CN106061476B - 异黄酮在逆转录病毒感染治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的实施方案提供基于潜伏病毒，特别是潜伏HIV病毒的再活化，来治疗潜伏逆转录病毒感染的新方法。本发明的实施方案也提供含有由式I和式II表示的异黄酮核心结构的化合物，包括能够在受治疗者中诱导病毒再活化的其类似物和其药学上可接受的衍生物。还提供通过给予药学有效量的本发明化合物，来再活化受治疗者中潜伏HIV感染的方法。这些化合物可以单独给药或者与涉及治疗处于病毒复制活性阶段的HIV感染的疗法例如HAART和/或涉及刺激受治疗者免疫系统的疗法联合给药。

Description

异黄酮在逆转录病毒感染治疗中的应用
发明领域
本发明部分涉及通过施用药剂（例如异黄酮）而治疗逆转录病毒感染（例如HIV感染）的方法。
发明背景
潜伏病毒是存在于细胞内的无活性病毒。许多逆转录病毒有能力作为潜伏病毒存在于宿主细胞内。潜伏病毒并不引起宿主细胞的快速裂解，而是在临床症状出现之前在宿主体内长期保持潜伏状态。术语潜伏期用来表示从感染到临床表现的间隔。被特定触发物启动后，潜伏病毒则可以开始复制并引发疾病。许多抗病毒药无法消除潜伏病毒；然而，对活跃复制的病毒有效。
人免疫缺陷病毒(HIV)是一种慢病毒(缓慢复制的逆转录病毒)，是能够长期以潜伏阶段存在于宿主体内的病毒的实例。HIV是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子。AIDS引起人类免疫系统进行性失效，引发机会性感染。目前，AIDS是全球最具毁灭性的人类疾病之一(Barresinoussi等人，1983； UNAIDS，2012)。到2011年底为止，大约34,000,000人患有HIV，2,500,000人是该年新感染者，1,700,000人死于AIDS (UNAIDS，2012)。
尽管“高活性抗逆转录病毒疗法”(HAART)显示出能够将HIV-1水平抑制到检测不到的水平，但是这种疗法不能有效地减少残余物，即整合到宿主细胞基因组中的潜伏原病毒DNA (Chun等人，1997；Finzi等人，1997；Wong等人，1997)。HIV-1能够在T细胞水平上建立潜伏感染状态(R. F. Siliciano和Greene，2011)。当活化CD4+ T细胞被HIV-1感染并变成长寿静息记忆状态时，病毒复制不被容许。观察到极低速度的HIV-1储库衰退，导致在60年内治疗受HIV感染的个体(Finzi等人，1999；J. D. Siliciano等人，2003；Strain等人，2003)。因此，单独的HAART无法消除HIV-1。当抗逆转录病毒疗法中断时，HIV-1病毒血症反弹。HIV-1储库产生屏障，抵抗HIV-1根除，使HAART无用。
潜伏的分子机制是复杂的，包括缺乏关键宿主转录因子(例如NFkB、Sp1和NFAT)核型的静息CD4+ T细胞、缺乏Tat和促进有效转录延伸的相关宿主因子、抑制HIV-1基因表达的外遗传改变以及转录干扰(Graci, Colacino, Peltz, Dougherty和Gu, 2009；R. F.Siliciano和Greene，2011)。分子研究已经确立：诱导型宿主转录因子刺激从HIV-1 LTR的转录(Contreras等人，2009；Folks等人，1986；Graci等人，2009；R. F. Siliciano和Greene，2011)。也已采用免疫活化策略做出了清除潜伏感染的细胞的临床尝试。也研究了从潜伏状态再活化HIV-1的小分子。
需要活化潜伏病毒(例如潜伏逆转录病毒，如HIV)的新干涉方法。在HIV感染的受治疗者体内，HIV-1表达的活化与HAART联合预期会导致T细胞使表达病毒蛋白的细胞凋亡或者宿主免疫系统对表达病毒蛋白的细胞的破坏，并因此使存留的HIV-1储库被耗尽。这种干涉不会只抑制HIV感染，而是还可以消除HIV感染。
发明简述
本发明涉及用于使潜伏逆转录病毒感染(如HIV感染)再活化的药物制剂和方法。本发明部分基于下述发现：异黄酮及其衍生物(例如黄豆苷元(Daidzein) (DDZ))可以用来激活潜伏感染细胞内休眠整合型逆转录病毒(如HIV)的表达，从而使潜伏逆转录病毒感染枯竭。此外，对潜伏逆转录病毒感染的选择性诱导会容许其他抗逆转录病毒药和抗病毒免疫应答接近并消除残留的逆转录病毒感染。
本发明的一个方面涉及用异黄酮或其可药用衍生物使潜伏逆转录病毒感染(如HIV感染)再活化的方法。本发明也包括研究在不同细胞模型中用有效量的异黄酮在转录水平上经长末端重复(LTR)的再活化机制的方法。
还提供具有能从潜伏感染细胞再活化潜伏逆转录病毒的异黄酮核心结构的化合物。也提供使用具有再活化和/或治疗潜伏逆转录病毒感染的异黄酮核心结构的化合物的方法。
使受治疗者体内潜伏逆转录病毒感染再活化的方法可以单独实施，或与涉及治疗处于病毒复制活性阶段的所述逆转录病毒感染的疗法和/或涉及刺激受治疗者免疫系统的疗法联合实施。
本发明的其他特征和优点从以下详细描述和权利要求书来看是显而易见的，并且被以下详细描述和权利要求书所包括。
附图简述
图1. 人免疫缺陷病毒(HIV)的解剖结构。
图2. 特定长寿细胞类型中的原病毒潜伏。有复制能力的HIV存在于静息CD4+ T细胞中，尽管长期暴露于抗逆转录病毒药也允许病毒持续存在多年而不发展。HIV的这种潜伏储库可以解释抗逆转录病毒治疗不能治愈HIV感染。
图3. 异黄酮在潜伏感染细胞中的再活化能力。图3A显示分别用50μg/ml DDZ、DDN、GST、GSN、GCT和GCN处理的潜伏HIV-1感染细胞模型J-Lat全长克隆10.6第1天上清液中的p24产生结果。图3B显示分别用50μg/ml DDZ、DDN、GST、GSN、GCT和GCN处理的潜伏HIV-1感染细胞模型J-Lat全长克隆10.6第2天上清液中的p24产生结果。图3C显示分别用50μg/mlDDZ、DDN、GST、GSN、GCT和GCN处理的潜伏HIV-1感染细胞模型J-Lat全长克隆10.6第3天上清液中的p24产生结果。10μM辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)和125ng/ml佛波醇肉蔻酸酯乙酸酯(PMA)用作阳性对照，0.25% DMSO用作阴性对照。所有结果以相比于未处理细胞的诱导倍数来显示。
图4. TZM-Bl细胞中异黄酮诱导的刺激。图4A显示DDZ在TZM-Bl细胞中的刺激能力。图4B显示DDN在TZM-Bl细胞中的刺激能力。图4C显示GST在TZM-Bl细胞中的刺激能力。图4D显示GSN在TZM-Bl细胞中的刺激能力。图4E显示GCT在TZM-Bl细胞中的刺激能力。图4F显示GCN在TZM-Bl细胞中的刺激能力。TZM-Bl细胞与连续稀释的DDZ、DDN、GST、GSN、GCT或GCN一起孵育48hr。将细胞裂解，测定荧光素酶表达水平。10μM SAHA和0.25% DMSO分别用作阳性对照和阴性对照。所有结果以相比于未处理细胞的诱导倍数来显示。
图5. 异黄酮在用pLTR-Luc转染的293T细胞中的刺激能力。用pLTR-Luc转染的293T细胞与连续稀释的DDZ、DDN、GST、GSN、GCT或GCN一起孵育48hr。将细胞裂解，测定荧光素酶表达水平。10μM SAHA和125ng/ml PMA用作阳性对照，0.25% DMSO用作阴性对照。所有结果以相比于未处理细胞的诱导倍数来显示。
