HUT61468A - Process for producing pharmaceutical compositions against human retrovirus and comprising xanthine derivatives as active ingredient - Google Patents

Description

ELJÁRÁS HATÓANYAGKÉNT XANTINSZÁRMAZÉRÓKAT TARTALMAZÓ, HUMÁN RETROVÍRUS ELLENI GYÓGYSZERKÉSZÍTMÉNYEK ELŐÁLLÍTÁSÁRA

Hoechst-Roussel Pharmaceuticals Incorporated, Somerville, NJ, Amerikai Egyesült Államok

DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, Boston, Amerikai Egyesült Államok

Feltalálók:

DEZUBE Bruce J., New lentre, MA

PARDEE Arthur B., Brookline, MA

RUPRECHT Ruth M., Boston, MA

NOVICK William J., Lebanon, NJ

Amerikai Egyesült Államok

A bejelentés napja: 1991. 11. 07.

Elsőbbsége: 1990. 11. 07. (610 230)

Amerikai Egyesült Államok

73642—1023-GI

-2A találmány tárgya eljárás xantinszármazékok alkalmazása humán retrovírus, mint például 1 típusú humán immunhiány vírus (HIV-1) replikációjának gátlására. A találmány tárgya továbbá eljárás a humán retrovírus szaporodás gátlására, ami a transzkriptáz aktivitás csökkenésével mérhető.

A szerzett immunhiány szindróma(Acquired immuné deficiency snydrome = AIDS) olyan tünetcsoport, amely ma Észak-Amerika, Európa és Közép-Afrika érdeklődésének középpontjában van. Az AIDS feltételezett kórokozója a HIV-l-nek nevezett retrovírus. A HIV-l-nek nevezett AIDS vírus a becslések szerint már 1,5 millió amerikait fertőzött meg, és 1991-re az Amerikai Egyesült Államokban 15 millió ilyen vírussal fertőzött ember lesz. A fertőzött egyedek súlyos immunoszupressziós tüneteket mutatnak, amelyeket degeneratív és akár halálos betegségek követnek.

Az első AIDS retrovírus, amelyet LAV és későbbi meghatározása szerint HlV-lj^y néven ismerünk, izolálását és jellemzését F. Barre-Sinoussi és munkatársai ismertetik a Science, 220, 868-871 (1983) irodalmi helyen.

A vírus néhány extraktumának és fehérjéjének vírus antitestek detektálására való alkalmazását ismertetik a 4 708 818 számú, amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.

Különböző kutatók azóta jó néhány AIDS retrovírus izolátumot jeleztek, és ezeket az irodalomban különböző jelölésekkel ismertetik. Ma már általánosan ismert, hogy a korábban limfadenopatiával kapcsolatos vírus (lymphadenopathy associated vírus = LAV), immunhiánnyal kapcsolatos

-3vírus (immun deficiency associated virus = IDAV1 és IDAV2), III típusú humán T-limfotróp vírus [humán T-lymphotropic virus type III (HTLV-III)] és AIDS-szel kapcsolatos vírus (ARV) néven ismert vírusok mind ugyanazon retrovírus változatok. Ismertetésüket megtaláljuk például a Natúré, 313, 636-637 (1985) irodalmi helyen.

A vírus taxonómiával foglalkozó Nemzetközi Bizottság azt javasolta, hogy az AIDS retrovírus hivatalos neve a Humán Immunodéticiency viruses, azaz a HÍV rövidítés legyen.

A HÍV izolátumokkal egyértelmű, de korlátozott kapcsolatban lévő humán retrovírus izolátumokat (például a 20-50 %-ban nukleinsav szekvencia azonosságot mutató izolátumokat) csak abban az esetben nevezzük HIV-nek, ha a csoport létező tagjaival biológiai és szerkezeti azonosságot mutatnak. [Science, 232, 697 (1986)].

Egy másik, HIV-2-nek (korábban LAV-2-nek) nevezett patogén humán retrovírust AIDS-szel fertőzött, nyugat-afrikai betegből nyertek. [Clavel és munkatársai, Science, 233, 343 (1986)]. A HIV-2 fertőzés olyan immunhiány szindrómával jár, amely az AIDS prototípus vírussal, a HIV1-el fertőzött betegek hasonló tüneteitől klinikailag megkülönböztethetetlen. A HIV-2 a HIV-l-gyel rokon, de attól eltérő vírus, amely lényegesen kisebb gyakorisággal okoz immunhiány szindrómát. [Guyader és munkatársai, Natúré, 326, 662-669 (1987)].

Szubhumán, főemlősökből a HIV-hez genetikailag és biológiailag hasonló retrovírusokat izoláltak. Ezeket a

-4retrovírusokat a gazdaszervezetnek, mint például majomszervezetnek megfelelő immunhiány vírus (simian immunodeficiency vírus = SIV) jelöléssel ismertetik. A SIV-et először a New England Régiónál Primate Research Centerben (NERPRC) fogvatartott rhesus macaques (Macaca mulatta) majmokból izolálták. [Kanki és munkatársai, Science 228, 1199 (1985)]. Ezután afrikai zöld majmokból izoláltak SIV-t, amelyet STLV-III jelöléssel láttak el. [Kanki és munkatársai, Science 230, 951 (1985)]. A HIV-2 és SIV között kiterjedt szerológiai keresztreakcióképesség áll fenn.

A HÍV terjedése gyakran szekszuális úton történik, azonban az intravénás narkotikumokat alkalmazó emberek is nagy rizikócsoportot képeznek. Számos ember fertőzött vérrel vagy vérkészítménnyel való kezelés következtében fertőződött HIV-vel. HIV-vel fertőzött anyák gyermekei is potenciális HIV-fertőzöttek. Ebben az esetben a fertőzés a méhlepényen keresztül történik.

A humán immunhiány vírus többszörös létezése, azaz például a HIV-1 és HIV-2 jelenléte nagyon összetett járványhelyzetet mutat. A HÍV fertőzés ma az Amerikai Egyesült Államokban létező közegészségügyi veszélyforrások legveszélyesebbike, és bizonyos népességi csoportokban vezető halálozási oknak számít. Általános vélemény az, hogy a retrovírusok terjedését csak a HÍV fertőzés ellen hatásos vakcina és gyógyszerkészítmény akadályozhatja meg. Ilyen vakcina kifejlesztésére számos kutatást végeztek, azonban még nem találták meg a hatásos anyagot, ezért fennáll a hatásos

-5vakcina kifejlesztése iránti igény.

A találmány célja a fenti igények kielégítésére olyan eljárás kidolgozása, amely a humán retrovírusok, mint például humán immunhiány vírus (HÍV) szaporodását megakadályozza. Az eljárásban a humán gazdaszervezetet olyan xantinnal kezeljük, amely a retrovírus ellen védő vagy a retrovírus replikációját megelőző hatást mutat.

A találmány tárgya közelebbről egy olyan eljárás, amelyben a humán betegnek legalább egy (I) általános képlett! 7-(oxo-alkil)-1,3-dialkil-xantint adagolunk - a képletben

R1 és R2 jelentése azonos vagy eltérő, és egymástól függetlenül 2-6 szénatomos, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, ciklohexilcsoport, egyenes vagy elágazó láncú alkoxi-alkil-csoport vagy hidroxi-alkil-csoport; és

A jelentése adott esetben metilesöpörttal helyettesített, legfeljebb 4 szénatomos szénhidrogéncsoport.

Az (I) általános képletű xantint a retrovírus szaporodás gátláshoz elegendő mennyiségben alkalmazzuk.

A találmány tárgya továbbá eljárás humán retrovírusok replikációjának gátlására emberben, amelynek során a humán betegnek (II) általános képletű hatóanyagot adagolunk - a képletben

R1 és R3 szubsztituensek legalább egyikének jelentése

a) tercier alkohol funkciójú (a) általános képletű csoport, amelyben

R4 jelentése 1-3 szénatomos alkilcsoport;

n értéke 2-5 egész szám; és a másik jelentése adott esetben hidrogénatom vagy egy legfeljebb két oxigénatommal megszakított és adott esetben hidroxi- vagy oxocsoporttal helyettesített, legfeljebb 6 szénatomos R5 alifás szénhidrogén-csoport; vagy

b) (b) általános képletű oxo-alkil-csoport, amelyben

Rg jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport;

és p értéke 2, 3 vagy 4; és a másik jelentése azonos a fentiekben meghatározottakkal; és

R₂ jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport.

A (II) általános képletű hatóanyagot a retrovírus szaporodás gátlásra megfelelő mennyiségben alkalmazzuk.

A (II) általános képletű hatóanyagok jellemző példája a jól ismert pentoxifillin. A pentoxifillin szájon át alkalmazható tablettakészítmény formában beszerezhető, Trental kereskedelmi nevű termék. Ezt a hatóanyagot a vér folyási tulajdonságainak javítására ugyan már alkalmazták (klinikai kísérletek: 1971), azonban retrovírus szaporodás gátló szerként való alkalmazását eddig még nem ismertették.

A HÍV súlyossága és terjedése a kezelést rendkívül megnehezíti. A találmány szerinti hatóanyag és eljárás lehetővé teszi a HÍV fertőzés megakadályozását, és a xantin

-7megfelelő mennyiségben való alkalmazásával a HÍV in vivő szaporodásának legalább a megakadályozását.

A találmány szerinti eljárásban bizonyos xantinszármazékokat alkalmazunk a humán retrovírusok replikációjának gátlására.

A humán retrovírusok burokkal rendelkező egyszálú RNS vírusok. A vírus reverz transzkriptázt (RT) tartalmaz, amely a vírus RNS genom - provírusként ismert - DNS-sé való transzkripcióját katalizálja. A DNS-forma integrálódik a gazdasejt DNS-ébe. A találmány értelmében xantinszármazékokat alkalmazunk a humán immunhiány vírus (HÍV), ideértve a HIV-1 és HIV-2 vírusokat, aktivitásának gátlására.

A találmány szerinti eljárás HIV-vel fertőzött és HÍV fertőzésnek kitett személyek kezelésére egyaránt alkalmas.

A találmány szerinti eljárás különösen alkalmas a HIV-1 vagy HIV-2 aktivitásának gátlására az ezekkel fertőzött személyekben. Megjegyezzük, hogy a találmány szerinti eljárás ismertetésekor az irodalomban LAV-I, HTLV-III és LAV-II jelölésű humán izolátumokra hivatkozunk, a találmány szerinti eljárás ugyanezen vagy ekvivalens retrovírusokra is kiterjed. Ezek a retrovírusok feltételezhetően az AIDS okozói.

A leírás szempontjából azokat a vírusokat tekintjük a LAV/HTLV-III-mal azonosnak vagy egyenértékűnek, amelyek lényegében kielégítik a következő kritériumokat:

a) A vírus tropikus a T-limfocitákra, elsősorban a T-segítő sejtekre (CD4⁺);

b) A vírus citopatikus a fertőzött CD4 sejtekre;

c) A vírus egy RNS-függő DNS polimerázt (reverz transzkriptázt) kódol, amely Mg⁺⁺-függő, és a reverz transzkripcióhoz templát/primerként poli(A_n)oligo(dT)i2-i8^_t alkalmazhat;

d) A vírus a LAV/HTLV-III graq és env régiókkal kódolt fehérjékkel immunológiailag lényegében keresztreaktív; és

e) A vírus a LAV-val vagy HTLV-III-mal lényegében nukleotid homológiát (közel 75-100 %) és aminosav szekvencia homológiát (közel 75-100 %) mutat.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott fő hatóanyag valamilyen xantin.

