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Die vorliegende Erfindung betrifft
4-Arylthiopyridin-2(1H)-one und ihre Anwendung als Medikamente.
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Sie bezieht sich insbesondere auf
ihre Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten, die mit dem humanen
Immunschwächevirus
(HIV) verbunden sind.
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Derivate von 1-[(2-Hydroxyethoxy)methyl]-6-(phenylthio)thymin
(HEPT) und Pyridinone sind für
ihre Eigenschaften der Hemmung der Reversen Transcriptase von HIV-1
bekannt.
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HEPT und ein anderes Derivat derselben
Familie, das als E-EPU (5-Ethyl-1-ethoxymethyl-6-(phenylthio)uracil) bezeichnet
wird, sind in 1 durch
Formel (1a) bzw. (1b) dargestellt. Pyridinone, die hemmende Wirkungen
auf die Reverse Transcriptase aufweisen, sind in 2 durch die Formeln (2a) und (2b) dargestellt.
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Andere Inhibitorverbindungen der
Reversen Transcriptase des Virus HIV, darunter Pyridinone, sind auch
in der Patentanmeldung
EP 0 462
800 (Merck) beschrieben. Diese Anmeldung beschreibt allgemein
eine Gruppe von Pyridinonen, die eine besondere Struktur aufweisen,
in der die Gruppe R
4 auf Position 4 des
Cyclus ein Alkylthio- oder Alkylaminorest ist und die Gruppe auf
Position 3 obligatorisch durch einen gegebenenfalls substituierten
Aryl- oder Heterocyclylrest substituiert ist, der über eine
Kette X-CHnR
3, bei der es sich nicht um
NHCO handeln kann, mit dem Pyridinonkern verbunden ist. Doch wurden
nur solche Verbindungen synthetisiert, bei denen der Rest R
4 ein Wasserstoffatom ist. Jedenfalls erwähnt dieses
Dokument nicht, dass die Verbindungen in das Viruspartikel eindringen.
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Diese Verbindungen weisen den Nachteil
auf, dass sie ein schnelles Auftreten von resistenten HIV-1-Stämmen bewirken,
und ihre langfristige Verwendung in einer Monotherapie beim Menschen
bei der Behandlung von Krankheiten, die mit dem HIV-Virus verbunden
sind, ist dadurch also schwierig.
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Ein weiteres Problem, das sich bei
der Behandlung der mit dem HIV-Virus verbundenen Krankheiten stellt,
liegt in der Blockierung der Umwandlung der genomischen RNA in provirale
DNA, ein unverzichtbarer Schritt bei der Integration in das eukaryontische
Genom. Neuere Arbeiten zeigen eindeutig, dass dieser Schritt der
Retrotranscription im Virion selbst stattfinden kann, wenn es noch
in der extrazellulären
Phase ist. So können
im Fall von Samenflüssigkeit
bis zu 2% der viralen Teilchen ihre Retrotranscription beendet haben,
bis sie mit der Zielzelle verschmelzen. Es ist also unerlässlich,
dass die Inhibitoren der Reversen Transcriptase (RT) in das Virion
eindringen können,
bevor es die Zelle erreicht hat.
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Die Studien von Perelson et al. (1996,
Science 271, 1582–1586) über die
virale Dynamik zeigen, dass die mittlere Lebensdauer eines Viruspartikels
im Blutplasma in der Größenordnung
von 8 Stunden liegt, das ist fast ein Viertel der geschätzten Lebensdauer
von HIV-1 in vivo. Das Virion ist in seiner extrazellulären Phase also
ein potentielles Ziel für
diese Inhibitoren.
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Man wird feststellen, dass auch andere
Thiopyridinone, die keine Anti-HIV-1-Aktivität aufweisen, beschrieben wurden.
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So beschreibt der Artikel von Croisy-Delcey
et al. (1983, J. Med. Chem., Vol. 26, Nr. 9, 1329–1333) die Synthese
von Analoga von Lucanthon, die antitumorale und bakterizide Aktivitäten aufweisen.
Die Zwischenverbindungen 7b, 17a und 17b sind Pyridinone.
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Der Artikel von Rivalle et al. (1980,
J. Heterocycl. Chem., Vol. 17, Nr. 2, 245– 248) beschreibt die Synthese
von Pyridochinoleinen über
Zwischenverbindungen, von denen einige Pyridinone sind. Es wird
keine Aktivität
erwähnt,
weder für
die End- noch für
die Zwischenverbindungen.
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Der Artikel von Upton (1986; J. Chem.
Soc. Perkin Trans. 1, Nr. 7, 1225–1229) beschreibt die Synthese von
Anthracenen, insbesondere über
Hydroxypyridine und nicht über
Pyridinone.
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Die Anmelderin hat sich bemüht, neue
Moleküle
zu finden, die eine starke hemmende Aktivität aufweisen, d. h. in geringen
Dosen aktiv sind, eine geringe Cytotoxizität haben und in das Viruspartikel
eindringen.
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Sie hat gezeigt, dass substituierte
4-Arylthiopyridin-2(1H)-one eine starke hemmende Aktivität und eine
geringe Cytotoxizität
aufweisen, wobei sie zugleich in das Viruspartikel eindringen.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
also Verbindungen der Formel (3), wobei:
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- – R1 und R2 unabhängig voneinander
ein Wasserstoffatom, eine aliphatische Gruppe oder eine Alkyloxyalkylgruppe,
in der die Alkylketten C1- bis C4-Gruppen sind, darstellen oder zusammen
einen aromatischen Ring bilden;
- – R3 eine NH2-, NHCOCH3-, NO2-, oder COOC2H5-Gruppe darstellt;
- – R4 eine Phenyl-, Pyrimidin-, Benzimidazol-,
Benzoxazol-, Benzothiazol-, Thiazolin-, Imidazol- oder Pyridingruppe
darstellt, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren aliphatischen
Gruppen und/oder mit einer oder mehreren Hydroxygruppen substituiert
ist;
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Vorteilhafterweise stellen R1 und R2 unabhängig voneinander
ein Wasserstoffatom, eine C1- bis C4-Alkylgruppe oder eine Alkyloxymethylgruppe,
vorzugsweise Ethoxymethylgruppe, dar.
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R6 kann eine
C1- bis C6-Alkylgruppe
sein, die gegebenenfalls mit einer Phenylgruppe substituiert ist, oder
R6 kann eine Benzylgruppe sein.
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R7 kann eine
C1- bis C6-Alkylgruppe,
insbesondere eine Ethylgruppe, sein.
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R4 ist vorteilhafterweise
eine Phenylgruppe, die mit Alkylgruppen, vorzugsweise mit zwei Methylgruppen,
substituiert ist, und besonders bevorzugt eine Phenylgruppe, die
mit zwei Methylgruppen in meta-Stellung substituiert ist.
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Besonders vorteilhafte Verbindungen
gemäß der vorliegenden
Erfindung sind die folgenden Verbindungen:
5-Ethyl-6-methyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Formel 7c);
5-Ethoxymethyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Formel 7g)
3-Amino-5-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Formel 8a);
3-Amino-5-ethyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Formel 8b);
3-Amino-5-ethoxymethyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Formel 89);
5-Ethyl-6-methyl-3-carbethoxy-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Formel 15).