图6. 黄豆苷元(Daidzein)从潜伏感染T细胞中再活化HIV。A72 (A)、J lat (B)或Ul (C)用50ug/ml黄豆苷元(Daidzein)或用作阳性对照的10 μM SAHA和125ng/ml PMA和用作阴性对照的0.25% DMSO刺激3天。6A 显示3天处理后用流式细胞术的GFP表达。B和C显示1、2和3天处理后用p24 ELISA在J Lat和U1细胞上清液中测量的病毒复制。所有结果以相比于未经刺激对照的诱导倍数来显示。
图7. 黄豆苷元(Daidzein)在转录水平上活化HIV复制。TZM-Bl细胞用增加浓度的黄豆苷元(Daidzein)刺激72 h。裂解细胞，测量荧光素酶活性。所有结果以相比于未经刺激对照的诱导倍数来显示。B，J Lat和C，TZM-Bl细胞与或不与Akt抑制剂一起预孵育，或者用或不用黄豆苷元(Daidzein) (50 μM)处理，用p24 ELISA评价病毒复制。
图8. 黄豆苷元(Daidzein)类似物活化HIV LTR。连续稀释的化合物与TZM-B1细胞在96孔板中共同培养。PMA和SAHA用作阳性对照，溶剂DMSO用作阴性对照。处理2天后裂解细胞，测试荧光素酶活性。
图9. 黄豆苷元(Daidzein)及其类似物在潜伏细胞模型J Lat全长克隆10.6中活化HIV复制。连续稀释的化合物与细胞在96孔板中共同培养。PMA和SAHA用作阳性对照，溶剂DMSO用作阴性对照。处理第1天(A)、第2天(B)和第3天(C)后收获细胞上清液，进行p24测试。
发明详细公开
下面参考实施例描述本发明的几个方面，实施例仅用于说明目的。应当理解，阐述众多特定细节、关系和方法是为了提供对本发明的全面理解。然而，相关领域的普通技术人员会容易认识到：本发明可以不用所述特定细节中的一个或多个来实施，或者可以用其他方法、方案、试剂、细胞系和动物来实施。本发明并不受所述的行为或事件的顺序所限制，因为某些行为可以按不同顺序发生和/或与其他行为或事件同时发生。此外，并非所有所述的行为、步骤或事件都是实施本发明方法学所需的。所述的或其中引用的技术和程序中的许多是众所周知的，且是本领域技术人员采用常规方法通常使用的。
在详细阐述本发明之前，对若干术语进行定义对于理解本发明可能是有帮助的，因此下面介绍这些术语。除非另有限定，否则本文所用的领域的所有术语、注释和其他科学术语或用辞意欲具有发明所属领域技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为了清楚起见和/或为了容易参考，在本文中对具有通常理解含义的术语给出了定义，本文中包括这样的定义不应当被解释为表示相对于本领域通常理解的有实质差异。应当进一步理解：术语(诸如常用字典中定义的那些)应当被解释为具有与相关领域环境中其含义相一致的含义和/或具有如本文他处限定的含义。
本文所用的单数形式″一种″、“一个”和″该”包括单数和复数指示物，除非上下文中明确另有所指。
本文所用的术语“包括”、“包含”与“含有”或者“含”同义，是包容性的或开放式的，并非排除额外的、未列举的成员、要素或方法步骤。数值范围以端点记载则包括相应范围内所包括的所有数值和分数以及所记载的端点。
本文所用的术语“药剂”或“剂”意指任何化学物质(例如无机物或有机物)、生物化学物质或生物学物质、分子或大分子(例如生物大分子)、它们的组合或混合物、组成未确定的样品、或从生物材料(如细菌、植物、真菌、动物细胞或组织)制备的提取物。药剂或剂的实例包括但不限于核酸、寡核苷酸、核酶、多肽、蛋白质、肽、肽模拟物、抗体、抗体片段或衍生物、适体、化学物质、有机分子、有机小分子、脂质、糖水化合物、多糖等以及它们的任意组合。
短语“治疗有效量”意指按照本发明治疗逆转录病毒感染(如HIV感染)所用的活性成分的量。该量将减少或消除所述逆转录病毒感染。
术语“预防(prophylaxis)”涉及“防止(prevention)”，意指目的在于预防而不是治疗或治愈疾病的措施或方法。因此，术语“预防有效量”是指防止接受预防有效量的主题化合物的受治疗者中HIV感染的主题化合物的量。
本文所用的“预防”或“防止”包括但不限于延迟症状发作、防止疾病复发或其组合。本文所用的预防或防止并不要求完全缺乏症状。
关于涉及本发明的一般性方法，特别参考众所周知的教科书，包括例如″Molecular Cloning: A Laboratory Manual″ (Sambrook, 2001), Animal Cell Culture(Morgan, 1993), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller, 1987); ″Short Protocols in Molecular Biology, 3nd Ed.″ (Ausubel, 1992); “RecombinantDNA Methodology II” (Wu, 1995)。
在本文中，术语“逆转录病毒”以其常规含义使用，通常包括其中遗传物质为单链RNA且在宿主中其利用逆转录酶将病毒RNA转录成DNA的一类病毒。本文所指的逆转录病毒可以特别属于病毒家族逆转录病毒科(Retroviridae)，更特别属于亚科慢病毒(Lentivirinae)。本文所指的逆转录病毒可以是致病的(即在受感染宿主中引起可表现的疾病表型)，或者可以是非致病的(即其中受感染宿主的状态并不表现看论证的疾病表型)。本文特别意指的是感染动物的逆转录病毒，更优选温血动物(甚至更优选脊椎动物，再更优选哺乳动物，还更优选灵长类动物，最优选人类)的逆转录病毒。本文特别优选人逆转录病毒，包括但不限于人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、绵羊脱髓鞘性脑白质炎慢病毒、牛免疫缺陷病毒(BIV)、猿猴逆转录病毒2型(SRV-2)、猿猴逆转录病毒1型(SRV-1)、松鼠猴逆转录病毒(SMRV-H)、猿猴梅森辉瑞病毒(MPMV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、小鼠脑池内a颗粒(IAP-MIA14)、仓鼠脑池内a颗粒(IAP-H18)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、牛白血病病毒(BLV)、人T细胞白血病病毒II型(HTLV-2)、人T细胞白血病病毒I型(HTLV-1)、狒狒内源病毒(BaERV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FeLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)、人泡沫逆转录病毒(HSRV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)和人内源逆转录病毒(HERV)。
