ES2275400B1 - Uso de compuestos agonistas de la actividad tubulina desacetilasa de la proteina hdac6 en la elaboracion de composiciones farmaceuticas, dichas composiciones farmaceuticas y sus aplicaciones en el tratamiento de infecciones virales. - Google Patents
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Abstract
Uso de compuestos agonistas de la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 en la elaboración de composiciones farmacéuticas, dichas composiciones farmacéuticas y sus aplicaciones en el tratamiento de infecciones virales. La presente invención se basa en el hecho de que el equilibrio de la acetilación/desacetilación de los microtúbulos es clave para modular la entrada de virus fusogénicos en las células eucariotas, preferentemente la entrada del virus VIH-1 en las células T, y que está regulado por la proteína HDAC6, lo que permite definir nuevas aproximaciones terapéuticas para la profilaxis y tratamiento de infecciones virales. Estas aproximaciones terapéuticas se basan en el uso de compuestos activadores de la actividad de dicha proteína HDAC6 y de las composiciones farmacéuticas que los contienen en métodos de tratamiento de dichas infecciones virales.
Description
Uso de compuestos agonistas de la actividad
tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 en la elaboración de
composiciones farmacéuticas, dichas composiciones farmacéuticas y
sus aplicaciones en el tratamiento de infecciones virales.
La presente invención se basa en el hecho de que
el equilibrio de la acetilación/desacetilación de los microtúbulos
es clave para modular la entrada de virus fusogénicos en las
células eucariotas, preferentemente la entrada del virus
VIH-1 en las células T, y que está regulado por la
proteína HDAC6, lo que permite definir nuevas aproximaciones
terapéuticas para la profilaxis y tratamiento de infecciones
virales. Estas aproximaciones terapéuticas se basan en el uso de
compuestos activadores de la actividad de dicha proteína HDAC6 y de
las composiciones farmacéuticas que los contienen en métodos de
tratamiento de dichas infecciones virales.
La presente invención se enmarca en el
desarrollo de nuevas composiciones farmacéuticas para la profilaxis
y el tratamiento de enfermedades provocadas por virus fusogénicos,
y más preferentemente por el virus VIH-1. Por lo
tanto, debe adscribirse al sector farmacológico y biomédico de las
enfermedades virales.
El proceso de infección de células eucariotas
por virus con envoltura o fusogénicos requiere de la fusión de las
membranas plasmática o endosomal de la célula huésped con la viral.
Esta reacción está catalizada por proteínas específicas de la
envoltura del virus, denominadas proteínas de fusión, que permiten
sobrepasar las barreras energéticas del proceso. Por ejemplo, la
penetración de Retrovirus en células permisivas para la infección
puede ocurrir por fusión de membrana de forma dependiente o
independiente del pH. El primer caso es propio del virus de la
gripe (T. Stegmann, A. Helenius. Influenza Virus Fusion: from
models toward a mechanism, in: J. Bentz (Ed.). Viral Fusion
Mechanisms, CRC Press, Boca Raton, FL (1993, pp.
89-111)), del virus Semliki Forest (R. Bron, et
al., 1993. EMBO J. 12:693-701), y el segundo
caso del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y simios (SIV)
(M.O. McClure, et al., 1988. EMBO J.
7:513-518) o del virus Sendai (D. Hoekstra et
al., 1985. Biochemistry 24:4739-4745). Hay que
destacar que ambos procesos son mecanísticamente similares, salvo
que la fusión de membrana tiene lugar en endosomas o en la
superficie de la célula diana, respectivamente (I. Martín, et
al., 1999. Advance Drug Delivery Reviews
38:233-255). Durante el proceso de fusión las
proteínas virales de fusión interaccionan simultáneamente con las
membranas celular y viral, favoreciendo la formación del poro de
fusión (T.H. Sollner, 2004. Current Opinión in Cell Biology
16:429-435). La mayoría de las proteínas virales de
fusión que se conocen interaccionan con la envoltura viral a través
de su dominio de transmembrana, que conecta la región intraviral
(o citoplasmática, en las células infectadas) con el ectodominio de
la proteína de fusión. Por otra parte, se acepta que la interacción
de la proteína de fusión viral con la membrana de la célula diana
involucra un dominio altamente hidrofóbico, de unos 15 residuos
aminoacídicos, denominado péptido de fusión (S.G. Peisajovich,
et al., 2003. BBA 1614:122-129). Este
segmento se encuentra localizado en la región
N-terminal de las proteínas de fusión, como ocurre
en la mayoría de los ortomixovirus, paramixovirus y otros
retrovirus relacionados (J. White et al., 1983. Q. Rev.
Biopohys. 16:151-195; B.M. Blumberg et al.,
1985. J. Gen. Virol. 66:317-331; W.R. Gallaher.
1987. Cell 50:327-328), o en el interior del
ectodominio de la proteína de fusión como en los casos del virus
del Sarcoma de Rous (E. Hunter et al., 1983. J. Virol.
46:920-936), del virus de la Estomatitis Vesicular
(M.A. Whitt, et al., 1990. J. Virol.
64:4907-4913) y del virus Ébola (W.R. Gallaher.
1996. Cell 85:477-478). Generalmente, se acepta que
cada proteína de fusión viral contiene un único péptido de fusión,
el cual es responsable directo de la desestabilización de la
membrana celular e iniciador de la formación del poro de fusión,
aunque no se puede obviar la participación de otras regiones de las
proteínas de fusión viral en la formación del poro de fusión (S.G.
Peisajovich, et al., 2003. BBA
1614:122-129).
Las proteínas de fusión se clasifican en dos
grupos principales: Tipo I (ej. Virus de la gripe, ébola, HIV y
Measles) y tipo II (virus del Dengue, de la fiebre amarilla y de la
encefalitis) (Revisiones en, T.H. Sollner. 2004. Current Opinión in
Cell Biology 16:429-435; A.E. Smith and A. Helenius,
2004. Science 304:237-242). Las proteínas de Tipo I
consisten en glucoproteínas que se ensamblan en homotrímeros, los
cuales se asocian entre sí a través de estructuras alargadas con
forma de espiral enrollada, en cuya región
N-terminal se localiza el péptido de fusión. La
liberación de energía que se produce durante la inserción del
péptido en la membrana celular, permite la aproximación de las
membranas viral y celular de forma focalizada, generándose el poro
de fusión (Revisión en, A.E. Smith and A. Helenius, 2004. Science
304:237-242). Las proteínas de Tipo II son propias
de Flavivirus y virus alfa (Revisión en, A.E. Smith and A.
Helenius, 2004. Science 304:237-242), se
caracterizan por poseer secuencias de fusión internas, y se
sintetizan y ensamblan en la superficie viral como heterodímeros
con otras proteínas de membrana. A pH bajo, se produce un cambio en
la estructura cuaternaria de los heterocomplejos, permitiendo la
disociación de la proteína de fusión viral del heterodímero, y
favoreciendo la reagrupación entre sí de las proteínas de fusión
para formar homotrímeros activos y funcionales (Revisión en, A.E.
Smith and A. Helenius, 2004. Science
304:237-242).
Por otro lado, el Virus de Inmunodeficiencia
Humana (VIH) es el agente etiológico del Síndrome de
Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) (F.
Barre-Sinoussi, et al., 1983. Science
200:868-871). El VIH de tipo 1
(HIV-1) infecta principalmente células CD4+ como
linfocitos T, monocitos y células dendríticas, a nivel de los
órganos linfoides y las mucosas de las regiones de entrada viral
(A.S. Fauci, 1988. Science 239:617-622; S.
Patterson, et al., 1994. Res. Virol.
145:171-176). La infección por VIH-1
necesita de una interacción de alta afinidad entre las
glucoproteínas de la envuelta del virus, gp120/gp41, con el receptor
CD4 (A.G. Dalgleish, et al., 1984. Nature
312:763-767; P.J. Maddon, et al., 1986. Cell
47: 333-348) y requiere además de la asociación con
receptores de quimiocinas, principalmente CCR5 (H. Choe, et
al., 1996. Cell 85:1135-1148, H. Deng, et
al., 1996. Nature 381:661-666; T. Dragic, et
al., 1996. Nature 381:667-673) y CXCR4 (Y.
Feng, et al., 1996. Science 272:872-877),
denominados co-receptores. Así, se ha propuesto que
la unión secuencial de la proteína viral gp120 con CD4, y con uno
de los co-receptores, induce cambios
conformacionales específicos en gp41, permitiendo así la fusión
viral con la membrana plasmática celular y la formación del poro de
fusión (H. Choe, et al., 1996. Cell
85:1135-1148). El co-receptor
utilizado por el VIH-1 determina el tropismo de la
cepa viral. En consecuencia, los virus que utilizan el receptor
CCR5 se denominan R5 trópicos y los que utilizan CXCR4, X4 trópicos
(E.A. Berger, et al., 1999. Annu. Rev. Immunol.
17:657-700). Desde un punto de vista clínico, los
virus VIH-1 R5 infectan monocitos y macrófagos, y
se implican en la transmisión horizontal (M.T. Roos, et al.,
1992. J. Infect. Dis. 165:427-432) y vertical (G.
Scarlatti, et al., 1993. Virology
197:624-629) del virus, prevaleciendo en la fase
seropositiva asintomática de la enfermedad. En etapas avanzadas de
la enfermedad, los virus VIH-1 X4, que infectan
principalmente linfocitos T CD4 (E.A. Berger, et al., 1999.
Annu. Rev. Immunol. 17:657-700), se convierten en
la cepa predominante, detectándose en un 50% de los enfermos
infectados por el VIH-1 (M. Tersmette, et
al., 1988. J. Virol. 62:2026-2032; R.I. Connor,
et al., 1997. J. Exp. Med. 185:621-628). La
fase de progresión de la enfermedad se caracteriza, además, por un
aumento de la carga viral (viremia) y una disminución rápida y
dramática de linfocitos T CD4+ (G. Pantaleo and A.S. Fauci, 1996.
Annu. Rev. Microbiol. 50:825-854), que se relaciona
con el colapso general del sistema inmune, y se considera factor
clave en la evolución del SIDA (J.D. Lifson, et al., 1986.