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Die vorliegende Erfindung betrifft
außerdem
die Gewinnung der Verbindungen gemäß der Erfindung. So können die
Verbindungen, in denen R3 NO2 darstellt
(Formel 7 und 9), erhalten werden, indem man ein Chlornitropyridinon
der Formel (6) mit einem gegebenenfalls substituierten Thiophenol
oder Mercaptoderivat eines Heterocyclus der Formel R4SH
umsetzt.
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Zur Herstellung von Verbindungen,
bei denen R3 NH2 darstellt
(Formel 8 und 10), kann das erhaltene Nitropyridinon mit Zinn(II)chlorid-Hydrat
oder durch katalytische Hydrierung reduziert werden.
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So wurden die Verbindungen der Formeln
7 und 8 gemäß der Erfindung
nach dem in 4 dargestellten
Reaktionsschema ausgehend von den entsprechenden Hydroxypyridin-2(1H)-onen
(Verbindungen 4) synthetisiert.
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Die Verbindungen 9a bis 9f wurden
gemäß dem in 5 dargestellten Schema erhalten.
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Die Verbindungen der Formel 4 sind
ihrerseits entweder so erhältlich,
wie es von Legraverend et al. beschrieben wurde (Nucleosides and
Nucleotides, 1986, 5(2), 125–134),
oder durch Reaktion von Ethyl-2-ethyl-3-aminocrotonat (Verbindung
12) mit Diethylmalonat, um die Zwischenverbindung 13 zu erhalten, die
ihrerseits mit Chlorwasserstoffsäure
hydrolysiert wird.
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Die Nitropyridinone (Verbindungen
5) wurden durch Reaktion mit Salpetersäure HNO3 hergestellt
und dann so, wie es von C. N. Nguyen et al. beschrieben wird (Anti-Cancer
Drug Design, 1992, 7, 219–233),
durch Reaktion der Verbindungen der Formel (5) mit einem POCl3/Benzyltriethylammoniumchlorid/CH3CN-Gemisch, das unter Rückfluss erhitzt wurde, in Chlornitropyridinone
(Verbindungen 6) umgewandelt.
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Die Kondensation der Verbindung (6a)
mit 3,5-Dimethylthiophenol, die in Gegenwart von Triethylamin in
Ethanol bei Raumtemperatur durchgeführt wird, führt zu 4-(3',5'-Dimethylphenyl)thio-5-methyl-3-nitropyridin-2(1H)-on
(Verbindung 7a). Die Reduktion mit Zinn(II)chlorid-Dihydrat in siedendem
Ethylacetat führt
zum Amin der Formel 8a.
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Die Verbindungen 7d, 7e und 8e wurden
durch Kondensation von Chlornitropyridinon (6a) mit Thiophenol oder
m-Thiocresol, gefolgt von der Reduktion der Nitro-Funktion (im Fall
von Verbindung 8e), erhalten.
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Aminopyridinon (10) wurde durch Reduktion
der Verbindung 9d in Gegenwart von Zinn(II)chlorid-Dihydrat in Ethylacetat
unter Rückfluss
erhalten.
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Die Verbindungen, bei denen R3 NHCOR6 darstellt
und R4 eine gegebenenfalls substituierte
Phenylgruppe darstellt, können
erhalten werden, indem man eine Verbindung der Formel (R6CO)2O oder R6COZ, wobei Z ein Rest ist, der freige setzt
werden und die Bildung einer Amidbindung ermöglichen kann, mit einem Aminopyridinon
umsetzt.
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So werden die Amide 11a bis lle und
11g gemäß dem in 6 dargestellten Reaktionsschema
durch Modifikation der Aminofunktion von 3-Amino-5-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 8a) oder 3-Amino-5-ethyl-6-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 8c) synthetisiert. Die Reaktion wurde in Gegenwart von
Ethylformiat, Essigsäureanhydrid,
Propionylchlorid, Heptansäureanhydrid
oder Phenylacetylchlorid durchgeführt.
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Das Derivat 3-N-(Ethoxycarbamyl)
(Verbindung 11f) wurde unter ähnlichen
Bedingungen mit Ethylchlorformiat synthetisiert.
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5-Ethylpyridinon und 5-Ethyl-6-methylpyridinon
wurden entweder ausgehend von 5-Ethyl-4-hydroxypyridin-2(1H)-on
(Verbindung 4b) oder ausgehend von 5-Ethyl-4-hydroxy-6-methylpyridin-2(1H)-on
(Verbindung 4c) erhalten. 7 zeigt
das Reaktionsschema für
die Gewinnung von Verbindung 4c durch eine Abfolge von zwei Schritten
ausgehend von Ethyl-2-ethylaminocrotonat (Verbindung 12). Die Nitrierung,
die Monochlorierung, die Substitution mit 3,5-Dimethylthiophenol und die Reduktion
der Nitrofunktion erfolgen anschließend gemäß dem Reaktionsschema der 4; sie führen zu den 3-Nitro- bzw. 3-Aminopyridinonderivaten
7b und 8b bzw. 7c und 8c. In derselben Weise wurden auch die analogen
Benzo[e]pyridinone 7f und 8f erhalten, indem man als Ausgangsverbindung
das kommerziell erhältliche
Chinolein-2,4-diol (Verbindung 4f) verwendete.
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Die Verbindungen, bei denen R3 eine COOR7-Gruppe
darstellt und R4 eine gegebenenfalls substituierte
Phenylgruppe darstellt, wurden erhalten, indem man ein 4-Chlorpyridinon
der Formel 14 gemäß dem Schema
der 7 mit einem gegebenenfalls
substituierten Thiophenol umsetzt. Das 4-Chlorpyridinon der Formel 14
kann seinerseits durch Reaktion des Hydroxypyridinons der Formel
13 in Gegenwart von POCl3 gemäß dem Schema
von 7 erhalten werden.
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So wurde das 3-Carbethoxy-5-ethyl-4-hydroxy-5-methylpyridin-2(1H)-on
(Verbindung 13), das im Laufe der Herstellung des Pyridinons (4c)
als Zwischenprodukt erhalten wurde, nacheinander in 4-Chlorpyridinon (Verbindung
14) und 4-Phenylthiopyridinon
(Verbindung 15) umgewandelt. Die Hydrolyse des 3-Carbethoxypyridinons 15 führt durch
Decarboxylierung zum Pyridinon (Verbindung 16), das in Position
3 nicht substituiert ist.
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Die Gewinnung der Verbindungen gemäß der Erfindung
ist nicht auf die oben beschriebenen Verfahren beschränkt. Sie
können
mit allen dem Fachmann bekannten Mitteln erhalten werden.
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich außerdem
auf Verbindungen, die bei der Synthese der Verbindungen der Formel
(3) als Zwischenprodukte auftreten und bei denen R1 und
R2 unabhängig
voneinander Ethyl- oder Methylgruppen sind und R3 NO2 oder NH2 ist und
die der Formel (6) entsprechen, in der R1 und
R2 so definiert sind.
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Sie bezieht sich außerdem auf
Verbindungen, die bei der Synthese der Verbindungen der Formel (3) als
Zwischenprodukte auftreten und bei denen R1 und
R2 unabhängig
voneinander Ethyl- und Methylgruppen sind und R3 die
Gruppe CO2C2H5 ist und die der in 8 dargestellten
Formel (17) entsprechen, in der R1 und R2 so definiert sind.
