PT99434A - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo derivados de xantina - Google Patents

Description

venção de HOECHST-ROUSSEI. PHAHMACETJTICALS HCORPQRATED, norte-americana, industrial e comercial, estabelecida em Route 202-206 North, Somerville, NJ 08875» Estados Unidos da América, e de DANA-PARBER CÂNCER INSIISUiDE, instituto de investigação científica norte-amerioana, (inventoresí Bruoe J. Dezube, Arthur B. Pardee, Ruth M. Rupreeht e William J* Noviek, Jr., residentes nos Estados Unidos da Amériea), para «PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES PARMACEUTIGAS COMENDO DERIVADOS DE XANTINA»

DesoricSo

Antecedentes da Presente Invenção

GrSP . A presente invenção refere-se à utilização de xantinas para inibir a replioação de retrovírus humanos, tais como o vírus da imunodeficiêneia humana, de tipo I (HIV-1)· A presente invenção refere-se, também, a um - 1 -

método para inibir a proliferação dos retrovírus humanos, oonforme se verificou pela redução da aotividade da trans-criptase inversa. 0 síndroma da imunodeficiência adquirida (SIDA) é uma situação que se reveste, aotualmente, da maior importância na América do Eforte, Europa e áfrica Central. Crê-se que o agente causal da SIDA consiste num retrovirus, designado por ΗΓΥ-1. Estimativas recentes sugerem a possibilidade de, pelo menos, 1,5 milhões de americanos estarem expostos ao vírus da SIDA designado por HIV-1, e que em 1991 se encontrem infectados com o virus da SIDA cerca de 15 milhões de pessoas. Os indivíduos infectados apresentam uma supressão imunolégica grave a que pode seguir-se uma série de doenças degenerativas e, mesmo fatais. 0 isolamento e caracterização dos primeiros retrovírus da SIDA conhecidos como DAT e, poste-riormente designados por HIV-1T|A¥, foram descritos numa trabalho apresentado por F. Barre-Sinoussa, e outros, Science 220:868-871 (1981). A utilização de alguns extrac-tos destes vírus e de algumas das suas proteínas para detec-tar os anticorpos contra o vírus, encontra-se descrita na Patente dos Estados Unidos ÍTS 4 708 818.

Foram referidos posteriormente, por diferentes investigações, diversos isolados do retrovirus da SIDA, tendo-se-lhes atribuído diferentes designações.

Ua actualidade, reconhece-se universalmente que os virus previamente denominados de virus associados à linfatenopatia (DAV), virus associados à imunodeficiência (IDAV1 e IDAV2) 0 vírus de tipo III I-linfotrdpico humano (HI1V-III) e o vírus relacionado com a SIDA (£RV) representavam todos variantes do mesmo retrovirus. Ver, por exemplo, Mature, 313:626-637 (1985). 2

Um subcomite empossado pelo Comité

Internacional da laxonimia dos Yirus propos que os retrovirus da SIDA fossem oficialmente designados por "Virus da Imunodefieiência Humana”, designada de forma abreviada por "HIV". Os isolados de retrovirus Humanos oom relação de afinidade elara, mas limitada, com isolados de HIY (por exemplo mais do que 20$, mas menos do que 50$ de identidade na sequência do ácido nucleico) não deverão ser designados por HIY, a não ser que possuam similiralidades estruturais e biológicas com membros existentes do grupo. Science, 232í697 (1986).

Recuperou-se um outro retrovirus humano patogénico, designado por HIV-2 (primitivamente MY-2), a partir de pacientes da África Ocidental, com SIDA. Clavel e outros, Science, 233*343-346 (1986). A infeoção com HIV-2 encontra-se associada com um sindroma de imunodefieiência clinicamente indistingível do sindroma causado pelos vírus protótipo da SIDA, HIV-1. HIY-2 encontra-se relacionado oom HIY-1, embora sendo distinguido deste e, induz umsindro--ma de imunodefieiência oom uma frequência marcadamente inferior. Guyader e outros, lature, 326; 662-669 (1987)*

Isolaram-se retrovirus geneticamente relacionados e, idênticos, do ponto de vista biológioo com HIV isolado a partir de primatas subhumanos. Designam-se estes retrovirus por virus da imunodefieiência da espécie hospedeira adequada, tal como o virus da imunodefieiência do simio (SIY). Isolou-se o SIY, em primeiro lugar a partir de macacos resus cativos (Macaca Mullatta) em "New England Regional Primate Research Genter (Nerprc). Kanki e outros, Seienoe 228:1199 (1985). Seguiu-se-lhe a divulgação do isolamento de um SIY designado por S5DLI-II do macaco verde Africano, Kanki e outros, Science 230*951 (1985). Existe uma emtensiva reactividade serológiea cruzada entre HIY-2 e . SIY. - 3 - A transmissão de HIV, efeotua-se frequentemente através de contacto sexual, apesar das pessoas que utilizam narcóticos por via intravenosa também representarem um grupo de alto risco. Também se verificou que um grande número de indivíduos foram infectados por HIV após terem recebido sangue ou produtos sanguíneos contaminados. Para além disso, verificou-se o nascimento de crianças infectadas por HIY de mães infectadas com HIV. Crê-se que este vírus seja transmitido pelas mães infectadas aos seus fetos. A existência de múltiplos vírus de imunodeficiência Humana, tais como HIV-1 e HIV-2, evidencia um quadro epidemicoldgico complexo. A infecção por HIV, representa, actualmente, a ameaça número um para a saúde pública, nos Estados tinidos, e uma causa de morte em determinadas áreas densamente populacionais, Existe um pensamento comum no que se refere ao facto de ser necessário desenvolver uma vacina ou uma composição farmacêutica eficaz, tendo oomo objectivo suster a disseminação destes retrovirus. Continua a trabalhar-se no desenvolvimento de uma vacina, mas ainda não foi descoberto um agente eficaz. Deste modo, continua a existir, na especialidade a necessidade de um método para inibir a actividade dos retrovirus Humanos. RESUMO DA PRESEITE IUVE1ÇÃ0 A presente invenção constitui um auxílio no preenchimento desta necessidade. Mais particularmente, a presente invenção proporciona um método para inibir a replicação dos retrovirus Humanos, tais como o vírus da imunodeficiência Humana (HIV). 0 método caraoterísti co pela administração a um Hospedeiro Humano de uma xantina que seja capaz de exibir um efeito protector ou de evitar a replicação retrovirioa.

De um modo mais específico, um dos métodos da presente invenção caracteriza-se pela administra-

çSo a um ser humano de, pelo menos 7-(oxo-alquil)l,3-dial-quil-xantina de fórmulai 0

o—ch3 ti 0 E 2 na qual

Os radieais E^ e E2 são iguais ou diferentes e, independentemente seleceionados entre o grupo constituido por radioais alquilo de eadeia linear ou rami-fioada com 2 a 6 átomos de earhono, radioais ciclo-hexilo, radicais alcoxi-alquilo de cadeia linear ou ramificada e, radicais hidroxi-alquiloj e o simbolo A representa um radical hidrooarboneto com mais de 4 átomos de carbono, que podem ser substituidos por um grupo metilo.

Utiliza-se a xantina de fórmula (I) numa quantidade que seja eficaz para inibir a replicação do retrovirus. A presente invenção proporciona também um método para inibir a replicação de um retrovirus humano, numser humano, oaracterizado o método pela administração a um ser humano de um composto de fórmula í 5 - f 0

R' 1

R' 2 (II) em que: pelo menos um dos radioais R^ e R^ representa a) um grupo hidroxilo ramificado de fórmula

-(CH2)n-C-GH3,

OH oom uma função áleool terciário, na qual o radical R^ representa um grupo alquilo com 1 a 3 átomos áe carbono e o simbolo n representa um número inteiro de 2 a 3, representando o outro radical R^ ou R^ que se pode encontrar, eventualmente presente o átomo de hidrogénio ou um grupo carboneto alifá-tico Rç, com mais de 6 átomos de carbono, cuja cadeia de carbono pode ser interrompida por mais de 2 átomos de oxigénio ou pode ser substituida por um grupo hidroxi ou oxo, ou b) pelo menos um dos radicais R^ ou R^ representa um grupo oxo-alquilo de fórmula - 6 -

Em que o radieal Rg representa o grupo alquilo G-pCg e o simbolo p=2, 3 ou 4} possuindo os radicais R^ e R^ as signifioaçóes anteriormente definidas e, representando o radical R2 um grupo alquilo com ala 4 átomos de carbono.

Utiliza-se a xantina de fórmula (II) numa quantidade que seja efioaz para inibir a replicação do retrovirus. A conhecida composição farmacêutica pentoxi-filina constitui um exemplo de um composto com a fórmula geral (II). A pentoxifilina encontra-se comercial- /τ>\ mente disponível sob a marca registada •'Irental'· 'V na forma de comprimidos para administração oral.

Apesar de se ter utilizado este composto como um medicamento para melhorar as propriedades do fluxo sanguíneo, (experiências clínicas em 1971) não foi feita qualquer referência a este medicamento como ini-bidor da replicação retrovírioa. A oaraeterística evasiva e a diversidade de HI7 torna difícil qualquer tipo de tratamento definitivo. Apresenta-se um agente e um método capaz de auxiliar na prevenção da disseminação de Hl? e de assistir no tratamento da referida infecção, que se caracteriza por se administrar xantina a um ser humano numa quantidade suficiente para evitar ou, pelo menos, inibir a replicação de Hiv, in vivo. - 7 -

DESCRIÇlQ PORMENORIZADA DOS ASPECTOS PREFERENCIAIS

De acordo com a presente invenção, empregam-se determinadas xantinas para inibir a replica-ção de um retrovirus humano. Far-se-á a descrição da natureza dos processos biológicos inicialmente envolvidos na presente invenção. A esta desorição seguir-se-á a descrição pormenorizada das xantinas e dos métodos para a preparação de xantinas. Apresentar-se-ão, então os resultados obtidos por ensaios, in vitro,

DESCRIÇlO PORMENORIZADA DOS ASPECTOS PREFENCIAIS

Pode utilizar-se o método da presente invenção para inibir a replioação de um retrovirus humano, que consiste num virus de ARN de cordão dnieo, encapsulado. 0 vírus contem transcriptase inversa (TI), que é utilizada para catalizar a transcrição do genoma de ARN do vírus na forma de ADN conhecida como o pró-virus. A forma de ADN integra-se, habitualmente no ADN da célula hospedeira. Utilizam-se, preferencialmente as xantinas, de aeordo com o descrito na presente invenção, para inibir a actividade do virus da imunodefioiênoia humana (HIV), incluindo HIV-1 e HIV-2. 0 método da presente invenção é títil para o tratamento de seres humanos injeetados por HIV ou susceptíveis de sofrerem infecçães por HIV. A presente invenção reveste-se de especial utilidade na inibição da actividade de HIV-1 e de HIV-2 nos seres humanos infectados por estes mesmos virus. Embora se faoa a descrição da presente invenção com base em isolados identificados na literatura como LAV-I e HTDV-III e, LAV-II, deverá eonsi-derar-se que a presente invenção abrange retrovirus iguais ou equivalentes. Pensa-se que estes retrovirus sejam os agentes causais da SIDA. - 8 - r