Science 232:1123-1127; H. Blaak, et al.,
2000. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
97:1269-1274).
El tejido linfoide, en el cual se localizan
células inmunocompetentes activadas y permisivas para la infección
por el VIH-1, representa unos de los principales
reservorios del VIH-1 y un entorno favorable para
la replicación viral. Durante los procesos de presentación del
antígeno los contactos célula infectada-célula
huésped se favorecen. Esto deriva en la fusión celular, generándose
células gigantes multinucleadas (sincitios), y favoreciéndose la
propagación viral. Las células infectadas fusionadas mueren por
apoptosis, rápidamente después de su formación. Este proceso se
relaciona con la degeneración del entorno linfoide, la depleción
dramática de células T CD4+, y se asocia con la aparición de cepas
VIH-1 X4 trópicas (A.S. Fauci, 1996. Nature
384:529-539; A.B. Van't Wout, et al., 1998.
J. Virol. 72:5099-5107). La fusión y muerte de las
células infectadas, conjuntamente con la lisis de células
individuales, se consideran los efectos citopáticos agudos del VIH
(D.D. Ho, et al., 1995. Nature 373:123-126;
X. Wei, et al., 1995. Nature
373:117-122).
El proceso de fusión e infección de células T
CD4+ por el virus VIH-1 se establece por
interacción cooperativa de la proteína viral gp120, asociada no
covalentemente a la proteína viral de transmembrana gp41, con el
receptor CD4 y el correceptor CXCR4 ó CCR5 de la célula diana
(R.W. Doms, 2000. Virology 276:229-37; S.E. Kuhmann,
et al., 2000. J. Virol. 74:7005-15). Durante
esta primera etapa de interacción virus-célula, el
VIH induce la codistribución y/o asociación del receptor CD4 con el
correceptor CXCR4 ó CCR5, en las zonas de contacto entre el virus
y la célula diana. En consecuencia, el bloqueo de la codistribución
de los receptores CD4 y CXCR4/CCR5 dificulta la formación del poro
de fusión, inhibiendo las etapas de fusión y entrada viral (D.S
Dimitrov, et al., 1999. Virology 259:1-6).
Más concretamente, distintos estudios sugieren que cada trímero de
Env del virus VIH-1 interactúa con múltiples
moléculas de CD4, CXCR4 o CCR5 (H. Choe, et al., 1996. Cell
85:1135-1148) y que son necesarios varios trímeros
para la formación del poro de fusión (S.E. Kuhmann, et al.,
2000. J. Virol. 74:7005-7015). La fusión de las
membranas celular y viral, regida en último término por la proteína
gp41, implica necesariamente la reorganización del citoesqueleto de
la célula diana, modificaciones de la morfología celular y la
inducción de señales celulares.
Sin embargo, y aunque hay evidencias de la
importancia del citoesqueleto para la infección viral, existen
pocos datos sobre los procesos de reorganización del mismo que
tienen lugar durante la infección por VIH-1. Por
otro lado, los componentes celulares del citoesqueleto están
implicados en los eventos tempranos durante la infección por
distintos virus, regulando la entrada del virus y la liberación de
su genoma así como promoviendo el movimiento de las cápsides virales
y la integración del genoma viral. Así, los citoesqueletos de
actina y tubulina deben estar intactos para una entrada eficaz del
virus del herpes simple y del virus simio 40, respectivamente (H.
Deng, et al., 1996. Nature 381:661-666; T.
Dragic, et al., 1996. Nature 381:667-673). En
el caso del virus VIH-1, se ha descrito que la
infección y la fusión con la célula huésped pueden ser
completamente inhibidas mediante la disrupción de la red de actina
(Y. Feng, et al., 1996. Science 272:872-877;
E.A. Berger, et al., 1999. Annu. Rev. Immunol.
17:657-700), probablemente mediante la
interferencia de la co-localización de los
receptores CD4 y CXCR4 (Y. Feng, et al., 1996. Science
272:872-877). En esta línea, se ha descrito además
que la actina y la tubulina del citoesqueleto están implicadas en
la transmisión y secreción del virus VIH-1 (R.
Pearce-Pratt, et al., 1994. J.Virol.
68:2898-2905; C. Jolly, et al., 2004. J.
Exp. Med. 199:283-293).
Por tanto, los eventos moleculares que tienen
lugar durante la fusión celular y la formación del poro de fusión
mediada por el virus VIH-1 son fenómenos claves en
el proceso infectivo de dicho virus y del desarrollo de la
enfermedad de inmunodeficiencia adquirida humana (SIDA). Sin
embargo, existe un número de aspectos aun desconocidos del proceso
de fusión que tiene lugar en un proceso infectivo entre un virus y
su célula huésped, y más preferentemente del proceso infectivo del
virus VIH-1, y del papel del citoesqueleto en este
proceso. De igual forma, tampoco existe mucha información de cómo
se puede producir la regulación del proceso infeccioso del virus
VIH-1 mediante la interferencia en el estado
dinámico de la membrana plasmática de la célula huésped, aunque se
ha observado que la Env del virus VIH-1 induce la
reorganización del citoesqueleto de actina vía
Rac-1 (S.E. Pontow, et al., 2004. J. Virol.
78:7138-7147).
Por otro lado, la unión del citoesqueleto a la
membrana plasmática celular proporciona un mecanismo de soporte a
dicha membrana que regula su rigidez, fortaleza y elasticidad (J.
Dai and M.P. Sheetz, 1999. Biophys. J.
77:3363-3370). La asociación entre la membrana
celular y el citoesqueleto es compleja e incluye interacciones del
citoesqueleto con proteínas y lípidos de la membrana. La
\alpha-tubulina acetilada constituye la forma
hidrofóbica de la tubulina que se asocia predominantemente a la
membrana (M. Nunez-Fernandez, et al., 1997.
Mol. Cell Biochem. 170:91-98) por su directa
interacción con la proteína ubicua de la superficie celular Na+,
K+-ATPasa (C.H. Casale, et al., 2003. FEBS Lett.
534:115-118).
Resultados experimentales indican que la
acetilación de microtúbulos cortos corticales, de la
\alpha-tubulina, está directamente involucrada en
el control de la dinámica de la membrana plasmática, y de la
migración celular (C. Gubert, et al., 2002. Nature
417:455-458), así como en la estabilización de las
diferentes estructuras intracelulares (B.J. Jasmin, et al.,
1990. Nature 344:673-675). Además, La proteína
\alpha-tubulina acetilada está implicada en la
estabilidad y funcionalidad de los microtúbulos (G. Piperno, et
al., 1987. J. Cell Biol. 104:289-302). Los
microtúbulos estables regulan el plegamiento de la membrana
plasmática dependiente de actina y la movilidad celular mediante la
activación de Rac-1 (C.M.
Waterman-Storer, et al., 1999. Curr. Opin.
Cell Biol. 11:61-67) ó Rho (G. Piperno, et
al., 1987. J. Cell Biol. 104:289-302).
La acetilación de la proteína
\alpha-tubulina se encuentra bajo el control de
la enzima histona desacetilasa 6 (HDAC6) (C. Hubbert, et
al., 2002. Nature 417:455-458; A. Matsuyama,
et al., 2002. EMBO J. 21:6820-6831),
perteneciente a la clase II de la familia de proteínas HDACs, la
cual se localiza principalmente en el citoplasma de las células
eucariotas, y es inhibida por tricostatina (TSA) (C. Hubbert, et
al., 2002. Nature 417:455-458; A. Matsuyama,
et al., 2002. EMBO J. 21:6820-6831) y
tubacina (S.J Haggarty, et al., 2003. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 100:4389-4394).
Recientemente, se ha descrito que la enzima
HDAC6, a través de su actividad tubulina desacetilasa, controla la
organización en la membrana celular de los receptores de superficie
CD3 y LFA-1, la translocación del centro
orga-
nizador de microtúbulos (MTOC) y la activación de los linfocitos T (J.M. Serrador, et al., 2004. Immunity 20:417-28).
nizador de microtúbulos (MTOC) y la activación de los linfocitos T (J.M. Serrador, et al., 2004. Immunity 20:417-28).
Sin embargo, el papel de la proteína tubulina
del citoesqueleto cortical de la célula huésped sobre la capacidad
de fusión viral y la formación del poro de fusión es desconocido.
Mas aún, no hay datos disponibles sobre la posible implicación de
las formas acetiladas de \alpha-tubulina en la
infección y fusión del virus VIH-1.
La presente invención se basa en el hecho de que
el equilibrio de la acetilación/desacetilación de los microtúbulos
es clave para modular la entrada de virus fusogénicos en las
células eucariotas, preferentemente la entrada del virus
VIH-1 en las células T, y que está regulado por la
proteína HDAC6, lo que permite definir nuevas aproximaciones
terapéuticas para la profilaxis y tratamiento de enfermedades
provocadas por virus fusogénicos, preferentemente provocada por el
virus de inmunodeficiencia humana adquirida
(VIH-1). Estas aproximaciones terapéuticas se basan
en el uso de compuestos activadores de la actividad de dicha
proteína HDAC6 y de las composiciones farmacéuticas que los
contienen.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye el uso de un compuesto o agente regulador,
preferentemente un activador, inductor o agonista de la actividad
tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 en la elaboración de
medicamentos o composiciones farmacéuticas para la profilaxis y
tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías de mamíferos,
ya sean humanos u otros animales, provocadas por por la entrada e
infección de células eucariotas por un virus fusogénico.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye una composición farmacéutica o un medicamento para el
tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con
la entrada e infección de un virus fusogénico en una célula
eucariota, preferentemente en células humanas, y más
preferentemente en linfocitos T que comprende un compuesto o agente
activador de la proteína HDAC6, en cantidad terapéuticamente
efectiva junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o
vehículos farmacéuticamente aceptables y que es capaz de inhibir la
entrada de dicho virus en la célula eucariota. Otro objeto de la
presente invención lo constituye el uso de la composición
farmacéutica de la presente invención en un método de tratamiento
de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por una
enfermedad, desorden o patología provocada por la infección de un
virus fusogénico consistente en la administración de dicha
composición terapéutica en dosis adecuada que modifica el estado de
acetilación de la tubulina y que actúa inhibiendo la entrada del
virus en el interior de la célula.
