PT88420B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas compreendendo 1-(2'-desoxi-2'-fluoro- beta -d-arabinofuranosil)-5-etiluracilo e metodo de tratamento de infeccoes pelo virus da hepatite utilizando estas composicoes - Google Patents

Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas compreendendo 1-(2'-desoxi-2'-fluoro- beta -d-arabinofuranosil)-5-etiluracilo e metodo de tratamento de infeccoes pelo virus da hepatite utilizando estas composicoes Download PDF

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Jack J Fox
Kyoichi A Watanabe
Carlos Lopez
Christian G Trepo
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Sloan Kettering Inst Cancer
Inst Nat Sante Rech Med
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    • AHUMAN NECESSITIES
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Description

SLOAN-KETTERING INSTITUTE FOR CÂNCER RESEARCH e INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ ET DE LA RECHERCHE MEDICALE PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO 1-(2'-DESOXI-2’-FLUORO- -D-ARABINOFURANOSIL)-5-ETILURACILO E MÉTODO DE TRATAMENTO DE INFECÇÕES PELO
VÍRUS DA HEPATITE UTILIZANDO ESTAS COMPOSIÇÕES
A presente invenção foi parcialmente participada pelo National Câncer Institute ao abrigo das concessões n°s. CA-08748, 18601 e 18856, pela concessão n°. CA-44094 de Department of Health and Human Services, pela Instituição The Veterans Administration e ainda ao abrigo da concessão ηδ. NO-A1-62521 de National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Deste modo o governo dos Estados Unidos da América do Norte possui alguns direitos na presente invenção.
Antecedentes da Invenção
Neste pedido de patente são referenciadas várias publicações identificadas por numeração árabe contida entre parenteses. No final da memória descritiva e imediatamente antes das reivindicações é possível encontrar as citações completas relativas a essas referências. Os conteúdos globais
dessas publicações consideram-se incorporados na presente memória descritiva por referência com o objectivo de se descrever mais completamente o estado da técnica de que faz parte a presente invenção.
A presente invenção refere-se a uma composição e a um método para o tratamento de infecções de vírus da hepatite utilizando o composto 1-(2'-desóxi-2’-fluoro-beta-D-arabino-furanosil)-5-etil-uracilo [FEAU]. 0 composto FEAU é um componente da família dos compostos 5-substituído-1 -(2'-desóxi-2'-substituído-p-D-arabino-furanosilo) anteriormente conhecidos como agentes anti-vírus do herpes, descritos na Patente Norte-americana nQ. 4 211 773 de autoria de Lopez e colaboradores, mas o composto FEAU, de per si, não se encontra alí descrito. Contudo o composto FEAU e a sua actividade anti-herpes foram descritos por Fox e colaboradores em Herpes Viruses and Virus Chemotherapy (R. Kano, A. Nakajima, eds.) Excerpta Medica, Amsterdam, pp. 53-56 (1985). Como exemplos desta família refere-se também os compostos 1 -(2'-desóxi-2'-fluoro-β-D-arabino-furanosil)-5-metil-uracilo [FMAU] e 1 -(2'-desóxi-2'-fluoro-β-D-arabino-furanosil)-5-iodo-citosina [FIAC]'.
FMAU FEAU
Embora não fosse previsível que o agente anti-vírus do herpes fosse também eficaz no tratamento da hepatite, procedeu-se à investigação desses compostos para verificação da sua utilidade como agentes anti-hepatite. Durante esta investigação descobriu-se que o composto FEAU era particularmente ideal no tratamento da hepatite. Embora se tivesse demonstrado que o composto FEAU era igualmente eficaz, ou talvez mais eficaz, para inibir a replicação do vírus da hepatite, verificou-se que produzia efeitos secundários tóxicos potencialmente letais. No entanto descobriu-se que o composto FEAU inibia eficazmente a replicação do vírus da hepatite sem originar efeitos secundários tóxicos de gravidade.
Uma forma particularmente vulgar de hepatite é
provocada pelo virião da hepatite B (VHB) . 0 VHB, também
conhecido por partícula de Dane, é uma partícula esférica
complexa de 42 nm constituída por um revestimento
lipoproteico exterior (antígeno da superfície da hepatite B, HBsAg) e por um núcleo interior (antígeno do núcleo da hepatite B, HBcAG). Este núcleo contem uma ADN-polimerase e um cordão de ADN parcialmente duplo, circular. In vitro, a ADN-polimerase preenche no genoma uma grande região de cordão simples, gerando no genoma uma região constituída totalmente por cordão duplo.
A natureza específica da ADN-polimerase associada à
partícula de Dane é incerta. A inibição selectiva da ADV-polimerase do VHB utilizando agentes intercalares, análogos de pirofosfato e nucleótidos de arabinofuranosilo é um processo conhecido e proporciona a possibilidade de inibir a replicação do vírus da hepatite B em indivíduos que sofram de hepatite B crónica.
Existe nas marmotas um agente com bastante afinidade com o VHB: o conhecido vírus da hepatite das marmotas (VHM). Esses dois vírus pertencem à mesma classe de vírus, frequentemente designados por vírus Hepa-ADN. Conforme anteriormente sugerido, as ADN-polimerases do VHB e do VHM partilham as mesmas características básicas. Em consequência estudou-se a actividade da ADN-polimerase do VHM paralelamente com a correspondente actividade do VHB num trabalho inicial in vitro.
Entre a classe de vírus Hepa-ADN apenas o VHB e o VHM são conhecidos como causadores de hepatite activa crónica e de carcinoma hepatocelular. De um modo geral, a infecção de VHM nas marmotas assemelha-se à infecção de VHB nos seres humanos, tanto sob o ponto de vista virológico como histopatológico.
As provas de que existe relação entre o vírus da hepatite B e o carcinoma hepatocelular advêm do modelo constituído pelo vírus da hepatite B da marmota (VHM)/marmota. É possível induzir um carcinoma hepatocelular
experimentalmente na marmota por inoculação com o VHM no momento do nascimento. Estes resultados não só proporcionam um suporte experimental para a função do VHM causadora de cancro como permitem validar também a utilização do vírus da hepatite da marmota como modelo patogénico para o vírus da hepatite B nos seres humanos.
SUMARIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a uma composição para o tratamento de uma infecção de vírus de hepatite num determinado paciente, incorporando essa composição uma quantidade do composto 1 -(2'-desóxi-2'-fluoro-p-D-arabino-furanosil)-5-etil-uracilo de fórmula estrutural:
e seus pró-fármacos e correspondentes sais farmaceuticamente aceitáveis, eficaz para inibir 'a replicação do vírus da hepatite nesse paciente, conjuntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.
A presente invenção proporciona também um método para o tratamento de uma infecção com o vírus da hepatite num
determinado paciente, consistindo esse método em administrar a esse paciente uma quantidade do composto que possui a fórmula estrutural:
e dos seus pró-fármacos e correspondentes sais farmaceuticamente aceitáveis, eficazes para inibirem a replicação do vírus da hepatite nesse paciente.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 ilustra a actividade da ADN-polimerase do VHM em marmotas infectadas cronicamente.
A Figura 2 representa uma comparação da inibição da replicação do VHM em marmotas tratadas com os compostos FMAU e FEAU.
A Figura 3 representa uma comparação da inibição da replicação do VHM em marmotas tratadas com os compostos FMAU e FEAU em doses menores.