Io que se refere à presente descoberta, considera-se que um virus é igual ou equivalente a LAV/HfliV-III se preencher substancialmente os seguintes critériosí a) 0 virus é trépioo para o linféoitos 3?, especial mente para as células I auxiliares (CB4+); b) 0 virus é citopático para as células CB4+j c) 0 virus codifica uma polimerase de ABI dependente do ABI (transoritase inversa), que é dependente de Mg++ e pode utilizar poli(A)Qoligod^2 2.8 00010 matriz/precursor para a transerição inversa; d) 0 virus é substaneial e imunologicamente interreac-tivo com as proteinas codificadas pelas regiSes gaq e env de LAV/HIIV-IIIj e e) 0 virus compartilha de homologia nucleotídâea substancial aproximadamente 75-100$) e de homologia sequêncial aminoáoida (aproximadamente 75-100$) com LAV ou HTIV-III. 0 principal ingrediente farmaceuticamen te aceitáv el activo utilizado no método da presente invenção é a xantina. Be acordo com o modo como é utilizado na presente invenção, o termo ,,xantinan engloba os compostos de férmula I e de férmula II que possuem um efeito proteotor (profiláctico) contra a infeoção por HIV, um efeito curativo (terapeutieo contra a infeeção por HIY, ou evitem a transmissão de HIY nos seres humanos, As xantinas englobam compostos que são utilizados antes da ocorrência da infec-gão por HIY ou antes da infeoção por HIV se tornar evidente tendo em vista evitar ou reduzir a ocorrência da infeoção,

As xantinas englobam, também compostos cuja aeção terapêutica é utilizada para confirmar a infeoção por HIY. Para além - 9 -

disso, as xantinas englobam compostos que são ilteis na prevenção da inveoção de seres humanos por veetores HIY, incluindo as xantinas que intervem ou interferem eom o ci-clo de replieação de HIY nos hospedeiros humanos. 0 mecanismo segundo o qual as xantinas da presente invenção inibem a replieação de HIY, in vivo, não se encontra totalmente esclarecido. Demonstrou-se que as xantinas inibem a replieação de HIV-1, por medição da actividade ET dos sobrenadantes de oulturas infectadas.

Em circunstancia alguma, o mecanismo de inibição da actividade dos retrovirus humanos se pode dever a um factor ou a uma combinação de faotores, tais como uma modificação de uma ou mais caraoterístioas genotipicas ou fenotípicas dos retrovirus ou à modificação dos processos víricos ou celulares. Para além disto, é evidente que os retrovirus penetram nas células; a xantina pode alterar o processo de penetração. Mas ainda, os elementos genómioos que controlam a expressão dos produtos necessários para a replieação víriea podem ser alterados ou o seu funcionamento pode ser efeetua-do pela xantina. Deste modo, a xantina pode alterar, por exemplo, a natureza do invólucro de gliooproteína do retrovirus ou inibir a expressão de diversos genes. As xantinas pode, também, agir, mediando o funcionamento do sistema reticulo-andotelial, antes ou depois da ocorrência de infecção por HIV, A xantina pode, também, inibir a proliferação de HIY nas células fagoeíticas infectadas. Deverá ter-se em atenção que as xantinas podem aotuar segundo qualquer destas vias ou por combinação das mesmas ou, de acordo com outras vias não reconheeidas actualmente. De qualquer modo, podem administrar-se as xantinas ao paciente em quantidades suficientemente para se atingir um ou mais dos referidos efeitos. A utilização de xantinas, de acordo com a presente invenção, num paciente com SIDA, destina-se a inibir a replieação de HIY, o que originará uma certa - 10 - τ

regeneração do organismo hopedeiro e, reduzirá, pelo menos, a pos terior deterioração do sistema imunitário do hospedeiro. Pode demonstrar-se a efioáeia das xantinas na prevenção ou inibição da replicação viriea e da infecção das células, utilizando ensaios normalizados, in vitro.

Pode, por exemplo, demonstrar-se o efeito inihidor das xantinas sobre a infeoção ou replioa-ção de HIY, cultivando o virus ou as oélulas infectadas pelo virus na presença e na ausência de xantina e, comparando depois os resultados. A capacidade das xantinas para inihir a replicação dos retrovirus humanos, pode ser demonstrada, in vitro, calculando a aotividade da transcritase inversa. Pode, por exemplo, concentrar-se meios condicionados de células infectadas por retrovirus, por precipitação com polie-tileno-glicol ou por centrifugação.

Podem recozer-se precursores de matrizes sintéticas contendo 12 a 18 bases de um ADI precursor em 300 bases de matriz de ARI. Podem romper-se os viriães contendo EI, com um detergente, tal como Triton X-100.

Ha presença de um nucleosido trifosfato adequado, tal eomo guanosina-trifosfato radioactivamente, um catião bivalente I t (habitualmente Mg ) e de potássio, a TI pode incorporar eficientemente 0 nueleotido marcado no cordão de AM, de acordo com 0 indicado pela sequência nuoleotidiea do cordão de ADI. Origina-se um híbrido ARIsADI, susoeptível de precipitar em ácido e maroado radioactivamente. Pode ana-lizar-se este produto num eontador de cintilação líquida e exprimir-se os resultados como pioomoles de um nucledsi-do monosfosfato incorporado, por unidade de tempo, ou de se compararem os resultados com um padrão, como unidades de EI. Utilizaram-se, habitualmente, dois precursores matriciais de sintese, nestes ensaio: Poli(A)n ligo(dt)12_i3 e ροϋ(0)Ώ Oligo(dG). A matriz/preoursor ροϋ(Ο)^ oligo - 11 -

(gLG)i2«i8 ^ específica para os retrovirus e é eficiente-mente utilizada pela transcritase inversa dos retrovirus 4.4* humanos, na presença de Mg

Também se pode detectar a inibição da replicação de HIY, utilizando anticorpos monoclonais ou policlonais num imuno-ensaio. Especificando, podem utilizar-se determinados ensaios imunolégioos para se efec-tuar o rastreio das xantinas da presente invenção quanto à sua efioácia, em estudos in vitro e in vivo. Os ensaios englobam o ensaio competitivo imunoabsorvendo ligado à enzima (ELISA) e ensaios da captura de antigenos.

Também se pode utilizar a reacção em cadeia de polimerase (RCP), como um ensaio para verificar a inibição da replicação de HIV-1, por amplificaçãoenzi-mática in vitro, de pequenas regiães dos retrovirus humanos, como por exemplo, as regiSès TI ou gag, Uma vez que se conhece a sequência que codifica a TI nos retrovirus humanos, pode utilizar-se a informação sequencial para sintetizar oligonucleótidos de 20 a 50 bases que se utilizam como precursores na sintese do ADI na RCP. Pode adi-oionar-se o ADI das células submetidas à investigação aos oligonucleétidos precursores, na presença dos quatro oligo-nucledsidos trifosfato, de uma ADI polimerase dependente de ADI estável ao aquecimento e de um tampão adequado.Pode oiclizar-se, então, a mistura de reacção, através do prooe-dimento convencional de amplificação a três fases, que envolve a desnaturação, por aquecimento, do ADI, o recozi-mento dos precursores, o que origina o ADI de cordão simples e a extensão do precursor para se formarem cópias múltiplas da sequência alvo. Em cada um dos ciclos verifica--se a duplicação do ADI alvo, originando uma expansão em progressão geométrica da sequência alvo.

Existem diversos métodos para quantificar e ampliar produtos. Para os pares de precursores - 12 -

nos quais existe uma sintese mínima de ADU nas amostras normais, é possível utilizar-se oomo substractos nueleosido--trifosfatos maroados radioactivamente, precipitar em ácido o produto amplificado e analisar o produto num contador de cintilação líquida. Se existir uma síntese significativa de ÃM no ADU normal, para um dado par de precursores, pode fraccionar-se o produto numa escala mínima, em bandas especificas que se quantificam utilizando um densiémetro.

Podem utilizar-se, de igual modo, manchas pontuais ou manchas Southern sobre o produto amplificado, podendo quantifiear-se a quantidade de produto hibridiado.

Um outro método que permite demonstrar a eficácia das xantinas na inibição da replieação ví-rica, de acordo com a presente invenção, envolve a cultura de células mononuoleares do sangue periférico normal ou de outras células em cultura exposta ao virus. Para se ensaiai a eficácia podem utilizar-se células sem vírus ou células infectadas pelos vírus que se eultivam simultaneamente com uma eélula indicadora sensível ao virus. 0 vírus re-plica-se no recipiente que contém a célula indicadora. Comparando a replieação vírica na ausência de xantina com a replieação vírica na presença do fármaco, pode demonstrar--se o efeito inibidor da xantina sobre HIY.

Também se pode demonstrar a inibição da replieação retrovírioa, de aeordo com a presente invenção, examinando a produção de virus, que pode ser determinada por mioroscopia electréniea de partículas vírieas evidentes e de diversos proteínas vírieas diferentes de II.

Em diversos protocolos de deteeção de proteína vírica, utilizam-se anticorpos monocloiais normalizados preparados em função do vírus em diversas espécies animais. Podem detectar-se rapidamente proteínas vírieas por imunofluo-rescênoia e, podem preparar-se soros sensíveis hiperimuno-ldgicos. Podem, também, utilizar-se os ensaios radioimunoló - 13 -

gico e ELISA para se determinar a presença de proteínas vírieas por competição, num sistema em que um sistema an-genoantioorpo identificável por marcação radioactiva ou eolorimetrioamente pode ser perturbado pela adição do an-tigene reactivo .

Uma outra abordagem para se demonstrar a eficácia das xantinas, de acordo com a presente invenção, envolve a deteoção do virus, por deteoção do ADI vírico assim como do mAEN vírioo integrados e não integrados* Nature, 512:166-169 (1984)# Especificando, num ensaio típico, exp8e-se as células a viriSes isentos de células, numa multiplicidade de partículas víricas por células e cultivam-se na presença ou na ausência de xantinas.

Extrai-se o ADI de alto peso molecular, em diversas alturas, e, ensaia-se para se verificar o seu teor de ADI vírioo utilizando uma sonda de ADI marcado ra-dioactivamente. Ia ausência de xantinas, sob as eondiçBes de cultura, detectou-se ADI vírico. Em contraste, no ADI proveniente das células que tinbam sido completamente protegidas oom xantinas, não se detectou ADI integrado ou não integrados.

As técnicas de hibridação de mancha Southern e Northern são áteis na determinação de quantidades relativas de ADI e de ARI vírico, proveniente das células e tecidos portadores do virus. Science, 227: 177-182 (1985). Pode constituir-se uma sonda para os pr<5-vírus integrados utilizando ADI pré-vírico marcado radioactivamente e olonado molecularmente, podendo depois, determinar-se num ensaio de transferência de ADN se existe um genoma prò-vírico integrado no ADI eelular, por hibridação. Se apenas algumas das células contiverem o pré-vírus, pode levar-se a efeito a hibridação in situ. Podem empregar-se estas técnhcas para se demonstrar o efeito das xantinas sobre a replicação dos retrovirus· - 14 -

Também é possível monitorizar-se a replicaçSo dos virus determinando se o AM vírieo se expressa nas células I alvo expostas ao vírus e cultivadas com ou seu xantinas. Neste ensaio, expoe-se as células a HIY e extrai-se o AM das células. Ensaia-se, depois, o AEN extraído quanto ao seu teor de AM vírieo, por hi-bridação da mancha Northern, utilizando uma sonda de AM anti-sentido de HIY marcada radioaotivamente. Science, 227:177-182 (1985), Na ausência de inibidor, é possível deteotar AM vírieo. Quando estas culturas se conservam por extensos períodos de tempo, na presença de xantinas, não é possível detectar-se a expressão AM vírieo nas células, ou se o for, a quantidade presente será reduzida. Este sistema de ensaio torna possível determinar a capacidade das xantinas para inibirem a sintese de nucleotidos de HIY e a expressão de mAM nas células T expostas ao virus.

