WO2006111596A1 - Uso de compuestos agonistas de la actividad tubulina desacetilasa de la proteína hdac6 en la elaboración de composiciones farmacéuticas, dichas composiciones farmacéuticas y sus aplicaciones en el tratamiento de infecciones virales - Google Patents

Uso de compuestos agonistas de la actividad tubulina desacetilasa de la proteína hdac6 en la elaboración de composiciones farmacéuticas, dichas composiciones farmacéuticas y sus aplicaciones en el tratamiento de infecciones virales Download PDF

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Francisco SÁNCHEZ MADRID
Agustín FERNÁNDEZ VALENZUELA
José Román CABRERO GARCÍA
Salvador NARANJO SUÁREZ
Mónica GORDON ALONSO
Marta Barrero Villar
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Universidad Autónoma de Madrid
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Definitions

  • the present invention is based on the fact that the balance of the acetylation / deacetylation of the microtubules is key to modulate the entry of spherogenic viruses into eukaryotic cells, preferably the entry of the HIV-I virus into T cells, and that it is regulated by the HDAC6 protein, which allows defining new therapeutic approaches for the prophylaxis and treatment of viral infections.
  • These therapeutic approaches are based on the use of activating compounds of the activity of said HDAC6 protein and of the pharmaceutical compositions containing them in methods of treating said viral infections.
  • the present invention is part of the development of new pharmaceutical compositions for the prophylaxis and treatment of diseases caused by spherogenic viruses, and more preferably by the HIV-I virus. Therefore, it must be attached to the pharmacological and biomedical sector of viral diseases.
  • the process of infection of eukaryotic cells by enveloped or spherogenic viruses requires the fusion of the plasma or endosomal membranes of the host cell with the viral This reaction is catalyzed by specific proteins in the virus envelope, called fusion proteins, which allow the energy barriers of the process to be overcome.
  • Retrovirus penetration into permissive cells for infection can occur by membrane fusion dependently or independently of pH.
  • the first case is the influenza virus (T. Stegmann, A. Helenius. Influenza Virus Fusion: from models towards a mechanism, in: J. Bentz (Ed.). Viral Fusión Mechanisms, CRC Press, Boca Ratón, FL
  • fusion proteins interact with the viral envelope through its transmembrane domain, which connects the intraviral region (or cytoplasmic, in infected cells) with the ectodomain of the fusion protein.
  • the interaction of the viral fusion protein with the membrane of the target cell involves a highly hydrophobic domain of about 15 amino acid residues, called fusion peptide (SG Peisajovich, et al., 2003. BBA 1614: 122-129). This segment is located in the N-terminal region of fusion proteins, as in most orthomyxoviruses, paramyxoviruses and other related retroviruses (J. White et al., 1983. Q. Rev. Biopohys.
  • each viral fusion protein contains a single fusion peptide, which is directly responsible for destabilization of the cell membrane and initiator of the formation of the fusion pore, although the participation of other regions of Viral fusion proteins in fusion pore formation (SG Peisajovich, et al., 2003. BBA 1614: 122-129). Fusion proteins are classified into two main groups: Type I (eg influenza virus, Ebola, HIV and Measles) and type II (Dengue virus, yellow fever and encephalitis) (Reviews in, TH Sollner 2004. Current Opinion in CeIl Biology 16: 429-435; AE Smith and A. Helenius, 2004. Science 304: 237-242).
  • Type I eg influenza virus, Ebola, HIV and Measles
  • type II Dengue virus, yellow fever and encephalitis
  • Type I proteins consist of glycoproteins that are assembled into homotymers, which are associated each other through elongated spiral-shaped structures, in whose N-terminal region the fusion peptide is located. The release of energy that occurs during the insertion of the peptide into the cell membrane, allows the approach of the viral and cellular membranes in a focused manner, generating the fusion pore (Review in, AE Smith and A. Helenius, 2004. Science 304 : 237-242).
  • Type II proteins are typical of Flavivirus and alpha virus (Review in, AE Smith and A. Helenius, 2004. Science 304: 237-242), are characterized by internal fusion sequences, and are synthesized and assembled on the surface viral as heterodimers with other membrane proteins.
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome
  • Type 1 HIV HIV-I primarily infects CD4 + cells such as T lymphocytes, monocytes and dendritic cells, at the level of lymphoid organs and mucous membranes of viral entry regions (AS Fauci,
  • HIV-I infection requires a high affinity interaction between the virus envelope glycoproteins, gpl20 / gp41, with the CD4 receptor (AG Dalgleish, et al., 1984.
  • HIV-I R5 viruses infect monocytes and macrophages, and are involved in horizontal (MT Roos, et al., 1992. J.Infect.Dis. 165: 427-432) and vertical ( G. Scarlatti, et al., 1993. Virology 197: 624-629) of the virus, prevailing in the asymptomatic seropositive phase of the disease.
  • HIV-I X4 viruses which primarily infect CD4 T lymphocytes (EA Berger, et al., 1999. Annu. Rev. Immunol. 17: 657-700), become the predominant strain, being detected in 50% of HIV-I infected patients (M.
  • the disease progression phase is also characterized by an increase in viral load (viremia) and a rapid and dramatic decrease in CD4 + T cells (G. Pantaleo and AS Fauci, 1996. Annu.Rev.Microbiol. 50: 825-854), which is related to the general collapse of the immune system, and is considered a key factor in the evolution of AIDS (JD Lifson, et al., 1986. Science 232: 1123-1127; H. Blaak, et al. , 2000.
  • Lymphoid tissue in which activated and permissive immunocompetent cells for HIV-I infection are located, represents one of the main reservoirs of HIV-I and a favorable environment for viral replication. During the presentation processes of the antigen the infected cell-host cell contacts are favored. This results in cell fusion, generating multinucleated giant cells (syncytia), and favoring viral propagation. Fused infected cells die by apoptosis, quickly after their formation.
  • the process of fusion and infection of CD4 + T cells by the HIV-I virus is established by cooperative interaction of the gpl20 viral protein, not covalently associated with the transmembrane viral protein gp41, with the CD4 receptor and the CXCR4 or CCR5 corrector of the target cell (RW Doms, 2000. Virology 276: 229-37; SE Kuhmann, et al., 2000. J. Virol. 74: 7005-15).
  • HIV induces the co-distribution and / or association of the CD4 receptor with the CXCR4 or CCR5 correceptor, in the areas of contact between the virus and the target cell.
  • the cytoskeleton for viral infection there is little data on its reorganization processes that take place during HIV-I infection.
  • the cellular components of the cytoskeleton are involved in the early events during infection by different viruses, regulating the entry of the virus and the release of its genome as well as promoting the - Viral capsid movement and viral genome integration.
  • actin and tubulin cytoskeletons must be intact for effective entry of herpes simplex virus and simian virus 40, respectively (H. Deng, et al., 1996. Nature 381: 661-666; T. Dragi ⁇ , et al., 1996. Nature 381: 667-673).
  • HIV-I virus it has been described that infection and fusion with the host cell can be completely inhibited by disruption of the actin network (Y. Feng, et al., 1996. Science 272: 872- 877; EA Berger, et al., 1999. Annu.Rev. Immunol.
  • the molecular events that take place during cell fusion and the formation of the fusion pore mediated by the HIV-I virus are key phenomena in the infective process of said virus and the development of human acquired immunodeficiency disease (AIDS) .
  • AIDS human acquired immunodeficiency disease
  • the binding of the cytoskeleton to the cellular plasma membrane provides a support mechanism for said membrane that regulates its rigidity, strength and elasticity (J. Dai and MP Sheetz, 1999. Biophys.J. 77: 3363-3370).
  • the association between the cell membrane and the cytoskeleton is complex and includes cytoskeleton interactions with membrane proteins and lipids.
  • Acetylated ⁇ -tubulin constitutes the hydrophobic form of tubulin that is predominantly associated with the membrane (M. Nunez-Fernandez, et al., 1997. Mol. CeIl Biochem. 170: 91-98) by its direct interaction with the protein ubiquitous Na + cell surface, K + -ATPase (CH.
  • Stable microtubules regulate plasma membrane folding dependent on Actin and cell mobility by activating Rac-1 (CM. Waterman-Storer, et al., 1999. Curr.Opin.Cell Biol. 11: 61-67) or Rho (G. Piperno, et al., 1987 J. CeIl Biol. 104: 289-302).
  • Rac-1 CM. Waterman-Storer, et al., 1999. Curr.Opin.Cell Biol. 11: 61-6
  • Rho G. Piperno, et al., 1987 J. CeIl Biol. 104: 289-302
  • the acetylation of the ⁇ -tubulin protein is under the control of the enzyme histone deacetylase 6
  • HDAC6 C. Hubbert, et al., 2002. Nature 417: 455-458;
  • A. Matsuyama, et al., 2002. EMBO J. 21: 6820-6831 belonging to class II of the HDACs family of proteins, which is located mainly in the cytoplasm of eukaryotic cells, and is inhibited by trichostatin (TSA) (C. Hubbert, et al., 2002. Nature 417: 455-458; A. Matsuyama, et al., 2002. EMBO J. 21: 6820-6831) and tubacina (S. J Haggarty, et al. ., 2003. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100: 4389-4394).
  • TSA trichostatin
  • HDAC6 enzyme through its tubulin deacetylase activity, controls the organization in the cell membrane of CD3 and LFA-I surface receptors, the translocation of the microtubule organizing center (MTOC) and the activation of T lymphocytes (JM Serrador, et al., 2004. Immunity 20: 417-28).
  • the present invention is based on the fact that the balance of the acetylation / deacetylation of the microtubules is key to modulate the entry of spherogenic viruses into eukaryotic cells, preferably the entry of the HIV-I virus into T cells, and that it is regulated by the HDAC6 protein, which allows to define new therapeutic approaches for the prophylaxis and treatment of diseases caused by spherogenic viruses, preferably caused by the acquired human immunodeficiency virus (HIV-I). These therapeutic approaches are based on the use of compounds activating the activity of said HDACS protein and the pharmaceutical compositions containing them.
  • an object of the present invention is the use of a compound or regulatory agent, preferably an activator, inducer or agonist of the tubulin deacetylase activity of the HDAC6 protein in the manufacture of medicaments or pharmaceutical compositions for the prophylaxis and treatment of diseases. , disorders or pathologies of mammals, whether human or other animals, caused by the entry and infection of eukaryotic cells by a spherogenic virus.
  • Another object of the present invention is a pharmaceutical composition or a medicament for the treatment of diseases, disorders or pathologies that occur with the entry and infection of a fusogenic virus in a eukaryotic cell, preferably in human cells, and more preferably in T lymphocytes.
  • Another object of the present invention is the use of the pharmaceutical composition of the present invention in a method of treating a mammal, preferably a human being, affected by a disease, disorder or pathology caused by the infection of a spherogenic virus consisting of the administration of said therapeutic composition in a suitable dose that modifies the acetylation state of the tubulin and that acts by inhibiting the entry of the virus into the cell.
  • the invention faces the problem of providing new effective tools for the identification of new pharmaceutical compounds and new therapies for the prophylaxis and treatment of viral infections, preferably of spherogenic viruses, and more preferably of the HIV-I virus.
  • the solution provided by this invention is based on the fact that the described results demonstrate that the acetylation / deacetylation of the ⁇ -tubulin protein represents a key regulator of the susceptibility of the eukaryotic host cells to fuse fusion pore formation - and be infected by a Fusonogenic virus, without affecting the expression and distribution on the cell surface of the receptors involved in the specific recognition phase of the Infectious process of the host cell, specifically, infection of the T-lymphocyte by the HIV-I virus through CD4, CCR5 and CXCR4 receptors.
  • the stabilization of the ⁇ -tubulin protein acetylation was obtained by silencing the expression of the HDAC6 enzyme using interfering RNAs (siRNA) or by chemical inhibition (TSA).
  • siRNA interfering RNAs
  • TSA chemical inhibition
  • the TSA compound can inhibit other nuclear HDCAs, other broad-spectrum chemical inhibitors such as sodium butyrate (NaBut) or trapoxin B do not affect tubulin deacetylase HDAC6 activity (C. Gubert, 2002. Nature
  • overexpression of the active form (wt) of HDAC ⁇ did not alter the expression of CD4 or CXCR4, nor its distribution in HIV-I-induced pseudopods.
  • the redistribution of the HDAC6 enzyme in the CXCR4 / CD4 clustering region decreases the amount of acetylated ⁇ -tubulin in the HIV-I cell / virus contact areas, as observed in the present work, and may be associated with less deformability of the membrane due to the HIV-I virus. Therefore, it is proposed that the connection between the plasma membrane and the acetylated ⁇ -tubulin protein is influenced by the activity of the HDAC ⁇ enzyme, regulating the dynamics and elasticity of the plasma membrane, and, therefore, strongly influences the fusion capacity of viral proteins with their host cells, and in particular of the gp41 / gpl20 Env proteins of the HIV-I virus with the T lymphocyte.
  • the over-expression of this enzyme may represent a cellular mechanism of protection against HIV-I virus infection, by altering the accumulation of the ⁇ -tubulin protein acetylated in the cell / HIV-1 contact areas. It is therefore plausible that the negative effect of the HDAC6 enzyme on the fusion and infection of the HIV-I virus was more relevant as Most HDAC ⁇ protein is expressed in host cells, which could easily act in the acetylated forms of ⁇ -tubulin that are concentrated in the cell / HIV-1 contact areas.
  • the rich spots (“hot spots”) generated by the action of HIV-1, where CD4 and the co-receptor are associated did not contain acetylated OC-tubulin in the cells that overexpress the active enzyme HDAC6.
  • HDAC ⁇ enzyme represents a putative mechanism for the positive regulation of the fusion capacity of the gp4l / gpl20 proteins, which could be dependent on the cell membrane capacity of the host to be deformable, and directly related to the state of the cortical cytoskeleton of tubulin.
  • tubulin is involved in HIV-I infection in the initial stages of infection, when the acetylated ⁇ -tubulin protein confers on the cell membrane the dynamic state necessary for fusion between the cell-virus membrane.
  • the present invention is based on the fact that the balance of the acetylation / deacetylation of microtubules is key to modulating the entry of spherogenic viruses into eukaryotic cells, preferably the entry of the HIV virus into T cells, and that It is regulated by the HDAC6 protein, which allows defining new therapeutic approaches for the prophylaxis and treatment of diseases caused by spherogenic viruses, preferably caused by the virus Acquired human immunodeficiency (HIV-I). These therapeutic approaches are based on the use of compounds activating the activity of said HDAC6 protein and the pharmaceutical compositions containing them.
