KR20020008178A - 억제적 알엔에이 분자 결정을 위한 생체 내에서의 선택 방법 - Google Patents
억제적 알엔에이 분자 결정을 위한 생체 내에서의 선택 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은ⅰ) 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 전사 생성물에 결합가능하고, 이의 분열에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 ; 상기 뉴클레오타이드 서열에 결합하는데 필요한 첫 번째 뉴클레오타이드 서열의 구역은 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 내에서 이형적임 ; 및 ⅱ) (a) mRNA 안정성 및/또는 번역에 필요한 서열에 실시가능하게 연결된 검출가능한 마커를 인코딩하는 코딩 구역 ; 및 (b) 코딩 구역과 mRNA 안정성 및/또는 번역에 필요한 적어도 하나 이상의 서열 사이에 위치한 세 번째 뉴클레오타이드 서열 ; 로 구성된 두 번째 뉴클레오타이드 서열 ; 상기 (a) 및 (b)는 숙주 세포 내에서 인접한 RNA 분자로서 (a) 및 (b)의 발현을 지시할 수 있는 조절적 서열에 실시가능하게 연결됨 ; 로 구성된 생체 내에서 이용하기에 적당한 선택 시스템을 제공한다.
Description
타겟 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 억제하는 억제적 RNA 분자의 사용에 많은 관심이 있다. 억제적 RNA 분자는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 전사 생성물에 결합가능하고, 이의 분열에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 예로 리보자임(ribozyme)(타겟 서열의 직접적인 분열을 가능하게 하는), 외생적 가이드(guide) 서열(EGSs) 및 안티-센스 또는 센스 RNA(다른 인자에 의해 분열을 유발할 수 있는)를 포함한다.
불행하게도 이러한 기술의 적용은 복잡한 mRNA의 두 번째 구조 때문에 어렴움에 봉착해있다. 현재 오픈되었거나 또는 모든 위치를 타겟함으로서 다른곳 보다 더 접근하기 쉬운 mRNA 내의 위치를 예측하는 것은 불가능하다.
이러한 오픈 지역을 검색하기 위해 사용된 접근 방법의 하나는 Southern(1997) 및 Milner(1997)에 의해 기술된 실험실 내에서의(in vitro) '올리고뉴클레오타이드 분석' 방법이다. 그러나 이러한 방법은 각각의 특정한 타겟 mRNA의 유일한 분석 수행시 시간이 소비된다. 더욱이 헤테로듀플렉스(heteroduplex)의 형성이 비-생리적 조건 하에서 수행된다. 이는 특히 mRNA가 5' 및 3' 말단 모두에 관련된 많은 단백질을 지닌다고 고려할 때 문제가 된다.
따라서 정상적인 생리적 환경 내에서의 오픈 mRNA 사이트를 발견하는 '생체 내에서의' 선택 방법을 이용하는 것이 유리하다. 더욱이 그 방법은 모든 RNA 분자가 각각의 시간에서 특정한 선택 방법에 의지하지 않고 이러한 방법으로 스캔(scan)될 수 있다는 점에서 일반적으로 유용하다.
발명의 요약
따라서 본 발명의 목적은 주어진 RNA 분자를 효과적으로 타겟하는 억제적 RNA 분자를 증명하기 위한 생체 내에서의 선택 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 타겟 서열 및 검출가능한 마커가 세포 내에서 인접한 RNA 분자로 발현되도록 검출가능한 마커에 실시가능하게 연결되는 타겟 서열을 발현하여 세포를 이용하여 생체 내에서 억제적 RNA 분자를 선택하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.
타겟 서열/검출가능한 마커 mRNA는 정상적인 5' 캡(cap) 및 3' 폴리(poly) A 꼬리를 포함할 것이다. 5' 캡 또는 3' 폴리 A 꼬리가 제거되면(예를 들어 억제적 RNA 분자에 의한 타겟 서열의 뒤따른 분열) mRNA는 불안정하게 되고 분해될 것이다. 이는 검출가능한 마커 유전자의 번역을 방지할 것이다.
예를 들어 검출가능한 마커가 프로드러그(prodrug)에서 세포독성적 화합물로 전환시킬 수 있는 효소일 경우 타겟 서열의 분열은 세포가 프로드러그에 둔감하게 할 것이다.
검출가능한 마커/타겟 유전자를 발현하는 세포는 많은 억제적 RNA 분자를 스크린하는데 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 발명자들은 이러한 세포를 다른 특이성 구역을 지닌 각각의 리보자임으로 리보자임-발현 벡터를 스크린하는데 사용하였다. 프로드러그에 저항성을 지닌 세포는 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 기술을 사용하여 결정될 수 있는 서열을 지닌 활성의 리보자임을 포함할 것이다.
따라서 본 발명은 :
(ⅰ) 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 전사 생성물에 결합가능하고, 이의 분열에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 ;
상기 뉴클레오타이드 서열에 결합하는데 필요한 첫 번째 뉴클레오타이드 서열의 구역은 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 내에서 이형적이고 ;
(ⅱ) (a) mRNA 안정성 및/또는 번역에 필요한 서열에 실시가능하게 연결된 검출가능한 마커를 인코딩하는 코딩 구역 ; 및
(b) 코딩 서열과 mRNA 안정성 및/또는 번역에 필요한 적어도 하나이상 의 서열 사이에 위치한 세 번째 뉴클레오타이드 서열 ;
로 구성된 두 번째 뉴클레오타이드 서열 ;
상기 (a) 및 (b)는 숙주 세포 내에서의 인접 RNA 분자로서 (a) 및 (b)를 직접적으로 발현 가능한 조절적 서열에 실시가능하게 연결됨 ;
로 구성된 생체 내에서의 이용에 적당한 선택 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 :
(ⅰ) 다수의 벡터, 각각의 벡터는
뉴클레오타이드 서열 또는 그의 전사 생성물에 결합가능하고, 이의 분열에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 다수의첫 번째 뉴클레오타이드 서열 ;
상기 뉴클레오타이드 서열에 결합하는데 필요한 첫 번째 뉴클레오타이드 서열의 구역은 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 내에서 이형적이고 ; 및
(ⅱ) (a) mRNA 안정성 및/또는 번역에 필요한 서열에 실시가능하게 연결된 검출가능한 마커를 인코딩하는 코딩 구역 ; 및
(b) 코딩 서열과 mRNA 안정성 및/또는 번역에 필요한 적어도 하나이상 의 서열 사이에 위치한 세 번째 뉴클레오타이드 서열 ;
로 구성된 두 번째 뉴클레오타이드 서열 ;
상기 (a) 및 (b)는 숙주 세포 내에서의 인접 RNA 분자로서 (a) 및 (b)를 직접적으로 발현 가능한 조절적 서열에 실시가능하게 연결되고,
상기 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 다수의 벡터 내에 또는 개별적인 벡터의 일부로서 존재함 ;
로 구성된 생체 내에서의 이용에 적당한 선택 방법을 제공한다.
바람직하게는 유전자 생성물은 리보자임, 안티-센스 리보핵산(ribonucleic acid) 및 외생적 가이드 서열로부터 선택된다.
바람직하게는 벡터는 바이러스 벡터, 더욱 바람직하게는 레트로바이러스 벡터이다.
바람직하게는 검출가능한 마커는 선택가능한 마커, 더욱 바람직하게는 프로드러그를 세포독성적 화합물로 전환가능한 효소이다. 특히 바람직한 실시태양에서 효소는 티미딘 키나제(thymidine kinase)이고, 프로드러그는 간시클로버(gancyclovir)이다.
본 발명은 각각의 바이러스 입자가 상기에 기술된 바와 같이 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 및/또는 두 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된 다수의 바이러스 입자를 더욱 제공한다.
또한 본 발명은 (ⅰ) 상기에 정의된 바와 같은 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 및 (ⅱ) 상기에 정의된 바와 같은 두 번째 뉴클레오타이드 서열을 생산자 세포 내로 도입시키는 것으로 구성된 방법으로, 상기에 정의된 바와 같이 다수의 바이러스 입자를 생성하기 위한 방법을 제공한다. 또한 이러한 방법에 의해 생성된 다수의 바이러스 입자가 제공된다.
또한, 본 발명은 상기에 기술된 바와 같이 세 번째 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 전사 생성물에 결합가능하고, 이의 분열에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열로부터 선택하기 위한 방법 ; 상기 방법은 :
(ⅰ) 상기에 기술된 바와 같이 두 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된 숙주세포 내로 하나 이상의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열을 도입시키고 ;
(ⅱ) 검출가능한 마커가 숙주 세포 내에서 활성적인 형태로 발현되지 않을 경우 숙주 세포를 선택하고 ; 선택적으로는
(ⅲ) 첫 번째 뉴클레오타이드 서열을 분리하고, 그의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는
것으로 구성된다.
바람직하게는 (ⅱ) 단계에서 검출가능한 마커는 선택가능한 마커이고, 숙주 세포는 선택가능한 마커의 존재시 세포독성적인 프로드러그와 같은 화합물에 접촉된다. 더욱 바람직하게는 선택가능한 마커는 티미딘 키나제이고 프로드러그는 간시노클로버이다.
바람직한 실시태양에서 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 내의 각각의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 검출가능한 마커를 인코딩하는 코딩 구역에 결합가능하고, 이의 분열에 영향을 미칠 수 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 어떠한 첫 번째 뉴클레오타이드 서열(들)도 제거될 수 있도록 검출가능한 마커의 불활성의 변형체를 인코딩하는 네 번째 뉴클레오타이드 서열의 하류에 위치한다.
본 발명의 특히 바람직한 관점에서 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 다수의 바이러스 벡터 내에 존재하고, 상기 바이러스 벡터는 검출가능한 마커의 불활성의 변형체를 인코딩하는 네 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성되고, 예비 단계에서와 같이 첫 번째 뉴클레오타이드 서열을 두 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된 생산자 세포 내로 도입하기 위해 다수의 벡터가 하나 이상의 생산자 세포 내로 도입되어 단계 (ⅰ)에서 사용된 감염성의 바이러스 입자를 유발한다.
또다른 관점에서 본 발명은 본 발명의 상기의 방법에 의해 수득된 첫 번째 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 이러한 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 치료에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 선택 시스템을 이용하여 mRNA 분자 상에서 오픈 사이트를 증명하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 생체 내에서의 최적의 억제적 RNA 분자를 선택하기 위한 방법에 관한 것이다.
도 1. 프로드러그 투약 반응 - 생존 백분율 대 프로드러그 농도의 그래프 : a. 대장균 질소환원효소(NTR)/메트로니다졸(metronidazole)(MTZ) 및 b. HSV-1 티미딘 키나제(TK)/간시클로버(GCV)
도 2. 방관자 효과 - 생존 백분율 대 프로드러그 농도의 그래프 : a. NTR/MTZ 및 b. TK/GCV
도 3은 pH4Z(tat-4Z)로 형질도입된 CTKtatSN, 촉매 활성이 제거된 안티-tat 리보자임(tat-RzM) 또는 안티-tat 리보자임(tat-Rz)로 구성된 HeLa 세포주의 % 생존의 막대 그래프를 나타낸 것이다. 세포는 GCV 또는 GCV 및 딜드린과 함께 인큐베이트되었다.
도 4는 벡터 게놈의 개략도를 나타낸 것이다.
도 5는 4개의 다른 HIV 벡터 내로 삽입된 리보자임을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 6은 PCR에 의한 적당한 3' LTR을 생성하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 7은 균주 HXB2(수탁번호: K03455)의 야생형 HIV gag,pol의 코돈 용법표를 나타낸 것이다.
도 8은 gag,pol-SYNgp로 명시된 코돈 최적화 서열의 코돈 용법표를 나타낸 것이다.