提及“与逆转录病毒相关的疾病或病症”时一般包括因宿主已经感染逆转录病毒所致宿主的任何和所有的状况。这样的状况可以包括但不限于受感染宿主中存在病毒性生物材料，例如受感染宿主的一个或多个细胞的基因组中存在原病毒和/或受感染宿主中存在病毒核酸、病毒蛋白或病毒颗粒。这样的状况也可以包括原病毒休眠或潜伏时的阶段、病毒在受感染宿主中产生但无可表现的疾病症状的前临床阶段、以及涉及可表现的疾病症状的临床阶段（诸如例如由HIV-1和HIV-2引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)或者由HTLV-1引起的成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)或热带痉挛性瘫痪(TSP)。
提及靶标(诸如复合物或蛋白)的“活性”时一般可以包括所述靶标生物活性的任何一个或多个方面，例如但不限于其生物化学活性、酶活性、信号传导活性和/或结构活性的任何一个或多个方面，例如在细胞、组织、器官或生物体内的活性。优选的是，所述活性是甲基化活性。
在一个实施方案中，靶标(诸如复合物或蛋白)的活性可以通过在细胞、组织、器官或生物体中导入或表达所述靶标的显性阴性变体(例如所述复合物的一个或多个成分的显性阴性变体、或所述蛋白的显性阴性变体)而受到调节，和特别是降低。
提及靶标(诸如复合物或蛋白)的“水平”时优选可以包括所述靶标的量和/或利用度(例如执行其生物活性的利用度)，例如在细胞、组织、器官或生物体内的量和/或利用度。例如，通过调节靶标的表达和/或调节已表达的靶标，可以调节靶标的水平。例如在编码所述靶标的异源核RNA (hnRNA)、前体mRNA (pre-mRNA)、mRNA或cDNA水平上，可以达到或观测到对靶标表达的调节。例如，通过本领域已知的方法，例如通过用反义因子(agent)诸如例如反义DNA或RNA寡核苷酸、编码所述反义因子的构建物或RNA干扰因子(agent)如siRNA或shRNA或其编码核酶或载体等，转染(如通过电穿孔、脂转染等)或转导(例如利用病毒载体)细胞、组织、器官或生物体，可以达到减少靶标的表达。
此外，通过本领域已知的方法，例如用处于影响细胞、组织、器官或生物体内适宜表达水平的调节序列控制下编码靶标的重组核酸来转染(例如通过电穿孔、脂转染等)或转导(例如利用病毒载体)所述细胞、组织、器官或生物体，可以达到增加所述靶标的表达。
所述靶标的水平可以例如通过改变所述靶标的形成(诸如例如导致复合物形成的折叠或相互作用)和/或所述靶标的稳定性(例如复合物组分缔合成复合物或从复合物解离的倾向)、降解或细胞定位来调节。
术语“阳性对照”意指其中预期有某一现象的组别。也就是说，它们通过利用业已知晓产生某一效果的实验处理，确保在应该有影响时出现该效果(然后将该效果与实验调查的处理相比较)。在此，阳性对照的实例是PMA和SAHA。
术语“阴性对照”意指其中预期无某一现象的组别。它们确保在应该无影响时无效果。为了继续药物测试实例，阴性对照是尚未施用目标药物的组别。该组不接受制剂，接受假制剂(即安慰剂)、仅有赋形剂(也称为仅有溶媒)的制剂或众所周知的“糖丸”。对照组应当显示出阴性效果或无效果。在此，阴性对照的一个实例是二甲基亚砜(DMSO)，其为溶解极性化合物和非极性化合物两者的极性非质子溶剂，且在广泛的有机溶剂和水中混溶。
术语“pLTR-Luc”意指含有HIV长末端重复(LTR)启动子和荧光虫荧光素酶报道基因的质粒。在一个实施方案中，pLTR-Luc用于研究受试样品调节来自LTR的基因表达的能力。pLTR-Luc质粒的构建基于分子克隆载体pVAX1和HIV骨架pNL4-3 R-E-Luc+。将pLTR-Luc质粒与聚乙烯亚胺(PEI)混合，加入293T细胞中进行转染。加入受试样品用于随后的刺激。
本文所用的术语“受治疗者”意指受逆转录病毒感染的个体，其可以是人类或非人类动物。
人免疫缺陷病毒(HIV)是慢病毒(Lentivirus)，后者是逆转录病毒科(Retroviridae)的成员。它是单链正义二倍体有包膜RNA病毒。一旦进入靶细胞内，病毒RNA基因组则通过随病毒基因组被转运进入靶细胞细胞质内的病毒编码的逆转录酶逆转录到双链DNA中。随后，所转录的病毒DNA被输入到靶细胞细胞核内，通过整合酶(也由病毒编码)整合到核DNA中。HIV和其他慢病毒的潜伏因其能整合到宿主细胞基因组中并以潜伏形式停留于此(即无复制)的能力所致。
因此，所述病毒避免被免疫系统检测到，可以停留于此达数年，产生被感染受治疗者体内所谓的HIV“储库”。一旦病毒被再活化，病毒DNA则被转录，产生新的RNA基因组和病毒蛋白，它们经过包装，作为新病毒颗粒从细胞中释放出来，所述新病毒颗粒可以感染新的细胞。HIV主要感染免疫系统细胞，从而减弱被感染受治疗者的免疫应答，由此得名“免疫缺陷病毒”。
当病毒变成能够复制时，HIV阳性受治疗者可能发生AIDS。本质上，HIV会攻击和破坏CD4+ T细胞、巨噬细胞和小胶质细胞。T细胞和巨噬细胞被破坏将使受治疗者容易受到正常情况下容易被受治疗者免疫系统避免的感染所感染。当受治疗者血液中的CD4+ T细胞数量降至低于200个细胞/μl时，细胞介导的免疫丧失，各种各样的机会微生物感染出现。然后，常见的机会感染和肿瘤(其大多数正常情况下受强壮的CD4+ T细胞介导的免疫控制)开始影响所述受治疗者。在患有HIV感染或AIDS的受治疗者未得到治疗时，由于免疫系统受损，他可能最终死于在其他情况下易于治愈的感染。
由于HIV的潜伏特征，如果例如通过持续的抗病毒治疗来控制，则导致HIV-DNA储库可以在被感染受治疗者的整个寿命期间继续存在，而无任何显著病征。然而，终止所述治疗会最终导致病毒被再活化。因此，被感染受治疗者可能从未完全无HIV感染。
已经表征了两种类型的HIV：HIV-1和HIV-2。HIV-1是最初被发现的病毒，是毒力最强的类型，感染性更强，是世界上大多数HIV感染的病因。HIV-2感染性较低，暴露于HIV-2的人群中有较小百分比被感染。HIV-2主要限于西非。
美国治疗HIV感染的治疗指南由美国卫生和人类服务部(DHHS)制定。最新的成人和青少年指南始于2009年12月1日。所述最新指南的细节可于万维网站：aidsinfo.nih.gov/contentfiles/lvguidelines/adultandadolescentgl.pdf获得，其内容通过引用而全文结合至本文中。这些指南在将来可能被修改，这样的改变在实施本发明时可被考虑。
高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)不足以消除受治疗者体内的HIV感染。本发明提供可以用来再活化潜伏HIV感染的化合物和方法。细胞内的被再活化的HIV感染很容易被受治疗者的免疫系统和/或HAART消除。本发明可以单独实施，或与靶向病毒复制活性期的HIV感染的其他HIV疗法(例如HAART)联合实施，以达到消除受治疗者体内的HIV感染。因此，本发明提供可以消除受治疗者体内HIV感染的化合物和方法。
本发明的实施方案提供被称为异黄酮的一类化合物及其衍生物，和其在活化潜伏逆转录病毒感染(例如潜伏HIV感染)的用途。异黄酮包括通常天然存在的、与异黄酮类化合物相关的一类有机化合物。有营养价值的异黄酮是异黄酮的取代衍生物，通过两个或三个氢原子被羟基置换而与母体相关。本发明实施方案的异黄酮包括但不限于黄豆苷元(Daidzein)、黄豆苷(Daidzin)、金雀异黄素(Genistein)、金雀异黄苷(Genistin)、黄豆黄素(Glycitein)、黄豆黄苷(Glycitin)及其可药用衍生物。可药用衍生物包括酰胺、盐、酯、醚、有机基衍生物、水合物或溶剂合物。其他可药用衍生物是本领域普通技术人员众所周知的，这些衍生物在本发明范围内。