Para além disto, as linhas de oélulas Mt2 e mT4 infeetadas por HIY 1 são sensíveis ao efeito cito-pátiGO do virus. Assim, podem utilizar-se estas células em ensaios de formação de placa para demonstrar o efeito inibidor das xantinas sobre a proliferação da infeeção por HIV. Science, 22^:553-566 (1985). A eficácia das xantinas para inibirem a infeeção por HIY ou a replicaçSo de HIY, também pode ser demonstrada in vitro, determinando o efeito inibidor do fármaco sobre a expressão da proteína p24 gag nas oélulas H9, parcialmente resistentes ao efeito citopático de HIV. M. Popovic e outros. Science, 224:497-500 (1084).

Também Be pode demonstrar a actividade anti-HIY indicando o efeito inibidor das xantinas no efeito citopático de HIV. M. Hiroaki e outros, Science, 240; 646-649 (1988).

Pinalmente, a actividade das xantinas pode ser demonstrada em células T normais, in vitro. Neste - 15 -

ensaio, utilizam-se células T normais auxiliares / intuto-ras, tais como as células ÍD clonais, auxiliares/indutoras normais olonadas específicas do toxoide tetânico (oélulas ÍDMII), para se monitorizar o efeito das xantinas na respostas proliferativa induzida pelo aatigene. H. Mit,suya e outros, descreveram pormenorizadamente esta técnica, Science, 2^0:646-649 (1988).

Pode confirmar-se, in vivo, a efieá-oia das xantinas na prevenção ou na inibição da infecção ou replioação de HIV, com ehimpanzés ou ratos SCID quimeras reconstituídos com células do sistema imunitário humano A infecção persistente com HIY foi demonstrada com este primata, apesar de não se ter demonstrado uma doença semelhante à SIM. Pode demonstrar-se a eficácia das xantinas por comparação dos ehimpanzés não tratados è tratados no que se refere à sero-conversão em antígenos HIV, ao re-iso-lamento do virus infecoioso dos animais, por linfadenopatia demonstrável, por alterações nos níveis linfocitários T4 ou ¢8 ou por combinação destas medidas.

Os virus HIY necessários para levar a efeito estes ensaios podem ser obtidos, a partir de fontes convencionais, utilizando técnicas conhecidas. Pode, estimular-se, por exemplo, células mononueleares preparadas a partir de sangue periférico, medula óssea e de outros teGidos, provenientes de pacientes ou de doadores, com agentes mitogénicos (fito-hemaglutinina-PHA), durante 48 a 72 horas e eolocar-se na cultura de células utilizando meio de crescimento enriquecido com factor de crescimento das oélulas T (PCCI). Pode detectar-se o virus : monitorizando os fluidos sobrenadantes no que se refere à aetivida-de da transoritase inversa; 2) transmitindo o virus a linfécitos T, humanos normais e frescos (por exemplo, sangue do cordão umbiliear, sangue periférico do adulto, ou leucócitos da medula óssea) ou a determinadas linhas de células ΐ,Μ, Popovic e outros, Science, 224:497 (1984): - 16 -

3) observação por mioroscopia eleotrdnica de células seccionadas e fixadasj e 4) ensaiando a expressão antigéniea, de acordo com procedimentos de imunofluorescén-cia indireota ou de mancha Western, utilizando soro de doadores sero-positivos. Pode levar-se a efeito a detec-ção das células positivas aos virus e a caracterização e comparação dos isolados viricos utilizando reagentes imunolégicos específicos para HIV e sondas de ácido nuclei-co. P. Barre-Sinoussi e outros, Science, 220:868-871 (1983)5 R. 0. Gallo e outros, Science, 220: 865-867 (1983).

Ensaiaram-se diversas e determinadas linhas de células como possíveis alvos para infecção por HIV. Podem também utilizar-se estas linhas celulares para as demonstrar a eficácia das xantinas nos ensaios anterior-mente descritos. Uma linha de células E. neoplásicas aneuplc^i-des provenientes de um adulto oom leucemia linfoide e, designada por HE é sensível à infecção por HELV-III. As células HE produzem eontinuamente HELV-III, após as células progenitores terem sido repetidamente expostas a fluídos concentrados de cultura de células, recolhidos de células T cultivadas a curto prazo (desenvolvidas em ECGP) originadas em pacientes oom o síndroma da linfadeno- patia ou SIDA. Quando a proliferação celular declina, habitualmente 10 a 20 dias após a exposição aos fluídos de cultura, adicionam-se as células progenitoras recentes, HE (não infectadas) à cultura. Para melhorar a tolerância para HIV e conservar o crescimento e a produção continua do virus, elonou-se extensivamente a população de células HE. Conservaram-se diversos desses clones HE em culturas.

Para além disso, existem diversas outras linhas de células E ou pré-E, humanas, que podem ser infectadas por HIV continuando a produzir HIV. Constituem exemplos dessas linhas de células, H4, H9, ΗΠΕ, 78, CEM, Molt 3 e, Ei7.4. Gallo e outros, Patente dos Estados Unidos JP 4 652 599. Para além disso, algumas linhas de células linfoblástieas B, também podem ser produtivamente - 17 -

infeetadas por HIV. Montagnier e outros, Science, 225s 63-66 (1984).

Em resumo, os procedimentos anteriores exemplificam técnicas que podem utilizar-se para se demonstrar a eficácia das xantinas na inibição da replicação de um retrovirus humano. Exemplos especifioos da inibição da replicação retroTÍrica pelas xantinas encontram-se incluídos, a seguir. 2, Administração de Xantinas a Pacientes Humanos

Pode administrar-se uma xantina ou uma mistura de xantinas a um ser humano que necessite de tal terapia, numa quantidade sufioiente para diminuir a replicação de um retrovirus humano. Embora se possam utilizar misturas de xantinas, não se observou qualquer especial vantagem na administração das referidas misturas.

Podem utilizar-se as xantinas e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, como agentes terapêutico nos mamíferos, incluindo, mas não se limitando, a seres humanos, na forma de pilula, comprimido, rebuçados, drageias, cápsulas, supositórios, soluçães injectáveis ou ingeríveis e, similares, no tratamento de seres humanos e de primatas não humanos sensíveis, em que exista distúrbios do funcionamento do sistema imunológico.

Embora as xantinas, sejam eficazes, por si sós, podem ser formuladas e administradas na forma dos seus sais por adição de ácido farmaeeutieamente aceitáveis, tendo em vista a estabilidade, conveniência de cristalização, aumento de solubilidade e, similares, Os sais por adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis preferenciais englobam os sais de ácidos minerais, como por exemplo o ácido olorídrico, sulfiírioo, nítrico e similares; os sais de ácidos carboxílicos monobásicos, tais como por - 18 -

exemplo, os ácidos acético, propiénieo, e similares; os sais de ácidos earboxílicos dibásicos, como por exemplo, os sais de ácidos maleico, fumárioo, oxalico e similares; e os sais de ácidos earboxílicos tribásieos, como ss sais de ácidos oarboxi-sucoínioo, cítrico e, similares.

Podem administrar-se as xantinas por via oral, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veículo edível. Podem ser introduzidas em cápsulas de gelatina ou, de acordo com técnicas de compressão, em comprimidos. Para administração terapeub ica oral, podem incorporar--se os compostos com excipientes e, utilizá-los na forma de comprimidos, rebuçados, cápsulas, elixires, suspensães, xaropes, bolachas, gomas de mascar e similares. Estas pre-paraçães deverão conter, pelo menos, 0,51° do ingrediente aetivo, podendo variar a quantidade em função da forma especifica de administração, podendo encontrar-se compreendido, oonvenientemente entre 4»0fo e cerca de 70fo do peso da unidade. A quantidade de xantina, nestas composiçSes será a quantidade adequada de modo a obter-se uma dosagem adequadamente. As eomposiçSes e preparaçães preferenciais, de acordo com a presente invenção, preparam-se de modo a que uma forma unitária de dosagem oral eontenha entre cerca de 1,0 mg e cerca de 400 mg do ingrediente aetivo.

Os eomprimidos, pílulas, cápsulas, rebuçados e similares podem conter os ingredientes seguintes: um ligante, tal como celulose microcristalina, goma alean-tira eu gelatina; um excipiente, tal como amido ou lactose; um agente desintegrante, tal como ácido algínico, Primogel, amido de milho e, similares; um lubrificante, tal oomo estearato de magnésio ou Sterotes; um lubrificante, tal como diéxido de silieone coloidal; um agente eduloorante, tal oomo sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante, tal como hortelã-pimenta, salicilato de metilo, ou essencia de laranja. No caso da forma de dosagem unitária consistir numa cápsula, esta englobará, para além dos ingredientes 19 -

anteriormente referidos, um veículo líquido, tal como um óleo gordo.

Outras formas de dosagem unitária podem conter materiais que modifiquem a forma física da forma de dosagem unitária, como por exemplo, revestimentos. Deste modo, os comprimidos ou pílulas poderio ser revestidos com açácar, shellac ou outros agentes de revestimento entérico. Um xarope pode conter, para alem do ingrediente activo, sacarose, como agente edulcorante e, conservantes, corantes, agentes de coloração e aromatizantes. Os materiais utilizados na preparação destas composições deverão ser farmaceutica-mente puros e, não deverão ser tóxicos nas quantidades utilizadas.

Para fins de administração parenteral, como por exemplo, por injecção intravenosa ou intramuscular, podem incorporar-se as xantinas numa solução ou suspensão.

Estas preparações deverão conter, pelo menos, 0,1% do composto anteriormente referido, podendo esta quantidade νθΓίφΓ entre 0,5% e cerca de 50% do seu peso. A quantidade do ingrediente activo nestas corrposições deverá consistir numa quantidade tal que proporciona nma dosagem adequada. As composições e preparações preferenciais, de acordo com a presente invenção, preparàm-se de modo a que uma forma unitária de dosagem parenteral contenha entre 0, 5 mg e 100 mg do ingrediente activo.

As soluções de suspensões de xantinas, também podem incluir os seguintes componentes: um diluente esterilizado, tal como água para injecções, soluções saii-na, óleos, polietileno-glicóis, glicerina, propileno-glicol ou outros solventes sintéticos? agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil-parabeno; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou dissulfureto de sódio? agentes que-liferos, tais como ácido etileno-diamino-tetracético? tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos; e agentes para ajustamento da tonicidade, tais como cloreto de sódio 20

e dextrose. A preparação parenteral pode ser introduzida em ampolas, seringas descartáveis ou em ampolas de doses múltiplas, de vidro ou de plástico.

