JP2003501070A - 阻害性ＲＮＡ分子を決定するためのｉｎｖｉｖｏでの選択方法 - Google Patents

阻害性ＲＮＡ分子を決定するためのｉｎｖｉｖｏでの選択方法

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キム，ナリー
コツォポウロウ，エカテリーニ
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オックスフォード バイオメディカ（ユーケイ）リミテッド
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Abstract

(57)【要約】 ｉｎ ｖｉｖｏで使用するのに適した選択システムであって、ｉ）ヌクレオチド配列に結合するのに必要な第１のヌクレオチド配列の領域が、複数の第１のヌクレオチド配列内で異種であるヌクレオチド配列またはその転写産物に結合して、その直接的または間接的な切断を実行することができる遺伝子産物をコードする複数の第１のヌクレオチド配列と、ｉｉ）（ａ）ｍＲＮＡの安定性および／または翻訳に必要な配列に作動可能に連結された検出可能なマーカーをコードするコード領域と、（ｂ）該コード領域およびｍＲＮＡの安定性および／または翻訳に必要な該配列の少なくとも１つとの間に配置された第３のヌクレオチド配列とを含み、宿主細胞での、隣接するＲＮＡ分子としての（ａ）および（ｂ）の発現を指令することができる制御配列に、（ａ）および（ｂ）が作動可能に連結された第２のヌクレオチド配列とを含む選択システムを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 ［発明の分野］ 本発明は、最適な阻害性ＲＮＡ分子を選択するためのｉｎ ｖｉｖｏの方法に
関する。
【０００２】 ［発明の背景］ 標的核酸配列の転写および／または翻訳を阻害するために、阻害性ＲＮＡ分子
を使用することには、かなりの関心がある。阻害性ＲＮＡ分子は、ヌクレオチド
配列、またはその転写産物に結合して、その直接的または間接的な切断を実行で
きる可能性がある。例としては、リボザイム（標的配列を直接切断することがで
きる）、外部ガイド配列（ＥＧＳ）およびアンチセンスまたはセンスＲＮＡ（他
の因子によって切断を生じさせることができる）などが挙げられる。
【０００３】 残念ながら、ｍＲＮＡが複雑な二次構造を有するため、このような技術の利用
は困難と直面してきた。現在、あらゆる位置を標的として試してみる以外に、オ
ープンなまたは利用できるｍＲＮＡ内の部位の位置を予測することは不可能であ
る。
【０００４】 これらのオープン領域の探索に使用される１つのこのようなアプローチは、Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ（１９９７）およびＭｉｌｎｅｒ（１９９７）により記載された
ｉｎ ｖｉｔｒｏ「オリゴヌクレオチドアレイ法」である。しかし、これらの方
法は、多くの時間を必要とする個々の標的ｍＲＮＡに特有のアレイの作成を含む
。さらに、非生理学的条件でヘテロ二重鎖の形成が行われる。このことは、ｍＲ
ＮＡが５’末端および３’末端の両者にて会合した多数のタンパク質を有すると
考えられる場合には、特に問題が多い。
【０００５】 従って、「ｉｎ ｖｉｖｏ」での選択方法を使用して、正常な生理学的状況で
オープンなｍＲＮＡ部位を発見することは有利であろう。さらに、本発明の方法
はいちいち特定の選択方法の力に頼ることなく、このようにして全てのＲＮＡ分
子を走査することが可能なため、一般に有用である。
【０００６】 ［発明の概要］ 従って、本発明の目的は、所与のＲＮＡ配列を効率よく標的化する阻害性ＲＮ
Ａ分子を識別するためのｉｎ ｖｉｖｏでの選択方法を提供することにある。
【０００７】 本発明者は、標的配列および検出可能なマーカーが、細胞において、隣接する
ＲＮＡ分子として発現されるように、検出可能なマーカーに作動可能に連結され
た標的配列を発現する細胞を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで阻害性ＲＮＡ分子（例
えば、リボザイム）を選択できることを示した。
【０００８】 標的配列／検出可能なマーカーｍＲＮＡは、正常な５’キャップおよび３’ポ
リＡ尾部を含む。５’キャップまたは３’ポリＡ尾部が除去されると（例えば、
阻害性ＲＮＡ分子による標的配列の切断後）、そのｍＲＮＡは不安定になり、分
解される。これによって、検出可能なマーカー遺伝子の翻訳が妨げられる。
【０００９】 例えば、検出可能なマーカーが、プロドラッグを細胞障害性の化合物に転換す
ることができる酵素である場合、標的配列の切断によって、細胞はプロドラッグ
に対し非感受性になる。
【００１０】 検出可能なマーカー／標的遺伝子を発現する細胞を使用して、多数の阻害性Ｒ
ＮＡ分子をスクリーニングすることができる。特に、本発明者はこのような細胞
を使用して、各リボザイムが異なる特異性領域を有するベクターのライブラリー
をスクリーニングした。プロドラッグ耐性細胞は活性なリボザイムを含み、次い
で、その配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の技術を使用して決定するこ
とができる。
【００１１】 従って、本発明は、（ｉ）ヌクレオチド配列、またはその転写産物に結合して
、その直接的または間接的な切断を実行することができる遺伝子産物をコードす
る複数の第１のヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列への結合に必要
な該第１のヌクレオチド配列の領域が、その複数の第１のヌクレオチド配列内で
異種である複数の第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）（ａ）ｍＲＮＡの安定性
および／または翻訳に必要な配列に作動可能に連結された検出可能なマーカーを
コードするコード領域と、（ｂ）該コード領域と、ｍＲＮＡの安定性および／ま
たは翻訳に必要な配列の少なくとも１つとの間に配置された第３のヌクレオチド
配列とを含み、宿主細胞での、隣接するＲＮＡ分子としての（ａ）および（ｂ）
の発現を指令することができる制御配列に、（ａ）および（ｂ）が作動可能に連
結されている第２のヌクレオチド配列とを含む、ｉｎ ｖｉｖｏで使用するのに
適した選択システムを提供する。
【００１２】 本発明は、（ｉ）複数のベクターであって、各ベクターが、ヌクレオチド配列
、またはその転写産物に結合して、その直接的または間接的な切断を実行するこ
とができる遺伝子産物をコードする第１のヌクレオチド配列を独立に含み、該ヌ
クレオチド配列に結合するのに必要な第１のヌクレオチド配列の領域がその複数
のベクター内で異種である複数のベクターと、（ｉｉ）（ａ）ｍＲＮＡの安定性
および／または翻訳に必要な配列に作動可能に連結された検出可能なマーカーを
コードするコード領域と、（ｂ）該コード領域と、ｍＲＮＡの安定性および／ま
たは翻訳に必要な配列の少なくとも１つとの間に配置された第３のヌクレオチド
配列とを含み、宿主細胞での、隣接するＲＮＡとしての（ａ）および（ｂ）の発
現を指令することができる制御配列に、（ａ）および（ｂ）が作動可能に連結さ
れている第２のヌクレオチド配列であって、複数のベクター内に存在するかまた
は別個のベクターの一部として存在する第２のヌクレオチド配列とを含む、ベク
ターシステムも提供する。
【００１３】 遺伝子産物は、リボザイム、アンチセンスリボ核酸および外部ガイド配列から
選択されることが好ましい。好ましくは、ベクターはウイルスベクターであり、
さらに好ましくは、レトロウイルスベクターである。
【００１４】 好ましくは、検出可能なマーカーは選択可能なマーカーであり、さらに好まし
くは、プロドラッグを細胞障害性の化合物に転換することができる酵素である。
特に好ましい実施形態において、酵素はチミジンキナーゼであり、プロドラッグ
はガンシクロビルである。
【００１５】 本発明は、複数のウイルス粒子であって、各ウイルス粒子が上記の第１のヌク
レオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列を含むウイルス粒子をさら
に提供する。
【００１６】 本発明は、前記複数のウイルス粒子を産生する方法も提供し、その方法は、プ
ロデューサー細胞に（ｉ）前記複数の第１のヌクレオチド配列および（ｉｉ前記
第２のヌクレオチド配列を導入するステップを含む。この方法で産生される複数
のウイルス粒子も提供する。
【００１７】 さらなる態様において、本発明は、前記複数の第１のヌクレオチド配列から、
第３のヌクレオチド配列またはその転写産物に結合してその直接的または間接的
な切断を実行することができる遺伝子産物をコードする第１のヌクレオチド配列
を選択する方法であって、（ｉ）１つ以上の第１のヌクレオチド配列を、上記の
第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞に導入するステップと、（ｉｉ）該宿主
細胞で、該検出可能なマーカーが活性な形で発現されない場合、該宿主細胞を選
択するステップと、任意選択的に、（ｉｉｉ）第１のヌクレオチド配列を単離し
、そのヌクレオチド配列を決定するステップとを含む方法を提供する。
【００１８】 好ましくは、ステップ（ｉｉ）において、検出可能なマーカーは選択可能なマ
ーカーであり、宿主細胞は選択可能なマーカーの存在下で細胞障害性であるプロ
ドラッグ等の化合物と接触している。さらに好ましくは、選択可能なマーカーは
チミジンキナーゼであり、プロドラッグはガンシクロビルである。
【００１９】 好ましい実施形態において、この複数の第１のヌクレオチド配列における各第
１のヌクレオチド配列は、検出可能なマーカーをコードするコード領域に結合し
てその切断を実行することができる遺伝子産物をコードする第１のヌクレオチド
配列が除去されるように、検出可能なマーカーの不活性な変異型をコードする第
４のヌクレオチド配列の下流に位置する。
【００２０】 本発明の特に好ましい態様では、複数の第１のヌクレオチド配列が、複数のウ
イルスベクター中に存在し、上記ウイルスベクターが、検出可能なマーカーの不
活性な変異型をコードする第４のヌクレオチド配列を含み、予備ステップとして
、複数のベクターが１つまたは複数のプロデューサー細胞に導入され、結果とし
て得られた伝染性ウイルス粒子が、ステップ（ｉ）で、第１のヌクレオチド配列
を、第２のヌクレオチド配列を含むプロデューサー細胞に導入するのに使用され
る。
【００２１】 本発明は、別の態様で、本発明の前記方法で得られる第１のヌクレオチド配列
を提供する。このような第１のヌクレオチド配列を治療において使用することが
できる。
【００２２】 さらなる態様では、本発明は、本発明の第１の態様による選択システムを使用
して、ＲＮＡ分子上のオープン部位を識別する方法を提供する。
【００２３】 ［発明の詳細な説明］ ［Ａ．選択システム成分］ ［（ｉ） 阻害性ＲＮＡ分子をコードする複数の第１のヌクレオチド配列］ 本発明の選択システムの第１の成分は、阻害性ＲＮＡ分子をコードする複数の
ヌクレオチド配列である。阻害性ＲＮＡ分子は、その配列に結合することにより
核酸配列の転写および／または翻訳を阻害することができるリボ核酸であると定
義される。一般に、阻害性ＲＮＡ分子は、ヌクレオチド配列、またはその転写産
物に結合して、直接的または間接的にその切断を実行することができる。例とし
ては、リボザイム（直接切断する）、外部ガイド配列（ＥＧＳ）およびアンチセ
ンスまたはセンスＲＮＡ（他の因子によって切断を生じさせる）などが挙げられ
る。
【００２４】 選択工程のための様々な配列を作製するためには、阻害性ＲＮＡ分子をコード
するこの複数の第１のヌクレオチド配列は、実質的に異種である。従って、標的
ヌクレオチド配列への結合に必要な阻害性分子の少なくともその部分は異なる。
触媒活性、構造的完全性および標的ヌクレオチド配列を分解させる細胞成分との
相互作用に必要な配列は変化していないことが好ましい。しかし、阻害性ＲＮＡ
分子配列の至る所に、ランダムに変更を加える突然変異誘発技術によって、ライ
ブラリーを作ることが便利であろう。これは、アンチセンスＲＮＡ構築物および
