ES2370888T3 - Modulación de la producción de retrovirus por apobec4. - Google Patents

Modulación de la producción de retrovirus por apobec4. Download PDF

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Abstract

Una proteína APOBEC4 humana modificada caracterizada porque el extremo N está modificado para estabilizar la proteína APOBEC4 o el extremo C está modificado, en la que la modificación del extremo N comprende la adición de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el marcador V5, el marcador c- myc y el marcador HA o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma, y en la que la modificación del extremo C comprende la adición de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el marcador V5, el marcador c-myc y el marcador HA o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma.

Description

Modulación de la producción de retrovirus por APOBEC4
Campo Técnico
La invención se refiere a la modulación de la liberación de retrovirus o partículas virales de los mismos desde células por APOBEC4 humana o una APOBEC4 humana modificada y a diversos usos de los mismos.
Técnica Antecedente
La familia del polipéptido catalítico de tipo 4 de la enzima de edición del ARNm de la apolipoproteína B (APOBEC4) es un miembro de la superfamilia AID/APOBEC específica de vertebrados de citidina desaminasas de edición de ARN/ADN (ROGOZIN, IB, y col. APOBEC4, a new member of the AID/APOBEC family of polynucleotide (deoxy)cytidine deaminases predicted by computational analysis. Cell Cycle. 2005, vol.4, nº 9, pág. 1281-5). La superfamilia de proteínas AID/APOBEC contiene cinco subfamilias (AID, APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3 y APOBEC4) e incluye varios miembros con la capacidad de desaminar citosina para dar uracilo en polinucleótidos monocatenarios, mientras que cumplen diversas funciones fisiológicas (CONTICELLO, SG, y col. Evolution of the AID/APOBEC family of polynucleotide (deoxy)cytidine deaminases. Mol Biol Evol. 2005, vol.22, no.367, p.77), entre las que se encuentra la inhibición de retrovirus por mecanismos dependientes e independientes de edición de ácidos nucleicos (HOLMES, RK, y col. APOBEC-mediated viral restriction: not simply editing? Trends Biochem Sci. 2005, vol.32, no.3, p.118-128). Se ha descrito un procedimiento para inactivar enzimas APOBEC por medio del virus espumoso Bet (documento WO 2005/117947), y el documento WO 2006/065377 desvela un procedimiento para la identificación de agentes que reducen el nivel de APOBEC3C activo en una célula.
En mamíferos, la expresión de APOBEC4 está regulada positivamente en testículos, lo que sugiere la posibilidad de que sea una enzima de edición para ARNm implicados en la espermatogénesis. Sin embargo, aún se desconoce la función o funciones fisiológicas exactas de APOBEC4. La secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos de APOBEC4 se conoce y está disponible para diversas especies, entre otras, ser humano (número de acceso del GenBank NM_203454, Gl 44888831), ratón (número de acceso del GenBank NC_000067, Gl 38073497), o rata (número de acceso del GenBank NM_001017492, Gl 62945336). APOBEC4 es una proteína de aproximadamente 370 aminoácidos y 41000 Da (APOBEC4 humana: 367 aminoácidos; 41581 Da) y comprende un dominio de dedo de cinc y, en la mayoría de las especies, una cola de polilisina C terminal.
Divulgación de la Invención
La invención se refiere a la materia objeto definida en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se basa en el descubrimiento de que la expresión de la proteína APOBEC4 o una proteína APOBEC4 modificada en una célula que produce un retrovirus conduce a una mayor o menor producción de retrovirus o partículas virales a partir de dicha célula. Específicamente, la estabilización de la proteína por modificación del extremo N, entre otras cosas, mediante adición de una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, el marcador V5, el marcador c-myc o el marcador HA, conduce a una mayor producción de retrovirus o partículas virales desde dicha célula. La modificación del extremo C, entre otras cosas, mediante la adición de al menos un marcador V5, marcador c-myc o marcador HA conduce a una menor producción de retrovirus o partículas virales desde dicha célula. También se desvela que la cola de polilisina C terminal de APOBEC4 puede modificarse por deleción o modificación por mutación.
Un primer aspecto de la invención es una proteína APOBEC4 humana modificada caracterizada porque el extremo N está modificado para estabilizar la proteína APOBEC4 o está modificado el extremo C. La modificación del extremo N comprende la adición de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el marcador V5, el marcador c-myc y el marcador HA o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma. Dicha al menos una secuencia de aminoácidos puede ser HA o una secuencia al menos un 90% idéntica a la misma. La modificación del extremo C comprende la adición de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el marcador V5, el marcador c-myc y el marcador HA o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma. Más preferentemente, dicha al menos una secuencia de aminoácidos es HA, 3 HA o una secuencia al menos un 90% idéntica a la misma.
Un aspecto adicional de la invención es una célula que expresa la proteína APOBEC4 modificada en el extremo C o N de la presente invención. Preferentemente, la célula produce además un retrovirus. Más preferentemente, el retrovirus o lentivirus se selecciona del grupo que consiste en VIH, VIH-1, VIH-2, VIS, VISagm, VISmac, VIF, VAIE, espumavirus (virus espumoso) y VLM. Incluso más preferentemente, dicho retrovirus o lentivirus es un virus deficiente en la replicación. En una realización preferida adicional, la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula humana, una célula HeLa, una célula 293T, una célula madre, un linfocito T auxiliar, un macrófago o progenitores o líneas celulares de los mismos.
Otro aspecto de la presente invención es un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína APOBEC4 modificada de la presente invención o el complemento de la misma. En una realización preferida, el ácido nucleico comprende un ácido nucleico que codifica la proteína APOBEC4 de la presente invención o un complemento del mismo, unido operativamente a un promotor. En una realización más preferida, el ácido nucleico es un vector para terapia génica. En una realización adicional más preferida, el promotor es el promotor de CMV.
Otro aspecto de la presente invención es el uso de la secuencia de ácido nucleico o célula de la presente invención para la producción de un medicamento. En una realización preferida, el ácido nucleico es un vector para terapia génica y/o un ácido nucleico que comprende el ácido nucleico que codifica la proteína APOBEC4 modificada de la presente invención unido operativamente a un promotor, preferentemente el promotor de CMV. En una realización preferida adicional, la célula expresa la proteína APOBEC4 modificada de la presente invención. En otra realización preferida, la célula expresa la proteína APOBEC4 modificada de la presente invención y además produce un retrovirus o partículas de virus del mismo, preferentemente un retrovirus deficiente en la replicación, más preferentemente un virus deficiente en la replicación seleccionado del grupo que consiste en VIH, VIS, VLM, VIF, VAIE, VIH-1, VIH-2, VISagm, VISmac, espumavirus o partículas de virus de los mismos. En un aspecto adicional, el medicamento se dirige al tratamiento o vacunación contra VIH, VIS, VLM, VIF, VAIE, VIH-1, VIH-2, espumavirus, VISagm y VISmac.
Otro aspecto de la invención es el uso de una partícula viral de la invención para la preparación de un medicamento, preferentemente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infecciones virales. En una realización preferida, las partículas virales comprenden una proteína APOBEC4 modificada en el extremo C de la invención, preferentemente la proteína APOBEC4-HA o APOBEC4-3xHA. En otra realización preferida, las partículas virales se basan en un virus seleccionado del grupo que consiste en VIH, VIS, VLM, VIF, VAIE, VIH-1, VIH-2, VISagm, VISmac, espumavirus, preferentemente VIH-1. En una realización preferida adicional, las partículas virales son partículas virales seudotipificadas. En otra realización de la presente invención, la partícula viral codifica ARNhc/ip que se dirige a la APOBEC4 endógena y codifica adicionalmente una APOBEC4 terapéutica de codones optimizados, por ejemplo, APOBEC-3xHA o APOBEC-HA, que no se ve afectada por las moléculas de ARNhc/ip.
Otro aspecto de la presente invención es una vacuna que comprende la célula de la presente invención y un vehículo farmacéutico aceptable. En una realización preferida, la célula expresa la proteína APOBEC4 modificada de la presente invención, estando la proteína APOBEC4 modificada en el extremo N para estabilizar la proteína APOBEC4 y produciendo además un retrovirus o partículas de virus del mismo, preferentemente un retrovirus o lentivirus deficiente en la replicación. En una realización preferida adicional, la célula es una célula madre o una célula autóloga, una célula T auxiliar o un macrófago.
Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para reducir la producción de retrovirus o partículas virales de los mismos en una célula que produce un retrovirus o partículas virales del mismo, comprendiendo el procedimiento a expresar una proteína APOBEC4 modificada de la presente invención en dicha célula, en el que el extremo C de la proteína APOBEC4 está modificado para reducir o inhibir la unión a la cola de polilisina C terminal de APOBEC4. En una realización preferida, la producción de retrovirus o partículas virales de los mismos se reduce al menos en un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99%.
Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para producir partículas retrovirales, comprendiendo el procedimiento cultivar una célula de acuerdo con la presente invención, en el que la célula produce un retrovirus deficiente en la replicación o partículas virales de un retrovirus y además expresa una proteína APOBEC4 modificada de la presente invención, en el que el extremo N de la proteína APOBEC4 se modifica para estabilizar la proteína APOBEC4. En una realización preferida, el extremo N de la proteína APOBEC4 se modifica por adición de un marcador HA. En una realización preferida adicional, la célula es una célula 293T o una célula HeLa cotransfectada con una construcción de fusión HA-APOBEC4 y un plásmido de expresión de VIH-1.
Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para seleccionar compuestos antivirales, comprendiendo el procedimiento las etapas de poner en contacto una célula que expresa una proteína APOBEC4 humana con un compuesto de ensayo, y determinar si el compuesto de ensayo afecta a la transcripción y/o expresión de APOBEC4 en dicha célula. En una realización preferida, la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de una primera célula en presencia del compuesto de ensayo se compara con la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de una segunda célula que no ha estado en contacto con el compuesto de ensayo, indicando una reducción en la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de la primera célula que el compuesto de ensayo es un compuesto antiviral potencial.
En una realización preferida, se usan células HeLa o 293T en el procedimiento de selección. En otra realización preferida, la cantidad de transcrito de APOBEC4 y/o proteína APOBEC4 se determina por RT-PCR, transferencia de Northern y transferencia de western, respectivamente.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento para seleccionar compuestos antivirales, comprendiendo el procedimiento las etapas de poner en contacto una célula que expresa un retrovirus y APOBEC4 humana con un compuesto de ensayo y determinar el título del retrovirus en presencia y ausencia del compuesto de ensayo, en el que una reducción en el título indica que el compuesto candidato interfiere con el montaje del retrovirus por interacción con la proteína APOBEC4 y, por lo tanto, es un posible fármaco antirretroviral.
También se desvelan moléculas – y agentes farmacéuticos basados en dichas moléculas – dirigidas y que interfieren con el ARNm de APOBEC4. Preferentemente, dichas moléculas son moléculas de ARNip o ARNhc dirigidas contra el ARNm de APOBEC4. Preferentemente, dichas moléculas se usan para la fabricación de un medicamento. Incluso más preferentemente, dichas moléculas se usan para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infecciones virales.
En las reivindicaciones y descripción detallada de la invención se describen otras realizaciones de la presente invención.
Breve Descripción de las Figuras en los Dibujos
La Figura 1 es una vista general estructural esquemática de la proteína APOBEC4 humana y las consecuencias de la modificación del extremo C, demostrada de forma ejemplar por un marcador HA.
La Figura 2 representa los mapas de vectores de plásmidos phA4-3xHA (Fig. 2A), phHA-A4cDNA3.1Zeo(+) (Fig 2B) y phA4cDNA3.1Zeo(+) (Fig. 2C), respectivamente.
La Figura 3 muestra los resultados de la transferencia de western de células 293T cotransfectadas con NL4-3 de VIH-1 y un plásmido de expresión que codifica una APOBEC4 no modificada, HA-APOBEC4 y APOBEC4-3xHA, respectivamente.
La Figura 4 muestra los resultados de la transferencia de western de células T293 cotransfectadas con un plásmido de expresión que codifica el virus indicador VIH-1 NL-luc R-E-y el plásmido de expresión que codifica la APOBEC4 no modificada, HA-APOBEC4 y APOBEC4-3xHA, respectivamente.
La Figura 5 muestra los resultados de los ensayos del virus indicador, en los que se muestra la cotransfección de las células con el virus indicador VIH-1 NL-luc R-E y el plásmido de expresión que codifica la APOBEC4 no modificada, HA-APOBEC4 y APOBEC4-3HA.
Descripción Detallada
Definiciones
“APOBEC4”, como se usa en la presente invención, se refiere a la proteína del polipéptido catalítico de tipo 4 de la enzima de edición del ARNm de la apolipoproteína B o al gen que codifica dicha proteína. Las proteínas APOBEC4 modificadas de la presente invención que contienen secuencias de aminoácidos adicionales, por ejemplo, un marcador tal como el marcador HA, se denominan HA-APOBEC4 si el marcador está unido al extremo N de la proteína APOBEC4 y APOBEC4-HA si el marcador está unido al extremo C de la proteína APOBEC4. De esta manera, V5-APOBEC4 y APOBEC4-V5 designan una proteína de fusión, en la que el marcador V5 está fusionado al extremo N y C de la proteína APOBEC4, respectivamente. Como ejemplo adicional, APOBEC4-3xHA designa una proteína de fusión de APOBEC4 y tres marcadores HA fusionados secuencialmente al extremo C de APOBEC4. Los ácidos nucleicos o plásmidos se designan de la misma manera.
Los “virus” de la presente invención incluyen todos los retrovirus, preferentemente lentivirus, más preferentemente VIH, VIS, VIF, VAIE, VLM, espumavirus, incluso más preferentemente VIH-1, VIH-2, VISagm, VISmac, y aún más preferentemente VIH-1. Además, la presente invención incluye virus mutados y/o truncados derivados de los retrovirus anteriores. Una subserie de dichos retrovirus mutados/truncados son las denominadas “partículas de vector” o “partículas virales”, que se refieren a retrovirus deficientes en la replicación. De esta manera, las partículas de vector retroviral de la presente invención son vectores retrovirales que pueden contener un ARN que, tras la infección de una célula huésped o diana, se transcribe de forma inversa y se inserta en el genoma de dicha célula. Este ARN puede contener un gen heterólogo, por ejemplo, el gen indicador de luciferasa de Photinus pyralis como en el virus indicador NL-luc R-E-descrito más adelante. Sin embargo, estar partículas de vector sólo contienen un genoma incompleto del lentivirus del que proceden. En general, la molécula de ARN de la partícula del vector no comprende la información genética de los propios genes gag, env y/o pol, lo cual es un requisito mínimo conocido para la replicación satisfactoria de un retrovirus. Como resultado, las partículas de vector son deficientes en la replicación, es decir, no pueden transducir una célula huésped o diana con la información genética requerida para su propia replicación.
De esta manera, una partícula de vector comprende un mínimo de las proteínas Gag, Pol y Env y una molécula de ARN (que puede ser un vector de expresión). La molécula de ARN procede del genoma del retrovirus, pero no comprende al menos uno de los genes gag, env o pol por sí mismos. Sin embargo, para producir una partícula de vector segura y eficaz, en general están ausentes dichos tres genes, así como cualquier otro gen no esencial. En el caso de VIH-1, dichos genes innecesarios del genoma de VIH-1 que pueden delecionarse de la molécula de ARN incluyen tat, vif, vpr, vpu y nef.
La molécula de ARN también puede comprender todos los elementos, por ejemplo, el elemento psi y RTL del genoma retroviral que se requieren para un empaquetamiento eficaz del ARN en las partículas de vector resultantes. En el caso de un vector de expresión, la molécula de ARN preferentemente comprende un gen adicional (normalmente heterólogo) que está bajo el control de un promotor adecuado, por ejemplo, el promotor de CMV, y por lo tanto se expresa tras la integración del gen en el genoma de la célula huésped o diana.
Por lo tanto, un ejemplo de una molécula de ARN que puede usarse para generar una partícula de vector retroviral se basa en el genoma de VIH-1 y comprende las RTL, el elemento psi y el promotor de CMV seguido del gen a trasducir, por ejemplo, un gen indicador tal como el gen de una proteína GFP o el gen indicador de luciferasa de Photinus pyralis. Tras la expresión de dichos genes indicadores, los títulos o la cantidad de las partículas de vector generadas pueden determinarse convenientemente por ensayos convencionales. Los genes gag, env, pol, tat, vif, vpr, vpu y/o nef de VIH-1 se retiran o se impide la expresión de sus productos génicos, por ejemplo, por una o más mutaciones de cambio de fase.
Otro ejemplo de un gen heterólogo comprendido por la molécula de ARN es el gen que codifica la proteína APOBEC4 (modificada) de la presente invención. De esta manera, la presente invención proporciona partículas de vector que se basan y presentan el tropismo de un retrovirus específico, por ejemplo VIH-1, y para las que se busca tratamiento, y comprende además un gen que codifica una proteína APOBEC4 modificada de la presente invención que reduce la producción del retrovirus. Dichas partículas de vector transfectarán las mismas células, posiblemente infectadas por VIH-1, y posteriormente reducirán la producción de VIH-1 por dichas células.
Los requisitos mínimos de un vector de lentivirus basado en VIH-1 se han descrito por KIM, VN, y col. Minimal requirement for a lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 1998, vol.72, no.1, p.811
6.
La molécula de ARN descrita anteriormente junto con las proteínas gag, pol y env, que pueden proporcionarse en trans por la línea celular de empaquetamiento, después se ensamblan en las partículas de vector o partículas vectoriales, que podrán infectar eficazmente a su célula diana o huésped, transcribir de forma inversa la molécula de ARN que puede comprender un gen heterólogo bajo el control de un promotor, por ejemplo el promotor de CMV, e integrar dicha información genética en el genoma de las células diana/huésped. Sin embargo, como la información genética de las proteínas gag, pol y/o env no está presente en la molécula de ARN transducida, las partículas del vector o partículas vectoriales serán deficientes en la replicación, es decir, no se producirá en la célula transducida ninguna nueva generación de dichas partículas de vector.