  • the activating or agonist compounds of HDAC6 could prevent the fusion and entry of spherogenic viruses into eukaryotic cells, preferably the fusion and entry of the HIV-I virus into T lymphocytes.
  • gene transfer technology could, through vectors suitable, be useful in a method of gene therapy treatment to express, preferably tissue-specific, the enzyme HDAC6 in the T lymphocytes of patients suffering from such diseases.
  • an object of the present invention is the use of a compound or regulatory agent, preferably an activator, inducer or agonist of the tubulin deacetylase activity of the HDAC6 protein, hereinafter use of a compound of the present invention, in the preparation of drugs or pharmaceutical compositions for the prophylaxis and treatment of diseases, disorders or pathologies of mammals, whether human or other animals, caused by the entry and infection of eukaryotic cells by a spherogenic virus.
  • the term "compound / activator or agonist” refers to a molecule that when bound or interacts with the HDAC6 protein, or with functional fragments thereof, increases the intensity or prolongs the duration of the biological activity of said protein. In this definition It also includes those compounds or molecules that allow to increase the expression of the gene coding for the HDAC6 protein, either the endogenous form that exists naturally in a cell or an exogenous form that is artificially introduced into said cell.
  • An activating agent may consist of a peptide, a protein, a nucleic acid, carbohydrates, an antibody, a chemical compound, or any other type of molecule that increases the effect and / or duration of the activity of the HDAC ⁇ protein.
  • influenza virus refers to a virus that infects eukaryotic cells, preferably from human and non-human mammals, by fusing the plasma or endosomal membrane of said host cell and the viral envelope. belonging, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, to the following group: influenza virus (Review in, T. Stegmann and A. Helenius. Influenza virus fusion: fusion models towards a mechanism, in: J Bentz (Ed.) / Viral Fusion Mechanisms, CRC Press, Boca Raton, PL, 1993, pp: 89-111), Semliki Forest virus (R. bron, et al., 1993. EMBO J.
  • influenza virus Review in, T. Stegmann and A. Helenius. Influenza virus fusion: fusion models towards a mechanism, in: J Bentz (Ed.) / Viral Fusion Mechanisms, CRC Press, Boca Raton, PL, 1993, pp: 89-111
  • Semliki Forest virus R.
  • a particular object of the present invention is the use of a compound of the invention in which the pharmaceutical composition is used for the prophylaxis and treatment of acquired human immunodeficiency disease caused by the HIV-I virus.
  • HIV-I virus refers to any of the existing strains of the HIV-I and HIV-2 virus.
  • agonist compounds of the activity of the HDACs proteins which can be used in the scope of the present invention as agonists of the HADC6 protein, and which are indicated below by way of illustration without That means a limitation on the scope of the present invention: xanthines (US Patent 20030134865).
  • another particular object of the present invention is the use of a compound of the present invention in which the agonist compound is constituted by a xanthine or its derivatives.
  • Another particular object of the present invention is the use of a compound of the present invention in which the compound is constituted by a genetic construct, hereinafter referred to as the HDAC6 gene construct of the present invention, which allows the expression of a protein or peptide with tubulin deacetylase activity that mimics the tubulin deacetylase activity of human HDAC6 protein inside mammalian cells, preferably human, and more preferably in T lymphocytes, similar to the genetic constructs elaborated in the present invention (See Example 3) and comprising one or more HDAC6 nucleotide sequences belonging to the following group: a) a nucleotide sequence consisting of the nucleotide sequence encoding the HDAC6 human tubulin deacetylase protein, b) a nucleotide sequence analogous to the sequence of a), c)
  • analog is intended to include any nucleotide sequence that can be isolated or constructed based on the sequence shown herein (SEQ ID NO1), for example, by introducing substitutions of conservative or non-conservative nucleotides, including the insertion of one or more nucleotides, the addition of one or more nucleotides at either end of the molecule or the deletion of one or more nucleotides at either end or inside the sequence, and that allows coding of a peptide or protein capable of mimicking the tubulin deacetylase action of human HDAC6.
  • the nucleotide sequence, full length, coding for the HDAC6 human tubulin deacetylase protein used in the present invention (SEQ ID NO1) is identified by accession number AF132609 in the NCBI.
  • an analogous nucleotide sequence is substantially homologous to the nucleotide sequence discussed above.
  • the term "substantially homologous” means that the nucleotide sequences in question have a degree of identity of at least 30%, preferably of at least 85%, or more preferably of At least 95%. It should be noted that the nucleotide sequence of human HDAC6 (SEQ ID NO1) has a variable homology with respect to other forms existing in other species.
  • nucleotide sequence of a) of the HDAC6 gene construct is the HDAC6 nucleotide sequence characterized by SEQ ID NO1 encoding the tubulin deacetylase protein human HDAC6 (SEQ ID N02).
  • a particular embodiment of the present invention is the use of the compound of the present invention in which the HDAC6 gene construct comprises the HDAC6 nucleotide sequence characterized in that it is a fragment of b) constituted by a nucleotide sequence encoding at least the sequence of amino acids between the two histine residues 216 and 611 of the human HDAC6 (SEQ ID NO2), keys to its functional activity.
  • HDAC6 deacetylase activity links the tubulin cytoskeleton with immune synapse organization. Immunity 20: 417-428) so This domain may be necessary for a fragment of HDAC6 to be functionally active.
  • the HDAC6 gene construct of the invention can also comprise, if necessary and to allow a better isolation, detection or secretion to the cytoplasm of the expressed peptide, to a nucleotide sequence encoding a peptide capable of being used for isolation, detection purposes. or secretion of said peptide.
  • another particular object of the present invention is the use of a compound of the present in which the agonist compound is an HDAC6 genetic construct described above which comprises, in addition to the HDAC6 nucleotide sequence, any other coding nucleotide sequence of a peptide or peptide sequence that allows the isolation, detection or secretion to the cellular cytoplasm of the peptide expressed, for example, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, a polyhistidine sequence (6xHis), a peptide sequence recognizable by a monoclonal antibody (for example, for identification, or any other that serves to purify the resulting fusion protein by immunoaffinity chromatography: tag peptides such as c-myc, HA, E-tag) (Using antibodies: a laboratory manual Ed. Harlow and David La ⁇ e (1999) CoId Spring Harbor Laboratory Press. New York Chapter: Tagging proteins. Pp. 347-377).
  • HDAC ⁇ nucleotide sequence and the HDAC6 genetic construct described previously can be obtained by one skilled in the art by employing techniques widely known in the state of the art (Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual 2 nd ed., CoId Sping Harbor Laoratory Press, NY, 1989 vol 1-3) Such nucleotide sequences may be integrated into a gene expression vector that allows regulation of expression thereof under appropriate conditions.
  • another particular object of the present invention is the use of a compound of the present invention in which the compound is constituted by a gene expression vector, hereinafter HDAC6 expression vector, comprising an HDAC6 nucleotide sequence or a HDAC6 genetic construction described in the present invention and which allows the expression of a protein or peptide with tubulin deacetylase activity that mimics the tubulin deacetylase activity of human HDAC ⁇ protein inside mammalian cells, preferably human cells, and more preferably in lymphocytes T.
  • HDAC6 expression vector comprising an HDAC6 nucleotide sequence or a HDAC6 genetic construction described in the present invention and which allows the expression of a protein or peptide with tubulin deacetylase activity that mimics the tubulin deacetylase activity of human HDAC ⁇ protein inside mammalian cells, preferably human cells, and more preferably in lymphocytes T.
  • an expression vector comprises, in addition to the HDAC6 nucleotide sequence or the HDAC6 genetic construct described in the invention, a promoter that directs its transcription (eg, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD, Drefc , etc.), to which it is operatively linked, and other necessary or appropriate sequences that control and r egulate such transcription and, where appropriate, the translation of the product of interest, for example, transcription initiation and termination signals (tlt2, etc.), polyadenylation signal, origin of replication, ribosome binding sequences (RBS), coding sequences of transcriptional regulators, (enhancers), silencers transcriptional (silencers), repressors, etc.
  • a promoter that directs its transcription eg, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD, Drefc , etc.
  • a promoter that directs its transcription eg,
  • expression vectors can be selected according to the conditions and needs of each specific case among expression plasmids, viral vectors (DNA or KNA), cosmids, artificial chromosomes, etc. which may also contain markers that can be used to select cells transiected or transformed with the gene or genes of interest.
  • the choice of the vector will depend on the host cell and the type of use to be performed. Therefore, according to a particular embodiment of the present invention said vector is a plasmid.
  • the obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art as well as for the transformation of microorganisms and eukaryotic cells different widely known methods can be used - chemical transformation, electroporation, microinjection, etc - described in various manuals [ Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2 nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY].
  • Gene expression systems may or may not allow the integration of the new genetic material into the genome of the host cell.
  • both the nucleotide sequence, gene construct or expression vector HDAC6 can be used as a medicament to protect host cells, preferably T lymphocytes, against infection of a spherogenic virus, preferably by HIV-I virus, in a method of treatment and prophylaxis of in vitro gene therapy of human T lymphocytes against HIV.
  • host cells preferably T lymphocytes
  • a spherogenic virus preferably by HIV-I virus
  • Biopharmaceutical tools and gene therapy procedures are sufficiently known by an expert in the art sector.
  • the origin of these agonist regulatory compounds of the activity of the HDAC proteins can be varied, so that they can be natural (for example, of plant, bacterial, viral, animal or eukaryotic microorganisms) or synthetic origin.
  • Another object of the present invention is a pharmaceutical composition or a medicament for the treatment of diseases, disorders or pathologies that occur with the entry and infection of a fusogenic virus in a eukaryotic cell, preferably in human cells, and more preferably in T lymphocytes.
  • pharmaceutical composition of the present invention which comprises a compound or activating agent of the HDAC6 protein, in a therapeutically effective amount together with, optionally, one or more pharmaceutically acceptable adjuvants and / or vehicles and which is capable of inhibiting the entry of said virus in the eukaryotic cell.
  • compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art. matter and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of the agonist regulatory agent or compound of the tubulin deacetylase activity of the HDAC6 protein, calculated to produce the desired effect and, in general, will come determined, among other causes, by the characteristics of the compounds, including the age, condition of the patient, the severity of the alteration or disorder, and the route and frequency of administration.
  • said therapeutic composition is prepared in the form of a solid form or aqueous suspension, in a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the therapeutic composition provided by this invention may be administered by any appropriate route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • the administration of the therapeutic composition provided by this invention is carried out parenterally, orally, intraperitoneally, subcutaneously, etc.
  • a review of the different pharmaceutical forms of drug administration and of the excipients necessary to obtain them can be found, for example, in the "Galician Pharmacy Treaty", C. Faul ⁇ i Trillo, 1993, Luzán 5, SA Ediations , Madrid.
  • Another particular object of the present invention is a pharmaceutical composition of the invention. in which the agonist compound is a xanthine or its derivatives.
  • Another particular object of the present invention is a pharmaceutical composition of the invention in which the activating compound is a genetic construct or an HDAC6 expression vector that allows the expression of a protein or peptide with tubulin deacetylase activity that mimics tubulin deacetylase activity of human HDAC6 protein inside mammalian cells, preferably human, and more preferably in T lymphocytes, similar to the genetic constructs elaborated in the present invention (see example 3) and comprising one or more of the sequences of HDAC6 nucleotides belonging to the following group: a) a nucleotide sequence consisting of the nucleotide sequence encoding the human tubulin deacetylase HDAC6 protein, b) a nucleotide sequence analogous to the sequence of a), c) a fragment of any one of the sequences of a) and b), and d) a nucleotide sequence that co It has any sequence belonging to a), b) and c).
  • the activating compound is
  • nucleotide sequence of a) is the nucleotide sequence SEQ ID NO1 encoding the human tubulin deacetylase HDAC6 protein (SEQ ID N02).
  • nucleotide sequence of b) is a fragment consisting of a nucleotide sequence encoding at least the amino acid sequence comprised between the two residues of histine 216 and 611 of the HDAC6 (SEQ ID N02).
  • Another object of the present invention is the use of the pharmaceutical composition of the present invention, hereinafter use of the pharmaceutical composition of the present invention, in a method of treatment or prophylaxis of a mammal, preferably a human being, affected by a disease, disorder or pathology caused by the infection of a fusogenic virus consisting of the administration of said therapeutic composition in adequate dose that modifies the acetylation state of tubulin and that acts by inhibiting the entry of the virus into the cell.
  • this HDAC6 agonist compound can favor the deacetylation of tubulin by increasing the tubulin deacetylase activity of the HDAC6 protein inside the eukaryotic cells and, therefore, preventing the entry and infection of the virus.
  • the use of the pharmaceutical composition of the present invention can be used in a treatment method in isolation or in conjunction with other pharmaceutical compounds.
  • Another particular object of the present invention is the use of the pharmaceutical composition of the invention in a method of treating a disease caused by a spherogenic virus that infects eukaryotic cells, preferably human and non-human mammalian cells, belonging, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, to the following group: the influenza virus (Review in, T. Stegmann and A. Helenius. Influenza fusion virus: fusion models towards a mechanism, in: J. Bents (Ed.), Viral Fusion Mechanisms, CRC Press, Boca Raton, FL, 1993, pp.-89-lll), the Semliki Forest virus (R. bron, et al., 1993. EMBO J.
  • influenza virus Review in, T. Stegmann and A. Helenius.
  • Influenza fusion virus fusion models towards a mechanism, in: J. Bents (Ed.), Viral Fusion Mechanisms, CRC Press, Boca Raton, FL, 1993, pp.-89-
  • HAV human immunodeficiency virus
  • SIV simian immunodeficiency virus
  • Sendai virus D. Hoekstra, et al., 1985. Biochemistry 24: 4739-4745
  • Rous Sarcoma virus Review in, 3.G. Peisajovich and Y. Shai. 2003. BBA 1614: 122-129
  • Vesicular Stomatitis virus Review in, SG Peisajovich and Y. Shai.
  • BBA 1614: 122-129 Ebola virus (Review in, SG Peisajovich and Y. Shai. 2003. BBA 1614: 122-129), Measles virus, Dengue virus, yellow fever virus and Encephalitis (Review in, TH Sollner.