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich außerdem
auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge einer
Verbindung gemäß der Erfindung,
wie sie oben beschrieben wurde, im Gemisch mit verträglichen
Trägerstoffen
enthalten.
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Sie betrifft auch ein Medikament,
das diese Verbindungen enthält.
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Schließlich bezieht sie sich auf
die Verwendung einer dieser Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments
zur Behandlung von Krankheiten, die mit HIV verbunden sind.
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Obwohl die vorliegenden Verbindungen
auf jedem dem Fachmann bekannten Weg verabreicht werden können, werden
sie den Patienten vorzugsweise oral, parenteral (einschließlich subkutaner,
intravenöser, intramuskulärer, intrasterna-
ler Injektionen), rektal und durch Inhalation verabreicht.
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Die Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung werden so zubereitet, dass sie den Anforderungen der vorgenannten
Verabreichungswege genügen,
und liegen zum Beispiel in Form von Tabletten, Gelatinekapseln,
injizierbaren sterilen Lösungen,
zum Beispiel injizierbaren sterilen wässrigen Suspensionen oder Ölsuspensionen,
Nasalpräparaten
oder Suppositorien vor.
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Wenn sie oral in Form von Suspensionen
verabreicht werden, können
diese Zusammensetzungen nach den Verfahren, die dem Fachmann bekannt
sind, hergestellt werden und können
mikrokristalline Cellulose als Füllstoff,
Alginsäure
oder Natriumalginat als Suspensionsmittel, Methylcellulose als Viskositätsverbesserer
sowie Aromastoffe enthalten.
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Wenn sie nasal oder durch Inhalation
verabreicht werden, können
diese Zusammensetzungen in Form von Kochsalzlösungen vorliegen und Benzylalkohol
oder jedes andere geeignete Konservierungsmittel, Substanzen zur
Resorptionsverbesserung, um die Bioverfügbarkeit zu verbessern, Fluorkohlenstoffe
und jedes andere dem Fachmann bekannte Dispersionsmittel oder Lösungsvermittler
enthalten.
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Die injizierbaren Lösungen oder
die Suspensionen können
zubereitet werden, indem man nichttoxische Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel
verwendet, die für
den parenteralen Weg annehmbar sind, wie Mannit, 1,3-Butandiol,
Wasser, Ringer-Lösung
oder eine isotonische Natriumchloridlösung oder jedes andere Dispersions-,
Netz- oder Suspensionsmittel, wie sterile Öle, insbesondere synthetische
Diglyceride oder Monoglyceride, und Fettsäuren, wie Oleinsäure.
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Wenn sie rektal, d. h. in Form von
Suppositorien, verabreicht werden, können diese Zusammensetzungen
durch Mischen einer Verbindung gemäß der Erfin dung mit einem geeigneten
nicht-irritierenden Trägerstoff,
wie Kakaobutter, synthetischen Glycerinestern oder Polyethylenglycolen,
die bei normalen Temperaturen fest sind, sich aber im Rektalraum
verflüssigen
oder auflösen,
um die Verbindung freizusetzen, hergestellt werden.
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Die Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung können
in Mengen zwischen 1 und 100 mg/kg Körpergewicht oral verabreicht
werden. Dennoch variieren die spezifischen Dosen und die Häufigkeit
der Behandlung von Patient zu Patient und können von verschiedenen Faktoren
abhängen,
einschließlich
der Aktivität
der eingesetzten Verbindung, ihrer metabolischen Stabilität, ihrer
Wirkungsgeschwindigkeit sowie des Alters, Gewichts und Allgemeinzustands
des Patienten zum Zeitpunkt der Verabreichung, der Clearance, den anderen
verwendeten Medikamenten und jedes anderen Faktors, der dem behandelten
Patienten inhärent
ist.
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Die Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung dien zur Hemmung der Reversen Transcriptase von HIV, zur
Prävention
und Behandlung der Infektion durch HIV sowie zur Behandlung von
pathologischen Folgen einer solchen Infektion, wie AIDS. Die Behandlung
von AIDS oder die Prävention
oder Behandlung der Infektion durch HIV kann als Behandlung eines
wesentlichen Bereichs der Infektion durch HIV, wie AIDS oder ARC
(AIDS-related Complex) definiert werden, ohne dass diese Definition
jedoch einschränkend
sein soll.
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Die Erfindung wird durch die folgenden
Beispiele veranschaulicht, ohne jedoch durch diese eingeschränkt zu sein.
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Die folgenden Figuren veranschaulichen
die Erfindung:
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Die 1 bis 3 stellen die Formeln der
Verbindungen (1), (2) bzw. (3) dar.
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Die 4 bis 7 stellen Reaktionsschemata
für die
Gewinnung der Verbindungen gemäß der Erfindung dar.
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Die 8 stellt
die Formel der Verbindung (17) dar.
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Die 9 zeigt
die Wirkung der Verbindung 7c auf die Aktivität der Reversen Transcriptasen
der Viren HIV-1 und HIV-2 in Gegenwart von zwei Matrizen-Primer-Paaren.
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10 zeigt
die dosisabhängige
Wirkung der Verbindung 7c auf die Hemmung der Reversen Transcriptase
von HIV-1. Die erwartete komplementäre DNA mit einer Länge von
147 Nucleotiden ist auf der linken Seite des Gels (Napf 1) angezeigt.
Die Näpfe
2 bis 5 entsprechen abnehmenden Konzentrationen der Verbindung 7c
(Napf 2: 400 nM; Napf 3: 300 nM; Napf 4: 100 nM; und Napf 5: 40
nM). Napf 6 enthält
keine Verbindung 7c.
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11 ist
ein Schema der Sonde, die verwendet wurde, um die komplementäre DNA der 10 nachzuweisen.
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12 ist
eine doppelt-reziproke (Linewear-Burk) Darstellung der Hemmung der
Reversen Transcriptase von HIV-1 durch die Verbindung 7c mit Poly-C-OligodG
als Matrizen-Primer-Paar und dGTP als Substrat.
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13 ist
eine doppelt-reziproke Darstellung, ähnlich wie 9, wobei Poly-A-Oligo-dT als Matrizen-Primer-Paar
und dTTP als Substrat verwendet werden.
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14 zeigt
die Messung der Aktivität
der Reversen Transcriptase (RT) nach Filtration über Anopore.
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15 zeigt
die Messung der Infektiosität
nach Filtration über
Anopore.
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Charakterisierung der Produkte: Es
wurde eine Dünnschichtchromatographie
(DC) auf Platten, die zuvor mit Silicagel 60F254 (Merck) beschichtet
wurden, durchgeführt.
Um die Verbindungen sichtbar zu machen, wurden die DC-Platten UV-Licht
ausgesetzt. Dann wurden Reinigungen auf Silicagelsäulen (40–60 μm) durch Mitteldruckchromatographie
durchgeführt.