El término “estabilización”, como se usa en al presente invención, se refiere a una inhibición o reducción de la degradación de proteínas o una inhibición o reducción del transporte de la proteína desde, por ejemplo, el citosol a otro compartimento celular o al exterior de la célula, conduciendo de esta manera a una mayor disponibilidad de la proteína dentro de la célula, por ejemplo, en el citosol. El experto en la materia conoce diversas formas para conseguir la estabilización de una proteína, entre otras, por modificación de la proteína mediante sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Una modificación preferida para conseguir la estabilización es la adición Nterminal de una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en el marcador V5, el marcador c-myc y el marcador HA o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma.
El experto en la materia podrá introducir fácilmente mutaciones tales como, por ejemplo, adiciones y deleciones, en una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos dada. Dichas metodologías conocidas se desvelan, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989).
La invención incluye particularmente secuencias de ácido nucleico u homólogos de las mismas, o fragmentos únicos de las mismas. En la presente invención, la secuencia de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína resultante se considera homóloga a un a segunda molécula de ácido nucleico si la secuencia de nucleótidos de la primera molécula de ácido nucleico es al menos aproximadamente un 70% idéntica, preferentemente al menos aproximadamente un 80% idéntica y más preferentemente al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95% o 99% idéntica a la secuencia de la segunda molécula de ácido nucleico. Como alternativa, la homología entre dos secuencias de ácido nucleico puede determinarse fácilmente usando el algoritmo conocido BLASTN (ALTSCHUL, SF, y col. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990, viol.215, nº 3, págs. 403-10) con parámetros por defecto. Como ejemplo adicional, otro ensayo conocido para averiguar la homología de dos secuencias de ácido nucleico es si hibridan en condiciones de hibridación normales, preferentemente en condiciones de hibridación rigurosas.
Usando las secuencias de ácido nucleico desveladas en el presente documento, el experto en la materia puede diseñar adicionalmente estructuras de ácido nucleico que tengan funciones deseadas particularmente en diversos tipos de aplicaciones. Por ejemplo, el experto en la materia puede construir oligonucleótidos o polinucleótidos para uso como cebadores en los procedimientos de amplificación de ácido nucleico, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), Reacción en Cadena de Reparación (RCR), PCRensayo de ligación de oligonucleótidos (PCR-OLA) y similares. También pueden construirse oligonucleótidos útiles como sondas en estudios de hibridación, tales como hibridación in situ. Se conocen numerosos procedimientos para marcar dichas sondas con radioisótopos, marcadores fluorescentes, enzimas y restos de unión (por ejemplo, biotina), por lo tanto, las sondas de la presente invención pueden adaptarse para la detectabilidad de una manera sencilla.
La proteína de la presente invención además incluye homólogos funcionales. Una proteína se considera un homólogo funcional de otra proteína para una función particular, si el homólogo tiene una función similar a la de la proteína original. El homólogo puede ser, por ejemplo, un fragmento de la proteína o un mutante de sustitución, adición o deleción de la proteína.
La determinación de si dos secuencias de aminoácidos son sustancialmente homólogas típicamente se basa en búsquedas FASTA de acuerdo con Pearson y col. PERASON, WR, y col. Improved tools for biological sequence comparison. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988, vol. 85, nº 8, págs. 2444-8. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una primera proteína se considera homóloga a la de una segunda proteína si la secuencia de aminoácidos de la primera proteína comparte al menos aproximadamente un 70% de identidad de secuencia de aminoácidos, preferentemente al menos aproximadamente un 80% de identidad y más preferentemente al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 99,5%, aún más preferentemente al menos un 99% de identidad, con la secuencia de la segunda proteína.
El término “seudotipificado”, como se usa en la presente invención, se refiere a una partícula de vector que lleva glicoproteínas de la envuelta procedentes de otros virus que tienen envueltas. La serie de huéspedes de los retrovirus o lentivirus de la presente invención, por lo tanto, pude expandirse o alterarse dependiendo del tipo de receptor de la superficie celular usado por la glicoproteína.
Las proteínas gag, pol y env necesarias para ensamblar la partícula del vector se proporcionan en trans por medio de una línea celular de empaquetamiento, por ejemplo HEK-293T. Esto se consigue normalmente por transfección de la línea celular de empaquetamiento con uno o más plásmidos que contienen los genes gag, pol y env. Para la generación de vectores seudotipificados, el gen env, originalmente derivado del mismo retrovirus que los genes gag y pol y que la molécula de ARN o vector de expresión, se cambia por la proteína o proteínas de la envuelta de un virus de envuelta diferente. Como ejemplo, se usa la proteína G de VSV.
De esta manera, una partícula de vector seudotipificado ejemplar basada en el retrovirus VIH-1 comprende (1) las proteínas Gag y Pol de VIH-1, (2) una molécula de ARN derivada del genoma de VIH-1 que puede usarse para generar una partícula de vector retroviral basada en el genoma de VIH-1 que carece de los genes gag, env, pol, tat, vif, vpr, vpu y nef, pero que comprende las RTL, el elemento psi y un promotor de CMV seguido del gen a transducir, por ejemplo, un gen para la proteína GFP, y (3) la proteína G de VSV. De esta manera, la partícula del vector seudotipificado resultante presentará el tropismo de VSV.
Otro ejemplo es el virus indicador NL-luc R-E-que procede de la variante NL4-3 de VIH-1 y se caracteriza por una deleción de los genes vpr, env y nef. Además, NL-luc R-E-lleva el gen indicador de luciferasa de Photinus pyralis y está seudotipificado con la proteína VSV-G.
Una partícula de virus o vector “derivada de”, por ejemplo, VIH-1, como se usa en la presente invención, se refiere a una partícula de virus o vector en la que la información genética del ARN y/o las proteínas Gag y Pol comprendidas por la partícula de virus o vector proceden originalmente del virus original, en el caso anterior VIH-1. Como se ha descrito anteriormente, el genoma retroviral original puede comprender mutaciones tales como deleciones, mutaciones de cambio de fase e inserciones.
El término “marcador”, como se usa en la presente invención, se refiere a una secuencia de aminoácidos corta que sirve como epítopo para la detección inmunológica de la proteína de interés. Los marcadores usados en la presente invención son HA, V5 y c-myc.
Taxonomía
Los virus de la familia taxonómica Retroviridae comparten, como característica de unificación, un genoma de ARNmc de cadena positiva (en el presente documento “ARN(+)mc”). Durante la infección, dicho ARN(+)mc no puede usarse directamente como molde (ARNm) y, por lo tanto, la información genética de este virus primero se transcribe de forma inversa desde ARN en ADN por una transcriptaza inversa proporcionada por el virus y posteriormente se integra en el genoma del huésped. De esta manera, el término “retro" se refiere a la actividad de la transcriptasa inversa y la transferencia de información genética desde el ARN al ADN. Actualmente se han identificado más de 570 virus individuales de la familia.
Una subfamilia de Retroviridae comprende los virus Orthoretroviridae, que incluyen los géneros de alfa-retrovirus, por ejemplo, con especies del virus de la leucosis aviar (VLA) los gamma-retrovirus, por ejemplo, con especies del virus de la leucemia murina (VLM) o el virus de la leucemia felina (VLF) o los delta-retrovirus, por ejemplo, con especies del virus de la leucemia bovina (VLB) o el virus linfotrópico T humano (VLTH).
Un género adicional de Orthoretroviridae, conocido como lentivirus, ha atraído recientemente mucho interés principalmente debido a un miembro bien conocido, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Sin embargo, el género de lentivirus comprende muchos otros virus. Además de las especies de VIH-1 o VIH-2, el virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB), el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) y el virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS) son ejemplos de esfuerzos investigación frecuentes y extensos. Puede encontrarse una visión general de los retrovirus y lentivirus, respectivamente, por ejemplo en Vigna y col. y Palu y col. (VIGNA, E, y col. Lentiviral vectors: excellent tools for experimental gene transfer and promising candidates for gene therapy. J Gene Med. 2000, vol.2, nº 5, págs. 308-16. PALU, G, y col. Progress with retroviral gene vectors. Rev Med Virol. 2000, viol.10, nº 3, págs. 185-202).
Características Estructurales y Genéticas de Genomas Retrovirales
Los genomas de retrovirus competentes para la replicación conocidos típicamente comprenden los cuatro dominios codificantes (gag, pro, pol, env), en los que gag codifica un polipéptido (en el presente documento “Gag”) en el que los productos de escisión comprenden las proteínas estructurales principales del núcleo del virus incluyendo las de la matriz (MA), la cápsida (CA) y la nucleocápsida (NC). Pro codifica parte de la poliproteína (Gag-Pro o Gag-Pro-Pol) en la que los productos de escisión típicamente incluyen proteasa (PR) y ocasionalmente dUTPasa (DU). Pol codifica parte de la poliproteína (Gag-Pro-Pol), en la que los productos de escisión típicamente incluyen transcriptasa inversa (TR) e integrasa (IN) y, en algunos lentivirus, dUTPasa (DU). En los espumavirus, pol se expresa a través de un ARNm con cortes y empalmes como una poliproteína Pol-Pol. Env codifica una poliproteína (Env) cuya escisión produce SU (superficie) y TM (transmembrana) que constituyen las proteínas estructurales de la envuelta viral.