  • Another particular embodiment of the present invention is the use of the pharmaceutical composition of the invention in a method of treating acquired human immunodeficiency disease caused by the HIV-I spherogenic virus. DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • HIV-I (a) X-GaI mapping of HeLa P5 cells fused with HeLa ADA cells in the absence (control) or presence of TSA (10, 100 and 300 nM), NaBut (2 ⁇ M), RANTES
  • HeLa P5 treated with 300 nM of 2 ⁇ M TB NaBut or untreated cells (e) Western blot for kinetic analysis of deacetylation of ⁇ -tubulin protein after treatment with TSA (300 nM, 4 hrs.) In clarified HeLa P5 cells .
  • FIG. 1 - Inhibition of the HDAC ⁇ enzyme increases cell fusion in T lymphocytes mediated by Env proteins of the VHI-I virus.
  • FIG. 3 Silence of HDAC6 expression increases fusion with cells expressing HIV-I virus Env proteins.
  • FIG. 1 Effect of silencing of the HDAC6 siRNA in the HIV-1 virus infection of HeLa P5 cells. Infection is measured by ⁇ -Gal production. In addition, the effect of a neutralizing monoclonal antibody is shown.
  • Figure 5 - Overexpression of HDAC6 decreases the ability of cells to fuse and be infected by the HIV-I virus.
  • results are representative of 3 independent experiments, (d) Location of acetylated ⁇ -tubulin and wild (wt) or mutated (dm) HDAC6-GFP enzyme in MT-2 cells, before and during HIV-I infection ( control, left panel and HIV-I NL43 in right panel, respectively).
  • Figure 7. The HIV-I virus recruits the HDAC6 enzyme and acetylated ⁇ -tubulin protein in the cell / virus contact areas, where CD4 and CXCR4 are co-distributed. (a) Redistribution of the acetylated ⁇ -tubulin protein in cell fusion models with HeLa cells and T lymphocytes (see arrowhead) in the cell / cell contact areas of the syncytium.
  • Example 1 The blocking of the HDAC6 enzyme promotes the formation of the syncytium dependent on gp41 / gpl20.
  • TSA increased HIV-I virus infection in a dose-dependent manner in HeLa P5 cells and in PBL ( Figure 4A and 4B) with any of the strains used: R5-tropic HIV-l ⁇ ai and X4-tropic HIV-INL-43 ( Figure 4A and 4B).
  • TSA increased HIV-I infection through the inhibition of the cytosolic HDAC ⁇ enzyme and the stabilization of cortical acetylated ⁇ -tubulin protein (Figure 4B), which was maintained after the removal of TSA ( Figure 4A and 4B) , which excludes the transcriptional effects of TSA in the production of ⁇ -GaI and in the replication of the HIV-I virus.
  • Example 3 Overexpression of HDAC6 alters cell fusion and HIV-I viral infection.
  • Example 4. The HIV-I virus recruits the HDAC6 enzyme and the acetylated ⁇ -tubulin protexna in the virus / cell contact areas.
  • acetylated OC-tubulin protein also concentrates on HIV-I virus-induced pseudopodia, although only in cells that express the inactive form (dm) of the HDAC ⁇ -GFP enzyme (Figure 6D, see fluorescence in lower figures of the right panel) or in untreated T cells that have low levels of the endogenous enzyme HDAC ⁇
  • anti-CD4 monoclonal antibody HP2 / 6 (IgGl) that inhibits the gpl20 / CD4 interaction has already been described previously (Carrera A. C, et al., 1987. Eur. J. Immunol. 17: 179-86 ); anti-CD4 v4-phycoerythrin (PE) (IgGl) mAb that does not react with the gpl20 junction point was provided by Becton Dickinson (San Jose, CA). He .
  • polyclonal antibody sc-5255 anti-HDAC6 was provided by Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA), and anti- ⁇ -tubulin mAb B-5-1-2, acetylated anti-tubulin 6-11B-1 and the Anti-vimentin were provided by Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
  • TSA and sodium butyrate (Nabut) were purchased from Calbiochem (San Diego, CA).
  • SDF-l ⁇ was kindly provided by Dr. F. Baleux (Pasteur Institute, Paris, France), the RANTES was obtained from R&D (Marina del Rey, CA).
  • the fluorescent locators of CMTMR and CMAC cells were obtained from Molecular Probes (Eugene, OR). Cells
  • Jurkat J77 human T cell lines, MT-2 cells and Jurkat T cells expressing the envelope of HIV-I (Env) -Hxbc2 virus (Jurkat Hxbc2) were cultured in RPMI 1640 culture medium supplemented with 10% of FCS
  • HDAC6 recombinant DNA constructs and cell lipo-transfection technique The wild (wt) -HDAC6-GFP and its mutant (dm) construction - HDAC6-GFP, which has a double mutation (H216A / H611A) that causes inactivation of deacetylase have already been described previously (Serrador JM, et al.,
  • MMV Moloney murine virus
  • the cells were resuspended in 60 ⁇ L of a MES solution (10 mM MES at pH 7.4, 150 mM ClNa, 5 mM EGTA, 5 mM MgCl 2 ) which also contains a set of protease inhibitors (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim, Germany), were sonicated twice for 30 seconds at 4 ° C and boiled in 5% ⁇ -mercaptoethanol solution for 1 minute at 100 0 C.
  • Cell lysates were analyzed on a 12% SDS-PAGE gel and immunolabelled for HDAC6 protein , ⁇ -tubulin, acetylated ⁇ -tubulin and vicentine as described (Serrador et al. (2004) HDAC6 deacetylase activity links the tunulin cytoskeleton with immune synapse organization. Immunity 20: 417-28). Determination of Env-mediated cell-cell cell fusion of HIV-I virus.
  • ⁇ -galactosidase cell fusion assays were performed as described (Valenzuela-Fernandez A., et al., 2001. J. Biol. Chem. 276: 26550-8). Briefly, HeLa 243 or HeLa ADA cells were co-incubated with HeLa P5 cells arranged in 96-well plates in a 1: 1 ratio for 16 hours. Then, the fused cells were washed, lysed (50 ⁇ L of lysis solution) and the enzymatic activity was evaluated by chemiluminescence ( ⁇ -gal reporter gene assay, Roche Diagnostics GMBH). When indicated, HeLa P5 cells were pre-treated with TSA or NaBut.
  • X-GaI staining of the syncytiums formed after 16 hours of cell co-culture was performed by fixing the cells with 0.5% glutaraldehyde and marking with the substrate of ⁇ -galactosidase X-gal (5-bromo-4 ⁇ chloro-3-indoyl- ⁇ -D-galactopyranoside), as described above
  • the double fluorescence cell fusion assay was performed as described (Valenzuela-Fernandez A., et al., 2001. J. Biol. Chem. 276: 26550-8). Briefly, Jurkat Hxbc2 cells, which express the Hxbc2 Env of the tropic strain X4 of the HIV-I virus, labeled with CMAC were co-cultured with TJ77 cells pre-loaded with CMTMR. The cellular syncytium, labeled with two chromophores, was detected 16 hours later by flow cytometry or fluorescent microscopy. When indicated, the cells were pre-incubated with TSA, Nabut or anti-CD4 mAb. Preparation of HIV-I virus Highly infectious preparations of the HIV-1 NL , 43 and HIV-1 BAL virus strains were generated by several consecutive passes of the original HIV-I isolates isolated from peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC cells were infected with a synchronous dose of HIV- virus 1NL4 3 and HIV-IBAL / culture supernatants
  • HIV-I NL43 virus Infection and entry of the HIV-I NL43 virus was tested in PBL cells activated by PHA or in MT-2 cells. When indicated, pre-treated T cells with anti-CD4 mAbs (5 ⁇ g / mL), SDF-l ⁇ (300 nM), AZT (5 ⁇ g / mL), TSA or NaBut. The entry of HIV-I virus into MT-2 cells was monitored for 12 hours after infection with HIV-I with the measurement of HIV-I gag proviral DNA by Taqman-PCR using specific primers as described above ( Zhao Y., et al., 2002. J.Clin.Microbiol. 40: 675-8).
  • HIV-I infection of PBL cells activated with PHA were evaluated by measuring the concentration of p24 in the culture supernatant by ELISA (INNOTEST HIV-I antigen aAb Innogenetic NY Ghent, Belgium) as described (Valenzuela A., et al., 1997. J. Virol. 71: 8289-98).
  • HeLa P5 cells were transfected with this siRNA at a final concentration of 200 nM using Oligofectamine (Invitrogen Corp. Carslbad, CA) according to the manufacturer's instructions. Negative control transfection with reagent only, or with transfection mixtures with a double stranded siRNA (Eurogenentec, Seraing, Belgium) that do not recognize any eukaryotic protein, were used as controls. The cells were transfected twice for 3 days and collected 24 hours after the last transfection. Total cell lysates (40 ⁇ g) were analyzed by Western blotting with anti-HDAC6, anti-oc-tubulin acetylated and anti- ⁇ -tubulin antibodies.
  • Jurkat J77 and MT-2 cells transfected with the wild (wt) form of HDAC6-GFP or mutated (dm) HDAC6-GFP were co-cultured with the strain HIV-1 NL43 (MOI, 1) for 90 minutes at 37 0 C. Then, the viral particles were cleared and the cells fixed with 2% paraformaldehyde. The co-distribution of CD4 and CXCR4 in pseudopodia structures was analyzed by immunofluorescence of cells labeled with a non-neutralizanet monoclonal antibody PE-v4 and with Alexa 350-streptavidin against a biotinylated primary monoclonal antibody anti-CXCR4.

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Abstract

La presente invención se basa en el hecho de que el equilibrio de la acetilación/desacetilación de los microtúbulos es clave para modular la entrada de virus fusogénicos en las células eucariotas, preferentemente la entrada del virus VIH-I en las células T, y que está regulado por la proteína HDAC 6, lo que permite definir nuevas aproximaciones terapéuticas para la profilaxis y tratamiento de infecciones virales. Estas aproximaciones terapéuticas se basan en el uso de compuestos activadores de la actividad de dicha proteína HDAC6 y de las composiciones farmacéuticas que los contienen en métodos de tratamiento de dichas infecciones virales.

Description

-ILUSO DE COMPUESTOS AGONISTAS DE LA ACTIVIDAD TUBULINA
DESACETILASA DE LA PROTEINA HDAC6 EN LA ELABORACIÓN DE COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS, DICHAS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y SUS APLICACIONES EN EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES VIRALES
La presente invención se basa en el hecho de que el equilibrio de la acetilación/desacetilación de los microtúbulos es clave para modular la entrada de virus fusogénicos en las células eucariotas, preferentemente la entrada del virus VIH-I en las células T, y que está regulado por la proteína HDAC6 , lo que permite definir nuevas aproximaciones terapéuticas para la profilaxis y tratamiento de infecciones virales. Estas aproximaciones terapéuticas se basan en el uso de compuestos activadores de la actividad de dicha proteína HDAC6 y de las composiciones farmacéuticas que los contienen en métodos de tratamiento de dichas infecciones virales.
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se enmarca en el desarrollo de nuevas composiciones farmacéuticas para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades provocadas por virus fusogénicos, y más preferentemente por el virus VIH-I. Por lo tanto, debe adscribirse al sector farmacológico y biomédico dé las enfermedades virales.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El proceso de infección de células eucariotas por virus con envoltura o fusogénicos requiere de la fusión de las membranas plasmática o endosomal de la célula huésped con la viral . Esta reacción está catalizada por proteínas específicas de la envoltura del virus, denominadas proteínas de fusión, que permiten sobrepasar las barreras energéticas del proceso. Por ejemplo, la penetración de Retrovirus en células permisivas para la infección puede ocurrir por fusión de membrana de forma dependiente o independiente del pH. El primer caso es propio del virus de la gripe (T. Stegmann, A. Helenius . Influenza Virus Fusión: from models toward a mechanism, in: J. Bentz (Ed.) . Viral Fusión Mechanisms, CRC Press, Boca Ratón, FL
(1993, pp. 89-111)), del virus Semliki Forest (R. Bron, et al., 1993. EMBO J. 12: 693-701), y el segundo caso del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y simios (SIV)
(M.0. McClure, et al., 1988. EMBO J. 7: 513-518) o del virus Sendai (D. Hoekstra et al., 1985. Biochemistry 24: 4739-4745) . Hay que destacar que ambos procesos son mecanísticamente similares, salvo que la fusión de membrana tiene lugar en endosomas o en la superficie de la célula diana, respectivamente (I. Martín, et al., 1999. Advance Drug Delivery Reviews 38: 233-255). Durante el proceso de fusión las proteínas virales de fusión interaccionan simultáneamente con las membranas celular y viral, favoreciendo la formación del poro de fusión (T. H. Sollner, 2004. Current Opinión in CeIl Biology 16: 429- 435) . La mayoría de las proteínas virales de fusión que se conocen interaccionan con la envoltura viral a través de su dominio de transmembrana, que conecta la región intraviral (o citoplasmática, en las células infectadas) con el ectodominio de la proteína de fusión. Por otra parte, se acepta que la interacción de la proteína de fusión viral con la membrana de la célula diana involucra un dominio altamente hidrofδbico, de unos 15 residuos aminoacídicos, denominado péptido de fusión (S. G. Peisajovich, et al., 2003. BBA 1614: 122-129). Este segmento se encuentra localizado en la región N-terminal de las proteínas de fusión, como ocurre en la mayoría de los ortomixovirus, paramixovirus y otros retrovirus relacionados (J. White et al., 1983. Q.Rev.Biopohys . 16: 151-195; B. M. Blumberg et al., 1985. J.Gen.Virol. 66: 317-331; W. R. Gallaher. 1987. CeIl 50: 327-328), o en el interior del ectodominio de la proteína de fusión como en los casos del virus del Sarcoma de Rous (E. Hunter et al., 1983. J.Virol. 46: 920-936), del virus de la Estomatitis Vesicular (M.A. Whitt, et al., 1990. J.Virol. 64: 4907-4913) y del virus Ébola (W. R. Gallaher. 1996. CeIl 85: 477-478). Generalmente, se acepta que cada proteína de fusión viral contiene un único péptido de fusión, el cual es responsable directo de la desestabilisación de la membrana celular e iniciador de la formación del poro de fusión, aunque no se puede obviar la participación de otras regiones de las proteínas de fusión viral en la formación del poro de fusión (S. G. Peisajovich, et al., 2003. BBA 1614: 122- 129) . Las proteínas de fusión se clasifican en dos grupos principales: Tipo I (ej . Virus de la gripe, ébola, HIV y Measles) y tipo II (virus del Dengue, de la fiebre amarilla y de la encefalitis) (Revisiones en, T. H. Sollner. 2004. Current Opinión in CeIl Biology 16: 429- 435; A. E. Smith and A. Helenius, 2004. Science 304: 237- 242) . Las proteínas de Tipo I consisten en glucoproteínas que se ensamblan en homotrímeros , los cuales se asocian entre sí a través de estructuras alargadas con forma de espiral enrollada, en cuya región N-terminal se localiza el péptido de fusión. La liberación de energía que se produce durante la inserción del péptido en la membrana celular, permite la aproximación de las membranas viral y celular de forma focalizada, generándose el poro de fusión (Revisión en, A. E. Smith and A. Helenius, 2004. Science 304: 237-242). Las proteínas de Tipo II son propias de Flavivirus y virus alfa (Revisión en, A. E. Smith and A. Helenius, 2004. Science 304: 237-242), se caracterizan por poseer secuencias de fusión internas, y se sintetizan y ensamblan en la superficie viral como heterodímeros con otras proteínas de membrana. A pH bajo, se produce un cambio en la estructura cuaternaria de los heterocomplej os , permitiendo la disociación de la proteína de fusión viral del heterodímero, y favoreciendo la reagrupación entre sí de las proteínas de fusión para formar homotrímeros activos y funcionales (Revisión en, A. E. Smith and A. Helenius, 2004. Science 304: 237-242). Por otro lado, el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) es el agente etiológico del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) (F. Barre-Sinoussi, et al., 1983. Science 200:868-871). El VIH de tipo 1 (HIV-I) infecta principalmente células CD4+ como linfocitos T, monocitos y células dendríticas, a nivel de los órganos linfoides y las mucosas de las regiones de entrada viral (A. S. Fauci,
.1988. Science 239: 617-622; S. Patterson, et al., 1994.