Alle Schmelzpunkte wurden mit einem Electrothermal 9200 gemessen
und sind nicht korrigiert. Die 1H-NMR-Spektren
wurden in den angegebenen Lösungsmitteln
mit Hilfe eines Bruker AC 200 mit CHCl3 (δ = 7,25 ppm)
oder DMSO (δ =
2,54 ppm) als internen Standards aufgenommen (*,# = austauschbare
Zuordnungen). Die Elementaranalysen (Tabelle 1) wurden vom Service
Central de Microanalyses du CNRS, 91190 Gif-sur-Yvette, Frankreich,
durchgeführt.
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Beispiel 1:
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Herstellung von Ethyl-2-ethyl-3-aminocrotonat
(Verbindung 12).
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Ethyl-2-ethylacetoacetat (150 g,
0,95 mol) und Ammoniumnitrat (84 g, 1,04 mol) werden in 1,1 l wasserfreiem
Tetrahydrofuran gelöst.
Das Gemisch wird 5 Tage lang gerührt,
während
man Ammoniak durchleitet. Das Lösungsmittel
wird bei Raumtemperatur verdampft, und es wird 1 l Wasser hinzugefügt. Das
Gemisch wird 30 min lang gerührt.
Der farblose feste Rückstand
wird durch Filtration isoliert und in Hexan umkristallisiert, was
das Produkt 12 (107 g, 72%) in Form von farblosen Kristallen ergibt:
Schmelzpunkt 61°C; 1H-NMR (CDCl3): δ = 4,11 (2H,
q, J = 7 Hz, OCH2CH3),
2,17 (2H, q, J = 7 Hz, CH2CH3),
1,93 (3H, s, CH3), 1,24 (3H, t, J = 7 Hz,
OCH2CH3), 0,94 (3H,
t, ) = 7 Hz, CH2CH3).
Anal. C8H15NO2 (C, H, N).
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Beispiel 2:
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Herstellung von 4-Hydroxy-5-ethyl-6-methyl-3-carbethoxypyridin-2(1H)-on (Verbindung
13).
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Natrium (48,34 g, 2,10 mol, in Stücken in
Kerosin) wird während
3 h unter Stickstoffatmosphäre
langsam in 530 ml Ethanol gelöst.
Das Gemisch wird zum Rückfluss
erhitzt, und während
30 min wird tropfenweise Diethylmalonat (335 ml, 2,20 mol, frisch
destilliert) hinzugefügt.
Immer noch unter Rückfluss
wird tropfenweise Aminocrotonat (Verbindung 13) (150 g; 0,96 mol)
in 200 ml Ethanol hinzugefügt.
Das Gemisch wird 72 h lang unter Rückfluss gerührt, was eine blassgelbe Suspension
ergibt. Diese Suspension wird auf Raumtemperatur abgekühlt, und
der Niederschlag wird durch Filtration isoliert. Der Feststoff wird
in Wasser gelöst,
auf 0°C
abgekühlt
und mit Salzsäure
bis auf pH 1 angesäuert.
Der Niederschlag wird durch Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen
und in Toluol kristallisiert, was das Produkt 13 (109,6 g, 51%)
in Form von weißen
Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 196–197°C; 1H-NMR
(DMSO-d6) δ 11,52 (1H, s, NH*-1), 11,32
(1H, s, OH*), 4,34 (2H, q, J = 7 Hz, COOCH2CH3), 2,39 (2H, q, J = 7,5 Hz, CH2CH3), 2,23 (3H, s, CH3-6),
1,31 (3H, t, J = 7 Hz, COOCH2CH3), 1,02
(3H, t, J = 7 Hz, CH2CH3).
Anal. C11H15NO4 (C, H, N).
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Beispiel 3:
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Herstellung von 5-Ethyl-4-hydroxy-6-methyl-pyridin-2(1H)-on
(Verbindung 4c).
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Der in Beispiel 2 hergestellte Ester
(13) (17,2 g, 76,4 mmol) wird in 1,2 l einer 1 N Salzsäure gelöst, und
das Gemisch wird 36 h lang unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Verdampfen
des Lösungsmittels
gibt man 100 ml Wasser hinzu und neutralisiert das Gemisch mit einer
wässrigen
Ammoniaklösung.
Der Niederschlag wird durch Filtration isoliert und mit Wasser gewaschen.
Man erhält
das Produkt 4c (11,2 g, 96%) in Form eines weißen Feststoffs: Schmelzpunkt
360°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 10,75 (1H,
s, NH-1), 5,46 (1H, s, H-3), 2,32 (2H, q, J = 7 Hz, CH2CH3), 2,13 (3H, s, CH3-6),
0,99 (3H, t, J = 7 Hz, CH2CH3).
Anal. C8H11N1O2 (C, H, N).
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Beispiel 4:
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Herstellung von 5-Ethyl-4-hydroxy-3-nitropyridin-2(1H)-on
(Verbindung 5b).
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Eine Suspension von Verbindung 4b,
die so erhalten wurde, wie es von Legraverend et al. (Nucleosides
and Nucleotides, 1986, 5(2), 125–134) beschrieben wurde (5,00
g, 36,0 mmol), in 40 ml Salpetersäure (d = 1,33) wird 10 min
lang bei Raumtemperatur und 12 min lang bei 75°C gerührt. Es werden sofort 150 ml Eiswasser
hinzugefügt,
der gelbe Niederschlag wird durch Filtration isoliert und in Wasser
umkristallisiert, was das Nitropyridinon 5b (5,4 g, 82%) in Form
von gelben Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 213–214°C; 1H-NMR
(DMSO-d6) δ 11,85 (1H, s, NH-1), 7,39 (1H,
s, H-6), 2,42 (2H, q, J = 7 Hz, CH2), 1,10
(3H, t, J = 7 Hz, CH3). Anal. C7H8N2O4·0,25H2O (C, H, N).
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Beispiel 5:
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Herstellung von 5-Ethyl-4-hydroxy-6-methyl-3-nitropyridin-2(1H)-on
(Verbindung 5c).
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Wie in Beispiel 4 für die Verbindung
5b beschrieben wurde, wird eine Suspension von Verbindung 4c (4,00
g, 26,0 mmol) in 32 ml Salpetersäure
(d = 1,33) 10 min lang bei Raumtemperatur und 10 min lang bei 80°C gerührt. Es
werden sofort 80 ml Eiswasser hinzugefügt, und der Niederschlag wird
durch Filtration isoliert und in Wasser umkristallisiert, was das
Nitropyridinon 5c (4,4 g, 85%) in Form von gelben Kristallen ergibt: Schmelzpunkt
255–256°C; 1H-NMR (DMSOd6) δ 11,90 (1H,
s, NH-1), 2,47 (2H, q, J = 7 Hz, CH2CH3), 2,27 (3H, s, CH3-6),
1,03 (3H, t, J = 7 Hz, CH2CH3).
Anal. C8H10N2O4 (C, H, N).
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Beispiel 6:
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Herstellung von 4-Hydroxy-3-nitrochinolin-2(1H)-on
(Verbindung 5f).