도 9는 env-mn으로 명명된 야생형 HIVenv의 코돈 용법표를 나타낸 것이다.
도 10은 SYNgp160mn로 명시된 코돈 최적화 서열의 코돈 용법표를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에서 사용된 3개의 플라스미드 구조물을 나타낸 것이다.
도 12는 레트로바이러스 벡터 입자를 생성하기 위한 2개의 시스템의 원리를 나타낸 것이다.
도 13a,도 13b - 외생적 가이드 서열의 디자인
본 발명은 하기의 실시예에 의해 더욱 기술될 것이나 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
A. 선택 시스템의 구성 요소
(ⅰ) 억제적 RNA 분자를 인코딩하는 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열
본 발명의 선택 시스템의 첫 번째 구성 요소는 억제적 RNA 분자를 인코드하는 다수의 뉴클레오타이드 서열이다. 억제적 RNA 분자는 서열에 결합함으로서 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 억제할 수 있는 리보핵산으로 정의된다. 일반적으로 억제적 RNA 분자는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 전사 생성물에 결합가능하고, 이의 분열에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 예로 리보자임(직접적인 분열), 외생적 가이드 서열(EGSs) 및 안티-센스 또는 센스 RNA(다른 인자에 의해 분열을 유발하는)를 포함한다.
억제적 RNA 분자를 인코딩하는 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 실질적으로 이형적이어서 선택 과정을 위한 다양한 서열을 생성할 것이다. 따라서 적어도 타겟 뉴클레오타이드 서열에 결합하는데 필요한 억제적 분자의 일부분이 변화할 것이다. 바람직하게는 촉매 활성, 구조적 보전 및 타겟 뉴클레오타이드 서열을 분해하는 세포 구성 성분과의 상호작용에 필요한 서열은 변화하지 않는다. 그러나 억제적 RNA 분자 전체를 무작위로 변화시키는 돌연변이화 기술에 의한 라이브러리(ilbrary)의 생성은 편리하다. 안티센스 및 센스 RNA 구조물의 경우 일반적으로 어떤 경우에도 바람직하다. 리보자임 및 EGS 서열에 관해서는 무작위로 합성되어 적당한 위치의 리보자임 및 EGS 구조물 내로 결찰되는 올리고뉴클레오타이드의 이용함으로서 라이브러리를 생성하는 것이 바람직하다. 이는 일반적으로 다른 기능적 도메인(domain)이 일정한 반면 특이성에 필요한 구역은 변화하는 리보자임/EGS 구조물 라이브러리를 유발한다.
예로서 무작위의 리보자임 라이브러리는 무작위의 뉴클레오타이드의 측면에있는 해머머리 모양의(hammerhead) 리보자임의 전도된 효소적 헬릭스(helix)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 구조함으로서 생성될 수 있다. 측면 서열은 리보자임을 위한 인식 구역을 제공한다. 각각의 측면 서열의 길이는 8 뉴클레오타이드가 적당한 길이이나 변할 수 있다. 이는 약 164(65536)개의 다른 분자의 복잡성을 나타낸다.
본 발명에 따라 이용하기 위한 적당한 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 리보핵산인 타겟 뉴클레오타이드 서열의 분열 및/또는 효소적 분해를 유발하는 유전자 생성물을 인코드한다. 특정한 예로서 리보자임, 외생적 가이드 서열 및 안티센 서열이 언급될 수 있다.
리보자임은 특정 사이트에서 RNA를 분열시키는 RNA 효소이다. 리보자임은 리보자임 분열 사이트를 포함하는 선택된 서열에 특이적이도록 설계될 수 있다. 따라서 리보자임은 전사된 바이러스 서열 내에서 선택된 인식 사이트를 지니도록 설계될 수 있다. 예로서 첫 번째 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드된 리보자임은 팩키지(packaging) 구성 성분 및 mRNA 게놈과 같은 바이러스 입자의 생성에 필요한 바이러스 게놈의 필수 요소를 인식하고 분열한다. 따라서 레트로바이러스(retroviral) 게놈의 경우 이러한 필수 요소는gag, pol및env유전자 생성물 및 바이러스 mRNA 게놈을 포함한다. 적어도gag, pol및env유전자서열 또는 더욱 일반적으로는 이러한 유전자로부터 전사된 RNA 서열을 인식하는 것이 가능한 적당한 리보자임은 이러한 서열에 결합하고 분열할 수 있다. 이는 mRNA 게놈뿐만 아니라 gag, pol 또는 env 단백질의 생성을 적당히 감소시키거나 방지할 수 있고, 따라서 레트로바이러스 입자의 생성을 감소시키거나 방지할 수 있다.
리보자임은 해머머리 모양, 머리핀 모양 및 간염 델타(delta) 안티게놈(antigenomic)의 리보자임을 포함하는 몇 가지의 형태가 있다. 여기 사용된 바람직한 리보자임은 부분적으로는 상대적으로 작은 크기 때문에, 타겟 분열 사이트에 필요한 서열이 최소한이기 때문에 및 잘 특성화되었기 때문에 해머머리 모양의의 리보자임이다. 현재 연구에 가장 일반적으로 사용되는 리보자임은 해머머리 모양 및 머리핀 모양의 리보자임이다.
각각의 개체의 리보자임은 타겟 RNA 내에서의 인식 사이트를 인식하고 결합하는 모티프(motif)를 지닌다. 이러한 모티프는 하나 이상의 "결합 팔(arm)" 일반적으로는 2개의 결합 팔을 형성한다. 해머머리 모양의 리보자임의 결합 팔은 헬릭스 Ⅱ의 측면에 있는 측면 서열 헬릭스 Ⅰ 및 헬릭스 Ⅲ이다. 이들은 각각 일반적으로 6∼10 뉴클레오타이드 사이의 변화가능한 길이일 수 있으나 더 짧거나 더 길 수 있다. 측면 서열의 길이는 분열 속도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어 측면 서열 내에서 20에서 12로 총 뉴클레오타이드 수를 감소시키는 것은 10배까지 리보자임 분열 HIV 서열의 전도율을 증가시킬 수 있다. 해머머리 모양의 리보자임 내의 리보자임 헬릭스 Ⅱ의 촉매 모티프는 분열 사이트와 관련된 사이트에서 타겟 RNA를 분열한다. 어떤 경우라도 리보자임은 적당한 분열 사이트를 포함하는 리보자임을 위한 인식 사이트의 존재 또는 부재에 의해 결정된 주어진 어떠한 RNA도 분열시킬 것이다.
리보자임의 각각의 타입은 그 자신의 분열 사이트를 인식한다. 해머머리 모양의 리보자임 분열 사이트는 G는 구아닌(guanine), U는 우라실(urasil) 및 X는 어떤 뉴클레오타이드 서열인 뉴클레오타이드 염기 3쌍 GUX 직접적인 상류를 지닌다. 머리핀 모양의 리보자임은 B는 아데닌(adenine) 이외의 어떤 뉴클레오타이드, N은 어떤 뉴클레오타이드, Y는 시토신(cytosine) 또는 티미딘(tymidine) 및 R은 구아닌 또는 아데닌인 BCUGNYR의 분열 사이트를 지닌다. 머리핀 모양의 리보자임에 의한 분열은 분열 사이트 내의 G와 N 사이에서 발생한다.
안티센스 기술은 당 분야에 잘 알려져 있다. 안티센스 서열이 기능을한다고 믿어지는 하나의 메카니즘은 헤테로듀플렉스의 분열 및 분해를 유발하는 세포성 단백질 RNAseH의 타겟 서열/안티센스 구조물 헤테로듀플렉스로의 보충(recruitment)이다. 따라서 리보자임과는 반대로 안티센스 구조물은 타겟 서열의 분열/분해를 간접적으로 이끈다고 말할 수 있다. 따라서 본 발명에 따라 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 필수적인/팩키지 구성 성분을 인코딩하는 유전자 또는예를 들어 결과적인 헤테로듀플렉스의 RNAseH 분해의 결과로서 유전자의 발현이 억제된 상기 유전자로부터 전사된 RNA에 결합하는 안티센스 RNA를 인코드한다. 안티센스 구조물이 항상 필수적인/팩키지 구성 성분 - 일부는 표면일 수 있다 - 을 인코딩하는 유전자의 전체 상보적 서열을 인코드할 필요는 없다. 숙련된 사람은 적당한 안티센스 구조물을 고안하는 방법을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
외생적 가이드 서열(EGSs)은 타겟 RNA 서열 내의 루프(loop)를 형성하는 상보적 타겟 서열에 결합하는 RNA 서열이고, 전체 구조는 타겟 RNA 서열의 RNaseP-매개된 분열을 위한 기질이다. EGS가 타겟 RNA에 어닐(anneal)될 때 형성된 구조는 tRNA 전구체 내에서 발견된 것과 매우 유사하다. RNaseP의 자연적 활성은 적당한 EGS를 고안함으로서 타겟 RNA를 분열시키도록 지시할 수 있다. EGS 디자인을 위한 일반적인 규칙은 도 13에 나타난 일반적인 EGS에 참조된 하기와 같다.
포유류 세포에서의 EGS 디자인의 규칙
타겟 서열 - 모든 tRNA 전구체 분자는 RNaseP 분열 사이트의 3'에 인접한 G를 지닌다(즉, G는 ACCA 서열의 앞에 있는 수용체 스템 상부에서 C와 염기쌍을 형성한다). 더욱이 모든 tRNA 내에서 8 뉴클레오타이드 하류에 U가 발견된다(즉, 위치 1에서의 G, 위치 8에서의 U). 피리미딘(pyrimidine)은 절단 사이트의 5'에 바람직하다. 일반적으로 다른 특정한 타겟 서열이 불필요하다.
EGS 서열 - 7 뉴클레오타이드 '수용체 스템' 아날로그(analogue)가 최적이다(5' 하이브리다이징(hybridising) 팔). 4 뉴클레오타이드 'D-스템' 아날로그가 바람직하다(3' 하이브리다이징 팔). 이러한 길이에서의 변형은 반응 운동학을 변화시킨다. 이는 각각의 타겟 사이트에 특이적일 것이다. 컨센서스(consensus) 'T-스템 및 루프' 아날로그는 필수적이다. 최소한의 5' 및 3' 비-쌍 서열이 EGS RNA의 원치않는 폴딩(folding)의 잠재성을 감소시키는데 바람직하다.
'안티-코돈(codon) 스템 및 루프' 아날로그의 삭제는 유리하다. 또한 변형가능한 루프의 삭제는 실험실 내에서 내성이 있을 수 있으나 이 둘 모두의 삭제를 위한 최적의 복위 루프는 생체 내에서 정의되지 않았다. 더 많은 지도는 예를 들어 Werneret al.(1997); Werneret al.(1998); Maet al.(1998) 및 Kawaet al.(1998)의 참조문헌에 의해 획득될 수 있다.
일반적으로 뉴클레오타이드 서열은 벡터 구조물의 일부분이 될 것이고, 따라서 숙주 세포 내에서 억제적 RNA 분자의 발현을 가능하게 하는 조절적 조절 서열에 실시가능하게 연결된 억제적 RNA 분자를 인코딩하는 첫 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된다. 바이러스 벡터 구조물을 포함하여 벡터 구조물의 더욱 상세한 것은 하기 섹션(section) B에 나타나 있다.
(ⅱ) 리포터 구조물로 구성된 두 번째 뉴클레오타이드 서열
시스템 내의 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 리포터 구조물로서 필수적으로 기능한다. 따라서 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 검출가능한 마커를 인코딩하는 코딩 구역으로 구성된다. 검출가능한 마커는 발현이 검출될 수 있는 유전자 생성물이다. 예로 lacZ, 녹색 형광 단백질 및 선택가능한 마커를 포함한다. 바람직하게는 검출가능한 마커는 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 이용하여 분류가능하다.