A Figura 4 ilustra a inibição da replicação do VHM em marmotas com administração oral do composto FEAU.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona uma composição para
L, o tratamento de uma infecção com o vírus da hepatite num determinado paciente, particularmente no caso dos seres humanos, sendo essa composição constituída por uma quantidade do composto 1 -(2'-desóxi-2'-fluoro-p-D-arabino-furanosil)-5-etil-uracilo [FEAU] o qual possui a fórmula estrutural:
e seus pró-fármacos e correspondentes sais farmaceuticamente aceitáveis, eficazes para inibirem a replicaçao do vírus da hepatite no referido paciente, conjuntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.
O termo pró-fármaco utilizado na presente memória descritiva refere-se a quaisquer entidades químicas que ao serem administradas a um paciente possam ser facilmente convertidas no composto FEAU. Apenas a título de exemplo refere-se que os pró-fármacos de FEAU englobam aqueles em que o grupo hidroxilo na posição 5' no radical açúcar é convertido num grupo mono- ou di-fosfato. 0 termo sal farmaceuticamente aceitável utilizado na presente memória descritiva engloba qualquer sal convencional do composto FEAU o qual possa ser utilizado em vez do composto FEAU, por exemplo, quaisquer sais alcalinos ou de metais alcalinos derivados do composto FEAU. Finalmente, o termo veículo farmaceuticamente aceitável” utilizado na presente memória descritiva engloba quaisquer veículos farmacêuticos consagrados na especialidade tais como as soluções estéreis, os comprimidos, os comprimidos revestidos e as cápsulas. Tipicamente esses veículos contêm excipientes tais como o amido, o leite, o açúcar, determinados tipos de argilas, gelatina, ácido esteárico ou seus sais, estearato de magnésio ou de cálcio, talco, gorduras ou óleos de origem vegetal, glicóis ou outros excipientes conhecidos. Esses veículos também podem incorporar agentes aromatizantes e corantes ou outros ingredientes. As composições que incorporam esses veículos são formuladas em conformidade com métodos convencionais bem conhecidos. De acordo com uma variante preferencial a composição utilizada é adaptada para administração oral.
De acordo com os ensinamentos da presente invenção, o vírus da hepatite pode eventualmente ser o vírus da hepatite A, da hepatite B ou o vírus da hepatite não-A ou não-B, em particular o vírus da hepatite B.
Ainda de acordo com os ensinamentos da presente invenção, a quantidade de composto que se incorpora na composição pode variar dentro de limites amplos. Os métodos
para a determinação da quantidade exacta são bem conhecidos pelos especialistas na matéria e dependem inter alia do paciente que se pretende tratar, do veículo farmacêutico específico e da via de administração que se vai utilizar e ainda da frequência com que se administra a referida composição. De um modo geral, a quantidade do composto existente na composição eficaz para inibir a replicação do vírus da hepatite varia aproximadamente entre 0,01 mg/kg de massa corporal do paciente/dia e 100,0 mg/kg de massa corporal do paciente/dia. De preferência essa quantidade é superior a 0,04 mg/kg de massa corporal do paciente/dia, por exemplo, aproximadamente entre 0,04 e 50,0 mg/kg de massa corporal do paciente/dia.
A presente invenção proporciona também um método para o tratamento de uma infecção de vírus da hepatite num paciente, consistindo esse método em administrar a esse paciente uma quantidade do composto que possui a fórmula estrutural:
e dos seus pró-fármacos e correspondentes sais farmaceuticamente aceitáveis, eficaz para inibir a replicação do vírus da hepatite nesse paciente.
De acordo com este método, a administração do composto pode ser efectuada eventualmente por qualquer dos métodos bem conhecidos na especialidade incluindo, sem que isso constitua qualquer limitação, a administração oral, intravenosa, intramuscular e subcutânea. De preferência administra-se o composto por via oral.
Na prática do método da presente invenção, a quantidade do composto eficaz para inibir a replicação do vírus é a que consta da composição, isto é, uma quantidade geralmente compreendida entre 0,01 mg/kg de massa corporal do paciente/dia e 100,00 mg/kg de massa corporal do paciente/dia, de preferência uma quantidade superior a 0,04 mg/kg de massa corporal do paciente/dia, por exemplo, uma quantidade compreendida aproximadamente entre 0,04 e 50,0 mg/kg de massa corporal do paciente/dia.
Finalmente, os vírus de hepatite que eventualmente é possível tratar utilizando o referido método são os vírus da hepatite A, da hepatite B ou da hepatite não-A ou não-B, em particular o vírus da hepatite B.
PORMENORES EXPERIMENTAIS
Os exemplos seguintes têm como objectivo proporcionar melhor compreensão da presente invenção mas, de
forma alguma devem ser considerados como limitativos do âmbito e do espírito da presente invenção definida pelas reivindicações adiante apresentadas.
Materiais e Métodos
ENSAIOS IN VITRO
Preparação das Partículas Virais
As partículas de VHB contendo a actividade da ADN-polimerase foram purificadas a partir do soro de um paciente com imunossupressão, positivo em HBsAG. 0 VHM foi obtido a partir de diversas amostras de soro provenientes de cinco marmotas (Marmota monax) portadoras crónicas do vírus. Essas marmotas inicialmente importadas da Pensilvânia pertenciam a uma colónia que durante mais de um ano foi controlada através de testes serológicos conforme descrito por Hantz e colaboradores, J. Virol. Metho. !_·. 45-55 (1983). Os vírus foram purificados por centrifugação em gradientes de sacarose e de CsCl isopícnico.
Produtos Químicos
Nos ensaios In vitro foram utilizados trifosfatos. Foi necessário utilizar trifosfatos devido ao esperado metabolismo celular.
Os trifosfatos nucleosídicos não marcados foram obtidos na empresa Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, U.S.A.. Os trifosfatos desoxirribonucleosídicos tritiados, [3H] dTTP (30 Ci/mmol), [3H] dATP (24 Ci/ramol),
1
[3H] dCTP (17 Ci/mmol) e [3H] dCTP (9,5 Ci/mmol) forma obtidos em Amersham (Amershal, França). 0 ACV foi obtido em Burroughs Welcome, Chapei Hill, North Carolina; e a síntese do BVdU foi descrita por Clerq e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76: 2947-2951 (1979). A síntese de FIAC foi descrita por Lopez e colaboradores (Patente Norte-americana no. 4 211 773). A síntese de FEAU foi descrita por Watanabe e colaboradores, J. Med. Chem. 27 : 91-94 (1984). Qualquer desses três análogos nucleosídicos foi convertido no seu correspondente 5'-trifosfato em conformidade com um procedimento descrito por Allaudeen e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78: 2698-2702 (1981 ). A pureza dos trifosfatos foi examinada por RMN- H num expectrómetro de Bruker HX-270 e por cromatografia em líquido de elevada pressão num cromatógrafo de gradiente de líquido de tipo Altex Modelo 332.
Ensaio da ADN-Polimerase
Submeteu-se a ADN-polimerase a um ensaio conforme descrito por Kaplan e colaboradores, J. Virol. 12: 995 (1973) com uma ligeira modificação. Efectuou-se o ensaio em 50 μΐ de uma mistura de reacção contendo 50 mM de Tris-HCl pH 7,5, 40 mM de MgC12, 60 mM de NH4CI, 100 μΜ de qualquer dos componentes dATP, dCTP e dGTP, 0,2-0,7 μΜ de [3H]-dTTP (30 Ci/mmol), 10 mM de 2-mercapto-etanol, 0,5% de Nonidet P-40 e enzima. A reacção começou com a adição das partículas de
vírus conjuntamente com 2-mercapto-etanol e Nonidet P 40. Efectuou-se a incubação à temperatura de 3 7’C durante 1 hora. 0 material radioactivo insolúvel em ácido foi recolhido num filtro de fibra de vidro (GF/C Whatman). Efectuou-se a lavagem dos filtros cinco vezes com uma solução arrefecida de ácido tricloro-acético a 5% contendo 10 mM de pirofosfato de sódio e depois com etanol a 95%. Mediu-se a radioactividade do filtro seco num contador de cintilação em líquido.