センスＲＮＡ構築物の場合、いずれの場合にも概して望ましい。リボザイムおよ
びＥＧＳ配列に関しては、ランダムに合成されたオリゴヌクレオチドを使用し、
次いでリボザイムまたはＥＧＳ構築物の適切な位置に結合させることによってラ
イブラリーを作成することが好ましい。その結果、特異性に必要な領域は変化す
るが、他の機能的ドメインは一般に一定であるリボザイム／ＥＧＳ構築物のライ
ブラリーが得られる。
【００２５】 例として、ランダムヌクレオチドで挟まれたハンマーヘッドリボザイムの、保
存された酵素ヘリックスを含むオリゴヌクレオチドを構築することによって、ラ
ンダムリボザイムライブラリーを作成することができる。フランキング配列は、
認識領域をリボザイムに提供する。各フランキング配列の長さは様々であっても
よいが、８ヌクレオチドが適当な長さである。この長さは、およそ１６4（６５
５３６）の異なる分子という複雑さを与える。
【００２６】 本発明に従って使用するのに適した第１のヌクレオチド配列は、結果として、
標的ヌクレオチド配列（一般にリボヌクレオチドである）の切断および／または
酵素分解を生じさせる遺伝子産物をコードする。個々の例として、リボザイム、
外部ガイド配列およびアンチセンス配列について述べる。
【００２７】 リボザイムは、ＲＮＡを特異的部位で切断するＲＮＡ酵素である。リボザイム
切断部位を含む選択された配列に特異的であるようにリボザイムを構築すること
ができる。従って、選択された認識部位を、転写されたウイルス配列中に有する
リボザイムを工作することができる。例として、第１のヌクレオチド配列により
コードされたリボザイムは、パッケージング成分およびｍＲＮＡゲノム等の、ウ
イルス粒子の産生に必要なウイルスゲノムの必須エレメントを認識して切断する
。従って、レトロウイルスゲノムの場合、このような必須エレメントは、ｇａｇ
、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物、ならびにウイルスのｍＲＮＡゲノムを含む。
ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子配列、またはもっと一般的には、これらの遺
伝子から転写されたＲＮＡ配列の少なくとも１つを認識することができる適当な
リボザイムは、このような配列に結合して切断することができる。このことは、
ｇａｌ、ｐｏｌまたはｅｎｖタンパク質ならびにｍＲＮＡゲノムの産生を適宜減
少または妨害し、従って、レトロウイルス粒子の産生を減少または妨害する。リ
ボザイムは、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイムおよびデルタ肝炎
抗ゲノムリボザイムを含む幾つかの型に分類される。ここで使用するのに好まし
いのはハンマーヘッドリボザイムである。それは、一部には、そのサイズが比較
的小さいため、その標的切断部位の配列必要条件が最低限であるため、また、十
分に特性決定されているためである。現在、調査研究で最もよく使用されるリボ
ザイムはハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムである。
【００２８】 個々のリボザイムは、標的ＲＮＡにおける認識部位を認識して結合するモチー
フを有する。このモチーフは、１つまたは複数の「結合アーム」、一般に２つの
結合アームの形をとる。ハンマーヘッドリボザイムにおける結合アームは、Ｈｅ
ｌｉｘＩＩを挟む、フランキング配列ＨｅｌｉｘＩおよびＨｅｌｉｘＩＩＩであ
る。これらは、多様な長さであってもよく、通常は、それぞれ６〜１０ヌクレオ
チドであるが、それより短いことも長いこともある。フランキング配列の長さは
、切断速度に影響を及ぼし得る。例えば、フランキング配列におけるヌクレオチ
ド総数が２０から１２に減少すると、ＨＩＶ配列を切断するリボザイムの代謝回
転が１０倍高まることが知られている。ハンマーヘッドリボザイムにおけるリボ
ザイムＨｅｌｉｘＩＩの触媒モチーフは、標的ＲＮＡを切断部位と呼ばれる部位
で切断する。リボザイムが所与のＲＮＡを切断するか否かは、適切な切断部位を
含むリボザイムに合った認識部位の有無によって決定される。
【００２９】 各タイプのリボザイムは、それぞれの切断部位を認識する。ハンマーヘッドリ
ボザイム切断部位は、ヌクレオチド塩基トリプレットＧＵＸ（式中、Ｇはグアニ
ンであり、Ｕはウラシルであり、Ｘは任意のヌクレオチド塩基である）をすぐ上
流に有する。ヘアピンリボザイムは、切断部位ＢＣＵＧＮＹＲ（式中、Ｂはアデ
ニン以外の任意のヌクレオチド塩基であり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｙ
はシトシンまたはチミンであり、Ｒはグアニンまたはアデニンである）を有する
。ヘアピンリボザイムによる切断は、切断部位におけるＧとＮとの間で起こる。
【００３０】 アンチセンス技術は、当技術分野で周知である。アンチセンス配列が作用する
と考えられる１つの機序は、細胞タンパク質ＲＮＡｓｅＨの、標的配列／アンチ
センス構築物ヘテロ二重鎖への補充であり、これが、ヘテロ二重鎖の切断および
分解を招く結果となる。従って、アンチセンス構築物は、リボザイムと違って、
間接的に標的配列の切断／分解に導くと言うことができる。従って、本発明によ
れば、第１のヌクレオチド配列は、例えば、結果として生じるヘテロ二重鎖のＲ
ＮＡｓｅＨ分解の結果として、遺伝子の発現が抑制されるように、必須／パッケ
ージング成分をコードする遺伝子か、上記遺伝子から転写されたＲＮＡのいずれ
かに結合するアンチセンスＲＮＡをコードすることが可能である。アンチセンス
構築物が必須／パッケージング成分をコードする遺伝子の相補配列全体をコード
する必要はなく、一部で十分であろう。当業者であれば、適当なアンチセンス構
築物のデザインのしかたを容易に決定することができるであろう。
【００３１】 外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、相補的な標的配列に結合し、標的ＲＮＡ配列に
おいてループを形成するＲＮＡ配列であり、総体的な構造は、標的ＲＮＡ配列の
ＲＮＡｓｅＰが介在する切断に関する基質である。ＥＧＳが標的ＲＮＡにアニー
ルするときに生じる構造は、ｔＲＮＡ前駆体でみられるものに非常に似ている。
適当なＥＧＳをデザインすることにより、ＲＮａｓｅＰの自然活性を、標的ＲＮ
Ａの切断に向けることができる。図１３に示す一般的なＥＧＳに関して、ＥＧＳ
デザインに関する一般規則は以下の通りである。
【００３２】 ［哺乳類細胞におけるＥＧＳ設計に関する規則（図１３参照）］ ［標的配列］ 全てのｔＲＮＡ前駆体分子はＲＮａｓｅＰ切断部位の３’に直に
接してＧを有する（すなわち、Ｇは、ＡＣＣＡ配列の前の、アクセプターステム
の先端のＣと塩基対を形成する）。さらに、全てのｔＲＮＡで、８ヌクレオチド
下流にＵが存在する（すなわち、１位にＧ、８位にＵ）。ピリミジンが切断部位
の好ましい５’と考えられる。他の特異的標的配列は、一般に必要ではない。
【００３３】 ［ＥＧＳ配列］ ７ヌクレオチドの「アクセプターステム」類似体が最適である
（５’ハイブリダイジングアーム）。４ヌクレオチド「Ｄ−ステム」類似体が好
ましい（３’ハイブリダイジングアーム）。この長さの変化によって、反応速度
が変わる可能性がある。これは、各標的部位に特異的である。コンセンサスＴス
テムおよびループ類似体は必須である。ＥＧＳ ＲＮＡの望ましくない折り畳み
の可能性を減少させるためには、最低限の５’および３’非対合配列が好ましい
。
【００３４】 「アンチコドンステムおよびループ」類似体の欠失が有益な可能性がある。可
変ループの欠失は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは許容できることもあるが、両者の欠失
に最適な置換ループは、ｉｎ ｖｉｖｏでは明確にされていない。さらなる指針
は、例えば、Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）；Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．（１９９８）；Ｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）およびＫａｗａ ｅｔ
ａｌ．（１９９８）を参照することによって得ることができる。
【００３５】 ヌクレオチド配列は、一般に、宿主細胞での阻害性ＲＮＡ分子の発現を可能に
する制御的制御配列に作動可能に連結された阻害性ＲＮＡ分子をコードする第１
のヌクレオチド配列をこのように含むベクター構築物の一部である。ウイルスベ
クター構築物を含む、ベクター構築物のさらなる詳細を、以下のセクションＢに
示す。
【００３６】 ［ｉｉ．レポーター構築物を含む第２のヌクレオチド配列］ 本システムにおける第２のヌクレオチド配列は、本質的にレポーター構築物の
役割を果たす。従って、第２のヌクレオチド配列は、検出可能なマーカーをコー
ドするコード領域を含む。検出可能なマーカーは、発現を検出することができる
遺伝子産物である。例としては、ｌａｃＺ．緑色蛍光タンパク質および選択可能
なマーカーなどが挙げられる。検出可能なマーカーは、蛍光活性化細胞選別（Ｆ
ＡＣＳ）を使用して選別できることが好ましい。
【００３７】 選択可能なマーカーは、一般に、その発現、または欠如が細胞の生存能力に影
響を及ぼす遺伝子産物である。従って、その例として、ネオマイシン等の抗生物
質に耐性の遺伝子を挙げることができる。特に好ましい例としては、直接に、ま
たはプロドラッグの毒性化合物への転換を介して、細胞に有毒な遺伝子産物など
が挙げられる。後者の一例は、ガンシクロビル等の化合物を細胞障害性化合物に
転換する酵素チミジンキナーゼである。従って、第２のヌクレオチド配列は、発
現されたとき、直接に、または外因的に添加された化合物の存在下で、細胞死を
引き起こすことによって細胞生存能力を低下させることができる遺伝子産物をコ
ードすることが好ましい。
【００３８】 第２のヌクレオチド構築物の重要な特徴は、コード領域に加えて、少なくとも
１つの第３のヌクレオチド配列が、コード配列の上流または下流のいずれかに存
在することである。その第３のヌクレオチド配列に対して、阻害性ＲＮＡ分子の
ライブラリーを試験することが望ましい。例えば、第３のヌクレオチド配列は、
ｇａｇ．ｐｏｌ配列の全部または一部をコードする配列等の、レトロウイルス成
分等のウイルス成分であってもよい。検出可能なマーカーコード配列の上流また
は下流のいずれかに第３のヌクレオチド配列が存在することは、第１のヌクレオ
チド配列によりコードされる阻害性ＲＮＡ分子の１つが第３のヌクレオチド配列
またはその転写産物に結合する場合、結果として生じる相互作用は、検出可能な
マーカーの発現を減少させるか阻害するように、第２のヌクレオチド配列の転写
を妨害し且つ／または第２のヌクレオチド配列から産生されるｍＲＮＡの安定性
を低下させることを意味する。チミジンキナーゼの場合、ＴＫ発現の阻害により
、細胞のガンシクロビルに対する感受性が除去される。その結果として、生き残
った細胞は、ガンシクロビルの存在下で、細胞死を引き起こすのに十分なＴＫを
発現しない。ＴＫ／ガンシクロビルを使用するとき、接合部を経て隣接する細胞
内に入る細胞障害性化合物による巻き添え効果（bystander effect）を最小限に
抑えるために、ジエルドリンも投与することが好ましい。巻き添え効果を有する
他の細胞障害性化合物にも、同様の考察が該当する。
【００３９】 従って、第３のヌクレオチド配列は、コード配列と、ｍＲＮＡの安定性および
／または翻訳に必要な配列との間にあるように、コード配列を基準にして配置さ
れる。例えば、第３のヌクレオチド配列は、転写されたｍＲＮＡにおいて、５’
キャップのすぐ下流または３’ポリＡ尾部のすぐ上流になるように、配置されて
いてもよい。５’キャップおよび／またはポリＡ尾部に結合してその切断を引き
起こす阻害性阻害性ＲＮＡ分子は、残りのｍＲＮＡの分解を増進する。従って、
第３のヌクレオチド配列は、一般に、検出可能なマーカーをコードするｍＲＮＡ
の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／または３’非翻訳領域内に存在する。