A leírásban alkalmazott xantin” kifejezés olyan (I) vagy (II) általános képletű vegyületekre vonatkozik, amelyek humán HÍV fertőzés ellen védő (profilaktikus), illetve gyógyító hatást mutatnak vagy a vírus terjedését gátolják. A xantinszárinazékok olyan hatóanyagok, amelyeket a HÍV fertőzés előfordulása előtt vagy a fertőzés nyilvánvalóvá válásakor alkalmazunk azzal a céllal, hogy a fertőzést megelőzzük vagy előfordulását csökkentsük. A xantinszármazékok azokat a hatóanyagokat is magukban foglalják, amelyek kifejlődött HÍV fertőzés esetén fejtik ki hatásukat. Ide tartoznak azok a xantinszármazékok is, amelyek emberek HÍV vektor által történő fertőzését megakadályozzák, köztük azok a xantinszármazékok, amelyek beavatkoznak a humán gazdaszervezetben a HÍV replikációs ciklusába, vagy annak működését zavarják.

Az a mechanizmus, ahogyan a találmány szerinti • ·

-9xantinszármazékok a HÍV in vivő replikációját gátolják, nem teljesen ismert. Fertőzött tenyészetek felülúszójának RTaktivitása mérésével kimutattuk, hogy a xantinszármazékok gátolják a HIV-1 replikációját. Feltételezésünk szerint a humán retrovírus aktivitásának gátlási mechanizmusa egy vagy több olyan tényező hatásából eredhet, mint például a retrovírus egy vagy több genotípus vagy fenotipus jellemzőjének vagy a virális vagy celluláris folyamatoknak a módosítása. Az tény, hogy a retrovírus bejut a sejtbe; a xantin pedig megváltoztathatja a bejutási folyamatot. Emellett xantin megváltoztathatja a vírus replikációjához szükséges termékek kifejezését szabáyozó genomiális elemeket vagy működésüket. így például a xantin megváltoztathatja a retrovírus glikoprotein burkának a természetét vagy gátolhatja a különböző gének kifejeződését. A xantinszármazékok úgy is működhetnek, hogy akár a HÍV fertőzés bekövetkezése előtt, akár utána a retikuloendoteliálisrendszer működésébe beavatkoznak. A xantinszármazékok a HÍV fertőzött fagocita sejtekben való szaporodását is gátolhatják. A xantinszármazékok hatásmechanizmusa bármelyik fenti mechanizmus vagy ezek valamilyen kombinációja vagy egyéb, jelenleg még nem ismert folyamat szerint lejátszódhat. A xantinszármazékokat bármelyik hatás eléréséhez elegendő mennyiségben kell adagolni.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott xantinszármazékok várhatóan meggátolják a HÍV AIDS-ben szenvedő betegekben való szaporodását, és így a gazdaszervezet bizonyos mértékű regenerálódását vagy legalább immunrendszere « «

-10további károsodásának megakadályozását idézik elő.

A xantinszármazékok vírus-replikációt megelőző vagy gátló hatását, valamint a sejtek fertőződésének megakadályozását standard in vitro kísérletekkel igazolhatjuk. A xantinszármazékok HÍV fertőzésre vagy replikációra kifejtett gátló hatását például úgy mutathatjuk be, hogy a vírust vagy a vírussal fertőzött sejtet a vizsgált xantin nélkül, illetve annak jelenlétében tenyésztjük, majd az eredményeket összehasonlítjuk.

A xantinszármazékok humán retrovírus replikációra kifejtett gátló hatását a reverz transzkriptáz aktiviás in vitro mérésével mutathatjuk be. Például a retrovírussal fertőzött sejtek kondicionált közege poli(etilénglikol)-lal való kicsapatással vagy centrifugálással koncentrálható. Egy DNS primer 12-18 bázisát tartalmazó szintetikus templát primer egy 300 bázisú RNS templáttal olvasztható össze. Az RT-tartalmú vironok detergenssel, mint például Triton Χ-100-zal elroncsolhatók. Megfelelően jelzett nukleozid-trifoszfát, mint például radioaktivan jelzett guanozin-trifoszfát, kétértékű kation (rendszerint Mg⁺⁺) és kálium jelenlétében az RT az RNS-szál nukleotid szekvenciája irányításának megfelelően hatásosan be tudja építeni a jelzett nukleotidot a DNS-szálba. Ennek hatására savval kicsapható, radioaktivan jelzett RNS:DNS hibrid jön létre. Ez a termék folyadék szcintillációs számlálóval elemezhető, és az eredmény az időegységenként beépített nukleozid-monofoszfát pikomolokban vagy - ha az eredményt standardhoz hasonlítjuk - RT-egységekben fejezhető ki.

-11* · · · » · *

Ebben a kísérletben általában a következő két fontos templát-primert alkalmazzuk:

poli(A)_noligo(dT)12-18; ^és poli(C)_noligo(dG).

A poli(C)_noligo(dG)12-18 templát/primer retrovírus specifikus, és Mg⁺⁺ jelenlétében humán retrovírus reverz transzkriptázzal hatékonyan alkalmazható.

A HIV-1 replikáció gátlás detektálása immunvizsgálatokban monoklonális vagy poliklonális antitestek alkalmazásával is történhet. Bizonyos immunovizsgálatok arra is alkalmazhatók, hogy a találmány szerinti xantinszármazékok in vitro és in vivő kísérletekben mutatott hatékonyságát vizsgáljuk. A kísérletben kompetitív enzimkapcsolt immunoszorbens vizsgálatot (ELISA) és antigén befogás vizsgálatot végzünk.

A HIV-1 replikáció gátlás kimutatására a polimeráz láncreakciót (polymerase chain reaction = PCR) is alkalmazhatjuk, amelyet a humán retrovírus kis régiók, például RT vagy gag régiók in vitro enzimatikus sokszorosításával végzünk. Mivel az RT-t kódoló nukleotid szekvencia a humán retrovírusokban ismert, ez az információ alkalmazható a 2030 bázisú oligonukleotidok szintetizálására, amelyeket a PCR-ben DNS szintézisben primerként alkalmazhatunk. A vizsgált sejtekből származó DNS-t az négy nukleozidtrifoszfát, hőstabil DNS-függő DNS-polimeráz és megfelelő puffer jelenlétében a primer oligonukleotidokhoz adhatjuk. A reakcióelegyet ezután a hagyományos háromlépcsős sokszorosítási eljárásban alkalmazhatjuk, ami DNS denatu

-12rálásából, a printereknek a kapott egyszálú DNS-hez történő olvasztásából, és a primerek többszörös célszekvenciává való sokszorosításából áll. A célzott DNS mindegyik ciklusban megkétszereződik, ami a célzott szekvencia geometriai kiterjesztését eredményezi.

A megsokszorozott termékek mennyiségét számos eljárással mérhetjük. Primer párok esetén, ahol a normál mintákban a DNS szintézis minimális, szubsztrátumként radioaktívan jelzett nukleozid-trifoszfátokat alkalmazhatunk, és a sokszorosított termék savas kicsapatását végezhetjük, és a termék elemzése folyadék szcintillációs számlálóval történhet. Ha egy adott primer pár esetén a normál DNS jellemző mértékű szintézise következik be, a termék kis léptékben frakcionálható, és az egyes sávok denzitométer segítségével kiértékelhetők. A sokszorosított terméket un. spot-blot vagy Southern-blot elemzésnek is alávethetjük, és a hibridizált detektor mennyiségét mérjük.

A találmány szerinti eljárásban retrovírus replikáció gátlására alkalmazott xantinszármazékok hatásosságát úgy is vizsgálhatjuk, hogy normál perifériás mononukleáris vérsejteket vagy a vírus által megtámadott egyéb sejteket tenyésztünk. A fertőzési vizsgálathoz szabad vírusokat vagy vírusfertőzött sejteket alkalmazunk, amelyeket érzékeny indikátor sejttel együtt tenyésztünk. A vírus a fogadó indikátor sejtben replikálódik. A xantin jelenlétében és hiányában mért vírus replikáció összehasonlításával a xantin HÍV elleni hatását igazolhatjuk.

A találmány szerinti xantinszármazékok retrovírus

< *·

C 4 • »·· · • ♦ · · *··· ·· ··«·

-13replikációgátló hatását úgy is vizsgálhatjuk, hogy a virustermelést vizsgáljuk elektronmikroszkóppal kimutatva a vírusrészecskéket, valamint az RT-től eltérő különböző virális fehérjék jelenlétével. A vírusproteinek kimutatására szolgáló különböző kimutatási eljárásokban standard antitesteket alkalmaznak, amelyek különböző emlős állatokban a vírus ellen képződnek. Az immunofluoreszcenciával a vírusfehérjék gyorsan kimutathatók, és így érzékeny hiperimmun szérum állítható elő. A radioimmun és ELISA vizsgálatok is alkalmazhatók a vírus fehérjék jelenlétének kompetitív módon való kimutatására; a vizsgálatban radioaktívan jelzett vagy kolorimnetriásan azonosítható antigénantitest-rendszert reaktív antigén hozzáadásával perturbálható.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott xantinszármazék hatékonyságát úgy is vizsgálhatjuk, hogy mérjük a nem integrált és integrált virális DNS-t és virális mRNS-t. [Natúré, 312. 166-169 (1984)]. Egy ilyen tipikus vizsgálatban úgy járunk el, hogy a sejteket sejtenként sok vírus részecske jelenlétében sejtmentes vironok hatásának tesszük ki, és az adott xantinszármazékok jelenlétében vagy anélkül tenyésztjük. A nagy molekulatömegű DNS-t megfelelő időnként kivonjuk, és radioaktívan jelzett HIV-próbával mérjük az extraktumok virális DNS-tartalmát. Ha a tenyészközeg xantinszármazékot nem tartalmaz, virális DNS detektálható. Ezzel szemben a xantinszármazékokkal teljesen védett DNS sejtek esetén sem integrált sem integrálatlan DNS nem detektálható.

-14.·· · f* · «· * · · · » · · • *·· · ·· ·♦< ··* ♦<· ···· ·*ί* ·®»’

A vírust tartalmazó sejtek és szövetek relatív virális DNS- és RNS-tartalma Southern- és Northern-blot hibridizációs eljárással mérhető. [Science, 227, 177-182 (1985)]. Molekulárisán klórozott, jelzett provirális DNS alkalmalmazásával az integrált provirushoz próba szerkeszthető, majd DNS transzfer kísérlettel meghatározható, hogy a celluláris DNS-be hibridizálással integrálódott-e provirális genom. Ha a provírust csak néhány sejt tartalmazza, in situ hibridizálás végezhető. Az ismertetett eljárások alkalmazhatók arra, hogy igazoljuk a xantinszármazékok retrovírus replikációra kifejtett hatását.