异黄酮通过在高等植物中产生类黄酮化合物的通用苯丙素类(phenylpropanoid)途径的分支产生。苯丙素类途径由氨基酸苯丙氨酸开始，该途径的中间体柚皮素被两种豆科植物特有的酶异黄酮合酶和脱水酶序贯转变为异黄酮金雀异黄素。同样的，另一种中间体柚皮素查耳酮经过三种豆科植物特有的酶查耳酮还原酶、II型查耳酮异构酶和异黄酮合酶序贯作用，转变为异黄酮黄豆苷元。
本发明异黄酮的某些实例提供于表1中。
表1. 可以再活化潜伏逆转录病毒(例如潜伏HIV-1)的异黄酮实例。所述异黄酮包括DDZ、DDN、GST、GSN、GCT、GCN及其可药用衍生物。
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
本发明的实施方案也提供如下所述的一类式I和式II化合物及其用于再活化潜伏逆转录病毒感染(例如潜伏HIV感染)的用途。式I和式II的结构提供于表2。
表2. 能够再活化潜伏逆转录病毒(如潜伏HIV-1)的本发明异黄酮的核心结构。
Figure 31994DEST_PATH_IMAGE002
本发明的实施方案还提供再活化受治疗者体内潜伏逆转录病毒感染(例如HIV感染)的方法。这类方法可以包括给需要这种治疗的受治疗者施用治疗有效量的一种或更多种异黄酮、其可药用衍生物或其组合。本发明的实施方案也提供再活化受治疗者体内潜伏逆转录病毒感染(例如HIV感染)的方法，包括给需要这种治疗的受治疗者施用治疗有效量的具有异黄酮核心结构的化合物，所述化合物选自：
a) 式I化合物：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE003
，或
b) 式II化合物：
Figure 949134DEST_PATH_IMAGE004
，
其中R1、R2、R3和R4互相独立地为H、OH、糖基、卤素、CH3、OCH3、CA3、OCA3、CN、NO2、A或OA，并且其中A为具有1-12个碳原子的支链或直链烷基，其中一个或更多个H原子可以被Hal、OH、OA、COOH、COOA、CN或N(A)2置换。
在一个实施方案中，本发明提供通过给需要这种治疗的受治疗者施用治疗有效量的一种或更多种异黄酮——式I或式II化合物、其可药用衍生物或它们的组合从而治疗受治疗者的逆转录病毒感染(例如HIV感染)的方法。在某些实施方案中，施用式I或式II化合物、其可药用衍生物或它们的组合的方法可以单独施用，或者与用于针对病毒感染活性期逆转录病毒感染的其他疗法联合施用。例如，一种通过施用式I或式II化合物、其可药用衍生物或它们的组合再活化受治疗者的HIV感染的方法与HAART联合实施。
在本发明的其他实施方案中，通过再活化逆转录病毒感染治疗受治疗者的逆转录病毒感染的方法，与涉及刺激受治疗者免疫系统的一种或更多种疗法联合实施。刺激受治疗者免疫系统可以促进受治疗者更强地抗击感染(例如再活化的HIV感染)和/或其他微生物感染。
涉及刺激受治疗者免疫系统的疗法的非限制性实例包括基于树突细胞的免疫疗法、T细胞过继转移、自体免疫增强疗法、基因工程T细胞、免疫恢复和/或疫苗接种。常规施用这些疗法和/或涉及治疗HIV感染的改进方法是本领域普通技术人员众所周知的，这样的常规施用和/或改进在本发明范围内。
涉及刺激受治疗者免疫系统的疗法的非限制性实例包括给受治疗者施用一种或更多种细胞因子。这类细胞因子包括但不限于白介素-2、白介素-4、白介素-5、白介素-7、白介素-10、转化生长因子-α、干扰素-γ和它们的组合。
涉及刺激受治疗者免疫系统的疗法可以包括施用能刺激免疫系统的小分子化合物、草药提取物和/或其组合。
高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)：抗逆转录病毒疗法(ART)是采用抗HIV药物治疗感染了人免疫缺陷病毒(HIV)的人员。标准的治疗由抑制HIV复制的至少三种药物的组合组成(通常被称为“高活性抗逆转录病毒疗法”或HAART)。使用三种药物是为了降低病毒产生抗性的可能性。ART具有降低HIV感染人员死亡率和发病率以及改善其生活质量两者的潜力。HAART降低受治疗者的HIV总负载、维持免疫系统功能并且防止通常导致死亡的机会感染。
美国国立卫生研究所和其他机构推荐为所有AIDS受治疗者提供抗逆转录病毒治疗。由于治疗方案选择和跟踪的复杂性、副作用的严重程度和患者依从以防止病毒产生抗性的重要性，这类机构强调受治疗者参与疗法选择的重要性并且建议分析低病毒负载受治疗者的风险和潜在益处。
HAART出现的日期被确定至1996年7月7-16日在大不列颠哥伦比亚省温哥华召开的第11届关于AIDS的国际会议。该会议期间Aaron Diamond AIDS Research Center, NewYork, NY的David Ho, MD和University of Alabama at Birmingham School ofMedicine的George Shaw, MD, PhD发布了病毒动态数据，数据显示平均HIV感染人员产生10,000,000,000病毒颗粒/日，使得强烈聚焦于这样的事实：这是一种需要抗病毒治疗的病毒感染。会议后Hammer及其同事以及Gulick和共同研究人员在New England Journal ofMedicine上连续发表文章，阐述了基于茚地那韦的HAART的实质利益。这一3药物疗法的理念被迅速结合到临床实践中，并快速地显示出引人注目的益处：AIDS发病率、死亡率和住院率降低60%-80%。
有几类药物通常联合使用来治疗HIV感染。这些药物的联合使用通常被称为ART或抗逆转录病毒疗法。抗逆转录病毒(ARV)药根据药物所抑制的逆转录病毒生活周期的阶段被大体上进行分类。典型的组合包括两种NRTI (核苷逆转录酶抑制剂)和一种PI (蛋白酶抑制剂)或者两种NRTI和一种NNRTI (非核苷逆转录酶抑制剂)。抗逆转录病毒药的组合经受正协同作用和负协同作用，这限制了可用组合的数量。
进入抑制剂(或融合抑制剂)通过阻断若干靶标之一而干扰HIV-1与宿主细胞的结合、融合和HIV-1进入宿主细胞。马拉韦罗和恩夫韦肽是两种该类药物。马拉韦罗通过靶向位于人辅助T细胞上的共受体CCR5而发挥作用。由于允许HIV靶向替代共受体如CXCR4的嗜性可能发生变化，故施用这种药物时应当小心。在罕见的病例中，个体可能有CCR5δ基因突变，导致CCR5共受体无功能，进而产生抗性手段或导致该病缓慢发展。然而，如先前所提及，如果靶向CXCR4的HIV变体变成显性，那么这可被克服。为了防止病毒与宿主细胞膜融合，可以使用Fuzeon (T20)。Fuzeon是一种必须注射的肽类药物，通过与HIV gp41的N末端七重复序列相互作用形成无活性异六螺旋束、因而防止宿主细胞被感染，从而发挥作用。
核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)和核苷酸逆转录酶抑制剂(NtRTI)是抑制逆转录的核苷类似物和核苷酸类似物。NRTI是链终止剂，一旦被掺入，因其缺乏3’ OH基团通过防止其他核苷也被掺入而发挥作用；它们皆作为竞争性底物抑制剂起作用。NRTI的非限制性实例包括脱氧胸苷、齐多呋定、司他夫定、地达诺新、扎西他宾、阿巴卡韦、拉米夫定、恩曲他滨和替诺福韦。