Electroforese de [ p]-ADN em Gel de Agarose
2 ~
Analisou-se o produto [ p]-ADN da reacçao endógena da ADN-polimerase por electroforese em gel de agarose conforme descrito por Summers e colaboradores,
Proc. Natl.
Acad. Sei. U.S.A. 72 : 4597-4601 (1975). A reacção foi efectuada em 15 μΐ da mistura padrão de ADN-polimerase com 1 μΜ de [ p] dCTP (500 Ci/mmol) que constituiu o nucleotido marcado.
Após 2 horas de incubação à temperatura de 37’C interrompeu-se a reacção por adição de 20 μΐ de 10 mM de Tris, 10 mM de EDTA, proteinase K na proporção de 0,1 mg por ml, 0,1% (peso/volume) de dodecil-sulfato de sódio, seguindo-se nova incubação durante 60 minutos à temperatura de 37°C. Adicionou-se 5 μΐ de uma solução de sacarose a 5% (peso/volume) e azul de bromofenol a 1% e depois aqueceu-se a mistura durante 60 minutos à temperatura de 65'C e a seguir arrefeceu-se imediatamente para a temperatura de 4’C e depois
analisou-se por electroforese sobre uma placa horizontal de gel contendo 1% de agarose. Após a electroforese secou-se o gel e revelou-se por autorradiografia.
Produto da Reacção da Polimerase do ADN de VHB e VHM
A especificidade da eficiência da ADN-polimerase nas preparações de partículas de VHB e de VHM foi controlada por análise do ADN marcado sintetizado durante a reacção endógena. 0 ensaio da ADM-polímerase foi efectuado conforme descrito no parágrafo relativo a métodos e materiais 32 utilizando-se [ p] dCTP como nucleótido marcado. Depois analisou-se o produto da reacção por electroforese em gelose e por autorradiografia. Os resultados obtidos demonstraram a síntese progressiva do ADN do VHB e do VHM após 15, 30, 120 e 180 minutos de reacção. Para o VHB obteve-se um ADN completo com o comprimento de 3,3 kb e formas menores (entre 1,8 e 2,8 kb) correspondentes a um preenchimento incompleto da região de cordão simples do genoma virai. O produto da reacção da ADN-polimerase do VHM foi mais heterogéneo e migrou ligeiramente mais depressa; após 180 minutos de reacção a forma mais longa do ADN do VHM tinha um Comprimento de 3,1 kb.
Sensibilidades Relativas das ADN-Polimerases do VHB e do VHM para os ACVTP, FIACTP e BVdUTP
Efectuou-se a comparação das sensibilidades
relativas das duas enzimas para os ACTVTP, FIACTP e BVdUTP utilizando um excesso de nucleótidos. Para cada inibidor manteve-se a concentração do correspondente trifosfato radioactivo entre 2 a 3 vezes o valor Km sendo a concentração dos restantes nucleótidos excessivamente grande (50 μΜ). Os resultados mostram que o FIACTP foi o inibidor mais eficiente da ADN-polimerase do VHB e o ara-CTP foi o menos eficiente; os BVdUTP e ara-TTP demonstraram uma Inibição idêntica.
Foram observados resultados idênticos com a ADN-polimerase do VHM. Determinou-se as concentrações dos trifosfatos necessárias para inibirem 50% das ADN-polimerases do VHB e do VHM e demonstrou-se que o valor DI5Q do FIACTP era bastante fraco (0,5 μΜ) comparativamente com os valores obtidos para os BVdUTP e ACVTP os quais foram respectivamente 5 e 18 vezes superiores.
Cinética da Inibição
Embora se saiba que é diferente o modo de acção dos diversos compostos, examinou-se a natureza da inibição dos ACVTP, FIACTP e BVdUTP sobre a síntese do ADN catalisada pelas ADN-polimerases do VHB e do VHM, determinando-se a intensidade da inibição com concentrações crescentes dos substratos. Nos ensaios com o ACVTP, o [ H]-dGTP foi o substrato de referência ao passo que os outros três nucleótidos estiveram em excesso. Foram utilizadas as mesmas ~ 3 condiçoes com [ H]-dCTP para a inibição de FIACTP e com ~
[ Η]dTTP para a inibição de BVdUTP. As representações gráficas de Lineweaver-Burk mostram que a inibição da reacção da ADN-polimerase do VHB proporcionada pelos compostos ACVTP, FIACTP e BVdUTP foi competitiva respectivamente cora dGTP, dCTP e dTTP. Forara obtidos resultados semelhantes com a ADNpolimerase do VHM. Determinou-se os valores Km dos compostos dGTP, dCTP, dTTP e os valores Ki dos compostos ACVTP e BVdUTP para as ADN-polimerases dos dois vírus. A ADN-polimerase do VHM demonstrou uma menor afinidade com ACVTP, FIACTP e BVdUTP do que a ADN-polimerase do VHB; no entanto, os cocientes Km/Ki foram comparáveis para as duas enzimas.
Efeito de BVdUTP, FIACTP e ACVTP sobre a Síntese do ADN In Vítro
Para se determinar o efeito dos três análogos sobre a síntese do ADN virai efectuou-se ao longo do tempo uma experiência com a ADN-polimerase do VHB. Utilizou-se [ H]-dATP como substrato marcado. Com qualquer dos quatro substratos nucleósido-trifosfato a reacção foi linear até 60 mn. Nos casos em que não houve dTTP, dCTP ou dGTP na mistura de reacção, não se observou qualquer síntese significativa de ADN. A substituição de dTTP por BVdUTP permitiu a síntese do ADN virai até ao valor de 46% do controlo após 3 horas de reacção. Este valor aumentou té 67% da actividade óptima após 4 horas de reacção. Todavia, numa experiência semelhante, não se observou qualquer síntese significativa de ADN com dTTP
substituído por ara-TTP.
Quando se efectuou uma experiência idêntica com FIACTP em vez de dCTP obteve-se uma fraca incorporação de [ H]-dAMP (o valor aproximado de 10% do controlo após 3 horas de reacção) ao passo que não observou qualquer incorporação significativa quando se utilizou ara-CTP em vez de dCTP. A substituição de dGTP por ACVTP não aumentou o processo de polimerização conforme se demonstra pela eficiência destes diferentes análogos relativamente aos substrtos alternativos de ADN-poliraerases de VHB e de VHM. O substrato BVdUTP foi o substrato alternativo mais eficiente para as duas enzimas. Analisou-se o ADN sintetizado com BVdUTP como substrato alternativo por electroforese em gel de agarose. Com o substrato BVdUTP apenas se obteve o preenchimento incompleto da região de cordão simples do ADN de VHB ou de VHM.
Estudou-se também o efeito do ACVTP sobre a síntese do ADN do VHB numa experiência ao longo do tempo. Utilizou-se como substrato marcado [ H]-dTTP. A reacção teve início sem dGTP ou com 5 μπι de ACVTP em vez de dGTP. Nestas condições não foi possível medir qualquer incorporação de [3H]-dTMP. Decorridos 120 minutos de reacção adicionou-se 100 μΜ de dGTP. No ensaio efectuado apenas sem dGTP, a adição de dGTP aumentou a síntese de ADN conforme esperado. Todavia, quando o ensaio foi efectuado primeiro com 5 μΜ de ACVTP em vez de dGTP, não se observou qualquer síntese de ADN após a adição
de 100 μιη de dGTP. Comparativamente, quando a reacção teve início com a mesma proporção de ACVTP (5 μΜ) e de dGTP (100 μΜ) observou-se uma síntese significativa de ADN. Foram efectuadas experiências semelhantes com ara-ATP e ara-CTP. Em ambos os casos a adição de substrato normal (dATP e dCTP) após 120 minutos de reacção em presença do análogo aumentou a síntese do ADN do VHB. Deste modo, a adição de ACVTP em vez do substrato trifosfato natural dGTP não melhorou a síntese de ADN mas teve como efeito aparente bloquear qualquer aumento de comprimento.