A vírus replikációt úgy is vizsgálhatjuk, hogy meghatározzuk, hogy a vírus hatásának kitett, és xantinszármazékokkal vagy anélkül tenyésztett cél T-sejtekben a virális RNS kifejeződik-e. Ebben a kísérletben a sejteket HÍV hatásának tesszük ki, és a sejtekből extraháljuk az RNS-t. Az extrahált RNS virális mRNS-tartalmát azután egy radioaktívan jelzett HÍV antiszensz RNS-próba alkalmazásával Northern-blot hibridizációs vizsgálattal határozzuk meg. [Science, 227. 177-182 (1985)]. Az inhibitor hiányában virális mRNS detektálható. Ha a tenyészetet hosszú ideig xantinszármazék jelenlétében tartjuk fenn, a sejtekben virális RNS kifejezés nem vagy csak kis mértékben mutatható ki. Ez a vizsgáló rendszer lehetővé teszi, hogy meghatározzuk a xantinszármazékoknak a HÍV nukleotid szintézist és a vírus hatásának kitett T-sejtekben az mRNS kifejezését gátló kapacitását.

Ezen túlmenően a HIV-l-fertőzött MT2 és MT4 sejtvona-15lak érzékenyek a vírus citopatikus hatására, ezért ezek a sejtek a xantinszármazékok HIV-fertőzésre vagy szaporodásra kifejtett gátló hatásának bemutatására alkalmas tarfoltképző kísérletekben is használhatók. [Science, 229, 563-566 (1985)].

A xantinszármazékok HIV-fertőzésre vagy -szaporodásra kifejtett gátló hatását olyan in vitro kísérlettel is bemutathatjuk, amelyben a hatóanyagok virális p24 gag fehérje H9 sejtekben való kifejezését gátló hatását vizsgáljuk, ahol a H9 sejtek részben ellenállnak a HÍV citopatikus hatásának. [M. Popovic és munkatársai, Science, 224 , 497500 (1984)]. A HÍV elleni hatást úgy is bemutathatjuk, hogy a xantinszármzékok HÍV citopatikus hatására kifejtett gátló hatását igazoljuk. [M. Hiroaki és munkatársai, Science, 240. 640-649 (1988)].

Végül a xantinszármazékok hatását a normál T-sejteken in vitro is bemutathatjuk. Ebben a vizsgálatban a xantinszármazékok antigén-indukált szaporodás válaszra kifejtett hatásának vizsgálatára normál klónozott helper-indukáló Tsejteket, mint például normál tetanusz-toxoidra specifikus helper/indukáló klónozott T-sejteket (TMII sejtek) alkalmazunk. Az eljárás részletes ismertetését megtaláljuk a H. Mitsuya és munkatársai, Science, 240. 646-649 (1988) irodalmi helyen.

A xantinszármazékok HIV-fertőzésre vagy -replikációra kifejtett megelőző vagy gátló hatása csimpánzzal vagy humán immunrendszersejtekkel ellátott kiméra SCID egerekkel in vivő igazolható. Ezekkel a főemlősökkel ismétlődő HÍV

-16fertőzés bemutatható, bár az AIDS-hez hasonló betegségek nem mutatkoznak. A xantinszármazékok hatékonysága igazolható a kezelt és kezeletlen csimpánzok HÍV antigén szerokonverzlójának összehasonlításával, a fertőző vírus állatokból való reizolálásával, kimutatható limfadenopátiával, a T4 vagy T8 limfocita szintek változásaival vagy a fenti eljárások kombinálásával.

A kísérletek elvégzéséhez szükséges HIV-t ismert eljárásokkal, ismert forrásokból nyerjük. Például úgy, hogy a perifériás vérből, csontvelőből vagy betegek és donorok egyéb szöveteiből nyert mononukleáris sejteket mitogénnel (fitohemagglutinin-PHA) 48-72 órán át stimuláljuk, és Tsejt növekedési faktorral (TCGF) kiegészített tenyészközegben sejt tenyészetet készítünk. A vírust a következőképpen detektálhatjuk:

1. mérjük a felülúszó folyadék virális reverz transzkriptáz aktivitását;

2. a vírust friss normál humán T-limfocitákba (például köldökzsinór vérbe, felnőtt perifériás vérbe vagy csontvelő leukocitákba) vagy T-sejtvonalakba visszük át [M. Popovich és munkatársai, 224. 497 (1984)];

3. rögzített és szekcionált sejtek elektronmikroszkópos megfigyelésével; és

4. szeropozitív donorból nyert szérum alkalmazásával, közvetett immunfluoroeszcenciás vagy Western-blot eljárással mérjük az antigén kifejezést.

A víruspozitív sejtek kimutatását és a vírus izolátumok jellemzését és összehasonlítását HIV-specifikus

-17immunológiai reagensekkel és nukleinsav próbákkal végezzük. [F. Barre-Sinoussi és munkatársai, Science, 220. 868-871 (1983) R. C. Gallo és munkatársai, Science, 220. 865-867 (1983) ].

Számos sejtvonalat vizsgáltunk a HIV-1 fertőzés lehetséges célpontjaként. Ezek a sejtvonalak a xantinszármazékok fenti kísérletekben mutatott hatásának bemutatására szintén alkalmazhatók. Egy limfoid leukémiás felnőttből származó, HT-jelölésű, neoplasztikus aneuploid Tsejtvonal HTLV-III-fertőzésre érzékeny, A HT sejtek folyamatosan termelnek HTLV-III-t, miután a szülősejteket ismételten olyan koncentrőlt sejttenyészet folyadékoknak tettük ki, amelyet limfadenopatiás vagy AIDS-es betegből származó, rövid ideig tenyésztett T-sejtekről (TCGF-ben tenyésztett) nyertünk. Amikor a sejtszaporodás csökken, ez rendszerint a tenyészfolyadék alkalmazása után 10-20 nappal következik be, a tenyészetekhez friss (nem fertőzött) HT szülősejteket adunk. A HT sejtpopulációt a HIV-fogadás javítására, az állandó növekedés megőrzésére és a vírus folyamatos termelődésének biztosítására nagy mértékben klónozzuk. A sejttenyészetben számos ilyen klónozott HT sejtklónt tartunk fenn.

A HT-n kívül számos egyéb T- vagy pre-T-humán sejtvonal létezik, amelyek HIV-vel fertőzhetők és HIV-t termelnek. Ilyen például a H4, H9, HUT78, CEM, Molt3, TÍ7.4 [Gallo és munkatársai, 4 652 599 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadiami leírás]. Ezenkívül némelyik B-limfoblaszt sejtvonal is alkalmazható HIV-termelő HÍV

-18fertőzésre. [Montagnier és munkatársai, Science, 225, 63-66 (1984) ].

A fentiekben ismertetett eljárásokat példaként ismertettük a xantinszármazékok humán retrovírusok replikáciéjára kifejtett gátló hatásának vizsgálatára. A xantinszármazékok retrovírusok replikációjára kifejtett gátló hatásának vizsgálatára alkalmas speciális vizsgálatokat az alábbiakban ismertetjük.

Xantinszármazékok adagolása humán betegeknek

A találmány szerinti xantinszármazék vagy xantinszármazékok elegye gyógykezelésre szoruló humán betegnek az adott humán retrovírus replikációjának csökkentéséhez megfelelő mennyiségben adagolható. Alkalmazhatók xantinszármazék-elegyek is, azonban ezeknek nincs különösebb előnyük.

A xantinszármazékok és gyógyászatilag elfogadható sóik emlősöknek, köztük embernek tabletta, pirula, nagy tabletta, pasztilla, kapszula, végbélkúp, injektálható vagy emészthető folyadék alakban adagolhatók. A készítmények embernek és immunrendszer működési zavarokban szenvedő főemlős állatoknak egyaránt adagolhatók.

Az önmagukban is hatásos xantinszármazékokat például stabilitásuk, kristályosíthatóságuk és oldhatóságuk növelésére gyógyászatilag elfogadható addiciós sóalakban is kiszerelhetjük és alkalmazhatjuk. Előnyös gyógyászatilag elfogadható addiciós sók az ásványi savak, például sósav,

-19kénsav és salétromsav sói; monobázikus karbonsavsók, például ecetsav- és propionsavsók; dibázikus karbonsavsók, például maleinsav- és oxálsavsók; és tribázikus karbonsavsók, például karboxi-borostyánkősav- és citromsavsók.

A xantinszármazékokat adagolhatjuk szájon át, például valamilyen inért hígítóval vagy ehető hordozóval. Adagolhatjuk zselatin kapszulában, vagy tabletta alakban.

Szájon át való adagolás esetén a hatóanyagokat kötőanyagokkal társítjuk, és tabletta-, pirula-, kapszula-, elixir-, szuszpenzió-, szirup-, ostya- vagy rágógumialakban alkalmazzuk. A készítményeknek legalább 0,5 tömeg% hatóanyagot kell tartalmazniuk, de a mennyiség az adott készítménytől függően az egység 4,0-70,0 tömeg%-áig változhat. A készítmények xantintartalma annyi legyen, hogy megfelelő hatóanyagtartalmú adagot kapjunk.

A találmány szerinti szájon át alkalmazható készítmények egységenként előnyösen 1,0-400 mg hatóanyagot tartalmaznak.

A tabletta-, pirula-, kapszula-, pasztilla és egyéb készítmények a következő adalékokat tartalmazhatják: kötőanyagot, mint például mikrokristályos cellulózt, tragakantot vagy zselatint; ragasztószert, például keményítőt vagy laktózt; dezintegráló szert, például alginsavat, Primagelt vagy kukoricakeményítőt; csúsztatószert, például magnéziumsztearátot, Sterotest vagy kolloid sziliciumdioxidot; édesítőszert, például szacharózt vagy szacharint; és ízesítőszert, például Gormentát, metil-szalicitátot vagy narancsízt. Kapszula készítmény esetén az egység kapszula a

-20fenti anyagokon kívül valamilyen folyékony hordozót, például olajat is tartalmazhat.

Az egyéb adagolási egységek más fizikai megjelenést módosító adalékanygokat, például bevonatot tartalmazhatnak. A tabletták és pirulák bevonhatók például cukorral, Shellakkal vagy egyéb emészthető bevonattal. A szirupkészítmény a hatóanyag mellett tartalmazhat édesítő szerként szacharózt, valamint konzerváló szereket, festékeket, színezékeket és ízesítő szereket. A alkalmazott adalékanyagoknak gyógyszertisztaságúaknak és az alkalmazott mennyiségben nem mérgezőeknek kell lenniük.

A parenterális alkalmazásra, mint például intravénás vagy intramuszkuláris injektálásra szánt készítmények esetén a xantinszármazékot oldat- vagy szuszpenzióalakban kell kiszerelni. Ezeknek a készítményeknek legalább 0,1 tömeg/ /térfogat% fenti hatóanyagot kell tartalmazniuk, de a hatóanyagtartalom 0,5-50 tömeg/térfogat% között változhat. Az ilyen készítményeknek annyi hatóanyagot kell tartalmazniuk, hogy megfelelő egységadagokat kapjunk. A találmány szerinti parenterális készítmények egységadagonként előnyösen 0,5100 mg hatóanyagot tartalmaznak.