非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)通过与该酶的变构位点结合而抑制逆转录酶；NNRTI作为逆转录酶的非竞争性抑制剂。NNRTI通过结合活性部位附近并引起“分子关节炎”而影响逆转录酶对底物(核苷酸)的处理。NNRTI可以被进一步分类为第1代和第2代NNRTI。第1代NNRTI结构上更刚性，针对它们的抗性可被快速地产生；然而，第2代NNRTI具有更具柔性的结构，可以更容易调节和更有效地抵抗突变。NNRTI例如包括奈韦拉平、地拉夫定、依法韦仑和利匹韦林。
整合酶抑制剂抑制整合酶，该酶负责将病毒DNA整合到受感染细胞的DNA中。有几种整合酶抑制剂目前处于临床试验中，雷特格韦(raltegravir)于2007年10月首先获FDA批准。雷特格韦有两个金属结合基团，在整合酶的金属结合位点与两个Mg2+离子竞争底物。另一个被批准用于临床的整合酶抑制剂是埃替拉韦。
蛋白酶抑制剂阻断病毒蛋白酶，该酶是从宿主细胞膜出芽时产生成熟病毒粒子所必需的。特别是，这些药物防止gag和gag/pol前体蛋白的切割。在蛋白酶抑制剂存在下产生的病毒粒子有缺陷，大多数是无感染性的。HIV蛋白酶抑制剂的非限制性实例是洛匹那韦、茚地那韦、那非那韦、安泼那韦和利托那韦。成熟抑制剂通过与gag结合而具有相似的作用，但是，在该类中开发出两个实验性药物—贝韦立马和Vivecon，后者于2010年停用。对某些蛋白酶抑制剂的抗性高。已经开发出第二代药物，它们对在其他情况下的抗性HIV变体有效。
当抗逆转录病毒药被不当使用时，这些多药物抗性毒株可能非常快速地变成占优势基因型。不当地连续使用逆转录酶抑制剂齐多呋定、地达诺新、扎西他宾、司他夫定和拉米夫定可导致产生多药物抗性突变。这些突变可以包括V75I、F77L、K103N、F116Y、Q151M和M184V突变。这些突变在蛋白酶抑制剂被广泛使用之前就被观测到。突变体保持对早期蛋白酶抑制剂沙奎那韦的敏感性。这些突变体也对罕用的逆转录酶抑制剂膦甲酸敏感。
近年来，制药公司一直在共同研究以将这些复杂治疗方案组合成更简单的配方，被称为固定剂量组合。例如，含有两种或三种药物的两个丸剂可以每日各服用两次。这大大提高了它们可被服用的容易性，进而提高了坚持性，因而提高了其长期有效性。缺乏坚持是经历过药物治疗的受治疗者中产生抗性的原因。维持适当疗法的受治疗者可以保持一种治疗方案而不产生抗性。这大大提高了预期寿命，并且如果有需要则留下更多药物可供个体使用。
可与本发明化合物一起施用的HAART治疗方案的实例包括但不限于：替诺福韦/恩曲他滨(两种NRTI的组合)和依法韦仑(一种NNRTI)；替诺福韦/恩曲他滨和雷特格韦(一种整合酶抑制剂)；替诺福韦/恩曲他滨、利托那韦和达芦那韦(后两者是蛋白酶抑制剂)；和替诺福韦/恩曲他滨、利托那韦和阿扎那韦(后两者是蛋白酶抑制剂)。
因此，在本发明的进一步实施方案中，通过再活化逆转录病毒感染而治疗受治疗者体内逆转录病毒感染的方法与涉及治疗逆转录病毒感染的一种或更多种疗法联合实施。涉及治疗逆转录病毒感染的疗法包括施用选自以下的一种或更多种药物：核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂和它们的组合。可用于本发明实施方案的核苷逆转录酶抑制剂包括替诺福韦、恩曲他滨及其组合。可用于本发明实施方案的非核苷逆转录酶抑制剂包括依法韦仑。可用于本发明实施方案的蛋白酶抑制剂包括利托那韦、达芦那韦、阿扎那韦和它们的组合。可用于本发明实施方案的整合酶抑制剂包括雷特格韦。在优选实施方案中，涉及治疗逆转录病毒感染的疗法包括施用两种核苷逆转录酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂，或者施用两种核苷逆转录酶抑制剂和一种非核苷逆转录酶抑制剂。
按照本发明实施方案和按照本发明实施方案使用的药物组合物，除活性成分外，可以包含可药用赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他材料。这些材料应当是无毒的，且不应当干扰活性成分的功效。载体或其他材料的精准性质将取决于给药途径，后者可以是任何系统给药常规途径。优选所述药剂经口服施用。按照本发明可以使用的其他给药途径包括经直肠、胃肠外、注射(例如静脉内、皮下、肌内或腹膜内注射)或经鼻途径。
对于注射，活性成分可以呈胃肠外可接受的无热原、具有适当pH、等渗和稳定性的水溶液形式。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
本发明实施方案的组合物可被配制成液体或固体形式。固体形式可以提供用于在通过静脉内注射或皮下注射施用之前重建，或用于吸入。所用的组合物将取决于所述分子的物理化学性质和递药途径。制剂可以包含赋形剂或赋形剂组合，例如糖类、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可以包含宽范围的抗体浓度和pH。固体制剂可以例如通过冻干、喷雾干燥或经超临界流体技术干燥来制备。制剂将取决于计划的递药途径；例如，用于肺部递药的制剂可以由具有确保被吸入时渗透到肺深部的物理性质的颗粒组成。
材料和方法：
细胞系
以下试剂通过AIDS Research and Reference Reagent Program, Division ofAIDS, NIAID, National Institute of Health获得：J Lat全长克隆10.6、A72和U1。让细胞在含有青霉素(100 IU/ml)、链霉素(100 IU/ml)和10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中于37℃、5% CO2下生长。TZM-B1细胞在含有相同补充物的Dulbecco氏改进Eagle氏培养基中培养。
荧光素酶测定
TZM-Bl细胞(106个细胞)在200 μL荧光素酶报道蛋白裂解缓冲液(目录号E387A,Promega, Madison, WI)中裂解。离心后，弃去细胞沉淀。使用一半的裂解溶液，用发光计进行分析。
各种各样的方法
p24 ELISA测定、质粒构建和细胞培养用标准方法进行。再活化测试用潜伏感染细胞系J-Lat全长克隆10.6、TZM-Bl或293T细胞的培养物进行。
HIV-1 p24产生用ZeptoMetrix HIV-1 p24抗原ELISA试剂盒评估，荧光素酶活性用Promega荧光素酶测定系统试剂盒评估。利用CambridgeSoft ChemDraw软件画出分子结构。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅仅用于说明目的，本领域技术人员会想到根据所述实施例和实施方案做出的各种修改或者变化，这些修改或者变化将包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求书的范围内。另外，本文所公开的任何发明或其实施方案的任何要素或限定可以与任何和/或所有其他要素或限定(单独的或以任何组合方式)或者本文所公开的任何其他发明或其实施方案相结合，并且所有这样的组合都考虑在本发明的范围，而不限于此。