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Wie in Beispiel 4 für die Verbindung
5b beschrieben wurde, wird eine Suspension von Verbindung 4f (9,00
g, 55,8 mmol) in 70 ml Salpetersäure
(d = 1,33) 15 min lang bei Raumtemperatur und 15 min lang bei 80°C gerührt. Es
werden sofort 250 ml Eiswasser hinzugefügt, der gelbe Niederschlag
wird durch Filtration isoliert und mit Wasser gewaschen sowie im
Vakuum über
P2O5 getrocknet,
was das Nitropyridinon 5f (11,3 g, 98%) in Form eines gelben Feststoffs
ergibt: Schmelzpunkt 250°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,85 (1H,
s, NH-1), 8,06 (1H, d, J = 8 Hz, H-8), 7,68 (1H, td, J1 =
8 Hz, J2 = 1 Hz, H-5), 7,37–7,26 (2H,
m, H-6 und 7). Anal. C9H6N2O4 (C, H, N).
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Beispiel 7:
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Herstellung von 4-Chlor-5-ethyl-3-nitropyridin-2(1H)-on
(Verbindung 6b).
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Man gibt Phosphoroxidchlorid (6,7
ml, 39,1 mmol) zu einer Lösung
von Verbindung 5b (3,00 g, 16,3 mmol) und Benzyltriethylammoniumchlorid
(14,90 g, 65,2 mmol) in Acetonitril (60 ml). Das erhaltene Gemisch wird
30 min lang bei 40°C
gerührt
und 1 h lang unter Rückfluss
erhitzt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gibt man 60 ml
Wasser hinzu und rührt
das Gemisch 3 h lang bei Raumtemperatur. Der gelbe Niederschlag
wird isoliert, mit Cyclohexan (3 × 6 ml) gewaschen und dann
getrocknet, was Verbindung 6b (2,4 g, 74%) in Form von blassgelben
Kristallen ergibt: 1H-NMR (DMSO-d6) δ 13,19
(1H, s, NH-1), 7,73 (1H, s, H-6), 2,56 (2H, q, J = 7,5 Hz, CH2CH3), 1,16 (3H,
t, J = 7,5 Hz, CH2CH3).
-
Beispiel 8:
-
Herstellung von 4-Chlor-5-ethyl-6-methyl-3-nitropyridin-2(1H)-on
(Verbindung 6c).
-
Wie in Beispiel 7 für die Verbindung
6b beschrieben wurde, wird Phosphoroxidchlorid (8,3 ml, 88,8 mmol)
zu einer Lösung
von Verbindung 5c (4,00 g, 20 mmol) und Benzyltriethylammoniumchlorid
(18,40 g, 80,8 mmol) in Acetonitril (80 ml) gegeben. Das erhaltene
Gemisch wird 30 min lang bei 40°C
gerührt
und 1 h lang unter Rückfluss
erhitzt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gibt man 150 ml
Wasser hinzu und rührt
das Gemisch 48 h lang bei Raumtemperatur. Der braune Niederschlag
wird isoliert, mit Cyclohexan (3 × 10 ml) gewaschen und aus
Ethanol umkristallisiert, was Verbindung 6c (1,5 g, 34%) in Form
von blassgelben Kristallen ergibt: 1H-NMR
(DMSO-d6) δ 12,98 (1H, s, NH-1), 2,58 (2H,
q, J = 7,5 Hz, CH2CH3),
2,38 (3H, s, CH3-6), 1,08 (3H, t, J = 7,5
Hz, CH2CH3).
-
Beispiel 9:
-
Herstellung von 4-Chlor-3-nitro-2-chinolein-2(1H)-on
(Verbindung 6f).
-
Wie in Beispiel 7 für die Verbindung
6b beschrieben wurde, wird Phosphoroxidchlorid (4,0 ml, 46,6 mmol)
zu einer Lösung
von Verbindung 5f (4,00 g, 19,4 mmol) und Benzyltriethylammoniumchlorid
(17,68 g, 77,6 mmol) in Acetonitril (80 ml) gegeben. Das erhaltene
Gemisch wird 30 min lang bei 45°C
unter Stickstoffatmosphäre
gerührt
und 20 min lang unter Rückfluss
erhitzt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gibt man 120 ml
Eiswasser hinzu. Das Gemisch wird bei 0°C mit 12 ml einer verdünnten wässrigen
Ammoniaklösung
(14%) neutralisiert und 1 h lang bei dieser Temperatur gerührt. Der
gelbe Niederschlag wird isoliert und 1 h lang in 120 ml Hexan gerührt. Nach
der Filtration wird Verbindung 6f (2,9 g, 67%) im Vakuum über P2O5 getrocknet, was
einen gelben Feststoff ergibt: 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,10
(1H, s, NH-1), 8,04 (1H, d, J = 8 Hz, H-8), 7,84 (1H, t, J = 8 Hz,
H-5), 7,54–7,43
(H, m, H-6 und 7).
-
Beispiel 10:
-
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung
7a).
-
Ein Gemisch von Verbindung 6a, die
nach Nguyen et al. (1992, siehe oben) erhalten wurde (1,88 g, 10,0
mmol), in 20 ml Ethanol und 2 ml Triethylamin wird bis zur Homogenität gerührt. Es
wird tropfenweise 3,5-Dimethylthiophenol (1,39 g, 10,1 mmol) hinzugefügt. Nach
1 h Rühren
bei Raumtemperatur wird der Niederschlag durch Filtration isoliert
und mit Cyclohexan (20 ml) gewaschen. Man erhält das Produkt 7a (2,66 g, 92%)
in Form eines gelben Feststoffs: Schmelzpunkt 235°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,27 (1H,
s, NH-1), 7,63 (1H, s, H-6),
7,01 (1H, s, H-4'), 6,96 (2H, s, H-2' und 6'), 2,27 (6H, s, CH3-3' und -5'), 1,89 (3H, s, CH3-5).
Anal. C14H14N2O3S·0,25H2O (C, H, N, S).
-
Beispiel 11:
-
Herstellung von 5-Ethyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung
7b).
-
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6b (2,42 g,
11,9 mmol) in 20 ml Ethanol und 2 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es
wird tropfenweise 3,5-Dimethylthiophenol (1,64 ml, 12,1 mmol) hinzugefügt. Nach
4 h Rühren
bei Raumtemperatur wird der Niederschlag durch Filtration isoliert
und aus Ethanol (15 ml) umkristallisiert. Man erhält das Produkt
7b (1,94 g, 53%) in Form von gelben Kristallen: Schmelzpunkt 197°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,29 (1H,
s, NH-1), 7,59 (1H, s, H-6),
7,00 (1H, s, H-4'), 6,94 (2H, s, H-2' und -6'), 2,36 (2H, q, J =
8 Hz, CH2CH3), 2,26
(6H, s, CH3-3' und -5'), 1,03 (3H, t, J
= 7 Hz, CH2CH3).
Anal. C15H16N2O3S (C, H, N, S).
-
Beispiel 12:
-
Herstellung von 5-Ethyl-6-methyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethylphenylthiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 7c).
-
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6c (0,90 g,
4,1 mmol) in 16 ml Ethanol und 9 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es
wird tropfenweise 3,5-Dimethylthiophenol (0,57 ml, 4,2 mmol) hinzugefügt. Nach
3 h Rühren
bei Raumtemperatur wird der Niederschlag durch Filtration isoliert
und aus Ethanol (50 ml) umkristallisiert. Man erhält das Produkt
7c (1,07 g, 81%) in Form von gelben Kristallen: Schmelzpunkt 236–237°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,28 (1H,
s, NH-1), 6,98 (1H, s, H-4'), 6,94 (2H, s, H-2' und -6'), 2,26 (6H,
s, CH3-3' und -5'), 2,12 (3H, s, CH3-6), 0,87 (3H, t, J = 7 Hz, CH2CH3), das Signal von CH2CH3 und das Signal des DMSO überlappen
sich. Anal. C16H18N2O3S (C, H, N, S).