A xantinszármazékokat tartalmazó oldat vagy szuszpenzió készítmények a következő adalékanyagokat tartalmazhatják: steril higítószert, mint például injektálásra megfelelő vizet, sóoldatot, olajat, polietilén-glikolt, glicerint, polipropilént-glikolt vagy egyéb szintetikus oldószereket; baktériumelleni szereket, mint példáuk benzilalkoholt vagy metil-parabéneket; antioxidánsokat, mint

-21például aszkorbinsavat vagy nátrium-biszulfitot; kelátképző szert, mint például etilén-diamin-tetraecetsavat; puffereket, mint például acetátokat, cifrátokat; tonicitás beállító szereket, mint például nátrium-kloridot vagy dextrózt. A parenterális készítményeket ampullában, eldobható fecskendőkben vagy többszörös adagot tartalmazó üveg vagy műanyag fiolákban tarthatjuk.

Az alkalmazott dózis ugyan változhat, azonban jó eredményeket érhetünk el, ha a kezelésre szoruló betegnek szájon át való, parenterális vagy intravénás alkalmazáskor testtömeg kg-onként, naponta 0,1-25 mg hatóanyagot adunk. A napi dózis napont általában 10-5000 mg, előnyösen 16003200 kg.

Megjegyezzük azonban, hogy az alkalmazott dózis a kezelt személy egyedi igénye függvényében változik, és a kezelt személy szakmai felügyelete és a xantinszármazékok hatásának ellenőrzése elengedhetetlen.

Azt is megjegyezzük, hogy a xantinszármazékokat a retrovírus aktivitás gátlására alkalmazott egyéb kezelés előtt, után vagy azzal egyidejűleg alkalmazhatjuk. így például HÍV fertőzés esetén a xantinszármazékokkal együtt alkalmazhatunk például 3'-azido-2·,3'-didezoxi-timidint (AZT), 2',3'-didezoxi-citidint (ddC), 2',3'-didezoxiadenozint (ddA), 2¹,3'-didezoxi-inozint (ddl) vagy ezek kombinációit. A találmány szerinti xantinszármazékokat a didezoxi-nukelozid-származékok mellett egyéb hatóanyagokkal is kombinálhatjuk. Például a xantinszármazékokat kombinálhatjuk HPA 23-mal, foszfonoformáttal (foszkarnet), ribavi

-22rinnel és rifobutinnal. Ehhez hasonlóan a találmány szerinti xantinszármazékokat kombinálhatjuk valamilyen kolónia stimuláló faktorral, mint például granulocita kolónia stimuláló faktorral (G-CSF), granulofág kolónia stimuláló faktorral (GM-CSF) vagy ezek kombinácóival. A találmány szerinti xantinszármazékokat kombinálhatjuk még egyéb gyógyszer hatóanygokkal, mint például aciklovirrel, α-interferonnal, adott esetben didezoxi-nukleoziddal, mint például AZT-vel. A találmány szerinti vírus elleni kezelést is kombinálhatjuk egyéb, a kezelendő egyed immunrendszerének erősítésére alkalmas eljárással. Például a humán immunstimulálást vagy immunrendszer helyreállítást csontvelő átültetéssel, ampligen gyógyszerrel vagy interleukin-2 alkalmazásával is elérhetjük. Emellett a xantinszármazékokat egyéb kombinációs gyógykezeléssel, mint például AZT-ampligen, ddC vagy GM-CSF kombinációval is alkalmazhatjuk.

A HIV-fertőzés ellen alkalmazott xantinszármazékokat peptidekkel is kombinálhatjuk.

A találmány szerinti eljárást humán betegek retrovírus fertőzés elleni vagy az ilyen fertőzés elterjedése elleni kezelésére alkalmas. A találmány szerinti eljárás a retrovírus szaporodás megakadályozásával lehetővé teszi a beteg kondíciójának és közérzetnek javítását. A betegek túlélési valószínűsége is megnő.

-23Αζ (I) általános képletű xantinszármazékok ismertetése és előállítási eljárása

A találmány szerinti xantinszármazékok az (I) általános képlettel jellemezhetők, amelyben

R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül 2-6 szénatomos, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, ciklohexil-, alkoxi-alkil- vagy hidroxi-alkil-csoport; és

A jelentése adott esetben metilcsoporttal helyettesített legfeljebb 4 szénatomos szénhidrogéncsoport.

Az (I) általános képletű vegyületek közül különösen előnyös HIV-1 reverz transzkriptáz hatást gátló hatóanyag az 1,3-dibutil-7-(2-oxo-propil)-xantin. Ez a leírásunkban DBOPX” rövidítéssel is jelölt vegyület a (III) képlettel jellemezhető. A (III) képletű hatóanyag retrovirális hatást gátló tulajdonsága bizonyítható.

A találmány szerinti xantinszármazékok közül ugyan a DBOPX különösen előnyös haóanyag, azonban számos egyéb ilyen vegyület is hatásosan alkalmazható. Az (I) általános képletű xantinszármazékok például egyéb alkil-, alkoxivagy hidroxi-alkil-csoportokkal is helyettesítve lehetnek. Megfelelő alkilesöpörtök az egyenes vagy elágazó láncú ilyen csoportok, mint például etil-, propil-, izopropil-, butil-, szek-butil-, terc-butil-, amil- vagy hexilcsoport. Alkoxi-helyettesített alkilcsoportok lehetnek a 2-6 szén

-24atomos, egyenes vagy elágazó láncú ilyen csoportok, mint például metoxi-metil-, amiloxi-metil-, metoxi-etil-, butoxi-etil- és propoxi-propil-csoportok. Hidroxi-alkilcsoportok lehetnek 1-6 szénatomos ilyen csoportot, mint például hidroxi-metil-, hidroxi-etil-, hidroxi-propilvagy hidroxi-hexil-csoport.

Az (I) általános képletű vegyület A szubsztituensét képező szénhidrogéncsoportok kétértékű telített alifás szénhidrogéncsoportok, amelyek a karbonilcsoporttal szomszédos szénatomon adott esetben metilcsoporttal helyettesítettek; ilyen csoport például a metilén-, etilén-, trimetilén- és tetrametiléncsoport; és ilyen metilcsoporttal helyettesített csoport például az etilidin-, 1,2propilén- és 1,3-butiléncsoport.

Megjegyezzük, hogy a találmány tárgyát képezik az olyan (I) áltlalános képletű hatóanyagok is, amelyek in vivő valamilyen fentiekben ismertetett (I) általános képletű hatóanyaggá vagy megfelelő metabolitjává alakulnak át.

A találmány szerinti xantinszármazékokat ismert eljárásokkal állíthatjuk elő. Az előállítást végezhetjük például úgy, hogy megfelelően helyettesített (Illa) általános képletű 1,3-dialkil-xantint - a képletben Rj és R₂ jelentése azonos a fentiekben meghatározottakkal - emelt hőmérsékleten, adott esetben oldószer jelenlétében olyan (IV) általános képletű a B-telítetlen metil-ketonnal reagáltatunk, amelyben R jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport. A reakció lejátszatása alkalikus közegben történhet.

Egy másik eljárás szerint úgy járunk el, hogy (II)

általános képletű 1,3-dialkil-xantin-származék-alkálifémsót - a képletben Rj és R₂ jelentése azonos a fentiekben meghatározottakkal - olyan (V) általános képletű oxoalkilhalogeniddel reagáltatunk, amelyben A jelentése azonos a fentiekben meghatározottakkal, és Hal jelentése halogénatom, előnyösen klór- vagy brómatom.

A reakciók kivitelezését előnyösen 40-80 °C-on, adott esetben megnövelt vagy csökkentett nyomáson, többnyire azonban atmoszférikus nyomáson végezzük. A kiindulási vegyületeket sztöchiometrikus arányban vagy feleslegben alkalmazzuk. Az alkalmazott alkálifémsót elkészíthetjük előre vagy a reakció folyamán.

Megfelelő reakcióoldószerek a vízzel elegyedő oldószerek, mint például rövid szénláncú alkoholok, például metanol, propanol és különböző butanolok; aceton; piridin; trietil-amin; polihidroxi-alkoholok, mint például etilénglikol és etilén-glikol-monometil- vagy monoétil-éter.

Az (I) általános képletű hatóanyagok közismertek vázizomzat vérellátását fokozó hatásukról és alacsony toxicitásukról. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott ilyen hatóanyagok közül a legelőnyösebb az 1,3-dibutil-7(2-oxopropil)-xantin, más néven DBPOX.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott vegyületek és előállítási eljárásuk részletes ismertetése a 4 242 345 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban található.

< · ·

A (II) általános képletű xantinszármazékok és előállítási eljárásuk ismertetése

A humán retrovírus aktivitás gátlását olyan (II) általános képletű vegyületek alkalmazásával is elérhetjük, amelyekben az R_x és R3 szubsztituensek legalább egyikének jelentése

a) tercier alkohol funkciójú (a) általános képletű csoport, amelyben

R4 jelentése 1-3 szénatomos alkilcsoport;

n értéke 2-5 egész szám; és a másik jelentése adott esetben hidrogénatom vagy egy legfeljebb 6 szénatomos, legfeljebb két oxigénatommal megszakított vagy adott esetben hidroxil- vagy oxocsoporttal helyettesített R5 alifás szénhidrogén-csoport; vagy

b) (b) általános képletű oxo-alkil-csoport, amelyben

Rg jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport; és p értéke 2, 3 vagy 4; és a másik jelentése azonos a fentiekben meghatározottakkal; és r₂ jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport.

A (II) általános képletű hatóanyagot a retrovírus aktivitás gátlásához elegendő mennyiségben alkalmazzuk. Ezek közül a hatóanyagok közül kereskedelmi termék a pentoxifillin (Trental) nevű hatóanyag. A humán retrovírus aktiví-

tásának gátlására alkalmas (II) általános képletű egyéb vegyületeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

Retrovírus aktivitás gátlására alkalmas (II) általános képletű vegyületek

Hatóanyag szám	*1	*2	«3
2	(bl)	metilcsoport	propilcsoport
3	(al)	metilcsoport	etoxi-metil-csoport
4	(al)	metilcsoport	metoxi-etoxi-etil-csoport
5	(al)	metilcsoport	hidrogénatom
6	(al)	metilcsoport	propilcsoport
7	(al)	metilcsoport	2-hidroxi-propil-csoport
8	(al)	metilcsoport	2-hidroxi-izobutil- -csoport
9	(al)	etilcsoport	metoxi-etil-csoport
10	(al)	metilcsoport	(al)
11	(al)	metilcsoport	metoxi-etil-csoport

A fentiekben ismertetett vgeyületek közül a 11. számú 7etoxi-metil-1- (5-hidroxi-5-metil-hexil) -3-metil-xantin is előnyös találmány szerinti hatóanyag.

Megjegyezzük, hogy a találmány tárgyát képezik az olyan (II) általános képletű hatóanyagok is, amelyek in vivő valamilyen fentiekben ismertetett (II) általános képletű hatóanyaggá vagy megfelelő metabolitjává alakulnak át.