Además, los retrovirus típicamente contienen dos repeticiones terminales largas (RTL) y una región de varios cientos (�300-1800) pares de bases compuestas de U3-R-U5 (5 a 3) que están localizadas en los dos extremos del genoma no integrado e integrado (proviral). Además, generalmente está presente dentro del genoma retroviral un elemento psi. El elemento psi es una señal de actuación cis, localizada cerca del extremo 5’ del genoma y designa una señal de empaquetamiento, que tiene importancia durante el ensamblaje del virus y conduce a la incorporación del ARN viral en el núcleo viral. Los retrovirus más complejos típicamente comprenden otros genes reguladores. En el caso de VIH-2, estos genes reguladores incluyen ref, tat, vif, nef, vpr y vpx.
Visión General de la Función de APOBEC4 en la Producción de Virus
APOBEC4 es una proteína eucariota y se expresa principalmente en testículos de mamífero, lo que sugiere que es una enzima de edición para ARNm implicados en la espermatogénesis. Como hipótesis de trabajo no limitante (véase la Figura 1a), durante la replicación viral se recluta un complejo que comprende APOBEC4 y al menos dos factores adicionales y aún desconocidos (factor X y factor Y) y se usan por la maquinaria de replicación del virus. Como se representa en la Figura 1a, APOBEC4 comprende un domino de dedo de cinc (hpesmlfemngyldsaiynndsirhiilysnnspcneanhcc, aa 93-134) y una cola de polilisina C terminal (kkkkkgkk, aa 360367), en el que la cola de polilisina permite la unión del factor Y, mientras que el factor X supuestamente se une al domino de dedo de cinc. Además, se supone un exceso dentro de la célula de los dos factores, X e Y, en comparación con APOBEC4 endógena.
La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento experimental de que la expresión de la proteína APOBEC4 en una célula que produce un retrovirus conduce a una mayor o menor producción de retrovirus a partir de dicha célula. Además, este efecto proviral se correlaciona directamente con la cantidad de ADN plasmídico que codifica la proteína APOBEC4 usada para la cotransfección y, por lo tanto, con la proteína APOBEC4 expresada. Este efecto proviral de correlación de la expresión de APOBEC4 puede explicarse con una mayor formación del complejo APOBEC4 reclutado por el virus: como hay un exceso de factor X e Y, la cantidad de APOBEC4 complejada con factor X y factor Y sólo dependerá de la cantidad de APOBEC4 expresada por la célula (y, por lo tanto, depende de la cantidad de ADN plasmídico usado durante la transformación). Se consiguió un aumento en la producción de virus de hasta 10 veces usando HA-APOBEC4 en comparación con el control negativo (293T transfectadas sólo con provirus).
Las proteínas se degradan de forma constante y se resintetizan por la célula (un proceso conocido como renovación de proteínas) o se transportan o translocan a diversos compartimentos celulares, por ejemplo, desde el citosol a las mitocondrias. Por consiguiente, si se cambia la renovación de proteínas, es decir, se impide o se ralentiza la degradación de proteínas, o se inhibe o ralentiza el transporte de la proteína desde el citosol a otro compartimento celular, la proteína se acumulará en el citosol de la célula.
Sorprendentemente, los inventores descubrieron que la estabilización/modificación de la proteína APOBEC4 por modificación del extremo N, entre otras cosas, por adición de una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, el marcador V5, el marcador c-myc o el marcador HA, y la expresión de dicha proteína en una célula que produce un retrovirus o partículas virales del mismo, conduce a un aumento de la producción de retrovirus o partículas virales por dicha célula en comparación con la expresión de APOBEC4 no modificada dentro de esa célula. La cantidad de virus que se detectaron por ensayos de transcriptasa inversa o transferencia de western aproximadamente en los 2 días posteriores a la cotransfección en el sobrenadante de las células mostró un aumento de 5-10 veces.
Otro aspecto de la presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que la modificación del extremo C de la proteína APOBEC4, entre otras cosas, por adición de al menos un marcador V5, marcador c-myc o marcador HA, y la posterior expresión de dicha proteína APOBEC4 modificada conduce a una producción reducida drásticamente (hasta un 95% o más) de retrovirus o partículas virales del mismo por dicha célula. Además, este efecto antiviral-viral se correlaciona directamente con la cantidad de ADN plasmídico que codifica la proteína APOBEC4 modificada usada para la cotransfección y, por lo tanto, con la proteína APOBEC4 modificada expresada por la célula. Este efecto antiviral de correlación de la presente invención puede explicarse por la competición de la APOBEC4 modificada expresada con la APOBEC4 endógena por el factor X. La proteína APOBEC4 modificada en el extremo C se unirá al factor X, pero no podrá unirse al factor Y para formar una APOBEC4 funcional complejada con factor X y factor Y que se necesita por el virus para la replicación. Por consiguiente, como la APOBEC4 modificada compite por el factor X, estará disponible menos de dicho factor X para la APOBEC4 endógena y, por lo tanto, se formará menos complejo de APOBEC4 funcional, conduciendo a la reducción observada de la producción de virus por la célula, es decir, el efecto antiviral.
Proteínas APOBEC4 y Construcciones
Se desvela que existen proteínas APOBEC4 de diversas especies, mamíferos y seres humanos. La presente invención hace uso de APOBEC4 humana. Las proteínas APOBEC4 preferidas incluidas por la invención son proteínas APOBEC4 modificadas de acuerdo con las enseñanzas desveladas en la presente memoria.
En general, la presente invención incluye proteínas APOBEC4 modificadas que están estabilizadas, preferentemente, por modificación de, por ejemplo, el extremo N, entre otras cosas, por adición de una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, el marcador V5, el marcador c-myc o, preferentemente, el marcador HA. Además, también se mencionan explícitamente como secuencias de aminoácidos que pueden usarse para modificar la proteína APOBEC4 de acuerdo con la presente invención secuencias de aminoácidos que son homólogas al marcador V5, el marcador c-myc o, preferentemente, el marcador HA, preferentemente al menos un 90% idénticas a las mismas. Además, se desvelan proteínas APOBEC4 que están modificadas para inhibir o reducir la unión de al menos un factor necesario para formar el complejo de APOBEC4 que se recluta durante la replicación viral. El experto en la materia conoce una multitud de medios para modificar una proteína para inhibir o reducir la unión de factores a la misma. Las proteínas APOBEC4 preferidas de la invención incluyen proteínas APOBEC4 modificadas en el extremo C por la adición de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el marcador V5, el marcador c-myc y el marcador HA o una secuencia de aminoácidos homóloga a los mismos. Además, también se mencionan explícitamente como secuencias de aminoácidos que pueden usarse para modificar la proteína APOBEC4 de acuerdo con la presente invención, secuencias de aminoácidos que son homólogas al marcador V5, al marcador c-myc o, preferentemente, al marcador HA, preferentemente al menos un 90% idénticas a los mismos. También se desvelan proteínas APOBEC4 que están mutadas dentro del domino de dedo de cinc, preferentemente por sustituciones de aminoácidos E95A, C127A y C134A. Las proteínas APOBEC4 modificadas más preferidas de la presente invención son HA-APOBEC4, APOBEC4-HA, APOBEC-3xHA. También se desvela APOBEC4 completa que carece de la cola de polilisina.
También se incluyen ácidos nucleicos que codifican las proteínas APOBEC4 de la presente invención, por ejemplo plásmidos construidos para la expresión de dichas proteínas. Además, también se incluyen todas las proteínas y ácidos nucleicos homólogos a la proteína APOBEC4 o a los ácidos nucleicos de la presente invención. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos de la proteína homóloga o la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico homólogo es al menos un 90%, 95%, 97%, 99% o 99,5% idéntica a las proteínas APOBEC4 o los ácidos nucleicos de la presente invención.
Dada la hipótesis de trabajo indicada anteriormente, evidentemente el experto en la materia puede obtener una multitud de proteínas APOBEC4 modificadas adicionales y homólogos funcionales de las mismas. También se desvela KRR1 (número de acceso del GeneBank NP_008974), la proteína 2 de unión a rev de VIH-1 humano que comprende de forma similar una cola de polilisina. De esta manera, también se desvela KRR1-HA, HA-KRR1, KRR1-3xHA y KRR1 con una cola de polilisina truncada o mutada. Además, se desvela que la cola de polilisina de la propia APOBEC4, en forma no modificada o que comprende sustituciones de aminoácidos, puede competir por al menos uno de los factores necesarios para formar un complejo de APOBEC4 funcional reclutado durante la reproducción viral.
Células
Aunque la presente invención se ha descrito de forma ejemplar y estudiado en células 293T y células HeLa, se contempla que pueden usarse otras células de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. Preferentemente, las células usadas de acuerdo con la presente invención son células humanas, macrófagos, linfocitos T, células madre, células antólogas, así como células progenitoras o líneas celulares de las mismas. Más preferentemente, las células son células 293T o células HeLa.
Usos Médicos y Composiciones Farmacéuticas
Las construcciones de la presente invención pueden usarse directamente en una diversidad de aplicaciones médicas o para la fabricación de medicamentos.