선택가능한 마커는 일반적으로 그의 발현 또는 부재가 세포 생존력에 영향을 미치는 유전자 생성물이다. 따라서 예로 네오마이신(neomycin)과 같은 항생제 저항성 유전자를 포함한다. 특히 바람직한 예는 직접적으로 또는 프로드러그에서 독성적인 화합물로의 변환을 통해 세포에 독성적인 유전자 생성물을 포함한다. 후자의 예는 간시클로버와 같은 화합물을 세포독성의 화합물로 변환하는 티미딘 키나제 효소이다. 따라서 발현될 때 두 번째 뉴클레오타이드 서열이 직접적으로 또는 외생적으로 첨가된 화합물의 존재시 세포 사멸을 유발시키는 것을 포함하여 세포 생존력을 감소시킬 수 있는 유전자 생성물을 인코드하는 것이 바람직하다.
두 번째 뉴클레오타이드 구조물의 중요한 특색은 코딩 구역에 첨가하여 적어도 하나 이상의 세 번째 뉴클레오타이드 서열이 코딩 서열의 상류 또는 하류에 존재하여 세 번째 뉴클레오타이드 서열에 대항하여 억제적 RNA 분자의 라이브러리를 시험하는데 바람직하다. 예를 들어 세 번째 뉴클레오타이드 서열은 모든 gag, pol 서열 또는 그 일부분을 인코딩하는 서열과 같은 레트로바이러스의 구성 성분과 같은 바이러스 구성 성분일 수 있다. 검출가능한 마커 코딩 서열의 상류 또는 하류의 세 번째 뉴클레오타이드 서열의 존재는 첫 번째 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드된 억제적 RNA 분자중의 하나가 세 번째 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 전사 생성물에 결합할 때 결과적인 상호작용이 두 번째 뉴클레오타이드 서열의 전사를 방지하고/또는 두 번째 뉴클레오타이드 서열로부터 생성된 mRNA의 안정성의 감소를 유발하여 검출가능한 마커의 발현이 감소되거나 억제되게 한다. 티미딘 키나제의 경우 TK 발현의 억제는 세포의 간시클로버에 대한 감수성을 감소시킨다. 따라서 생존하는 세포는 간시클로버의 존재시 세포 사멸을 유발시키기에 충분한 TK를 발현하지 않는다. TK/간시클로버가 사용될 경우, 또한 갭 정션(gap junction)을 통한 이웃 세포로의 세포독성적 화합물의 통과로 인한 방관자(bystander) 효과를 최소화하기 위해 딜드린(dieldrin)을 투여하는 것이 바람직하다. 유사한 고려가 방관자 효과를 지닌 다른 세포독성적 화합물에 적용된다.
따라서 세 번째 뉴클레오타이드 서열은 코딩 서열과 mRNA 안정성 및/또는 번역에 필요한 서열 사이에 있도록 코딩 서열에 관련하여 위치한다. 예를 들어 세 번 째 뉴클레오타이드 서열은 전사된 mRNA 내에서 5' 캡 바로 하류 또는 3' 폴리 A꼬리의 바로 상류에 있도록 위치된다. 5' 캡 및/또는 3' 폴리 A 꼬리에 결합하거나 분열을 유발하는 억제적 RNA 분자는 잔여 mRNA의 분해를 강화할 것이다. 따라서 세 번째 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 검출가능한 마커를 인코딩하는 mRNA의 5' 및/또는 3' 비번역된 구역(UTRs) 내에 존재할 것이다.
세 번째 뉴클레오타이드 서열은 이에 대항하여 효과적으로 기능하는 억제적 RNA 분자를 증명하는데 바람직한 뉴클레오타이드 서열이다. 따라서 발현을 억제하거나 감소시키는데 바람직한 유전자 생성물의 모두 또는 그 일부분을 인코드한다. 이러한 유전자 생성물은 발현이 질병과 관련된 포유류 세포 유전자 생성물을 포함한다. 또한 세 번째 뉴클레오타이드 서열은 병원성 생물체의 구성 성분, 특히 HIV와 같은 레트로바이러스성 병원체와 같은 바이러스성 병원체를 인코드한다. 이러한 성분은 예를 들어 gag.pol 또는 env 또는 액세서리 인자를 포함한다.
첫 번째 뉴클레오타이드 서열에 있어 하나 이상의 세 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 섹션 B에 기술된 바와 같이 핵산 벡터의 일부이다.
B. 핵산 벡터
일반적으로 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 핵산 벡터 내에 존재하고, 숙주 세포 내의 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 하는 조절적 조절 서열에 실시가능하게 연결되는, 동일하거나 다른 핵산 벡터이다.
"실시가능하게 연결된"이라는 용어는 기술된 구성 성분이 그들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있다는 것을 의미한다. 코딩 서열에 "실시가능하게 연결된" 조절적 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 양립할 수 있는 조건 하에서 달성되는 방식으로 결찰된다.
예를 들어 조절 서열은 전사 조절자에 더욱 반응적인 조절 서열에 의해 지시된 전사 수준을 생성하는 전사 조절적 요소에 더욱 첨가함으로서 변형된다.
본 발명의 벡터는 억제적 RNA 분자의 발현을 제공하기 위해 하기에 기술된 바와 같이 적당한 숙주 세포 내로 형질전환되거나 세포감염된다. 벡터는 이용된 숙주 세포와 양립할 수 있도록 선택될 것이다.
억제적 RNA 분자를 인코딩하는 서열에 실시가능하게 연결된 조절 서열은 프로모터/인핸서(enhancer) 및 다른 발현 조절 신호를 포함한다. 이러한 조절 서열은 발현 벡터가 이용되도록 고안된 숙주 세포와 양립할 수 있도록 선택된다. 프로모터라는 용어는 당 분야에서 잘 알려있으며, 최소한의 프로모터로부터 상류 요소 및 인핸서까지의 크기 및 복잡성에 걸친 핵산 구역을 포함한다.
일반적으로 프로모터는 곤충 세포와 같은 다른 진핵세포 내에서 기능적인 프로모터가 사용되더라도 포유류 세포 내에서 기능적인 프로모터로부터 선택된다. 일반적으로 프로모터는 바이러스성 또는 진핵세포의 유전자의 프로모터 서열로부터 유도된다. 예를 들어 발현이 발생하는 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터일 수 있다. 또한 예를 들어 몰로니(Moloney) 쥐과 백혈병 바이러스 긴 말단 반복(MMLV LTR) 프로모터, 라우스(rous) 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터 또는 인간 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus)(CMV) IE 프로모터와 같은 바이러스 프로모터가 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에 이용된 벡터는 예를 들어 플라스미드, 염색체 또는 인공적 염색체와 같은 비-바이러스성일 수 있다. 일반적인 세포감염 방법은 일렉트로포레이션(elctroporation), DNA 바이오리스틱스(biolistics), 지질-매개 세포감염, 응축된 DNA-매개 세포감염, 리포솜(liposome), 면역리포솜, 리포펙틴(lipofectin), 양이온 약제-매개, 양이온 페이셜(facial) 암피필(amphiphile)(CFAs)(Nature Biotechnology 1996 14;556) 및 그의 조합물을 포함한다.
또한 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 아데노-결합된 바이러스(AAV) 벡터, 헤프페스(herpes) 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스(lentivirus)벡터, 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. "바이러스 벡터"라는 용어는 팩키지 구성 성분의 존재시 타겟 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자 내로 바이러스 RNA 게놈을 팩키지하는 것이 가능하도록 충분한 바이러스 게놈 정보로 구성된 숙주 세포 내에서 전사되는 것이 가능한 바이러스 게놈으로 구성된 뉴클레오타이드 구조물을 나타낸다. 타겟 세포의 감염은 역전사 및 특정 바이러스에 적당한 타겟 세포 게놈으로의 통합을 포함한다. 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터는 벡터에 의해 타겟 세포로 전달되는 예를 들어 억제적 라이보자임을 인코딩하는 첫 번째 뉴클레오타이드 서열인 이형적 코딩 서열(관심있는 뉴클레오타이드)을 운반한다. 바이러스 벡터는 최종적인 타겟 세포 내에서 감염성 바이러스 입자를 생성하는 독립적인 복제가 불가능하다.
"바이러스 벡터 시스템"이라는 용어는 숙주 세포 내에서의 바이러스 입자를 생성하기 위해 바이러스 입자 생성을 위한 다른 필요한 구성 성분과 결합될 때 사용될 수 있는 키트 부분을 의미한다. 예를 들어 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 첫 번째 뉴클레오타이드 서열을 바이러스 게놈 벡터 구조물 내로 클로닝하는데 적당한 플라스미드 벡터 구조물 내에 존재한다. 키트 내에서 개별적인 플라스미드 벡터 구조물 내에 존재하는 두 번째 뉴클레오타이드 서열(리포터 구조물)과 결합될 때 첫 번째 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 다수의 플라스미드 및 두 번째 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드의 결과적 조합은 본 발명의 필수 요소로 구성된다. 그 후 이러한 키트는 숙련자에 의해 플라스미드 및선택적으로는 바이러스 어셈블리(assembly)에 필요한 다른 성분을 인코딩하는 핵산 구조물과 함께 숙주 세포 내로 세포감염될 때 감염성 바이러스 입자의 생성을 이끌 적당한 바이러스 벡터 게놈 구조물이 생성에 사용된다.
또한 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 첫 번째 뉴클레오타이드 구조물과 동일한 벡터 구조물의 일부로서 편리하게 존재한다. 이러한 방법으로 어떤 개체 세포 내에서의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 및 리포터 구조물(TK 유전자와 같은)의 동시-발현이 확보된다. 유사하게 바이러스 벡터 또한 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오타이드 서열 모두로 구성된다.
또한 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 키트에 포함된 팩키지 세포주 내에 안정하게 존재할 수 있다.
키트는 숙주 세포 및 바이러스 어셈블리에 필요한 필수적인 바이러스 폴리펩타이드를 인코딩하는 다른 플라스미드와 같은 바이러스 입자를 생성하는데 필요한 다른 구성 성분을 포함한다. 예로서 키트는 안티-HIV 리보자임을 인코딩하는 첫 번째 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 다수의 플라스미드 및 5' 및/또는 3' UTR 내에 위치한 세 번째 뉴클레오타이드 서열에 실시가능하게 연결된 TK를 인코딩하는 두 번째 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 선택적인 구성 성분은 (a) 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오타이드 서열을 바이러스 게놈 내로 클로닝하기 위한 적당한 제한효소 인식 사이트를 지닌 HIV 게놈 구조물; (b) VSV-G env 단백질을 인코딩하는 플라스미드 및 (c) gag.pol을 인코딩하는 플라스미드가 될 것이다. 또한 바이러스 입자의 어셈블리에 필요한 바이러스 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 예를 들어 VSV-G 발현 세포주와 같이 뉴클레오타이드 서열로 구성된 팩키지 세포주로서 키트 내에 제공된다.
바이러스 벡터는 일반적으로 레트로바이러스 벡터이고, HIV 벡터와 같이 특히 렌티바이러스 벡터이다. 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 적당한 레트로바이러스로부터 유도되거나 유도가능하다. 많은 다른 레트로바이러스가 증명되었다. 예로 : 쥐과 백혈병 바이러스(MLV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 원숭이 면역결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV), 말과 감염성 빈혈증 바이러스(EIAV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 후지나미(Fujinami) 육종 바이러스(FuSV), 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스(Mo-MLV), FBR 쥐과 골육종 바이러스(FBR MSV), 몰로니 쥐과 육종 바이러스(Mo-MSV), 아벨슨(Abelson) 쥐과 백혈병 바이러스(A-MLV), 조류 골수구종증 바이러스-29(MC29) 및 조류 적아세포증 바이러스(AEV) 등을 포함한다. 레트로바이러스의 상세한 목록은 Coffinet al., 1997, "Retroviruses". Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp758-763에서 발견된다.