Efeito Inibidor dos Análogos Nucleosídicos sobre as
ADN-Polimerases de VHB e de VHM
Foi necessário converter os análogos nucleosídicos que exibiam actividade anti-virai nos seus derivados trifosfato no interior da célula para interferirem com a síntese do ADN. A inibição preferencial da ADN-polimerase do vírus herpes simplex proporcionada pelos compostos ACVTP, BVdUTP e FIACTP é um assunto já documentado e pode explicar eventualmente uma parte da actividade anti-virai selectiva dos análogos nucleosídicos ACV, BVdUTP e FIAC. As provas in vitro anteriormente descritas demonstram que qualquer dos três compostos inibe as ADN-polimerases do VHB e do VHM e demonstram que a inibição é competitiva com os correspondentes substratos trifosfato naturais. Comparou-se as correspondentes actividades inibidoras de ACVTP, BVdUTP e
FIACTP e de outros dois análogos nucleotídicos, designadamente ara-CTP e ara-TTP. A actividade inibidora sobre as ADN-polimerases de VHB e de VHM diminuiu pela ordem a seguir indicada: FIACTP, BVdUTP, ara-TTP, ACVTP, ara-CTP.
ENSAIOS IN VIVO
Ensaios In Vivo de FMAU contra a Hepatite Activa
Crónica das Marmotas composto FMAU é solúvel em água. Por esse motivo a água ou as soluções aquosas são preferenciais como solventes para a administração do composto. A solubilidade do composto FMAU é de 66 rag/ml à temperatura de 24’C e de 81 mg/ml à temperatura de 28C. 0 seu peso molecular é 260.
Administrou-se a todas as marmotas portadoras do vírus da hepatite activa crónica (Hantz, supra) o composto FMAU duas vezes por dia por injecções intraperitoneais de FMAU em conformidade com as doses seguintes:
Ng. de Animais Doses
2 2 mg/kg por dia durante 7 dias
2 4 mg/kg por dia durante 5 dias
Observou-se em qualquer dos quatro animais uma
inibição extraordinária e quase imediata da replicação do vírus da hepatite das marmotas. Decorrida uma semana após a administração das doses referidas, a ADN-polimerase do vírus da hepatite das marmotas tinha caído para níveis considerados normais. O composto FMAU suprimiu a replicação do vírus da
hepatite das marmotas e esta inibição persistiu durante 20-50 dias após ter cessado o tratamento.
Foram também efectuados estudos utilizando o composto aciclovir ou ara-AMP em doses semelhantes. Os níveis de replicação do vírus diminuíram. Todavia esses níveis retomaram os seus valores anteriores ao tratamento após ter cessado esse tratamento.
Efectuou-se ensaios subsequentes em marmotas portadoras do vírus da hepatite, utilizando também os seguintes compostos derivados nucleosídicos da pirimidina: FIAC (2'-fluoro-2'-desóxi-arabinosil-5 - iodo-ocitosina) e FIAU (2'-fluoro-2'-desóxi-arabinosil-5-iodo-uracilo). Tal como sucedia no caso do composto FMAU, a água continua a ser o veículo preferencial. Estes compostos são também solúveis em água de acordo com o quadro seguinte:
Peso mol.
FIAC 7,2 mg/ml a 21 °C 371
FIAU 4,0 mg/ml a 28°C 372
Se necessário, é possível aumentar a solubilidade
dos compostos FMAU, FIAC e FIAU adicionando um ácido ou uma base ao solvente aquoso. A título de exemplo refere-se que é possível aumentar a solubilidade do composto FIAC para cerca de 250 mg/ml adicionando cerca de um equivalente molar de ácido clorídrico embora seja aceitável uma concentração em ácido clorídrico ligeiramente inferior.
No caso do composto FIAU a solubilidade pode ser
aumentada muitas vezes adicionando um equivalente de
hidróxido de sódio o que dá origem ao sal sódico de FIAU.
EXEMPLO 1
Testes in vivo com FEAU
Neste exemplo efectua-se a descrição de estudos bioquímicos e anti-virais comparativos para os nucleósidos 2fluoro-substituído-arabinosil-pirimidina designados por FMAU e FEAU. Os estudos bioquímicos indicaram que o composto FEAU deve ser um agente selectivo anti-vírus do herpes que é menos tóxico do que o composto FMAU. Procedeu-se à avaliação do composto FEAU contra infecções de vírus de varicela dos símios em macacos verdes africanos e tal como sucedia com o composto FMAU verificou-se que era altamente eficaz para evitar escoriações e para reduzir a viremia sem toxicidade
aparente para doses de 30, 10 ou 3 mg/kg/dia x 10
administradas por via intravenosa. A administração oral do
composto FEAU nesses macacos segundo doses de 10, 3 e 1
mg/kg/dia x 10 foi igualmente eficaz.
composto FEAU parece ser o mais prometedor dos análogos nucleosídicos até agora testados contra vírus de tipo hepa-ADN e, em conformidade com a presente invenção, demonstra possuir eficácia clínica contra o vírus da hepatite
B.
FEAU
F Μ A U
E D U
Desde o relatório original (1) sobre a síntese e sobre as actividades anti-vírus do herpes de vários nucleósidos da pirimidina substituídos na posição 5 e que possuem o radical 1 -(2'-desóxi-2'-fluoro-β-D-arabino-furanosilo), os estudos relativos a estruturas e actividades
indicaram que o substituinte 2'-fluor na configuração
superior (arabino) conferia uma mais poderosa actividade
anti-virai do que os substituintes 2'-OH, -hidrogénio ou
outros 21 1-halogéneos (2). Aléid disso, pelos trabalhos
publicados (3, 4) sabe-se que os nucleósidos de substituinte
2' -fluor são resistentes à clivagem catabólica pelas
fosforilases nucleosídicas, presumivelmente como consequência de uma estabilidade metabólica acrescida da ligação N22
-glicosilo imposta por este substituinte em 2' electronegativo. Entre os diversos nucleósidos de 2'-fluoro-5-substituído-arabinosil-pirimidina sintetizados (1), o composto FIAC [1 -(2'-desóxi-2'-fluoro-β-D-arabino-furanosil)-5-iodo-citosina] demonstrou eficácia clínica contra infecções de vírus do herpes em ensaios clínicos na fase 1 (5) e contra o vírus Zoster da varicela em ensaios clínicos na fase 2 (6) em pacientes cancerosos imunocomprometidos. Descobriu-se que o correspondente análogo da timina, o composto 1 -(2'-desóxi-21-fluoro-β-D-arabino-furanosil)-5metil-uracilo [FMAU] era mais poderoso nos murganhos infectados com o vírus do herpes simplex (VHS) de tipos 1 e 2 sem toxicidade manifesta para os níveis de dosagem eficaz. Descobriu-se também que o composto FMAU era activo in vitro e in vivo contra linhas celulares de leucémia P-815 e L-1210 resistentes ao agente anti-leucémico arabino-furanosil-citosina [Ara-C]. Uma experiência de Fase 1 do composto FMAU em pacientes com cancro em estado avançado demonstrou que a disfunção do sistema nervoso central (SNC) induzida pelo fármaco era a toxicidade limitadora da dose (7).