La invención se enfrenta con el problema de
proporcionar nuevas herramientas eficaces para la identificación de
nuevos compuestos farmacéuticos y nuevas terapias para la
profilaxis y el tratamiento de infecciones virales, preferentemente
de virus fusogénicos, y más preferentemente del virus
VIH-1.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que los resultados descritos demuestran que la
acetilación/desacetilación de la proteína
\alpha-tubulina representa un regulador clave de
la susceptibilidad de las células eucariotas huésped para
fusionarse - formación del poro de fusión - y ser infectadas por un
virus fusogénico, sin afectar a la expresión y distribución en la
superficie celular de los receptores implicados en la fase de
reconocimiento específico del proceso infectivo de la célula
huésped, en concreto, la infección del linfocito T por el virus
VIH-1 a través de receptores CD4, CCR5 y CXCR4.
Este hecho indica que dicha vía de regulación de los mecanismos
generales de fusión de membrana inherentes al mecanismo de fusión
de toda una serie de virus con envoltura, a través de la enzima
HDAC6, es clave para permitir la infección de células eucariotas
por estos virus fusogénicos.
En la presente invención, la estabilización de
la acetilación de la proteína \alpha-tubulina se
obtuvo mediante el silenciamiento de la expresión de la enzima
HDAC6 utilizando RNAs de interferencia (siRNA) o mediante su
inhibición química (TSA). Hay que resaltar que aunque el compuesto
TSA puede inhibir otras HDCAs nucleares, otros inhibidores químicos
de amplio espectro como el butirato sódico (NaBut) o trapoxina B no
afectan a la actividad tubulina desacetilasa HDAC6 (C. Gubert,
2002. Nature 417:455-458). Así, la cuantificación de
la proteína \alpha-tubulina acetilada en
presencia de TSA en comparación con NaBut, permite monitorizar el
efecto de la inhibición específica de la actividad tubulina
desacetilasa de la enzima HDAC6. Cabe destacar que la
estabilización de la \alpha-tubulina acetilada
mediante la inhibición del enzima HDAC6 se asoció fuertemente con
una mayor capacidad de las células a fusionarse y a ser infectadas
por el virus VIH-1.
Por el contrario, las células diana que
sobre-expresan la forma activa
"wild-type" (wt) de la enzima HDAC6, acopladas
o no a la proteína verde GFP, presentaron unos niveles reducidos de
\alpha-tubulina acetilada al igual que una menor
susceptibilidad para fusionarse y para ser infectadas con el virus
VIH-1, sugiriendo que la acetilación de
\alpha-tubulina puede regular la deformabilidad
de la membrana celular. Sin embargo, la
sobre-expresión de la forma activa (wt) de HDAC6 no
alteró la expresión de CD4 ni de CXCR4, ni tampoco su distribución
en los pseudópodos inducidos por VIH-1. Además, la
redistribución de la enzima HDAC6 en la región de agrupamiento
CXCR4/CD4 disminuye la cantidad de
\alpha-tubulina acetilada en las áreas de contacto
célula/virus VIH-1, tal como se ha observado en el
presente trabajo, pudiendo estar asociado con una menor
deformabilidad de la membrana por el virus VIH-1.
Por lo tanto, se propone que la conexión entre la membrana
plasmática y la proteína \alpha-tubulina acetilada
se encuentra influenciada por la actividad de la enzima HDAC6,
regulando la dinámica y elasticidad de la membrana plasmática, y,
por tanto, influye fuertemente en la capacidad de fusión de las
proteínas virales con sus células huésped, y en concreto de las
proteínas Env gp41/gp120 del virus HIV-1 con el
linfocito T.
Como la enzima HDAC6 es reclutada en las áreas
de contacto célula/virus, la sobre-expresión de
esta enzima puede representar un mecanismo celular de protección
frente a la infección del virus VIH-1, al alterar la
acumulación de la proteína \alpha-tubulina
acetilada en las áreas de contacto célula/VIH-1. Es
por tanto plausible que el efecto negativo de la enzima HDAC6 en la
fusión e infección del virus VIH-1 fuera más
relevante cuanto mayor cantidad de proteína HDAC6 es expresada en
las células huésped, la cual podría actuar fácilmente en las
formas acetiladas de \alpha-tubulina que se
concentran en las áreas de contacto célula/VIH-1. A
este respecto, las zonas ricas("hot spots") generadas por la
acción del VIH-1, donde se asocian CD4 y el
co-receptor, no contenían
\alpha-tubulina acetilada en las células que
sobre-expresan la enzima activa HDAC6.
Teniendo en cuenta todas estas evidencias
experimentales, puede postularse que la inhibición de la enzima
HDAC6 representa un mecanismo putativo para la regulación positiva
de la capacidad de fusión de las proteínas gp41/gp120, la cual
podría ser dependiente de la capacidad de la membrana celular del
huésped a ser deformable, y directamente relacionada con el estado
del citoesqueleto cortical de tubulina. En este modelo, la
tubulina está implicada en la infección por VIH-1 en
las etapas iniciales de la infección, cuando la proteína
\alpha-tubulina acetilada confiere a la membrana
celular el estado dinámico necesario para la fusión entre la
membrana celular-virus.
En resumen, la presente invención se basa en el
hecho de que el equilibrio de la acetilación/desacetilación de los
microtúbulos es clave para modular la entrada de virus fusogénicos
en las células eucariotas, preferentemente la entrada del virus VIH
en las células T, y que está regulado por la proteína HDAC6, lo que
permite definir nuevas aproximaciones terapéuticas para la
profilaxis y tratamiento de enfermedades provocadas por virus
fusogénicos, preferentemente provocada por el virus de
inmunodeficiencia humana adquirida (VIH-1). Estas
aproximaciones terapéuticas se basan en el uso de compuestos
activadores de la actividad de dicha proteína HDAC6 y de las
composiciones farmacéuticas que los contienen.
Los compuestos activadores o agonistas de HDAC6
podrían impedir la fusión y entrada de virus fusogénicos en
células eucariotas, preferentemente la fusión y entrada del virus
VIH-1 en los linfocitos T. En este sentido, además,
la tecnología de transferencia génica podría, mediante vectores
adecuados, ser de utilidad en un procedimiento de tratamiento de
terapia génica para expresar, preferentemente de forma
tejido-específica, el enzima HDAC6 en los
linfocitos T de pacientes que sufren este tipo de enfermedades.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye el uso de un compuesto o agente regulador,
preferentemente un activador, inductor o agonista de la actividad
tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6, en adelante uso de un
compuesto de la presente invención, en la elaboración de
medicamentos o composiciones farmacéuticas para la profilaxis y
tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías de mamíferos,
ya sean humanos u otros animales, provocadas por por la entrada e
infección de células eucariotas por un virus fusogénico.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "compuesto/agente activador o agonista" se refiere a
una molécula que cuando se une o interactúa con la proteína HDAC6,
o con fragmentos funcionales de la misma, incrementa la intensidad
o prolonga la duración de la actividad biológica de dicha proteína.
En esta definición se incluye además aquellos compuestos o moléculas
que permiten incrementar la expresión del gen codificante de la
proteína HDAC6, ya sea la forma endógena existente de forma natural
en una célula o una forma exógena que se introduce artificialmente
en dicha célula. Un agente activador puede estar constituido por un
péptido, una proteína, un ácido nucleico, carbohidratos, un
anticuerpo, un compuesto químico, o cualquier otro tipo de molécula
que incremente el efecto y/o la duración de la actividad de la
proteína HDAC6.
Tal y como se utiliza en la presente invención
el término "virus fusogénico" se refiere a un virus que
infecta células eucariotas, preferentemente de mamíferos humanos y
no humanos, mediante la fusión de la membrana plasmática o
endosomal de dicha célula huésped y la envoltura viral
perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de
la presente invención, al siguiente grupo: el virus de la gripe
(Revisión en, T. Stegmann and A. Helenius. Influenza virus fusion:
fusion models toward a mechanism, in: J. Bentz (Ed.), Viral Fusion
Mechanisms, CRC Press, Boca Raton, FL, 1993, pp:
89-111), el virus Semliki Forest (R. bron, et
al., 1993. EMBO J. 12:693-701), el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la inmunodeficiencia
simia (SIV) (M.O. McClure, et al., 1988. EMBO J.
7:513-518), el virus Sendai (D. Hoekstra, et
al., 1985. Biochemistry 24:4739-4745), el virus
del Sarcoma de Rous (Revisión en, S.G. Peisajovich and Y. Shai.
2003. BBA 1614:122-129), el virus de la Estomatitis
Vesicular (Revisión en, S.G. Peisajovich and Y. Shai. 2003. BBA
1614:122-129), el virus Ébola (Revisión en, S.G.
Peisajovich and Y. Shai. 2003. BBA 1614:122-129), el
virus Measles, virus del Dengue, el virus de la fiebre amarilla y
de la encefalitis (Revisión en, T.H. Sollner. 2004. Current
Opinión in Cell Biology 16:429-435; Revisión en,
A.E. Smith and A. Helenius 2004. Science
304:237-242).
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye el uso de un compuesto de la invención en el que la
composición farmacéutica se utiliza para la profilaxis y el
tratamiento de la enfermedad de inmunodeficiencia humana adquirida
provocada por el virus VIH-1.
Tal y como se utiliza en la presente invención
el término "virus VIH-1" se refiere a
cualquiera de las cepas existentes del virus VIH-1
y VIH-2.
En este sentido, en el estado de la técnica
existen descritos compuestos agonistas de la actividad de las
proteínas HDACs, que pueden ser utilizados en el ámbito de la
presente invención como agonistas de la proteína HADC6, y que se
indican a continuación a título ilustrativo sin que eso signifique
una limitación al alcance de la presente invención: xantinas
(patente US 20030134865).