Embora os valores das dosagens possam variar, obtem-se bons resultados quando se administram as xantinas de fórmula I ou de fórmula II a um indivíduo que necessite de tal tratamento, na forma de uma dose oral, parenteral ou intravenosa eficaz, de aproximadamente 0,1 a 25 mg/icg do peso corporal, por dia. Uma quantidade eficaz particularmente preferencial consáste em carta de 1,0 mg/Kg do peso corporal/dia. Geralmente, as doses diárias oscilam entre 10-5000 mg, de preferência entre 1600-3200 mg, por dia.

Deverá, contudo, ter-se em consideração que para um determinado indivíduo, deverão ajustar-se regímenes de dosagem específicos, consoante as necessidades individuais e a opinião profissional de quem administra ou supervisiona a administração das xantinas. Deverá considerar--se, ainda, que as dosagens anterioçmente indicadas são apenas exemplificadas e não poderão, de modo algum, limitar o âmbito ou a prática da presente invenção.

Deverá, ainda, ter-se em consideração que as xantinas podem ser utilizadas antes, após ou em simultâneo com outros tratamentos que inibem a actividade retrovèri-ca. Deste modo, por exemplo, no caso de HIV, podem utilizar--se as xantinas com 3'-azido-2*,3'-didesoxi-timidina (A ZT), 2’,3 '-didesoxi-citidina (ddC), 21,3'-didesoxi-adenosina (ddA), 2', 3 '-didesoxi-inosina (ddl) ou com combinações destes fármacos. Para alem dos didesoxi-nucleotidos podem utilizar-se diversos outros agentes em combinação com as xantinas da presente invenção. Podem administrar-se, por exemplo, as xantinas em conexão com terapias que se baseiam na utilização dos compostos HPA 23, fosfonoformado (foscarnet!, ribavirina e rifabutina. De modo idêntico, podem utilizar-se 21

as xantinas da presente invenção, com factores estimulantes de colónias, tais como o factor estimulante de colónias de granulócitos (G-CSF), factor estimulante das colónias de granulócitos matrófagos (GM-CSF), ou com combinações destes fármacos. Podem também utilizar-se as xantinas, de acordo com a presente invenção, com outros fármacos, tais como o aciclovir, β-interferão, ou combinações destes fãrmacos com ou sem um didesoxi-nucleósido, tal como ΑΖΊ?.

As terapias antivíricas que se descrevem na presente invenção, também podem ser utilizadas em combinação com terapias dê reforço do sistema imunitário de um individuo. P0de por exemplo, efectuar-se a imunoestimulação ou a imuno-reconstiti-tuição por transplantação da medula óssea, utilização do fármaco ampligénio, ou por administração de interleucina--2 a um paciente humano.

Para além disto, podem utilizar-se as xantinas com outras combinações de terapias, tais como com ΑΞΤ em combinação com ampligénio, ddC ou GM-CSG. Também se podem utilizar as xantinas com peptidos utilizados para evitar ou inibir a infecçlo ou a repliçaçao de HIV. P0de utilizar-se a presente invenção para tratar infecções retroviricas em seres humanos ou como agente profilático para esse tipo de infecções. A presente invenção torna possível melhorar a situação e o bem estar do paciente, inibindo a replicação de um retrovirus. Contempla, ainda uma melhoria no que se refere à sobrevivência dos pacientes. 3. Dascricão e P-reparacão de Xantina de Formula (i)

Uta grupo de xantinas que pode ser utilizado, na presente invenção possui a seguinte fórmula: 22 -

Os substituintes dos radio ais R·^ e R2 na formula I são idênticos ou diferentes e foram independentemente seleccionados entre o grupo constituído por radicais alquilo de cadeia linear ou ramificada com 2 a 6 átomos, radieais eiclo-hexilo, aleoxi-alquilo e hidroxi-al-quilo. 0 substituinte A representa um radioal hidrocarbone-to com mais de 4 átomos de carbono, que pode ser substituído por um grupo metilo.

Um composto que se encontra englobado dentro dos compostos de fórmula I, que se verificou ser particular eficaz na inibiçSo da actividade da transorip-tase inversa HIV-1 é l,3-dibutil-7-(2-oxopropil)xantina.

Este composto que também se refere na presente invenção de modo abreviado por HDB0PXn, possui a seguinte fórmula: 0

II

gh2-o-oh3 - 23 - (XII)

é possível demonstrar-se a capacidade do composto III para inibir a aetividade retrovírioa.

Apesr de DBOPX ser a xantina especial-· mentè preferida, para utilização na presente invenção, podem utilizar-se diversos outros compostos. Por exemplo, as xantinas de fórmula I podem ser substituidas por outros grupos alquilo ou por grupos alooxi ou hidroxi-al-quilo. Os grupos alquilo adequados englobam grupos de cadeia linear ou ramificada, tais como etilo, propilo, isopropilo, butilo, seo-butilo, terc-butilo, amilo, he-xilo e, similares. Os grupos alquilo substituidos por alooxi, englobam grupos de cadeia linear ou ramificada convertendo de 2 a 6 átomos de carbono nos grupos alooxi e alquilo combinados, ineluindo os grupos metoxi-metilo, amiloxi-metilo, metoxi-etilo, butoxi-etilo, propoxi--propilo e similares. Os grupos hidroxi-alquilo são os que oontém de 1 a 6 átomos de carbono, tais oomo os grupos hidroxi-metilo, hidroxi-etilo, Mdroxi-propilo, Mdroxi--hexilo e, similares.

Os grupos de bidrocarbonetos representados por A na fórmula I são grupos de bidrooarbonetos alifáticos saturados bivalentes, isto é, grupos metileno, etileno, trimetileno e tetrametileno, que podem ser substituidos, no átomo de carbono adjacente ao grupo car-bonilo, por metilo. Estes grupos substituidos por metilo englobam grupos etilidina, 1,2-propileno e, 1,3-butileno.

Deverá considerar-se que o método da presente invenção pode ser posto em prática com compostos que se alteram, in vivo, numa das xantinas de fórmula I anteriormente referidas, assim como eom compostos que produzem metabolitos formados a partir das xantinas de fórmula I anteriormente referidas.

Os compostos de fórmula I utilizados na presente invenção, podem ser sintetizados utilizando - 24 -

técnicas conhecidas. Podem, por exemplo, preparar-se os compostos a temperaturas elevadas, eventualmente na presença de um solvente, fazendo reagir as xantinas 1,3-dialqui-lo substituidas correspondentes da fórmula

(III) nas quais os radioais RI e R2 possuem as significaçóes an-teriormente definidas, eom cetonas metílioas β -insa-turadas que correspondem à fórmula n2o = 0 - 0 - ch5 (IV)

I I R 0 0 radical R, na fórmula IV, representa um substituinte que pode consistir num átomo de hidrogénio ou num grupo metilo. Pode levar-se a efeito a reaeção em meio alcalino.

Um meio alternativo de preparação consiste em fazer-se reagir sais de metais alcalinos de derivados de 1,3-dialquil-xantinas, de fórmula geral II, nos 1 2 quais os radicais R e R possuem as significaçães anterior-mente definidas, como haletos de oxaalquilo que correspondem à fórmula CH3 - C - A - Hal (V)

M - 25 - 0

nos quais o simbolo A possui a significação anteriormente definida e Hal representa um átomo de halogéneo, de modo preferência um átomo de oloro ou de bromo.

Efectuam-se, preferencialmente estas reacções, a uma temperatura entre 40 e 80°0, eventualmente sob pressão elevada ou reduzida, mas habitualmente à pressão atmosférica. Podem utilizar-se os compostos individuais de partida quer em quantidades estequiometricas quer em excesso. Os sais alcalinos, no método alternativo de preparação podem ser preparados anteoipadamente ou durante a própria reacção.

Os solventes adequados para utilização nas reaoçães oonsistem em compostos miscíveis em água, de preferência, álcoois inferiores, tais como metanol, pro-panol, isopropanol e diversos butanéis; acetona; piridina; trietil-aminaj álcoois poli-hidricos tais como etileno-gli-ool, éter mono-metílico ou mono-etílico.

Os compostos de fórmula I são conhecidos pelo seu efeito mareado no aumento do fluxo sanguíneo atrav's do músculo esquelético e pela sua baixa toxicidade. 0 mais activo desses compostos, para utilização, de acordo com a presente invenção é a l,3-dibutil-7-(2-oxo-pro·· pil)xantina, isto é DBPOX.

Na Patente dos Estados Unidos N2 4 242 345» encontra-se uma descrição mais pormenorizada dos compostos utilizados na presente invenção e dos métodos para a preparação desses eompostos, englobando-se aqui, a título de referência, toda a descoberta contida na referida patente.

4. Descrição e Preparação das Xantinas de fórmula II

Pode conseguir-se inibir a actividade dos retrovirus humanos, administrando a um paciente humano, 26 -

uma xantina de fórmula

em que, pelo menos, um dos radicais R1 e Έ? representa a) um grupo hidroxi-alquilo ramificado, de fórmula -(CH2)n-C-CH5,

I

OH com uma função álcool terciário, na qual o radical R^" representa um grupo alquilo com 1 a 3 átomos de carbono e em que o simbolo n representa um número inteiro de 2a 5» representando os outros 1 3 radicais R ou R^ uqe podem eventualmente encontrar--se presentes, um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroearboneto alifático, R^ que possua até 6 átomos de oarbono, podendo essa oadeia de carbono ser interrompida por um ou dois átomos de oxigénio, ou podendo ser substituída por um grupo hidro-xi ou oxo, ou b) pelo menos um dos radicais R ou R^ representa um grupo oxalilo de fórmula - 27 -

g

Em que o radical 1 representa um 1 6 grupo alquilo (0 -0 ) e p= 2,3 ou 4; os outros radicais 1 2 R e R possuem as significações anteriormente definidas, 2 e o radical R representa um grupo alquilo anteriormente 2 definidas, e o radical R representa um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono. Utilizam-se a xantina de fórmula II, numa quantidade tal que seja efioaz na inibição da actividade retrovírica. Entre estes compostos, encontra-se o composto oomercialmentè disponível pentoxifilina (Iren-tal). Podem utilizar-se diversos outros compostos para inibir a actividade dos retrovirus humanos. Entre estes compostos encontram-se aqueles que se identificam, a seguir: - 28 -

INIBIÇÃO BA ACIIVIBABE ΕΕΪΒ.0ΥΙΕΙ0Α compostos be eõbmjla(ii)

Oomp* NQ E1 e2 S3 0 * 2 oh3-o-(ch2)4- -CH_ 3 -ch2-oh2-oh3 OH 1 3 ch3-o-(ch2)4- » -oh3 -CH2-0H2-0-0H3 ch5 4 II tl -ch2-0-(ch2 )2-0-01^ 5 I! II -H 6 H II -CH2-CH2-CH3 OH 1 7 II II -0H2-0H-CH3 OH » 8 II II -CH2-CH-(CH3)2 9 II -CH2-CH3 -oh2-o-oh2-oh3 - 29 -

Oomp. 12 E1 &2 ^ CR, 3 10 n -oh3 4ch2)4-c-ch3 1 OH 11 tl H -ch2-o-ch2-ch3

Ia presente invenção utiliza-se pre-ferenoialmente o composto 7-etoxi-metil-l-(5-hidroxi-5--metil-hexil)-3-metil-xantina, isto é, o composto 12 11. 0 oomposto 7-etoxi-metil-l-(5-Mdroxi -5-metil-hexil)-3-metil-xantina, isto é, o oomposto is ll também é preferencial, na presentè invenção.