Res.Virol. 145: 171-176). La infección por VIH-I necesita de una interacción de alta afinidad entre las glucoproteínas de la envuelta del virus, gpl20/gp41, con el receptor CD4 (A. G. Dalgleish, et al., 1984.
Nature 312: 763-767/ P. J. Maddon, et al., 1986. CeIl 47: 333-348) y requiere además de la asociación con receptores de quimiocinas , principalmente CCR5 (H. Choe, et al., 1996. CeIl 85: 1135-1148, H. Deng, et al., 1996. Nature 381: 661-666; T. Dragic, et al., 1996. Nature 381: 667-673) y CXCR4 (Y. Feng, et al., 1996. Science 272: 872-877), denominados co-receptores . Así, se ha propuesto que la unión secuencial de la proteína viral gpl20 con CD4 , y con uno de los co-receptores, induce cambios conformacionales específicos en gp41, permitiendo así la fusión viral con la membrana plasmática celular y la formación del poro de fusión (H. Choe, et al., 1996. CeIl 85: 1135-1148). El co-receptor utilizado por el VIH-I determina el tropismo de la cepa viral. En consecuencia, los virus que utilizan el z-eceptor CCR5 se denominan R5 trópicos y los que utilizan CXCR4 , X4 trópicos (E.A. Berger, et al., 1999. Annu . Rev . Immunol . 17: 657-700). Desde un punto de vista clínico, los virus VIH-I R5 infectan monocitos y macrófagos, y se implican en la transmisión horizontal (M. T. Roos, et al., 1992. J.Infect.Dis. 165: 427-432) y vertical (G. Scarlatti, et al., 1993. Virology 197: 624-629) del virus, prevaleciendo en la fase seropositiva asintomática de la enfermedad. En etapas avanzadas de la enfermedad, los virus VIH-I X4, que infectan principalmente linfocitos T CD4 (E.A. Berger, et al., 1999. Annu . Rev . Immunol . 17: 657-700), se convierten en la cepa predominante, detectándose en un 50% de los enfermos infectados por el VIH-I (M. Tersmette, et al., 1988. J.Virol. 62: 2026- 2032; R. I. Connor, et al., 1997. J.Exp.Med. 185:621-628). La fase de progresión de la enfermedad se caracteriza, además, por un aumento de la carga viral (viremia) y una disminución rápida y dramática de linfocitos T CD4+ (G. Pantaleo and A. S. Fauci, 1996. Annu.Rev.Microbiol . 50: 825-854), que se relaciona con el colapso general del sistema inmune, y se considera factor clave en la evolución del SIDA (J. D. Lifson, et al., 1986. Science 232: 1123-1127; H.Blaak, et al., 2000. Proc.Natl.Acad.Sci. U. S. A. 97: 1269-1274). El tejido linfoide, en el cual se localizan células inmunocompetentes activadas y permisivas para la infección por el VIH-I, representa unos de los principales reservorios del VIH-I y un entorno favorable para la replicaσión viral. Durante los procesos de presentación del antígeno los contactos célula infectada- célula huésped se favorecen. Esto deriva en la fusión celular, generándose células gigantes multinucleadas (sincitios) , y favoreciéndose la propagación viral. Las células infectadas fusionadas mueren por apoptosis, rápidamente después de su formación. Este proceso se relaciona con la degeneración del entorno linfoide, la depleción dramática de células T CD4+, y se asocia con la aparición de cepas VIH-I X4 trópicas (A. S. Fauci, 1996. Nature 384: 529-539; A. B. Van't Wout, et al., 1998. J.Virol. 72: 5099-5107). La fusión y muerte de las células infectadas, conjuntamente con la lisis de células individuales, se consideran los efectos citopáticos agudos del VIH (D. D. Ho, et al., 1995. Nature 373: 123- 126; X. Wei, et al., 1995. Nature 373: 117-122). El proceso de fusión e infección de células T CD4+ por el virus VIH-I se establece por interacción cooperativa de la proteína viral gpl20, asociada no covalentemente a la proteína viral de transmembrana gp41, con el receptor CD4 y el correceptor CXCR4 ó CCR5 de la célula diana (R.W. Doms, 2000. Virology 276: 229-37; S. E. Kuhmann, et al., 2000. J.Virol. 74: 7005-15). Durante esta primera etapa de interacción virus-célula, el VIH induce la codistribución y/o asociación del receptor CD4 con el correceptor CXCR4 ó CCR5 , en las zonas de contacto entre el virus y la célula diana. En consecuencia, el bloqueo de la codistribución de los receptores CD4 y CXCR4/CCR5 dificulta la formación del poro de fusión, inhibiendo las etapas de fusión y entrada viral (D. S Dimitrov, et al., 1999. Virology 259:1-6). Más concretamente, distintos estudios sugieren que cada trímero de Env del virus VIH-I interactúa con múltiples moléculas de CD4 , CXCR4 o CCR5
(H. Choe, et al., 1996. CeIl 85: 1135-1148) y que son necesarios varios trímeros para la formación del poro de fusión (S. E. Kuhmann, et al., 2000. J.Virol. 74: 7005-
7015) . La fusión de las membranas celular y viral, regida en último término por la proteína gp41, implica necesariamente la reorganización del citoesqueleto de la célula diana, modificaciones de la morfología celular y la inducción de señales celulares. Sin embargo, y aunque hay evidencias de la importancia del citoesqueleto para la infección viral, existen pocos datos sobre los procesos de reorganización del mismo que tienen lugar durante la infección por VIH-I. Por otro lado, los componentes celulares del citoesqueleto están implicados en los eventos tempranos durante la infección por distintos virus, regulando la entrada del virus y la liberación de su genoma así como promoviendo el — movimiento de las cápsides virales y la integración del genoma viral. Así, los citoesqueletos de actina y tubulina deben estar intactos para una entrada eficaz del virus del herpes simple y del virus simio 40, respectivamente (H. Deng, et al., 1996. Nature 381: 661- 666; T. Dragiσ, et al., 1996. Nature 381: 667-673). En el caso del virus VIH-I, se ha descrito que la infección y la fusión con la célula huésped pueden ser completamente inhibidas mediante la disrupción de la red de actina (Y. Feng, et al., 1996. Science 272: 872-877; E. A. Berger, et al., 1999. Annu.Rev. Immunol . 17: 657-700), probablemente mediante la interferencia de la co-localización de los receptores CD4 y CXCR4 (Y. Feng, et al., 1996. Science 272: 872-877). En esta línea, se ha descrito además que la actina y la tubulina del citoesqueleto están implicadas en la transmisión y secreción del virus VIH-I (R. Pearce-Pratt, et al., 1994. J.Virol. 68: 2898-2905; C. Jolly, et al., 2004. J.Exp.Med. 199: 283-293). Por tanto, los eventos moleculares que tienen lugar durante la fusión celular y la formación del poro de fusión mediada por el virus VIH-I son fenómenos claves en el proceso infectivo de dicho virus y del desarrollo de la enfermedad de inmunodeficiencia adquirida humana (SIDA) . Sin embargo, existe un número de aspectos aun desconocidos del proceso de fusión que tiene lugar en un proceso infectivo entre un virus y su célula huésped, y más preferentemente del proceso infectivo del virus VIH- 1, y del papel del citoesqueleto en este proceso. De igual forma, tampoco existe mucha información de cómo se puede producir la regulación del proceso infeccioso del virus VIH-I mediante la interferencia en el estado dinámico de la membrana plasmática de la célula huésped, aunque se ha observado que la Env del virus VIH- 1 induce la reorganización del citoesqueleto de actina vía Rac-1 (S. E. Pontow, et al., 2004. J.Virol. 78: 7138- 7147) .
Por otro lado, la unión del citoesqueleto a la membrana plasmática celular proporciona un mecanismo de soporte a dicha membrana que regula su rigidez, fortaleza y elasticidad (J. Dai and M. P. Sheetz, 1999. Biophys.J. 77: 3363-3370) . La asociación entre la membrana celular y el citoesqueleto es compleja e incluye interacciones del citoesqueleto con proteínas y lípidos de la membrana. La α-tubulina acetilada constituye la forma hidrofóbica de la tubulina que se asocia predominantemente a la membrana (M. Nunez-Fernandez, et al., 1997. Mol. CeIl Biochem. 170: 91-98) por su directa interacción con la proteína ubicua de la superficie celular Na+, K+-ATPasa (CH. Cásale, et al., 2003. FEBS Lett. 534: 115-118). Resultados experimentales indican que la acetilación de microtúbulos cortos corticales, de la α-tubulina, está directamente involucrada en el control de la dinámica de la membrana plasmática, y de la migración celular (C. Gubert, et al., 2002. Nature 417: 455-458), así como en la estabilización de las diferentes estructuras intracelulares (B. J. Jasmin, et al., 1990. Nature 344: 673-675) . Además, La proteína α-tubulina acetilada está implicada en la estabilidad y funcionalidad de los microtúbulos (G. Piperno, et al., 1987. J. CeIl Biol . 104: 289-302). Los microtúbulos estables regulan el plegamiento de la membrana plasmática dependiente de actina y la movilidad celular mediante la activación de Rac-1 (CM. Waterman-Storer, et al., 1999. Curr.Opin.Cell Biol . 11: 61-67) ó Rho (G. Piperno, et al., 1987. J. CeIl Biol. 104: 289-302). La acetilación de la proteína α-tubulina se encuentra bajo el control de la enzima histona desacetilasa 6
(HDAC6) (C. Hubbert, et al., 2002. Nature 417: 455-458;
A. Matsuyama, et al., 2002. EMBO J. 21: 6820-6831), perteneciente a la clase II de la familia de proteínas HDACs, la cual se localiza principalmente en el citoplasma de las células eucariotas, y es inhibida por tricostatina (TSA) (C. Hubbert, et al., 2002. Nature 417: 455-458; A. Matsuyama, et al., 2002. EMBO J. 21: 6820- 6831) y tubacina (S. J Haggarty, et al., 2003. Proc . Nati. Acad. Sci. USA 100: 4389-4394).
Recientemente, se ha descrito que la enzima HDAC6, a través de su actividad tubulina desacetilasa, controla la organización en la membrana celular de los receptores de superficie CD3 y LFA-I, la translocación del centro organizador de microtúbulos (MTOC) y la activación de los linfocitos T (J. M. Serrador, et al., 2004. Immunity 20: 417-28) .
Sin embargo, el papel de la proteína tubulina del citoesqueleto cortical de la célula huésped sobre la capacidad de fusión viral y la formación del poro de fusión es desconocido. Mas aún, no hay datos disponibles sobre la posible implicación de las formas acetiladas de α-tubulina en la infección y fusión del virus VIH-I. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en el hecho de que el equilibrio de la acetilación/desacetilación de los microtúbulos es clave para modular la entrada de virus fusogénicos en las células eucariotas, preferentemente la entrada del virus VIH-I en las células T, y que está regulado por la proteína HDAC6 , lo que permite definir nuevas aproximaciones terapéuticas para la profilaxis y tratamiento de enfermedades provocadas por virus fusogénicos, preferentemente provocada por el virus de inmunodeficiencia humana adquirida (VIH-I) . Estas aproximaciones terapéuticas se basan en el uso de compuestos activadores de la actividad de dicha proteína HDACS y de las composiciones farmacéuticas que los contienen.
Así, un objeto de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto o agente regulador, preferentemente un activador, inductor o agonista de la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 en la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para la profilaxis y tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías de mamíferos, ya sean humanos u otros animales, provocadas por por la entrada e infección de células eucariotas por un virus fusogénico. Otro objeto de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica o un medicamento para el tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con la entrada e infección de un virus fusogénico en una célula eucariota, preferentemente en células humanas, y más preferentemente en linfocitos T que comprende un compuesto ó agente activador de la proteína HDAC6 , en cantidad terapéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables y que es capaz de inhibir la entrada de dicho virus en la célula eucariota. Otro objeto de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la presente invención en un método de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por una enfermedad, desorden o patología provocada por la infección de un virus fusogénico consistente en la administración de dicha composición terapéutica en dosis adecuada que modifica el estado de acetilación de la tubulina y que actúa inhibiendo la entrada del virus en el interior de la célula.
Descripción detallada
La invención se enfrenta con el problema de proporcionar nuevas herramientas eficaces para la identificación de nuevos compuestos farmacéuticos y nuevas terapias para la profilaxis y el tratamiento de infecciones virales, preferentemente de virus fusogénicos, y más preferentemente del virus VIH-I.