-
Beispiel 13:
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Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-phenylthiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 7d).
-
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,20 g,
1,1 mmol) in 2 ml Ethanol und 0,2 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es
wird Thiophenol (0,12 ml, 1,1 mmol) hinzugefügt. Nach 15 h Rühren bei
Raumtemperatur wird der gelbe Niederschlag durch Filtration isoliert
und mit Ethanol gewaschen, was das Produkt 7d (0,13 g, 47%) in Form
eines gelben Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 214–216°C; 1H-NMR
(DMSO-d6) δ 12,86 (1H, s, NH-1), 7,65 (1H,
s, H-6), 7,45–7,36
(5H, m, H-2', -3', -4', -5' und -6'), 1,89 (3H, s, CH3-5).
Anal. C12H10N
2O3S·0,125H2O (C, H, N, S).
-
Beispiel 14:
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Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(3'-methylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 7e).
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Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,50 g,
2,6 mmol) in 10 ml Ethanol und 0,3 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es
wird tropfenweise m-Thiocresol (0,35 g, 2,8 mmol) in 5 ml Ethanol
hinzugefügt.
Nach 15 h Rühren
bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel
verdampft, und es werden 15 ml Wasser hinzugefügt. Die Suspension wird 2 h
lang bei Raumtemperatur gerührt.
Der gelbe Niederschlag wird durch Filtration isoliert, mit 6 × 2 ml Wasser
gewaschen, getrocknet und aus Ethanol umkristallisiert, was das
Produkt 7e (0,52 g, 71%) in Form von gelben Nadeln ergibt: Schmelzpunkt
222–223°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,85 (1H,
s, NH-1), 7,64 (1H, s, H-6), 7,27(1H, t, J = 8 Hz, H-5'), 7,20–7,14 (3H,
m, H-2', -4' und -6'), 2,31 (3H, s, CH3-3'),
1,89 (3H, s, CH3-5). Anal. C13H12N2O3S·0,25H2O (C, H, N, S).
-
Beispiel l5:
-
Herstellung von 3-Nitro-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiochinolein-2(1H)-on
(Verbindung 7f).
-
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6f (1,40 g,
6,2 mmol) in 50 ml Ethanol und 1,3 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Während 15
min wird tropfenweise 3,5-Dimethylthiophenol (0,86 ml, 6,3 mmol)
in 30 ml Ethanol hinzugefügt.
Das Gefäß ist mit
einer Falle ausgestattet, die CaCl2 enthält. Nach
2 h 30 Rühren
bei 50°C
wird das Lösungsmittel
verdampft, und es werden 100 ml Wasser hinzugefügt. Das Gemisch wird mit einer
verdünnten
wässrigen
Ammoniaklösung
neutralisiert, und es wird 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der
braune Niederschlag wird durch Filtration isoliert, mit Hexan gewaschen
und aus Ethanol (200 ml) umkristallisiert. Man erhält das Produkt
7f (1,19 g, 59%) in Form von orangegelben Kristallen: Schmelzpunkt
294°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,89 (1H,
breit, NH-1), 7,96 (1H, dd, J1 = 8 Hz, J2 = 1 Hz, H-8), 7,70 (1H, td, J1 =
8 Hz, J2 = 1 Hz, H-5), 7,48 (1H, d, J = 8 Hz, H-6*), 7,31 (1H,
td, J1 = 8 Hz, JZ =
1 Hz, H-7*), 7,05 (2H, s, H-2' und -6'), 6,98 (1H, s, H-4'), 2,23
(6H, s, CH3-3' und -5'). Anal. C17H14N2O3S (C, H, N,S).
-
Beispiel 16:
-
Herstellung von 5-Ethoxymethyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethlphenl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 7g):
-
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6g, die nach
C. H. Nguyen et al. (1992, siehe oben) erhalten wurde (0,15 g, 0,6
mmol) in 5 ml Ethanol und 0,1 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es
wird tropfenweise 3,5-Dimethylthiophenol (0,09 g, 0,6 mmol) in 3
ml Ethanol hinzugefügt.
Nach 2 h Rühren
bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel
verdampft, und es werden 10 ml Wasser hinzugefügt. Das Gemisch wird durch
Zugabe von 0,5 ml verdünnter
wässriger
Ammoniaklösung (14%)
basisch gemacht, und die Suspension wird 2 h lang bei Raumtemperatur
gerührt.
Der gelbe Niederschlag wird durch Filtration isoliert, mit Wasser
und Hexan gewaschen und dann getrocknet, was das Produkt 7 g (0,16
g, 74%) in Form eines cremefarbigen Pulvers ergibt: Schmelzpunkt
143–144°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,25 (1H,
s, NH-1), 7,75 (1H, s, H-6), 7,01 (1H, s, H-4'), 6,98 (2H, s, H-2'
und -6'), 4,23 (2H, s, OCH2-5), 3,37 (2H,
q, J = 7 Hz, CH
3
CH
20),
2,26 (6H, s, CH3-3' und -5'), 1,08 (3H,
t, J = 7 Hz, CN3CH2O).
Anal. C16H18N2O4S (C, H, N, S).
-
Beispel 17:
-
Herstellung von 3-Amino-5-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung
8a).
-
Man gibt Zinn(II)chlorid-Dihydrat
(9,75 g, 43,0 mmol) zu einer Suspension von Verbindung 7a (2,50
g, 8,6 mmol) in Ethylacetat (150 ml). Das Gemisch wird 1 h lang
unter einer Argonatmosphäre
unter Rückfluss erhitzt.
Nach Abkühlung
auf 0°C
gibt man Eiswasser (110 ml) und eine gesättigte Natriumcarbonatlösung hinzu,
bis man einen basischen pH-Wert erhält. Man entfernt den Niederschlag
durch Filtration. Die filtrierten Phasen werden getrennt, und man
extrahiert die wässrige
Phase mit Ethylacetat. Die vereinigten organischen Phasen werden
mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(3 × 120
ml) gewaschen, über
Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand
wird durch Säulenchromatographie
gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/ Ethanol-Gemisch (9 : 1)
als Eluent verwendet, was das Produkt 8a (2,02 g, 87%) in Form eines
blassgelben Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 208°C; 1H-NMR
(DMSO-d6) δ 11,46 (1H, s, NH-1), 6,82 (1H, s,
H-4'), 6,72 (2H, s, H-2' und -6'), 6,62 (1H, s, H-6), 5,46 (2H,
s, NH2-3), 2,22 (6H, s, CH3-3'
und -5'), 1,97 (3H, s, CH3-5). Anal. C14H16N2OS
(C, H, N, S).
-
Beispiel 18:
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Herstellung von 3-Amino-5-ethyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung
8b).