일부 레트로바이러스의 게놈 구조상의 상세한 것은 당 분야에서 발견된다.예로서 HIV 및 Mo-MLV의 세부사항은 NCBI 유전자은행(각각 게놈 수탁번호 AF033819 및 AF033811임)으로부터 발현된다.
렌티바이러스 그룹은 "영장류" 및 "비-영장류"로 양분될 수 있다. 영장류 렌티바이러스의 예로 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 자가-면역결핍 증후군(AIDS)의 원인제 및 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV) 등을 포함한다. 비-영장류 렌티바이러스 그룹은 염소 관절염-뇌염관련 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈증 바이러스(EIAV) 및 더욱 최근에 기술된 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 및 소 면역결핍 바이러스(BIV)뿐만 아니라 원형 "슬로우(slow) 바이러스" 비스나/매디(visna/maedi) 바이러스(VMV)를 포함한다.
레트로바이러스 게놈의 기본 구조는 5' LTR 및 3' LTR이고, 그 사이 또는 그 안에 게놈을 팩키지될 수 있게 하는 팩키지 신호, 프라이머 사이트, 숙주 세포 내로의 통합을 가능하게 하는 통합 사이트 및 팩키지 구성 성분을 인코드 하는gag, pol및env등이 있다 - 이들은 바이러스 입자의 어셈블리에 필요한 폴리펩타이드이다. 더욱 복잡한 레트로바이러스는 통합된 프로바이러스(provirus)의 RNA 전사체를 핵에서 감염된 타겟 세포의 세포질로 효과적으로 운반할 수 있는 HIV 내의rev및 RRE 서열과 같은 부가적인 특색을 지닌다.
프로바이러스 내에서 이들 유전자는 양 말단에서 긴 말단 반복(LTRs)이라고명명된 구역의 측면에 위치한다. LTR은 프로바이러스 통합 및 전사에 중요하다. 또한 LTR은 인핸서-프로모터 서열로 작용하고, 바이러스 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 레트로바이러스 RNAs의 캡시드화(encapsidation)가 바이러스 게놈의 5' 말단에 위치한 psi 서열에 의해 발생한다.
LTRs 자체는 U3, R 및 U5로 명명된 3개의 요소로 나뉠 수 있는 서열과 동일하다. U3은 RNA의 3' 말단에 유일한 서열로부터 유도된다. R은 RNA의 양 말단에서 반복된 서열로부터 유도되고, U5는 5' 말단에 유일한 서열로부터 유도된다. 3개의 요소의 크기는 다른 레트로바이러스에 따라 매우 변화할 수 있다.
결함있는 레트로바이러스 벡터 게놈에서gag, pol및env는 부재하거나 또는 기능적이지 않을 수 있다. RNA의 양 말단에서 R 구역은 반복된 서열이다. U5 및 U3은 RNA의 게놈에서 각각 5' 및 3' 말단에서 유일한 서열을 나타낸다.
유전자 치료 및/또는 다른 분자생물학 기술에 사용되는 일반적인 레트로바이러스 벡터에서 복제에 필수적인 적어도 하나 이상의gag, pol및env단백질 코딩구역 부분이 바이러스로부터 제거된다. 이는 레트로바이러스 벡터를 복제-결함으로 만든다. 제거된 단백질은 게놈을 숙주 게놈으로 통합할 수 있으나 변형된 바이러스 게놈이 구조적 단백질의 부재에 기인하여 자신을 번식시킬 수 없는 바이러스를 생성하기 위해 첫 번째 뉴클레오타이드와 같은 관심있는 서열(NOI)에 의해 대치될 수도 있다. 숙주 게놈 내로 통합되면 NOI의 발현이 발생한다 - 예를 들어 치료적 및/또는 진단적 효과를 유발. 따라서 일반적으로 NOI의 관심있는 사이트 내로의 트랜스퍼(transfer)는 : 재조합 바이러스 벡터 내로 NOI를 통합하고 ; 비리온(virion) 외피 내로 변형된 바이러스 벡터를 팩키지하고 ; 및 관심있는 사이트 - 타겟된 세포 또는 타겟된 세포군과 같은 - 의 형질도입을 가능하게 함으로서 달성된다.
따라서 본 발명에서 이용되기 위한 최소한의 레트로바이러스 게놈은 (5')R-U5 - 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 및/또는 두 번째 뉴클레오타이드 서열 - U3-R(3')로 구성될 것이다. 그러나 숙주 세포/팩키지 세포 내에서의 레트로바이러스 게톰을 생성하는데 사용된 플라스미드 벡터는 또한 숙주 세포/팩키지 세포에서의 게놈의 전사를 지시하는 레트로바이러스 게놈에 실시가능하게 연결된 전사 조절적 조절 서열을 포함한다. 이러한 조절적 서열은 전사된 레트로바이러스 서열, 즉, 5' U3 구역과 결합된 자연적 서열일 수 있거나 또는 예를 들어 CMV 프로모터와 같이 또다른 바이러스 프로모터와 같은 이형적 프로모터일 수 있다.
일부 레트로바이러스 게놈은 효과적인 바이러스 생성을 위한 부가적인 서열을 필요로 한다. 예를 들어 HIV의 경우 바람직하게는rev및 RRE 서열이 포함된다. 그러나rev및 RRE 서열의 필요성은 코돈 옵티미세이션(optimisation)에 의해 감소되거나 제거될 수 있다.
레트로바이러스 벡터 게놈이 프로바이러스 DNA로서 그의 타겟 세포의 게놈 내로 통합되면 리보자임 서열은 발현될 필요가 있다. 레트로바이러스 내에서 프로모터는 프로바이러스의 5' LTR U3 구역 내에 위치한다. 레트로바이러스 벡터 내에서 이형적 유전자의 발현을 이끄는 프로모터는 5' U3 구역 내의 본래의 레트로바이러스 프로모터이거나 벡터 내로 설계된 또다른 프로모터이다. 또다른 프로모터는 본래의 5' U3 프로모터를 레트로바이러스로 물리적으로 대치하거나 LTRs 사이에서와 같이 벡터 게놈 내에서의 다른 곳으로 통합된다.
일반적으로 복제-결함 레트로바이러스 벡터는 예를 들어 팩키지 또는 헬퍼(helper) 세포주와 재조합 벡터의 조합을 이용함으로서 연속된 형질도입을 위한 레트로바이러스 벡터의 적당한 적정량을 준비하기 위해 번식된다. 즉, 3개의 팩키지 단백질은 인 트랜스(in trans)로 제공될 수 있다.
"팩키지 세포주"는 하나 이상의 레트로바이러스gag, pol및env유전자를 포함한다. 팩키지 세포주는 레트로바이러스 DNA를 팩키지하는데 필요한 단백질을 생성하나psi구역의 부재에 기인하여 캡시드화를 유발할 수 없다. 그러나 NOI 및psi구역을 운반하는 재조합 벡터가 팩키지 세포주 내로 도입되면 헬퍼 단백질은 재조합 바이러스 군체를 생성하는psi-양성 재조합 벡터를 팩키지할 수 있다. 이러한 군체는 NOI를 타겟 세포의 게놈 내로 도입하는 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 이는 바이러스 적정량을 증가시키는 것으로 나타나기 때문에 스플라이스 도너(splice donor)의 상류에서gag시작 코돈의 하류까지 걸쳐있는 부가적인 서열(Benderet al., 1987)을 포함하는psi플러스라고 명명된psi팩키지 세포를 이용하는 것이 바람직하다.
게놈이 바이러스 단백질을 생성하는데 필요한 모든 유전자를 지니지 않는 재조합 바이러스는 단지 한번만 형질도입할 수 있고, 번식할 수 없다. 타겟 세포의 단한번의 형질도입만 가능한 이러한 바이러스 벡터는 복제 결함 벡터로 알려졌다. 따라서 NOI이 잠재적으로 해로운 레트로바이러스의 생성없이 숙주/타겟 세포내로 도입된다. 유용한 팩키지 라인(line)의 요약은 Coffinet al., 1997(ibid) 내에 나타나 있다.
바람직하게는gag, pol및env바이러스 코딩 구역이 팩키지 세포주 내로 독립적으로 세포감염되는 개별적 발현 플라스미드를 수행하는 레트로바이러스 팩키지 세포주가 이용된다. 종종 3개의 플라스미드 세포감염 방법으로 설명되는(Soneokaet al., 1995) 이러한 전략은 3개의 재조합 이벤트가 야생형 바이러스 생성에 필요하기 때문에 복제-유능 바이러스 생성의 잠재성을 감소시킨다. 재조합은 상동성에 의해 크게 촉진되기 때문에 벡터 및 헬퍼의 게놈 사이의 상동성의 감소 또는 제거는 또한 복제-유능 헬퍼 바이러스 생성의 문제점을 감소시키는데 사용될 수 있다.
안정하게 세포감염된 팩키지 세포주의 또다른 것은 일시적으로 세포감염된 세포주를 이용하는 것이다. 벡터가 발달하고 있을 경우 일시적인 세포감염이 벡터의 생성 수준을 측정하는데 유리하게 이용된다. 이러한 관점에서 일시적인 세포감염은 안정한 벡터-생성 세포주를 생성하는데 필요한 더욱 긴 시간을 피하고, 또한 벡터 또는 레트로바이러스 팩키지 구성 성분이 세포에 독성적인 경우 사용된다. 일반적으로 레트로바이러스 벡터를 생성하는데 사용된 구성 성분은 gag/pol 단백질, env 단백질을 인코딩하는 플라스미드 및 NOI 함유 플라스미드를 포함한다. 벡터 생성은 하나 이상의 이들 구성 성분의 다른 필요한 구성 성분을 함유한 세포 내로의 일시적인 세포감염을 포함한다. 벡터가 세포사멸을 유도하는 세포 사이클 또는 유전자의 억제자와 같은 숙주 세포의 복제를 방해하는 독성적 유전자 또는 유전자들을 인코드할 경우 안정한 벡터-생성 세포주를 생성하는 것은 어려우나, 일시적인 세포감염은 세포가 사멸하기 전에 벡터를 생성하는데 이용될 수 있다. 또한 세포주는 안정한 벡터-생성 세포주로부터 수득된 수준과 유사한 벡터 적정량 수줄을 생성하는 일시적 세포감염을 이용하여 발달되었다.
생산자 세포/팩키지 세포는 어떤 적당한 세포 타입도 될 수 있다. 가장 일반적으로 포유류 생산자 세포가 사용되나 곤충 세포와 같은 다른 세포도 배제되지 않는다. 분명히 생산자 세포는 env 및 gag, pol mRMA를 효과적으로 번역할 수 있어야 할 것이다. 숙련자는 또한 예들 들어 팩키지 구성 성분을 인코딩하는 뉴클레오타이드 구조물을 세포주 내로 안정하게 도입함으로서 적당한 팩키지 세포주를 생성할 수 있다.