Tomando o composto FMAU como composto de referência, efectuou-se também as sínteses de outros compostos derivados de 2'-fluoro-arauracilo substituídos por grupos alquilo na posição 5 (8, 9) incluindo o composto 1-(2'-desóxi-21 -fluoro-β-D-arabino-furanosil)-5-etil-uracilo
[FEAU]. Conforme se mostra no Quadro I, embora o composto FEAU exibisse uma potência que em termos de logaritmo é aproximadamente uma unidade inferior à potência do composto FMAU contra células de Vero infectadas com VHS-1 e VHS-2 em cultura, o primeiro desses compostos exibiu bastante menos toxicidade para as células do hospedeiro, daí resultando um índice terapêutico extremamente favorável (9, 10).
QUADRO I
ACTIVIDADE COMPARATIVA ANTI-VHS DOS COMPOSTOS FMAU E FEAU
EM ENSAIOS DE REDUÇÃO EM PLACA COM CÉLULAS DE VERO
VHS-1(F)* VHS-2(G)* di50 ÍNDICE TERAPÊUTICO
de50 ( M-m) DEg0 DE50(gM) DEgo (μΜ) di50/de90 VHS-1 VHS-2
FMAU 0,010 0,042 0, 023 0,09 2,8 67 31
FEAU 0,024 0,26 0,24 0,91 200 769 220
* Coeficiente de Correlação 0,86.
# Efeito citotóxico medido em células em rápida divisão.
Quadro 11(10) mostra uma comparação da actividade anti-viral dos compostos FMAU, FEAU e 5-etil-2'-desóxiuridina (EDU) em murganhos inoculados íntracerebralmente com o VHS-2. O composto FEAU demonstrou actividade a 50 mg/kg/dia durante 4 dias e foi altamente eficaz para reduzir a mortalidade
nestes murganhos para doses de 100-200 mg/kg/dia. Para estes níveis de dosagem não se observou toxicidade. Em murganhos normais (não infectados) o composto FEAU demonstrou ser não tóxico para doses de 800 mg/kg/dia administradas duas vezes por dia durante 4 dias. É de salientar que o composto EDU, o qual difere estruturalmente do composto FEAU apenas pela ausência do substituinte 2'-fluor, é muito menos eficaz do que o composto FEAU neste modelo de encefalite de murganho provocada pelo VHS-2. Esta descoberta é consistente com a observação anteriormente efectuada (1) que atesta importância do substituinte 2'-fluor no que diz respeito actividade anti-VHS exibida por estes nucleósidos de arabinofuranosil-pirimidina.
Concluiu-se em trabalhos anteriormente publicados (11) que o composto FMAU é um poderoso e selectivo agente anti-virai para o tratamento da encefalite dos murganhos provocada pelo VHS-2 e por essa razão mereceu consideração como agente potencial em experiências com seres humanos para o tratamento da encefalite provocada pelo VHS em recéra
-nascidos e em adultos segundo fracos níveis de dosagem. Os resultados preliminares descritos nos Quadros I e II para o composto FEAU sugerem (10) que este composto pode eventualmente ser também merecedor de consideração idêntica. Tomando como base estas descobertas anteriores (10) e tendo em consideração o relatório bioquímico preliminar (12)
procedeu-se à realização de novos estudos comparativos bioquímicos e anti-virais com os compostos FMAU e FEAU, incluindo as suas actividades relativas contra os vírus de varicela dos símios em macacos verdes africanos e contra o vírus da hepatite no modelo animal dependente das marmotas.
QUADRO II
EFEITOS ANTI-VIRAIS DOS COMPOSTOS FEAU, FMAU E EDU
EM MURGANHOS INOCULADOS INTRACEREBRALMENTE
COM VHS-2 (ESTIRPE G)
% DE GANHO DEC
TRATAMENTO DOSE* MDD** PESO NUM DIA -
MG/KG/DIA SOBREVIVENTES 7 14 21 30
CONTROLO NEG.(SEM VIRUS) - 100
PBS (CONTROLO COM VIRUS) 6,7 7
-3 9. 13 16
-22 -14 + 8 + 17 +
10 9,4 8 -7 -13 + 31 + 36
50 11,8 25 3 -10 16 25
100 11,0 72 2 7 13 13
200 (14)* 93 0 1 9 13
FMAU
EDU
7.6 13 -10 -626
8.6 33 3 13 34 43
I * ADMINISTRADO5HORASAPOSÃINOCULAÇÃO INTRACEREBRAL. POSOLOÇIA: DUAS VEZES POR DIA DURANTE 4 DIAS. ** CALCULADA
AO 21 DIA. # OS NUMEROS ENTRE PARENTESES INDICAM A9 MORTE DE UM UNICO ANIMAL, δ COMPARATIVAMENTE COM O 1 DIA. TOMANDO COMO BASE O PESO DE UM UNICO ANIMAL SOBREVIVENTE.
5?
Estudos Bioquímicos Comparativos
Os resultados de estudos bioquímicos (13) dos
efeitos relativos dos compostos FEAU e FMAU sobre o
desenvolvimento de célul as de mamíferos estão indicados no
Quadro III.
QUADRO III
COMPARAÇÃO DOS EFEITOS DOS COMPOSTOS FEAU E FMAU
NAS CÉLULAS DOS MAMÍFEROS
DE50 (EM μΜ) PARA INIBIR 0 DESENVOLVIMENTO CELULAR EM: FEAU FMAU FEAU FMAU
CÉLULAS HL-60 2060 15,4 133
CÉLULAS DE VERO >200 2,8 >71
DE5q (μΜ) PARA INIBIR A INCORPORAÇÃO DE TIMIDINA NO ADN FEAU FMAU FEAU FMAU
CÉLULAS P-815 700 14,0 50
CÉLULAS L-1210 630 28, 0 22
CÉLULAS DA MEDULA OSSEA DO RATO 3700 8,9 415
Faz-se observar que no caso da linha celular da leucémia promielocítica dos seres humanos (HL-60) tal como no caso das células de Vero (provenientes do macaco verde africano) o composto FEAU é bastante menos inibidor do crescimento do que ο composto FMAU, ο que se pode comparar favoravelmente com o estudo in vitro cujos dados estão indicados no Quadro I. De modo idêntico, contra linhas celulares de roedores (P-815, L-1210 e células da medula óssea do rato) o composto FEAU é bastante menos inibidor do crescimento do que o composto FMAU (Quadro II).
Determinou-se as constantes cinéticas celulares (Κχ) para a inibição da incorporação do precursor natural no ADN das células L-1210, proporcionada pelos compostos FEAU e FMAU. Utilizando como substratos precursores naturais marcados com tritio (timidina, 21-desóxiuridina e 2'-desóxicitidina) verificou-se facilmente que o composto FEAU era um inibidor muito mais fraco do que o composto FMAU do anabolismo do nucleósido natural nestas células de mamíferos (12, 13).
Estudos efectuados sobre a incorporação dos 1 4 compostos FEAU e FMAU, com marcação 2- C, nos ADN de células de mamíferos demonstraram a existência de diferenças bastante significativas (Quadro IV).