实施例1：异黄酮对HIV-1基因表达的影响
异黄酮诸如黄豆苷元增加潜伏感染细胞系J-Lat全长克隆10.6上清液中的p24产生。将J-Lat全长克隆10.6细胞以1×105/孔接种于96孔U底板的100 μl生长培养基中，然后用50 μg/ml DDZ、DDN、GST、GSN、GCT或GCN处理。在共孵育后第1、2和3天收集上清液进行HIV-1 p24测试。10 μM SAHA和125 ng/ml PMA用作阳性对照；而0.25% DMSO用作阴性对照。用未处理细胞获得的结果(标记为CO)被设定为值1。所有结果以相比于未处理细胞的诱导倍数来表示。
结果示于图3，表明异黄酮处理的细胞相对于未处理细胞，上清液中p24产生显著增加。另外，随着共孵育时间的流逝，在异黄酮处理细胞的上清液中也观察到p24产生明显增加，如图3A-3C所示。
实施例2：在TXM-B1细胞模型中异黄酮对来自HIV长末端重复的基因表达调控的影响
在该实验中，表明：异黄酮诸如黄豆苷元增加来自LTR的基因表达。为了测试在TZM-Bl细胞模型中的活化能力，将TZM-Bl细胞以1.3×105/孔接种于96孔平底板中的100 μl生长培养基中。过夜培养后，将TZM-Bl细胞与连续稀释的DDZ、DDN、GST、GSN、GCT或GCN共孵育48hr。共孵育36hr后弃去上清液。细胞用50 μl裂解缓冲液裂解，于室温下保持30 min。将40 μl 裂解液转移至白板中进行荧光素酶测定。10 μM SAHA和0.25% DMSO分别用作阳性对照和阴性对照。用未处理细胞获得的结果(标记为CO)被设定为值1。所有结果以相比于未处理细胞的诱导倍数来表示。
结果示于图4，表明相对于未处理细胞，异黄酮处理细胞中的荧光素酶活性明显增加。另外，在异黄酮处理细胞中来自HIV LTR的转录增加是剂量依赖性的，如图4A-4F所示。
实施例3：在pLTR-Luc转染的293T细胞中异黄酮对来自HIV长末端重复(LTR)的基因表达调控的影响
在该实验中，表明：异黄酮诸如黄豆苷元增加来自LTR的基因表达。将293T细胞以1×105/孔接种于24孔板中的500 μl生长培养基中。过夜培养后，将培养基更换为新鲜培养基。将pLTR-Luc质粒与PEI混合，于室温下保持15 min。此后，将混合物加入293T细胞中。6hr共孵育后，吸出培养基，将转染的293T细胞与连续稀释的DDZ、DDN、GST、GSN、GCT或GCN共孵育48hr。共孵育36hr后弃去上清液。细胞用200 μl裂解缓冲液裂解，于室温下保持30min。将150 μl 裂解液转移至白板中进行荧光素酶测定。分别将10 μM SAHA和125 ng/mlPMA用作阳性对照；和将0.25% DMSO用作阴性对照。用未处理细胞获得的结果(标记为CO)被设定为值1。所有结果以相比于未处理细胞的诱导倍数来表示。
结果示于图5，表明相对于未处理细胞，异黄酮处理细胞中的荧光素酶活性增加。另外，在异黄酮处理细胞中来自HIV LTR的转录增加是剂量依赖性的，如图5A-5F所示。
实施例4：在HJV慢性感染细胞系中HIV产生的活化
将Ul或J Lat细胞以1×105细胞/ml平板接种于96孔板中；收集上清液，然后用化合物每日进行刺激，通过p24 ELISA (PerkinElmer Life Sciences)或流式细胞术进行GFP检测，对上清液中的病毒释放进行定量。基线水平是对照细胞中50-100 pg/ml。用抑制剂预处理1 h，然后用受试化合物进行刺激。
黄豆苷元(daidein)从潜伏感染的T细胞系再活化IDV复制
为了表征黄豆苷元刺激病毒复制的能力，用50 μM受试化合物刺激慢性感染的细胞系。利用p24 ELISA分析来自J Lat细胞和Ul细胞的病毒颗粒产生，利用流式细胞术分析来自A72细胞的GFP 表达。在经黄豆苷元和PMA但非SAHA或DMSO处理过的淋巴细胞A72细胞中观测到HIV再活化(图6A)。在经黄豆苷元、SAHA和PMA处理过的淋巴细胞J Lat全长克隆10.6中检测到约50倍的HIV诱导(图6B)。正如所预期的，SAHA再活化Ul 细胞中的HIV复制；然而，用黄豆苷元处理Ul细胞并未诱导HIV复制(图6C)。这一结果提示：黄豆苷元从T细胞再活化潜伏的HIV，其效力与SAHA相当，可能通过不同于SAHA的机制。
黄豆苷元在转录水平上活化HIV复制
为了确定黄豆苷元是否通过影响来自HIV LTR的基因表达来刺激病毒复制，利用TZM-Bl细胞，在它们的基因组中其含有连接至荧光素酶报道基因的整合的HIV LTR。黄豆苷元从6.25 μM浓度开始，诱导剂量依赖性的荧光素酶活性增加，在50 μM浓度，相对于未刺激的对照，在这些细胞中达到HIV复制的14倍诱导(图7A)。
黄豆苷元诱导的IDV复制依赖于Akt信号传导途径
Akt途径参与SAHA诱导的HIV复制。为了确定黄豆苷元是否也活化该途径，分别在基于TZM-B1细胞和J Lat细胞的测定中使用Akt抑制剂。Akt抑制剂使黄豆苷元诱导的病毒复制降低超过50% (图7B，比较泳道2-3)。重要的是，这些抑制剂对HIV产生的基线水平没有显著影响(图7C)。
这些结果提示：黄豆苷元以Akt依赖方式刺激细胞中的病毒复制。
实施例5. 黄豆苷元及其类似物的结构活性关系
为了获得结构活性关系(SAR)和了解特权结构上取代基的活性要求，在TZM-B1细胞系(图8)和J Lat (图9)中测试了黄豆苷元的5种类似物。所测试的所有5种类似物在TZM-B1细胞系中都能够活化LTR，效力相当。然而，金雀异黄素和金雀异黄苷并未显示在潜伏感染的T细胞系J Lat中再活化HIV复制的有效活性，而其他4种类似物黄豆苷元、黄豆苷(Daizin)、黄豆黄素和黄豆黄苷在50 μM浓度下有效地再活化HIV复制，分别相比于未刺激细胞诱导HIV复制达41倍、48倍、44倍、40倍。
对所述6种化合物的SAR分析表明：生物功能性核心结构是4′-羟基异黄酮(表2)。在C-5位加入羟基，显著降低其生物功能。C-7位羟基的糖基化和C-6位的甲氧基修饰对其生物功能都没有显著影响(表1)。
以上对具体实施方案的描述应当全面揭示了本发明的一般性质，因此，其他人员可以通过应用本领域的技术常识，无需过度实验，在不偏离本发明的一般理念下，容易地对这样的特定实施方案进行修改和/或改变以用于各种应用。由于可以对所述的本发明优选实施方案进行细节上的许多修改、变化和改变，故前述描述中的和附图中所示的所有要素应当被解释为说明性的，而非限制性的。因此，本发明的范围应当由所附的权利要求书及其法律上的等同物来确定。此外，本发明的宽度和范围不应当受到上述示例性实施方案中的任一个限制，而应当同样仅根据下述的权利要求书及其等同物来限定。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体在表述上结合进来。如有矛盾，则以本说明书(包括定义)为准。另外，本文所述的材料、方法和实例仅仅是说明性的，而非意在限制。
本说明书中引用的所有文件通过引用全文结合到本文中。
参考文献：
1. Ausubel, F. M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology:Wiley。