【００４０】 第３のヌクレオチド配列は、それに対して効率よく作用する阻害性ＲＮＡ分子
を識別することが望まれるヌクレオチド配列であってもよい。従って、第３のヌ
クレオチド配列は、発現を阻害または減少させることが望ましい遺伝子産物の全
部または一部をコードする。このような遺伝子産物としては、発現が疾病と関連
した哺乳類細胞遺伝子産物などが挙げられる。あるいは、第３のヌクレオチド配
列は、病原性微生物の成分、特に、ＨＩＶを含む、レトロウイルス病原体等のウ
イルス病原体の成分をコードしてもよい。このような成分は、例えば、ｇａｇ．
ｐｏｌまたはｅｎｖまたは補助因子（accessory factor）を含んでもよい。
【００４１】 第１のヌクレオチド配列に関しては、セクションＢで論じる通り、１つまたは
複数の第３のヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列は、一般に、核酸
ベクターの一部である。
【００４２】 ［Ｂ．核酸ベクター］ 第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、一般に核酸ベクタ
ーに存在し、宿主細胞での第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配
列の発現を可能にする制御調節配列に作動可能に連結された同じ核酸ベクターで
あってもよく、異なる核酸ベクターであってもよい。
【００４３】 用語「作動可能に連結された」は、記載の成分を、所期の方式で作動させるこ
とができる関係にあることを意味する。コード配列に「作動可能に連結された」
制御配列は、調節配列と相容れる条件で、コード配列の発現が実現する方法で連
結されている。
【００４４】 調節配列により指令される転写レベルを、もっと転写修飾因子に応答するよう
にするために、調節配列を、例えば、さらなる転写制御エレメントの付加によっ
て修飾することも可能である。
【００４５】 以下に記載の通りに、本発明のベクターを、適当な宿主細胞に形質転換または
トランスフクションして、阻害性ＲＮＡ分子を発現させることが可能である。使
用される宿主細胞と相容れるベクターが選択される。
【００４６】 阻害性ＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結された調節配列としては
、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現制御シグナルなどがある。これら
の調節配列は、宿主細胞と相容れるように選択することが可能であり、それに合
わせて使用すべき発現ベクターが設計される。プロモーターという用語は、当技
術分野で周知であり、最低限のプロモーターから、上流のエレメントおよびエン
ハンサーを含むプロモーターまでの、サイズおよび複雑さの範囲の核酸を含む。
【００４７】 プロモーターは、一般に、哺乳類細胞において作動できるプロモーターから選
択されるが、昆虫細胞等の、他の真核細胞において作動できるプロモーターを使
用することも可能である。プロモーターは、一般に、ウイルス遺伝子または真核
遺伝子のプロモーター配列に由来する。例えば、プロモーターは、発現が起こる
細胞のゲノムに由来するプロモーターであってもよい。ウイルスのプロモーター
、例えば、ネズミモロニー白血病ウイルス長末端反復（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）プロ
モーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターまたはヒトサイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターを使用してもよい。
【００４８】 本発明の方法で使用されるベクターは、非ウイルス、例えば、プラスミド、染
色体または人工染色体であってもよい。代表的なトランスフクション方法として
は、エレクトロポレーション、ＤＮＡ微粒子銃、脂質媒介トランスフクション、
コンパクト化ＤＮＡ媒介トランスフクション、リポソーム、イムノリポソーム、
リポフェクチン、陽イオン性薬剤媒介、陽イオン性表面両親媒性物質（ＣＦＡ）
（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９６ １４； ５５６）、
およびそれらの組合わせなどがある。
【００４９】 あるいは、ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクター
としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、
ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター
、バキュロウイルスベクターなどがあるが、その限りではない。用語「ウイルス
ベクター」は、宿主細胞で転写されうるウイルスゲノムを含み、そのゲノムが、
パッケージング成分の存在下で、ウイルスＲＮＡゲノムを、標的細胞を感染させ
ることができるウイルス粒子内にパッケージングできるほど十分なウイルスの遺
伝情報を含むヌクレオチド構築物を指す。標的細胞の感染は、逆転写、および個
々のウイルスに適する場合、標的細胞ゲノム内への組み込みを含む。使用されて
いるウイルスベクターは、一般に、ベクターによって標的細胞（例えば阻害性リ
ボザイムをコードする第１のヌクレオチド配列）に送達されるべき異種コード配
列（関心のあるヌクレオチド）を担持する。ウイルスベクターは、最終的な標的
細胞内で自立複製して伝染性ウイルス粒子を産生することができない。
【００５０】 用語「ウイルスベクターシステム」は、ウイルス粒子産生に必要な他の成分と
組合わせて、宿主細胞でウイルス粒子を産生するときに使用することができる構
成要素のキットを意味するものとする。例えば、複数の第１のヌクレオチド配列
が、一般に、第１のヌクレオチド配列をウイルスゲノムベクター構築物にクロー
ニングするのに適したプラスミドベクター構築物中に存在してもよい。別個のプ
ラスミドベクター構築物中に存在してもよい、第２のヌクレオチド配列（レポー
ター構築物）とキット中で配合するとき、結果として得られる第１のヌクレオチ
ド配列を含む複数のプラスミドと、第２のヌクレオチド配列を含むプラスミドと
の組合わせは、本発明の必須エレメントを含む。次いで、プラスミドおよび任意
にウイルス組立に必要な他の成分をコードする核酸構築物と一緒に宿主細胞にト
ランスフェクトするとき、熟練者は、このようなキットを、伝染性ウイルス粒子
の産生につながる適当なウイルスベクターゲノム構築物の作製に使用することが
可能である。
【００５１】 第２のヌクレオチド配列も、第１のヌクレオチド構築物と同じベクター構築物
の一部として都合よく存在してもよい。このようにして、個々の細胞における第
１のヌクレオチド配列およびレポーター構築物（ＴＫ遺伝子等）の同時発現が保
証される。同様に、ウイルスベクターも、第１のおよび第２のヌクレオチド配列
を含んでもよい。
【００５２】 あるいは、第２のヌクレオチド配列は、キットに含まれるパッケージング細胞
系内に安定して存在することも可能である。
【００５３】 キットは、ウイルス粒子を産生するのに必要な他の成分、例えば、宿主細胞お
よびウイルスの構築に必要な必須ウイルスポリペプチドをコードする他のプラス
ミドを含んでもよい。例として、キットは、抗ＨＩＶリボザイムをコードする第
１のヌクレオチド配列と、５’および／または３’ＵＴＲ内に配置された第３の
ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＴＫをコードする第２のヌクレオチド
配列とを含む複数のプラスミドを含んでもよい。そのとき、任意の成分は、（ａ
）第１のおよび第２のヌクレオチド配列をウイルスゲノムにクローニングするの
に適した制限酵素認識部位を有するＨＩＶウイルスゲノム構築物と、（ｂ）ＶＳ
Ｖ−Ｇ ｅｎｖタンパク質をコードするプラスミドと、（ｃ）ｇａｇ．ｐｏｌを
コードするプラスミドであろう。あるいは、ウイルス粒子の構築に必要なウイル
スのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列を含むパ
ッケージング細胞系、例えば、ＶＳＶ−Ｇ発現細胞系として、キットで提供する
ことが可能である。
【００５４】 ウイルスベクターは、一般に、レトロウイルスベクター、特に、ＨＩＶベクタ
ー等のレンチウイルスベクターである。本発明のレトロウイルスベクターは、適
当なレトロウイルスから誘導されてもよく、または誘導可能であってもよい。多
数の異なるレトロウイルスが同定されている。例としては、ネズミ白血病ウイル
ス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス、ヒト
Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マ
ウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、フジナミ
肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、
ＦＢＲマウス骨肉種ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス
（Ｍｏ−ＭＳＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨
髄球腫症ウイルス２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）な
どが挙げられる。レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ
．，１９９７．“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ
, ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ．ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８-７６３にある。
【００５５】 幾つかのレトロウイルスのゲノム構造に関する詳細は、当技術分野で見つける
ことが可能である。例として、ＨＩＶおよびＭｏ−ＭＬＶに関する詳細は、ＮＣ
Ｂ１ Ｇｅｎｂａｎｋ（それぞれ、ゲノム寄託番号第ＡＦ０３３８１９およびＡ
Ｆ０３３８１１）から見つけることができる。
【００５６】 レンチウイルス群は、さらに、「霊長類」および「非霊長類」に分けることが
できる。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
（ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因病原体）、およびサル免疫不全ウ
イルス（ＳＩＶ）などが挙げられる。非霊長類レンチウイルス群としては、プロ
トタイプ「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関
連のヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ
）および最近記述されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウ
イルス（ＢＩＶ）などがある。
【００５７】 レトロウイルスゲノムの基本構造は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲであり、そ
の間またはその中に、ゲノムのパッケージングを可能にするパッケージングシグ
ナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムへの組み込みを可能にするための組
み込み部位、およびパッケージング成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎ
ｖ遺伝子（これらは、ウイルス粒子の組立に必要なポリペプチドである）が配置
されている。もっと複雑なレトロウイルスは、さらなる特徴、例えば、ＨＩＶに
おけるｒｅｖおよびＲＲＥ配列（これは、感染した標的細胞の核から細胞質に組