En un aspecto de la invención, las proteínas APOBEC4 estabilizadas/modificadas en el extremo N de la invención pueden expresarse en una célula que produce un retrovirus o partículas virales del mismo y usarse para aumentar la producción de retrovirus o partículas virales por dicha célula. Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para aumentar la producción de retrovirus, entre otros, VIH, VIS, VIF, VAIE, VLM, VIH-1, VIH-2, VISagm, VISmac, espumavirus o partículas virales de los mismos en una célula que posteriormente puede aislarse y usarse para la vacunación contra dicha retrovirus.
En otra realización, la presente invención puede usarse para terapia génica, entre otras cosa, para tratar, inhibir o reducir la producción de un retrovirus en un mamífero. En una realización, los virus o partículas virales de la presente invención, o preparaciones farmacéuticas de los mismos, pueden administrarse a un mamífero, preferentemente un ser humano o un caballo. Si los virus o partículas virales presentan el mismo tropismo que el retrovirus que se va a tratar, entonces se producirá la infección selectiva de las células del mamífero que son células diana del retrovirus a tratar por los virus o partículas virales de la presente invención. Tras la entrada en la célula, los virus o partículas virales de la invención expresan la proteína APOBEC4 modificada en el extremo C, lo cual posteriormente conduce a una reducción en la producción viral a partir de dicha célula. Como ejemplo, si se va a tratar VIH-1, al mamífero se le administran virus derivados de VIH-1 y que comprenden la información genética de una proteína APOBEC4 modificada en el extremo C, preferentemente APOBEC4-3xHA. Cuando los virus administrados proceden de VIH-1, presentan el mismo tropismo que un virus VIH-1 y, por consiguiente, infectarán a los mismos tipos celulares, por ejemplo, linfocitos T. Las células infectadas ahora expresarán la proteína APOBEC4 modificada en el extremo C, lo cual reducirá la producción de VIH-1. Es evidente para el experto en la materia que de esta manera pueden tratarse infecciones con cualquier otro retrovirus, incluyendo VIH, VIS, VIF, VAIE, VLM, VIH1, VIH-2, espumavirus, VISagm y VISmac.
Se desvela que los virus o partículas virales de la presente invención que llevan la información genética de la proteína APOBEC4 modificada en el extremo C de acuerdo con la presente invención pueden usarse para transducir células diana retrovirales ex vivo y después se puede reintroducir estas células en el mamífero a tratar. En el caso del VIH, las células diana preferentemente son linfocitos T auxiliares y/o macrófagos o sus células progenitoras.
Se desvela que la construcción de transferencia que puede transducirse al interior de las células diana del retrovirus por medio de los virus o partículas virales de la presente invención codifica ARNhc/ip que se dirige a la APOBEC4 endógena y codifica adicionalmente una APOBEC4 terapéutica de codones optimizados, por ejemplo, APOBEC3xHA o APOBEC-HA, que no se ve afectada por las moléculas de ARNhc/ip. La construcción de transferencia codifica un anticuerpo que se dirige a la APOBEC4 endógena y puede codificar o no una proteína APOBEC4 terapéutica modificada, que no se ve afectada por los anticuerpos.
Pueden formularse composiciones farmacéuticas basadas en las construcciones de la presente invención de cualquier manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. De esta manera, los virus o partículas virales, ácidos nucleicos, proteína y compuestos que inhiben la transcripción y/o expresión de APOBEC4 o el funcionamiento apropiado de APOBEC4 de la presente invención pueden formularse por administración, por ejemplo, por inyección, inhalación o aislamiento (a través de la boca o la nariz) o por administración oral, bucal, parenteral o rectal.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse para una diversidad de modos de administración, incluyendo la administración sistémica, tópica o localizada. Pueden encontrarse técnicas y formulaciones, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. Para la administración sistémica, se prefiere la inyección, incluyendo la inyección intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para la inyección, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse en soluciones líquidas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank o solución de Ringer. Además, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en forma sólida y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes del uso. También son adecuadas formas liofilizadas de la composición farmacéutica.
Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido cálcico); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o almidón glicolato sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sódico). Los comprimidos también pueden revestirse por procedimientos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para reconstituirse con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tampón, agentes saporíferos, colorantes y edulcorantes cuando sea apropiado.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección en embolada o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o recipientes multidosis, con un conservante añadido opcionalmente. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse adicionalmente como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener otros agentes que incluyen agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Además, las composiciones farmacéuticas pueden formularse también como una preparación de depósito. Estas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. De esta manera, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como una sal moderadamente soluble. Otros sistemas de liberación adecuados incluyen microesferas, que ofrecen la posibilidad de una liberación local no invasiva de fármacos durante un periodo de tiempo prolongado. Esta tecnología puede incluir microesferas que tienen un tamaño precapilar, que pueden inyectarse a través de un catéter coronario en cualquier parte seleccionada de un órgano sin producir inflamación o isquemia. El agente terapéutico administrado después se libera lentamente desde las microesferas y se absorbe por las células circundantes presentes en el tejido seleccionado.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a atravesar. Dichos penetrantes se conocen generalmente en a técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, sales biliares y derivados de ácido fusídico. Además, pueden usarse detergentes para la facilitar la infiltración. La administración transmucosa puede realizarse usando pulverizaciones nasales o supositorios.
Ensayos de Selección de Compuestos Antivirales
El papel clave que juega APOBEC4 en la reproducción retroviral hace que sea una diana importante para los fármacos antirretrovirales. De esta manera, APOBEC4 puede usarse en un ensayo para seleccionar compuestos que inhiban la transcripción y/o expresión de APOBEC4, y/o la función de APOBEC4 en la reproducción retroviral.
Como se descubrió que APOBEC4 endógena se expresa en, entre otras, células 293T o células HeLa, dichas células podrían usarse en un ensayo de alto rendimiento para seleccionar compuestos que inhiban la transcripción y/o expresión de APOBEC4. Es evidente para el experto en la materia que también podrían usarse en dicho ensayo células o líneas celulares que expresen APOBEC4 endógena.
En una realización de la invención, el procedimiento para seleccionar compuestos antivirales comprende las etapas de poner en contacto una célula que expresa una proteína APOBEC4 humana con un compuesto de ensayo y determinar si el compuesto de ensayo afecta a la transcripción y/o expresión de APOBEC4 en dicha célula, en el que una reducción en la transcripción y/ expresión de APOBEC4 indica que el compuesto de ensayo es un compuesto antiviral. En una realización preferida, la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de una primera célula en presencia del compuesto de ensayo se compara con la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de una segunda célula que no ha estado en contacto con el compuesto de ensayo, en el que una reducción en la transcripción y/o expresión de APOBEC4 en la primera célula indica que el compuesto de ensayo es un posible compuesto antiviral. Preferentemente, las células usadas en el procedimiento de selección son células humanas, macrófagos, células T, células madre, células autólogas así como células progenitoras o líneas celulares de las mismas. Más preferentemente las células son células 293T o células HeLa. Preferentemente, la transcripción y/o expresión de APOBEC4 se determina por RT-PCR, transferencia de Northern y transferencia de Western, respectivamente.
En una realización adicional, la invención se refiere a un procedimiento de selección para seleccionar compuestos antivirales. Inicialmente pueden seleccionarse compuestos candidatos o diseñarse químicamente basándose en su unión predicha o determinada a la proteína APOBEC4. La unión predicha de un compuesto, por ejemplo, una proteína, a APOBEC4, puede calcularse usando algoritmos de acoplamiento conocidos por el experto en la materia que producen muchas estructuras posibles de un complejo proteína-proteína proteína-compuesto y, en la mayoría de los casos, alguno de ellos imitan la estructura correcta dentro de un valor de r.m.s.d. (desviación cuadrática media) de <3A. Puede usarse el análisis de unión BIOCOR para medir la unión de un compuesto dado a APOBEC4. Después se infectan células 293T con un retrovirus y se determina el título del retrovirus en presencia y ausencia de uno o más de los compuestos candidatos seleccionados. Una reducción en el título indica que el compuesto candidato interfiere con el ensamblaje del retrovirus por interacción con la proteína APOBEC4 y, por lo tanto, es un posible fármaco antirretroviral.
Como ejemplo adicional, se usan moléculas de ARNip o ARNhc dirigidas contra el ARNm de APOBEC4 como compuestos de ensayo antirretrovirales. Es de esperar que el silenciamiento (knock-down) de APOBEC4 por dichas moléculas de ARNip o ARNhc reduzca en gran medida la liberación de virus por la célula infectada. Por lo tanto, pueden usarse moléculas de ARNip o ARNhc como fármacos antirretrovirales.
Ejemplos
Generación de Plásmidos
Para la expresión de APOBEC4 y APOBEC4 modificada se generaron plásmidos por PCR, partiendo del ADNc de APOBEC4 (número de acceso del GeneBank NM_203454) de células germinales humanas. La proteína APOBEC4 no modificada y la proteína de fusión de APOBEC4 modificada que comprendía una adición N-terminal de un marcador se expresaron a partir del plásmido pcDNA3.1/Zeo(+) (Invitrogen). La proteína de fusión de APOBEC4 modificada que comprendía una adición C-terminal de un marcador se expresó a partir del plásmido pMHC3xHA.