2. Barresinoussi, F., Chermann, J. C., Rey, F., Nugeyre, M. T.,Chamaret, S., Gruest, J., ... Montagnier, L. (1983). Isolation of a T-Lymphotropic Retrovirus from a Subject at Risk for Acquired Immune-DeficiencySyndrome (Aids) (从有获得性免疫缺陷综合征风险的受治疗者分离嗜T淋巴细胞逆转录病毒). Science, 220 (4599), 868-871. Doi: DOI 10.1126/science. 6189183。
3. Chun, T. W., Stuyver, L., Mizell, S. B., Ehler, L. A., Mican, J.A., Baseler, M., ... Fauci, A.S. (1997). Presence of an inducible HIV-1latent reservoir during highly active antiretroviral therapy (高活性抗逆转录病毒治疗期间存在诱导型HIV-1潜伏储库). Proc Natl Acad Sci U S A, 94 (24),13193-13197。
4. Contreras, X., Schweneker, M., Chen, C. S., McCune, J. M., Deeks,S. G., Martin, J.和Peterlin, B. M. (2009). Suberoylanilide hydroxamic acidreactivates HIV from latently infected cells (辛二酰苯胺异羟肟酸从潜伏感染细胞中再活化HIV). J Biol Chem, 284 (11), 6782-6789. doi: 10.1074/jbc.M807898200。
5. Finzi, D., Blankson, J., Siliciano, J. D., Margolick, J. B.,Chadwick, K., Pierson, T., ... Siliciano, R. F. (1999). Latent infection ofCD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even insubjects on effective combination therapy (即使在进行有效联合治疗的受治疗者体内CD4+ T细胞的潜伏感染也提供了HIV-1终身存留的机制), Nature Medicine, 5(5),512-517. doi: 10.1038/8394。
6. Finzi, D., Hermankova, M., Pierson, T., Carruth, L. M., Buck, C.,Chaisson, R. E., ... Siliciano, R. F. (1997). Identification of a reservoirfor HIV-1 in subjects on highly active antiretroviral therapy (正进行高活性抗逆转录病毒治疗的受治疗者体内鉴定HIV-1储库)，Science, 278 (5341), 1295-1300。
7. Folks, T., Powell, D. M., Lightfoote, M. M., Benn, S., Martin, M.A.和Fauci, A. S. (1986), Induction of HTLV-III/LAV from a nonvirus-producingT-cell line: implications for latency (从无病毒产生T细胞系诱导HTLV-III/LAV:提示潜伏), Science, 231 (4738), 600-602。
8. Graci, J. D., Colacino, J. M., Peltz, S. W., Dougherty, J. P.和Gu,Z. (2009). HIV type-1 latency: targeted induction of proviral reservoirs (HIV1型潜伏: 原病毒储库的靶向诱导)，Antivir Chem Chemother, 19 (5), 177-187。
9. Miller, J. H. (1987)，Gene transfer vectors for mammalian cells (用于哺乳动物细胞的基因转移载体): Cold Spring Harbor Laboratory Press。
10. Morgan, S. J.和Darling, D. C. (1993). Animal cell culture (动物细胞培养): BIOS Scientific Publishers。
11. Sambrook, J., Russell, D. W.和Russell, D. W.. (2001)，Molecularcloning: a laboratory manual (分子克隆: 实验室手册): Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory。
12. Siliciano, J. D., Kajdas, J., Finzi, D., Quinn, T. C., Chadwick,K., Margolick, J. B., ... Siliciano, R. F. (2003). Long-term follow-upstudies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in restingCD4+ T cells (长期随访研究证实HIV-1潜伏储库在静息CD4+ T细胞中稳定)，NatureMedicine, 9 (6), 727-728. doi: 10.1038/nm880。
13. Siliciano, R. F.和Greene, W. C. (2011)，HIV latency (HIV潜伏)，ColdSpring Harb Perspect Med, 1(1), a007096. doi: 10.1101/cshperspect. a007096。
14. Strain, M. C., Gunthard, H. F., Havlir, D. V., Ignacio, C. C.,Smith, D. M., Leigh-Brown, A. J.,... Wong, J. K. (2003)，Heterogeneousclearance rates of long-lived lymphocytes infected with HIV: intrinsicstability predicts lifelong persistence (终身感染HIV的淋巴细胞的不均一清除速率: 固有稳定性预示终身存留)，Proc Natl Acad Sci U S A,100 (8), 4819-4824. doi:10.1073/pnas. 0736332100。