-28·· t «·«·· • · · * Λ ·· • · ·« « ♦ ·» W· • · · I ··«·»«· ♦ · · · · « · t> «· »· ·

A pentoxifillin például a szájon át való adagolása után majdnem teljes egészében metabolizálódik. A metabolitok elsődleges kiválasztásául szolgáló emberi vizeletben a következő hét metabolitot azonosították:

I. métábólit

II. métábólit

III. métábólit

IV. métábólit

V. metabolit

VI. metabolit

VII. metabolit

1-(5-hidroxi-hexil)-3,7-dimetil-xantin

1-(5,6-dihidroxi-hexil)-3,7-dimetil-xantin

1- (4,5-dihidroxi-hexil)-3,7-dimetil-xantin

1-(4-karboxi-butil)-3,7-dimetil-xantin

1-(3-karboxi-propil)-3,7-dimetil-xantin l-(5-oxohexil)-3-metil-xantin

1-(5-hidroxi-hexil)-3-metil-xantin

Ezek közül az I. és V. metabolit a legfontosabb. Az V. metabolit, a legfontosabb vizelet metabolit, az adagolt dózis 50-60 %—át alkotja. Pentoxifillint és I. metabolitot a vizelet csak nyomokban tartalmaz. A pentoxifillin-dihidroxi-származékok (II. és III. metabolit) a kiválasztott termékek 12 %-át, és a IV. metabolit körülbelül 8 %-át alkotja.

A (II) általános képletű vegyületet a 3 737 433 számú amerikai egyesült államokbeli és a 831 051 számú belga szabadalmi leírás szerint (R1/R3 jelentése oxoalkil-csoport) állítjuk elő. Abban az esetben, ha R1/R3 jelentése tercier-alkohol-csoport az előállítást a PCT/EP86/00401 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés szerinti módon végezzük. A fenti eljárások a találmány szerinti (II) általános képletű vegyületek előállítási változatait ismerte-29·· ♦ * * 9 *· • · · ♦ 4 4 · ⁹ 000 0 0 0 ·«· • · «0 ·»·« « · • ·* · ·· ···· · »» tik.

Az egyik előállítási változatban úgy járunk el, hogy

a) (VII) általános képletű 3-alkil-xantin-származákot

- a képletben R₃ jelentése legfeljebb 4 szénatomos alkilcsoport - olyan (VIII) általános képletű alkilező szerrel reagáltatunk, amelyben X jelentése halogénatom, előnyösen klór-, bróm- vagy jódatom vagy szulfonsav-észtercsoport vagy foszforsav-észtercsoport; és R4 jelentése és n értéke azonos a fentiekben meghatározottakkal, és így olyan (IX) általános képletű vegyületet kapunk, amelyben R₃ jelentése tercier-hidroxi-alkil-csoport és Rí jelentése hidrogénatom ; és a₃) az így kapott vegyületet a (VIII) általános képletű alkilező szerrel vagy egyéb alkilező szerrel alkilezzük, és így olyan (X) általános képletű találmány szerinti vegyületet kapunk, amelyben az Rí és R₃ jelentése egymástól függetlenül hidroxi-alkilcsoport; vagy a₂) (Xa) általános képletű vegyületet - a képletben X jelentése azonos a (VIII) általános képletű vegyületnél, és R5 jelentése azonos a fentiekben meghatározottakkal - (XI) általános képletű vegyületté alakítunk.

Az átalakítást mindkét esetben bázikus közegben végezzük, vagy a xantinszármazékokat sóalakban alkalmazzuk.

Egy másik eljárásban úgy járunk el, hogy

b) (XII) általános képletű 1,3-dialkil xantinszár-30- ·· · ♦· « ·· • · · · · « · « ··· · · · ··» • · · · ···· · ··»·· ·· ···· · <*· mazékot a 7-helyzetben, előnyösen bázikus közegben vagy sóalakban, egylépcsős reakcióban (VIII) általános képletű vegyülettel helyettesítünk, és így (XI) általános képletű vegyületet kapunk.

Egy következő eljárásban úgy járunk el, hogy

c) (VII) általános képletű 3-alkil-xantin-származékot a fentiekhez hasonlóan előnyösen bázikus közegben vagy sóalakban először (XIII) általános képletű vegyülettel reagáltatjuk, így olyan (XIV) általános képletű 3,7-dihelyettesített xantinszármazékot kapunk, amelyekben R15 jelentése azonos a fentiekben R5 esetén meghatározottakkal vagy benzil- vagy difenil-metil-csoport; majd az így kapott vegyületet az 1-helyzetben, előnyösen most is bázikus közegben vagy sóalakban (VIII) általános képletű vegyülettel helyettesítjük, és így olyan (XV) általános képletű vegyületet kapunk, amelyben R15 jelentése benzil- vagy difenil-metilcsoport; és olyan (XV) általános képletű vegyületet, amelyben R15 jelentése benzil- vagy dimetil-csoport vagy alkoxi-metil- vagy alkoxialkoxi-metil-csoport redukáló vagy hidrolikus körülmények között találmány szerinti (XVI) általános képletű vegyületté alakítunk át, amelyet azután, kívánság esetén (VIII) vagy (Xa) általános képletű vegyülettel reagáltatunk, és így a találmány szerinti (X) vagy (XV) általános képletű vegyületet kapjuk.

··» •e *· · ·· « ♦ · · · 'Λ Λ • ··· · · » * · · · ·«·· ··»< ·· ···« ·

-31Egy másik eljárásban

d) (XI) vagy (XV) általános képletű találmány szerinti vegyületet, amelyben R5 vagy R15 jelentése oxoalkil-csoport, hagyományos ketocsoport-redukálószerrel a megfelelő találmány szerinti hidroxi-alkilezett xantinszármazékká alakítunk át.

A kiindulási anyagként alkalmazott (VII), illetve (XII) általános képletű 3-alkil-, illetve 1,3-dialkil-xantinszármazékok és a (VIII), (Xa) és (XIII) általános képletű alkilező szerek ismert vegyületek, és előállításuk ismert eljárásokkal történhet. A (VIII) általános képletű tercier alkoholt például úgy állíthatjuk elő, hogy (XVII) általános képletű szférikusán nem gátolt halogén-ketonokat a karbonilcsoport reduktív alkilezése közben R4-M általános képletű alkil-fémvegyülettel, elsősorban magnézium-, cink- vagy lítium származékkal reagáltatunk. A reakciót lejátszathatjuk például a szokásos körülmények között R4-Mg-Hal általános képletű (Grignard) vegyülettel vagy R4-L1 általános képletű vegyülettel [ismertetését megtaláljuk például a Houben-Weyl, VI/1 kötet, 2. rész (1980) 928-40. oldalán, elsősorban a 1021. és 1104-1112. oldalon).

A halogén-ketonok (XVIII) általános képletű vegyületek metil-magnézium-halogenidekkel vagy metil-litium-halogenidekkel való reagáltatása is a fenti eredményhez vezet.

A (XVII) és (XVIII) általános képletű hidroxi-ketonok alkil-fémvegyületekkel egyszerű eljárással a megfelelő diolvegyületekké alakíthatók át. A reakciót lejátszathatjuk

-32közvetlenül vagy a hidroxicsoport ideiglenes átalakításával, például 5,6-dihidro-4H-piránnal való acetálképzéssel. [Az eljárás ismertetését megtaláljuk például a Houben-Weyl, Vl/la kötet. 2. rész (1980) 1113-1124. oldalán]. Az így kapott vegyületből a (VIII) általános képletű vegyületet a láncvégi primer hidroxilcsoport szulfonil- vagy foszforhalogeniddel vagy anhidridekkel, előnyösen bázikus közegben megvalósított szelektív észterezésével állítjuk elő.

A (VIII) általános képletű tercier-alkoholszármazékok előállítását úgy is végezhetjük, hogy uj-klór-l-bróm-alkán monomét il ez ésével uj-klór-alkil-fémvegyületet állítunk elő [Houben-Weyl, XIII/2 kötet (1973), 102. és 319. oldal], majd az így kapott vegyületet R4-CO-CH3 általános képletű ketonnal reagáltatjuk, és közben megfelelő hőmérséklet szabályozással ügyelünk arra, hogy az alkanolátból a fémsó kilépése mellett végbemenő gyűrűzáródással képződő intermedier melléktermék kialakulását visszaszorítsuk; vagy kiindulási anyagként tú-halogén-l-alkanol-vegyületeket a szokásos eljárással fémvegyületté alakítunk, előnyösen tetrahidropiranil-(2)-éter-alakú ilyen vegyületeket vagy a hidroxilcsoport kívánt alkil-fémvegyülettel alkanoláttá történt átalakításával [az eljárás ismertetését megtaláljuk például Houben-Weyl, XIII/2a kötet (1973) 113. oldalán]; az így kapott vegyületet R4-CO-CH3 általános képletű ketonnal reagáltatjuk, és így a fentiekben ismertetett diolvegyületet kapjuk [Houben-Weyl, VI/la kötet, 2. rész (1980) 1029. oldal]; és ezután a primer hidroxilcsoportot megfelelő szulfonsav- vagy foszforsavszármazékkal szelektív észtere

-33zésnek vetjük alá.

Az olyan (VIII) általános képletű vegyületet, amelyben R₄ jelentése metilcsoport, ügy is előállíthatjuk, hogy -halogén-alkánsav-alkil-észtert [Hal-(CH2)4-COO-alkil] két ekvivalens metil-fémvegyülettel reagáltatjuk, amelynek során a két metilcsoport beépülésével az észter a ketonvegyületen keresztül tercier-alkohollá alakul át [HoubenWeyl, Vl/la kötet, 2. rész (1980), 1171-1174. oldal]. Az ω -hidroxi-karbonsav-észter-vegyületek metil-fémvegyületekkel a hidroxilcsoport védelme nélkül vagy a hidroxilcsoport védelme mellett, például tetrahidropiranil-(2)- vagy metoxi-metil-észter-alakban vagy adott esetben lakton- vagy gyűrűs észteralakban is diolokká konvertálhatók. [HoubenWeyl, Vl/la kötet, 2. rész (1980), 1174-1179. oldal], és az így kapott vegyületekből a primer hidroxilcsoport szulfonsav- vagy foszforsav-halogeniddel vagy anhidriddel megvalósított szelektív észterezésével a (VIII) általános képletű aktív alkilező szert állíthatjuk elő.

A fentiekben ismertetett eljárással előállítható (VIII) általános képletű vegyületek jellemző képviselői a [ (cd ~1)-hidroxi-( uj-1)-metil]-butil-, -pentil, -hexil- és -heptil, [( uj-2)-hidroxi-( uj-2)-metil]-pentil-, -hexil-, -heptil és -oktil- és [ (uJ-3)-hidroxÍ7(vO-3)-metil]-hexil, -heptil-, -oktil- és -nonil-kloridok, bromidok, jodidok, szulfonátok és foszfátok.