Para ilustrar con un ejemplo, se usaron los siguientes cebadores para la generación de phA4-3xHA (SEC ID Nº: 1 y 2), un plásmido de expresión basado en el plásmido pMHC3xHA y que expresaba la proteína APOBEC4 humana modificada con tres marcadores HA fusionados al extremo C: cebador 5’; cag gcg gta cca gcc tgg aga caa att gat gg (SEC ID Nº: 7), cebador 3’: gac ttg gat ccc ctt tct tcc ctt tct tct tct tct ttt cat ctg cct cct tgc tac (SEC ID Nº: 8).
Para la generación del plásmido de expresión pHA-hA4_cDNA3.1Zeo(+) (SEC ID Nº:3 y 4), basado en el plásmido pcDNA3.1/Zeo(+) y que expresa la proteína APOBEC4 modificada con un marcador HA fusionado al extremo N, se usaron los siguientes cebadores: cebador 5’: cgg atc cct agc aat ggg ata tcc ata cga tgt tcc aga tta cgc tga gcc cat ata tga gga gta cc (SEC ID Nº: 9), cebador 3’: gaa ttc ttt att tct tcc ctt tct tct tct tc (SEC ID Nº: 10).
Para la generación del plásmido de expresión phA4_cDNA3.1Zeo(+) (SEC ID Nº: 5 y 6), de forma similar basado en el plásmido pcDNA3.1/Zeo(+) y que expresa la proteína APOBEC4 humana, se usaron los siguientes cebadores: cebador 5’ cgg atc cct agc aat gga gcc cat ata tg (SEC ID Nº: 11), cebador 3’ gaa ttc ttt att tct tcc ctt tct tct tct tc (SEC ID Nº: 12).
Los amplicones generados se clonaron en los vectores plasmídicos respectivos usando las enzimas de restricción BamHI y EcoRI. Las Figuras 2A-C muestran mapas plasmídicos de los tres vectores de expresión ilustrados en los ejemplos phA4-3xHA, pHAhA4_cDNA3.1Zeo(+) y phA4_cDNA3.1Zeo(+), respectivamente.
El experto en la materia sabrá cómo generar diferentes vectores de expresión que comprenden, entre otras cosas, diferentes marcadores, por ejemplo, el marcador V5 o c-myc, un número diferente de marcadores o cómo introducir un número diferente de marcadores o cómo introducir mutaciones en el gen APOBEC4 para, por ejemplo, truncar o delecionar completamente la cola de poli-lisina C-terminal, o insertar mutaciones al dominio de dedo de cinc.
Cultivo Celular
A continuación se ilustra un ejemplo de un cultivo celular de células 293T. Las enseñanzas de la presente invención, consideran e incluyen el uso de diferentes células.
Se cultivaron células 293T adherentes en DMEM (GIBCO/BRL). Para el pase de las células, las células se separaron usando una solución de EDTA 1 mM/PBS y se transfirieron a medio limpio (1:10) dos veces por semana. Las células se lavaron usando PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, NaH2PO4 4,3 mM, K H2PO4 1,4 mM). Todos los medios de cultivo se complementaron con suero bovino fetal al 10% (FCS, Biochrom KG), L-glutamina 2 mM (Biochrom KG) y antibióticos (100 U/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina [Biochrom KG]). El FCS se incubó durante 30 minutos a 46 ºC para la inactivación de los componentes del sistema de complemento. El cultivo de las células se realizó en un incubador de células (BBD 6220, Heraeus) a 37 ºC y con CO2 al 5%.
Transfección y Producción de Sobrenadante de Cultivo de Células Virales
Un día antes de la transfección, se sembraron 0,8 x 106 células 293T por pocillo de la placa de cultivo celular. Para la transfección, se uso LipofectamineLTX (Invitrogen) en una relación 2:1 (!l de LipofectamineLTX : !g ADN plasmídico) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Para la producción del sobrenadante de cultivo de células virales, las células se co-transfectaron con 1 !g ADN plasmídico de un genoma proviral, si era necesario 0,5 !g de vector de expresión pMD.G (que expresa la proteína VSV-G) y 0-3 !g del plásmido de APOBEC4 respectivo. Si era necesario, se añadía plásmido pCDNA3.1 para mantener la cantidad total de ADN añadida en 45 !g. La recogida del sobrenadante viral se realizó 48 después de la transfección. Los residuos celulares contenidos en los sobrenadantes se retiraron por filtración usando filtros con un tamaño de poro de 45 !m (Sartorius). El filtrado se almacenó a -80 ºC.
Ensayo de Virus Indicador de Luciferasa
Los virus indicadores permiten un análisis rápido y cuantitativo de las interacciones de los componentes celulares y virales así como de los factores antivirales. Para estudiar la influencia de APOBEC4 sobre la interacción virushuésped, se empleó el virus indicador seudotipificado de VSV-G NC-luc R-E. NC-luc R-E procede de la variante de VIH-1 NL4-3 y se caracteriza por una deleción de los genes env y net. Además, NL-luc R-E lleva el gen indicador de luciferasa de Photinus pyralis.
Se transfectaron células 293T con una cantidad igual de los diferentes plásmidos. 48 horas después de la transfección y la producción de virus/partículas virales con o sin la APOBEC4 (modificada) de la presente invención, se recogieron virus/partículas virales y se analizaron los lisados celulares (de aproximadamente 2 x 104 células) con respecto a la expresión de luciferasa usando el Kit Stadylite HTS (Perkin Elmer) y de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida Desnaturalizante (SDS-PAGE) y Transferencia de Western
Para la lisis celular se lavaron células 293T en 1 ml de PBS después de recoger los virus/partículas virales, se separaron usando PBS/EDTA, se sedimentaron (250 rpm, 5 min a TA) y se realizó la lisis durante una incubación de 5 minutos en hielo después de la adición de tampón de lisis RIPA (TRIS 25 mM, pH 8, NaCl 137 mM, glicerina al 1%, SDS al 0,1 %, Na-desoxicolato al 0,5% y NaPO4 al 1 %). Después de una etapa de centrifugación de 10 minutos a
14.000 rpm y 4 ºC, se realizó la concentración de la proteína del sobrenadante de acuerdo con Bradford: se añadieron 5 !l del sobrenadante a 1.000 !l de reactivo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, USA) y se midió la absorción a 595 nm usando un espectrómetro (Gene Quant II, RNA/DNA-Calculator, Pharmacia Biotech).
Para la SDS-PAGE y transferencia de Western el lisado celular correspondiente a 30 !g de proteína total se cargó en geles con gradiente de NuPAGE (4-12%; Invitrogen) y se realizó una electroforesis de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La membrana de PVDF (Invitrogen) se incubó con solución de bloqueo (PBS, leche en polvo al 5%, Tween 20 al 0,5% [Roth]) durante 1 hora o durante una noche a 4 ºC para prevenir una unión inespecífica del anticuerpo primario. Como anticuerpos primarios, se usaron anti-HA de ratón (1:5.000 en solución de bloqueo MMS-101 P, Covance), anti-aTubulina de ratón (1:10000, B5-1-2, Sigma) o antip24 de ratón (1:800, 183H12-5C). El siguiente reactivo se obtuvo a través de NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 p24 Monoclonal Antibody (183-H12-5C) del Dr. Bruce Chesebro and Kathy Wehrly). Como anticuerpo secundario, se usó un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:7500 GE Healthcare). Antes y después de cada periodo de incubación, la membrana se lavó primero con solución de lavado 1 (PBS, Tween20 al 0,5%) dos veces y posteriormente se incubó en solución de lavado 2 (PBS, Tween20 al 0,1%) durante 25 minutos. Como sustrato se usó Lumigen PS-3 Acridan (ECL plus Western Blotting Detection System, GE Healthcare), cuya conversión enzimática conduce a emisión de luz. La detección de la emisión de luz se realizó usando Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare) en solución de desarrollo (Curix 60, Agfa).
Ejemplo 1: Modulación de la Producción de Virus VIH-1 NL4-3 por la Expresión de APOBEC4
A continuación se usan células 293T como tipo celular ejemplar y se usa VIH-1 como virus ejemplar.
Se co-transfectaron células 293T como se han descrito anteriormente con un vector de expresión que comprendía la secuencia de ácido nucleico proviral de la variante de VIH-1 NL4-3 y vectores de expresión que codifican la proteína APOBEC4 humana no modificada, así como proteínas APOBEC4 humanas modificadas HA-APOBEC4, APOBEC-HA and APOBEC4-3xHA, respectivamente. Posteriormente, se determinó la producción de virus en el sobrenadante viral (V) y lisados celulares (C), respectivamente, en un ensayo de transcriptasa inversa (RT-PCR; no mostrado) y transferencia de western. Específicamente, se evaluó la expresión del antígeno p24 de VIH, el marcador HA y la tubulina.
La Figura 3 muestra los resultados de la transferencia de western. La co-transfección de las células con VIH-1 NL4-3 y el plásmido de expresión que codifica la proteína APOBEC4 no modificada conducen a un aumento en la producción viral tanto en el sobrenadante viral (V) como en los lisados celulares (C) que está correlacionado de forma directa y lineal con la cantidad de plásmido de APOBEC4 usado durante la co-transfección (Fig. 3, panel central).