Deverá considerar-se que o método da presente invenção pode ser posto em prátioa oom oompostos que se alteram, in vivo, numa d as xantinas anteriormente referidas, de férmula II, assim oomo com compostos que produzem metabolitos, in vivo, idênticos aos metabolitos formados pelas xantinas anteriormente referidas, de fórmula II.

Por exemplo, após administração oral e intravenosa, a pentoxifilina é quase oompletamente rnota-bolizada. Identificaram-se os sete metabolitos seguintes, na urina humana, que é a via de exoreção predominante dos metabolidos: - 30 -

12 Metabolito I 13 Metabolito II 14 Metabolito III 15 Metabolito IV 16 Metabolito V 17 Metabolito VI 18 Metabolito VII l-(5-hidroxi-liexil)-3,7-dimetil-xan-tina l-( 5 , 6-di-b.idroxi-h.exil) -3r7-dimetil--xantina 1-(4,5-di-hidr oxi-bexil)-3»7-dime ti1--xantina l-(4-oarboxi-butil)-3,7-dimetil-xan-tina l-(3-oarboxi-propil)-3,7-dimetil-xan-tina l-(5-oxo-liexi)-3-metil-xantina 1- (5-Mdroxi-bexi) -3 -metil-xantina.

Os metabolitos I e V são os principais metabolitos. 0 metabolito V, o principal metabolito urinário, consiste em 50-60$ da dose administrada. Apenas se encontram na urina vestígios de pentoxifílina e de Metabolito I, Os derivados di-bidroxi da pentoxifilina (Metabolitos II e III) representam, aproximadamente 12 por cento e o Metabolito IV cerca de 8 por cento dos produtos de excreção.

Os compostos de fórmula II podem ser preparados, de acordo com as deseobertas referidas na Patente dos Estados Unidos ]js 3 737 433 e na Patente Belga / 1 3 is 831 051 (em que os radicais R e R' representam oxo- 1/3 -alilo). Io caso de pelo menos um dos radicais R /Ir representarem um álcool terciário, pode fazer-se referência ao Pedido de Patente Internacional PCI/EP86/00401, registado em 1986, Julbo, 08, em que se reivindica a prioridade alemã de 1985, Juliio 08. leste pedido de patente enoontra--se consignado assim como na invenção a que diz respeito, diversos aspectos de vias de síntese para as xantinas de fórmula II, que se consideram englobados pela presente invenção. - 31 -

Hm dos exemplos de um dos aspectos consiste em

a) fazer reagir 3-alquil-xantinas de fórmula YII

(VII) %

na qual o radical R^ representa um grupo alquilo que possua até 4 átomos de c arbono com agentes de alquilação de fórmula VIII (VIII) x-(°h2}-c-ch3

OH

na qual o s imbolo X representa o átomo de Ralogé-neo, de preferência o átomo de cloro, bromo ou iodo, ou um grupo éster de um ácido sulfónico ou um grupo éster de um ácido fosfórico e, em que o radical R^ e o simbolo n possuem as signifioaçSes anteriormente definidas, para se obter compostos de fórmula IX - 52 -

oom um grupo hidroxi-alquilo terciário, na posição R^ e o átomo de hidrogénio na posição 1 , e, a ) alquilando-o oom o mesmo agente de alquilação ou oom um agente de alquilação diferente, de fdrmula VIII, para se obterem compostos em oonformidade com a invenção de fdrmula X

com dois grupos hidroxi-alquilo terciários iguais ou dife- 1 3 rentes, nas posiçdes 1 e R , ou - 33 -

OH (ΣΙ) !m qualquer dos oasos é preferível actuar na presença de meios alcalinos ou utilizar as xanti-nas na forma dos seus sais.

Um outro aspeoto consiste em b) substituir as xantinas 1,3-dialquiladas, de fór

mula XII

na posição 7, de preferencia, na presença de meio alcalino ou na forma de seus sais, por uma reae-ção a um passo com um composto de fórmula 7III, para se obterem compostos de fórmula XI.

Um outro aspecto consiste em c) fazer reagir, em primeiro lugar as 3-alquil-xanti- nas de fórmula VII, tal como anteriormente se referiu, preferencialmente na presença de meio alcalino ou na forma dos seus sais, com um composto de fórmula - 34 -

R 15

-X (XIII)

cotn a formação de xantinas 5,7-dissubstituidas de fdrmula XIV

(XIV) 15

Ia qual o radioal R possui a si- Ç

gnifioação anteriormente referida para R ou representa um grupo benzilo ou difenil-metilo e, subs-tituindo-as, então, na poBição 1, novamente na presença de meio alcalino ou na forma dos seus sais, por um composto de fdrmula VIII. Obtem-se compostos de fdrmula XV

15 nos quais, o radical R representa um grupo benzilo ou difenil-metilo e, convertendo os compostos de fdrmula VI, nos quais o radioal R1^ representa um grupo benzilo ou difenil-metilo ou um grupo - 55 -

alooxi-metilo ou alcoxialeoxi-metilo, sob pressão reduzida ou condiçóes hidroliticas, em compostos da presente invenção, de fórmula XVI

que se fazem reagir subsequentemente, se se desejar com um composto de fórmula VIII ou Xa para se urbterem compostos pertencentes à presente invenção, de fórmulas X ou XV.

Um outro aspecto oonsiste em: d) reduzir compostos de fórmulas XI ou XV, pertencen-

C tes à presente invenção, nos quais os radicais Br 15 ou R representam um grupo oxo-alquilo, com agentes de redução convenientemente convencionais para o grupo ceto, para se obterem as xantinas correspondentes hidroxi-alquilaâas, pertendentes à presente invenção.

As 3-alquil- ou 1,3-dialq.uil-xantinas, de fórmulas VII ou XII, utilizadas na presente invenção, como materiais de partida e os "agentes de alquilação" de fórmulas VIII, Xa e XIII são na sua maioria conhecidos e podem ser facilmente preparados, de acordo com métodos divulgados na respectiva literatura. Deste modo, os alcoóis terciários de fórmula VIII, por exemplo, podem obter-se por sintese organometálica, fazendo reagir as halo- - 36 -

-cetonas estereoquimicamente não protegidas, de fdrmula (XVII)

Hal-(QH2)fl-CO-CH3 numa reaoção designada por reaoção de síntese, com alquilação redutiva do grupo carbonilo, ootn compos-

sob as condiçães usuais (ver, por exemplo, Houben--Weyl, vol. Vl/1 a, Parte 2 (1980), pp. 928-40, especialmente ff. 1021 e 1104-1112).

Po mesmo modo, a reaeção das lialo- -cetonas de fórmula (XVIII)

Hal-(0H2)n-C0-E4 ootn kaletos de metil-magnósio ou de metil-lítio conduz do mesmo modo ao alvo pretendido.

Xambém se podem converter as hidroxi -cetonas correspondentes às fórmulas XVII e XVIII, lentamente, em diois, com compostos alquilmetálicos, de acordo com o procedimento usual, directamente ou mascarando temporariamente o grupo iiidroxi, por exemplo, por formação de acetal com 5»6-di-hidro-4H-pirano (ver, por exemplo Houben-Heyl, vol Vl/l a, Parte 2 (1980), pp. 1113--1124), a partir dos quais se formam compostos de fórmula VIII, por estèrificação selectiva dos grupos liidroxilo primários terminais com grupos sulfonilo ou halogenetos ou anidridos fosfóricos, vantajosamente na presença de meio alcalino.

Outras possibilidades para a sintese de derivados de álcoóis terciários, de fórmula VIII, con- - 37 - sistem da mono-metalização de w-cloro-bromo-aloanos para se obterem compostos w-cloro-alquilmetálicos (Houben--Weyl, Vol. XIIl/2 a (1973), ρρ. 102 e 319) e a sua sub- a sequente reacção com as oetonas R -CO-CH , sendo de realçar que a formação do produto intermédio a partir dos al-canoatos formados como intermediários devido à sua tendência em contrariar o fecho do anel com a eliminação de sal metálico ser minimizado pelo adequado controlo de temperatura ou pela utilização de w-halo-l-alcanéis como materiais de partida, que são metalizados do modo habitual, de preferência na forma de (2)éter tetra-piranilieo ou apés a formação do alcanoato do grupo hidroxi (MO-CH )β--Hal) com qualquer dos compostos alquil-metálioos (ver, por exemplo, Houben-Weyl, Vol. XIIl/2 a (1973), p. 113), fazendo-se depois reagir com as oetonas R^ -CO-CH^ para se obterem os diais mencionados no parágrafo precedente (Houben-Whyl, Vol. Vl/la, Parte 2 (1980), p. 1029) e, esterifiçando, subsequente e selectivamente o grupo hidroxilo primário com derivados adequados de ácido sulfé-nico ou de ácido fosfórico. 21, também, possível fazer-se uma abordagem conveniente aos compostos de fórmula VIII, nos quais o radical R^ representa um grupo metilo, através da reaoção de ésteres alquilicos do ácido w-halo-alcnoilo (Hal-(CH ) -COO-alquilo) com dois equivalentes de um composto metilmetálioo, fazendo o ester reagir através de ee-tona para se produzir um álcool terciário com a introdução de dois grupos metílioos (Houben-Weyl, Vol. Vl/la,

Parte 2(1980), pp. 1171-1174). Do mesmo modo, podem converter-se os ésteres do ácido w-hidroxicarboxílico em âiois com compostos metilmetálioos com ou sem protecção do grupo hidroxilo, por exemplo, na forma de éster tetra-hidro-piranílico (2) ou de éster metoximetílico, ou eventualmente, na forma de laotonas como ésteres cíclicos (ver, por exemplo, Houben-Whyl, Vol. Vl/la, Parte 2 (1980) pp. 1174-1179) a partir dos quais se podem obter, - 38 -

por sua vez, agentes de alquilação activos de fórmula VIII, por esterifioação selectiva do grupo hidroxilo primário oom haletos ou anidridos sulfónioos ou fosfóricos.

Os compostos adequados de fórmula VIII que se podem preparar, de acordo oom os métodos ante-riormente descritos são os oloretos, brometos, iodetos, sulfonatos e fosfatos de /“(w-l)-hidroxi-(w-l)-metil_7 butilo, -pentilo, -hexilo, e -heptilo, de /""(w-2-)-hidro-xi-(w-2)-metil><i_7pefítilo, -hexilo, -heptilo e -octilo, e de /~(ν-3)-ΜόΓθχ1-(ν~3)-ιηβΐϋ^1ιβχί1ο, -heptilo, -octilo, ©u -ftonilo,

Entre os compostos de fórmula B?-

alooxi-metílioos e alcoxi-alcoxi-metílicos ocupam uma posição espeoial, uma vez que os seus haletos podem também ser utilizados oom exito oomo reagentes, embora possam surgir problemas de toxicidade, pelo menos na utilização em larga esoala. Por esta razão, a utilização dos sulfonatos correspondentes é preferencial, neste oaso, em espeoial, encontrando-se facilmente disponíveis, fazendo reagir, por exemplo, anidridos mistos de ácidos carboxílicos alifá-ticos e ácidos sulfónioos alifáticos ou aromáticos (Μ. H. Karger e outros, J. Org. Chem. £6 (1971), pp. 528-531) com os acetais dialquilicos de formaldeído ou com os acetaisi dialcoxi-alquilicos de formaldeído, numa reacção lenta e ligeiramente quantitativa (Μ. H. Karger e outros, J. Amer. Chem. Soo. £1 (1969), pp. 5663/5665: R^-S02-0-C0- (0 -,^-0 ) Alkyl + R8-0-CH2-0-R8 -(C1-C4)Alkyl-C02R8 r7-so2-o-gh2-o-e8 - 39 -

ta um grupo alifático tal oomo metilo, etilo, ou trifluoro--metilo, ou um grupo aromátioo como por exemplo, fenilo, 4-tolilo ou 4-bromo-fenilo, mas representa, preferencial-

Q mente um grupo metilo ou 4-tolilo e o radical R representa um grupo alquilo ou aleoxi-alquilo, que recai na definição dos radioais B? ou R"^.

