einer Menge von etwa 1600-3200 mg/Tag verabreicht wird.

5. Verwendung nach Anspruch 1, worin die kombinierte Menge aus dem Xanthin und dem antiviralen Mittel zur Verringerung des Auftretens opportunistischer Infektionen, die mit AIDS beim Menschen einhergehen, wirksam ist.

6. Verwendung einer kombinierten Menge von

A) einem Metaboliten von Pentoxifyllin, ausgewählt aus der aus 1-(5-Hydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin; 1-(5,6- Dihydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin; 1-(4,5-Dihydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin; 1-(4-Carboxybutyl)-3,7-dimethylxanthin; 1-(3-Carboxypropyl)-3,7-dimethylxanthin; 1- (5-Oxohexyl)-3-methylxanthin und 1-(5-Hydroxyhexyl)-3-methylxanthin bestehenden Gruppe, und

zur Herstellung eines zur Hemmung der Replikation eines Human- Immundefizienz-Virus wirksamen Medikamentes.

7. Verwendung nach Anspruch 6, worin der Metabolit 1-(5-Hydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin ist.

8. Verwendung nach Anspruch 6, worin der Metabolit 1-(3-Carboxypropyl)-3,7-dimethylxanthin ist.