A xantinváz 1- és 7- helyzetébe az Rg-szubsztituens beépítésére, valamint 7-helyzetébe az Ri5-szubsztituens beépítésére alkalmas R5-X (Xa), illetve R15-X általános

-34képletű vegyületek közül az alkoxi-metil- és alkoxialkoxi-metil-szármázékok különösen előnyösek, mert halogenidjeik valóban nagyon jó reagensek, de - elsősorban ipari méretű alkalmazásuk - toxikológiai problémákat vet fel. Emiatt előnyösebb a megfelelő szulfonátok alkalmazása; ezek a vegyületek például alifás-karbonsavanhidrid- és alifásvagy aromás-szulfonsav-elegyek [M.H. Karger és munkatársai; J. Org. Chem. 36, 528-531 (1971)] formaldehid-dialkil-acetátokkal vagy dialkoxi-acetátokkal történő reagáltatásával állíthatók elő [Μ. H. Karger és munkatársai, J. Amer. Chem. Soc. 91, 5663./5665. oldal (1969)] az 1. reakcióvázlat szerint egyszerűen és közel kvantitatív kitermeléssel.

Az 1. reakcióvázlaton R7 jelentése alifás szénhidrogén-csoport, mint például metil-, etil- vagy trifluormetil-csoport vagy aromás csoport, mint például fenil-,

4-tolil- vagy bróm-fenil-csoport, előnyösen metil- vagy

4-tolil-csoport; és Rg jelentése az R5 vagy R15 meghatározással felölelt csoportokkal azonos alkil- vagy alkoxialkil-csoport.

A reakciót lejászathatjuk magában az anyagban vagy a reagensekkel szemben inért, vízmentes, aprotikus oldószerben, -20°-(+40)°C, előnyösen 0-20 °C hőmérsékleten. A hidrolízisre és hőbomlásra érzékeny szulfonátokat nem szükséges elválasztani; ezeket előnyösen a xantinszármazékok nitrogénjére való helyettesítésre azonnal felhasználjuk, nem szükséges a szokásosan alkalmazott bázikus kondenzáló szer hozzáadása sem.

A (IX), (XVI), (VII), (VIII) vagy (Xa) vagy (XIII)

-35mono- vagy diszubsztituált xantinszármazékok reakcióját általában valamilyen, a reagensekkel szemben inért szétoszlató szerben vagy oldószerben játszatjuk le. Ilyen oldószerek például a dipoláros, aprotikus oldószerek, például formamid, dimetil-formamid, dimetil-acetamid, N-metil-pirrolidon, tetrametil-karbamid, hexametil-foszfor-triamid, dimetil-szulfoxid, aceton vagy butanon; valamint alkoholok, mint például metanol, etilén-glikol és ezek 1-4 szénatomos alkilcsoporttal alkotott, összesen legfeljebb 5 szénatomos mono- és dialkil-éterei, etanol, propanol, izopropanol és a különböző butanolok; szénhidrogének, mint például benzol, toluol vagy xilolok; halogénezett szénhidrogének, mint például diklór-metán vagy kloroform; piridin; vagy a felsorolt oldószerek elegyei vagy vízzel alkotott elegyei is alkalmazhatók.

Az alkilező reakció kivitelezését valamilyen bázikus kondenzáló szer jelenlétében célszerű végezni. Ilyen anygaként alkalmazhatunk alkálifém- vagy alkáliföldfémhidroxidokat, -karbonátokat, -hidrideket, alkoholátokat és szerves bázisokat, mint például trialkil-amin-vegyületeket, például trietil- vagy tributil-amint, kvaterner ammóniumvagy foszfónium-hidroxidokat és adott esetben helyettesített ammónium- vagy foszfóniumcsoportokat tartalmazó térhálósított gyantákat. A xantinszármazékokat az alkilezési reakcióban közvetlenül, külön előállított sóalakban, mint például alkálifém-, alkáliföldfém- vagy adott esetben helyettesített ammónium- vagy foszfóniumsó formában is alkalmazhatjuk. A mono- vagy diszubsztituált

-36xantinszármazékok alkilezését a fentiekben ismertetett szervetlen kondenzáló szerek jelenlétében vagy alkálifémvagy alkáliföldfémsó alakjukban un. fázistranszfer katalizátor, például tercier-amin, kvaterner ammónium- vagy foszfóniumsó vagy koronaéter jelenlétében, előnyösen fázistranszfer katalízisre megfelelő kétfázisú rendszerben végezzük. Fázistranszfer katalizátorként alkalmazhatunk kereskedelemben beszerezhető tetra(1-4’szénatomos alkil)- és metil-trimetil-ammónium- és -foszfóniumsókat, metil-, mirisztil-, fenil- és benzil-tri(l-4 szénatomos alkil)- és cetil-trimetil-ammónium-, valamint (1-12 szénatomos alkil)és benzil-trifenil-foszfóniumsókat, amelyek közül előnyösebbek a nagyobb és szimmetrikusabban elrendezett kationt tartalmazó vegyületek.

Az la, R5 és Rj_5 csoportok fentiekben ismertetett eljárásokkal való beépítését 0 °C-tól az alkalmazott reakcióközeg forráspontjáig terjedő hőmérsékleten, előnyösen 20-130 °C-on, adott esetben emelt vagy csökkentett nyomáson és 1 óránál kevesebbtől néhány óráig terjedő reakcióidő alatt végezzük.

A (X) általános képletű találmány szerinti vegyület (Vili) általános képletű 3-alkil-xantin-vegyületekből való előállításakor két tercier hidroxil-alkil-csoportot kell beépíteni. A xantinvázhoz rendre azonos vagy különböző szubsztituenst kapcsolhatunk, vagy egyetlen reakcióban elválasztás nélkül két azonos szubsztituenst építünk hozzá.

A benzil- és difenil-metil-csoportok (XV) általános képletű vegyületről való lehasítását és ezzel a xantin 7

-37helyzetű atomjának kialakítását az alkaloid- és peptidkémiában kifejlesztett, széleskörűen ismert védő eljárásokkal végezzük. A kémiai redukció, elsősorban a benzilvegyületek folyékony ammóniában nátriummal végzett reagáltatása mellett [Houben-Weyl, XI/1 kötet (1957), 964.975. oldal] a fentiekben ismertetett két aralkil-csoport eltávolítását katalitikus hidrogenolízissel, nemesfém katalizátorral is végezhetjük [Houben-Weyl, XI/1 kötet (1957), 968-971. oldal és IV/1C kötet, I. rész (1980), 400404. oldal]. Reakcióközegként általában rövid szénláncú alkoholokat (adott esetben hangyasav vagy ammónia hozzáadásával) vagy valamilyen aprotikus oldószert, mint például dimetil-formamidot vagy elsősorban jégecetet alkalmazunk, de az ismertetett oldószerek vizes elegyei is jól használhatók. Különösen jól alkalmazható hidrogénező katalizátor a palládiumkorom és aktívszenes vagy bárium-szulfátos palládium, míg az egyéb nemesfémek, mint például platina, ródium és ruténium alkalmazása a kompetitív gyűrűhidrogénezés következtében mellékreakciókhoz vezet, emiatt korlátozottan alkalmazható. A hidrogenolízist előnyösen 20-100 °C-on, atmoszférikus nyomáson vagy előnyösen legfeljebb 10⁴ Pa-ig terjedő, enyhe túlnyomáson, néhány perctől néhány óráig terjedő reakcióidéig végezzük.

Az olyan (XV) általános képletű 1,3,7-triszubsztituált-xantinszármazékok, amelyek az R15 helyzetben alkoximetil- vagy alkoxi-alkoxi-metil-csoportot tartalmaznak az Ο,Ν-acetálvegyületek képviselői. Ennek megfelelően a 7helyzetű szubsztituensek lehasítása a szokásos savas hidro

-38lízissel történhet [Houben-Weyl, Vl/Ib kötet (1984), 741745. oldal], amelynek eredményeként (XVI) általános képletű 7H vegyület képződik. Hidrolítikusan lehasítható előnyös csoport metoxi-, etoxi-, propoxi-metil, metoxi-etoxi- és etoxi-etoxi-metil-csoport. A reakció kivitelezését adott esetben egy oldat promotert, mint például jégecetet, dioxánt, tetrahidrofuránt vagy rövid szénláncú alkoholt tartalmazó híg ásványi savban, mint például sósavban vagy kénsavban való melegítéssel végezzük. Alkalmazhatunk perklórsavat vagy szerves savat, mint például katalitikus mennyiségű ásványi savat tartalmazó trifluor-ecetsavat, hangyasavat vagy ecetsavat is. Az alkoxi-alkoxi-metilvegyületek Lewis-savak, mint például cink-bromid vagy titán-tetraklorid vízmentes közegben, előnyösen diklórmetánban vagy kloroformban való alkalmazásával is hasíthatók, és a 7-bróm-metil- vagy 7-bróm-cink-származékok a vizes feldolgozás folyamán spontán hidrolizálódó intermedierként képződnek. Az ásványi savban végzett hasítás reakcióhőmérsékletét úgy kell megválasztani, hogy az 1helyzetben lévő tercier-hidroxi-alkil-csoport jelentős mértékű dehidratálódása ne forduljon elő; ezért ennek a hőmérsékletnek általában 100 °C alatt kell lennie.

A (XI) és (XV) általános képletű xantinszármazékok R5 és Rj5 helyzetben lévő oxo-alkil-csoportjának megfelelő hidroxil-alkil-vegyületté való redukciója bázikus fémekkel vagy katalitikus hidrogénezéssel történhet, a megfelelő eljárást azonban úgy kelll kiválasztani, hogy a reakció enyhe körülmények között, nagy hozammal és egyszerű fém • *

-39hidridekkel (MH_n), komplex fém-hidridekkel (M¹[M²H_n]_m vagy szerves fém-hidridekkel játszódjon le [Houben-Weyl, IV/ld kötet (1981), 267-282. oldal és Vl/lb kötet (1984) 141155. oldal]. A leggyakoribb ilyen a ketonredukcióban alkalmazott komplex fém-hidridek például litium-alanát, litiumbór-hidrid és elsősorban a nátrium-bró-hidrid, amely kisebb reakcióképessége miatt könnyebben kezelhető, és lehetővé teszi az alkoholos, alkoholos/vizes és tiszta vizes oldatokban vagy szuszpenziókban való feldolgozást. Reakcióközegként alkalmazhatunk még más, egyébként szokásosan inért oldószereket, például étereket, mint például dietil-étert, tetrahidrofuránt, 1,2-dimetoxi-etánt vagy szénhidrogéneket, piridint, nitrileket, mint például acetonitrilt is. A megfelelően 0 °C-tól az alkalmazott oldószer forráspontjáig terjedő hőmérsékleten, előnyösen szobahőmérsékleten eljátszatott reakció általában gyors, és néhány perctől néhány óráig terjdő idő alatt teljesen befejeződik.