QUADRO IV
INCORPORAÇÃO DE [2-14C]-FEAU OU [2-14C]-FMAU
NO ADN DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS
INCORPORAÇÃO A 10μΜ (EM p MOLE/106 CÉLULAS/HORA)
LINHA CELULAR FEAU FMAU
L-1210 NÃO DETECTAVEL* 0, 69
VERO NÃO DETECTAVEL* 1,3
CÉLULAS DE VERO INFECTADAS COM VHS-1 0, 48 3,4
* NÃO DETECTAVEL A 100 μΜ
Não houve incorporação detectável de radioactividade do FEAU no interior do ADN tanto das células L-1210 como das células de Vero, mas houve quantidades substanciais de radioactividade do composto FMAU incorporadas no interior do ADN de qualquer dessas linhas celulares. Quando as células de Vero infectadas cora VHS-1 forma expostas aos compostos FEAU e
4
FMAU marcados com C, ambos os nucleósidos foram incorporados no interior do ADN dessas células infectadas pelo vírus. Nestas condições, a incorporação do composto FMAU nas células de Vero infectadas com o VHS-1 é sete vezes superior ao valor observável para o composto FEAU. Esta diferença na incorporação pode ser eventualmente ser devida à maior afinidade do composto FMAU paa a ADN-polimerase
codificada virai e é comparável à amplitude da diferença dos seus efeitos anti-herpéticos in vitro (13).
Constitui facto geralmente aceite que a actividade selectiva anti-herpes dos nucleósidos de 2'-fluoro-arabinosil-pirimidina está associada em grande medida com a sua capacidade para serem reconhecidos como bons substratos para a timidina-quinase (TK) específica do VHS, mas não pela TK do hospedeiro (14, 15). Conforme se mostra no Quadro V, o composto FMAU é um bom substrato (relativamente à timidina) para as enzimas TK do citosol e mitocondrial derivadas da linha celular humana HL-60 e também para as enzimas TK derivadas de VHS-1 e VHS-2. Pelo contrário, o composto FEAU é um substrato bastante fraco para as enzimas TK derivadas da linha celular HL-60 do hospedeiro (13). Estes resultados são consistentes com o relatório recente de Mansuri e seus colaboradores (16) o qual demonstrou que o composto FEAU exibe uma afinidade muito fraca para a enzima TK das células de Vero (comparativamente com a timidina) mas exibe uma afinidade elevada para a enzima TK codificada pelo VHS-1 e VHS-2. Os resultados por eles obtidos indicam que, em células de Vero não infectadas, o composto FEAU poderia ser fosforilado segundo uma taxa bastante fraca em presença de timidina.
Estes estudos bioquímicos (10, 12-16) sugerem que o composto FEAU deve ser mais selectivo na sua actividade anti31
-virai e por essa razão deve ser menos tóxico para o hospedeiro. Experiências efectuadas in vivo com murganhos (10, 13) demonstram que qualquer dos compostos FMAU e FEAU é relativamente não tóxico. Todavia o composto FMAU é bastante neurotóxico nos cães (dose letal de 2,5 mg/kg/dia, i.v. x 5) ao passo que estudos preliminares efectuados com o composto FEAU nos cães para uma dose de 50 mg/kg/dia x 10 demonstram apenas uma toxicidade moderada (dose letal correspondente a 100 mg/kg/dia x 10). Conforme referido antes, o composto FMAU exibiu uma toxicidade no SNC limitadora da dose em pacientes com cancros em estado avançado (7) para uma dose intravenosa correspondente a 0,8 mg/kg/dia x 5.
QUADRO V
TAXAS PERCENTUAIS DE FOSFORILAÇÃO DOS COMPOSTOS
FEAU E FMAU (EM RELAÇÃO A TIMIDINA*) ORIGINADAS
POR DIVERSAS TIMIDINA-QUINASES
FONTE ENZIMATICA FEAU FEAU
CÉLULAS HL-60
TK DO CITOSOL 0-2,1 81,7
TK MITOCONDRIAL N/A 219,0
TK DO VHS-1 (ESTIRPE KOS) 82,7 42,0
TK DO VHS-2 (ESTIRPE 33) 203,2 146,6
* TIMIDINA A 400 μΜ
Estudos Comparativos contra o Vírus da Varicela dos Símios Efectuados em Macacos
Estudos da instituição Delta Regional Primate Research Center compararam as actividades dos compostos FEAU e FMAU em macacos verdes africanos infectados com o vírus da varicela dos símios (WS). Tal como se mostra no Quadro VI, os três controlos não tratados exibiram uma viremia acentuada
Q e morreram por volta do 11 dia. Os macacos tratados com o composto FEAU segundo três níveis de dosagem (por via intravenosa) não demonstraram sinais de toxicidade aparente mesmo para a dose mais elevada de 30 mg/kg/dia x 10. Os testes hematológicos e as análises químicas do soro para todos os macacos tratados foram normais e a viremia (relativamente aos macacos de controlo) foi mínima mesmo para a menor dose de 3 mg/kg/dia. Apesar de os macacos de controlo desenvolverem graves escoriações, nenhum dos macacos tratados com o composto FEAU desenvolveu escoriações para qualquer destes níveis de fármaco. Outros estudos demonstraram que uma dose menor de 1 mg/kg/dia evitou o desenvolvimento de escoriações mas não reduziu a viremia em dois dos três macacos. Estes resultados sugerem que a dose mínima eficaz neste sistema, para o composto FEAU, é de aproximadamente 1 mg/kg/dia. Estudos concorrentes efectuados com o composto FMAU demonstraram que é aproximadamente 40 vezes mais poderoso contra o WS sendo a dose eficaz mínima de cerca de
0,04 mg/kg/dia x 10.
O composto FEAU também foi altamente eficaz no tratamento no vírus da varicela dos símios, administrado por via oral. A administração oral segundo níveis de dosagem correspondentes a 10, 3 ou 1 mg/kg/dia x 10 evitou a formação de escoriações (Quadro VII) e reduziu a viremia significativamente. Mesmo para a dose de 1 mg, as escoriações foram praticamente todas evitadas (apareceram duas vesículas
Q ao 9 dia as quais desapareceram imediataraente). Para as doses de 10 mg/kg/dia x 10 administradas por via oral não se observou quaisquer sinais de toxicidade. Demonstra-se deste modo que o composto FEAU é um agente anti-virai altamente eficaz e selectivo no tratamento de infecções de WS, tanto por via intravenosa como por via oral.
QUADRO VI
AVALIAÇÃO DO COMPOSTO FEAU NO TRATAMENTO DE INFECÇÕES
DE VIRUS DA VARICELA DOS SIMIOS, UTILIZANDO-SE
MACACOS VERDES AFRICANOS
GRUPO DE TRATAMENTO* N° DO MACACO VIREMIA** - : PFU MÉDIO NOS DIAS P.I.
3 5 7 9 11
CONTROLO G029 1 140 >400 MORTO
h2o G030 3 163 >400 >400 MORTO
G031 1 99 >400 MORTO
FEAU - G023 1 0 0 0 0
30 MG/KG/DIA G024 2 0 0 0 0
FEAU - G025 1 14 5 0 0
10/MG/KG/DIA G026 0 1 1 0 0
FEAU G027 1 8 0 0 0
3 MG/KG/DIA G028 0 1 1 0 0
O TRATAMENTO FOI ADMINISTRADO POR INJECÇÃO I.V. DUAS
VEZES POR DIA COM INICIO 48 HORAS APOS A INOCULAÇÃO DO
VIRUS E PROLONGANDO- SE POR 10 DIAS
DETERMINOU-SE A VIREMIA POR CULTURA DE LINFOCITOS RECOLHIDOS A PARTIR DE 3 ML DE SANGUE HEPARINIZADO NOS DIAS INDICADOS POS-INJECÇÃO (P.I.). O VALOR PFU MÉDIO INDICADO REPRESENTA O NUMERO MÉDIO DE PLACAS PRESENTES EM DOIS BALÕES DE CO-CULTURAS DE CÉLULAS DE VERO INOCULADAS COM CADA UMA DAS SUSPENSÕES DE LINFOCITOS.