Así, otro objeto particular de la presente
invención lo constituye el uso de un compuesto de la presente
invención en el que el compuesto agonista está constituido por una
xantina o sus derivados.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el uso de un compuesto de la presente invención en
el que el compuesto está constituido por una construcción genética,
en adelante construcción génica HDAC6 de la presente invención, que
permite la expresión de una proteína o péptido con actividad
tubulina desacetilasa que mimetiza la actividad tubulina
desacetilasa de la proteína HDAC6 humana en el interior de células
de mamífero, preferentemente humanas, y más preferentemente en
linfocitos T, de forma similar a las construcciones genéticas
elaboradas en la presente invención (ver Ejemplo 3) y que comprende
una o varias secuencias de nucleótidos HDAC6 pertenecientes al
siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de
nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a la
secuencia de mostrada en la presente memoria (SEQ ID NO 1), por
ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos
conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o
más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera
de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más
nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia,
y que permita la codificación de un péptido o proteína capaz de
mimetizar la acción tubulina desacetilasa de la HDAC6 humana.
La secuencia de nucleótidos, longitud completa,
codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6 que
se utiliza en la presente invención (SEQ ID NO 1) está identificada
por el número de acceso AF1326O9 en el NCBI.
En general, una secuencia de nucleótidos análoga
es sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos
comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa
que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de
identidad de, al menos, un 30%, preferentemente de, al menos, un
85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%. Hay que indicar
que la secuencia de nucleótidos de la HDAC6 humana (SEQ ID NO 1)
presenta una homología variable con respecto a otras formas
existentes en otras especies.
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye el uso del compuesto de la presente
invención en el que la secuencia de nucleótidos de a) de la
construcción génica HDAC6 es la secuencia de nucleótidos HDAC6
caracterizada por la SEQ ID NO 1 codificante de la proteína
tubulina desacetilasa humana HDAC6 (SEQ ID NO 2). Una realización
particular de la presente invención lo constituye el uso del
compuesto de la presente invención en el que la construcción génica
HDAC6 comprende la secuencia de nucleótidos HDAC6 caracterizada
porque es un fragmento de b) constituido por una secuencia de
nucleótidos codificante al menos de la secuencia de aminoácidos
comprendida entre los dos residuos de histina 216 y 611 de la HDAC6
humana (SEQ ID NO 2), claves para su actividad funcional. Hay que
indicar que la mutación en estas dos histinas produce una proteína
HDAC6 inactiva (ver Ejemplo 3; Serrador JM et al., 2004.
HDAC6 deacetylase activity links the tubulin cytoskeleton with
immune synapse organization. Immunity 20:417-428)
por lo que este dominio puede ser necesario para que un fragmento
de HDAC6 sea funcionalmente activo.
La construcción génica HDAC6 de la invención
también puede comprender, en caso necesario y para permitir un
mejor aislamiento, detección o secreción al citoplasma del péptido
expresado, a una secuencia de nucléotidos que codifica para un
péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento,
detección o secreción de dicho péptido. Por tanto, otro objeto
particular de la presente invención lo constituye el uso de un
compuesto de la presente en el que el compuesto agonista es una
construcción genética HDAC6 descrita anteriormente que comprende,
además de la secuencia de nucleótidos HDAC6, cualquier otra
secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o secuencia
peptídica que permita el aislamiento, la detección o la secreción
al citoplasma celular del péptido expresado, por ejemplo, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, una
secuencia de polihistidina (6xHis), una secuencia peptídica
reconocible por un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, para su
identificación, o cualquier otra que sirva para purificar la
proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad:
péptidos etiqueta tales como c-myc, HA,
E-tag) (Using antibodies: a laboratory manual. Ed.
Harlow and David Lane (1999). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
New York. Capítulo: Tagging proteins. Pp.
347-377).
La secuencia de nucleótidos HDAC6 y la
construcción genética HDAC6 descritas previamente pueden obtenerse
por un experto en el sector de la técnica mediante el empleo de
técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica (Sambrook
et al. ``Molecular cloning, a Laboratory Manual 2^{nd}
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 vol
1-3). Dichas secuencias de nucleótidos pueden estar
integradas en un vector de expresión génica que permite la
regulación de la expresión de la misma en condiciones
adecuadas.
Por tanto, otro objeto particular de la presente
invención lo constituye el uso de un compuesto de la presente
invención en que el compuesto está constituido por un vector de
expresión génica, en adelante vector de expresión HDAC6, que
comprende una secuencia de nucleótidos HDAC6 o una construcción
genética HDAC6 descritas en la presente invención y que permite la
expresión de una proteína o péptido con actividad tubulina
desacetilasa que mimetiza la actividad tubulina desacetilasa de la
proteína HDAC6 humana en el interior de células de mamíferos,
preferentemente células humanas, y más preferentemente en
linfocitos T.
En general, un vector de expresión comprende,
además de la secuencia de nucleótidos HDAC6 o de la construcción
genética HDAC6 descritos en la invención, un promotor que dirige su
transcripción (por ejemplo, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD,
\sqsupsetret, etc), al que está operativamente enlazado, y
otras secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan
dicha transcripción y, en su caso, la traducción del producto de
interés, por ejemplo, señales de inicio y terminación de
transcripción (tlt2, etc), señal de poliadenilación, origen
de replicación, secuencias de unión a ribosomas (RBS), secuencias
codificantes de reguladores transcripcionales, (enhancers),
silenciadores transcripcionales (silencers), represores, etc.
Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse
de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto
entre plásmidos de expresión, vectores virales (DNA o RNA),
cósmidos, cromosomas artificiales, etc. que pueden contener,
además, marcadores utilizables para seleccionar las células
transfectadas o transformadas con el gen o genes de interés. La
elección del vector dependerá de la célula huésped y del tipo de
uso que se quiera realizar. Por tanto, según un modo de realización
particular de la presente invención dicho vector es un plásmido. La
obtención de dicho vector puede realizarse por métodos
convencionales conocidos por los técnicos en la materia al igual
que para la transformación de microorganismos y células eucariotas
se pueden utilizar diferentes métodos ampliamente conocidas -
transformación química, electroporación, microinyección, etc -
descritos en diversos manuales [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and
Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual,
2^{nd} ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
N.Y.].
Los sistemas de expresión génica pueden permitir
o no la integración del nuevo material genético en el genoma de la
célula huésped. De esta forma, tanto la secuencia de nucleótidos,
construcción génica o el vector de expresión HDAC6 pueden utilizarse
como un medicamento para proteger células huésped, preferentemente
linfocitos T, contra la infección de un virus fusogénico,
preferentemente por el virus VIH-1, en un
procedimiento de tratamiento y profilaxis de terapia génica in
vitro de linfocitos T humanos frente al VIH-1.
Las herramientas biofarmacéuticas y los procedimientos de terapia
génica son suficientemente conocidas por un experto del sector de
la técnica.
Finalmente, el origen de estos compuestos
reguladores agonistas de la actividad de las proteínas HDACs puede
ser variado, de tal forma que pueden ser origen natural (por
ejemplo, de origen vegetal, bacteriano, vírico, animales o
microorganismos eucariotas) o sintético.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye una composición farmacéutica o un medicamento para el
tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con
la entrada e infección de un virus fusogénico en una célula
eucariota, preferentemente en células humanas, y más
preferentemente en linfocitos T, en adelante composición
farmacéutica de la presente invención, que comprende un compuesto o
agente activador de la proteína HDAC6, en cantidad terapéuticamente
efectiva junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o
vehículos farmacéuticamente aceptables y que es capaz de inhibir la
entrada de dicho virus en la célula eucariota.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son
los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia
y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones
terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad del agente o compuesto regulador, agonista, de la
actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6, calculada
para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada,
entre otras causas, por las características propias de los
compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad
de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de
administración. En otra realización particular, dicha composición
terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión
acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición
terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada
por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha
composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía
de administración elegida. En una realización particular, la
administración de la composición terapéutica proporcionada por esta
invención se efectúa por vía parenteral, por vía oral, por vía
intraperitoneal, subcutánea, etc. Una revisión de las distintas
formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los
excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede
encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia
Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones,
Madrid.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la
que el compuesto agonista es una xantina o sus derivados.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la
que el compuesto activador es una construcción genética o un vector
de expresión HDAC6 que permite la expresión de una proteína o
péptido con actividad tubulina desacetilasa que mimetiza la
actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 humana en el
interior de células de mamífero, preferentemente humanas, y más
preferentemente en linfocitos T, de forma similar a las
construcciones genéticas elaboradas en la presente invención (ver
ejemplo 3) y que comprende una o varias de las secuencias de
nucleótidos HDAC6 pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención
en la que la secuencia de nucleótidos de a) es la secuencia de
nucleótidos SEQ ID NO 1 codificante de la proteína tubulina
desacetilasa humana HDAC6 (SEQ ID NO 2).
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención
en la que la secuencia de nucleótidos de b) es un fragmento
constituido por una secuencia de nucleótidos codificante, al menos,
de la secuencia de aminoácidos comprendida entre los dos residuos
de histina 216 y 611 de la HDAC6 (SEQ ID NO 2).
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de la presente
invención, en adelante uso de la composición farmacéutica de la
presente invención, en un método de tratamiento o profilaxis de un
mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por una
enfermedad, desorden o patología provocada por la infección de un
virus fusogénico consistente en la administración de dicha
composición terapéutica en dosis adecuada que modifica el estado de
acetilación de la tubulina y que actúa inhibiendo la entrada del
virus en el interior de la célula.
De esta forma, este compuesto agonista de la
HDAC6 puede favorecer la desacetilación de la tubulina mediante el
aumento de la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6
en el interior de las células eucariotas y, por tanto, impedir la
entrada e infección del virus.
El uso de la composición farmacéutica de la
presente invención puede utilizarse en un método de tratamiento de
forma aislada o conjuntamente con otros compuestos
farmacéuticos.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la
invención en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad
provocada por un virus fusogénico que infecta células eucariotas,
preferentemente células de mamíferos humanos y no humanos,
perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de
la presente invención, al siguiente grupo: el virus de la gripe
(Revisión en, T. Stegmann and A. Helenius. Influenza virus fusion:
fusion models toward a mechanism, in: J. Bentz (Ed.), Viral Fusion
Mechanisms, CRC Press, Boca Raton, FL, 1993,
pp:89-111), el virus Semliki Forest (R. bron, et
al., 1993. EMBO J. 12:693-701), el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la inmunodeficiencia
simia (SIV) (M.O. McClure, et al., 1988. EMBO J.