La co-transfección con el plásmido de expresión que codificaba la proteína HA-APOBEC4 conduce a un mayor aumento en la producción viral tanto en el sobrenadante viral como en los lisados celulares en comparación con la co-transfección con la proteína APOBEC4 no modificada. La producción viral que dio como resultado la cotransfección con el plásmido de expresión HA-APOBEC4 aumentó de 5 a 10 veces en comparación con la de la cotransfección con el plásmido de expresión APOBEC4. De forma similar, la cantidad de virus producidos se correlacionaba directa y linealmente con la cantidad de plásmido HA-APOBEC4 usado durante la co-transfección (Fig. 3, panel inferior).
La co-transfección con el plásmido de expresión que codificaba la proteína APOBEC4-3xHA condujo a una drástica reducción (hasta el 95%) en la producción viral tanto en el sobrenadante viral como los lisados celulares en comparación con la co-transfección con la proteína APOBEC4 no modificada. De forma similar, el grado de inhibición de la producción de virus se correlacionaba directa y linealmente con la cantidad de plásmido de APOBEC4-3xHA usado durante la co-transfección (Fig. 3, panel superior). Se obtuvieron resultados similares usando un plásmido de expresión que codificaba APOBEC4-HA (no mostrado).
Conjuntamente, los resultados indican que se recluta un complejo de APOBEC4 por la célula infectada con virus durante la producción de virus. Si está presente proteína APOBEC4 adicional, se aumenta la producción de virus. La expresión de una proteína APOBEC4 modificada que se estabiliza por modificación del extremo N, entre otros, por adición de una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, el marcador HA, conduce a una mayor cantidad de complejos de APOBEC4 en la célula y por lo tanto a una mayor producción del virus por dicha célula. La expresión de una proteína APOBEC4 modificada cuya unión a la cola de poli-lisina C-terminal se reduce o se inhibe, entre otras cosas, por modificación del extremo C, por ejemplo, por adición de una secuencia de aminoácidos como marcador HA o tres marcadores HA, conduce a una menor cantidad de complejo de APOBEC4 en la célula y por lo tanto una menor producción del virus por dicha célula.
Además, como es evidente por los resultados, por ejemplo, de la transferencia de western, los efectos pro-y antivirales, respectivamente de acuerdo con la presente invención se correlacionan directamente con la cantidad de vector de expresión de APOBEC4 usado para la transfección. En otras palabras, la relación entre el vector de expresión que codifica el genoma proviral y el vector plasmídico que codifica la proteína APOBEC4 (modificada) determina el nivel de aumento o reducción de virus por la célula transfectada. Como la cantidad de ADN que puede transfectarse a una célula está limitada debido a la citotoxicidad del reactivo de transfección, se generaron líneas celulares que expresaban de forma estable la proteína APOBEC4 (modificada) y posteriormente se transfectaron con vectores de expresión que codificaban diversos genomas provirales. En dichas líneas celulares, claramente se aumentaron los efectos pro-y antivirales de la presente invención.
Ejemplo 2: Modulación de la Producción de Virus VIH-1 NL-luc R-E por la Expresión de APOBEC4
Se repitieron los experimentos del Ejemplo 1 usando el derivado de VIH-1 NL4-3 NL-luc R-E-, seudotipificado con la proteína VSV-G.
La Figura 4 muestra los resultados de la transferencia de western que confirman los descubrimientos del Ejemplo 1. La co-transfección de las células con un plásmido de expresión que codifica el virus indicado y el plásmido de expresión que codifica la proteína APOBEC4 no modificada conduce a un aumento en la producción viral tanto en el sobrenadante viral como en la célula (Fig. 4, panel central); la co-transfección con el plásmido de expresión que codifica la proteína HA-APOBEC4 conduce a un aumento mayor en la producción viral (Fig. 4, panel inferior) y la cotransfección con el plásmido de expresión que codifica la proteína APOBEC4-3xHA conduce a una reducción drástica de la producción viral (Fig. 4, panel superior). De forma similar, el grado de aumento o reducción en la producción de virus se correlaciona directa y linealmente con la cantidad de plásmido de expresión de APOBEC4 usado durante la co-transfección. Se obtuvieron resultados similares usando un plásmido de expresión que codificaba APOBEC4-HA (no mostrado).
Conjuntamente, los resultados indican que los efectos pro-y antivirales desvelados por la presente invención no se restringen al genoma proviral de tipo silvestre sino que también son aplicables, por ejemplo, a virus seudotipificados.
Ejemplo 3: Ensayos con Virus Indicador
El virus indicador seudotipificado VSV-G NL-luc R-E-se empleó para verificar los resultados determinados por transferencia de western. Se transfectaron células 293T como se ha descrito anteriormente, se recogieron los virus y los lisados celulares de aproximadamente 2 x 104 células se analizaron con respecto a la expresión de luciferasa.
La Figura 5 muestra los resultados de los ensayos con virus indicador y demuestra que la expresión del gen indicador de luciferasa (en lugar del gen nef viral) depende de la expresión de APOBEC4 de la misma manera que la producción de virus depende de la expresión de APOBEC4. La co-transfección de las células con NL-luc R-E-y el plásmido de expresión que codifica la proteína APOBEC4 no modificada conduce a un aumento en la actividad luciferasa que se correlaciona directa y linealmente con la cantidad de plásmido APOBEC4 usado durante la cotransfección.
La co-transfección con el plásmido de expresión que codifica la proteína HA-APOBEC4 conduce a un mayor aumento en la actividad de luciferasa en comparación con la co-transfección con la proteína APOBEC4 no modificada. De forma similar, el aumento en la actividad luciferasa se correlaciona de forma directa y lineal con la cantidad de plásmido de HA-APOBEC4 usado durante la co-transfección.
La co-transfección con el plásmido de expresión que codifica la proteína APOBEC4-3xHA conduce a una reducción drástica en la actividad luciferasa en comparación con la co-transfección con la proteína APOBEC4 no modificada. De nuevo, el grado de reducción en la actividad luciferasa se correlaciona de forma directa y lineal con la cantidad de plásmido de APOBEC4-3HA usado durante la co-transfección. Se obtuvieron resultados similares usando un plásmido de expresión que codificaba APOBEC4-HA no mostrado.
Conjuntamente estos resultados demuestran que los ensayos de virus indicador de la presente invención permiten una lisis rápida y cuantitativa de interacciones de los componentes celulares y virales así como de factores antivirales. Además, los resultados demuestran que los efectos pro-y antivirales de la presente invención también son aplicables para virus que están modificados genéticamente, por ejemplo, para llevar un gen heterólogo.
Ejemplo 4: Modulación de la Producción de Diferentes Cepas de Virus por la Expresión de APOBEC4
Se repitieron los experimentos de los Ejemplos anteriores usando un genoma de virus truncado que codificaba sólo las proteínas y enzimas estructurales (Gag, Pol). Además, se ensayaron VISagm, VISmac y VLM como cepas de virus diferentes adicionales.
Para todos los virus ensayados, pudieron verificarse los resultados de los Ejemplos anteriores. En cada caso, la cotransfección de las células con un plásmido de expresión que codifica el genoma proviral y el plásmido de expresión que codifica la proteína APOBEC4 no modificada conduce a un aumento en la producción viral tanto en el sobrenadante viral como en la célula; la co-transfección con el plásmido de expresión que codifica la proteína HA-APOBEC4 conduce a un mayor aumento en la producción viral y la co-transfección con el plásmido de expresión que codifica la proteína APOBEC4-3xHA o APOBEC3-HA conduce a una reducción drástica en la producción viral. En cada caso, el grado de aumento o reducción en la producción de virus se correlaciona de forma directa y lineal con la cantidad de plásmido de expresión de APOBEC4 usado durante la co-transfección.
Conjuntamente los resultados indican que los efectos pro-y antivirales que desvela la presente invención no se restringen al virus VIH-1, sino que también son aplicables, por ejemplo, a virus VIH truncados y/o a diversos retrovirus o lentivirus distintos. Por lo tanto, la presente invención proporciona medios para aumentar o reducir, es decir, modular la producción de retrovirus y lentivirus o partículas de los mismos.
Ejemplo 5: APOBEC4 como Diana de Fármacos Antirretrovirales
Se ponen en contacto células 293T o HeLa con un compuesto candidato y la cantidad de transcrito de APOBEC4 y/o de proteína APOBEC4 se determina por RT-PCR, transferencia de Northern y transferencia de western respectivamente. Una reducción del transcrito de APOBEC4 y/o de proteína APOBEC4 en presencia del compuesto candidato en comparación con la ausencia del compuesto candidato indica que el compuesto candidato es un posible inhibidor de la transcripción y/o expresión de APOBEC4 y por lo tanto un posible fármaco antirretroviral.
En otro ensayo, se ponen en contacto células 293T o HeLa infectadas con un retrovirus con uno o más compuestos de ensayo, por ejemplo, moléculas de ARNip o ARNhc dirigidas contra el ARNm de APOBEC4, y se determina el título del retrovirus en presencia y ausencia de un compuesto de ensayo. Una reducción en el título indica que el compuesto de ensayo interfiere con el ensamblaje del retrovirus por interacción con la proteína APOBEC4 y, por lo tanto, es un posible fármaco antirretroviral.