Pode efeotuar-se a reacção na substân-eia ou num solvente anidro aprótico e inerte para os reagentes a temperaturas entre -20°C e +40°0, de preferência entre 0°0 e 20°0. Mo se torna necessário o isolamento intermédio dos sulfonatos altamente reactivos, que são sensíveis à hidrólise e termicamente lábeis; utilizam-se, preferenci-almentè, imediatamente como produtos brutos para a substituição do azoto das xantinas, sendo desnecessária e a habitual adição de um agente de condensação alcalino.

Efectua-se habitualmente a reacção dos derivados de xantina mono- ou dissubstituidos, IX, XVI, VII, VIII ou Xa ou XIII num agente de distribuição ou solvente inerte para os reagentes. Ra prática são especialmente representativos, os solventes aprótieos, bipolares, oomo por exemplo a formamida, a dimetil-formamida, a dime-tilacetamida, a R-metil-pirrolidona, tetra-metil-ureia, triamida hexametil-fosfórica, sulfóxido de dimetilo, acetona ou butanonaj no entanto, podem, também utili-zar-se álcoois tais como metanol, etileno-glicol e os seus éteres mono- ou dialquilieos, possuindo o grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, mas possuindo em conjunto, no máximo, 5 átomos de carbono, etanol, propanol, isopropanol e diversos butanóis; hidrocarbonetos, tais como benzeno, tolueno ou xilenos; hidrocarbonetos halogenados, tais como dicloro-metano ou clorofórmio; piridina e misturas dos solventes mencionados ou as suas misturas com água. - 40 -

Efectuam-se adequadamente as "reac-ções de alquilação", na presença de um agente de condensação aloalino. Exemplos de materiais adequados para esta reac ção são os hidróxidos, carbonatos, hidratos de metais alcalinos ou de metais alcalino-terrosos, e bases orgânicas tais como trialquil-aminas (por exemplo, trietil- ou tributil-amina) hidróxidos de amónio quaternário ou de fosfónio e resinas retioularmente ligadas com grupos fos-fónio ou amónio fixos e eventualmente substituidos. Também se podem utilizar os derivados de xantina, directamen-te, na reacção de alquilação, na forma dos seus sais se-paradamente preparados, tais como os sais de metais alcalinos, alcalino-terrosos ou sais de fosfónio ou de amónio, eventualmente substituidos, Também se pode alquilar os derivados de xantina mono e dissubstituidos, na presença dos agentes de condensação inorgânicos anteriormente referidos ou na forma dos seus sais de metais alcalinos ou alcalino-terrosos, com o auxílio dos chamados agentes catalíticos de transferência de fase, como por exemplo as ami-nas terciárias, sais de amónio quaternário ou de fosfónio, ou étères em coroa, de preferência num sistema de 2 fases sob condições de catálise de transferência de fase. Entre os agentes eataliticos de transferência de fase adequados, que se encontram, regra geral, eomercialmente disponíveis, encontram-se os sais de tetra(G^-O^)alquil- e de metil--trimetil-amónio e de -fosfónio, os sais de metil-, miris-til-, fenil- e benziltri(C^-C^)- e de cetil-trimetilamó-nio, assim como os sais de 0 -0 )alquil- e de benzil--trifenilfosfónio, tendo-se demonstrado que os compostos que possuem ocatião maior e mais simétrico são os mais eficazes. (Γ "I c A introdução dos grupos Ia, Ir e 3t , de acordo com os procedimentos anteriormente descritos, efectua-se, geralmente, a uma temperatura de reacção compreendida entre 0°G e o ponto de ebulição do meio de reao-ção utilizado, de preferência entre 20° e 150°G, eventual- - 41 -

mente a uma pressão elevada ou reduzida, para a qual o tempo de reaeção pode ser inferior a 1 hora ou superior a diversas horas. A reaeção das 3-alquil-xantinas (VIII) para se produzirem os compostos pertencentes à presente invenção, de fórmula X, torna necessária a introdução de dois grupos hidroxi-alquilo terciários. Podem ligar-se substituintes iguais ou diferentes ao esqueleto da xantinas, sucessivamente, ou podem ligar-se dois grupos hidroxialquilo sem isolamento dos intermediários numa reaeção dnica.

Efectua-se a clivagem redutiva dos grupos benzilo e difenil-metilo, dos compostos de fórmula XV com formação do átomo de xantina na posição 7, sob condiçóes normalizadas desenvolvidas especialmente na técnica do grupo protector na sintese de alcaloides e de peptidos e que se presume encontrar-se amplamente divulgada. Entre a redução química, particularmente a dos compostos bçnzílicos com sódio em amónia líquida (Hiuben-Weyl, Vol. Xl/a, pp. 974-975), a eliminação dois dois grupos aralquilo anteriormente referidos, por hidrogenólise catalítica, utilizando como agente catalítico um metal precioso é também especialmente prática (Houben-Weyl, Vol. Xl/l (1957), pp. 968-971 e Vol. IV/lC, Parte I (1980), pp. 400--404). Utiliza-se vulgarmente, um álcool inferior como meio de reaeção (com a adição eventual de ácido fórmico ou de amónia), ou um solvente aprótioo tal como dimetil--formamida eu, em especial, ácido acético glacial; no entanto, as suas misturas com água também podem ser utilizadas.

Os agentes catalíticos de hidrogena-ção especialmente adequados são o negro de paládio e paládio sobre carvão activado ou sulfato de bário, uma vez que outros metais preciosos tais como a platina, o ródio e o - 42 -

ruténio dem frequentemente origem a reacção secundárias devido à hidrogenação competitiva do anel e, por este motivo, devam apenas ser utilizados solo determinadas condiçães. Efeotua-se a hidrogenação, preferencialmente, a temperaturas compreendidas entre 20°0 e 100°0 e a pressão atmosférica, ou de preferênoia, a uma pressão levemente mais elevada, de aproximadamente 10 bar, sendo geralmente necessários tempos de reacção que vão de alguns minutos a diversas horas.

As xantinas 1,3,7-trissubstituídas, de fórmula XV, que possuem um grupo alooxi-metilo ou um 15 grupo alooxi-alcoxi-metilo na posição E. representam Ο,Ν-acetais. Por consequência, os seus substituintes na posição 7 podem ser separados por hidrólise ácida (cf. Hou-ben-Weyl, Vol, Vl/lb (1984), pp. 741-745) formando-se, do mesmo modo os compostos 7H de fórmula XVI. Constituem exemplos de grupos preferenciais que podem ser hidroliticamente eliminados, os grupos metoxi e etoxi e propoxi-metilo, assim como os grupos metoxi-etoxi-e etoxi-etoxi-metilo. Efectua-se a reacção, de iim modo vantajoso, com aquecimento, em ácidos minerais diluidos, tais como o ácido clorídrico ou o ácido sulfárico, eventualmente com a adição de ácido aoótioo glacial, dioxano, tetra-hidrofurano ou de um álcool inferior como um promotor da solução. São também líteis o ácido perclórioo ou os ácidos orgânicos, tais como os ácidos trifluoroacético, fórmico, e acético, em combinação com quantidades catalíticas de ácidos minerais0 Os compostos alcoxi-alcoximetílioos, em particular, também podem ser clivados utilizando ácidos de lewis, tais como brometo de zinco e tetracloreto de titânio em meio anidro de preferência em dicloro-metano ou clorofórmio, hidrolizan-’ do-se espontaneamente durante o processamento aquoso os derivados 7-bromo-metilo ou 7-bromo-zinco, formados como compostos intermediários, Na clivagem em soluçSo mineral ácida, tem de se seleccionar a temperatura de reacção de modo a que não ocorra uma desidratação significativa do - 43 -

grupo hidroxi-alquilo terciário, na posição l.$ Deverá, no entanto, regra geral, ser inferior a 100°C. A redução das xantinas de fórmulas XI e XV como um grupo oxo-alquilo na posição de B? ou de 15 R. nos compostos de grupo hidroxi-alquilo correspondentes, pode ser efectuada,em prineipio, com metais alcalinos ou por hidrogenação catalítica, mas o método de escolha consiste em que a reacção se efectue sob oondições muito moderadas e, em grandes quantidades com liidretos de metais simples (MHn), Mdretos de complexos metálicos (M CM H, ou Mdretos organometálioos (Houben-Weyll, Vol. IV/ld (1981), pp. 267-282 e Vol. Vl/lb (1984), pp. 141-155).

Dos numerosos hidretos de complexos metálicos que se podem utilizar para redução dascetonas, os reagentes mais frequentemente utilizados que se podem mencionar são, por exemplo, o alanato de lítio, o boro-Mdreto de lltio e, especialmente, o boro-Mdreto de sódio, que é fácil de manusear devido à sua baixa reactividade e que acima de tudo permite trabalhar em soluções ou suspensões alcoólicas, alcoólico- aquosas, e puramente aquosas. Para além dos outros solventes inertes usuais, tais como os éteres (como por exemplo éter dietílico, tetra-hidroburano, 1,2-dime-toxi-etano), também se podem utilizar como meio de reac-ção, hidrooarbonetos e piridina e nitrilos, tal como aoeto-nitrilo, A hidrogenação, que se efectua de um mado adequado, a temperaturas compreendidas entre 0°C e o ponto de ebulição, mas, de preferência à temperatura ambiente, decorre, geralmente de um modo rápido e, encontra-se completa ao fim de um período de tempo que oscila entre alguns minutos e algumas horas.