7:513-518), el virus Sendai (D. Hoekstra, et
al., 1985. Biochemistry 24:4739-4745), el virus
del Sarcoma de Rous (Revisión en, S.G. Peisajovich and Y. Shai.
2003. BBA 1614:122-129), el virus de la Estomatitis
Vesicular (Revisión en, S.G. Peisajovich and Y. Shai. 2003. BBA
1614:122-129), el virus bola (Revisión en, S.G.
Peisajovich and Y. Shai. 2003. BBA 1614:122-129), el
virus Measles, virus del Dengue, el virus de la fiebre amarilla y
de la encefalitis (Revisión en, T.H. Sollner. 2004. Current Opinión
in Cell Biology 16:429-435; Revisión en, A.E. Smith
and A. Helenius 2004. Science 304:237-242).
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la
invención en un método de tratamiento de la enfermedad de
inmunodeficiencia humana adquirida provocada por el virus
fusogénico VIH-1.
Figura 1.- La inhibición de HDAC6 incrementa la
fusión célula-célula mediada por las proteínas Env
del virus VIH-1. (a) El marcaje
x-Gal de las células HeLa P5 fusionadas con células
HeLa ADA en ausencia (control) o presencia de TSA (10, 100 y 300
nM), NaBut (2 \muM), RANTES (300 y 700 nM) o anticuerpo
monoclonal (Acm) anti-CD4 (5 \mug/ml). (b)
Cuantificación (\beta-Gal de los experimentos de
fusión celular mediados por Env de las cepas trópica R5 y trópica
X4 en células HeLa P5 tratadas con TSA, y en presencia o ausencia
de anticuerpo monoclonal anti-CD4. (c) Western blot
para el análisis cinético de la acetilación de la proteína
\alpha-tubulina acetilada en células HeLa P5
tratadas con TSA (10, 100 y 300 nM) o NaBut (500 \muM). Las
cifras indican las veces que se incrementa la proteína
\alpha-tubulina acetilada con respecto a células
no tratadas. (d) Análisis por citometría de flujo de la expresión
de CD4, CXCR4 y CCR5 en células HeLa P5 tratadas con 300 nM de TSA
2 \muM NaBut o células no tratadas (e) Western blot para el
análisis cinético de la desacetilación de proteína
\alpha-tubulina tras el tratamiento con TSA (300
nM, 4 hrs.) en células HeLa P5 aclaradas. Las cifras indican la
cantidad de proteína \alpha-tubulina acetilada
después de eliminar el TSA, y referido al momento cero (4 hrs. de
tratamiento con TSA 300 nM). (f) Cuantificación
(\beta-Gal de los experimentos de fusión de
células HeLa ADA con células HeLa P5 pretratadas con TSA o Nabut
durante 4 hrs. a 37ºC antes de la adición de las células HeLa ADA.
Se muestra además el efecto de un anticuerpo monoclonal
anti-CD4. (g) El marcaje X-Gal de
las células HeLa ADA fusionadas con no tratadas (control) o con
células HeLa P5 pre-tratadas con 300 nM TSA, en
presencia o en ausencia de un anticuerpo monoclonal
anti-CD4.
Figura 2.- La inhibición de la enzima HDAC6
incrementa la fusión celular en linfocitos T mediada por proteínas
Env del virus VHI-1. (a) Análisis por citometría de
flujo de sincitios fusionados entre células J77 y células T
Hxbc2-Env en presencia o en ausencia de TSA o
NaBut. Se muestra un Western blot de análisis cinéticos de la
acetilación de la proteína \alpha-tubulina en
células J77 tratadas con TSA (2 \muM). Los valores indican el
incremento de la acetilación \alpha-tubulina en
comparación con los definidos en la banda de control de
\alpha-tubulina. (b) Imágenes de los sincitios
formados entre las células J77 y las Hxbc2 bajo tratamientos de TSA
y NaBut. Además, se muestran el efecto de un anticuerpo monoclonal
anti-CD4. (c) Análisis de citometría de flujo de
células J77 que expresan CD4 y CXCR4 tratadas con TSA (300 nM),
NaBut (2 \muM) o de células no tratadas.(d) Internalización de
CXCR4 inducida por SDF-1\alpha en ausencia de TSA
o en presencia de 300 nM de TSA. (e)
\alpha-tubulina acetilada en células J77 tratadas
con TSA (300 nM) o NaBut (2 mM) y en células no tratadas. Los
datos de las imágenes de fluorescencia y de los western blots son
representativos de 3 experimentos independientes (media\pmSE;
n=4).
Figura 3.- El silenciamiento de la expresión de
HDAC6 incrementa la fusión con células que expresan proteínas Env
del virus VIH-1. (a) Cuantificación mediante western
blot de la expresión de la enzima HDAC6 y de
\alpha-tubulina acetilada en células HeLa P5
tratadas con siRNA. Las imágenes de fluorescencia muestran altos
niveles de \alpha-tubulina acetilada en células
donde la expresión de HDAC6 fue silenciada (cabezas de flechas).
(b) Imágenes DIC de sincitios formados entre células HeLa ADA
fusionadas con células HeLa P5 tratadas con siRNA (1 y 2) o sin
tratar (4) o con células HeLa P5 transfectadas con un siRNA como
control negativo y de especificidad (5). Se muestra además el
efecto de un anticuerpo monoclonal anti-CD4 en
células no tratadas (3) o células tratadas con
siRNA-HDAC6 (6). (c) Cuantificación de
\beta-Gal de la fusión celular mediada por Env
entre células HeLa P5, tratadas con siRNA (si) o no, con células
HeLa que expresan Env de las cepas R5- o
X4-trópicas, en presencia o ausencia de un
anticuerpo monoclonal anti-CD4.
Figura 4.- El silenciamiento e inhibición de
HDAC6 favorece la infección por el virus VIH-1. (a)
Efecto de TSA o NaBut en la infección por el virus
VIH-1 de células HeLa P5 con las cepas virales
VIH-1_{Bal} y VIH-1_{NL43}. La
infección fue medida mediante la producción de
(\beta-Gal, 52 hrs después de la infección. (b)
Producción viral (medida de p24) en PBL activados con PHA
pretratadas con TSA o NaBut. Las imágenes de inmunofluorescencia y
los análisis de western blot muestran los niveles de
\alpha-tubulina acetilada en PBL activadas con
PHA, después de 2 hrs. de tratamiento con TSA (300 nM) o Nabut (2
\muM). Se muestran además el efecto de AZT, un neutralizante del
anticuerpo monoclonal anti-CD4, RANTES y
SDF-1\alpha en los paneles A y B. (c) Efecto del
silenciamiento del siRNA HDAC6 en la infección por el virus
VIH-1 de células HeLa P5. La infección se mide
mediante la producción (\beta-Gal. Además, se
muestra el efecto de un anticuerpo monoclonal neutralizante.
Figura 5.- La sobre-expresión de
HDAC6 disminuye la capacidad de las células de fusionarse y de ser
infectadas por el virus de VIH-1. (a) Expresión de
las formas salvajes (wt) y mutada (dm) de la enzima
HDAC6-GFP en células HeLa P5. (b) Análisis de
western blot de la expresión de la enzima salvaje (wt) y mutada
(dm) HDAC6-GFP y sus efectos en los niveles de la
proteína \alpha-tubulina acetilada. (c) Análisis
de citometría de flujo de la expresión de CD4, CXCR4 y CCR5 en
células HeLa P5 no transfectadas o transfectadas con la forma
salvaje (wt) o mutada (dm) de la enzima HDAC6-GFP.
(d) Cuantificación (producción de (\beta-Gal) de
la fusión celular mediada por Env entre células HeLa ADA y no
transfectadas (control), o entre células HeLa P5 transfectadas con
la forma salvaje (wt) o mutada (dm) de la enzima
HDAC6-GFP. Se muestran además imágenes DIC de los
sincitios formados después de 16 horas de la fusión. (e) Infección
del virus VIH-1 en células HeLa P5 no transfectadas
(control) o en transfectadas con la forma salvaje (wt) o mutada
(dm) de la enzima HDAC6-GFP con la cepa
VIH-1_{BaL}. Además, se muestra el efecto de un
anticuerpo monoclonal anti-CD4 y AZT. Las imágenes
de western blot y DIC son representativas de tres experimentos
independientes (media\pmSEM; n=4).
Figura 6.- La sobre-expresión de
HDAC6 altera la infección por el virus VIH-1 y la
redistribución de la proteína \alpha-tubulina
acetilada en las áreas de contacto célula/virus
VIH-1. (a) Análisis de citometría de flujo de
células MT-2 que expresan las formas salvaje (wt) y
mutada (md) de la enzima HDAC6-GFP y la proteína
GFP. (b) Análisis de citometría de flujo de CD4 y CXCR4 en células
MT-2 parentales, expresando wt-HDAC6
o dm-HDAC6. (c) Análisis de la entrada e infección
del virus VIH-1 en células MT-2
transfectadas con retrovirus con las formas salvaje (wt) y mutada
(md) de la enzima HDAC6-1 GFP mediante la
cuantificación de DNA VIH-1-gag
intracelular, con respecto a células MT-2 control
transfectadas o no con GFP (control). Estos resultados son
representativos de 3 experimentos independientes. (d) Localización
de \alpha-tubulina acetilada y de la enzima
salvaje (wt) o mutada (dm) HDAC6-GFP en células
MT-2, antes y durante la infección de
VIH-1 (control, panel izquierdo y
VIH-1_{NL43} en panel derecho,
respectivamente).
Figura 7.- El virus VIH-1
recluta a la enzima HDAC6 y a la proteína
\alpha-tubulina acetilada en las áreas de contacto
1 célula/virus, donde CD4 y CXCR4 se co-distribuyen.