み込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写物の能率的な輸出を可能にする）を有する
。
【００５８】 プロウイルスでは、これらの遺伝子は、両末端にて、長末端反復（ＬＴＲ）と
呼ばれる領域で挟まれている。ＬＴＲは、プロウイルスの組み込みおよび転写に
関与する。ＬＴＲは、エンハンサープロモーター配列の役割も果たし、ウイルス
遺伝子の発現を調節することができる。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成
は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列によって行われる。
【００５９】 ＬＴＲ自体は、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる、３つのエレメントに分けるこ
とができる同一配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する
。Ｒは、ＲＮＡの両端で反復する配列であり、Ｕ５は、ｅＲＮＡの５’末端に特
有の配列に由来する。３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルス間で
かなり異なることがある。
【００６０】 欠損レトロウイルスベクターでは、ゲノムｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖは存在
しなくてもよく、または機能しなくてもよい。ＲＮＡの両端におけるＲ領域は、
反復配列である。Ｕ５およびＵ３は、それぞれ、ＲＮＡゲノムの５’末端および
３’末端における固有の配列を表す。
【００６１】 遺伝子療法および／または分子生物学の他の技術で使用するのに適した代表的
なレトロウイルスベクターでは、複製に不可欠なｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖタ
ンパク質コード領域の１つまたは複数の少なくとも一部をウイルスから除去する
ことができる。これによって、レトロウイルスベクターは複製能欠損となる。除
去部分を、関心のあるヌクレオチド配列（ＮＯＩ）、例えば、第１のヌクレオチ
ドで置き換えて、そのゲノムを宿主ゲノムに組み込むことができる。修飾された
ウイルスゲノムは、構造タンパク質が欠如しているため、それ自身増殖すること
ができない。宿主ゲノムに組み込まれると、ＮＯＩの発現が起こり、その結果、
例えば、治療作用および／または診断作用が生じる。従って、ＮＯＩの関心部位
への転移は、一般に、ＮＯＩを組換えウイルスベクターに組み込むこと、修飾さ
れたウイルスベクターをウイルス外被内にパッケージングすること、および標的
細胞または標的細胞集団等の、関心部位の形質導入を可能にすることによって実
現される。
【００６２】 従って、本発明で使用するための最低限のレトロウイルスゲノムは、（５’）
Ｒ−Ｕ５−第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列−Ｕ
３−−Ｒ（３’）であろう。しかし、宿主細胞／パッケージング細胞内でレトロ
ウイルスゲノムを作製するのに使用されるプラスミドベクターは、宿主細胞／パ
ッケージング細胞内でゲノムの転写を指令するように、レトロウイルスゲノムに
作動可能に連結された転写制御調節配列も含む。これらの制御配列は、転写され
たレトロウイルス配列と関連のある天然の配列、すなわち、５’Ｕ３領域であっ
てもよく、別のウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター等の異種プ
ロモーターであってもよい。
【００６３】 一部のレトロウイルスゲノムは、能率的なウイルス産生のためにさらなる配列
を必要とする。例えば、ＨＩＶの場合、ｒｅｖおよびＲＲＥ配列が含まれること
が好ましい。しかし、コドンの最適化によって、ｒｅｖおよびＲＲＥの要求を減
少させるかまたは排除することができる。
【００６４】 いったんレトロウイルスベクターゲノムがその標的細胞ゲノムにプロウイルス
ＤＮＡとして組み込まれたら、リボザイム配列が発現されることが必要である。
レトロウイルスの場合、プロモーターはプロウイルスの５’ＬＴＲ Ｕ３領域に
位置する。レトロウイルスベクターでは、異種遺伝子の発現を推進するプロモー
ターは、５’Ｕ３領域内の固有のレトロウイルスプロモーターであってもよく、
またはベクターに設計された代替プロモーターであってもよい。代替プロモータ
ーは、レトロウイルス固有の５’Ｕ３プロモーターと物理的に入れ替わってもよ
く、あるいはＬＴＲ間等の、ベクターゲノム内の異なる場所に組み込まれてもよ
い。
【００６５】 一般に、複製能欠損レトロウイルスベクターは、例えば、その後の形質導入に
適した力価のレトロウイルスベクターを調製するために、パッケージングまたは
ヘルパー細胞系と組換えベクターとの組合わせを使用して増殖させる。換言すれ
ば、３つのパッケージングタンパク質をトランスで（in trans）提供することが
できる。
【００６６】 「パッケージング細胞系」は、レトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ
遺伝子の１つまたは複数を含む。パッケージング細胞系は、レトロウイルスＤＮ
Ａのパッケージングに必要なタンパク質を産生するが、ｐｓｉ領域が欠けている
ため、キャプシド形成を招来することはできない。しかし、ＮＯＩおよびｐｓｉ
領域を担持する組換えベクターがパッケージング細胞系内に導入されるとき、ヘ
ルパータンパク質は、ｐｓｉ陽性組換えベクターをパッケージして、組換えウイ
ルスストックを作ることができる。ＮＯＩを標的細胞のゲノムに導入するために
、このウイルスストックを使用して、細胞を形質導入することができる。スプラ
イスドナーの上流からｇａｇ出発コドンの下流にわたるさらなる配列を含む、ｐ
ｓｉプラス（ｐｓｉ ｐｌｕｓ）と呼ばれるｐｓｉパッケージングシグナルは、
ウイルス力価を高めることが明らかにされているため、これを使用することが好
ましい（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。
【００６７】 ウイルスタンパク質を作るのに必要な全ての遺伝子が欠如しているゲノムを有
する組換えウイルスは、一度に限って形質導入することができ、増殖することは
できない。標的細胞の形質導入を１回だけできるこれらのウイルスベクターは、
複製欠損ベクターとして知られる。従って、潜在的に危険なレトロウイルスが生
成されることなく、ＮＯＩが宿主／標的細胞ゲノムに導入される。Ｃｏｆｆｉｎ
ｅｔ ａｌ．，１９９７（同書）には、利用できるパッケージング系の一覧が
提示されている。
【００６８】 ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖウイルスコード領域が、パッケージング細胞系に
独立にトランスフェクトされる別個の発現プラスミド上にある、レトロウイルス
パッケージング細胞系を使用することが好ましい。３プラスミドトランスフクシ
ョン法と呼ばれることもある（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９５）この
方法は、野生型ウイルス産生に３つの組換え事象を必要とするため、複製有能ウ
イルスが産生する可能性を減少させる。組換えは、相同性によって大きく促進さ
れるため、ベクターのゲノムとヘルパーのゲノムとの間の相同性を減少させるか
または排除することによって、複製能力のあるヘルパーウイルス産生の問題を減
少させることもできる。
【００６９】 安定してトランスフェクトされたパッケージング細胞系の代替法は、一過性に
トランスフェクトされた細胞系を使用することである。一過性トランスフクショ
ンは、ベクターを開発しているときに、ベクター産生レベルの測定に都合よく使
用することができる。この点に関して、一過性トランスフクションは、安定なベ
クター産生細胞系の作製に必要な長時間がいらず、また、ベクターまたはレトロ
ウイルスのパッケージング成分が細胞に有毒な場合も使用することができる。レ
トロウイルスベクターの作製に一般的に使用される成分としては、ｇａｇ／ｐｏ
ｌタンパク質をコードするプラスミド、ｅｎｖタンパク質をコードするプラスミ
ドおよびＮＯＩを含むプラスミドなどがある。ベクター作製は、これらの成分の
１つまたは複数を、他の必要成分を含む細胞に、一過性にトランスフクトするこ
とを含む。ベクターが、有毒遺伝子または細胞周期のインヒビターまたはアポト
ーシスを誘導する遺伝子等の宿主細胞の複製を妨害する遺伝子をコードする場合
、安定したベクター産生細胞系を作製することは困難かもしれないが、細胞が死
ぬ前に、一過性トランスフクションを使用してベクターを作製することができる
。また、安定したベクター産生細胞系から得られるレベルに匹敵するベクター力
価レベルをもたらす一過性トランスフクションを使用して、細胞系が開発されて
いる。
【００７０】 プロデューサー細胞／パッケージング細胞は、任意の適当な細胞型であっても
よい。最も一般的には、哺乳類プロデューサー細胞が使用されるが、昆虫細胞等
の他の細胞が除外されるものではない。明らかに、プロデューサー細胞は、ｅｎ
ｖおよびｇａｇ、ｐｏｌ ｍＲＮＡを効率よく翻訳できることが必要であろう。
多くの適するプロデューサー／パッケージング細胞系が、当技術分野で知られて
いる。当業者は、例えば、パッケージング成分をコードするヌクレオチド構築物
を、ある細胞系に安定に導入することによって、適当なパッケージング細胞系を
作製することもできる。
【００７１】 ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ ＲＮＡ転写物の切断を実行する能力に
ついて試験しようとしている阻害性ＲＮＡ分子を、レトロウイルスゲノム内の第
１のヌクレオチド配列がコードする場合、阻害性ＲＮＡ分子の結合を減少または
妨害するために、組み込まれたかまたはプラスミド上にあるパッケージング細胞
系、またはｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖタンパク質をコードする一過性
にトランスフェクトされたプロデューサー細胞系に存在するヌクレオチド配列を
修飾してもよい。この方式では、阻害性ＲＮＡ分子は、ウイルス粒子のパッケー
ジングに不可欠な、パッケージング細胞系での、ウイルスポリペプチドの発現を
妨害しない。ライブラリーのランダム性を考えると、明らかに、ライブラリー内
の幾つかの配列が、修飾されたパッケージング成分を切断することは依然として
あり得るが、第３のヌクレオチド配列および対応するパッケージング成分をコー
ドする配列を有することによって異なる、修飾されたパッケージング成分に影響
を及ぼす阻害性分子が、同時に第３のヌクレオチド配列に影響を及ぼす可能性は
低く、従って、多くの場合、この細胞は検出可能なマーカーを産生し、スクリー
ニングから除去される。
【００７２】 「ウイルス粒子のパッケージングに不可欠なウイルスポリペプチド」という用
語は、これが存在しなければウイルスゲノムをパッケージすることができないウ
イルス粒子中にパッケージされるべきウイルスゲノムによって通常コードされる
ポリペプチドを意味する。例えば、レトロウイルスであれば、このようなポリペ
プチドは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖなどであろう。用語「パッケージング成
分」および「必須成分」も、この定義に含まれる。
【００７３】 例として、リボザイムの場合、抵抗性は、一般に、リボザイム認識部位を除去
する配列の変化による。同時に、必須／パッケージング成分に関するアミノ酸コ
ード配列は、その配列によってコードされるウイルス成分が、同じままであるか
、または少なくとも十分に類似したままで必須／パッケージング成分の機能が損
なわれないように保持される。また、多くの場合、複数の第１のヌクレオチド配
列がランダムなことを考えると、パッキング成分をコードするヌクレオチド配列
の広範な修飾が必要であろう。
【００７４】 アンチセンス配列では、第３のヌクレオチド配列は、あるアンチセンス配列は