Podem preparar-se, também as hidro-xi-alquil-xantinas terciárias, de fórmula II, fazendo reagir as xantinas substituidas de fórmula XIX - 44 -

10 (XIX) que contem dois grupos idênticos ou diferentes de fórmula -(°Η2)η-°°-0Η5 (XX) S -(ch2)b-oo-e4 (XXI) ou apenas um substituinte de fórmula XX ou XXI e o C 1 c átomo de hidrogénio, ou os grupos Br ou R p nas q iq posições de R e de R , com compostos alquil 1 3 (C-Cr)- ou metil-metálicos eom ‘'alquilação** redu-tiva dos grupos oarhonilo para se ohterem as xantina pertencentes à presente invenção, de fórmulas IX e XVI ou metalizando as xantinas de fórmula XIX, que possuem dois grupos idênticos ou diferentes, de fórmula -(OH )n-Hal (XVII), representando Hal, de preferência, cloro ou bromo, ou apenas um desses grupos e o átomo de hidrogénio ou o substituinte R^ou R’1’'5 na outra posição, na posição terminal e, fazendo-se depois, reagir com as cetonas de fórmula r4-co-oh5 (XVIII) eom alquilação redutiva do grupo oarbonilo, para se obter as xantinas de fórmulas Ιχ e XVI, perten-

centes à presente invenção, ou g) convertendo as xantinas de fórmula XIX com o grupo -(CH2)n-C00-(0i-c4)alauil (XXIV) na posição de R^ e/ou de R^® e, eventualmente, o átomo de hidrogénio ou o grupo R^ ou R^ na outra posição, por meio de dois equivalentes de um composto metil-metálico por grupo aleoxi-carbonilo, em xantinas de fórmulas IX a XVI, nas quais R^ representa um grupo metilo, ou h) convertendo as xantinas de fórmula XIX, que possuam dois grupos iguais ou diferentes de fórmula (XXV)

-(0H2) j-CEaOH CH, 7 ou apenas um desses grupos e hidrogénio ou os gru- 5 15 q io pos R ou R nas posiçSes de R5 e de R , nas quaisi o grupo (XXIV) pode conter a dupla ponte C=C também em posição isomérioa, arranjos no átomo de . 2 carbono ramificado, tais como -C=CH , por hidratação catalizada por r.ácido, obedecendo à Regra de Markiwnkoff, nas xantinas de fórmulas IX a XVI pertencentes à presente invenção e, se se desejar, converter as hidroxi-alquilaminas terciárias de fórmulas Ib' e os compostos pertencentes à presente invenção, de acordo com os áétodos das alíneas de e) a f) que possuam um átomo de hidrogénio nas posiçSes 1 a 7» eventualmente na presença de meio alcalino ou na forma dos seus sais, com os agentes de alquilação de fórmula VIII ou Xa ou XIII, nos - 46

compostos tnssubstituidos de fórmulas X ou XI ou XV, nos 2 4 5 15 quais os radicais R ,R ,R , R e o símbolo n, nas fórmulas anteriores possuem as significaçóes anteriormente definidas.

Os compostos 3-alquilados mono- ou dioxo-alquil- (XIXa), -(w-haloalquil) (XIXb), -(w-alcoxi--oarbonil-alquil)- (XIXc) e -alquenilxantinas (XIXd) necessários como materiais de partida são conhecidos ou podem ser facilmente preparados, por exemplo, a partir de 3--alquil-xantinas (VII) e de sulfoniloxi- ou halo-cetonas (XVII) e (XVIII), w-halo-alquil-sulfonatos, ou de l,w-di--halo-alcanos (cf., por exemplo: V.B. Kalcheva e outros, Journal fur prakt. Chemie 327 (1985) pp. 165-168, w--sulfoniloxi ou de esteres alquilieos do ácido w- halo-oar-boxílico ou de sulfoniloxi ou halo-alquenos que correspondeu, à fórmula XXV, sob as condiçães de reacção previamente descritas detalhadamente para a alquilação das xantinas mono-e dissubstituídas com os compostos de fórmula VIII e Xa.

Nas reacçSes organometálicas das Q ΤΛ xantinas XIXa e XIXc funeionalizadas nos grupos R e R , o procedimento é idêntico, em principio, ao descrito para a preparação dos álcoois terciários de fórmula VIII, utilizados como agentes de alquilação. Deste modo, pode efectuar-se uma alquilação redutiva das oetinas (XIXa) e dos esteres (XIXc), por exemplo, com compostos como al-quil-potássio, sódio, -lítio, -magnésio, -zinoo, -cádmio, -alumínio e, -estanho. 1 também se podem utilizar os compostos alquil-titânio e -zircónio, reoentemente recomendados (D. Seebaeh e outros, Agnew, Ohem ££ (1983), pp. 12-26).

Io entanto, uma vez que os oompostos alquilmetálioos de sódio e de potássio possuem uma tendência para reacçóes seeundárias, dada a sua elevada reactividade e os de zinco e de eádamo são relativamente lentos, os compostos vulgarmente preferenciais são o alquil-lítio e o -magnésio (Grig-nard). - 47 -

Os compostos organometálicos fortemente nueleófilioos são muito sensíveis à hidrólise e à oxidação. A sua manipulação é sqgura, embora neGessite de ser processado em meio anidro e, eventualmente sob uma atmosfera de gás inerte. Os solventes ou agentes de distribuição habituais, são, em primeiro lugar os adequados também, para a preparação dos oompostos alquil-metálicos.

Constituem exemplos práticos especialmente osk éteres com um ou mais átomos de oxigénio, por exemplo éter dietílioo, dipropílioo, dibutílico ou di-iso-amílico, 1,2-dimetoxi-etano, tetra-hidrofurano, dioxano, tetra-hidro-pirano, furano, e anisolo e hidroearbonetos alifáticos ou aromáticos, tais como o éter de patróleo, o ciclohexano, benzeno, tolueno, xilenos, dietil-benzenos e, tetra-hidronaftaleno; no entanto, as aminas terciárias, tais coma a trietil-amina, ou solventes apróticos bipola-res, tais como triamida hexametil-fosfdrica, assim como misturas dos solventes mencionados também podem ser utilizadas com êxito. A reacção dos oompostos de grupo oar-bonilo (XIXa) e (XIXc) com os compostos de Grignard, também se pode efeetuar de um modo benéfico, colocando o composto organometálico num éter e, adicionando a cetona ou o éster, gota a gota, na forma de uma solução em dicloro--metano ou de 1,2-dioloro-etano, recomenda-se, frequentemente a adição de brometo de magnésio, que é susceptível de aumentar a nuoleofilioidade do composto organometálico devido à sua participação no estado de transição ciolioo do complexo.

Combinam-se, geralmente., a cetona ou o éster e o composto organometálico a temperaturas entre 0°C e 60°C, ou à temperatura ambienta, oom arrefecimento externo, utilizando-se usualmente o composto alquil--metálieo oom um ligeiro excesso. Gompleta-se vulgarmente a reacção por aquecimento breve à temperatura de refluxo, durante períodos que vão de várias minutos a algumas horas. - 48 -

Decompõe-se, preferencialment§ o alcanoato formado com solução aquosa de cloreto de amónio ou oom ácido acético diluído.

Os compostos metálicos de magnésio e de lítio, são adequados, em primeiro lugar para a metaliza-ção de w-halo-alquil-xantinas (XIXb). Por outro lado, a substituição do átomo de halogéneo por lítio, que se torna possível utilizando reagentes de organo-lítio, geralmentè 1-butil-, 2-butil-, -t-butil- ou fenil-lítio, desempenham uma função secundária, preparando-os vantajosamente em éteres, hidrocarbonetos, aminas terciárias ou solventes apró-ticos, referidos como partieularmentè adequados para a reac-· ção das xantinas (XIXa) e (XIXo) com compostos alquil--metálicos, a temperaturas entre 25°0 e 125°c, de preferência a uma temperatura inferior a 100°0. Se se efeetuar a reacção de metalização em hidrocarbonetos, é frequentemente útil adicionar um éter, tal como tetra-hidrofurano ou uma amina terciária, tal como trietilamina, numa quantidade estereoçrétrioa. Também pode ser áltil a utilização de agentes catalíticos, tais eomo butanol, cloreto de alumínio, tetracloreto de silicone, tricloro-metano e aleoola-tos de alumínio ou de magnésio.

Na permuta halogénio-metanol os cloretos reagem, habitualmente mais lentamente do que os brometos e iodetos correspondentes, mas geralmente proporcionam melhor rendimento do composto organometálico„ Para se acelerar o início da reacção. recomenda-se, frequentemente a adição de algum brometo de magnésio, de alguns grãos de iodo ou de algumas gotas de bromo, de tetra-cloro--metano ou de iodeto de metilo com ligeiro aquecimento. Uormalmente, não se isolam os compostos de Grignard obtidos, que se fazem imediatamente reagir com cetonas de fórmula XXIII sob as condições de reacção descritas para a alquilação redutiva das xantinas XIXa e XIXo. - 49 -

A adição de água à dupla ponte C=C das alquenil-xantinas (XIXd) com o elemento estrutural de fórmula XXV, no qual o grupo hidroxi se adiciona ao átomo de carbono oom o menor ntímero de átomos de hidrogénio para formar álooois terciários, de acordo com a Regra de Markownokoff, ocorre habitual menta., em solução ou suspensão aquosa, na presenga de ácidos fortes, tais como os ácidos sulfiírico, nítrico ou fosfórico. lambém se podem utilizar como agentes catalíticos hidrogeno-halogenetos e ácidos sulfónicos, tais oomo ácido trifluoro-metano-sulfóni-co, resinas ácidas de permuta, complexos de trifluoroeto de boro ou ácido oxálico. Io entanto é preferível utilizar áciâo sulflírico, com uma concentração do ácido entre 50 e 65$, sendo suficiente uma temperatura compreendida entre 0°0 e 10°C. Io entanto, também se podem utilizar, por vezes conccentrações de ácido e/ou temperaturas de reacção superiores ou inferiores às anteriormente referidas. Em qualquer dos casos, deverão conservar-se as temperaturas de reacção o mais baixas possível, uma vez que a desidratação inversa em olefina pode causar sérias perturbaçães a temperaturas superiores a aproximadamente 60°C. A adição de um solvente inerte aos ácidos, tal como 1,4-dioxano, benzeno ou tolueno, proporciona, por vezes, alguns benefícios. Uma vez que os ésteres podem formar compostos intermédios na hidratação catalizada por ácido, especialmente quando se utilizam concentraçães ácidas elevadas, recomenda-se o tratamento do lote de reacção com uma grande quantidade de água, com breve aquecimento após a acção do ácido, para hidrólise do éster ou para processar a mistura a nível alcalino.

As condiçães experimentais para a conversão opcional dos compostos 1- e 7H- (IX) ou (XIV), pertencentes à presente invenção nas xantinas tri-substitui-das de fórmula X ou XV, por I-alquilação com os compostos VIII ou Xa de XIII, já foram anteriormente pormenorizadamente descritas. - 50 -

Dependendo do comprimento da Gadeia a 2 do grupo alquilo de E. (pelo menos C ) e/ou da estrutura de um substituinte de EP (por exemplo 2-hidroxipropilo) as hidroxi-alquil-xantinas t erciárias de fórmula II podem possuir dois átomos de carbono assimétricos e, por isso podem encontrar-se presentes nas suas formas de es-tereo-isdmeros. A presente invenção refere-se, deste modo, aos compostos estereoisoméricamente puros e às suas misturas.

Descrever-se-á, agora, a presente invenção, mais pormenorizadamente, através dos Exemplos que se seguem.

EXEMPLOS

Para se demonstrar a eficácia da invenção reivindicada, ensaiou-se um composto de fórmula II, para se demonstrar a inibição da aotividade retrovírica, in vitro. Embora diversos compostos pertencentes às fórmulas gerais I e II sejam eficazes, exemplificar-se-á com pentoxifilina, que constitui a forma preferencial da presente invenção. EXEMPLO 1

Desenvolveram-se células humanas "Jurkat" (uma linha de células Ϊ CD4 de linfoma, em meio RPMI-1640 enriquecido com 10$ de soro de feto de vitela, penicilina e estreptomioina e L-glutamina. Produziu-se HIV-1 nas células Jurhat, Durante a fase de crescimento exponencial, recolheu-se o srbrenadante isento de células, ensaiou-se a sua aotividade paraRI (de acordo com o método de Dayton e outros, Oell 1986, 44...941-947) e congelou--se em aliquotas, a -70°0, até se utilizar. Irataram-se previamente as células Jurkat oom pentoxifilina, em diversas concentrações durante 4 horas após o que se adicionou, - 51 -

às culturas, HI7-1 (10 unidades de actividade RI).