QUADRO VII
AVALIAÇÃO DO DOSEAMENTO ORAL DO COMPOSTO FEAU
NO TRATAMENTO DE INFECÇOES DE VIRUS DE VARICELA DOS SIMIOS,
UTILIZANDO MACACOS VERDES AFRICANOS:
EFEITO SOBRE AS ESCORIAÇÕES#
GRUPO DE TRATAMENTO* N° DO MACACO ESCORIAÇÕES - GRAVIDADE NOS DIAS P.I.
6 7 8 9 10 11 12 14
CONTROLO - F644 ± 3 + 4 + 4 + MORTO
PBS G668 - - ± 2 + 1 + ± ±
G604 - ± 3 + 4 + 4 + 2 + +
FEAU - G249 - - - - - - -
10 MG/KG/DIA G267 - - - - - - -
G264 - - - - - - -
FEAU - G665 - - - - - - -
3 MG/KG/DIA G257 - - - - - - -
G268 - - - - - - -
FEAU - G269 - - - - - - -
1 MG/KG/DIA G270 - - - - - - -
G274 - - - ± - - -
* ADMINISTROU-SE O TRATAMENTO ATRAVÉS DE UM TUBO INTRODUZIDO NO ESTOMAGO DUAS VEZES POR DIA COM INICIO 48 HORAS APOS A INOCULAÇÃO DO VIRUS E PROLONGANDO - SE DURANTE 10 DIAS.
# CLASSIFICOU-SE A GRAVIDADE DAS ESCORIAÇÕES SEGUNDO UMA ESCALA DESDE ± ATÉ 4+. REGISTOU-SE ESCORIAÇÃO DE TIPO ± QUANDO FORAM OBSERVADAS ALGUMAS VESÍCULAS, AO PASSO QUE SE REGISTOU ESCORIAÇÃO DE TIPO 4+ QUANDO SE OBSERVOU UMA DISTRIBUIÇÃO DE VESÍCULAS DISSEMINADAS POR TODA A SUPERFÍCIE CORPORAL.
Tendo em consideração (a) a actividade in vitro (15, 17) dos compostos FIAC e FMAU contra o vírus Zoster da
varicela (VZV, um componente do grupo de vírus dos herpes
humanos); (b) a eficácia assinalada do composto FIAC para o
tratamento do vírus Zoster da varicela nas experiências de
Fase 2 em pacientes com iraunossupressão (6); e (c) as
actividades in vivo dos compostos FMAU e FEAU contra o vírus da varicela dos símios tal como descrito na presente memória descritiva e também na publicação (18), é admissível que o composto FEAU exiba também de modo significativo uma actividade selectiva contra os VZV nos seres humanos.
EXEMPLO 2
Estudos Comparativos Anti-Vírus da Hepatite nas Marmotas
Neste exemplo avaliou-se os compostos FEAU e FMAU contra o vírus da hepatite das marmotas (VHM) em marmotas cronicamente infectadas (modelo animal seleccionado para a avaliação de potenciais agentes anti-vírus da hepatite B nos seres humanos). 0 composto FEAU inibe a replicação do VHM em doses de 2 e 0,2 mg/kg/dia x 10 em todos os animais testados. O efeito inibidor foi imediato, não tóxico e de longa duração. Estudos preliminares indicaram que o composto FEAU também é eficaz contra o VHM quando administrado por via oral. 0 composto FMAU produziu também efeitos inibidores imediatos contra a replicação do VHM em doses de 2 e
0,2 mg/kg/dia x 5; contudo foram observados níveis inaceitáveis de toxicidade com o composto FMAU para esses valores de dosagem.
O vírus da hepatite B (VHB), que é um componente do vírus hepa-ADN, provoca a hepatite aguda e crónica nos seres humanos. Estima-se que cerca de 200 milhões de pessoas sejam portadores deste vírus. O VHB pode eventualmente ser o agente causativo primário do carcinoma hepatocelular (19). Os vírus do grupo hepa-ADN também foram descobertos em outros animais tais como as marmotas (Marmota Monax). As estreitas semelhanças estruturais e de tipo clínico-patológico, incluindo a homologia do ácido nucléico (20) existentes entre o vírus da hepatite das marmotas (VHM) e o VHB sugerem que a marmota representa um modelo útil para o estudo de infecções persistentes do vírus da hepatite e também para o estudo da sua relação com o desenvolvimento do cancro do fígado (21). TA1 como o VHB, o vírus da hepatite das marmotas produz uma ADN-polimerase bastante semelhante, para a sua replicação e integLação. Os potenciais agentes anti-VHB podem ser eventualmente detectados pela inibição das ADN-polimerases endógenas de VHM ou VHB obtida a partir de soros preparados a partir de marmotas portadoras crónicas e partir de pacientes com imunossupressão positiva para antígeno da superfície do vírus da hepatite B. Esses estudos foram efectuados na instituição Hepatitis Virus
Unit, INSERM,
Lyon, França, com o objectivo de se medir os efeitos inibidores de alguns nucleósido-trifosfatos sobre estas ADN-polimerases virais endógenas.
Numa série de ensaios (22, 23) determinou-se as sensibilidades relativas das ADN-polimerases do VHB e do BHM para diversos nucleósido-trifosfatos (Quadro VIII). Dos seis nucleósido-trifosfatos examinados o composto FMAU foi o mais eficiente inibidor de qualquer das ADN-polimerases de VHB ou de VHM, seguido de perto pelo composto FIAC. Por outro lado, embora as potências (valores DI50) de cada um destes seis trifosfatos contra as ADN-polimerases de VHB ou de VHM não fossem idênticas, foram bastante próximas. Como facto importante salienta-se que as ordens de potência destas ADN-polimerases virais como inibidores foram idênticas. Estes resultados atestam ainda as surpreendentes semelhanças entre o VHB e o VHM e sugerem a validade da marmota como modelo animal por excelência para a avaliação in vivo dos potenciais agentes anti-vírus da hepatite B (23).
QUADRO VIII
ACTIVIDADES INIBIDORAS COMPARATIVAS DOS ANALOGOS NUCLEOSIDO-TRIFOSFATO SOBRE AS ADN-POLIMERASES DO VIRUS DA HEPATITE HUMANA (VHB) E DO VIRUS DA HEPATITE DAS MARMOTAS (VHM)
INIBIDOR NUCLEOSIDO-TRIFOSFATO DI50 (μΜ)*
ADN-POLIMERASE DO VHB ADN-POLIMERASE DO VHM
FMAU-TP 0,025 0,05
FIAT-TP 0,05 0, 10
BVDU-TP 0,25 0, 30
ARA T-TP 0,30 0,40
ACV-TP 0,90 0, 70
ARA C-TP 1,10 1,20
*DI50 = CONCENTRAÇÃO DE INIBIDOR QUE PROPORCIONA 50% DE
INIBIÇÃO DA ACTIVIDADE DA ADN-POLIMERASE.