-
Wie in Beispiel 17 für die Verbindung
8a beschrieben wurde, gibt man Zinn(II)chlorid-Dihydrat (6,67 g, 29,6
mmol) zu einer Suspension von Verbindung 7b (1,80 g, 5,9 mmol) in
Ethylacetat (100 ml). Das Gemisch wird 1 h lang unter einer Argonatmosphäre auf 70°C erhitzt.
Nach Abkühlung
auf 0°C
neutralisiert man die Lösung
mit einer gesättigten
Natriumcarbonatlösung
(90 ml). Man entfernt den Niederschlag durch Filtration. Die filtrierten
Phasen werden getrennt, und man extrahiert die wässrige Phase mit Dichlormethan.
Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(3 × 120
ml) gewaschen, über
Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand
wird durch Säulenchromatographie
gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (9 : 1) als
Eluent verwendet, was das Produkt 8b (1,04 g, 64%) in Form eines
hellbeigen Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 208– 209°C; 1H-NMR
(DMSO-d6) δ 11,51 (1H, s, NH-1), 6,81 (1H,
s, H-4'), 6,68 (2H, s, H-2' und -6'), 6,56 (1H, s, H-6), 5,43 (2H,
s, NH2-3), 2,40 (2H, q, J = 7,5 Hz, CH2CH3), 2,21 (6H,
s, CH3-3' und -5'), 1,04 (3H, t, J = 7 Hz,
CH2CH3). Anal. C15H18N2OS·0,25H2O (C, H, N, S).
-
Beispiel 19:
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Herstellung von 3-Amino-5-ethyl-6-methyl-4-(3',5'-dimethlphenyl)-thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 8c).
-
Wie in Beispiel 17 für die Verbindung
8a beschrieben wurde, gibt man Zinn(II)chlorid-Dihydrat (3,11 g, 13,2
mmol) zu einer Suspension von Verbindung 7c (1,00 g, 3,1 mmol) in
Ethylacetat (50 ml). Das Gemisch wird 1 h lang unter einer Argonatmosphäre auf 70°C erhitzt.
Nach Abkühlung
auf 0°C
neutralisiert man die Lösung
mit einer gesättigten
Natriumcarbonatlösung
(60 ml). Man entfernt den Niederschlag durch Filtration. Die filtrierten
Phasen werden getrennt, und man extrahiert die wässrige Phase mit Dichlormethan.
Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(3 × 120
ml) gewaschen, über
Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand
wird durch Säulenchromatographie
gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (95 : 5)
und am Ende Ethylacetat als Eluent verwendet, was das Produkt 8c
(0,80 g, 88%) in Form eines blassgelben Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt
188–189°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,52 (1H,
s, NH-1), 6,80 (1H, s, H-4'), 6,70 (2H, s, H-2' und -6'), 5,17 (2H,
s, NH2-3), 2,21 (6H, s, CH3-3'
und -5'), 2,12 (3H, s, CH3-6), 0,93 (3H,
t, J = 7 Hz, CH2CH3),
das Signal von CH2CH3 und das
Signal des DMSO überlappen
sich. Anal. C16H20N2OS (C, H, N, S).
-
Beispiel 20:
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Herstellung von 3-Amino-5-methyl-4-(3'-methylphenvl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung
8e).
-
Wie in Beispiel 17 für die Verbindung
8a beschrieben wurde, gibt man Zinn(II)chlorid-Dihydrat (1,12 9, 5,0
mmol) zu einer Suspension von Verbindung 7e (0,36 g, 1,3 mmol) in
Ethylacetat (25 ml). Das Gemisch wird 20 h lang unter einer Argonatmosphäre auf 80°C erhitzt.
Nach Abkühlung
auf Raumtemperatur neutralisiert man die Lösung mit einer gesättigten
Natriumcarbonatlösung
(30 ml). Die gelbe Farbe des Gemischs wird rot. Nach 15 min Rühren entfernt
man den Niederschlag durch Filtration über Celite. Die filtrierten
Phasen werden getrennt, und man extrahiert die wässrige Phase mit Dichlormethan.
Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen, über
Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie
gereinigt, wobei man ein Ethylacetat/Heptan-Gemisch (2 : 1 bis 4
: 1) als Eluent verwendet, was das Produkt 8e (0,18 g, 56%) in Form
eines braunen Pulvers ergibt: Schmelzpunkt 170–171°C; 1H-NMR
(DMSO-d6) δ 11,48 (1H, s, NH-1), 7,20 (1H,
t, J = 7,5 Hz, H-5'), 6,97–6,92
(3H, m, H-2', -4' und -6'), 6,62 (1H, s, H-6), 5,49 (2H, s, NH2-3),
2,27 (3H, s, CH3-3'), 1,97 (3H, s, CH3-5). Anal. C13H14N2O3S
(C, H, N, S).
-
Beispiel 21:
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Herstellung von 3-Amino-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiochinolein-2(1H)-on (Verbindung 8f).
-
Wie in Beispiel 17 für die Verbindung
8a beschrieben wurde, gibt man Zinn(II)chlorid-Dihydrat (1,04 g, 4,6
mmol) zu einer Suspension von Verbindung 7f (0,30 g, 0,9 mmol) in
Ethylacetat (10 ml). Das Gemisch wird 1 h lang auf 70°C erhitzt.
Nach Abkühlung
auf 0°C
gibt man 10 ml Eiswasser hinzu und macht die Lösung mit einer gesättigten
Natriumcarbonatlösung
basisch. Man entfernt den gelben Niederschlag durch Filtration.
Die filtrierten Phasen werden getrennt, und man extrahiert die wässrige Phase
mit 3 × 10
ml Ethylacetat. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer
gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(3 × 10
ml) gewaschen, über
Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Der erhaltene Feststoff
wird aus Ethylacetat kristallisiert, was das Produkt 8f (0,14 g,
52,5%) in Form von grünen
Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 235– 236°C; 1H-NMR
(DMSO-d6) δ 10,01 (1H, s, NH-1), 7,72 (1H,
d, J = 8 Hz, H-8), 7,33–7,09
(3H, m, H-5, -6 und -7), 6,80 (1H, s, H-4'), 6,77 (2H, s, H-2' und
-6'), 6,06 (2H, s, NH2), 2,18 (6H, s, CH3-3' und -5'). Anal. C17H16N2OS·0,25H2O (C, H, N, S).
-
Beispiel 22:
-
Herstellung von 3-Amino-5-ethoxymethyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 8g):
-
Verbindung 7g (150 mg, 0,45 mmol)
wird in absolutem Ethanol (5 ml) gelöst. Der Katalysator (Palladium
auf Kohle 10%, 50 mg) wird hinzugefügt, und das Gemisch wird 24
Stunden lang bei Raumtemperatur unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Der
Katalysator wird durch Filtration entfernt, und das Lösungsmittel wird
verdampft. Der Rückstand
wird durch Säulenchromatographie
gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (1 : 0 bis
96 : 4) als Eluent verwendet, was das Produkt 8g (32 mg, 23%) in
Form von braunen Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 149–150°C; 1N-NMR (CDCl3): 12,27
(1H, breites s, NH-1), 6,90 (1H, s, H-6), 6,76 (1H, s, H-4'), 6,73
(2H, s, H-2' und -6'), 4,91 (2H, s, NH2-3),
4,35 (2H, s, CH2O-5), 3,48 (2H, q, J = 7
Hz, CH
3
CH
20),
2,22 (6H, s, CH3-3' und -5'), 1,14 (3H,
t, J = 7 Hz, CH3CH20).