레트로바이러스 게놈 내에서의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열이gag, pol및/또는envRNA 전사체 분열에 영향을 미치는 능력이 있는지에 대해 시험된 억제적 RNA 분자를 인코드할 경우 통합되거나 또는 플라스미드를 수행하는 팩키지 세포주 내에 또는 gag, pol 및/또는 env 단백질을 인코드하는 생산자 세포 내에 존재하는 뉴클레오타이드 서열이 억제적 RNA 분자(들)의 결합을 감소시키거나 방지하도록 일시적으로 세포감염된 변형된다. 이러한 방법으로 억제적 RNA 분자(들)는 바이러스 입자를 팩키지하는데 필수적인 팩키지 세포주 내의 바이러스 폴리펩타이드의 발현을 방지할 것이다. 분명히, 라이브러리의 무작위적 성질이 주어지면 라이브러리 내의 일부 서열이 변형된 팩키지 구성 성분을 분열할 것이나, 세 번째 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 다른 팩키지 구성 성분을 인코딩하는 서열을 지님으로서 변형된 팩키지 구성 성분에 영향을 미치는 억제적 분자는 동시에 세 번째 뉴클레오타이드 서열에 영향을 미치기 쉽게 되고, 따라서 세포는 많은 경우 검출가능한 마커를 생성하고, 스크린으로부터 배출될 것이다.
"바이러스 입자의 팩키지에 필수적인 바이러스 폴리펩타이드"라는 용어는 이것이 존재하지 않을 경우 바이러스 게놈이 팩키지 되지 않는, 바이러스 입자로 팩키지 되도록 하는 바이러스 게놈에 의해 정상적으로 인코드된 폴리펩타이드 의미한다. 예를 들어 레트로바이러스의 경우 이러한 폴리펩타이드는 gag, pol 및 env를 포함한다. 또한 "팩키지 구성 성분" 및 "필수 구성 성분"이라는 용어는 이러한 정의 내에 포함된다.
예로서 리보자임의 경우 저항성은 일반적으로 리보자임 인식 사이트를 제거하는 서열 내에서의 변화에 의한 것이다. 동시에 필수/팩키지 구성성분에 대한 아미노산 코딩 서열은 서열에 의해 인코드된 바이러스 구성 성분이 필수/팩키지 구성성분의 기능이 포함되지 않은 것과 동일하게 또는 적어도 충분히 유사하게 남아있도록 보유된다. 또한 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열의 무작위적 성질이 종종 주어지고, 팩키지 구성 성분을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 대규모의 변형이 필요시 된다.
안티센스 서열의 경우 세 번째 뉴클레오타이드 서열은 안티센스 서열이 세 번째 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 전사체에 결합하더라도 안티센스 서열은 필요한 팩키지 구성 성분 또는 그로부터의 전사된 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 효과적으로 결합할 수 없다는 점에서 바이러스 팩키지 구성 성분을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 구별된다. 일반적으로 세 번째 뉴클레오타이드 서열과 팩키지 필요한 구성 성분을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 사이의 차이점은 상기에 언급한 바와 같이 적은 수의 아미노산 변화가 허용되더라도 필수/팩키지 구성성분의 기능이 유의적으로 손상되지 않았다는 것을 제시하는 보존적 변화일 것이다.
더욱 일반적으로 적당한 접근은 필요한 팩키지 구성 성분의 뉴클레오타이드 서열을 변화시켜 세 번째 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 구역에 걸친 뉴클레오타이드 상동성이 95% 이하, 더욱 바람직하게는 90, 80 또는 70% 이하인 반면 아미노산 상동성은 바람직하게는 적어도 95%가 되게 하는 것이다.
바람직하게는 억제적 RNA 인식 사이트를 제거하는 것에 더하여 바이러스 구성 성분을 위한 코딩 서열의 변화는 레트로바이러스 벡터 입자 생성을 위한 생산자 세포로서 작용하는 포유류 세포 또는 다른 세포에서의 코돈 용법을 위한 서열을 개선한다. 이러한 코동 용법에서의 개선은 "코돈 옵티미세이션"이라고 나타낸다. HIV 및 다른 렌티바이러스를 포함하여 많은 바이러스는 많은 드문 코돈을 사용하고, 통상적으로 사용되는 포유류 코돈에 상응하는 이러한 변화에 의해 포유류 생산자 세포 내에서의 팩키지 구성 성분의 증가된 발현이 달성될 수 있다. 코돈 용법표는 다양한 다른 생물체뿐만 아니라 포유류 세포에 대해 자라 알려져 있다.
따라서 바람직하게는 팩키지 구성 성분을 인코딩하는 서열은 코돈 최적화된다. 더욱 바람직하게는 서열은 완전히 최적화된다. 하기의 코돈 옵티미세이션에서 억제적 RNA 인식 사이트로 작용할 수 있고, 팩키지 구성 성분을 인코딩하는 서열 내에 더 이상 존재하지 않는 야생형gag, pol및env서열 내에 많은 사이트가 있는 것으로 나타났다.
코돈 최적화 HIV 팩키지 구성 성분의 부가적인 장점은 이것이 유전자 발현을 증가시킬 수 있다는 것이다. 특히gag, pol발현 Rev 독립적이 되게 하여rev및 RRE가 게놈 내에 포함될 필요가 없게 할 수 있다(Hasset al., 1996). 따라서 Rev-독립적 벡터가 가능하다. 결국 이는 레트로바이러스 벡터 내에서 안티-rev또는 RRE 인자의 사용을 가능하게 한다.
실험적 및 시행적 적용 모두에서 높은-적정량 바이러스 준비는 매우 바람직하다. 바이러스 적정량의 증가를 위한 기술은 상기에 기술된 바와 같이psi플러스(plus) 팩키지 신호 및 바이러스 군체 농도를 이용하는 것을 포함한다. 더욱이 소포성-구내염 바이러스로부터의 G 단백질과 같은 다른 외피 단백질의 이용은 하기 농도를 ml 당 109로 적정량을 증가시켰다. 그러나 일반적으로 바이러스 입자가 치료를 원하는 바이러스로 감염된 세포를 우선적으로 감염시키도록 외피 단백질이 선택될 것이다. 예를 들어 HIV 벡터가 HIV 감염 치료에 사용되는 경우 사용된 env 단백질은 HIV env 단백질이 될 것이다.
C. 선택 방법
본 발명의 선택 방법은 두 번째 뉴클레오타이드 서열의 존재시 숙주 세포 내로 하나 이상의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열을 도입시키는 것을 포함한다. 숙주 세포 내로 핵산을 도입시키기 위한 방법은 예를 들어 세포감염과 같이 당 분야에서 잘 알려져 있다. 일반적으로 뉴클레오타이드 서열은 벡터의 일부분이다. 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 동일한 벡터의 일부분이거나 개별적 핵산 분자 상에 존재한다. 두 번째 뉴클레오타이드 서열도 숙주 세포의 게놈 내로 안정하게 도입된다.
첫 번째 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드된 억제적 RNA 분자는 검출가능한 마커의 발현을 억제하거나 감소시키고, 검출가능한 마커 발현의 억제 또는 감소를 이끌지 않는 첫 번째 뉴클레오타이드 서열을 포함한 세포로부터의 분자와 같은 것을 포함하는 세포를 구별하는 것을 가능하게 할 것이다. 효과적인 억제적 RNA 분자를 포함하는 세포는 억제적 RNA 분자의 서열 및 타겟 분자 구역의 서열까지도 증명하기 위해 예를 들어 PCR 반응과 같은 것에 이용될 수 있다.
검출가능한 마커가 FACS-분류가능한 것인 경우 효과적인 억제적 RNA 분자를 포함하는 세포는 잔여 세포로부터 분류될 수 있다. 선택가능한 마커가 프로드러그로부터 세포독성적 화합물로 전환하는 것이 가능한 효소일 경우 효과적인 억제적 RNA 분자를 포함하는 이러한 세포는 프로드러그에 대한 둔감성에 의해 선택가능하게 될 것이다. 더욱 특별하게는 효과적인 억제적 RNA 분자를 포함하는 이러한 세포는 프로드러그로의 선택에서 더 잘 생존할 수 있게 될 것이다.
바람직한 실시태양에서 후자의 선택 과정은 첫 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된 바이러스 벡터의 라이브러리를 이용하여 편리하게 수행된다. 바이러스 벡터 라이브러리는 예를 들어 TK와 같은 것을 인코딩하는 두 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된 생산자 세포 내로 세포감염된다. 연속된 프로드러그(예를 들어 간시클로버와 같은) 선택에서 생존한 세포는 일반적으로 효과적인 억제적 RNA 분자를 인코딩하는 적어도 하나 이상의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된다. 더한 선택적 단계는 상기 세포로부터의 바이러스 입자를 수확하여 더한 세포를 형질도입하기 위해 감염성 바이러스 입자를 이용하는 것이다. 일반적으로 이러한 가외의 단계의 장점은 필수 바이러스 서열/팩키지 구성 성분을 분열하지 않는 첫 번째 뉴클레오타이드 서열만 이러한 두 번째 단계를 통해 성공적으로 수행될 것이라는 점이다. 더욱이 바이러스 세포로부터 수득된 바이러스 상청액의 희석 시리즈를 만듦으로서 PCR에 의해 증명을 단순화할 단지 하나의 첫 번째 억제적 서열로 구성된 세포를 생성하는 것이 가능하다.
일부 억제적 분자가 세 번째 뉴클레오타이드 서열을 타겟하는데 실패하는 것 이외의 다른 이유에 의해 세포 사멸을 유발한다는 것을 유의하여야 한다. 예를 들어 억제적 분자는 세포 생존에 필수적인 mRNA의 분해를 유발할 수 도 있다. 일반적으로 이러한 분자를 포함하는 세포는 사멸하기 때문에 무작위적 라이브러리의 이러한 요소에 대한 선택은 불필요하다.
또한 첫 번째 뉴클레오타이드 서열이 검출가능한 마커를 인코딩하는 코딩 구역의 분열에 결합하고 그에 영향을 미치는 것이 가능한 경우 "펄스(false) 양성"이 수득된다. 예를 들어 선택 과정이 프로드러그로의 선택에서 생존하기 위해 효과적인 억제적 RNA 분자를 포함하는 세포의 수용력에 의존적인 경우 펄스 양성은 억제적 RNA 분자(들)가 프로드러그에서 세포독성적 화합물로 전환하는 효소를 인코딩하는 mRNA를 직접적으로 타겟하면 수득된다. 특히 바람직한 실시태양에서 선택 단계는 두 번째 핵산에서 이용된 검출가능한 마커의 서열을 타겟하는 억제적 RNA 분자 분자를 인코딩하는 벡터를 제거하는데 포함된다.
이는 예를 들어 첫 번째 뉴클레오타이드 서열을 검출가능한 마커를 인코딩하는 비-기능적 뉴클레오타이드 서열로 구성된 구조물 내로 삽입하고, 세 번째 뉴클레오타이드 서열("네 번째 뉴클레오타이드서열")이 결핍됨으로서 수행된다. 바람직하게는 다른 벡터 서열은 두 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된 벡터와 동일하다. 일반적으로 검출가능한 마커를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 기능적인 검출가능한 마커의 발현을 방지하는 삽입 또는 삭제에 의해 변형된다. 따라서 불활성의 검출가능한 마커는 비-기능적이 되게 하는 돌연변이와는 별개로 두 번째 핵산에 이용된 검출가능한 마커 서열과 동일하다.
구조물은 초기 스크리닝 단계를 위한 라이브러리 바이러스 벡터를 생성하는데 사용될 수 있다. (ⅰ) 검출가능한 마커에 결합하고 분열을 유발할 수 있고 ; (ⅱ) 함유된 바이러스 게놈에 영향을 미치고 ; (ⅲ) 바이러스 팩키지에 영향을 미치고 ; 또는 (ⅳ) 세포를 죽이는 억제적 분자를 인코딩하는 게놈은 바이러스 입자 내로 팩키지되지 않을 것이다. 따라서 바이러스의 풀(pool)은 (ⅰ) 검출가능한 마커의 분열을 유발할 수 있고 ; (ⅱ) 세포 생존에 불리하고 ; 또는 (ⅲ) 선택 분석에서 바이러스 생성을 억제할 수 있지 않도록 미리 선택된 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성되도록 생성된다.