Foram efectuados estudos para avaliação dos compostos FMAU e FEAU neste modelo de animal utilizando marmotas natural e cronicamente infectadas com o vírus da hepatite das marmotas (24) . Admitiu-se que estes nucleósidos seriam anabolizados originando os correspondentes nucleósido-trifosfatos no interior do animal. Mediu-se a replicação do VHM periodicamente através da actividade da ADN-polimerase endógena e pela detecçao do ADN do VHM através de um ensaio de hibridação de manchas por pontos. As actividades da ADN40
-polimerase virai na Figura
1. Foram compostos
FMAU mg/kg/dia início no dia replicação do
das marmotas não tratadas estão indicadas investigadas três dosagens diferentes dos
FEAU. 0 composto FMAU numa dose de 2 (administrada
0), produziu
VHM conforme por via intraperitoneal com uma inibição acentuada da demonstrado pela supressão completa da actividade da ADN-polimerase do VHM (Figura 2). Todavia, para esta dose foram observados níveis elevados de toxicidade no SNC os quais eventualmente são letais. O composto FEAU administrado por via intraperitoneal (i.p.) na dose de 2 mg/kg/dia x 10 originou também uma supressão quase imediata da replicação do VHM e não exibiu quaisquer efeitos tóxicos. Para uma dose de 0,2 mg/kg/dia o composto FMAU (administrado durante 5 dias) e o composto FEAU (administrado durante 10 dias) foram igualmente eficazes na supressão da replicação virai (Figura 3). Para esta dose o composto FMAU exibiu uma toxicidade menos grave e retardada ao passo que o composto FEAU voltou a ser não tóxico. Mesmo para doses de 0,04 mg/kg/dia x 10 o composto FEAU exerceu um efeito anti-VHM ainda assinalável. Um estudo preliminar efectuado com uma marmota à qual se administrou o composto FEAU por via oral segundo uma dose de 0,2 mg/kg/dia x 10 revelou uma supressão significativa da replicação do VHM sem que se tivesse observado qualquer toxicidade (Figura 4).
Depois de ter cessado a administração do fármaco a
actividade inibidora do composto FEAU nas doses de 0,2 ou 2 mg manteve-se significativa durante um período de seis semanas, voltando lentamente aos níveis pré-tratamento. A inibição da replicação do VHM por acção do composto FEAU foi praticamente imediata e revelou-se extraordinariamente mais duradoura do que no caso de utilização de outros agentes anti-virais tais como os compostos 6-desóxi-aciclovir, DHPG ou Ara-AMP. Estes últimos fárraacos diminuíram também os níveis da ADN-polímerase do VHM, mas rapidamente regressaram aos valores pré-tratamento após ter cessado a administração do fármaco. Contrariamente aos resultados anteriormente obtidos com os composto FMAU e FIAC (em que se demonstrou a toxicidade letal) apenas se observou cerca de 10% de perda de peso após o tratamento com FEAU (24).
A eficácia observada do composto FEAU contra a replicação do vírus da hepatite das marmotas para estes fracos níveis de dosagem foi bastante surpreendente. Tomando como base os estudos in vitro sobre o vírus do herpes simplex (9, 10), os estudos in vivo sobre a encefalite do herpes no modelo de murganho (10) e os estudos sobre o vírus da varicela dos símios em macacos verdes africanos, conforme descrito na presente memória descritiva, era de admitir que o composto FEAU fosse muito menos poderoso do que o composto FMAU. Os resultados obtidos sugerem que o composto FEAU pode eventualmente ser um agente eficaz sob o ponto de vista
clínico contra o vírus da hepatite B. Tomando como base a sua potência e selectividade, admite-se que possa ser o mais prometedor dos análogos nucleosídicos até agora testados.
EXEMPLO 3
De acordo com os procedimentos do Exemplo 2 estudou-se melhor a inibição da replicação do VHM por acção do composto FEAU segundo doses diferentes administradas por via oral às marmotas através de tubos inseridos no
Efectuou-se o exame de dois grupos de marmotas com estômago.
diferentes valores iniciais de replicação do VHM.
A. Alta Replicação
Procedeu-se ao teste de sete marmotas com alta replicação de VHM. Alta replicação significa mais de
1000 unidades de contagem por minuto da actividade da
ADN-polimerase, tendo sido 1600 o valor médio da replicação.
Duas destas marmotas foram utilizadas como elementos de controlo e, com ligeiras flutuações, exibiram a mesma replicação de
VHM durante os dias da experiência.
As restantes cinco oral com 0,2 mg
FEAU/kg/dia.
marmotas foram tratadas por via 0
Por volta do 23 dia todas essas marmotas haviam diminuído os valores de replicação. Contudo, quatro dessas cinco marmotas ainda estavam acima do nível normal definido por 50 unidades actividade da
ADN-polimerase.
de contagem por minuto para a
Q
Em consquência, ao 24 dia, aumentou-se a dosagem dessas quatro marmotas para 1 mg
FEAU/kg/dia mantendo-se a quinta sob acção de uma dose de 0,2 2 mg FEAU/kg/dia. Ao 60 dia a replicaçao foi completamente inibida nos cinco animais sem que houvesse efeitos tóxicos secundários.
B. Fraca Replicação
Procedeu-se ao teste de sete marmotas com fraca replicação de VHM. Fraca replicação significa menos de 1000 unidades de contagem por minuto paa a actividade da ADN-polimerase, tendo sido de 600-800 o valor médio da replicação. Duas dessas marmotas forma utilizadas como elementos de controlo e, com ligeiras flutuações, exibiram a mesma replicação de VHM durante os 60 dias da experiência.
As restantes cinco marmotas foram tratadas por via oral com 0,04 mg FEAU/kg/dia. Por volta do 23S dia todas essas marmotas haviam diminuído os valores de replicação. Contudo, duas das cinco marmotas ainda se mantinham acima do nível normal. Em consequência, ao 24° dia aumentou-se a dosagem destas duas marmotas para 0,2 mg FEAU/kg/dia mantendo-se as restantes três marmotas sob a acção de uma dose de 0,04 mg FEAU/kg/dia. Ao 60° dia a replicação foi completamente inibida nos cinco animais sem que houvesse quaisquer efeitos tóxicos secundários.
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Claims (16)

1.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas utilizáveis no tratamento de pacientes infectados pelo vírus da hepatite, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade do composto de fórmula ou uma sua forma pró-fãrmaca ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, eficaz para inibir a replicação do vírus da hepatite em um paciente, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o vírus da hapatite ser o vírus da hepatite A.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o vírus da hepatite ser o vírus da hepatite B.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o vírus da hepatite ser o vírus da hepatite não-A, não-B.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a quantidade eficaz para inibir a replicação do vírus da hepatite estar compreendida entre cerca de 0,01 mg/kg de peso corporal do paciente/dia e cerca de 100,0 mg/kg de peso corporal do paciente/dia.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a quantidade do composto ser superior a cerca de 0,04 mg/kg de peso corporal do paciente/dia.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de a quantidade do composto estar compreendida entre cerca de 0,04 mg/kg de peso corporal do paciente/dia e cerca de 50,0 mg/kg de peso corporal/dia.
8.- Método de tratamento de uma infecção pelo vírus da hepatite, em um paciente, caracterizado pelo facto de se administrar ao paciente uma quantidade do composto de fórmula ou de uma sua forma pró-fármaca ou de ura seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, eficaz para inibir a replicação do vírus da hepatite no paciente.
9.- Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se fazer a administração por via oral.
10.- Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se fazer a administração por via intravenosa.
11.- Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a quantidade eficaz para inibir a replicação do vírus da hepatite estar compreendida entre cerca de 0,01 mg/kg de peso corporal do paciente/dia e cerca de 100,0 mg/kg de peso corporal do paciente/dia.
12. - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de a quantidade do composto ser superior a cerca de 0,04 mg/kg de peso corporal do paciente/dia.
13. - Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de a quantidade do composto estar compreendida entre cerca de 0,04 mg/kg de peso corporal do paciente/dia e cerca de 50,0 mg/kg de peso corporal do paciente/dia.
14. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o paciente ser um ser humano.
15, - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o vírus da hepatite ser o vírus da hepatite A.
16. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o vírus da hepatite ser o vírus da hepatite B.
Métoco de acordo com a reivindicação 8, caracterizado de o vírus da hepatite ser o vírus da hepatite não-A,
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