(a) Redistribución de la proteína \alpha-tubulina
acetilada en modelos de fusión celular con células HeLa y
linfocitos T (ver punta de flechas) en las áreas de contacto
célula/célula del sincitio. (b) Expresión y localización de la
enzima endógena HDAC6 y de la proteína
\alpha-tubulina acetilada en células
MT-2 parentales infectadas por el virus
VIH-1 y en células no infectadas. (c) Análisis de
microscopía de fluorescencia de CD4, CXCR4 y de la enzima salvaje
(wt) o mutada (dm) HDAC6-GFP en células
MT-2 no infectadas (panel izquierdo)o
infectadas (panel derecho).
Con el objeto de evaluar el efecto de la
estabilización de la proteína \alpha-tubulina en
la capacidad de fusión de las proteínas de la envoltura del virus
VIH-1 gp41/gp120 se utilizaron inhibidores químicos
de HDAC6. Así, se ensayó el efecto del inhibidor general de las
proteínas HDACs, TSA, el cual además inhibe la actividad tubulina
desacetilasa de HDAC6, y el butirato sódico (NaBut) en distintos
modelos de fusión célula-célula mediados por el
virus VIH-1. En primer lugar, se empleó un modelo de
fusión celular mediado por proteínas Env en células HeLa 243 o en
células ADA que se fusionaron con células HeLa P5 (Schwartz, O.
et al., 1994. Virology 198:360-365;
Pleskoff, O. et al., 1997. Science
276:1874-1878). Se observó que TSA promueve
fuertemente la formación de células polinucleadas gigantes
(sincitio) de manera dosis dependiente (Figura 1A, 1B), mientras
que NaBut no provocaba dicho resultado (Figura 1A). Los sincitios
formados por las células tratadas con TSA fueron mayores que
aquellos obtenidos en células no tratadas o tratadas con NaBut
(Figura 1A), y este efecto fue observado tanto con proteínas Env de
las cepas trópicas X4 y R5, con una actividad máxima a dosis de 300
nM de TSA (Figura 1B). Una clara correlación se observó entre el
efecto de TSA en la capacidad de fusión de gp41/gp120 (Figura 1B) y
la cantidad de proteína \alpha-tubulina acetilada
(Figura 1C), siendo ambas dependientes de la dosis (Figura 1B y 1C,
las cuales presentan 300 nM de TSA) y del tiempo. Por el
contrario, no observó ningún efecto en la acetilación de la proteína
\alpha-tubulina con distintas dosis y tiempos de
tratamientos con NaBut (Figura 1C). Como se esperaba, el efecto de
TSA en la formación de sincitios fue revocado mediante anticuerpos
monoclonales neutralizantes anti-CD4 (Figura 1A y
1B), o mediante RANTES (Figura 1A) y SDF-1\alpha
(datos no mostrados). Mas aún, los niveles de expresión de CD4,
CXCR4 y CCR5 en células HeLa P5 no fueron alterados de forma
significativa por la adición de TSA (Figura 1D). Estos datos
sugieren que TSA favorece el paso de formación del poro de fusión
durante el proceso de fusión celular, provocando cambios en la
deformabilidad de la membrana sin alterar la interacción inicial de
las proteínas Env con el receptor CD4.
Para valorar el efecto de TSA en la activación
de LTR-lacZ se realizaron una serie de
experimentos de fusión célula-célula mediante el
pretratamiento de las células HeLa P5 con TSA, y eliminándolo antes
de la adición de las células HeLa Env+. Se observó que TSA
estabiliza un importante conjunto de
\alpha-tubulina acetilada, la cual disminuye
hasta los niveles basales después de 2 horas de haber eliminado el
TSA (Figura 1E). La cantidad de \alpha-tubulina
acetilada eliminada a los 30 y 60 minutos fue un 60% y un 30%
mayor, respectivamente, que aquellas observadas en células no
tratadas o en células tratadas con NaBut (Figura 1E). Como una vez
que se produce el contacto con el virus VIH-1, la
fusión de membrana y la entrada viral tienen lugar en
aproximadamente en 30-60 minutos (Reeves, J.D.
et al., 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
99:16249-54; Raviv, Y. et al., 2002. Virology
293:243-51), estos datos sugieren que la
acetilación de los microtúbulos se traduce en una mayor permisividad
de las células a la fusión. Por lo tanto, el tratamiento de las
células HeLa P5 con TSA incrementa la formación de sincitio con
respecto al tratamiento con ADA en células HeLa (Figura 1F) y en
células HeLa 243 (datos no mostrados). El efecto del TSA o del
NaBut en la transcripción de LTR-lacZ,
después de eliminar las drogas, fue excluido por la ausencia de
producción \beta-Gal en las células control no
fusionadas HeLa P5, o en las células tratadas con NaBut (Figura 1F,
1G).
Con el objeto de trasladar estas observaciones a
linfocitos T se empleó un modelo de fusión
célula-célula basado en células Jurkat que expresan
X4-tropic Hxbc2-Env (Cao, J., et
al., 1996. J Virol 70, 1340-54),
co-cultivadas con células J77 (CXCR4+/CD4+). El
tratamiento de las células J77 con TSA claramente estabiliza una
intensa corteza de proteína \alpha-tubulina
acetilada (Figura 2A, 2E) e induce la formación de grandes
sincitios, mientras que NaBut no produjo ningún efecto (Figura 2A y
2B). Como se observó en células HeLa, la expresión de las
proteínas CXCR4 y CD4 no se vieron modificadas significativamente
por el tratamiento con TSA o con NaBut (Figura 2C), y tampoco la
internalización de CXCR4 inducida por SDF-1\alpha
se vio afectada por TSA (Figura 2D).
Para valorar adicionalmente el papel de la
proteína \alpha-tubulina acetilada en la fusión e
infección por VIH-1 se realizaron un silenciamiento
selectivo de la expresión HDAC6 mediante la inhibición específica
de su RNAm con RNAs de interferencia (siRNA) (Hubbert C., et
al., 2002. Nature 417:455-458; Serrador J.M.,
et al., 2004. Immunity 20:417-28). La
inhibición de la expresión endógena de HADC6 en las células HeLa P5
indujo un incremento 3 veces mayor de la proteína
\alpha-tubulina, sin afectar a los niveles
totales de esta proteína o de otros componentes del citoesqueleto,
como la vimentina (Figura 3A) o la expresión de CXCR4, CCR5 y CD4
(datos no mostrados). El silenciamiento específico de HDAC6 generó
unas células HeLa P5 más permisivas, las cuales presentan una mayor
actividad de fusión con ambos Env R5-tropic y
X4-tropic (Figura 3B, 3C).
En los modelos de fusión
célula-célula, las áreas de contacto presentadas
por las células que expresan Env fueron mayores que aquellas
observadas en modelos de infección celular, mediante el uso de
partículas virales de VIH-1 purificadas. La
siguiente pregunta que se planteó fue si el efecto de la inhibición
de HDAC6 y, por tanto la subsiguiente estabilización de la proteína
\alpha-tubulina acetilada cortical, influye en la
infección por el virus VIH-1 utilizando células
HeLa P5 o linfocitos de células periféricas activadas con PHA
(PHA-activated PBL). La infección del virus
VIH-1 en células HeLa P5 se valoró mediante la
producción de \beta-Gal y la activación de los
linfocitos de sangre periférica por PHA mediante la determinación
del antígeno p24 en el sobrenadante libre de células (Figura 4A y
4B, respectivamente). Se observó que TSA incrementó la infección
por el virus VIH-1 de una manera dosis dependiente
en células HeLa P5 y en PBL (Figura 4A y 4B) con cualquiera de las
cepas utilizadas: R5-tropic
VIH-1_{Bal} y X4-tropic
VIH-I_{NL-43} (Figura 4A y 4B).
TSA incrementó la infección de VIH-1 a través de la
inhibición de la enzima HDAC6 citosólica y de la estabilización de
la proteína \alpha-tubulina acetilada cortical
(Figura 4B), el cual se mantuvo tras la eliminación de TSA (Figura
4A y 4B), lo que excluye los efectos transcripcionales de TSA en la
producción de \beta-Gal y en la replicación del
virus VIH-1. Al igual que en los modelos de fusión
célula-célula, el incremento de la infección del
virus VIH-1 en células HeLa P5 (Figura 4A) y en
células PBL activadas con PHA se correlacionó con los niveles de
proteína \alpha-tubulina acetilada (Figura 1E y
4B). Asimismo, el silenciamiento de HDAC6 produjo células HeLa P5
más permisivas, las cuales fueron infectadas más eficazmente con
partículas virales de cepas R5- o X4 trópicas de
VIH-1 (Figura 4C).
Estos resultados sugieren que los niveles de
proteína \alpha-tubulina acetilada ejercen un
claro efecto en la susceptibilidad de células diana a fusionarse y
ser infectadas por el virus VIH-1.
Se valoró además el efecto de la
sobre-expresión de la forma salvaje activa de HDAC6
(wild-type, wt) (Figura 5A y 5B) sobre la capacidad
de fusión de las proteínas gp120/gp41 y la infección por el virus
VIH-1. Como control se utilizó en paralelo una
forma mutada de la enzima HDAC6 desacetilasa inactiva (dm) (Figura
5A y 5B) en las cuales dos residuos de histidina claves para la
actividad desacetilasa fueron mutados a alanina (Serrador J.M.,
et al., 2004. Immunity 20:417-28). Se
observó que i) la capacidad de fusión de células HeLa P5
transformadas con la forma salvaje de la proteína
HDAC6-GFP con células HeLa ADA (Figura 5D) o con
células 243 (datos no mostrados), y ii) la capacidad de ser
infectadas por cepas virales de VIH-1 trópicas R5 y
X4 (Figura 5E y datos no mostrados, respectivamente) se redujeron
drásticamente con respecto a lo observado con células parentales o
células HeLa P5 transfectadas con la forma inactiva de
HDAC6-GFP (dm).