Conservaram-se as células na concentração adequada de pentoxifilina durante um total de 7 dias, altura em que se mediu a actividade da II nos sobre-nadantes isentos de células. Paralelamente, ensaiou-se a viabilidade das células, corando com azul de tripano as células Jurgat não infectadas, tratadas durante 7 dias com diversas concentrações de pentoxifilina, Os resultados encontram-se expressos como uma percentagem de controlo.

Pentoxifilina Iransoritase Inversa (mioromolar) ($ controlo) 0 100 50 84,6 100 72,9 500 69,5 1000 55,0 A viabilidade celular após 7 dias de exposição à pentoxifilina foi > 95$. A pentoxifilina diminuiu a replicação de HIV-1, segundo determinado pela actividade da trans-criptase inversa (um indicador da replicação de HIV-1) nas células Jurkat em fase de infeoção aguda por HIV. EXEMP10 2

Obtiveram-se as células mononucleares do sangue periférico (MSP) por centrifugação em gradiente de liocol-Hypaque, doado por indivíduos normais sero-nega-tivos a HIV-1. Cultivaram-se as células MSP em meio RPMI--1640, enriquecido com 20$ de soro de feto de vitela, penicilina, estreptomicina e L-glutamina. Após estimulação das - 52 -

células durante a noite com 15 /Ug/ml de conhanavalina A, conservaram-se em 10 unidades/ml de interleuoina-2 (TL-2) durante o período de duração do ensaio. Para se ensaiar a inibição da replicação de HIV-1 nas células MSP. pela pentoxifilina, trataram-se previamente as células MSP com diversas concentrações de pentoxifilina durante 4 horas, apds o que se adicionou HIV-1, às culturas. Conservaram-se as células em concentrações adequadas do fármaco, durante um total de 7 dias, ponto em que se mediu a actividade de TI nos sobrenadantes isentos de células (10 unidades cpm de actividade de TI).

Paralelamente, analisou-se a citotoxi-cidade, corando com azul de tripano as células MSP não infectadas, durante 7 dias com diversas concentrações de pentoxifilina. Os resultados encontram-se expressos como uma percentagem de controlos não tratados.

Viabilidade (fo controlo

Pentoxifilina (micromolar)

Transcriptase inversa (jo controlo/ 0 100 25 75 50 72 250 50 500 22 1000 18 100 5 ND 9 95,5 0 ND 7 84,8 6 50,0 A pentoxifilina diminuiu a replicação de HIV-1, conforme se determinou pela actividade da transcriptase inversa nas células mononucleares do sangue periférico, em fase de infeeção aguda por HIV-1. - 55 - <

EXEMPLO 5 A sub-regulação àa expressão dos genes mediada por HIY-1 UR: cultivaram-se oélulas U38 (Pelber BK, Pavlakis &N. Science 1988, 259i184-187, na presenta ou na ausência.de 10 ng/mlde £orbol-12-miristato--13-acetato (PMA). As células U38 derivam da linha de células monocitoides humanas, U937 e, contém cópias integradas de HIV-l I!ER ligadas ao gene de cloranfenicol-acetil--transferase (0ΑΪ). Estas células foram amavelmente cedidas pela Dr§ Barbara Felber (National Oancer Institute, Pre-derick, Maryland, USA). Duas horas mais tarde, lavaram-se as células uma vez com solução salina tampão (BBS) e cultivaram-se na presença de diversas oonoentraçães de pentoxi-filina. Decorridos dois dias, ensaiou-se a viabilidade celular, por coloração com azul de tripano e mediu-se a ac-tividade de CAT, tal como anteriormente se descreveu (Sodroski, «Γ. e outros, Science 1985, 227:171-173) após normalização os extraotos celulares quanto ao seu teor de proteinas.

Actividade CAT 44.3 50.4 23,9 20,3 19.5

Pentoxifilina estimulada por este forbólico (mioromolar) 0 50 100 500 1000 - 54 -

Pentoxifilina Hão estimulada por este forbélico

(tnioromolar) Actividade CAI 0 50 100 500 1000 4.75 4,91 3.75 2,95 2,81 A pentoxifilina diminuiu a aetivida de de cloranfenicoltransacetilase (CA£) nas oélulas TJ38, previamente tratadas ou não tratadas oom éster forbélico. Utiliza-se frequentemente o ensaio CAI para determinar os efeitos de agentes sobre um faotor de activação de um gene que aotua na repetição terminal longa de HIV-1 (LER).

Resumindo, as xantinas são especial· mente úteis oomo agentes antivíricos para o tratamento terapêutico de seres humanos. As xantinas oonstituem agentes terapêuticos valiosos tanto para a profilaxia oomo para o tratamento de infeoções retrovfricas em seres humanos. Exibem actividade anti-vírica contra os virus de AIDS (SIDA) que é muito pouco usual e inesperada, tendo em vista a actividade anti-vírica limitada e especifica, dos agentes anti-víricos da técnica anterior. As xantinas podem exibir supressão das lesães celulares induzidas por virus em tecidos e oélulas de seres humanos e de animais. As xantinas podem, também reduzir as manifestações de mortalidade e a morbilidade das em seres humanos, incluindo a redução da ocorrência de infecçães oportunistas associadas à AIDS (SIDA) e a redução progressiva dos efeitos degenera •tivòs de HIV no sistema nervoso central. - 55 -

Claims (1)

1. KBIVIKDIOAOOES - 1» - Processo para a preparação de uma composição farmaoeutica para a inibição de replioação de retrovírus humanos caracterizado por se incorporar como ingrediente activo pelo menos um composto 7-(oxo-alquil)--1,3-dialquil-xantinas de fórmula geral (l)s

   na qual os radicais e Rg, iguais ou diferentes, são se-leccionados entre o grupo constituído por radicais alquilo de cadeia linear ou ramificada possuindo entre 2 e 6 átomos de carbono, oiclo-hexilo, grupos alooxi-alquilo de cadeia linear ou ramificada e radicais hidroxi-alquiloj o simbolo A representa um radical hidrooarboneto possuindo até 4 átomos de carbono, o qual pode ser substituído por um grupo metilo; ou por se incorporar o composto de fórmula geral II - 56 -

   em que pelo menos um dos radioais R^ e R^ representa alternativamente a) um grupo hidroxi-alquilo de cadeia ramificada de fórmula (CHg^-C-CH,, t OH na qual o radical representa um grupo alquilo possuindo entre 1 e 3 átomos de carbono e o simbolo n representa um numero inteiro compreendido entre 2 1 3 5, representando um outro grupo R ou R que facultativamente pode estar presente um átomo de hidrogénio ou um grupo hidrocarboneto alifátioo R^ possuindo até 6 átomos de carbono, cuja cadeia de carbono pode ser interrompida com o máximo de 2 ato-mos de oxigénio, podendo a substituição fazer-se com um grupo hidroxi ou oxo, ou b) um grupo oxo-alquilo de fórmula geral - 57 - ο II Ε6 - C - (GH2)p etn que o radical E^ possui entre 1 e β átomos de carbono e o simbolo p representa o inteiro 2, 3 ou 1 2 4, possuindo os radicais E ou E as significaçães 2 definidas antes e representando o radical E um grupo alquilo (0^0^), numa proporção compreendida entre 0,5 $> e 70 $ em peso da unidade de administração. - 2ã - Processo de acordo com a reivindicação 1 caraoterizado pelo facto de o composto de fórmula geral I ser l,3-dibutil-7-(2-oxopropil)-xantina. - 33 - Processo de acordo com a reivindicação 1 oaracterizado pelo facto de o composto de fórmula geral II ser pentoxifilina. - 4» - Processo de acordo com a reivindicação 1 caraoterizado pelo facto de na fórmula geral II o radical E"1* representar 0 II ch3-c-(oh2)4- - 58 -

   2 o radical R representar um grupo de fórmula -0¾ 3 g o radical R representar um grupo de fórmula -ch2-ch2-ch3 . - 5» - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de na fórmula geral II o radical R^ representar um grupo de fórmula OH 0^-0-(0¾)^ I

   o radical R2 representar um grupo de fórmula -CH^ e o ra dical R^ representar um grupo de fórmula -oh2-oh2-o-oh5. Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de na fórmula geral II o radioal R-j_ representar um grupo de fórmula OH 0^-0-(0¾)^ I

   - 59 -

   o radical R2 representar o grupo -OH^ e o radical R3 representar utn grupo de fórmula _oh2-o-(oh2)2-o-ch3. - 7* - Processo de acordo com a reivindicação 1 oaracterizado pelo facto de na fórmula geral II o radical R^ representar um grupo de fórmula OH t ch3-c-(ch2)4- 1 CH3 o radical R2 representar o grupo -0H3 e o radioal R3 representar -H. - 8* - Processo de acordo com a reivindicação 1 oaracterizado pelo facto de na fórmula geral II o radical R^ representar um grupo de fórmula OH i ch3-c-(ch2)4- CH3 o radical R2 representar o grupo -CH3 e o radical R3 representar o grupo de fórmula -oh2-ch2-oh3 . - 60 - _ ga _ Processo de aoordo com a reivindicação 1 oaracterizado pelo facto de na fórmula geral II o radical representar o grupo de fórmula OH t oh3-c-(oh2)4- » ch5 o radical R2 representar o grupo -OH^ e o radical R^ representar o grupo de fórmula OH i -CH2-CH-CH5. - 10 § - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de na fdrmula geral II o radical representar o grupo de fórmula OH i 0H3-0-(0H2)4- I oh3 o radical R2 representar o grupo -0¾. e o radical R representar o grupo de fórmula 3 OH t -CH2-0H-(0H3)2. - 61 -

   - 11§ - Processo de acordo coei a reivindicação 1 oaracterizado pelo facto de na fórmula geral II o radical R4 representar o grupo de fórmula OH ch5-o-(oh2)4- 1 CH* 5 o radical R2 representar o grupo de fórmula -CHg-CH^ e o radical R^ representar o grupo de fórmula -oh2-o-oh2-oh3. - 12â - Processo de acordo com a reivindicação 1 oaracterizado pelo facto de na fórmula geral II o radical Rj_ representar o grupo de fórmula OH I oh5-c-(ch2)4- I ch3 o radical R2 representar o grupo -OH^ e o radical R^ representar o grupo de fórmula CH^ « -(CHg^-O-CHj t OH - 62 - - 13 β - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado péb facto de na fórmula geral II o radical representar o grupo de fórmula OH t OHj-íMCHg^- » CH^ o radical R2 representar o grupo -CH^ e o radical R^ representar o grupo de fórmula -ch2-o-ch2-ch3 . A requerente reivindica a prioridade do pedido norte-americano apresentado em 7 de Hovembro de 1990, sob o número de série 610,230. Lisboa, 6 de lovembro de 1991

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