第３のヌクレオチド配列、またはその転写物に結合することができるが、そのア
ンチセンス配列は必要なパッケージング成分またはそれから転写されたＲＮＡを
コードするヌクレオチド配列に効率よく結合することができない程度までウイル
スのパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列と異なる。第３のヌクレ
オチド配列と、必要なパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列との間
の違いは、一般に、保存的な変化であるが、上述の通り、必須／パッケージング
成分の機能が著しく損なわれなければ、少数のアミノ酸変化は容認される。
【００７５】 もっと一般的には、適当なアプローチは、アミノ酸相同性が好ましくは少なく
とも９５％であるが、第３のヌクレオチド配列に対応する領域全体のヌクレオチ
ド相同性が９５％未満であるように、好ましくは９０、８０または７０％未満で
あるように、必要なパッケージング成分のヌクレオチド配列を変えることであっ
てもよい。
【００７６】 阻害性ＲＮＡ認識部位を除去するほかに、ウイルス成分のコード配列を変える
ことによって、レトロウイルスベクター粒子産生のためのプロデューサー細胞の
役割を果たす哺乳類細胞または他の細胞におけるコドン使用に合わせて配列が改
良されることが好ましい。このコドン使用の改良は「コドン最適化」と呼ばれる
。ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは、多数のレアコドン
（rare codon）を使用しており、また、これらを、よく使用される哺乳類のコド
ンに対応するように変えることによって、哺乳類プロデューサー細胞でのパッケ
ージング成分の発現増大を実現することができる。コドン使用表は、哺乳類細胞
ならびに様々な他の生物に関する技術分野で周知である。
【００７７】 従って、パッケージング成分をコードする配列は、最適化されたコドンである
ことが好ましい。さらに好ましくは、この配列は完全に最適化されたコドンであ
る。コドン最適化後、阻害性ＲＮＡ認識部位の役割を果たすことができ、且つパ
ッケージング成分をコードする配列中にもはや存在しない多数の部位が、野生型
ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ配列中に存在することが確認される。
【００７８】 コドン最適化ＨＩＶパッケージング成分のさらなる利点は、これによって、遺
伝子発現が増大することである。特に、ｒｅｖおよびＲＲＥがゲノムに含まれる
必要がないように、ｇａｇ、ｐｏｌ発現Ｒｅｖを非依存性にできることである（
Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。その結果、Ｒｅｖ非依存性ベクターが可
能になる。これによって、次には、レトロウイルスベクターにおけるアンチｒｅ
ｖまたはＲＲＥ因子の使用が可能になる。
【００７９】 実験的用途でも、実際的用途でも、高力価ウイルス調製物を使用することは極
めて望ましい。ウイルス力価を高めるための技術は、上述のｐｓｉプラスパッケ
ージングシグナルおよびウイルスストックの濃縮を使用することを含む。さらに
、水泡性口内炎ウイルスからのＧタンパク質等の、異なるエンベロープタンパク
質を使用することにより、１０9／ｍｌまで濃縮した後、力価が改良された。し
かし、一般に、エンベロープタンパク質は、ウイルス粒子が、治療したいウイル
ス感染細胞を優先的に感染させるように選択される。例えば、ＨＩＶベクターを
使用してＨＩＶ感染を治療する場合、使用されるｅｎｖタンパク質はＨＩＶｅｎ
ｖタンパク質である。
【００８０】 ［Ｃ．選択方法］ 本発明の選択方法は、第２のヌクレオチド配列の存在下で１つまたは複数の第
１のヌクレオチド配列を宿主細胞に導入することを含む。核酸を宿主細胞に導入
する方法は、当技術分野で周知であり、例えばトランスフクションなどがある。
一般に、ヌクレオチド配列はベクターの一部である。第１のおよび第２のヌクレ
オチド配列は、同じベクターの一部であってもよく、別の核酸分子上にあっても
よい。第２のヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノムに安定に導入されていても
よい。
【００８１】 第１のヌクレオチド配列によりコードされた阻害性ＲＮＡ分子が検出可能なマ
ーカーの発現を阻害するかまたは減少させる場合、このような分子を含む細胞を
、検出可能なマーカーの発現の阻害または減少につながらない第１のヌクレオチ
ド配列を含む細胞と区別することができる。効果的な阻害性ＲＮＡ分子を含む細
胞を、例えば、ＰＣＲ反応で使用して、阻害性ＲＮＡ分子の配列を識別し、その
結果、標的分子の領域の配列を識別することができる。
【００８２】 検出可能なマーカーがＦＡＣＳ選別可能な場合、効果的な阻害性ＲＮＡ分子を
含む細胞を残りの細胞と選別することができる。選択可能なマーカーが、プロド
ラッグを細胞障害性化合物に転換することができる酵素である場合、効果的な阻
害性ＲＮＡ分子を含む細胞を、その細胞のプロドラッグに対する無反応性に基づ
いて選択することができる。もっと具体的には、効果的な阻害性ＲＮＡ分子を含
む細胞は、生存プロドラッグを用いた選択によりうまく耐えることができるであ
ろう。
【００８３】 好ましい実施形態では、後者の選択方法は、第１のヌクレオチド配列を含むウ
イルスベクターのライブラリーを使用して都合よく実施される。ウイルスベクタ
ーライブラリーを、例えば、ＴＫをコードする第２のヌクレオチド配列を含むプ
ロデューサー細胞にトランスフェクトする。その後のプロドラッグ（例えば、ガ
ンシクロビル）選択に耐える細胞は、一般に、効果的な阻害性ＲＮＡ分子をコー
ドする少なくとも１つの第１のヌクレオチド配列を含む。さらなる任意のステー
ジは、前記細胞からウイルス粒子を回収し、伝染性ウイルス粒子を使用してさら
なる細胞を形質導入することである。この追加のステップの利点は、一般に、必
須ウイルス配列／パッケージング成分を切断しない第１のヌクレオチド配列のみ
が、この第２のステージまで首尾よく成し遂げることである。さらに、生存でき
る細胞から得られたウイルス上澄の連続希釈を作ることにより、第１の阻害性配
列を１つだけ含む細胞を作製することができ、これによって、ＰＣＲによる識別
が簡単になる。
【００８４】 一部の阻害性分子は、第３のヌクレオチド配列を標的にできないこと以外の他
の理由で、細胞死を引き起こす可能性があることに留意すべきである。例えば阻
害性分子は、細胞生存に不可欠なｍＲＮＡの分解を引き起こすことがある。一般
に、このような分子を含む細胞は死ぬため、ランダムライブラリーのこれらのエ
レメントに対する選択は必要ではない。
【００８５】 第１のヌクレオチド配列が検出可能なマーカーをコードするコード領域に結合
して、これを切断することができる場合、「擬陽性」が得られることもある。例
えば、選択方法が効果的な阻害性ＲＮＡ分子を含むこれらの細胞が、プロドラッ
グを用いた選択に耐えられる能力に依存する場合、阻害性分子が、プロドラッグ
を細胞障害性化合物に転換する酵素をコードするｍＲＮＡを直接標的とするので
あれば、擬陽性が得られる。特に好ましい実施形態では、第２の核酸で使用され
る検出可能なマーカーの配列を標的とする阻害性分子をコードするベクターを除
去するための選択ステップが含まれる。
【００８６】 これは、例えば、第１のヌクレオチド配列を、検出可能なマーカーをコードし
且つ第３のヌクレオチド配列が欠けている非機能的ヌクレオチド配列（「第４の
ヌクレオチド配列」）を含む構築物に挿入することによって行われる。他のベク
ター配列は、第２のヌクレオチド配列を含むベクターの配列と同じであることが
好ましい。一般に、検出可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列は、機能
的検出可能なマーカーの発現を妨げるために、挿入または欠失により修飾されて
いた。従って、検出可能なマーカーを非機能的にさせる突然変異を別にして、不
活性な検出可能なマーカーは、第２の核酸で使用される検出可能なマーカー配列
と同じ配列である。
【００８７】 次いで、この構築物を使用して、初回スクリーニングステージ用のライブラリ
ーウイルスベクターを作製する。（ｉ）検出可能なマーカーに結合して、切断を
引き起こすことができる、（ｉｉ）それらが含まれるウイルスゲノムに影響を及
ぼす、（ｉｉｉ）ウイルスのパッケージングに影響を及ぼす、または（ｉｖ）細
胞を死滅させる、阻害性分子をコードするゲノムは、ウイルス粒子内にパッケー
ジされない。従って、（ｉ）検出可能なマーカーの切断を引き起こすことができ
ない、（ｉｉ）細胞生存に有害でない、または（ｉｉｉ）選択アッセイで、ウイ
ルス産生を阻害することができない、ように予め選択された複数の第１のヌクレ
オチド配列を含むウイルスのプールを作ることが可能である。
【００８８】 次いで、このウイルスプールを使用して、上述の選択過程において、第２のヌ
クレオチド配列を含む細胞を形質導入することができる。
【００８９】 ［Ｄ．最適化された阻害性ＲＮＡ分子の使用］ 本発明の選択方法で識別された、リボザイム等の、最適化された阻害性ＲＮＡ
分子を使用して、その標的ヌクレオチド配列またはその転写産物の、標的細胞に
おける発現を阻害することができる。
【００９０】 例えば「ノックアウト」実験を実施することによって、遺伝子発現をブロック
することの作用を調査するために、最適化された阻害性ＲＮＡ分子を使用して、
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、細胞での遺伝子発現を除去すること
ができる。このような実験は、例えば、標的確認、スクリーニングまたはモデル
構築に有用である。
【００９１】 あるいは、本発明の選択方法で識別された、最適化された阻害性ＲＮＡ分子を
、遺伝子療法およびＲＮＡの直接投与等の治療用途で使用することができる。特
に、病原体の必須成分をコードするヌクレオチド配列を標的とする最適化された
阻害性ＲＮＡ分子を使用して、上記病原体によって引き起こされる疾病を治療す
ることができる。従って、ＨＩＶの成分を標的とする最適化された阻害性ＲＮＡ
分子を使用して、ＨＩＶ感染または関連症状を減少または防止することが可能で
ある。
【００９２】 従って、最適化された阻害性ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む
核酸ベクターを使用して、ウイルス感染症、好ましくはレトロウイルス感染症、
特にレンチウイルスの、ことにＨＩＶ感染症を治療または予防することができる
。特に、上記核酸ベクターを使用して、阻害性ＲＮＡ分子を、ウイルス感染症の
ための治療を必要としているヒトまたは動物に送達することができる。核酸ベク
ターとしては、ウイルスベクターおよびそれから得られる伝染性ウイルス粒子な
どがある。ウイルスベクターが、病原体ウイルスの成分を標的とする、選択され
た第１のヌクレオチド配列を含み、その成分も、選択された第１のヌクレオチド
配列を含む伝染性ウイルス粒子の生成に必要な場合、パッケージング／プロデュ
ーサー細胞内の成分のヌクレオチド配列は、一般に上述の通りに修飾される。特
に、リボザイムおよび修飾されたレトロウイルスのｅｎｖおよびｇａｇ．ｐｏｌ
配列の使用に関して、手引きを参考例に示す。
【００９３】 ＨＩＶ−１は、ＨＩＶ−１感染症に対処するための方法の開発に、理想的なベ
クターを提供する。これは、取り出されて、トランスプロデュース（ｔｒａｎｓ
−ｐｒｏｄｕｃｅ）されたウイルス粒子（従って、非病原性であるが、依然とし
て免疫原性である）によってパッケージされたオープンリーディングフレームを
有するゲノムを使用して、リボザイム、イントラボディーズ（ｉｎｔｒａ−ｂｏ
ｄｉｅｓ）、イントラカインズ（ｉｎｔｒａ-ｋｉｎｅｓ）、ＲＮＡデコイおよ
び／またはトランスドミナント変異タンパク質等の抗ＨＩＶ分子を輸送すること
ができるためである。
【００９４】 スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位が保持されている場合、
１つのウイルスの構築物で、８つまでの異なる抗ＨＩＶ因子を作ることが可能で