Referencias
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Bundesrepublik Deutschland, letztvertreten durch den Präsidenten des Paul-Ehrlich-Instituts Prof. Dr. Johannes Löwer
<120> Modulación de la producción de retrovirus por APOBEC4
<130> 141-003
<160> 12
<170> PatentIn versión 3.4
<210> 1
<211> 5255
<212> ADN
<213> Plásmido phA-3xHA
<220>
<221> promotor
<222> (3)..(591)
<223> CMV
<220>
<221> CDS
<222> (702)..(1919)
<223> hAPOBEC4-3xHA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1827)..(1853)
<223> HA1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1857)..(1883)
<223> HA2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1887)..(1913)
<223> HA3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1917)..(1919)
<223> STOP
<220>
<221> polyA_signal
<222> (2076)..(2126)
<223> poli A de SV40
<220>
<221> misc_feature
<222> (3153)..(3947)
<223> Kan/Neo r
<400> 1
<210> 2
<211> 405
<212> PRT
<213> Plásmido phA-3xHA
<400> 2
<210> 3
<211> 6138
<212> ADN
<213> Plásmido pHA-hA4-cDNA3.1Zeo(+)
<220>
<221> promotor
<222> (232)..(819)
<223> promotor de CMV
<220>
<221> primer_bind
<222> (769)..(789)
<223> cebador directo de CMV
<220>
<221> primer_bind
<222> (863)..(882)
<223> cebador de T7
<220>
<221> promotor
<222> (863)..(879)
<223> promotor de T7
<220>
<221> CDS
<222> (941)..(2074)
<223> HA-hA4
<220>
<221> misc_feature
<222> (947)..(973)
<223> marcador HA
<220>
<221> primer_bind
<222> (2145)..(2162)
<223> Cebador inverso de BGH
<220>
<221> polyA_signal
<222> (2151)..(2375)
<223> pA de BGH
<220>
<221> rep_origin
<222> (2421)..(2849)
<223> origen de f1
<220>
<221> promotor
<222> (2854)..(3224)
<223> promotor temprano de SV40
<220>
<221> promotor
<222> (3239)..(3306)
<223> promotor de EM7
<220>
<221> misc_feature
<222> (3307)..(3681)
<223> Zeo(R)
<220>
<221> rep_origin
<222> (4324)..(4997)
<223> origen de pUC
<220>
<221> misc_feature
<222> (5142)..(6002)
<223> Amp(R)
<220>
<221> promotor
<222> (6003)..(6101)
<223> promotor de bla
<400> 3
<210> 4
<211> 377
<212> PRT
<213> Plásmido pHA-hA4-cDNA3.1Zeo(+)
<220>
<223> Plásmido pHA-hA4-cDNA3.1Zeo(+)
<400> 4
<210> 5
<211> 6108
<212> ADN
<213> Plásmido phA4-cDNA3.1Zeo(+)
<220>
<221> promotor
<222> (232)..(819)
<223> promotor de CMV
<220>
<221> primer_bind
<222> (769)..(789)
<223> cebador directo de CMV
<220>
<221> primer_bind
<222> (863)..(882)
<223> cebador de T7
<220>
<221> promotor
<222> (863)..(879)
<223> promotor de T7
<220>
<221> CDS
<222> (941)..(2044)
<223> hA4
<220>
<221> primer_bind
<222> (2115)..(2132)
<223> cebador inverso de BGH
<220>
<221> polyA_site
<222> (2121)..(2345)
<223> pA de BGH
<220>
<221> rep_origin
<222> (2391)..(2819)
<223> origen de f1
<220>
<221> promotor
<222> (2824)..(3194)
<223> promotor temprano de SV40
<220>
<221> promotor
<222> (3209)..(3276)
<223> Promotor de EM7
<220>
<221> misc_feature
<222> (3277)..(3651)
<223> Zeo(R)
<220>
<221> polyA_signal
<222> (3781)..(3911)
<223> pA de SV40
<220>
<221> rep_origin
<222> (4294)..(4967)
<223> origen de pUC
<220>
<221> misc_feature
<222> (5112)..(5972)
<223> Amp(R)
<220>
<221> promotor
<222> (5973)..(6071)
<223> promotor de bla
<400> 5
<210> 6
<213> Plásmido phA4-cDNA3.1Zeo(+)
<220>
<223> Plásmido phA4-cDNA3.1Zeo(+)
<400> 6 10
<210> 7
<211> 32
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador directo
<400> 7
<210> 8
<211> 57
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador inverso
<400> 8
<210> 9
<211> 68
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador directo
<400> 9 <210> 10
<211> 32
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador inverso
<400> 10
<210> 11
<211> 29
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador directo
<400> 11
<210> 12
<211> 32
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador inverso

Claims (24)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una proteína APOBEC4 humana modificada caracterizada porque el extremo N está modificado para estabilizar la proteína APOBEC4 o el extremo C está modificado, en la que la modificación del extremo N comprende la adición de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el marcador V5, el marcador cmyc y el marcador HA o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma, y en la que la modificación del extremo C comprende la adición de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el marcador V5, el marcador c-myc y el marcador HA o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma.
  2. 2.
    La proteína APOBEC4 modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que al menos una secuencia de aminoácidos añadida al extremo N es un marcador HA o una secuencia al menos un 90% idéntica a la misma.
  3. 3.
    La proteína APOBEC4 modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que al menos una secuencia de aminoácidos añadida al extremo C es el marcador HA o 3 marcadores HA o una secuencia al menos un 90% idéntica a la misma.
  4. 4.
    Una célula que expresa la proteína APOBEC4 modificada de acuerdo con las reivindicaciones 1-3.
  5. 5.
    La célula de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la célula produce además un retrovirus o partículas virales del mismo.
  6. 6.
    La célula de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el retrovirus es un lentivirus y/o es un virus deficiente en la replicación.
  7. 7.
    La célula de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el extremo N de la proteína APOBEC4 está modificado para estabilizar la proteína APOBEC4.
  8. 8.
    La célula de acuerdo con las reivindicaciones 4-7, en la que la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula 293T, una célula HeLa, una célula T auxiliar y un macrófago.
  9. 9.
    Un ácido nucleico que codifica la proteína APOBEC4 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el complemento de la misma.
  10. 10.
    Un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9.
  11. 11.
    Un ácido nucleico o un vector para terapia génica somática que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el ácido nucleico que codifica APOBEC4 está unido operativamente a un promotor.
  12. 12.
    Una vacuna que comprende la célula de acuerdo con la reivindicación 7 y un vehículo farmacéutico aceptable.
  13. 13.
    Una partícula retroviral deficiente en la replicación que comprende el ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 10-11, en la que el ácido nucleico es un ARN.
  14. 14.
    La partícula retroviral de acuerdo con la reivindicación 13, en la que la partícula retroviral procede de VIH, VIH-1, VIH-2, VIS, VISagm, VISmac, espuma virus, VIF, VAIE o VLM.
  15. 15.
    Un procedimiento in vitro para reducir la producción de retrovirus o lentivirus o partículas virales de los mismos de una célula que produce un retrovirus, lentivirus o partículas de vector de los mismos, comprendiendo el procedimiento expresar una proteína APOBEC4 modificada de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 3 en dicha célula, en la que el extremo C de la proteína APOBEC4 está modificado.
  16. 16.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la producción de retrovirus o partículas virales de los mismos se reduce al menos un 20%.
  17. 17.
    Un procedimiento para producir partículas retrovirales, comprendiendo el procedimiento cultivar una célula de acuerdo con la reivindicación 7.
  18. 18.
    El uso de una célula de acuerdo con la reivindicación 7, del ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11 o de la partícula retroviral de acuerdo con las reivindicaciones 13-14 para la fabricación de un medicamento.
  19. 19.
    El uso de una célula de acuerdo con la reivindicación 7, del ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11 o de la partícula retroviral de acuerdo con las reivindicaciones 13-14 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o vacunación contra una infección por un retrovirus.
  20. 20.
    Un procedimiento para seleccionar compuestos antivirales, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    poner en contacto una célula que expresa una proteína APOBEC4 humana con un compuesto de ensayo; y determinar si el compuesto de ensayo afecta a la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de dicha célula, en el que una reducción en la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de dicha célula indica que el compuesto de ensayo es un compuesto antiviral.
  21. 21.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de una primera célula en presencia de un compuesto de ensayo se compara con la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de una segunda célula en ausencia de dicho compuesto de ensayo,
    en el que una reducción en la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de la primera célula en comparación con la 5 segunda célula indica que el compuesto de ensayo es un compuesto antiviral.
  22. 22.
    El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 20 ó 21, en el que la transcripción y/o expresión de APOBEC4 se determina por RT-PCR, transferencia de Northern y/o transferencia de western.
  23. 23.
    Un procedimiento para seleccionar compuestos antivirales, comprendiendo el procedimiento las etapas de
    poner en contacto una célula que expresa un retrovirus y una proteína APOBEC4 con un compuesto de ensayo; 10 y
    determinar el título del retrovirus en presencia y ausencia del compuesto de ensayo,
    en el que una reducción en el título indica que el compuesto de ensayo es un compuesto antiviral.
  24. 24. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20-23, en el que el compuesto de ensayo es una molécula de ARNip o ARNhc dirigida contra el ARNm de APOBEC4.
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