15. UNAIDS. (2012)，UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic (UNAIDS全球AIDS流行报告)。
16. Wong, J. K., Hezareh, M., Gunthard, H. F., Havlir, D. V.,Ignacio, C. C., Spina, C. A.和Richman, D. D. (1997)，Recovery of replication-competent HIV despite prolonged suppression of plasma viremia (尽管延长抑制血浆病毒血症仍回收到有复制能力的HIV)，Science, 278 (5341), 1291-1295。
17. Wu, R. (1995). Recombinant DNA Methodology II (重组DNA方法学II):Academic Press。

Claims (18)

1.治疗有效量的如下化合物在制备用于使受治疗者中潜伏的人免疫缺陷病毒感染再活化的药物中的用途：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
4', 7-二羟基异黄酮(黄豆苷元)、
Figure DEST_PATH_IMAGE002
黄豆苷元7-葡糖苷(黄豆苷)、
Figure DEST_PATH_IMAGE003
4', 7-二羟基-6-甲氧基异黄酮,
Figure DEST_PATH_IMAGE004
黄豆黄素7-葡糖苷(黄豆黄苷)和它们的组合。
2.根据权利要求1所述的用途，还包括施用涉及刺激受治疗者的免疫系统的疗法。
3.根据权利要求1所述的用途，还包括施用涉及治疗逆转录病毒感染的疗法。
4.根据权利要求2所述的用途，其中所述涉及刺激受治疗者的免疫系统的疗法包括基于树突细胞的免疫疗法、T细胞过继转移、自体免疫增强疗法、基因工程T细胞、免疫恢复、疫苗接种或它们的组合。
5.根据权利要求2所述的用途，其中所述涉及刺激受治疗者的免疫系统的疗法包括给受治疗者施用一种或更多种细胞因子。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述一种或更多种细胞因子选自白介素-2、白介素-4、白介素-5、白介素-7、白介素-10、转化生长因子-α、干扰素-γ和它们的组合。
7.根据权利要求3所述的用途，其中所述涉及治疗逆转录病毒感染的疗法包括施用至少一种核苷逆转录酶抑制剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述至少一种核苷逆转录酶抑制剂选自替诺福韦、恩曲他滨及其组合。
9.根据权利要求3所述的用途，其中所述涉及治疗逆转录病毒感染的疗法包括施用至少一种非核苷逆转录酶抑制剂。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述至少一种非核苷逆转录酶抑制剂为依法韦仑。
11.根据权利要求3所述的用途，其中所述涉及治疗逆转录病毒感染的疗法包括施用至少一种蛋白酶抑制剂。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述至少一种蛋白酶抑制剂选自利托那韦、达芦那韦、阿扎那韦和它们的组合。
13.根据权利要求3所述的用途，其中所述涉及治疗逆转录病毒感染的疗法包括施用至少一种整合酶抑制剂。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述至少一种整合酶抑制剂为雷特格韦。
15.根据权利要求3所述的用途，其中所述涉及治疗逆转录病毒感染的疗法包括施用选自以下的一种或更多种药物：核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂和它们的组合。
16.根据权利要求3所述的用途，其中所述涉及治疗逆转录病毒感染的疗法包括施用两种核苷逆转录酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂。
17.根据权利要求3所述的用途，其中所述涉及治疗逆转录病毒感染的疗法包括施用两种核苷逆转录酶抑制剂和一种非核苷逆转录酶抑制剂。
18.根据权利要求3所述的用途，其中所述涉及治疗逆转录病毒感染的疗法包括施用选自以下的至少一种药物：替诺福韦、恩曲他滨、依法韦仑、雷特格韦、利托那韦、达芦那韦、阿扎那韦和它们的组合。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012035321A1 (en) * 2010-09-14 2012-03-22 Ucl Business Plc Methods, compounds and compositions relating to activating a latent virus
WO2013182662A1 (en) * 2012-06-06 2013-12-12 Bionor Immuno As Vaccine

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001253823A (ja) * 2000-03-09 2001-09-18 Yasukazu Tanuma Ｈｉｖ遺伝子発現抑制剤
CN101279993B (zh) * 2008-03-28 2011-10-12 中国科学院上海有机化学研究所 3-芳基-8-羟基色原酮-7-O-α-D-呋喃阿拉伯糖苷化合物及其合成方法和用途
CN102302484B (zh) * 2011-07-11 2013-09-11 中国科学院上海药物研究所 异黄酮类化合物的用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012035321A1 (en) * 2010-09-14 2012-03-22 Ucl Business Plc Methods, compounds and compositions relating to activating a latent virus
WO2013182662A1 (en) * 2012-06-06 2013-12-12 Bionor Immuno As Vaccine

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Inhibition of HIV Activation in Latently Infected Cells by Flavonoid Compounds;J. WILLIAM CRITCHFIELD等;《AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES》;19961101;第12卷;第39-46页 *
Journal of Nutritional Biochemistry;Aline Andres等;《Journal of Nutritional Biochemistry》;20091231;第20卷;第563-569页 *

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