바이러스의 이러한 풀은 상기에 기술된 바와 같이 한차례의 선택에서 두 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된 세포를 형질도입하는데 이용될 수 있다.
D. 최적화된 억제적 RNA 분자의 이용
리보자임과 같은 본 발명의 선택 방법에 의해 증명된 최적화된 억제적 RNA 분자는 타겟 세포 내에서 그들의 타겟 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 전사체의 발현을 억제하는데 사용된다.
이는 예를 들어 "넉-아웃(knock-out)" 실험을 수행함으로서 유전자 발현을 봉쇄하는 효과를 연구하기 위해 실험실 내에서 또는 생체 내에서 세포의 유전자 발현을 제거하는데 사용된다. 이러한 실험은 예를 들어 타겟 확인, 스크리닝 또는모델 건축에 유용하다.
또한 본 발명의 선택 방법에 의해 증명된 최적화된 억제적 RNA 분자는 유전자 치료 및 직접적인 RNA의 투여와 같은 치료적 적용에 사용된다. 특히 병원균의 필수 구성 성분을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 타겟하는 최적화된 억제적 RNA 분자는 상기 병원균에 의해 유발된 질병을 치료하는데 사용된다. 따라서 HIV의 구성 성분을 타겟하는 최적화된 억제적 RNA 분자는 HIV 감염 또는 그와 관련된 증후군을 감소시키거나 방지하는데 사용된다.
따라서 최적화된 억제적 RNA 분자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산 벡터는 바이러스성 감염, 바람직하게는 레트로바이러스 감염, 특히 렌티바이러스, HIV 감염을 치료하거나 방지하는데 사용된다. 특별히 상기 핵산 벡터는 바이러스성 감염의 치료를 요하는 인간 또는 동물에 억제적 RNA 분자를 전달하는데 사용된다. 핵산 벡터는 바이러스 벡터 및 그로부터 수득된 감염성 바이러스 입자를 포함한다. 바이러스 벡터가 병원성 바이러스의 구성 성분을 타겟하는 선택된 첫 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성되고, 또한 구성 성분이 선택된 첫 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된 감염성 바이러스 입자의 생성에 필요한 경우 일반적으로 팩키지/생산자 세포 내의 구성 성분의 뉴클레오타이드 서열은 상기에 기술된 바와 같이 변형될 것이다. 특히 안내는 리보자임의 이용 및 변형된 레트로바이러스 env 및 gag.pol 서열의 이용에 대한 참조 실시예에 나타나 있다.
HIV-1은 HIV-1 감염을 막기 위한 전략의 발달을 위한 이상적인 벡터를 제공한다. 이는 트랜스-생성된 바이러스 입자에 의해 제거되고 팩키지된 오픈 리딩 프레임이(따라서 비-병원성이나 여전히 면역원임) 리보자임, 인트라-바디(intra-bodies), 인트라-킨(intra-kine), RNA 미끼, 및/또는 트랜스-우세 돌연변이 단백질과 같은 안티-HIV 분자를 운반하는데 이용될 수 있기 때문이다.
스플라이스 도너(splice donor) 및 스플라이스 억셉터(splice acceptor) 사이트가 보유될 경우 8개까지의 뚜렷한 안티-HIV 인자가 단지 하나의 바이러스 구조물에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어 Tat 리딩 프레임은 Tat 타겟팅 리보자임으로 대치될 수 있고, nef 리딩 프레임은 tat 트랜스우세 돌연변이로 대치될 수 있다.
리보자임과 같은 억제적 RNA 분자는 이러한 시스템의 중요한 구성 성분이 된다.
바람직하게는 핵산 벡터/바이러스 입자는 약제적으로 수용가능한 운반체 또는 약제적 조성물을 생성하는 희석제와 결합된다. 따라서 본 발명은 또한 약제적으로 수용가능한 운반체, 희석제, 부형제 또는 보조제와 함께 본 발명의 치료적으로 효과적인 양의 핵산 벡터/바이러스 입자로 구성된 개인의 치료를 위한 약제적조성물을 제공한다. 약제적 조성물은 인간 또는 동물에 사용될 수 있다.
약제적 운반체, 부형제 또는 희석제의 선택은 투여의 의도된 루트(route) 및 표준화된 약제적 시행에 따라 선택될 수 있다. 적당한 운반체 및 희석제는 예를 들어 인산염-완충 식염수와 같은 등장성 식염수를 포함한다. 약제적 조성물은 운반체, 부형제 또는 희석제, 적당한 바인더(binder)(들), 윤활제(들), 부유 약제(들), 코팅 약제(들), 용매제(들) 및 타겟 사이트(예를 들어 액체 전달 시스템과 같은) 내로의 바이러스 진입을 돕거나 증가시키는 다른 운반 약제(들)로 구성된다.
약제적 조성물은 비경구적, 근육내, 정맥내, 두개골내, 피하의, 눈안의 또는 트랜스더말(transdermal) 투여를 위해 포뮬레이트(formulate)된다.
적당한 곳에서 약제적 조성물은 : 흡입제, 좌약 또는 페서리 형태, 일반적으로 로션, 용액, 크림, 연고 또는 가루 분말 형태, 피부 패취(patch)의 이용에 의한, 전분 또는 락토오스(lactose)와 같은 부형제를 포함하는 타블렛(tablet) 형태 또는 단독 또는 부형제와의 혼합물의 캡슐 또는 오뷸(ovule) 또는 풍미 또는 색체 약제를 함유하는 엘릭시르(elixir), 용액 또는 현택액 형태의 하나 이상에 의해 투요될 수 있고, 또는 이들은 예를 들어 인트라카버노살로, 정맥내, 근육내 또는 피하와 같이 비경구적으로 주사될 수 있다. 비경구적 투여의 경우 조성물은 예를 들어 혈액과 등장성의 용액을 만들기에 충분한 염 또는모노사카라이드(monosaccharides)와 같은 다른 물질을 함유한 멸균된 수용액의 형태로 가장 잘 이용된다. 구강내 또는 설하내 투여의 경우 조성물은 통상적인 방식으로 포뮬레이트될 수 있는 타블렛 또는 마름모꼴 정제의 형태로 투여된다.
투여되는 바이러스의 양은 일반적으로 103∼1010pfu, 바람직하게는 105∼108, 더욱 바람직하게는 106∼107pfu의 범위내에 있다. 일반적으로 주사되면 약제적으로 수용가능한 적당한 운반체 또는 희석제 내의 1∼10㎕의 바이러스가 투여된다.
폴리뉴클레오타이드/벡터가 있는 그대로의(naked) 핵산으로서 투여되면 투여된 핵산의 양은 일반적으로 1㎍∼10mg, 바람직하게는 100㎍∼1mg의 범위 내에 있다.
본 발명의 방법에 의해 선택된 첫 번째 뉴클레오타이드 서열(또는 다른 치료적 서열)이 유도가능한 조절적 서열의 조절 하에 있는 경우 치료의 지속을 위한 유전자 발현이 유도될 필요가 있다. 조건이 치료되면 유도인자는 제거되고, 뉴클레오타이드 서열의 발현은 중지된다. 이는 분명히 임상적인 장점을 지닐 것이다. 예를 들어 이러한 시스템은 tet 억제자/VP16 융합 단백질 상의 효과를 통한 유전자 발현을 활성하시키기 위해 항생적 테트라사이클린(tetracycline)의 투여를 포함한다.
E. 생체 내의 선택 방법
하나의 관점에서 본 발명은 mRNA 분자 상의 오픈 리딩 프레임을 증명하기 위한 방법을 제공한다.
"오픈"이라는 용어는 mRNA가 생리적인 증거로 있을 경우 리보자임, 안티센스 RNA 또는 EGSs와 같은 억제적 RNA 분자에 접근하기 쉬운 사이트를 의미한다.
본 발명의 선택 시스템을 이용하여 mRNA는 세 번째 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드된다. 예를 들어 세 번째 뉴클레오타이드 서열이 전체 유전자일 경우 선택 시스템은 상응하는 mRNA 분자 상의 하나 이상의 오픈 사이트를 증명하는데 사용될 수 있다. 억제적 RNA 분자(리보자임, 안티센스 RNA 또는 EGSs와 같은)가 선택 시스템을 이용하여 세 번째 뉴클레오타이드 서열에 결합 가능한 것으로 증명되면 타겟 사이트는 표준 기술을 이용하여 추론될 수 있다. 예를 들어 억제적 분자가 안티센스 서열인 경우 안티센스 서열의 "최적" 상보 서열과 mRNA 서열간의 서열 비교는 안티센스 서열이 mRNA에 결합하는 사이트라는 것을 나타낼 것이다.
본 발명은 실시예에 의해 더욱 기술될 것이고, 본 발명 수행시 당분야의 일반적인 기술자에게 도움을 주나 본 발명의 범위를 제한하고자 하지는 않는다. 실시예는 도면을 참조한다.
본 발명은 각각 해머머리 모양의 리보자임의 촉매 도메인을 포함하는 리보자임의 라이브러리 생성에 근거를 둔 방법을 발달시켰다. 시행절차는 자살 유전자(티미딘 키나제(TK)가 바람직하다)를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 게놈을 포함하는 바이러스를 생성하는 것을 포함한다. 타겟 서열은 이것의 하류에 삽입된다. 또한 또는 이에 더하여 내생적 리보솜 엔트리(entry)사이트(IRES)가 TK 서열의 상류에 삽입될 경우 타겟 서열은 상류에 삽입될 수 있다. 이러한 벡터로 형질도입된 세포는 간시클로버에 민감하게 될 것이다.
그러나 바이러스 게놈이 전사되면 mRNA는 TK 유전자뿐만 아니라 타겟 서열도 포함한다. 이러한 mRNA는 정상적인 5' 캡 및 3' 폴리 A 꼬리를 포함할 것이다. 5' 캡 또는 폴리 A 꼬리가 리보자임으로의 분열에 의해 제거될 경우 mRNA는 불안정해지고, 분해된다. 이는 TK 유전자의 번역을 방지하여 활성적인 리보자임을 발현하는 세포가 간시클로버에 둔감하게 만든다.
(실시예 1) 프로드러그 시스템의 선택(선택가능한 마커)
본 발명에 사용된 두 번째 뉴클레오타이드는 검출가능한 마커를 인코드한다. 2개의 잘 알려진 효소-프로드러그 조합의 투약 반응은 효과적인 프로드러그 시스템을 선택하기 위해 측정되었다.
A. 대장균 질소환원효소(NTR)메트로니다졸(MTZ) 조합 : HT1080 세포(NTR-) 및 HT1080 NTR 양성 세포(NTR+)는 MTZ의 농도를 달리하여 인큐베이트되었고, 생존한 세포의 백분율이 측정되었다(도 1a).
B. HSV-1 티미딘 키나제(TK)/간시클로버(GCV) 조합 : 다양한 바이러스 벡터로 형질도입된 HeLa 세포주는 72시간 동안 GCV로 처리되었고, 생존한 세포의 백분율이 측정되었다(도 1b 참조). CXSN = 비어있는 바이러스 벡터, CTKSN = TK 양성 바이러스, CTKmSN = TK 돌연변이 바이러스, CTKtatSN = 활성의 TK 유전자의 HIV-1 tat 유전자 ORF 하류를 포함하는 벡터(도 4d), CTKenvSN = 활성의 TK 유전자의 HIV-1 env 유전자 ORF 하류를 포함하는 벡터(도 4d). CXSN은 pHIT111로부터의 lac Z 유전자를 제거함으로서 생성된다. C = 5' U3에 위치하는 CMV 프로모터, X = 관심있는 유전자의 클로닝 사이트, S = SV40 프로모터 및 N = 네오마이신 저항성 유전자. Tk = 티미딘 키나제, Tkm = 티미딘 키나제 돌연변이.