Resultados similares fueron observados en
experimentos de infección con el virus VIH-1
(Figura 6C) con la línea celular de linfocitos T
MT-2 que expresan la forma salvaje o mutada de
HDAC6-GFP, traducidas por espinoculación viral
(Figura 6A, alrededor del 70% de las células expresan las dos
formas de la enzima). Los microtúbulos acetilados corticales se
detectaron pobremente en las células MT-2 que
expresan la forma salvaje de la proteína HDAC6-GFP
(Figura 6D, determinado por la ausencia de fluorescencia en células
blancas (marcadas con asterisco) al compararse con las células
parentales o las células MT-2 que expresan la forma
mutada de la proteína HDAC6-GFP (Figura 6D, ver la
fluorescencia en células de la parte inferior de la figura). Se
observó que la enzima salvaje HDAC6-GFP altera la
entrada y la infección del virus VIH-1 (Figura 6C,
alrededor de un 75% de inhibición) mediante la determinación
cuantitativa del DNA proviral
VIH-1-gag contenido en las células
MT-2 infectadas 12 horas después de la infección
con el virus VIH-1 (Figura 6C). Por otro lado, la
sobre-expresión de la enzima HDAC6 no modificó los
niveles de CD4, CCR5 o CXCR4 en la superficie celular (Figura 5C y
6B).
Por tanto, la susceptibilidad de las células a
ser infectadas por el virus VIH-1 parece estar
directamente relacionado con sus niveles de proteína
\alpha-tubulina acetilada, e inversamente ligada
a la actividad de la enzima HDAC6 (Figura 5E y 6C).
Tal y como se ha comentado anteriormente, la
interacción cooperativa debe tener lugar entre la envoltura viral y
el receptor celular y las moléculas co-receptoras
para que se produzca la entrada del virus (Layne S.P., et
al., 1990. Nature 346:277-9; Kuhmann S.E.,
et al., 2000. J.Virol 74:7005-15) La
modificación de la co-distribución de CD4 y de las
moléculas co-receptoras en las áreas de contacto
célula/virus puede alterar el proceso de formación del poro de
fusión (Dimitrov D.S., et al., 1999. Virology
259:1-6) y, por tanto, regular la infección por el
virus VIH-1.
Por ello, se procedió a determinar si la
concentración de la enzima HDAC6 y de la proteína
\alpha-tubulina desacetilada localizadas en el
área de contacto célula/célula durante la infección del virus
VIH-1 inducían la formación de sincitios. En ambas
células transformadas, HeLa y MT-2, la forma
salvaje (wt) y mutada (dm) de la enzima HDAC6-GFP
se localizaron en el citoplasma (Figura 5A, 6D y 7C), de forma
similar a lo observado con la enzima endógena (Figura 7B). Las
células HeLa P5 y MT-2 que expresan las dos formas
de la enzima HDAC6 no sufrieron cambios morfológicos significativos
y como se indica anteriormente, los niveles de CD4, CXCR4 y CCR5 en
la superficie celular se mantuvieron inalterados (Figura 5C y 6B).
Interesantemente, se observó que la proteína
\alpha-tubulina acetilada estaba concentrada
principalmente en el área de contacto de las células usando ambas
células Env R5-tropic y X4-tropic
(Figura 7B, indicado mediante flechas).
Seguidamente, se determinó la localización de la
enzima HDAC6 durante la infección celular y se observó que el
virus VIH-1 indujo la redistribución de la enzima
HDAC6-GFP hacia las estructuras de pseudopodia,
co-localizándose con CXCR4 y CD4 (Figura 7C), lo
cual indica que la enzima HDAC6 es reclutada en las áreas de
contacto célula/virus VIH-1. Esta redistribución de
la enzima HDAC6 fue independiente de su actividad enzimática, ya
que tanto la forma salvaje como la mutada presentaron una
localización similar (Figura 7C). Más aún, la proteína
\alpha-tubulina acetilada además se concentra en
la pseudopodia inducida por el virus VIH-1, aunque
sólo en las células que expresan la forma inactiva (dm) de la
enzima HDAC6-GFP (Figura 6D, ver fluorescencia en
las figuras inferiores del panel derecho) o en células T no
tratadas que presentan bajos niveles de la enzima endógena HDAC6
(Figura 7B), mientras que no se observa dicha concentración en
células que sobre-expresan la forma activa (wt) de
la enzima HDAC6-GFP (Figura 6D, evaluado por la
ausencia de fluorescencia, células blancas en el panel derecho, ver
asterisco).
La capacidad de la enzima tubulina desacetilasa
HDAC6 de regular la co-distribución de CXCR4 y CD4
inducida por el virus VIH-1 se analizó durante las
etapas iniciales del proceso infectivo. La cepa del virus
VIH-1_{NL43} trópica X4 indujo el agrupamiento de
CXCR4 y CD4 después de 90 minutos de la infección en células
MT-2 transformadas ya sea con la forma salvaje (wt)
o con la forma mutada (dm) de la enzima HDAC6-GFP
(Figura 7C). La sobre-expresión de la forma activa
(wt) de la enzima HDAC6-GFP no tuvo efecto en la
co-distribución de CD4-CXCR4 (Figura
7C). Estos datos indican que la enzima HDAC6 altera la entrada y
la infección por el virus VIH-1 por un mecanismo que
no parece alterar las interacciones virus
VIH-1/receptor-co-receptor
en la membrana celular.
El anticuerpo monoclonal (mAb)
anti-CD4 HP2/6 (IgGl) que inhibe la interacción
gp120/CD4 ya ha sido descrito anteriormente (Carrera A.C., et
al., 1987. Eur. J. Immunol. 17:179-86); el mAb
anti-CD4 v4-ficoeritrina (PE)
(IgGl) que no reacciona con el punto de unión gp120 fue
proporcionado por Becton Dickinson (San José, CA). El anticuerpo
policlonal sc-5255 anti-HDAC6 fue
proporcionado por Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA), y
el mAb anti-\alpha-tubulina
B-5-1-2, el
anti-tubulina acetilada
6-11B-1 y el
anti-vimentina fueron proporcionados por Sigma
Chemical Co. (St. Louis, MO). El TSA y el butirato sódico (Nabut)
fueron adquiridos a Calbiochem (San Diego, CA).
SDF-1\alpha fue proporcionado gentilmente por el
Dr. F. Baleux (Pasteur Institute, Paris, Francia), el RANTES fue
obtenido de R&D (Marina del Rey, CA). Los localizadores
fluorescentes de células CMTMR y CMAC fueron obtenidas de Molecular
Probes (Eugene, OR).
Las líneas celulares T humanas Jurkat J77, las
células MT-2 y las células Jurkat T que expresan la
envoltura del virus VIH-1
(Env)-Hxbc2 (Jurkat Hxbc2) fueron cultivadas en el
medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS. El clon
celular HeLa P5, transformado de forma estable con el cDNA de las
proteínas CD4 y CCR5 humanas y con un gen reportero
\beta-Gal dirigido por el LTR del VIH
(Pleskoff O., et al., 1997. Science
276:1874-8) fue proporcionado por el Dr. M. Alizon
(Hópital Cochin, Paris, Francia). Las células HeLa 243 y ADA fueron
también proporcionadas por el Dr. M. Alizon, y
co-expresan las proteínas Tat y Env del virus
VIH-1 (Schwartz O., et al., 1994. Virology
198:360-5; Pleskoff O., et al., 1997.
Science 276:1874-8). Los linfocitos de sangre
periférica humanos (PBL) fueron obtenidos y aislados de donantes
sanos usando un gradiente de densidad por centrifugación
Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences,
Buckinghamshire, UK). Las células PBL fueron activadas durante 3
días con 1 gg/mL de PHL (Murex Diagnostics Corp. Norcross, GA) y
entonces fueron cultivados con IL-2 (6
unidades/mL).
La construcción salvaje
(wt)-HDAC6-GFP y su mutante
(dm)-HDAC6-GFP, que presenta una
doble mutación (H216A/H611A) que provoca la inactivación
desacetilasa ya han sido descritas con anterioridad (Serrador J.M.,
et al., 2004. Immunity 20:417-28). Estos dos
vectores de expresión fueron transfectados en células HeLa P5
usando Megafectin-20 (Qbiogene Inc. Carlsbad, CA)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Las células MT-2 y Jurkat J77
que expresan GFP, la forma salvaje (wt) o mutada (dm) de
HDAC6-GFP fueron obtenidas mediante la infección
con un virus murino Moloney modificado (MLV), el cual es defectivo
para la replicación. Brevemente, GFP,
wt-HDAC6-GFP y
dm-HDAC6-GFP fueron clonados en el
vector bicistrónico pLZR-IRES/GHR (gentilmente
proporcionado por el Dr. Antonio Bernad, Centro Nacional de
Biotecnología (CSIC) Madrid, España). La producción retroviral y la
transducción celular se llevó a cabo tal como se ha descrito
anteriormente (Abad J.L., et al., 2002. J.Gene.Med.
4:27-37).
Células no tratadas y tratadas con TSA o NaBut
fueron lavadas e incubadas con los anticuerpos
anti-CXCR4 o anti-CCR5 marcados con
PE-12G5, o con anti-CD4 marcado con
FITC durante 30 minutos a temperatura ambiente. Como controles se
utilizaron otros mAbs frente a dominios irrelevantes. Para los
ensayos de internalización de CXCR4, las células J77 fueron
incubadas con distintas concentraciones de
SDF-1\alpha durante 1 hora a 37ºC y
posteriormente las células fueron analizadas como se ha descrito
(Valenzuela-Fernandez A., et al., 2001.
J.Biol.Chem. 276:26550-8).
Las células HeLa P5, MT-2 y
Jurkat J77 fueron fijadas y permeabilizadas durante 3 minutos en
PBS 2% formaldehído-0.5% Triton
X-100, e inmunomarcadas para
\alpha-tubulina, \alpha-tubulina
acetilada o HDAC6 tal como se ha descrito anteriormente (Grozinger
C.M., et al., 1999. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.
96:4868-73; Serrador J.M., et al., 2004.
Immunity 20:417-28). Las células fueron
visualizadas usando un fotomicroscopio Leica DMR (Leica,
Heidelberg, Alemania) y un microscopio confocal Leica
TCS-SP.
Las células fueron resuspendidas en 60 \muL de
una solución MES (10 mM MES a pH 7.4, 150 mM de C1Na, 5 mM EGTA, 5
mM de MgCl_{2}) que contiene además un conjunto de inhibidores
de proteasas (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim, Alemania), se
sonicaron 2 veces durante 30 segundos a 4ºC y hervidos en solución
5% \beta-mercaptoetanol durante 1 minuto a 100ºC.