La solución proporcionada por esta invención se basa en que los resultados descritos demuestran que la acetilación/desacetilación de la proteína α-tubulina representa un regulador clave de la susceptibilidad de las células eucariotas huésped para fusionarse formación del poro de fusión - y ser infectadas por un virus fusogénico, sin afectar a la expresión y distribución en la superficie celular de los receptores implicados en la fase de reconocimiento específico del proceso infectivo de la célula huésped, en concreto, la infección del linfocito T por el virus VIH-I a través de receptores CD4 , CCR5 y CXCR4. Este hecho indica que dicha vía de regulación de los mecanismos generales de fusión de membrana inherentes al mecanismo de fusión de toda una serie de virus con envoltura, a través de la enzima HDAC6 , es clave para permitir la infección de células eucariotas por estos virus fusogénicos . En la presente invención, la estabilización de la acetilación de la proteína α-tubulina se obtuvo mediante el silenciamiento de la expresión de la enzima HDAC6 utilizando RNAs de interferencia (siRNA) o mediante su inhibición química (TSA) . Hay que resaltar que aunque el compuesto TSA puede inhibir otras HDCAs nucleares, otros inhibidores químicos de amplio espectro como el butirato sódico (NaBut) o trapoxina B no afectan a la actividad tubulina desacetilasa HDAC6 (C. Gubert, 2002. Nature
417:455-458). Así, la cuantificación de la proteína α- tubulina acetilada en presencia de TSA en comparación con
NaBut, permite monitorizar el efecto de la inhibición específica de la actividad tubulina desacetilasa de la enzima HDAC6. Cabe destacar que la estabilización de la α-tubulina acetilada mediante la inhibición del enzima HDAC6 se asoció fuertemente con una mayor capacidad de las células a fusionarse y a ser infectadas por el virus
VIH-I.
Por el contrario, las células diana que sobre-expresan la forma activa uwild-type" (wt) de la enzima HDAC6 , acopladas o no a la proteína verde GFP, presentaron unos niveles reducidos de α- tubulina acetilada al igual que una menor susceptibilidad para fusionarse y para ser infectadas con el virus VIH-I, sugiriendo que la acetilación de α-tubulina puede regular la deformabilidad de la membrana celular. Sin embargo, la sobre-expresión de la forma activa (wt) de HDACβ no alteró la expresión de CD4 ni de CXCR4 , ni tampoco su distribución en los pseudópodos inducidos por VIH-I. Además, la redistribución de la enzima HDAC6 en la región de agrupamiento CXCR4/CD4 disminuye la cantidad de α- tubulina acetilada en las áreas de contacto célula/virus VIH-I, tal como se ha observado en el presente trabajo, pudiendo estar asociado con una menor deformabilidad de la membrana por el virus VIH-I. Por lo tanto, se propone que la conexión entre la membrana plasmática y la proteína α-tubulina acetilada se encuentra influenciada por la actividad de la enzima HDACβ, regulando la dinámica y elasticidad de la membrana plasmática, y, por tanto, influye fuertemente en la capacidad de fusión de las proteínas virales con sus células huésped, y en concreto de las proteínas Env gp41/gpl20 del virus HIV-I con el linfocito T.
Como la enzima HDAC6 es reclutada en las áreas de contacto célula/virus, la sobre-expresión de esta enzima - puede representar un mecanismo celular de protección frente a la infección del virus VIH-I, al alterar la acumulación de la proteína α-tubulina acetilada en las áreas de contacto célula/VIH-1. Es por tanto plausible que el efecto negativo de la enzima HDAC6 en la fusión e infección del virus VIH-I fuera más relevante cuanto mayor cantidad de proteína HDACβ es expresada en las células huésped, la cual podría actuar fácilmente en las formas acetiladas de α-tubulina que se concentran en las áreas de contacto célula/VIH-1. A este respecto, las zonas ricas ("hot spots") generadas por la acción del VIH- 1, donde se asocian CD4 y el co-receptor, no contenían OC- tubulina acetilada en las células que sobre-expresan la enzima activa HDAC6. Teniendo en cuenta todas estas evidencias experimentales, puede postularse que la inhibición de la enzima HDACβ representa un mecanismo putativo para la regulación positiva de la capacidad de fusión de las proteínas gp4l/gpl20, la cual podría ser dependiente de la capacidad de la membrana celular del huésped a ser deformable, y directamente relacionada con el estado del citoesqueleto cortical de tubulina. En este modelo, la tubulina está implicada en la infección por VIH-I en las etapas iniciales de la infección, cuando la proteína α- tubulina acetilada confiere a la membrana celular el estado dinámico necesario para la fusión entre la membrana celular-virus .
En resumen, la presente invención se basa en el hecho de que el equilibrio de la acetilación/desacetilación de los microtúbulos es clave para modular la entrada de virus fusogénicos en las células eucariotas, preferentemente la entrada del virus VIH en las células T, y que está regulado por la proteína HDAC6, lo que permite definir nuevas aproximaciones terapéuticas para la profilaxis y tratamiento de enfermedades provocadas por virus fusogénicos, preferentemente provocada por el virus de inmunodeficiencia humana adquirida (VIH-I) . Estas aproximaciones terapéuticas se basan en el uso de compuestos activadores de la actividad de dicha proteína HDAC6 y de las composiciones farmacéuticas que los contienen.
Los compuestos activadores o agonistas de HDAC6 podrían impedir la fusión y entrada de virus fusogénicos en células eucariotas, preferentemente la fusión y entrada del virus VIH-I en los linfocitos T. En este sentido, además, la tecnología de transferencia génica podría, mediante vectores adecuados, ser de utilidad en un procedimiento de tratamiento de terapia génica para expresar, preferentemente de forma tejido-específica, el enzima HDAC6 en los linfocitos T de pacientes que sufren este tipo de enfermedades.
Así, un objeto de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto o agente regulador, preferentemente un activador, inductor o agonista de la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 , en adelante uso de un compuesto de la presente invención, en la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para la profilaxis y tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías de mamíferos, ya sean humanos u otros animales, provocadas por por la entrada e infección de células eucariotas por un virus fusogénico.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "compuesto/agente activador o agonista" se refiere a una molécula que cuando se une o interactúa con la proteína HDAC6 , o con fragmentos funcionales de la misma, incrementa la intensidad o prolonga la duración de la actividad biológica de dicha proteína. En esta definición se incluye además aquellos compuestos o moléculas que permiten incrementar la expresión del gen codificante de la proteína HDAC6, ya sea la forma endógena existente de forma natural en una célula o una forma exógena que se introduce artificialmente en dicha célula. Un agente activador puede estar constituido por un péptido, una proteína, un ácido nucleico, carbohidratos, un anticuerpo, un compuesto químico, o cualquier otro tipo de molécula que incremente el efecto y/o la duración de la actividad de la proteína HDACβ .
Tal y como se utiliza en la presente invención el término "virus fusogénico" se refiere a un virus que infecta células eucariotas, preferentemente de mamíferos humanos y no humanos, mediante la fusión de la membrana plasmática o endosomal de dicha célula huésped y la envoltura viral perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, al siguiente grupo: el virus de la gripe (Revisión en, T. Stegmann and A. Helenius. Influenza virus fusión: fusión models toward a mechanism, in: J. Bentz (Ed.)/ Viral Fusión Mechanisms, CRC Press, Boca Ratón, PL, 1993, pp : 89-111), el virus Semliki Forest (R. bron, et al., 1993. EMBO J. 12: 693-701), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , el virus de la inmunodeficiencia simia (SIV) (M.0. McClure, et al., 1988. EMBO J. 7: 513-518), el virus Sendai (D. Hoekstra, et al., 1985. Biochemistry 24: 4739-4745), el virus del Sarcoma de Rous (Revisión en, S. G. Peisajovich and Y. Shai . 2003. BBA 1614: 122- 129) , el virus de la Estomatitis Vesicular (Revisión en, S. G. Peisajovich and Y. Shai. 2003. BBA 1614: 122-129), el virus Ébola (Revisión en, S. G. Peisajovich and Y. Shai. 2003. BBA 1614: 122- 129), el virus Measles, virus del Dengue, el virus de la fiebre amarilla y de la encefalitis (Revisión en, T. H. Sollner. 2004. Current Opinión in CeIl Biology 16: 429-435; Revisión en, A. E. Smith and A. Helenius 2004. Science 304: 237-242) .
Un objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto de la invención en el que la composición farmacéutica se utiliza para la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de inmunodeficiencia humana adquirida provocada por el virus VIH-I.
Tal y como se utiliza en la presente invención el término "virus VIH-I" se refiere a cualquiera de las cepas existentes del virus VIH-I y VIH-2. En este sentido, en el estado de la técnica existen descritos compuestos agonistas de la actividad de las proteínas HDACs, que pueden ser utilizados en el ámbito de la presente invención como agonistas de la proteína HADC6 , y que se indican a continuación a título ilustrativo sin que eso signifique una limitación al alcance de la presente invención: xantinas (patente US 20030134865) .
Así, otro objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto de la presente invención en el que el compuesto agonista está constituido por una xantina o sus derivados. Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto de la presente invención en el que el compuesto está constituido por una construcción genética, en adelante construcción génica HDAC6 de la presente invención, que permite la expresión de una proteína o péptido con actividad tubulina desacetilasa que mimetiza la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 humana en el interior de células de mamífero, preferentemente humanas, y más preferentemente en linfocitos T, de forma similar a las construcciones genéticas elaboradas en la presente invención (ver Ejemplo 3) y que comprende una o varias secuencias de nucleótidos HDAC6 pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6, b) una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a) , c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) , y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a) , b) y c) . En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a la secuencia de mostrada en la presente memoria (SEQ ID NOl) , por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia, y que permita la codificación de un péptido o proteína capaz de mimetizar la acción tubulina desacetilasa de la HDAC6 humana. La secuencia de nucleótidos, longitud completa, codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6 que se utiliza en la presente invención (SEQ ID NOl) está identificada por el número de acceso AF132609 en el NCBI.
En general, una secuencia de nucleótidos análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de nucleótidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 30%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%. Hay que indicar que la secuencia de nucleótidos de la HDAC6 humana (SEQ ID NOl) presenta una homología variable con respecto a otras formas existentes en otras especies. Otra realización particular de la presente invención lo constituye el uso del compuesto de la presente invención en el que la secuencia de nucleótidos de a) de la construcción génica HDAC6 es la secuencia de nucleótidos HDAC6 caracterizada por la SEQ ID NOl codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6 (SEQ ID N02) . Una realización particular de la presente invención lo constituye el uso del compuesto de la presente invención en el que la construcción génica HDAC6 comprende la secuencia de nucleótidos HDAC6 caracterizada porque es un fragmento de b) constituido por una secuencia de nucleótidos codificante al menos de la secuencia de aminoácidos comprendida entre los dos residuos de histina 216 y 611 de la HDAC6 humana (SEQ ID NO2) , claves para su actividad funcional. Hay que indicar que la mutación en estas dos histinas produce una proteina HDAC6 inactiva (ver Ejemplo 3; Serrador JM et al., 2004. HDAC6 deacetylase activity links the tubulin cytoskeleton with immune synapse organization. Immunity 20: 417-428) por lo que este dominio puede ser necesario para que un fragmento de HDAC6 sea funcionalmente activo. La construcción génica HDAC6 de la invención también puede comprender, en caso necesario y para permitir un mejor aislamiento, detección o secreción al citoplasma del péptido expresado, a una secuencia de nucléotidos que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento, detección o secreción de dicho péptido. Por tanto, otro objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto de la presente en el que el compuesto agonista es una construcción genética HDAC6 descrita anteriormente que comprende, además de la secuencia de nucleótidos HDAC6 , cualquier otra secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o secuencia péptídica que permita el aislamiento, la detección o la secreción al citoplasma celular del péptido expresado, por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, una secuencia de polihistidina (6xHis) , una secuencia péptídica reconocible por un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, para su identificación, o cualquier otra que sirva para purificar la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad: péptidos etiqueta tales como c-myc, HA, E-tag) (Using antibodies: a laboratory manual. Ed. Harlow and David Lañe (1999). CoId Spring Harbor Laboratory Press. New York. Capítulo: Tagging proteins. Pp. 347-377).
La secuencia de nucleótidos HDACβ y la construcción genética HDAC6 descritas previamente pueden obtenerse por un experto en el sector de la técnica mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica (Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual 2nd ed. , CoId Sping Harbor Laoratory Press, N. Y., 1989 vol 1-3) . Dichas secuencias de nucleδtidos pueden estar integradas en un vector de expresión génica que permite la regulación de la expresión de la misma en condiciones adecuadas.
Por tanto, otro objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto de la presente invención en que el compuesto está constituido por un vector de expresión génica, en adelante vector de expresión HDAC6, que comprende una secuencia de nucleótidos HDAC6 o una construcción genética HDAC6 descritas en la presente invención y que permite la expresión de una proteína o péptido con actividad tubulina desacetilasa que mimetiza la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDACβ humana en el interior de células de mamíferos, preferentemente células humanas, y más preferentemente en linfocitos T. En general, un vector de expresión comprende, además de la secuencia de nucleótidos HDAC6 o de la construcción genética HDAC6 decritos en la invención, un promotor que dirige su transcripción (por ejemplo, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD, Drefc, etc) , al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan dicha transcripción y, en su caso, la traducción del producto de interés, por ejemplo, señales de inicio y terminación de transcripción (tlt2, etc) , señal de poliadenilación, origen de replicación, secuencias de unión a ribosomas (RBS) , secuencias codificantes de reguladores transcripcionales, (enhancers) , silenciadores transcripcionales (silencers) , represores, etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos de expresión, vectores virales (DNA o KNA) , cósmidos, cromosomas artificiales, etc. que pueden contener, además, marcadores utilizables para seleccionar las células transíectadas o transformadas con el gen o genes de interés . La elección del vector dependerá de la célula huésped y del tipo de uso que se quiera realizar. Por tanto, según un modo de realización particular de la presente invención dicho vector es un plásmido. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia al igual que para la transformación de microorganismos y células eucariotas se pueden utilizar diferentes métodos ampliamente conocidas - transformación química, electroporación, microinyección, etc - descritos en diversos manuales [Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) . Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, N. Y.] .