ある。例えば、Ｔａｔリーディングフレームは、Ｔａｔを標的とするリボザイム
と入れ替わることができ、ｎｅｆリーディングフレームは、ｔａｔトランスドミ
ナント突然変異体と入れ替わることが可能である。
【００９５】 リボザイム等の阻害性ＲＮＡ分子は、このようなシステムの重要成分であろう
。
【００９６】 核酸ベクター／ウイルス粒子を製薬上許容できる担体または希釈剤と組み合せ
て、医薬組成物を作ることが好ましい。従って、本発明は、個体を治療するため
の医薬組成物であって、本発明の核酸ベクター／ウイルス粒子の治療有効量と共
に、製薬上許容できる担体、希釈剤、賦形剤、または助剤を含む組成物も提供す
る。この医薬組成物はヒト用であってもよく、動物向けであってもよい。
【００９７】 製剤用担体、賦形剤または希釈剤の選択は、所期の投与経路および標準的な薬
務に関して選択することができる。適当な担体および希釈剤としては、等張食塩
水、例えばリン酸緩衝食塩水などがある。医薬組成物は、担体、賦形剤または希
釈剤として（または、それに加えて）、適当な結着剤、滑沢剤、沈澱防止剤、被
覆剤、被覆剤、可溶化剤、およびウイルスの標的部位への侵入を助けたり増加さ
せたりすることが可能な他の輸送剤（例えば、脂質配送システム等）を含んでも
よい。
【００９８】 医薬組成物を非経口、筋内、静脈内、脳内、皮下、眼内または経皮投与用に製
剤化することができる。
【００９９】 適する場合、吸入剤、座薬またはペッサリーの形態で、ローション剤、液剤、
クリーム、軟膏、粉剤の形態で局所的に、皮膚パッチを使用して、澱粉または乳
糖等の賦形剤を含む錠剤の形態でまたは単独または賦形剤との混合物のカプセル
剤または卵型剤（ovules）で、または香味料または着色料を含むエリキシル剤、
液剤または懸濁液の形態で経口的に、の１つまたは複数によって医薬組成物を投
与することができ、また、本医薬組成物は、非経口的に、例えば海綿体内、静脈
内、筋内または皮下に、注射することができる。非経口投与の場合、溶液を血液
と等張にするために、他の物質、例えば十分な塩類または単糖類を含んでもよい
滅菌水溶液の形態で、本組成物を最もよく使用することができる。バッカルまた
は舌下投与の場合、従来の方法で製剤化することができる錠剤またはトローチ剤
の形態で、本組成物を投与することができる。
【０１００】 投与されるウイルスの量は、一般に、１０3〜１０10ｐｆｕの範囲であり、好
ましくは、１０5〜１０8ｐｆｕ、さらに好ましくは１０6〜１０7ｐｆｕの範囲で
ある。注射するとき、一般に、製薬学上許容できる適当な担体または希釈剤中に
１〜１０μｌのウイルスで投与される。
【０１０１】 ポリヌクレオチド／ベクターが裸の核酸として投与されるとき、投与される核
酸の量は、一般に１μｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１００μｇ〜１ｍｇの範囲であ
る。
【０１０２】 本発明の方法で選択される第１のヌクレオチド配列（または他の治療用配列）
が、誘導可能な制御配列の調節下にある場合、治療継続期間中、遺伝子発現を誘
導することのみが必要であろう。いったん病気を治療したら、その後は、インデ
ューサーを除去し、ヌクレオチド配列の発現を停止させる。これは、明らかに臨
床上の利点を有するであろう。このようなシステムは、例えば、抗生物質テトラ
サイクリンを投与し、ｔｅｔレプレッサー／ＶＰ１６融合タンパク質に対するそ
の作用を介して、遺伝子発現を活性化することを含む。
【０１０３】 ［Ｅ．Ｉｎ ｖｉｖｏ選択法］ １つの態様では、本発明はｍＲＮＡ分子上のオープン部位を識別する方法を提
供する。
【０１０４】 「オープンな」という用語は、ｍＲＮＡがその生理学的配置にあるとき、リボ
ザイム、アンチセンスＲＮＡまたはＥＧＳ等の阻害性ＲＮＡ分子が接近しやすい
部位を意味する。
【０１０５】 本発明の選択システムを使用して、ｍＲＮＡが第３のヌクレオチド配列により
コードされる。例えば、第３のヌクレオチド配列が全遺伝子であれば、本選択シ
ステムを使用して、対応するｍＲＮＡ分子上の１つまたは複数のオープン部位を
識別することができる。いったん阻害性ＲＮＡ分子（リボザイム、アンチセンス
ＲＮＡまたはＥＧＳ等）が、本発明の選択システムを使用して第３のヌクレオチ
ド配列に結合することができると確認されたら、標準的な技術を使用して、標的
部位を推測することができる。例えば、阻害性分子がアンチセンス配列であれば
、アンチセンス配列の「最適な」相補配列と、ｍＲＮＡ配列との間の配列の比較
により、アンチセンス配列がｍＲＮＡに結合した部位が明らかになるはずである
。
【０１０６】 次に、例としての意図にすぎず、且つ本発明の範囲を制限する意図のない以下
の実施例で、本発明をさらに説明する。
【０１０７】 次に本発明を、当業者が本発明を実行するのを助けるのに役立つことを意味し
、いかなる形でも、本発明の範囲を制限する意図のない例として、さらに詳細に
説明する。以下の実施例は、図を参照する。
【０１０８】 ［実施例］ 本発明者は、それぞれ、ハンマーヘッドリボザイムの触媒ドメインを含む、リ
ボザイムのライブラリーの作成に基づく方法を開発した。この手順は、自殺遺伝
子（チミジンキナーゼ（ＴＫ）が好ましい）をコードするヌクレオチド配列を含
むゲノムを含むウイルスを作製することを含む。この下流に標的配列を挿入する
。あるいは、またはさらに、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）がＴＫ配列の
上流に挿入されるのであれば、標的配列を上流に挿入してもよい。このベクター
を使用して形質導入される細胞は、ガンシクロビル感受性になる。
【０１０９】 しかし、ウイルスゲノムが転写されると、ｍＲＮＡはＴＫ遺伝子のみならず、
標的配列も含む。このｍＲＮＡは、通常の５’キャップおよび３’ポリＡ尾部を
含む。５’キャップまたはポリＡ尾部が、リボザイムによる切断によって除去さ
れると、ｍＲＮＡは不安定になり、分解される。これによって、ＴＫ遺伝子の翻
訳が妨害され、活性なリボザイムを発現する細胞が、ガンシクロビル非感受性に
なる。
【０１１０】 ［実施例１ プロドラッグ系（選択可能なマーカー）の選択］ 本発明で使用する第２のヌクレオチドは、検出可能なマーカーをコードする。
我々は、酵素プロドラッグ選択システムを使用して本発明を例証することを選択
した。効果的なプロドラッグ系を選択するために、２つのよく知られた酵素−プ
ロドラッグ組合わせの用量応答を測定した。
【０１１１】 ［Ａ．Ｅ ｃｏｌｉニトロ還元酵素（ＮＴＲ）／メトロニダゾール（ＭＴＺ）の
組合わせ］ ＨＴ１０８０細胞（ＮＴＴＲ−）およびＨＴ１０８０ ＮＴＲ陽性細胞（ＮＴ
Ｒ＋）を様々な濃度のＭＴＺと共にインキュベートし、生き残った細胞のパーセ
ンテージを測定した（図１Ａ）。
【０１１２】 ［Ｂ．ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ（ＴＫ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）組合わ
せ］ 様々なウイルスベクターを用いて形質導入したＨｅＬａ細胞系を、ＧＣＶで７
２時間処理し、生き残った細胞のパーセンテージを測定した（図１Ｂ参照）。Ｃ
ＸＳＮ=中空ウイルスベクター、ＣＴＫＳＮ=ＴＫ陽性ウイルス、ＣＴＫｍＳＮ=
ＴＫ突然変異体ウイルス、ＣＴＫｔａｔＳＮ=活性なＴＫ遺伝子の下流にＨＩＶ
−１ ｔａｔ遺伝子ＯＲＦを含むベクター（図４Ｄ）、ＣＴＫｅｎｖＳＮ=活性
なＴＫ遺伝子の下流にＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子ＯＲＦを含むベクター（図４Ｄ）
。ＣＸＳＮは、ｐＨＩＴ１１１からｌａｃＺ遺伝子を除去することにより作製さ
れる。Ｃ=５’Ｕ３の代わりのＣＭＶプロモーター、Ｘ=クローニング部位、関心
のある遺伝子の場合、Ｓ=ＳＶ４０プロモーターおよびＮ=ネオマイシン耐性遺伝
子。Ｔｋ=チミジンキナーゼ、ＴＫｍ=チミジンキナーゼ突然変異体。
【０１１３】 以上の結果から、ＴＫ／ＧＣＶシステムを用いて、よりよい感受性を獲得でき
ることがわかる。しかし、ＴＫ／ＧＣＶは、巻き添え効果をもたらす。一般に、
使用される薬剤は、巻き添え効果を有してはならない、すなわち、プロドラッグ
を活性化する酵素を発現している細胞周囲の細胞の死を惹起してはならない。巻
き添え効果は、原形質膜を横切って周囲の細胞に侵入するか、またはギャップ結
合を介して他の細胞に侵入するかの、活性型のプロドラッグに起因する。ＧＣＶ
の場合、巻き添え効果は、ギャップ結合を介して横切る薬剤によって引き起こさ
れる。都合よく、これらのギャップ結合は、薬剤ジエルドリンによってブロック
することができ、従って、巻き添え効果を制限することができる（Ｔｏｕｒａｉ
ｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【０１１４】 図２は、上述の２つの酵素／プロドラッグ系の巻き添え効果を示す。図２Ａで
は、安定したＨＴ１０８０ＮＴＲ陽性細胞系を、１０ｍＭのＭＴＺの存在下で２
４時間、ＨＴ１０８０細胞と共培養した。図２Ｂでは、安定したＨｅＬａ ＴＫ
細胞系を、ジエルドリン（１６μｇ／ｍｌ）の存在下および非存在下で７２時間
、ＧＣＶを含むＨｅＬａ細胞と共培養した。
【０１１５】 このデータから、ジエルドリンを使用して、ＴＫ／ＧＣＶの巻き添え効果を最
小限に抑えられることは明白である。
【０１１６】 そこで、ＴＫ／ＧＣＶは、酵素を持つまたは持たない細胞を識別する上でより
敏感なため、我々は、巻き添え効果をもたないＮＴＲ／メトロニダゾール（ＭＴ
Ｚ）よりむしろＨＳＶ−１ＴＫ／ＧＣＶ／ジエルドリンを使用することを選択し
た（図１Ａ．１Ｂ）。図１から決定される通り、試験で使用されるＧＣＶの量は
、３μｇ／ｍｌである。
【０１１７】 ［実施例２ ハンマーヘッドリボザイムを使用したｉｎ ｖｉｖｏ選択］ ランダムオリゴヌクレオチドの合成により、ハンマーヘッドリボザイムのライ
ブラリーを作成する。次いで、これらをＣＴＫｍＳＮ（図４Ｂ）の不活性なＴＫ
コード配列の下流に挿入して、複数の酵素（ＣＴＫｍＲｚＬＢ−図４）を得る。
【０１１８】 ＣＴＫｍＳＮ（図４Ｂ）は、ｐＨＩＴ１１１（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．
，１９９５）（図４Ａ）のｌａｃＺを除去して中間構築物ＣＫＳＮ（図４Ａ）を
得、次いでその場所に、フレームシフト突然変異（ＢｓＰ ＥＩ部位における切
断および補充）により構築された不活性なＴＫコード配列を挿入することによっ
て構築した。ヒトヘルペスウイルス１の配列は、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，
１９８１（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｖ００４６７）に提供されている。
【０１１９】 不活性型の酵素の下流にライブラリーを挿入するためには、ＴＫ含有ＲＮＡを
切断する（従って、選択の際に擬陽性を招くことになる）リボザイムがベクター
ライブラリーに含まれないことを保証することが必要である。３プラスミドコト
ランスフクションシステム（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９５）を使用
してウイルスを作製し、ＨｅＬａ細胞の形質導入に使用した。ＧＣＶに曝露後、
生き残った細胞を測定することによって、突然変異体の活性を評価した。
【０１２０】 標的ＲＮＡ配列を、ウイルスベクターＣＴＫＳＮ（図４Ｂ）の活性型酵素の下
流に挿入して、ＣＴＫＸＳＮ（Ｘ＝標的配列）を作製した（図４Ｃ）。ＣＴＫＳ
Ｎは、ＴＫ配列をＣＸＳＮ（図４Ａ）に挿入することにより作製される。３プラ
スミド・コトランスフェクション後、ウイルスを使用して、ＮＩＨ３Ｔ３．Ｈｅ
Ｌａまたは他の細胞等の細胞を形質導入する。巻き添え効果を最小限に抑えるた
めにＨｅＬａ細胞を選択した（ＨｅＬａ細胞は、低いパーセンテージのギャップ
結合連絡を有し、ＧＣＶの巻き添え効果は、グアノシン一リン酸類似体のギャッ
プ結合を介した伝送に起因する）。巻き添え効果を最小限に抑えるために、ジエ
ルドリンも使用した。
【０１２１】 安定した細胞系は、ネオマイシン選択（Ｇ４１８、１ｍｇ/ｍｌ、１０日間）