Los lisados celulares fueron analizados en un gel 12%
SDS-PAGE e inmunomarcados para la proteína HDAC6,
\alpha-tubulina, \alpha-tubulina
acetilada y vicentina tal como se ha descrito (Serrador et
al. (2004) HDAC6 deacetylase activity links the tunulin
cytoskeleton with immune synapse organization. Immunity
20:417-28).
Los ensayos de fusión celular
\beta-galactosidasa se realizaron tal como se ha
descrito (Valenzuela-Fernandez A., et al.,
2001. J. Biol. Chem. 276:26550-8). Brevemente, las
células HeLa 243 o HeLa ADA fueron co-incubadas con
células HeLa P5 dispuestas en placas de 96 pocillos en un ratio 1:1
durante 16 horas. Entonces, las células fusionadas fueron lavadas,
lisadas (50 \muL de solución de lisis) y la actividad enzimática
se evaluó mediante quimioluminiscencia (ensayo de gen reportero
(\beta-gal, Roche Diagnostics GMBH). Cuando se
indique, las células HeLa P5 fueron pre-tratadas
con TSA o NaBut. La tinción X-Gal de los sincitios
formados, después de 16 horas de co-cultivo celular
se realizó mediante la fijación de las células con 0.5%
glutaraldehído y marcaje con el sustrato de
\beta-galactosidasa X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indoil-(\beta-D-galactopiranosida),
tal como se ha descrito anteriormente (Pleskoff O., et al.,
1997. Science 276:1874-8).
El ensayo de fusión celular de doble
fluorescencia se realizó según está descrito
(Valenzuela-Fernandez A., et al., 2001. J.
Biol. Chem. 276:26550-8). Brevemente, las células
Jurkat Hxbc2, que expresan la Env Hxbc2 de la cepa trópica X4 del
virus VIH-1, marcadas con CMAC fueron
co-cultivadas con células TJ77
pre-cargadas con CMTMR. El sincitio celular,
marcado con dos cromóforos, se detectó 16 horas después mediante
citometría de flujo o microscopía fluorescente. Cuando se indica,
las células fueron pre-incubadas con TSA, Nabut o
mAb anti-CD4.
Las preparaciones altamente infecciosas de las
cepas del virus VIH-1_{NL43} y
VIH-1_{BAL} se generaron mediante varios pases
consecutivos de los aislados de VIH-1 originales
aislados de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) tal
como se ha descrito (Valenzuela A., et al., 1997. J. Virol.
71:8289-98). Brevemente, las células PBMC fueron
infectadas con una dosis sincrónica del virus
VIH-1_{NL43} y VIH-1_{BAL}, los
sobrenadantes del cultivo (centrifugados a 5.000 x g durante 10
minutos) se recuperaron tres días después y mantenidos a 70ºC.
Alícuotas descongeladas frescas fueron filtradas mediante un filtro
de tamaño de poro de 0.22 \mum antes de sus uso.
La infección y entrada del virus
VIH-1_{NL43} se ensayó en células PBL activadas
mediante PHA o en células MT-2. Cuando se indique,
las células T pre-tratadas con los mAbs
anti-CD4 (5 \mug/mL),
SDF-1\alpha (300 nM), AZT (5 \mug/mL), TSA o
NaBut. La entrada del virus VIH-1 en las células
MT-2 se monitorizó durante 12 horas después de la
infección con VIH-1 con la medida del DNA proviral
gag VIH-1 mediante Taqman-PCR
usando cebadores específicos tal como se ha descrito anteriormente
(Zhao Y., et al., 2002. J. Clin. Microbiol.
40:675-8). La infección de VIH-1 de
células PBL activadas con PHA se evaluaron midiendo la
concentración de p24 en el sobrenadante de los cultivos mediante
ELISA (INNOTEST HIV-1 antigen aAb Innogenetic N.Y.
Ghent, Bélgica) tal como se ha descrito (Valenzuela A., et
al., 1997. J.Virol. 71:8289-98).
La infección con cepas del virus
VIH-1_{NL43} y VIH-1_{BAL} de
las células HeLa P5 se realizó en placas de 96 pocillos durante 5
horas a 37ºC. El virus fue eliminado mediante lavado (PBS) y las
células infectadas fueron tratadas con tripsina (5 minutos a 37ºC).
Las células HeLa P5 fueron cultivadas durante las próximas 52
horas. Entonces, las células infectadas fueron lisadas, y los
niveles de infección de VIH-1 fueron evaluados
mediante medida de \beta-galactosidasa. Cuando se
indique, las células fueron pre-tratadas con TSA o
NaBut durante 2 horas a 37ºC antes de la infección con
VIH-1.
Se generó un siRNA de doble cadena frente a la
secuencia de HDAC6 comprendida entre los nucleótidos
211-231 (Eurogenentec, Seraing, Bélgica) tal como
se ha descrito (Serrador J.M., et al., 2004. Immunity
20:417-28). Las células HeLa P5 fueron
transfectadas con este siRNA a una concentración final de 200 nM
utilizando Oligofectamine (Invitrogen Corp. Carslbad, CA) según las
instrucciones del fabricante. La transfección control negativo con
sólo reactivo, o con mezclas de transfección con un siRNA de doble
cadena (Eurogenentec, Seraing, Bélgica) que no reconocen ninguna
proteína eucariota, se utilizaron como controles. Las células
fueron transfectadas dos veces durante 3 días y recogidas 24 horas
después de la última transfección. Los lisados celulares totales (40
\mug) se analizaron mediante Western blot con anticuerpos
anti-HDAC6,
anti-\alpha-tubulina acetilada y
anti-\alpha-tubulina.
Las células Jurkat J77 y MT-2
transfectadas con la forma salvaje (wt) de
HDAC6-GFP o mutada (dm) HDAC6-GFP
fueron co-cultivadas con la cepa
VIH-1_{NL43} (MOI, 1) durante 90 minutos a 37ºC.
Entonces, las partículas virales fueron aclaradas y las células
fijadas con un 2% paraformaldehído. La
co-distribución de CD4 y CXCR4 en las estructuras
de pseudopodia se analizó mediante inmunofluorescencia de las
células marcadas con un anticuerpo monoclonal no neutralizante
PE-v4 y con Alexa 350-estreptavidina
contra un anticuerpo monoclonal primario biotinilado
anti-CXCR4.
<110> UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE COMPUESTOS AGONISTAS DE LA
ACTIVIDAD TUBULINA DESACETILASA DE HDAC6 EN LA ELABORACIÓN DE
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS, DICHAS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y
SUS APLICACIONES EN EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES VIRALES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P574/2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3648
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3648)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de HDAC6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1215
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (12)
1. Uso de un compuesto agonista de la actividad
tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6, constituido por una
construcción genética o un vector de expresión HDAC6 que permite la
expresión de una proteína o péptido con actividad tubulina
desacetilasa que mimetiza la actividad tubulina desacetilasa de la
proteína HDAC6 humana en el interior de células eucariotas, en la
elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para la
profilaxis y tratamiento de enfermedades de mamíferos, ya sean
humanos u otros animales, provocadas por la entrada e infección de
un virus fusogénico de células eucariotas.
2. Uso de un compuesto según la reivindicación 1
caracterizado porque el virus fusogénico pertenece al
siguiente grupo: el virus de la gripe, el virus Semliki Forest, el
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la
inmunodeficiencia simia (SIV), el virus Sendai, el virus del Sarcoma
de Rous, el virus de la Estomatitis Vesicular, el virus Ébola, el
virus Measles, virus del Dengue, el virus de la fiebre amarilla y
de la encefalitis.
3. Uso de un compuesto según la reivindicación 1
caracterizado porque el virus fusogénico es el virus
VIH-1.
4. Uso de un compuesto según la reivindicación 1
caracterizado porque la construcción genética comprende una
o varias secuencias de nucleótidos HDAC6 pertenecientes al
siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).
5. Uso de un compuesto según la reivindicación 4
caracterizado porque el compuesto es una construcción
génica HDAC6 que comprende como secuencia de nucleótidos de a) la
SEQ ID NO 1 codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana
HDAC6 (SEQ ID NO 2).
6. Uso de un compuesto según la reivindicación 4
caracterizado porque el compuesto es una construcción
génica HDAC6 que comprende como fragmento de b) un fragmento de la
SEQ ID NO 1 codificante, al menos, de la secuencia de aminoácidos
comprendida entre los dos residuos de histina 216 y 611 de la HDAC6
humana (SEQ ID NO 2).
7. Uso de un compuesto según la reivindicación 1
caracterizado porque el compuesto está constituido por un
vector de expresión génica que comprende una secuencia de
nucleótidos HDAC6 o una construcción genética HDAC6 y que permite
la expresión de una proteína o péptido con actividad tubulina
desacetilasa que mimetiza la actividad tubulina desacetilasa de la
proteína HDAC6 humana en el interior de células de mamíferos.
8. Uso de un compuesto según las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la célula
eucariota de un mamífero es un linfocito T humano.
9. Composición farmacéutica o un medicamento
para el tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que
cursan con la entrada e infección de un virus fusogénico en una
célula eucariota caracterizada porque comprende un compuesto
agonista de la proteína HDAC6 humana, constituido por una
construcción genética o un vector de expresión HDAC6 que permite la
expresión de una proteína o péptido con actividad tubulina
desacetilasa que mimetiza la actividad tubulina desacetilasa de la
proteína HDAC6 humana en el interior de células eucariotas, en
cantidad terapéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o
más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
10. Composición farmacéutica según la
reivindicación 9 caracterizada porque comprende una o varias
de las secuencias de nucleótidos HDAC6 pertenecientes al siguiente
grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).
11. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10 caracterizada porque la secuencia de
nucleótidos de a) es la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 1
codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6 (SEQ
ID NO 2).
12. Composición farmacéutica según la
reivindicación 11 caracterizada porque la secuencia de
nucleótidos de b) es un fragmento constituido por una secuencia de
nucleótidos codificante, al menos, de la secuencia de aminoácidos
comprendida entre los dos residuos de histina 216 y 611 de la HDAC6
humana (SEQ ID NO 2).
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