A (II) általános képletű hidroxil-alkil-xantin-származékokat úgy is előállíthatjuk, hogy (XIX) általános képletű helyettesített xantinszármazékokat

e) amelyek az Rg és R^q helyzetben két egymástól független (XX) vagy (XXI) általános képletű csoportot vagy ezek egyikét és egy hidrogénatomot vagy az R5 vagy R15 csoportot tartalmaznak, a karbonilesöpört reduktív alkilezésére” (1-3 szénatomos alkil)- vagy metil-fémvegyülettel reagáltatunk, és így (IX)-(XVI) képletű találmány szerinti vegyületet kapunk; vagy

f) (XIX) általános képletű xantinvegyületet, amely • · · · · ♦ · · • · · · « · · • «·· * ·· ··· • · · · ««««« « ···· · · ··«« « «· két azonos vagy eltérő -(CH₂)n~^Hal általános képletű csoportot - a képletben Hal jelentése előnyösen klór- vagy brómatom - vagy csak egy ilyen csoportot és a másik helyzetben egy hidrogénatomot vagy R5 vagy R15 szubsztituenst tartalmaz, a zárócsoportnál fémvegyülettel reagáltatunk, majd a karbonilesöpört reduktív alkilezésére (XVIII/a) általános képletű ketonnal reagáltatjuk, és így (IX) - (XVI) általános képletű találmány szerinti vegyületet kapunk; vagy

g) (XIX) általános képletű xantinszármazékot, amely az Rg és/vagy Rjo helyzetben (XXIV) általános képletű csoportot és a másik helyzetben adott esetben hidrogénatomot vagy R5 vagy R15 csoportot tartalmaz, alkoxi-karbonilcsoportonként két ekvivalens metil-fém-vegyülettel olyan (IX)-(XVI) általános képletű xantinvegyületekké alakítunk át, amelyben R4 jelentése metilcsoport; vagy

h) (XIX) általános képletű xantinvegyületeket, amelyek az Rg és Rio helyzetekben két azonos vagy különböző (XXV) általános képletű csoportot vagy egy ilyen csoportot és egy hidrogénatomot vagy R5 vagy R15 csoportot tartalmaznak, és a (XXV) általános képletű csoportok a C=C kettős kötést adott esetben az elágazó szénatom izomer helyzetében is tartalmazhatják, ilyen például a -C=CH2 csoport, a Markownikoff-szabály szerint savkatalízises hidrogénezéssel (IX)-(XVI) találmány szerinti vegyületté alakítjuk át, és ezután, kívánság esetén az (Ib') általános képletű vegyületeket, ha a találmány szerinti e)-h) eljárással állítjuk elő, és az 1- vagy 7-helyzetben hidrogénatomot tartalmaz- • V ♦ · · • · · * ♦ » · • ··· « ·· ··· • · « · ····« · ···· · · · 4 · · « ««

-41nak, adott esetben bázikus közegben vagy sóalakban a (VIII) vagy (Xa) vagy (XIII) általános képletű triszubsztituált vegyületekké alakítjuk át, amelyekben R2, R4, R5 és ^r15 jelentése és n értéke azonos a fentiekben meghatározottakkal.

A kiindulási vegyületként szükséges (XIXa) általános képletű 3-alkilezett mono- vagy dioxo-alkil-vegyületek, (XlXb) általános képletű -(ui -halogén-alkil)-vegyületek, (XIXc) általános képletű -( uj~alkoxi-karbonil-alkil)vegyületek és (XlXd) általános képletű -alkenil-xantin-vegyületek ismertek vagy könnyen előállíthatók. Az előállításukat végezhetjük például (VII) általános képletű 3-alkilxantin-vegyületekből, (XVII) vagy (XVIII) általános képletű szulfonil-oxi- vagy halogén-keton-vegyületekből, uJ-halogénalkil-szulfonátokból vagy 1, tu-dihalogén-alkánokból [V. B. Kalcheva és munkatársai, Journal für prakt. Chemie 327, (1985), 165-168. oldal], vagy (XXV) általános képletű uj-szulfonil-oxi- vagy <v-halogén-karbonsav-alkil-észterekből vagy szulfonil-oxi- vagy halogén-alkánokból a (VIII) és (Xa) általános képletű vegyületekkel, a mono- és diszubsztituált xantinvegyületek előállítására fentiekben ismertetett eljárásokkal.

A (XIXa) és (XIXc) általános képletű, R9 és R^q csoportoknál funkcionalizált xantinszármazékok szerves fémvegyületekkel lejátszódó reakciója ugyanazon elveken alapszik, mint az alkilezőszerként használt (VIII) általános képletű tercier alkoholok előállítása. Ennek megfelelően a (XIXa) általános képletű ketonok és (XIXc) általános «« · « ··<· « * · ··« ♦ · · · «···· 9 • · · * < · ···· « «« -42képletű észterek reduktív alkilezése például alkil-kálium-, -nátrium-, -lítium-, -magnézium-, -cink-, -kadmium-, -alumínium- vagy -ónvegyülettel történhet. Mostanában javasolt alkil-titán- és -cirkóniumvegyületek [D. Seebach és munkatársai, Agnew, Chem. 95, 12-26. oldal (1983)] szintén alkalmazhatók. A nátrium- és kálium-alkil-fémvegyületek azonban a nagy reakcióképességük miatt mellékreakciókra hajlamosak, a cink- és kadmiumvegyületek pedig viszonylag lassúak, ezért általában előnyös az alkil-litium- és -magnéziumvegyületek (Grignard-vegyületek) alkalmazása.

Az erősen nukleofil szerves fémvegyületek hidrolízisre és oxidációra nagyon érzékenyek. Emiatt biztonságos kezelésük vízmentes közegben, adott esetben inért gáz atmoszférában történik. Oldószerként vagy szétoszlató szerként általában az alkil-fémvegyületek előállításánál szokásos anyagokat alkalmazzuk. Gyakorlatilag jól alkalmazhatók az egy vagy több éteres oxigénatomot tartalmazó éterek, például dietil-, dipropil-, dibutil- vagy diizoamiléter, 1,2-dimetoxi-etán, tetrahidrofurán, dioxán, tetrahidropirán, furán és anizol, és az alifás vagy aromás szénhidrogének, mint például petroléter, ciklohexán, benzol, toluol, xilox, dietil-benzolok és tetrahidronaftalin; továbbá a tercier aminok, mint például trietil-amin vagy dipoláris aprotikus oldószerek, mint például hexametil-foszfor-triamid, valamint a felsorolt oldószerek elegyei. A (XIXa) és (XIXc) általános képletű karbonilvegyületek R4~MgHal általános képletű Grignard-vegyületekkel lejátszódó reakcióját előnyösen úgy folytatjuk el, hogy a szerves fémvegyü-43letet éterbe tesszük, és a ketont vagy észtert diklór-metános vagy 1,2-diklór-metános oldatalakban csepegtetjük hozzá. Gyakran javasolnak magnézium-bromid hozzáadását is; ez a vegyület résztvesz a komplex ciklikus átmeneti állapotában és növeli a szerves fémvegyület nukleofil jellegét.

A keton vagy észter és a szerves fémvegyület reagáltatását -20 °C-tól 100 °C-ig, előnyösen 0 °C-től 60 °C-ig terjedő hőmérsékleten, vagy külső hűtés nélkül szobahőmérsékleten, enyhe alkil-fémvegyület felesleg mellett végezzük. A reakció befejezését általában rövid ideig tartó visszafolyató hütő alatt történő melegítéssel végezzük. A visszafolyatás mellett megvalósított melegítés ideje néhány perctől néhány órán át terjedhet. A képződött alkanolát előnyösen vizes ammónium-klorid oldattal vagy híg ecetsav oldattal bontható el.

A (XlXb) általános képletű uj-halogén-alkil-xantin-vegyületek fémvegyületté való átalakítására elsődlegesen alkalmas vegyület a fémmagnézium és -lítium. A halogénatom litiumatommal való helyettesítésében alsóbb rendű szerepet játszanak a következő szerves litiumreagensek: 1-butil-, 2butil-, terc-butil- vagy fenil-litium. A Grignard-vergyületek azonban, amelyeket előnyösen éterekben, szénhidrogénekben, tercier aminokban vagy aprotikus oldószerekben állítunk elő, nagyon jól alkalmazhatók a (XIXa) és (XIXc) általános képletű xantinvegyületek alkil-fémvegyületekkel való reakciójában. Ez a reakció 25-125 °C-on, előnyösen 100 °C alatt játszódik le. Ha fémvegyületekké való átalakítást szénhidrogénekben játszatjuk le, valamilyen éter, mint

-44például tetrahidrofurán vagy tercier amin, mint például trietil-amin sztöchiomterikus mennyiségben való hozzáadása gyakran hasznosnak bizonyul. A reakció elősegítésére katalizátort, mint például butanolt, aluminium-kloridot, szilicium-tetrakloridot, tetraklór-metánt és alumíniumvagy magnézium-alkoholátokat alkalmazhatunk. A halogén-fém cserereakcióban a kloridok általában sokkal lassabban reagálnak, mint a bromidok vagy jodidok, de rendszerint a legjobb szerves fémvegyület hozamot eredményezzék. A reakcióbeindulás gyorsítására valamennyi magnézium-bromid, néhány szem jód vagy néhány csepp bróm, tetraklór-metán vagy metil-jodid és enyhe melegítés alkalmazható. A kapott Grignard-vegyületeket elválasztás nélkül, azonnal reagáltatjuk a (XXIII) általános képletű ketonnal. Az alkalmazott reakciókörülmények a (XIXa) és (XIXc) általános képletű xantinvegyületek reduktív alkilezésének fentiekben ismertetett körülményeivel azonosak.

Ha egy (XXV) általános képletű szerkezeti elemet tartalmazó (XlXd) alkenil-xantin-vegyülethez vizet adunk, a hidroxilesöpört a Markownikoff-szabály szerint a kevesebb hidrogént tartalmazó szénatomhoz kapcsolódik. Ez a folyamat vizes oldatban vagy szuszpenzióban, erős savak, mint például kénsav, salétromsav vagy foszforsav jelenlétében játszódik le. Katalizátorként alkalmazhatunk hidrogén-halogenideket és szulfonsavat, mint például trifluor-metánszulfonsavat, savas ion cserélő gyantákat, bró-trifluoridkomplexeket vagy oxálsavat. A reakció lejátszatása előnyösen 50-60 térfogat%-os kénsavas oldatban 0-10 °C-on

-45történik, azonban ettől eltérő savkoncentrációt és hőmérsékletet is alkalmazhatunk. Mindenesetre a reakcióhőmérsékletet a lehető legalacsonyabb értéken kell tartani, mert az olefin - 60 C° fölötti hőmérsékleten jellegzetesen bekövetkező - fordított dehidratációja zavaró lehet.

Némelykor előnyös lehet, ha a savhoz inért oldószert, mint például 1,4-dioxánt benzolt vagy toluolt adunk. Mivel az észterek a savval katalizált hidrolízisben, különösen nagy savkoncentráció mellett intermedierképzésre hajlamosak, az észter hidrolízis elősegítésére a reakcióélegyet a savval való érintkezés után, rövid idejű melegítés mellett nagy mennyiségű vízzel kezeljük, vagy az elegyet alkalikus közegben dolgozzuk tovább.

A (IX) vagy (XVI) általános képletű 1- vagy 7H-vegyületek (X) vagy (XV) általános képletű triszubsztituált xantinvegyületekké történő konverzióját, amely a (XIII) általános képletű vegyületek (VIII) általános képletű vegyületekkel megvalósított N-alkilezésével megy végbe, a fentiekben részletesen ismertettük.

A (II) általános képletű tercier-hidroxi-alkil-xantinvegyületek az R4 alkilcsoport lánchosszúságától (legalább 2 szénatomos) és/vagy az R5 szubsztituens szerkezetétől (például 2-hidroxi-propil) függően egy vagy több aszimetrikus szénatomot tartalmazhatnak, ezért sztereoizomer alakban lehetnek jelen. Ennek következtében a tiszta sztereoizomerek és elegyeik is a találmány tárgyát képezik.