Los sistemas de expresión génica pueden permitir o no la integración del nuevo material genético en el genoma de la célula huésped. De esta forma, tanto la secuencia de nucleótidos, construcción génica o el vector de expresión HDAC6 pueden utilizarse como un medicamento para proteger células huésped, preferentemente linfocitos T, contra la infeciδn de un virus fusogénico, preferentemente por el virus VIH-I, en un procedimiento de tratamiento y profilaxis de terapia génica in vitro de linfocitos T humanos frente al VIH-I. Las herramientas biofarmacéuticas y los procedimientos de terapia génica son suficientemente conocidas por un experto del sector de la técnica. Finalmente, el origen de estos compuestos reguladores agonistas de la actividad de las proteínas HDACs puede ser variado, de tal forma que pueden ser origen natural (por ejemplo, de origen vegetal, bacteriano, vírico, animales o microorganismos eucariotas) o sintético. Otro objeto de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica o un medicamento para el tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con la entrada e infección de un virus fusogénico en una célula eucariota, preferentemente en células humanas, y más preferentemente en linfocitos T, en adelante composición farmacéutica de la presente invención, que comprende un compuesto ó agente activador de la proteína HDAC6, en cantidad terapéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables y que es capaz de inhibir la entrada de dicho virus en la célula eucariota .
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto regulador, agonista, de la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 , calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración. En otra realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por vía parenteral, por vía oral, por vía intraperitoneal , subcutánea, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid. Otro objeto particular de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto agonista es una xantina o sus derivados .
Otro objeto particular de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto activador es una construcción genética o un vector de expresión HDAC6 que permite la expresión de una proteína o péptido con actividad tubulina desacetilasa que mimetisa la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 humana en el interior de células de mamífero, preferentemente humanas, y más preferentemente en linfocitos T, de forma similar a las construcciones genéticas elaboradas en la presente invención (ver ejemplo 3) y que comprende una o varias de las secuencias de nucleótidos HDAC6 pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6 , b) una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a) , c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) , y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a) , b) y c) .
Otra realización particular de la presente invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que la secuencia de nucleótidos de a) es la secuencia de nucleótidos SEQ ID NOl codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6 (SEQ ID N02) . Otra realización particular de la presente invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que la secuencia de nucleótidos de b) es un fragmento constituido por una secuencia de nucleótidos codificante, al menos, de la secuencia de aminoácidos comprendida entre los dos residuos de histina 216 y 611 de la HDAC6 (SEQ ID N02) .
Otro objeto de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la presente invención, en adelante uso de la composición farmacéutica de la presente invención, en un método de tratamiento o profilaxis de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por una enfermedad, desorden o patología provocada por la infección de un virus fusogénico consistente en la administración de dicha composición terapéutica en dosis adecuada que modifica el estado de acetilación de la tubulina y que actúa inhibiendo la entrada del virus en el interior de la célula. De esta forma, este compuesto agonista de la HDAC6 puede favorecer la desacetilación de la tubulina mediante el aumento de la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 en el interior de las células eucariotas y, por tanto, impedir la entrada e infección del virus. El uso de la composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse en un método de tratamiento de forma aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos .
Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad provocada por un virus fusogénico que infecta células eucariotas, preferentemente células de mamíferos humanos y no humanos, perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, al siguiente grupo: el virus de la gripe (Revisión en, T. Stegmann and A. Helenius. Influenza virus fusión: fusión models toward a mechanism, in: J. Bents (Ed.), Viral Fusión Mechanisms, CRC Press, Boca Ratón, FL, 1993, pp.-89-lll), el virus Semliki Forest (R. bron, et al., 1993. EMBO J. 12:693-701), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , el virus de la inmunodeficiencia simia (SIV) (M.0. McClure, et al., 1988. EMBO J. 7:513-518), el virus Sendai (D. Hoekstra, et al., 1985. Biochemistry 24:4739-4745), el virus del Sarcoma de Rous (Revisión en, 3.G. Peisajovich and Y. Shai. 2003. BBA 1614:122-129), el virus de la Estomatitis Vesicular (Revisión en, S. G. Peisajovich and Y. Shai.
2003. BBA 1614:122-129), el virus Ébola (Revisión en, S. G. Peisajovich and Y. Shai. 2003. BBA 1614:122-129), el virus Measles, virus del Dengue, el virus de la fiebre amarilla y de la encefalitis (Revisión en, T. H. Sollner.
2004. Current Opinión in CeIl Biology 16:429-435; Revisión en, A. E. Smith and A. Helenius 2004. Science 304:237-242) .
Otra realización particular de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en un método de tratamiento de la enfermedad de inmunodeficiencia humana adquirida provocada por el virus fusogénico VIH-I. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.- La inhibición de HDAC6 incrementa la fusión célula-célula mediada por las proteínas Env del virus
VIH-I. (a) El mareaje X-GaI de las células HeLa P5 fusionadas con células HeLa ADA en ausencia (control) o presencia de TSA (10, 100 y 300 nM) , NaBut (2 μM) , RANTES
(300 y 700 nM) o anticuerpo monoclonal (Acm) anti-CD4 (5 μg/ml) . (b) Cuantificación β-Gal de los experimentos de fusión celular mediados por Env de las cepas trópica R5 y trópica X4 en células HeLa P5 tratadas con TSA, y en presencia o ausencia de anticuerpo monoclonal anti-CD4.
(c) Western blot para el análisis cinético de la acetilación de la proteína α-tubulina acetilada en células HeLa P5 tratadas con TSA (10, 100 y 300 nM) o NaBut (500 μM) . Las cifras indican las veces que se incrementa la proteína α-tubulina acetilada con respecto a células no tratadas. (d) Análisis por citometría de flujo de la expresión de CD4 , CXCR4 y CCR5 en células
HeLa P5 tratadas con 300 nM de TSA 2 μM NaBut o células no tratadas (e) Western blot para el análisis cinético de la desacetilación de proteína α-tubulina tras el tratamiento con TSA (300 nM, 4 hrs . ) en células HeLa P5 aclaradas. Las cifras indican la cantidad de proteína α- tubulina acetilada después de eliminar el TSA, y referido al momento cero (4 hrs. de tratamiento con TSA 300 nM) . (f) Cuantificación β-Gal de los experimentos de fusión de células HeLa ADA con células HeLa P5 pretratadas con TSA o Nabut durante 4 hrs. a 37 °C antes de la adición de las células HeLa ADA. Se muestra además el efecto de un anticuerpo monoclonal anti- CD4. (g) El mareaje X-GaI de las células HeLa ADA fusionadas con no tratadas (control) o con células HeLa P5 pre-tratadas con 300 nM TSA, en presencia o en ausencia de un anticuerpo monoclonal anti-CD4.
Figura 2. - La inhibición de la enzima HDACβ incrementa la fusión celular en linfocitos T mediada por proteínas Env del virus VHI-I. (a) Análisis por citometría de flujo de sincitios fusionados entre células J77 y células T Hxbc2- Env en presencia o en ausencia de TSA o NaBut . Se muestra un Western blot de análisis cinéticos de la acetilación de la proteína α-tubulina en células J77 tratadas con TSA
(2 μM) . Los valores indican el incremento de la acetilación α-tubulina en comparación con los definidos en la banda de control de α-tubulina. (b) Imágenes de los sincitios formados entre las células J77 y las Hxbc2 bajo tratamientos de TSA y NaBut. Además, se muestran el efecto de un anticuerpo monoclonal anti-CD4. (c) Análisis de citometría de flujo de células J77 que expresan CD4 y CXCR4 tratadas con TSA (300 nM) , NaBut (2 μM) o de células no tratadas. (d) Internalizacíón de CXCR4 inducida por SDF- lα en ausencia de TSA o en presencia de 300 nM de TSA. (e) α-tubulina acetilada en células J77 tratadas con TSA (300 nM) o NaBut (2 mM) y en células no tratadas. Los datos de las imágenes de fluorescencia y de los western blots son representativos de 3 experimentos independientes (media±SE; n=4) .
Figura 3. - El silenciamiento de la expresión de HDAC6 incrementa la fusión con células que expresan proteínas Env del virus VIH-I. (a) Cuantificación mediante western blot de la expresión de la enzima HDAC6 y de α- tubulina acetilada en células HeLa P5 tratadas con siRNA. Las imágenes de fluorescencia muestran altos niveles de α-tubulina acetilada en células donde la expresión de HDAC6 fue silenciada (cabezas de flechas) . (b) Imágenes DIC de sincitios formados entre células HeLa ADA fusionadas con células HeLa P5 tratadas con siRNA (1 y 2) o sin tratar (4) o con células HeLa P5 transfectadas con un siRNA como control negativo y de especificidad (5) . Se muestra además el efecto de un anticuerpo monoclonal anti-CD4 en células no tratadas (3) o células tratadas con siRNA-HDACβ (β) . (c) Cuantificación de β-Gal de la fusión celular mediada por Env entre células HeLa P5 , tratadas con siRNA (si) o no, con células HeLa que expresan Env de las cepas R5- o X4 -trópicas, en presencia o ausencia de un anticuerpo monoclonal anti-CD4. Figura 4.- El silenciamiento e inhibición de HDAC6 favorece la infección por el virus VIH-I. (a) Efecto de TSA o NaBut en la infección por el virus VIH-I de células HeLa P5 con las cepas virales VIH-lBai y VIH-INL43, La infección fue medida mediante la producción de β-Gal, 52 hrs después de la infección, (b) Producción viral (medida de p24) en PBL activados con PHA pretratadas con TSA o NaBut. Las imágenes de inmunofluorescencia y los análisis de western blot muestran los niveles de α-tubulina acetilada en PBL activadas con PHA, después de 2 hrs. de tratamiento con TSA (300 nM) o Nabut (2 μM) . Se muestran además el efecto de AZT, un neutralizante del anticuerpo monoclonal anti-CD4, RANTES y SDF- lα en los paneles A y B. (c) Efecto del silenciamiento del siRNA HDAC6 en la infección por el virus VIH- 1 de células HeLa P5. La infección se mide mediante la producción β-Gal. Además, se muestra el efecto de un anticuerpo monoclonal neutralizante . Figura 5,- La sobre-exprésion de HDAC6 disminuye la capacidad de las células de fusionarse y de ser infectadas por el virus de VIH-I. (a) Expresión de las formas salvajes (wt) y mutada (dm) de la enzima HDAC6-GFP en células HeLa P5. (b) Análisis de western blot de la expresión de la enzima salvaje (wt) y mutada (dm) HDAC6-
GFP y sus efectos en los niveles de la proteína OC- tubulina acetilada. (c) Análisis de citometría de flujo de la expresión de CD4 , CXCR4 y CCR5 en células HeLa P5 no transfectadas o transfectadas con la forma salvaje (wt) o mutada (dm) de la enzima HDAC6-GFP. (d)
Cuantificación (producción de β-Gal) de la fusión celular mediada por Env entre células HeLa ADA y no transfectadas
(control) , o entre células HeLa P5 transfectadas con la forma salvaje (wt) o mutada (dm) de la enzima HDAC6-GFP. Se muestran además imágenes DIC de los sincitios formados después de 16 horas de la fusión, (e) Infección del virus VIH-I en células HeLa P5 no transfectadas (control) o en transfectadas con la forma salvaje (wt) o mutada (dm) de la enzima HDAC6-GFP con la cepa VIH-lBaL. Además, se muestra el efecto de un anticuerpo monoclonal anti-CD4 y
AZT. Las imágenes de western blot y DIC son representativas de tres experimentos independientes
(media±SEM; n=4) .
Figura 6.- La sobre-expresión de HDAC6 altera la infección por el virus VIH-I y la redistribución de la proteína α-tubulina acetilada $ta\lwϊas áreaá de contacto célula/virus VIH-I. (a) Análisis de citometría de flujo de células MT-2 que expresan las formas salvaje
(wt) y mutada (md) de la enzima HDAC6-GFP y la proteína GFP. (b) Análisis de citometría de flujo de CD4 y CXCR4 en células MT-2 parentales, expresando wt-HDACβ o dm-
HDAC6. (c) Análisis de la entrada e infección del virus
VIH-I en células MT-2 transíectadas con retrovirus con las formas salvaje (wt) y mutada (md) de la enzima HDAC6- GFP mediante la cuantificación de DNA VIH-1-gag intracelular, con respecto a células MT-2 control transíectadas o no con GFP (control) . Estos resultados son representativos de 3 experimentos independientes, (d) Localización de α-tubulina acetilada y de la enzima salvaje (wt) o mutada (dm) HDAC6-GFP en células MT-2, antes y durante la infección de VIH-I (control, panel izquierdo y VIH-INL43 en panel derecho, respectivamente) . Figura 7.- El virus VIH-I recluta a la enzima HDAC6 y a la proteína α-tubulina acetilada en las áreas de contacto célula/virus, donde CD4 y CXCR4 se co-distribuyen. (a) Redistribución de la proteína α-tubulina acetilada en modelos de fusión celular con células HeLa y linfocitos T (ver punta de flechas) en las áreas de contacto célula/célula del sincitio. (b) Expresión y localización de la enzima endógena HDAC6 y de la proteína α-tubulina acetilada en células MT-2 parentales infectadas por el virus VIH-I y en células no infectadas, (c) Análisis de microscopía de fluorescencia de CD4 , CXCR4 y de la enzima salvaje (wt) o mutada (dm) HDAC6-GFP en células MT-2 no infectadas (panel izquierdo) o infectadas (panel derecho) EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Ejemplo 1. - El bloqueo de la enzima HDAC6 promueve la formación del sincitio dependiente de gp41/gpl20.