이들 결과는 더 좋은 민감성이 TK/GCV 시스템에서 수득될 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나 TK/GCV는 방관자 효과를 생산한다. 일반적으로 사용된 약물은 방관자 효과, 즉 프로드러그를 활성화시키는 효소를 발현하는 세포를 둘러싸서 세포의 사멸을 유발시키면 안된다. 방관자 효과는 플라스마 막을 교차하고 주위 세포로 진입하거나 갭 정션을 통해 다른 세포로 진입하는 프로드러그의 활성적 형태에 기인한다. GCV의 경우 방관자 효과는 갭 정션을 통한 약물의 교차에 의해 유발된다. 다행히 이러한 갭 정션은 약물 딜드린에 의해 봉쇄될 수 있고, 따라서 방관자 효과를 제한할 수 있다(Touraineet al., 1998).
도 2는 상기에 기술된 2개의 효소/프로드러그 시스템의 방관자 효과를 나타낸 것이다. 도 2a에서 HT1080 NTR 양성 안정 세포주는 10mM MTZ의 존재하에 24시간 동안 HI1080 세포와 동시-인큐베이트되었다. 도 2b에서 HeLa TK 안정 세포주는 딜드린(16㎍/ml) 존재 및 부재시 72시간 동안 GCV를 지닌 HeLa 세포와 동시-인큐베이트되었다.
이러한 데이터로부터 TK/GCV 방관자 효과가 딜드린을 사용함으로서 최소화될 수 있다는 것이 분명해졌다.
따라서 세포가 효소를 지니는지 여부를 구분하는데 TK/GCV가 더욱 민감하기 때문에(도 1a, 1b) 방관자 효과를 나타내지 않는 NTR/메트로니다졸(MTZ) 존재시의 HSV-1 TK/GCV/딜드린을 이용하는 것을 선택하였다. 본 연구에 사용된 GCV의 양은 도 1로부터 결정된 3㎍/ml이다.
(실시예 2) 해머머리 모양의 리보자임을 이용한 생체 내의 선택
해머머리 모양의 리보자임의 라이브러리는 무작위 올리고뉴클레오타이드 합성에 의해 생성된다. 그 후 이들은 다수의 효소를 생성하는 불활성의 TK 코딩 서열의 CTKmSN (도 4b) 하류 내로 삽입된다(CTKmRzLB - 도 4c).
CTKmSN(도 4b)는 중간 구조물 CKSN(도 4a)를 생성하는 pHIT111의 lacZ를 제거하고(Soneokaet al., 1995), 그 후 그의 위치 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이(BsP EI 사이트에서의 절단 및 재충전)에 의해 구조된 불활성 TK 코딩 서열 내로 삽입함으로서 구조되었다. 인간 헤르페스 바이러스 1의 서열은 Wagneret al., 1981(유전자은행 수탁번호: V00467) 내에 제공된다.
효소의 불활성 형태의 라이브러리 하류의 삽입은 RNA을 포함하는 TK를 절단하는(따라서 선택에서 펄스 양성을 이끄는) 어떤 리보자임도 벡터 라이브러리 내에 포함되지 않는다는 것을 확신하기 위해 필요하다. 바이러스는 3개의 플라스미드 동시-세포감염 시스템에 의해 생성되었고(Soneokaet al., 1995), HeLa 세포를 형질도입하는데 사용되었다. 돌연변이의 활성은 GCV에 노출된 후의 세포 생존을 측정함으로서 결정되었다.
X = 타겟 서열인 CTKXSN(도 4c)를 생성하기 위해 타겟 RNA 서열은 효소의 활성 형태 하류의 바이러스 벡터 CTKSN(도 4b) 내로 삽입되었다. CTKSN은 CXSN 내로 TK 서열을 삽입시킴으로서 생성된다(도 4a). 3개의 플라스미드 동시-세포감염 후, 바이러스는 NIH3T3, HeLa와 같은 세포 또는 다른 세포를 형질도입하는데 사용된다. HeLa 세포는 방관자 효과를 최소화하기 위해 선택되었다(HeLa 세포는 갭-정션의 커뮤니케이션(communication)의 낮은 백분율을 지니고, GCV의 방관자 효과는 갭 정션을 통한 단일인산염 구아노신 아날로그의 트랜스미션(transmission)에 기인한다). 또한 딜드린은 방관자 효과를 최소화하는데 사용되었다.
안정한 세포주는 네오마이신 선택에 의해 생성된다(G418, 10일 동안 1mg/ml). 이들 세포주는 리보자임 라이브러리(CTKmRxLB)를 포함하는 벡터로 형질도입될 수 있고, GCV 선택이 뒤따라 행해진다. HIV 서열을 절단하는 리보자임은 TK의 번역을 방지할 것이고, 따라서 세포는 생존할 것이다. 다른 모든 세포는 기능적 TK를 보유하기 때문에 사멸할 것이다. 그 후 PCR은 리보자임 서열을 성립하는데 사용될 수 있다.
(실시예 3) 최적화된 리보자임을 이용한 생체 내에서의 시험
실시예 1에 따라 수득된 최적화된 리보솜은 질병 치료에 사용된다. 특히 많은 이들 리보자임은 많은 사이트를 타겟팅하는 것을 가능하게 하는데 이용된다. 더욱이 HIV 치료시 HIV 벡터는 이것은 야생형 게놈의 팩키지를 방해하는 것을 유발하기 때문에 리보자임을 전달하는데 사용될 수 있다.
이러한 접근의 시행 가능성을 시험하기 위해 tat 안정 세포주 상에서 안티-tat 리보자임을 시험하였다. 도 3에 나타난 바와 같이 기능적 리보자임을 포함하는 세포를 선택하는 것이 가능하다. 또한 이러한 선택을 수행할 수 있도록 방관자 효과가 제거되어야 한다는 것이 분명하다.
이러한 기술은 HIV 게놈의 모든 부분에 특이적인 리보자임을 찾는데 사용될수 있다. 더욱이 이러한 방법은 RNA 타겟을 위한 생체 내에서의 관련된 리보자임을 분리하는 수단을 제공한다.
(참조 실시예 1) 리보자임을 운반하는 게놈의 구조
HIVgag.pol서열은 코돈 최적화되었고(도 8 및 서열번호: 1), 약 40 뉴클레오타이드의 겹친 올리고스(oligos)를 이용하여 합성되었다. 이는 3가지의 장점을 지닌다. 첫 번째로 이는 HIV 기초 벡터가 리보자임 및 다른 치료적 인자를 운반하는 것을 가능하게 한다. 두 번째로 코돈 옵티미세이션은 유전자 발현의 더 높은 수준에 기인한 더 높은 벡터 적정량을 생성한다. 세 번째로gag.pol발현은 안티-rev또는 RRE 인자의 이용을 가능하게 하는rev독립적이 되게 한다.
gag.pol 내의 보존된 서열은 로스앤젤레스 국립 연구소(http://hiv-web.
lanl.gov/)의 HIV 서열 데이터베이스를 참조하여 증명되었고, 리보자임을 디자인하는데 이용되었다. HIV-1의 서브타입(subtype) 사이의 변이성 때문에 리보자임은 북아메리카, 라틴 아메리카 및 캐리브해, 유럽, 일본 및 오스트레일리아 내에서 우세한 서브타입을 분열하도록 고안되었다 ; 즉 서브타입 B이다. 선택된 사이트는 코돈 최적화된 gagpol mRNA를 절단하는 가능성이 낮다는 것을 확신하기 위해 합성gagpol서열과 교차-참조되었다. 리보자임은 각각 5' 및 3' 말단에서 XhoI 및 SalI 사이트와 함께 디자인되었다. 이는 개별적 및 일련의 리보자임의 구조를 가능하게 한다.
리보자임은 하기의 일반적 구조의 해머머리 모양의 구조이다 :
Helix Ⅰ Helix Ⅱ Helix Ⅲ
5'-NNNNNNNN∼ CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA ∼NNNNNNNN∼
리보자임(Helix Ⅱ)의 촉매적 도메인은 촉매적 전도(turnover)를 감소시키지 않고 일부 변화에 내성이 있을 수 있다.
필수 GUX 트리플렉스(triplex)(X는 어떤 뉴클레오타이드이다)를 지닌 분열 사이트, 타겟팅gag및pol은 하기와 같다 :
GAG 1 5' UAGUAAGAAUGUAUAGCCCUAC
GAG 2 5' AACCCAGAUUGUAAGACUAUUU
GAG 3 5' UGUUUCAAUUGUGGCAAAGAAG
GAG 4 5' AAAAAGGGCUGUUGGAAAUGUG
POL 1 5' ACGACCCCUCGUCACAAUAAAG
POL 2 5' GGAAUUGGAGGUUUUAUCAAAG
POL 3 5' AUAUUUUUCAGUUCCCUUAGAU
POL 4 5' UGGAUGAUUUGUAUGUAGGAUC
POL 5 5' CUUUGGAUGGGUUAUGAACUCC
POL 6 5' CAGCUGGACUGUCAAUGACAUA
POL 7 5' AACUUUCUAUGUAGAUGGGGCA
POL 8 5' AAGGCCGCCUGUUGGUGGGCAG
POL 9 5' UAAGACAGCAGUACAAAUGGCA
리보자임은 4개의 다른 HIV 벡터 내로 삽입되었다(pH4 (Gervaixet al., 1997), pH6, pH4.1 or pH6.1)(도 5). pH4 및 pH6에서 리보자임의 전사는 내생적 HCMV 프로모터에 의해 이루어진다(Foecking and Hofstetter, 1986). pH4.1 및 pH6.1로부터 리보자임은 5' LTR로부터 발현된다. pH4와 pH6 사이( 및 pH4.1과 pH6.1 사이)의 주요한 차이가 생성 플라스미드 내의 3' LTR 내에 존재한다. HCMV 프로모터는 대부분의 U3을 대치하고, 높은 구성적(constitutive) 수준으로 발현을 이끌 것인 반면, HIV-1 U3은 Tat의 존재시에만 높은 수준의 발현을 지지할 것이다.
HCMV/HIV-1 하이브리드 3' LTR은 3개의 PCR 프라이머로의 재조합 PCR에 의해 생성된다(도 6). PCR의 첫 번째 라운드(round)는 HIV-1 HXB2 서열 8900-9123을 증폭하는 주형으로서 pH4(Kimet al., 1998)를 이용하여 RIB1 및 RIB2와 함께 수행된다. PCR의 두 번째 라운드는 pH4로부터의 하이브리드 5'LTR을 증폭시킴으로서 HIV-1 U3의 5' 말단과 HCMV 프로모터 사이에 정션을 생성한다. 첫 번째 PCR 반응및 RIB3으로부터의 PCR 생성물 각각 5' 프라이머 및 3' 프라이머로 작용한다.
RIB1 : 5' - CAGCTGCTCGAGCAGCTGAAGCTTGCATGC - 3'
RIB2 : 5' - GTAAGTTATGTAACGGACGATATCTTGTCTTCTT - 3'
RIB3 : 5' - CGCATAGTCGACGGGCCCGCCACTGCTAGAGATTTTC - 3'
그 후 PCR 생성물은SphI 및SalI으로 절단되고, pH4 내로 삽입되고, 따라서 3' LTR을 대치한다. 결과 플라스미드는 pH6으로 명시된다. pH4.1 및 pH6.1을 구조하기 위해 pH4 및 pH6 내의 내생적 HCMV 프로모터(SpeI -XhoI)는 pBluescriptⅡ KS+(Stratagene)(SpeI -XhoI)의 폴리클로닝(polycloning) 사이트로 대치된다.