によって作製した。リボザイムライブラリーを含むベクター（ＣＴＫｍＲｘＬＢ
）を用いてこれらの細胞系を形質導入することができ、ＧＣＶ選択は以下の通り
である。ＨＩＶ配列を切断するリボザイムは、ＴＫの翻訳を妨害し、従って、こ
の細胞は生き残る。他の細胞は全て、機能的ＴＫを保持するため、死滅する。次
いで、ＰＣＲを使用してリボザイム配列を確定する。
【０１２２】 ［実施例３ 最適化されたリボザイムを使用したｉｎ ｖｉｖｏ試験］ 実施例１によって得られた最適化されたリボソームを、疾病の治療に使用する
ことが可能である。特に、多数のこうしたリボザイムを、連係して使用すること
ができ、多数の部位を標的とすることが可能である。さらに、ＨＩＶの治療にお
いて、ＨＩＶベクターを使用して、リボザイムを送達することができるが、これ
は、野生型ゲノムのパッケージングの妨害を引き起こすためである。
【０１２３】 このアプローチの実現可能性を試験するために、我々は、ｔａｔ安定細胞系で
、抗ｔａｔリボザイムを試験した。図３に示す通り、機能的リボザイムを含む細
胞を選択をすることが可能である。このような選択を実施できるためには、巻き
添え効果を排除しなければならないことも明白である。
【０１２４】 この技術を使用して、ＨＩＶゲノムの全てに特異的なリボザイムを見つけるこ
とができる。さらに、この方法は、ＲＮＡ標的に関連したリボザイムを、ｉｎ
ｖｉｖｏで単離する方法を提供する。
【０１２５】 ［参考例１ リボザイムを担持するゲノムの構築］ ＨＩＶｇａｇ．ｐｏｌ配列は、最適化されたコドンであり（図８および配列番
号１）、およそ４０ヌクレオチドの重複オリゴを使用して合成した。この配列は
、３つの利点を有する。第１に、この配列によってＨＩＶ系ベクターがリボザイ
ムおよび他の治療用因子を運ぶことが可能になる。第２に、コドン最適化により
、より高いレベルの遺伝子が発現するため、より高いベクター力価が生じる。第
３に、ｇａｇ．ｐｏｌ発現がｒｅｖ非依存性になり、抗ｒｅｖまたはＲＲＥ因子
を使用することが可能になる。
【０１２６】 ｇａｇ．ｐｏｌ内に保存された配列を、ＬｏｓＡｌａｍｏｓＮａｔｉｏｎａｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／
）におけるＨＩＶ配列データベースを参照することによって識別し、これを使用
してリボザイムを設計した。ＨＩＶ−１はサブタイプ間で多様なため、北アメリ
カ、ラテンアメリカ、カリブ、ヨーロッパ、日本およびオーストラリア内で支配
的なサブタイプ、すなわち、サブタイプＢを切断するように、リボザイムをデザ
インした。コドン最適化したｇａｇｐｏｌ ｍＲＮＡを切断する可能性が低いこ
とを保証するために、選択した部位を、合成ｇａｇｐｏｌ配列と相互参照した。
リボザイムを、それぞれ５’末端および３’末端にてＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部
位で消化した。こうすることによって、別々且つ直列のリボザイムを構築するこ
とが可能になる。
【０１２７】 リボザイムは、以下の一般構造で表されるハンマーヘッド構造である。
【化１】
【０１２８】 リボザイム（ヘリックスＩＩ）の触媒ドメインは、触媒回転を減少させずに、
幾つかの変化に耐えることができる。
【０１２９】 必須のＧＵＸトリプレット（Ｘは任意のヌクレオチド塩基である）を含む、切
断部位、ターゲティングｇａｇおよびｐｏｌ、は、以下の通りである。
【０１３０】
【化２】
【０１３１】 このリボザイムを４つの異なるＨＩＶベクター（ｐＨ４（Ｇｅｒｖａｉｘ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９７）．ｐＨ６、ｐＨ４．１またはｐＨ６．１）（図５）内
に挿入する。ｐＨ４およびｐＨ６では、リボザイムの転写は内部ＨＣＭＶプロモ
ーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ａｎｄ Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ，１９８６）により
推進される。ｐＨ４．１およびｐＨ６．１から、５’ＬＴＲからのリボザイムが
発現される。ｐＨ４とｐＨ６（およびｐＨ４．１とｐＨ６．１）との主要な違い
は、産生プラスミドにおける３’ＬＴＲにある。ｐＨ４およびｐＨ４．１は、３
’ＬＴＲにＨＩＶ Ｕ３を有する。ｐＨ６およびｐＨ６．１は、３’ＬＴＲにＨ
ＣＭＶを有する。ＨＣＭＶプロモーターは、Ｕ３の大部分と入れ替わり、高い構
成レベルで発現を推進するが、ＨＩＶ−１ Ｕ３は、Ｔａｔの存在下に限って、
高レベルの発現を支持する。
【０１３２】 ３つのＰＣＲプライマーを用いた組換えＰＣＲで、ＨＣＭＶ／ＨＩＶ−１ハイ
ブリッド３’ＬＴＲを作製する（図６）。第１の巡ＰＣＲは、ＨＩＶ−１ ＨＸ
Ｂ２配列８９００−９１２３を増幅するための鋳型としてｐＨ４を使用し、ＲＩ
Ｂ１およびＲＩＢ２を用いて実施した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。第
２の巡のＰＣＲは、ｐＨ４から５’ＬＴＲハイブリッドを増幅することにより、
ＨＩＶ−１ Ｕ−３の５’末端と、ＨＣＭＶプロモーターとの間の接合部を作る
。第１のＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物およびＲＩＢ３は、それぞれ、５’プライ
マーおよび３’プライマーの役割を果たす。
【０１３３】
【化３】
【０１３４】 次いで、ＰＣＲ産物をＳｐｈＩおよびＳａｌＩで切断し、ｐＨ４に挿入し、そ
の結果、３’ＬＴＲに取って代わる。このようにして得られたプラスミドをｐＨ
６と呼ぶ。ｐＨ４．１およびｐＨ６．１を構築するために、ｐＨ４およびｐＨ６
の内部ＨＣＭＶプロモーター（ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩ）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＩＩＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のポリクローニング部位（ＳｐｅＩ−Ｘ
ｈｏＩ）と入れ替える。
【０１３５】 リボザイムをゲノムベクターバックボーンのＸｈｏＩ部位に挿入する。いかな
る立体配置のいかなるリボザイムも、同様の方法で使用することが可能であろう
。
【０１３６】 ［参考例２ パッケージング系の構築］ パッケージング系は、様々な形態をとることができる。第１の形態のパッケー
ジング系では、ＨＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌ成分は、ＨＩＶｅｎｖコード配列と同時
発現する。この場合、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖコード配列を、ゲノムに組込
まれる抗ＨＩＶリボザイムに耐性であるように改造する。同時に、耐性を実現す
るためにコドン使用を変えながら、最も高度に発現される哺乳類の遺伝子使用パ
ターンに適合するようにコドンを選択することができる。これによって、発現レ
ベルは劇的に上昇し（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７； Ｓｃｈ
ｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、従って、力価が上昇する。コドン最適
化されたＨＩＶ ｅｎｖコード配列は、Ｈａａｓら（１９９６）により記述され
ている。本発明の例では、修飾されコドン最適化されたＨＩＶ ｅｎｖ配列が使
用される（配列番号３））。対応するｅｎｖ発現プラスミドをデザインは、ｐＳ
ＹＮｇｐ１６０ｍｎと呼ばれる。修飾された配列は、Ｈａａｓらにより使用され
なかった余分のモチーフを含む。余分の配列は菌株ＭＮのＨＩＶ ｅｎｖ配列か
ら取り、コドン最適化した。核酸配列の同様の修飾は、豊富なｔＲＮＡに対応す
るコドンを使用する限り、同様に作用し（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．
，１９９６）、ゲノム中のリボザイムに対する抵抗性につながるであろう。
【０１３７】 最適化されたコドン使用を用いたｇａｇ．ｐｏｌコード配列の１例では、重複
オリゴヌクレオチドを合成し、次いで一緒に連結させて、合成コード配列を作製
する。野生型の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｋ０３４５５）および合成（ｇａ
ｇｐｏｌ−ＳＹＮｇｐ）ｇａｇｐｏｌ配列を、それぞれ、配列番号１および２に
示し、それらのコドン使用を、それぞれ、図７および図８に示す。野生型ｅｎｖ
コード配列の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ１７４４９）を、配列番号３に示
し、合成のコドン最適化配列を配列番号４に示し、それらのコドン使用表を、そ
れぞれ図９および図１０に示す。ｅｎｖコード配列を使用した場合と同様、リボ
ザイムに対する抵抗性を実現するｇａｇ、ｐｏｌ配列を使用することが可能であ
ろう。示した合成配列は、ｇａｇ、ｐｏｌ−ＳＹＮｇｐと呼ばれ、５’末端にＥ
ｃｏＲＩ部位を、また３’末端にＮｏｔＩ部位を有する。これをｐＣｌｎｅｏ（
Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入し、プラスミドｐＳＹＮｇｐを作製する。
【０１３８】 第２の形態のパッケージング系では、合成ｇａｇ、ｐｏｌカセットが、ＨＩＶ
を偽型化する表面タンパク質を産生する非ＨＩＶエンベロープコード配列と同時
発現される。これは、例えば、ＶＳＶ−Ｇ（Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ．．１９９６，
Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０）両種指向性ＭＬＶｅｎｖ（Ｃｈｅｓｅｂｒｏ
ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｐｅｃｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）であっ
てもよく、ＨＩＶ 粒子に組み込まれるであろう任意の他のタンパク質であって
もよい（Ｖａｌｓｅｓｉａ Ｗｉｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４１）。
これは、ベクターを特定の組織に向けてターゲティングさせることができる分子
を含む。リボザイムにより切断されない非ＨＩＶエンベロープタンパク質に関す
るコード配列が必要であり、従って、配列修飾を必要としない（しかし、哺乳類
細胞におけるコドン使用のための最適化等の、他の理由で、若干の配列修飾が望
ましいこともある）。
【０１３９】 ［参考例３ ベクター粒子の作製］ ベクター粒子は、Ｓｏｎｅｏｋａら（１９９５）に記載のものと類似した一過
性３プラスミドトランスフクションシステム（transient three-plasmid transf
ection system）か、または他のレトロウイルスベクター（Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ
．，１９９６；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｙｕ
ｅｔ ａｌ．，１９９６）に使用されたものと類似したプロデューサー細胞系
のいずれかから作製することができる。これらの原理を図１１および１２に示す
。例えば、Ｓｏｎｅｏｋａら（１９９５）の記載通りに、２９３Ｔ細胞の３プラ
スミドトランスフクションでｐＨ６Ｒｚ、ｐＳＹＮｇｐおよびｐＲＶ６７（ＶＳ
Ｖ−Ｇ発現プラスミド）を使用して（図１２）、Ｈ６Ｒｚ−ＶＳＶと呼ばれるベ
クター粒子を作製する。これらは、Ｈ６ＲｚゲノムをＣ１８６６またはＪｕｒｋ
ａｔ等のＣＤ４＋細胞に形質導入して、多標的リボザイムを産生する。これらの
細胞におけるＨＩＶ複製は、現在厳しく制限されている。
【０１４０】 上記明細書に記載の全ての出版物を引用することにより本明細書の一部をなす