Con el objeto de evaluar el efecto de la estabilización de la proteína α-tubulina en la capacidad de fusión de las proteínas de la envoltura del virus VIH-I gp41/gpl20 se utilizaron inhibidores químicos de HDAC6. Así, se ensayó el efecto del inhibidor general de las proteínas HDACs, TSA, el cual además inhibe la actividad tubulina desacetilasa de HDAC6 , y el butirato sódico (NaBut) en distintos modelos de fusión célula-célula mediados por el virus VIH-I. En primer lugar, se empleó un modelo de fusión celular mediado por proteínas Env en células HeLa 243 o en células ADA que se fusionaron con células HeLa P5 (Schwartz, 0. et al., 1994. Virology 198: 360-365; Pleskoff, 0. et al., 1997. Science 276: 1874-1878). Se observó que TSA promueve fuertemente la formación de células polinucleadas gigantes (sincitio) de manera dosis dependiente (Figura IA, IB) , mientras que NaBut no provocaba dicho resultado (Figura IA) . Los sincitíos formados por las células tratadas con TSA fueron mayores que aquellos obtenidos en células no tratadas o tratadas con NaBut (Figura IA) , y este efecto fue observado tanto con proteínas Env de las cepas trópicas X4 y R5 , con una actividad máxima a dosis de 300 nM de TSA (Figura IB) . Una clara correlación se observó entre el efecto de TSA en la capacidad de fusión de gp41/gpl20 (Figura IB) y la cantidad de proteína α-tubulina acetilada (Figura IC) , siendo ambas dependientes de la dosis (Figura IB y IC, las cuales presentan 300 nM de TSA) y del tiempo. Por el contrario, no observó ningún efecto en la acetilación de Ia proteína α-tubulina con distintas dosis y tiempos de tratamientos con NaBut (Figura IC) . Como se esperaba, el efecto de TSA en la formación de sincitios fue revocado mediante anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-CD4 (Figura IA y IB) , o mediante RANTES (Figura IA) y SDF-lα (datos no mostrados) . Mas aún, los niveles de expresión de CD4 , CXCR4 y CCR5 en células HeLa P5 no fueron alterados de forma significativa por la adición de TSA (Figura ID) . Estos datos sugieren que TSA favorece el paso de formación del poro de fusión durante el proceso de fusión celular, provocando cambios en la deformabilidad de la membrana sin alterar la interacción inicial de las proteínas Env con el receptor CD4. Para valorar el efecto de TSA en la activación de LTR- lacZ se realizaron una serie de experimentos de fusión célula-célula mediante el pretratamiento de las células HeLa P5 con TSA, y eliminándolo antes de la adición de las células HeLa Env+ . Se observó que TSA estabiliza un importante conjunto de α-tubulina acetilada, la cual disminuye hasta los niveles básales después de 2 horas de haber eliminado el TSA (Figura IE) . La cantidad de OC- tubulina acetilada eliminada a los 30 y 60 minutos fue un
60% y un 30% mayor, respectivamente, que aquellas observadas en células no tratadas o en células tratadas con NaBut (Figura IE) . Como una vez que se produce el contacto con el virus VIH-I, la fusión de membrana y la entrada viral tienen lugar en aproximadamente en 30-60 minutos (Reeves, J. D. et al., 2002. Proc .Nati . Acad. Sci .
U. S. A. 99: 16249-54; Raviv, Y. et al., 2002. Virology 293: 243-51), estos datos sugieren que la acetilación de los microtúbulos se traduce en una mayor**"permisividad de las células a la fusión. Por lo tanto, el tratamiento de las células HeLa P5 con TSA incrementa la formación de sincitio con respecto al tratamiento con ADA en células HeLa (Figura IF) y en células HeLa 243 (datos no mostrados) . El efecto del TSA o del NaBut en la transcripción de LTR-lacZ, después de eliminar las drogas, fue excluido por la ausencia de producción β-Gal en las células control no fusionadas HeLa P5, o en las células tratadas con NaBut (Figura IF, IG)
Con el objeto de trasladar estas observaciones a linfocitos T se empleó un modelo de fusión célula-célula basado en células Jurkat que expresan X4-tropic Hxbc2-Env
(Cao, J., et al., 1996. J Virol 70, 1340-54), co- cultivadas con células J77 (CXCR4+/CD4+) . El tratamiento de las células J77 con TSA claramente estabiliza una intensa cortesa de proteína α-tubulina acetilada (Figura 2A, 2E) e induce la formación de grandes sincitios, mientras que NaBut no produjo ningún efecto (Figura 2A y 2B) . Como se observó en células HeLa, la expresión de las proteínas CXCR4 y CD4 no se vieron modificadas significativamente por el tratamiento con TSA o con NaBut
(Figura 2C) , y tampoco la internalización de CXCR4 inducida por SDF-lα se vio afectada por TSA (Figura 2D) . Ejemplo 2.- El silenciamiento de la proteína HDAC6 incrementa la entrada y la infección por VIH-I.
Para valorar adicionalmente el papel de la proteína OC- tubulina acetilada en la fusión e infección por VIH-I se realizaron un silenciamiento selectivo de la expresión HDAC6 mediante la inhibición específica de su RNAm con RNAs de interferencia (siRNA) (Hubbert C, et al., 2002. Nature 417: 455-458; Serrador J. M. , et al., 2004. Immunity 20: 417-28). La inhibición de la expresión endógena de HADC6 en las células HeLa P5 indujo un incremento 3 veces mayor de la proteína α-tubulina, sin afectar a los niveles totales de esta proteína o de otros componentes del citoesqueleto, como la vimentina (Figura 3A) o la expresión de CXCR4 , CCR5 y CD4 (datos no mostrados) . El silenciamiento específico de HDAC6 generó unas células HeLa P5 más permisivas, las cuales presentan una mayor actividad de fusión con ambos Env R5-tropíc y X4-tropic (Figura 3B, 3C) .
En los modelos de fusión célula-célula, las áreas de contacto presentadas por las células que expresan Env fueron mayores que aquellas observadas en modelos de infección celular, mediante el uso de partículas virales de VIH-I purificadas. La siguiente pregunta que se planteó fue si el efecto de la inhibición de HDAC6 y, por tanto la subsiguiente estabilización de la proteína α- tubulina acetílada cortical, influye en la infección por el virus VIH-I utilizando células HeLa P5 o linfocitos de células periféricas activadas con PHA (PHA-activated PBL) . La infección del virus VIH-I en células HeLa P5 se valoró mediante la producción de β-Gal y la activación de los linfocitos de sangre periférica por PHA mediante la determinación del antígeno p24 en el sobrenadante libre de células (Figura 4A y 4B, respectivamente) . Se observó que TSA incrementó la infección por el virus VIH-I de una manera dosis dependiente en células HeLa P5 y en PBL (Figura 4A Y 4B) con cualquiera de las cepas utilizadas: R5-tropic VIH-lβai y X4- tropic VIH-INL-43 (Figura 4A y 4B) . TSA incrementó la infección de VIH-I a través de la inhibición de la enzima HDACβ citosólica y de la estabilización de la proteína α-tubulina acetilada cortical (Figura 4B) , el cual se mantuvo tras la eliminación de TSA (Figura 4A y 4B) , lo que excluye los efectos transcripcionales de TSA en la producción de β- GaI y en la replicación del virus VIH-I. Al igual que en los modelos de fusión célula-célula, el incremento de la infección del virus VIH-I en células HeLa P5 (Figura 4A) y en células PBL activadas con PHA se correlacionó con los niveles de proteína α-tubulina acetilada (Figura IE y 4B) . Asimismo, el silenciamiento de HDAC6 produjo células HeLa P5 más permisivas, las cuales fueron infectadas más eficazmente con partículas virales de cepas R5- o X4 trópicas de VIH-I (Figura 4C) .
Estos resultados sugieren que los niveles de proteína α- tubulina acetilada ejercen un claro efecto en la susceptibilidad de células diana a fusionarse y ser infectadas por el virus VIH-I.
Ejemplo 3.- La sobreexpresión de HDAC6 altera la fusión celular y la infección viral por VIH-I.
Se valoró además el efecto de la sobre-expresión de la forma salvaje activa de HDAC6 (wild-type, wt) (Figura 5A y 5B) sobre la capacidad de fusión de las proteínas gpl20/gp41 y la infección por el virus VIH-I. Como control se utilizó en paralelo una forma mutada de la enzima HDAC6 desacetilasa inactiva (dm) (Figura 5A y 5B) en las cuales dos residuos de histidina claves para la actividad desacetilasa fueron mutados a alanina (Serrador J. M., et al., 2004. Immunity 20: 417-28). Se observó que i) la capacidad de fusión de células HeLa P5 transformadas con la forma salvaje de la proteína HDACβ-
GFP con células HeLa ADA (Figura 5D) o con células 243 (datos no mostrados) , y H) la capacidad de ser infectadas por cepas virales de VIH-I trópicas R5 y X4
(Figura 5E y datos no mostrados, respectivamente) se redujeron drásticamente con respecto a lo observado con células parentales o células HeLa P5 transfectadas con la forma inactiva de HDAC6-GFP (dm) .
Resultados similares fueron observados en experimentos de infección con el virus VIH-I (Figura 6C) con la línea celular de linfocitos T MT-2 que expresan la forma salvaje o mutada de HDAC6-GFP, traducidas por espinoculación viral (Figura 6A, alrededor del 70% de las células expresan las dos formas de la enzima) . Los microtúbulos acetilados coi-ticales se detectaron pobremente en las células MT-2 que expresan la forma salvaje de la proteína HDAC6-GFP (Figura 6D, determinado por la ausencia de fluorescencia en células blancas
(marcadas con arterisco) al compararse con las células parentales o las células MT-2 que expresan la forma mutada de la proteína HDAC6-GFP (Figura 6D, ver la fluorescencia en células de la parte inferior de la figura) . Se observó que la enzima salvaje HDAC6-GFP altera la entrada y la infección del virus VIH-I (Figura 6C, alrededor de un 75% de inhibición) mediante la determinación cuantitativa del DNA proviral VIH-1-gag contenido en las células MT-2 infectadas 12 horas después de la infección con el virus VIH-I (Figura SC) . Por otro lado, la sobre-expresión de la enzima HDACβ no modificó los niveles de CD4 , CCR5 o CXCR4 en la superficie celular (Figura 5C y 6B) .
Por tanto, la susceptibilidad de las células a ser infectadas por el virus VIH-I parece estar directamente relacionado con sus niveles de proteína α-tubulina acetilada, e inversamente ligada a la actividad de la enzima HDAC6 (Figura 5E y 6C)
Ejemplo 4.- EL virus VIH-I recluta a la enzima HDAC6 y a la protexna α-tubulina acetilada en las áreas de contacto virus/célula.
Tal y como se ha comentado anteriormente, la interacción cooperativa debe tener lugar entre la envoltura viral y el receptor celular y las moléculas co-receptoras para que se produzca la entrada del virus (Layne S. P., et al., 1990. Nature 346: 277-9; Kuhmann S. E., et al., 2000. J.Virol 74: 7005-15) La modificación de la co- dístribución de CD4 y de las moléculas co-receptoras en las áreas de contacto célula/virus puede alterar el proceso de formación del poro de fusión (Dimitrov D. S., et al . , 1999. Virology 259: 1-6) y, por tanto, regular la infección por el virus VIH-I.
Por ello, se procedió a determinar si la concentración de la enzima HDAC6 y de la proteína α-tubulina desacetilada localizadas en el área de contacto célula/célula durante la infección del virus VIH-I inducían la formación de sincitios. En ambas células transformadas, HeLa y MT-2, la forma salvaje (wt) y mutada (dm) de la enzima HDAC6- GFP se localizaron en el citoplasma (Figura 5A, 6D y 7C) , de forma similar a lo observado con la enzima endógena (Figura 7B) . Las células HeLa P5 y MT-2 que expresan las dos formas de la enzima HDACβ no sufrieron cambios morfológicos significativos y como se indica anteriormente, los niveles de CD4 , CXCR4 y CCR5 en la superficie celular se mantuvieron inalterados (Figura 5C y 6B) . Interesantemente, se observó que la proteína α- tubulina acetilada estaba concentrada principalmente en el área de contacto de las células usando ambas células Env R5-tropic y X4-tropic (Figura 7B, indicado medíante flechas . ) Seguidamente, se determinó la localización de la enzima HDACβ durante la infección celular y se observó que el virus VIH-I indujo la redistribución de la enzima HDACβ - GFP hacia las estructuras de pseudopodia, colocalizándose con CXCR4 y CD4 (Figura 7C) , lo cual índica que la enzima HDAC6 es reclutada en las áreas de contacto célula/virus VIH-I. Esta redistribución de la enzima HDACβ fue independiente de su actividad enzimática, ya que tanto la forma salvaje como la mutada presentaron una localización similar (Figura 7C) . Más aún, la proteína OC- tubulina acetilada además se concentra en la pseudopodia inducida por el virus VIH-I, aunque sólo en las células que expresan la forma inactiva (dm) de la enzima HDACβ - GFP (Figura 6D, ver fluorescencia en las figuras inferiores del panel derecho) o en células T no tratadas que presentan bajos niveles de la enzima endógena HDACβ
(Figura 7B) , mientras que no se observa dicha concentración en células que sobre-expresan la forma activa (wt) de la enzima HDAC6-GFP (Figura 6D, evaluado por la ausencia de fluorescencia, células blancas en el panel derecho, ver asterisco) . La capacidad de la enzima tubulina desacetilasa HDAC6 de regular la co-distribución de CXCR4 y CD4 inducida por el virus VIH-I se analizó durante las etapas iniciales del proceso infectivo. La cepa del virus VIH-1NL43 trópica X4 indujo el agrupamiento de CXCR4 y CD4 después de 90 minutos de la infección en células MT-2 transformadas ya sea con la forma salvaje (wt) o con la forma mutada (dm) de la enzima HDAC6-GFP (Figura 7C) . La sobre-expresión de la forma activa (wt) de la enzima HDAC6-GFP no tuvo efecto en la co-distribución de CD4-CXCR4 (Figura 7C) . Estos datos indican que la enzima HDAC6 altera la entrada y la infección por el virus VIH-I por un mecanismo que no parece alterar las interacciones virus VIH-1/receptor-co- receptor en la membrana celular.
Material y Métodos
Anticuerpos y reactivos
El anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD4 HP2/6 (IgGl) que inhibe la interacción gpl20/CD4 ya ha sido descrito anteriormente (Carrera A. C, et al., 1987. Eur . J. Immunol . 17: 179-86); el mAb anti-CD4 v4- ficoeritrina (PE) (IgGl) que no reacciona con el punto de unión gpl20 fue proporcionado por Becton Dickinson (San José, CA) . El . anticuerpo policlonal sc-5255 anti-HDAC6 fue proporcionado por Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA) , y el mAb anti-α-tubulina B-5-1-2, el anti- tubulina acetilada 6-11B-1 y el anti-vimentina fueron proporcionados por Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) . El TSA y el butirato sódico (Nabut) fueron adquiridos a Calbiochem (San Diego, CA) . SDF- lα fue proporcionado gentilmente por el Dr. F. Baleux (Pasteur Institute, Paris, Francia) , el RANTES fue obtenido de R&D (Marina del Rey, CA) . Los localizadores fluorescentes de células CMTMR y CMAC fueron obtenidas de Molecular Probes (Eugene, OR) . Células
Las líneas celulares T humanas Jurkat J77, las células MT-2 y las células Jurkat T que expresan la envoltura del virus VIH-I (Env) -Hxbc2 (Jurkat Hxbc2) fueron cultivadas en el medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS. El clon celular HeLa P5, transformado de forma estable con el cDNA de las proteínas CD4 y CCR5 humanas y con un gen reportero β-Gal dirigido por el LTR del VIH
(Pleskoff 0., et al., 1997. Science 276: 1874-8) fue proporcionado por el Dr. M. Alizon (Hδpital Cochin, Paris, Francia) . Las células HeLa 243 y ADA fueron también proporcionadas por el Dr. M. Alizon, y coexpresan las proteínas Tat y Env del virus VIH-I (Schwartz O., et al., 1994. Virology 198: 360-5; Pleskoff O., et al . , 1997. Science 276: 1874-8). Los linfocitos de sangre periférica humanos (PBL) fueron obtenidos y aislados de donantes sanos usando un gradiente de densidad por centrifugación Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Las células PBL fueron activadas durante 3 días con 1 μg/mL de PHL (Murex Diagnostics Corp. Norcross, GA) y entonces fueron cultivados con IL-2 (6 unidades/mL) .