리보자임은 게놈 벡터 골격(backbone) 내의XhoI 사이트 내로 삽입된다. 어떤 형상 내의 어떤 리보자임도 유사한 방법으로 이용될 수 있다.
(참조 실시예 2) 팩키지 시스템의 구조
팩키지 시스템은 다양한 형태를 사용할 수 있다. 팩키지 시스템의 첫 번째 형태에서 HIV gag, pol 구성 성분은 HIV env 코딩 서열과 함께 동시-발현된다. 이러한 경우 gag, pol 및 env 코딩 서열 모두 변화하여 게놈 내로 조립되는 안티-HIV 리보자임에 저항적이 된다. 저항성을 달성하는 코돈 용법의 변화와 동시에코돈은 가장 높게 발현된 포유류 유전자의 용법 패턴을 매치(match)시키는데 선택될 수 있다. 이는 발현 수준을 극적으로 증가시키고(Schneideret al., 1997; Schwartzet al., 1992), 적정량도 증가시킨다. 코돈 최적화 HIV env 코딩 서열은 Haaset al.,(1996)에 의해 기술되었다. 본 실시예에서 변형된 코돈 최적화 HIV env 코딩 서열이 사용되었다(서열번호: 3). 상응하는 env 발현 플라스미드는 pSYNgp160mn으로 명시된다. 변형된 서열은 Haaset al.에 의해 이용되지 않은 여분의 모티프를 포함한다. 여분의 서열은 균주 MN 및 최적화된 코돈의 HIV env 서열로부터 취해진다. 핵산 서열의 유사한 변형은 이것이 풍부한 tRNAs에 상응하는 코돈을 사용하는 한(Zolotukhinet al., 1996) 유사하게 기능하고, 게놈 내에서의 리보자임에 정항성을 나타내게 한다.
최적화된 코돈 용법을 지닌 gag, pol 코딩 서열의 하나의 예에서 겹치는 올리고뉴클레오타이드가 합성되고, 그 후 함께 결찰되어 합성 코딩 서열을 생성한다. 야생형 서열(유전자은행 수탁번호 K03455) 및 합성(gagpol-SYNgp) gagpol 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2에 나타나 있고, 그들의 코돈 용법은 각각 도 7 및 도 8에 나타나 있다. 야생형 env 코딩 서열의 서열(유전자은행 수탁번호 M17449)은 서열번호 3에 나타나 있고, 합성적 코돈 최적화 서열의 서열은 서열번호 4에 나타나 있고, 그들의 코돈 용법표는 각각 도 9 및 도 10에 나타나 있다. env 코딩 서열과 함께 리보자임에의 저항성을 달성한 어떤 gag, pol 서열도 사용될 수 있다. 나타낸 합성 서열은 gag, pol-SYNgp로 명시되고, 5' 말단에서EcoRI 사이트를 지니고, 3' 말단에서Not1 사이트를 지닌다. 이는 플라스미드 pSYNgp를 생성하는 pClneo(Pormega) 내로 삽입된다.
팩키지 시스템의 두 번째 형태에서 합성 gag, pol 카세트는 HIV룰 슈도타입(pseudotype)하는 표면 단백질을 생산하는 비-HIV 외피 코딩 서열과 함께 동시발현된다. 이는 예로 VSV-G(Oryet al., 1996; Zhuet al., 1990), 암포트로픽(amphotropic) MLV env(Chesebroet al., 1990, Spectoret al., 1990) 또는 HIV 입자 내로 통합되는 또 다른 단백질(Valsesia Wittmannet al., 1994)이 될 수 있다. 이는 벡터를 특정한 조직으로 타겟하는 것이 가능한 분자를 포함한다. 리보자임에 의해 분열되지 않고 따라서 어떤 서열 변형도 나타내지 않는 비-HIV 외피 단백질을 위한 코딩 서열이 필요시 된다(일부 서열 변형이 포유류 세포 내에서의 코돈 옵티미세이션과 같은 다른 이유에 바람직하더라도).
(참조 실시예 3) 벡터 입자 생성
벡터 입자는 Soneokaet al. (1995)에 의해 기술된 것과 유사한 일시적인 3개-플라스미드 세포감염 시스템 또는 다른 레트로바이러스 벡터에 이용되는 것과 유사한 생산자 세포주(Oryet al., 1996; Srinivasakumaret al., 1997; Yuet al., 1996)로부터 생성될 수 있다. 이들 원리는 도 11 및 도 12에 나타나 있다. 예를 들어 Soneokaet al. (1995)에 의해 기술된 바와 같이 293T 세포의 3개의 플라스미드 세포감염에서 pH6Rz, pSYNgp 및 pRV67(VSV-G 발현 플라스미드)을 이용함으로서(도 12) H6Rz-VSV로 명시된 벡터 입자가 생성된다. 이들은 C1866 또는 Jurkat과 같은 CD4+ 세포로 H6Rz를 형질도입하고, 멀티타겟(multitarget) 리보자임을 생성한다. 이들 세포 내에서의 HIV 복제는 매우 제한된다.
상기 명세서 내에 기술된 모든 출판물은 참조문헌에 나타나 있다. 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 의도에 위배됨이 없이 당 분야의 숙련자에게 분명할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 관계되어 기술되었더라도 청구된 본 발명은 이러한 특정한 실시태양에 한정되면 안된다. 사실상 분자생물학 및 관련 분야의 숙련자에게 분명한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방식의 다양한 변형은 하기의 청구범위 내에 있다.
(참고문헌)
Claims (22)
- ⅰ) 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 전사 생성물에 결합가능하고, 이의 분열에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 ;상기 뉴클레오타이드 서열에 결합하는데 필요한 첫 번째 뉴클레오타이드 서열의 구역은 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 내에서 이형적임 ; 및ⅱ) (a) mRNA 안정성 및/또는 번역에 필요한 서열에 실시가능하게 연결된 검출가능한 마커를 인코딩하는 코딩 구역 ; 및(b) 코딩 구역과 mRNA 안정성 및/또는 번역에 필요한 적어도 하나 이상의 서열 사이에 위치한 세 번째 뉴클레오타이드 서열 ;로 구성된 두 번째 뉴클레오타이드 서열 ;상기 (a) 및 (b)는 숙주 세포 내에서 인접한 RNA 분자로서 (a) 및 (b)의 발현을 지시할 수 있는 조절적 서열에 실시가능하게 연결됨 ;로 구성된 생체 내에서 이용하기에 적당한 선택 시스템
- ⅰ) 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 전사 생성물에 결합가능하고, 이의 분열에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열로 각각의 벡터가 독립적으로 구성된 다수의 벡터;상기 뉴클레오타이드 서열에 결합하는데 필요한 첫 번째 뉴클레오타이드 서열의 구역은 다수의 벡터 내에서 이형적임 ; 및ⅱ) (a) mRNA 안정성 및/또는 번역에 필요한 서열에 실시가능하게 연결된 검출가능한 마커를 인코딩하는 코딩 구역 ; 및(b) 코딩 구역과 mRNA 안정성 및/또는 번역에 필요한 적어도 하나 이상의 서열 사이에 위치한 세 번째 뉴클레오타이드 서열 ;로 구성된 두 번째 뉴클레오타이드 서열 ;상기 (a) 및 (b)는 숙주 세포 내에서 인접한 RNA 분자로서 (a) 및 (b)의 발현을 지시할 수 있는 조절적 서열에 실시가능하게 연결되고,상기 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 다수의 벡터 내에 또는 개별적 벡터의 일부분으로서 존재함 ;로 구성된 벡터 시스템
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 유전자 생성물은 리보자임, 안티-센스 리보핵산 및 외생적 가이드 서열로부터 선택됨을 특징으로 하는 시스템
- 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터임을 특징으로 하는 시스템
- 제 4항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터임을 특징으로 하는 시스템
- 상기한 어느 한 항에 있어서, 상기 검출가능한 마커는 선택가능한 마커임을 특징으로 하는 시스템
- 제 6항에 있어서, 상기 선택가능한 마커는 프로드러그를 세포독성적 화합물로 전환가능한 효소임을 특징으로 하는 시스템
- 제 7항에 있어서, 상기 효소는 티미딘 키나제(thymidine kinase)이고, 상기 프로드러그는 간시클로버(gancyclovir)임을 특징으로 하는 시스템
- 상기한 어느 한 항에 있어서, 상기 세 번째 뉴클레오타이드 서열은 두 번째뉴클레오타이드 서열의 3' 및/또는 5' 비번역된 구역 내에 존재함을 특징으로 하는 시스템
- 제 1항에 따른 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 및/또는 제 1항에 따른 두 번째 뉴클레오타이드 서열로 각각 구성된 다수의 바이러스 입자
- ⅰ) 제 1항 내에서 정의된 바와 같은 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 및 ⅱ) 제 1항 내에서 정의된 바와 같은 두 번째 뉴클레오타이드 서열을 생산자 세포 내로 도입시키는 것으로 구성된, 제 10항에 따른 다수의 바이러스 입자를 생성하기 위한 방법
- 제 11항의 방법에 의해 생성된 다수의 바이러스 벡터
- ⅰ) 하나 이상의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열을 제 1항에서 정의된 바와 같은 두 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된 숙주 세포 내로 도입하고 ;ⅱ) 검출가능한 마커가 숙주 세포 내에서 활성적 형태로 발현되지 않을 경우숙주 세포를 선택하고 ; 선택적으로는ⅲ) 첫 번째 뉴클레오타이드 서열을 분리하고, 그의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 :것으로 구성된, 제 1항 내에서 정의된 바와 같이 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 전사 생성물에 결합가능하고, 이의 분열에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열로부터 선택하기 위한 방법
- 제 13항에 있어서, 상기 (ⅱ) 단계에서 검출가능한 마커는 선택가능한 마커이고, 숙주 세포는 선택가능한 마커의 존재시 세포독성적인 화합물과 접촉함을 특징으로 하는 방법
- 제 14항에 있어서, 선택가능한 마커는 티미딘 키나제이고, 화합물은 간시클로버임을 특징으로 하는 방법
- 제 13항 내지 제 15항의 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 마커를 인코딩하는 코딩 구역에 결합가능하고, 이의 분열에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미칠수 있는 유전자 생성물을 인코딩하는 첫 번째 뉴클레오타이드 서열(들)을 제거하는 선택 단계로 더욱 구성됨을 특징으로 하는 방법
- 제 16항에 있어서, 상기 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 내의 각각의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 검출가능한 마커의 불활성 변이체를 인코딩하는 네 번째 뉴클레오타이드 서열의 하류에 위치함을 특징으로 하는 방법
- 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 상기 다수의 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 검출가능한 마커의 불활성 변이체를 인코딩하는 네 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된 다수의 바이러스 벡터 내에 존재하고, 선택 단계에서 다수의 벡터는 하나 이상의 생산자 세포 내로 도입되고, 결과적 감염성 바이러스 입자는 두 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된 생산자 세포 내로 첫 번째 뉴클레오타이드 서열을 도입하는 (ⅰ) 단계에서 이용됨을 특징으로 하는 방법
- 제 13항 내지 제 18항의 어느 한 항에 의한 방법에 의해 수득된 첫 번째 뉴클레오타이드 서열
- 제 19항에 따른 첫 번째 뉴클레오타이드 서열로 구성된 레트로바이러스 벡터
- 치료에 이용하기 위한 제 19항에 따른 첫 번째 뉴클레오타이드 서열
- 제 1항 내지 제 19항의 어느 한 항에 따른 선택 시스템을 이용한 mRNA 분자 상의 오픈 사이트를 증명하기 위한 방법
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