ものとする。記述されている本発明の方法およびシステムの様々な修飾および変
更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明白になるであ
ろう。具体的な好ましい実施形態と関連して本発明を説明してきたが、特許請求
した本発明は、このような具体的な実施形態に不当に限定されてはならないと理
解すべきである。さらに言えば、分子生物学または関連分野における熟練者に明
らかな、本発明を実行するための記載されている様式の様々な修飾は、クレーム
の範囲内であるものとする。
【０１４１】 ［説明の配列表部分］ 配列番号１ 菌株ＨＸ１３２の野生型ｇａｇｐｏｌ配列（寄託番号Ｋ０３４５５
）
【化４】
【０１４２】
【化４（つづき）】
【０１４３】 配列番号２ ｇａｇｐｏｌ−ＳＹＮｇｐコドン最適化ｇａｇｐｏｌ配列
【化５】
【０１４４】
【化５（つづき）】
【０１４５】 配列番号３ ＨＩＶ−１ＭＮからのエンベロープ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番
号Ｍ１７４４９）
【化６】
【０１４６】
【化６（つづき）】
【０１４７】 配列番号４ Ｓｙｎｇｐ−１６０ｍｎコドン最適化ｅｎｖ配列
【化７】
【０１４８】 参考文献
【表１】
【０１４９】
【表１（つづき）】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 プロドラッグ用量応答を示す。生存率とプロドラッグ濃度のグラフである。Ａ
．がＥ．ｃｏｌｉニトロ還元酵素（ＮＴＲ）／メトロニダゾール（ＭＴＺ）であ
り、Ｂ．がＨＳＶ−１チミジンキナーゼ（ＴＫ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）で
ある。
【図２】 巻き添え効果を示す。生存率とプロドラッグ濃度のグラフである。Ａ．がＮＴ
Ｒ／ＭＴＺであり、Ｂ．がＴＫ／ＧＣＶである。
【図３】 ｐＨ４Ｚ（ｔａｔ−４Ｚ）、触媒活性を除去したアンチ−ｔａｔリボザイム（
ｔａｔ−ＲｚＭ）または抗ｔａｔリボザイム（ｔａｔ−Ｒｚ）を用いて形質導入
されたＣＴＫｔａｔＳＮを含むＨｅＬａ細胞系に関する生存率の棒グラフである
。細胞は、ＧＣＶまたはＧＣＶおよびジエルドリンと共にインキュベートした。
【図４】 ベクターゲノム類の略図である。
【図５】 ４つの異なるＨＩＶベクターに挿入されたリボザイムを概略的に示す図である
。
【図６】 ＰＣＲによる適当な３’ＬＴＲの作製方法を概略的に示す図である。
【図７】 菌株ＨＸＢ２（寄託番号：Ｋ０３４５５）の野生型ＨＩＶｇａｇ、ｐｏｌのコ
ドン使用表である。
【図８】 ｇａｇ,ｐｏｌ−ＳＹＮｇｐと呼ばれるコドン最適化配列のコドン使用表であ
る。
【図９】 ｅｎｖ−ｍｎと呼ばれる野生型ＨＩＶｅｎｖのコドン使用表である。
【図１０】 ＳＹＮｇｐ１６０ｍｎと呼ばれるＨＩＶｅｎｖのコドン最適化配列のコドン使
用表である。
【図１１】 本発明で使用するための３つのプラスミド構築物である。
【図１２】 レトロウイルスベクター粒子を作製するための２つのシステムを支持する原理
を示す図である。
【図１３Ａ、Ｂ】 外部ガイド配列の設計を示す図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年７月１１日（２００１．７．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 キム，ナリー アメリカ合衆国ペンシルヴァニア州19104 −6148、フィラデルフィア、キュリー・ブ ールヴァード 415、クリニカル・リサー チ・ビルディング 326、ユニヴァーシテ ィ・オヴ・ペンシルヴァニア・スクール・ オヴ・メディシン、ハワード・ヒューズ・ メディカル・インスティテュート (72)発明者 コツォポウロウ，エカテリーニ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02115、 ボストン、ロングウッド・アヴェニュー 320、チルドレンズ・ホスピタル、エンダ ーズ 850 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA07 CA11 EA02 HA08 HA11 HA19 HA20 4B063 QA01 QA08 QQ10 QQ53 QR07 QR36 QS32 4B065 AA97X AA97Y AB01 AC20 BA02 CA23 CA46

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｉｎ ｖｉｖｏで使用するのに適した選択システムであって、 （ｉ）ヌクレオチド配列、またはその転写産物に結合して、その直接的または
    間接的な切断を実行することができる遺伝子産物をコードする複数の第１のヌク
    レオチド配列であって、 該ヌクレオチド配列への結合に必要な該第１のヌクレオチド配列の領域が、該
    複数の第１のヌクレオチド配列内で異種である複数の第１のヌクレオチド配列と
    、 （ｉｉ） （ａ）ｍＲＮＡの安定性および／または翻訳に必要な配列に作動可
    能に連結された検出可能なマーカーをコードするコード領域と、 （ｂ）該コード領域と、ｍＲＮＡの安定性および／または翻訳に必要な該配
    列の少なくとも１つとの間に配置された第３のヌクレオチド配列と を含み、 宿主細胞での、隣接するＲＮＡ分子としての（ａ）および（ｂ）の発現を指令
    することができる制御配列に、（ａ）および（ｂ）が作動可能に連結されている
    第２のヌクレオチド配列と を含む選択システム。
  2. 【請求項２】 （ｉ）複数のベクターであって、各ベクターが、ヌクレオチ
    ド配列、またはその転写産物に結合して、その直接的または間接的な切断を実行
    することができる遺伝子産物をコードする第１のヌクレオチド配列を独立に含み
    、 該ヌクレオチド配列に結合するのに必要な該第１のヌクレオチド配列の領域が
    該複数のベクター内で異種である複数のベクターと、 （ｉｉ） （ａ）ｍＲＮＡの安定性および／または翻訳に必要な配列に作動可
    能に連結された検出可能なマーカーをコードするコード領域と、 （ｂ）該コード領域と、ｍＲＮＡの安定性および／または翻訳に必要な該配
    列の少なくとも１つとの間に配置された第３のヌクレオチド配列と を含み、 宿主細胞での隣接するＲＮＡとしての（ａ）および（ｂ）の発現を指令するこ
    とができる制御配列に、（ａ）および（ｂ）が作動可能に連結されている第２の
    ヌクレオチド配列であって、該複数のベクター内に存在するかまたは別のベクタ
    ーの一部として存在する第２のヌクレオチド配列と を含むベクターシステム。
  3. 【請求項３】 前記遺伝子産物が、リボザイム、アンチセンスリボ核酸およ
    び外部ガイド配列から選択される請求項１または２に記載のシステム。
  4. 【請求項４】 前記ベクターがウイルスベクターである請求項２または３に
    記載のシステム。
  5. 【請求項５】 前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである請求
    項４に記載のシステム。
  6. 【請求項６】 前記検出可能なマーカーが選択可能なマーカーである請求項
    １〜５のいずれか１項に記載のシステム。
  7. 【請求項７】 前記選択可能なマーカーが、プロドラッグを細胞障害性化合
    物に転換することができる酵素である請求項６に記載のシステム。
  8. 【請求項８】 前記酵素がチミジンキナーゼであり、前記プロドラッグがガ
    ンシクロビルである請求項７に記載のシステム。
  9. 【請求項９】 前記第３のヌクレオチド配列が、前記第２のヌクレオチド配
    列の３’および／または５’非翻訳領域内に存在する請求項１〜８のいずれか１
    項に記載のシステム。
  10. 【請求項１０】 複数のウイルス粒子であって、各ウイルス粒子が請求項１
    に記載の第１のヌクレオチド配列および／または請求項１に記載の第２のヌクレ
    オチド配列を含む複数のウイルス粒子。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の複数のウイルス粒子を作製する方法で
    あって、（ｉ）請求項１に記載の複数の第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）請
    求項１に記載の第２のヌクレオチド配列とを、プロデューサー細胞に導入するス
    テップを含む方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の方法により作製された複数のウイルス
    粒子。
  13. 【請求項１３】 請求項１に記載の複数の第１のヌクレオチド配列から、第
    ３のヌクレオチド配列またはその転写産物に結合して、その直接的または間接的
    な切断を実行することができる遺伝子産物をコードする第１のヌクレオチドを選
    択する方法であって、 （ｉ）１つ以上の第１のヌクレオチド配列を、請求項１に記載の第２のヌクレ
    オチド配列を含む宿主細胞に導入するステップと、 （ｉｉ）検出可能なマーカーが該宿主細胞で活性型で発現しない場合に、該宿
    主細胞を選択するステップと、任意選択的に、 （ｉｉｉ）該第１のヌクレオチド配列を単離して、そのヌクレオチド配列を決
    定するステップと を含む方法。
  14. 【請求項１４】 ステップ（ｉｉ）において、前記検出可能なマーカーが選
    択可能なマーカーであり、前記宿主細胞を該選択可能なマーカーの存在下で細胞
    障害性の化合物と接触させる請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記選択可能なマーカーがチミジンキナーゼであり、前記
    化合物がガンシクロビルである請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記検出可能なマーカーをコードするコード領域に結合し
    て、その切断直接的または間接的切断を実行することができる遺伝子産物をコー
    ドする任意の第１のヌクレオチド配列を除去するための選択ステップをさらに含
    む請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 複数の第１のヌクレオチド配列中の各第１のヌクレオチド
    配列が、検出可能なマーカーの不活性な変異型をコードする第４のヌクレオチド
    配列の下流に位置する請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記複数の第１のヌクレオチド配列が、複数のウイルスベ
    クター中に存在し、前記ウイルスベクターが検出可能なマーカーの不活性な変異
    型をコードする第４のヌクレオチド配列を含み、前記選択ステップで前記複数の
    ベクターが１つまたは複数のプロデューサー細胞に導入され、得られた伝染性ウ
    イルス粒子が、ステップ（ｉ）で該第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチ
    ド配列を含むプロデューサー細胞に導入するのに使用される請求項１６または１
    ７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法により得ら
    れた第１のヌクレオチド配列。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の第１のヌクレオチド配列を含む、レト
    ロウイルスベクター。
  21. 【請求項２１】 治療における使用のための請求項１９に記載の第１のヌク
    レオチド配列。
  22. 【請求項２２】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の選択システムを使用
    してｍＲＮＡ分子上のオープン部位を識別する方法。
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