Construcciones de DNA recombinantes HDAC6 y técnica de lipo-transfección celular La construcción salvaje (wt) -HDAC6-GFP y su mutante (dm) - HDAC6-GFP, que presenta una doble mutación (H216A/H611A) que provoca la inactivación desacetilasa ya han sido descritas con anterioridad (Serrador J. M. , et al.,
2004. Immunity 20: 417-28). Estos dos vectores de expresión fueron transfectados en células HeLa P5 usando Megafectin-20 (Qbiogene Inc. Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabi'icante.
Transducción retroviral HPAC6 en células T Las células MT-2 y Jurkat J77 que expresan GFP, la forma salvaje (wt) o mutada (dm) de HDAC6-GFP fueron obtenidas mediante la infección con un virus murino Moloney modificado (MLV) , el cual es defectivo para la replicación. Brevemente, GFP, wt-HDAC6-GFP y dm-HDAC6-GFP fueron clonados en el vector bicistrónico pLZR-IRES/GHR (gentilmente proporcionado por el Dr. Antonio Bernad, Centro Nacional de Biotecnología (CSIC) Madrid, España) . La producción retroviral y la transducción celular se llevó a cabo tal como se ha descrito anteriormente (Abad J. L., et al., 2002. J.Gene.Med. 4: 27-37).
Análisis de citometría de flujo y ensayos de internalilzación Células no tratadas y tratadas con TSA o NaBut fueron lavadas e incubadas con los anticuerpos anti-CXCR4 o anti-CCR5 marcados con PE-12G5, o con anti-CD4 marcado con FITC durante 30 minutos a temperatura ambiente. Como controles se utilizaron otros mAbs frente a dominios irrelevantes. Para los ensayos de internalización de CXCR4 , las células J77 fueron incubadas con distintas concentraciones de SDF-lα durante 1 hora a 370C y posteriormente las células fueron analizadas como se ha descrito (Valenzuela-Fernandez A., et al., 2001. J.Biol.Chem. 276: 26550-8). Inmunofluorescencia Las células HeLa P5, MT-2 y Jurkat J77 fueron fijadas y permeabilizadas durante 3 minutos en PBS 2% formaldehído- 0.5% Tritón X-100, e inmunomarcadas para α-tubulina, α- tubulina acetilada o HDAC6 tal como se ha descrito anteriormente (Grozinger CJ., et al., 1999. Proc.Natl.Acad.Sci. U. S. A. 96: 4868-73; Serrador J. M., et al., 2004. Immunity 20: 417-28). Las células fueron visualizadas usando un fotomicroscopio Leica DMR (Leica, Heidelberg, Alemania) y un microscopio confocal Leica TCS-SP.
Análisis de Western blot
Las células fueron resuspendidas en 60 μL de una solución MES (10 mM MES a pH 7.4 , 150 mM de ClNa, 5 mM EGTA, 5 mM de MgCl2) que contiene además un conjunto de inhibidores de proteasas (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim, Alemania), se sonicaron 2 veces durante 30 segundos a 4°C y hervidos en solución 5% β-mercaptoetanol durante 1 minuto a 1000C. Los lisados celulares fueron analizados en un gel 12% SDS-PAGE e inmunomarcados para la proteína HDAC6 , α-tubulina, α-tubulina acetilada y vicentina tal como se ha descrito (Serrador et al. (2004) HDAC6 deacetylase activity links the tunulin cytoskeleton with immune synapse organization. Immunity 20: 417-28) . Determinación de la fusión celular célula-célula mediada por Env del virus VIH-I.
Los ensayos de fusión celular β-galactosidasa se realizaron tal como se ha descrito (Valenzuela-Fernandez A., et al., 2001. J.Biol . Chem. 276: 26550-8). Brevemente, las células HeLa 243 o HeLa ADA fueron co-incubadas con células HeLa P5 dispuestas en placas de 96 pocilios en un ratio 1:1 durante 16 horas. Entonces, las células fusionadas fueron lavadas, lisadas (50 μL de solución de lisis) y la actividad enzimática se evaluó mediante quimioluminiscencia (ensayo de gen reportero β-gal, Roche Diagnostics GMBH) . Cuando se indique, las células HeLa P5 fueron pre-tratadas con TSA o NaBut . La tinción X-GaI de los sincitios formados, después de 16 horas de co-cultivo celular se realizó mediante la fijación de las células con 0.5% glutaraldehido y mareaje con el sustrato de β- galactosidasa X-gal (5-bromo-4~cloro-3-indoil-β-D- galactopiranosida) , tal como se ha descrito anteriormente
(Pleskoff O., et al., 1997. Science 276: 1874-8).
El ensayo de fusión celular de doble fluorescencia se realizó según está descrito (Valenzuela-Fernandez A. , et al., 2001. J.Biol . Chem. 276: 26550-8). Brevemente, las células Jurkat Hxbc2, que expresan la Env Hxbc2 de la cepa trópica X4 del virus VIH-I, marcadas con CMAC fueron co-cultivadas con células TJ77 pre-cargadas con CMTMR. El sincitio celular, marcado con dos cromóforos, se detectó 16 horas después mediante citometría de flujo o microscopía fluorescente. Cuando se indica, las células fueron pre-incubadas con TSA, Nabut o mAb anti-CD4. Preparación de virus VIH-I Las preparaciones altamente infecciosas de las cepas del virus VIH-1NL,43 y VIH-1BAL se generaron mediante varios pases consecutivos de los aislados de VIH-I originales aislados de células mononucleares de sangre periférica
(PBMC) tal como se ha descrito (Valenzuela A., et al . ,
1997. J.Virol. 71: 8289-98). Brevemente, las células PBMC fueron infectadas con una dosis sincrónica del virus VIH- 1NL43 y VIH-IBAL/ los sobrenadantes del cultivo
(centrifugados a 5.000 x g durante 10 minutos) se recuperaron tres días después y mantenidos a 70 °C. Alícuotas descongeladas frescas fueron filtradas mediante un filtro de tamaño de poro de 0.22 μm antes de sus uso.
Infección y entrada del virus VIH-I
La infección y entrada del virus VIH-I NL43 se ensayó en células PBL activadas mediante PHA o en células MT-2. Cuando se indique, las células T pre-tratadas con los mAbs anti-CD4 (5 μg/mL) , SDF-lα (300 nM) , AZT (5 μg/mL) , TSA o NaBut. La entrada del virus VIH-I en las células MT-2 se monitorizó durante 12 horas después de la infección con VIH-I con la medida del DNA proviral gag VIH-I mediante Taqman-PCR usando cebadores específicos tal como se ha descrito anteriormente (Zhao Y., et al., 2002. J.Clin.Microbiol. 40: 675-8). La infección de VIH-I de células PBL activadas con PHA se evaluaron midiendo la concentración de p24 en el sobrenadante de los cultivos mediante ELISA (INNOTEST HIV-I antigen aAb Innogenetic N. Y. Ghent, Bélgica) tal como se ha descrito (Valenzuela A., et al., 1997. J.Virol. 71: 8289-98).
La infección con cepas del virus VIH-1NL43 y VIH-1BAL de las células HeLa P5 se realizó en placas de 96 pocilios durante 5 horas a 370C. El virus fue eliminado mediante lavado (PBS) y las células infectadas fueron tratadas con tripsina (5 minutos a 37°C) . Las células HeLa P5 fueron cultivadas durante las próximas 52 horas. Entonces, las células infectadas fueron lisadas, y los niveles de infección de VIH-I fueron evaluados mediante medida de β- galactosidasa. Cuando se indique, las células fueron pre-tratadas con TSA o NaBut durante 2 horas a 370C antes de la infección con VIH-I. Silenciamiento de HDAC6 Se generó un siRNA de doble cadena frente a la secuencia de HDACβ comprendida entre los nucleótidos 211-231
(Eurogenentec, Seraing, Bélgica) tal como se ha descrito
(Serrador J. M. , et al., 2004. Immunity 20: 417-28). Las células HeLa P5 fueron transfectadas con este siRNA a una concentración final de 200 nM utilizando Oligofectamine (Invitrogen Corp. Carslbad, CA) según las instrucciones del fabricante. La transfección control negativo con sólo reactivo, o con mezclas de transfección con un siRNA de doble cadena (Eurogenentec, Seraing, Bélgica) que no reconocen ninguna proteína eucariota, se utilizaron como controles. Las células fueron transfectadas dos veces durante 3 días y recogidas 24 horas después de la última transfección. Los lisados celulares totales (40 μg) se analizaron mediante Western blot con anticuerpos anti- HDAC6 , anti-oc-tubulina acetilada y anti-α-tubulina .
Agrupamiento de las proteínas CXCR4 y CD4 durante la infección con VIH-I
Las células Jurkat J77 y MT-2 transfectadas con la forma salvaje (wt) de HDAC6-GFP o mutada (dm) HDAC6-GFP fueron co-cultivadas con la cepa VIH-1NL43 (MOI, 1) durante 90 minutos a 370C. Entonces, las partículas virales fueron aclaradas y las células fijadas con un 2% paraformaldehido. La co-distribución de CD4 y CXCR4 en las estructuras de pseudopodia se analizó mediante inmunofluorescencia de las células marcadas con un anticuerpo monoclonal no neutralizanet PE-v4 y con Alexa 350-estreptavidina contra un anticuerpo monoclonal primario biotinilado anti-CXCR4.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Uso de un compuesto agonista de la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 en la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para la profilaxis y tratamiento de enfermedades de mamíferos, ya sean humanos u otros animales, provocadas por la entrada e infección de un virus fusogénico de células eucariotas .
2. - Uso de un compuesto según la reivindicación 1 caracterizado porque el virus fusogénico pertenece al siguiente grupo: el virus de la gripe, el virus Semliki Porest, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , el virus de la inmunodeficiencia simia (SIV) , el virus Sendai, el virus del Sarcoma de Rous, el virus de la Estomatitis Vesicular, el virus Ébola, el virus Measles, virus del Dengue, el virus de la fiebre amarilla y de la encefalitis .
3. - Uso de un compuesto según la reivindicación 1 caracterizado porque el virus fusogénico es el virus VIH- 1.
4.- Uso de un compuesto según la reivindicación 1 caracterizado porque el compuesto agonista está constituido por una xantina o sus derivados.
5.- Uso de un compuesto según la χ-eivindicación 1 caracterizado porque el compuesto está constituido por una construcción genética que permite la expresión de una proteína o péptido con actividad tubulina desacetilasa que mimetiza la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 humana en el interior de células eucariotas y que comprende una o varias secuencias de nucleótidos HDACβ pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6, b) una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a) , c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) , y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a) , b) y c) -
6. - Uso de un compuesto según la reivindicación 5 caracterizado porque el compuesto es una construcción génica HDACβ que comprende como secuencia de nucleótidos de a) la SEQ ID NOl codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6 (SEQ ID N02) .
7.- Uso de un compuesto según la reivindicación 5 caracterizado porque el compuesto es una construcción génica HDAC6 que comprende como fragmento de b) un fragmento de la SEQ ID NOl codificante, al menos, de la secuencia de aminoácidos comprendida entre los dos residuos de histina 216 y 611 de la HDAC6 humana (SEQ ID N02) .
8. - Uso de un compuesto según la reivindicación 1 caracterizado porque el compuesto está constituido por un vector de expresión génica que comprende una secuencia de nucleótidos HDACβ o una construcción genética HDACβ y que permite la expresión de una proteína o péptido con actividad tubulina desacetilasa que mimetiza la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 humana en el interior de células de mamíferos .
9.- Uso de un compuesto según las reivindicaciones
1 a la 8 caracterizado porgue la célula eucariota de un mamifero es un linfocito T humano.
10.- Composición farmacéutica o un medicamento para el tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con la entrada e infección de un virus fusogénico en una célula eucariota caracterizada porque comprende un compuesto agonista de la proteína HDACβ humana, en cantidad terapéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
11.- Composición farmacéutica según la reivindicación 10 caracterizada porque el compuesto agonista es una xantina o sus derivados .
12. - Composición farmacéutica según la reivindicación 10 caracterizada porque el compuesto agonista es una construcción genética o un vector de expresión HDAC6 que permite la expresión de una proteína o péptido con actividad tubulina desacetilasa que mimetiza la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 humana en el interior de células eucariotas y que comprende una o varias de las secuencias de nucleótidos HDAC6 pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDACβ, b) una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a) , c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) , y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a) , b) y e).
13. - Composición farmacéutica según la reivindicación 12 caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de a) es la secuencia de nucleótidos SEQ ID NOl codificante de la proteína tubulina desacetilasa humana HDAC6 (SEQ ID N02) .
14. - Composición farmacéutica según la reivindicación 12 caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de b) es un fragmento constituido por una secuencia de nucleótidos codificante, al menos, de la secuencia de aminoácidos comprendida entre los dos residuos de histina 216 y 611 de la HDAC6 humana (SEQ ID N02) .
15. - Uso de la composición farmacéutica según las reivindicaciones 10 a la 14 en un método de tratamiento o profilaxis de un mamífero afectado por una enfermedad, desorden o patología provocada por la entrada e infección de un virus fusogénico.
16. - Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 15 caracterizado porque la enfermedad provocada por un virus fusogénico que infecta células eucariotas pertenece al siguiente grupo: el virus de la gripe, el virus Semliki Forest, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , el virus de la inmunodeficiencia simia (SIV), el virus Sendai, el virus del Sarcoma de Rous, el virus de la Estomatitis Vesicular, el virus Ébola, el virus Measles, virus del Dengue, el virus de la fiebre amarilla y de la encefalitis .
17.- Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 15 caracterizado porque la enfermedad provocada por un virus fusogénico que infecta células eucariotas es la enfermedad de inmunodeficiencia humana adquirida provocada por el virus fusogénico VIH-I.
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Rainho Examining The Role of Nef in the Resistance of SIV-Infected Macrophages to CD8+ T Cell Suppression

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