A következő példákat a találmány részletesebb ismertetésére mutatjuk be.

-46A találmány szerinti eljárás hatásosságának vizsgálatát a (II) általános képletű vegyületek retrovirus aktivitás gátlásának in vitro vizsgálatával végeztük. A (I) és (II) általános képletű vegyületek közül számos vegyület bizonyult hatásosnak, a példákban azonban a találmány szerinti előnyös pentoxifillint alkalmaztuk.

1. példa % borjú embriószériummal, penicillinnel, sztreptomicinnel és L-glutaminnal kiegészített RPMI-1640 tenyészközegben humán Jurkat sejteket (CD4⁺ T-sejt limfoma vonal) tenyésztettünk. A Jurkat sejtekben HIV-l-et állítottunk elő. A logfázisú növekedés alatt sejtmentes felülúszót gyűjtöttünk, megvizsgáltuk RT-aktivitását [Dagon és munkatársai, Cell 44, 941-947 (1986)] és alikvot adagokban, -70 °C-on a felhasználásig fagyasztva tároltuk. A Jurkat sejteket különböző koncentrációjú pentoxifilinnel 4 óra hosszat előkezeltük, majd a tenyészetekhez HIV-l-t adtunk (10⁴ cpm RT aktivitás-egységenként). A sejteket 7 napig a megfelelő koncentrációjú pentoxifillinben tartottuk és ekkor megmértük a sejtmentes felülúszó RT-aktivítását.

Ezzel párhuzamosan mértük a nem fertőzött, 7 napig különböző koncentrációjú pentoxifillinben tartott Jurkat sejtek életképességét. A mérést tripánkék foltvizsgálattal végeztük. A kapott eredményeket a kontroll %-ában kifejezve a következőkben foglaljuk össze:

Pentoxifillin rmikromoll	Reverz transzkriptáz rkontroll%l
0	100
50	84,6
100	72,9
500	69,5
1000	55,0

A sejtek életképessége a 7 napos pentoxifilinnes hatás után >95 %.

A pentoxifillin, amint azt a reverz transzkriptáz aktivitás (a HIV-1 replikációjának egyik jele) csökkenés mutatja a HIV-vel fertőzött Jurkat sejtekben csökkentette a HIV-1 replikációját.

2. példa

Normál HIV-1 szeronegatív egyedekből nyert vér FicollHypaque gradiens centrifuágálásával humán perifériális vér mononukleáris sejteket (PBM) állítottunk elő. A PBM-t 20 % borjú embriószérummal, penicillinnel, sztreptomicinnel és L-glutaminnal kiegészített RPMI-1640 tenyészközegben tenyésztettük. A sejteket egy éjszakán át 15 gg/ml konkanavalin A-val stimuláltuk, majd a kísérlet időtartama alatt 10 egység/ml interleukin-2 (IL-2) oldatban tartottuk. A pentoxifillin által PBM-ben a HIV-1 replikációjára kifejtett gátló hatás vizsgálatához a PBM-t különböző koncentrációjú pentoxifillinnel előkezeltük 4 óra hosszat, majd a tenyészethez HIV-l-t adtunk (10⁴ cpm RT aktivitás

-48egységenként). 7 napig a megfelelő koncentrációjú pentoxifillinben tartottuk, és ekkor megmértük a sejtmentes felülúszó RT-aktivítását. Ezzel párhuzamosan mértük a nem fertőzött, 7 napig különböző koncentrációjú pentoxifillinben tartott PBM-en a citotoxicitást. A mérést tripánkék foltvizsgálattal végeztük. A kapott eredményeket a kontroll %-ában a köveetkezőkben foglaljuk össze:

Pentox i f i11in Tmikromoll	Reverz transzkriptáz Γkontroll %1	Életképesség íkontroll %1
0	100	100
25	72,5	ND
50	72,9	93,5
250	30,0	ND
500	22,7	84,8
1000	18,6	50,0

ND: nem határoztuk meg

A pentoxifillin, amint azt a reverz transzkriptáz aktivitás mutatja, a HIV-l-gyel fertőzött perifériás vér mononukleáris sejtekben csökkentette a HIV-1 replikációját.

3. példa

A HIV-1 LTR közvetítési! gén- kifejezés leszabályozására [Felber BK, Pavlakis GN. Science 239, 184-187 (1988)] U38 sejteket 10 ng/ml forobol-12-mirisztát-13-acetát (PMA) jelenlétében és anélkül tenyésztettünk. Az U38 sejteket az U937

-49monocita humán sejtvonalból nyertük; ezek a sejtek a kloramfenikol-acetil-transzferáz (CAT) génhez ligáit HIV-1 LTR integrált másolatokat tartalmaztak. A sejteket Dr. Barbara Felber intézetéből (National Cancer Institute, Frederich, Maryland, USA) kaptuk. A sejteket két óra múlva egyszer átmostuk foszfátpufferolt sóoldatban (PBS), majd különböző koncentrációjú pentoxifillinnel tenyésztettük. 2 nap múlva tripánkék folt vizsgálattal mértük a sejtek életképességét, és a sejtextraktum fehérjetartalomra nézve történt standardizálása után a fentiekben ismertetett eljárással mértük a CAT aktivitást.

[Sodroski, J. és munkatársai; Science 227. 171-173 (1985)]. Az eredményeket a következőkben foglaljuk össze:

Forbol-észterrel stimulált CAT aktivitás pentoxifillin

Tmikromoll

100

500

1000

44.3

50.4

23,9

20,3

19.5

Forbol-észterrel nem stimulált pentoxifillin rmikromoll

CAT aktivitás

100

500

1000

4.75

4,91

3.75

2,95

2,81

-50• · · · · · · • ·*· · ·· «·« • ♦ «· ····· · ···· ·· ···· · · ·

A pentoxifillin a forbol-észterrel való előkezeléstől függetlenül csökkenti az U38 sejtek kloramfenikol-transzacetiláz (CAT) aktivitását. A CAT vizsgálatot gyakran alkalmazzák a HIV-1 hosszúidejű ismétlésére (long terminál repeat = LTS) kifejtett gén aktivációs faktorra ható anyagok vizsgálatánál.

Összefoglalva azt mondhatjuk, hogy a xantinszármazékok különösen jól alkalmazhatók emberek víruselleni gyógykezelésére. A xantinszármazékok humán retrovírus fertőzés ellen alkalmazható, értékes gyógyszerek mind a megelőzés, mind a kezelés terén. Ezek a szerek a korábban ismert, nagyon korlátozott és specifikus hatású AIDS vírusellenes szerekkel szemben nagyon jó vírusellenes hatást mutatnak. A xantinszármazékok az állat és humán sejtszövet vírus által indukált sejtsérülését elnyomják, és csökkentik a humán megbetegedési és halálozási valószínűséget, ezen belül az AIDS-szel kapcsolatos véletlen megbetegedést, valamint csökkentik a HÍV központi idegrendszerre kifejtett károsító hatását.

Claims (14)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. ELjárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként legalább egy (I) általános képletű 7-(oxo-alkil)-1,3-dialkil-xantint

   - a képletben

   Ri és Rj jelentése egymástól függetlenül 2-6 szénatomos, egyenes vagy elágazó láncú alkilesöpört, ciklohexilesöpört, egyenes vagy elágazó láncú alkoxi-alkil-csoport és hidroxi-alkil-csoport; és

   A jelentése adott esetben metilcsoporttal helyettesített legfeljebb 4 szénatomos szénhidrogéncsoport vagy legalább egy (II) általános képletű vegyületet

   - a képletben

   R1 és R3 szubsztituensek legalább egyikének jelentése

   a) tercier alkohol funkciójú (a) általános képletű csoport, amelyben

   R4 jelentése 1-3 szénatomos alkilcsoport;

   n értéke 2-5 egész szám; és a másik jelentése adott esetben hidrogénatom vagy egy legfeljebb két oxigénatommal megszakított és adott esetben hidroxi- vagy oxocsoporttal helyettesített R5 alifás szénhidrogén-csoport; vagy

   b) (b) általános képletű oxo-alkil-csoport, ·· · » * · ·· • » » * « 5 · • ·# » « · · ··· • · · V *···· amelyben

   Rg jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport;

   és p értéke 2, 3 vagy 4; és a másik jelentése azonos a fentiekben meghatározottakkal; és r₂ jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport a gyógyszergyártásban szokásos hordozó-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve humán retrovírus replikációját gátló gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő komponensekből 1. típusú humán immunhiány vírus (HIV-1) elleni gyógyszerkészítményt állítunk elő.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletű hatóanyagként l,3-dibutil-7-(2oxi-propil)-xantint alkalmazunk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (II) általános képletű hatóanyagként pentoxifillint alkalmazunk.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű hatóanyagot alkalmazunk, amelyben

   R1 jelentése (bj) általános képletű csoport;

   R₂ jelentése metilcsoport; és

   R₂ jelentése propilesöpört.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű hatóanyagot alkalmazunk, amelyben

   -534 « * · · ·« « · · · ♦ * · • ··» · e ··* * • « « 4 · # 44 ♦4 • · 4 ·· «44» ·«4

   R1 jelentése (ajJ általános képletű csoport;

   R2 jelentése metilcsoport; és

   R3 jelentése etoxi-metil-csoport.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű hatóanyagot alkalmazunk, amelyben

   R1 jelentése (aj) általános képletű csoport;

   R2 jelentése metilcsoport; és

   R3 jelentése metoxi-etoxi-metil-csoport.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű hatóanyagot alkalmazunk, amelyben

   Ri jelentése (aj) általános képletű csoport;

   R2 jelentése metilcsoport; és

   R₃ jelentése hidrogénatom.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű hatóanyagot alkalmazunk, amelyben *1

   R2 *3
10. 10.

    jelentése (ajJ általános képletű csoport;

    jelentése metilcsoport; és jelentése propilesöpört.

    Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű hatóanyagot alkalmazunk, amelyben

    R1 jelentése (a^) általános képletű csoport;

    R2 jelentése metilcsoport; és

    R3 jelentése 2-hidroxi-propil-csoport.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, • ··· e · « • * · · ν··· « · « I ·· 4·»· ·

    -54• *· ν· hogy olyan (II) általános képletű hatóanyagot alkalmazunk, amelyben

    Rj jelentése (ajJ általános képletű csoport;

    R₂ jelentése metilcsoport; és

    R3 jelentése 2-hidroxi-izobutil-csoport.
12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű hatóanyagot alkalmazunk, amelyben

    Rj jelentése (ajJ általános képletű csoport;

    R₂ jelentése etilcsoport; és

    R₃ jelentése metoxi-etil-csoport.
13. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű hatóanyagot alkalmazunk, amelyben

    R1 jelentése (aj) általános képletű csoport;

    R₂ jelentése metilcsoport; és

    R3 jelentése (aj) áltlaános képletű csoport.
14. 14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű hatóanyagot alkalmazunk, amelyben

    Rj jelentése (a^) általános képletű csoport;

    R₂ jelentése metilcsoport; és

    R3 jelentése metoxi-etil-csoport.