Anal. C16H20N2O2S1 (C,
H, N, S).
-
Beispiel 23:
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Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(4',6'-dimethylpyrimidin-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 9a).
-
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,14 g,
0,72 mmol) in 10 ml Ethanol und 0,26 ml Triethylamin (1,80 mmol)
bis zur Homogenität
gerührt.
Es wird 2-Mercapto-4,6-di-methylpyrimidin
(0,09 g, 0,67 mmol) hinzugefügt.
Nach 3 h Rühren
unter Rückfluss
wird das Lösungsmittel
verdampft. Man fügt
10 ml Wasser hinzu und rührt
die Suspension 1 h lang bei Raumtemperatur. Der Feststoff wird durch
Filtration isoliert und im Vakuum über P2O5 getrocknet, was das Produkt 9a (0,12 g,
58%) in Form eines blassgelben Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 238–239°C; 1H-NMR(DMSO-d6) δ 13,02 (1H, s, NH-1), 7,75 (1H,
s, H-6), 7,15 (1H, s, H-5'), 2,36 (3H, s, CH3-4'
und -6'), 2,03 (3H, s, CH3-5). Anal. C12H12N4O3S·0,125H2O (C, H, N, S).
-
Beispiel 24:
-
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(4'-hydroxy-6'-methylpyrimidin-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 9b).
-
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,50 g,
2,6 mmol) in 20 ml Ethanol und 0,55 ml Triethylamin (4,0 mmol) bis
zur Homogenität
gerührt.
Es wird 4-Hydroxy-2-mercapto-6-methylpyrimidin
(0,38 g, 2,7 mmol) hinzugefügt.
Die Suspension wird 4 h 30 unter Rückfluss und 15 h lang bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Lösungsmittel wird
verdampft, und man gibt 10 ml Wasser hinzu. Das Gemisch wird mit
einer verdünnten
wässrigen
Ammoniaklösung
basisch gemacht, und es wird 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der
Niederschlag wird durch Filtration entfernt. Man neutralisiert die wässrige Phase
durch Zugabe von Salzsäure,
und man extrahiert mit 3 × 150
ml Ethylacetat. Die organische Phase wird konzentriert, und der
Rückstand
wird durch Säulenchromatographie
gereinigt, wobei man ein Hexan/Ethylacetat-Gemisch (1 : 1 bis 0
: 1) und ein Ethylacetat/Ethanol-Gemisch (95 : 5 bis 9 : 1) als
Eluenten verwendet, was das Produkt 9b (0,23 g, 30%) in Form von
blassgrünen
Kristallen ergibt: Schmelzpunkt > 350°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 13,02 (1H,
s, NH-1), 7,86 (1H, s, H-6), 6,04 (1H; s, H-5'), 2,22 (3H, s, CH3-6'), 1,90 (3H, s, CH3-5).
Anal. C11H10N4O4S (C, H, N, S).
-
Beispiel 25:
-
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(benzimidazol-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung
9c).
-
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,10 g,
0,5 mmol) in 10 ml Ethanol und 0,11 ml Triethylamin (0,8 mmol) bis
zur Homogenität
gerührt.
Es wird 2-Mercaptobenzimidazol (0,08 g, 0,5 mmol) hinzugefügt, und
das Gemisch wird 6 h 30 unter Rückfluss
und 72 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird verdampft,
und man gibt 10 ml Wasser hinzu. Die Suspension wird 3 h lang bei
Raumtemperatur gerührt.
Der erhaltene gelbe Feststoff wird durch Filtration isoliert, mit
Wasser gewaschen und im Vakuum über
P2O5 getrocknet,
was das Produkt 9c (0,11 g, 66%) in Form von gelben Kristallen ergab:
Schmelzpunkt 272–275°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,93 (1H,
s, NH-1), 7,72 (1H, s, H-6), 7,56 (2H, m, H-5' und -8'), 7,25–7,21 (2H,
m, H-6' und -7'), 1,88 (3H, s, CH3-5). Anal. C13H10N4O3S·0,25H2O·0,25C2H5OH (C, H, N).
-
Beispiel 26:
-
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(benzoxazol-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 9d).
-
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,50 g,
2,6 mmol) in 20 ml Ethanol und 0,55 ml Triethylamin (4,0 mmol) bis
zur Homogenität
gerührt.
Es wird 2-Mercaptobenzoxazol (0,40 g, 2,6 mmol) hinzugefügt, und
das Gemisch wird 3 h lang unter Rückfluss und 15 h lang bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Lösungsmittel
wird verdampft, und der Rückstand
wird aus Ethanol kristallisiert, was das Produkt 9d (0,22 g, 27%)
in Form eines braunen Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 180–181°C; 1H-NMR
(DMSO-d6) δ 8,91 (1H, breit, NH-1), 7,85
(1H, s, H-6), 7,81–7,70
(2H, m, H-5' und -8'), 7,50–7,39
(2H, m, H-6' und -7'), 2,10 (3H, s, CH3-5).
Anal. C13H9N3O4S·0,5C2H5OH (C, H, N, S).
-
Beispiel 27:
-
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(benzothiazol-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung
9e).
-
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,10 g,
0,5 mmol) in 10 ml Ethanol und 10 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es
wird 2-Mercaptobenzothiazol (0,09 g, 0,5 mmol) hinzugefügt, und
das Gemisch wird 15 h lang bei Raumtemperatur und 4 h lang unter
Rückfluss
gerührt.
Alle flüchtigen
Substanzen werden verdampft, und man gibt 10 ml Wasser hinzu. Die
Suspension wird 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der gelbe Feststoff wird
durch Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über P2O5 getrocknet, was
das Produkt 9e (0,10 g, 60%) in Form von gelben Kristallen ergibt:
Schmelzpunkt 240°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,90 (1H,
breit, NH-1), 8,09 (1H, dd, J1 = 7 Hz, J2 = 1 Hz, H-8'#), 7,96 (1H, dd, J1 = 7 Hz, Jz = 1 Hz, H-5'#), 7,88 (1H, s,
H-6), 7,56 (1H, td, J1 = 7 Hz, Jz = 1 Hz,
H-7'*), 7,47 (1H, td, J1 = 7 Hz, J2 = 1 Hz, H-6'*), 2,10 (3H, s, CH3-5). Anal. C13H9N3O3S2 (C, H, N).
-
Beispiel 28:
-
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(thiazolin-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 9f).
-
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,50 g,
2,6 mmol) in 10 ml Ethanol und 20 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es
wird 2-Mercaptothiazolin (0,32 g, 2,6 mmol) hinzugefügt, und
das Gemisch wird 8 h lang unter Rückfluss und 15 h lang bei Raumtemperatur
gerührt.
Alle flüchtigen
Substanzen werden verdampft, und man gibt 20 ml Wasser hinzu. Die Suspension
wird 48 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der Feststoff wird durch
Filtration isoliert und mit Wasser gewaschen. Er wird durch Säulenchromatographie
gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (1 : 0 bis
9 : 1) als Eluent verwendet, was das Produkt 9f (0,05 g, 7%) in
Form von braunen Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 177°C; 1H-NMR
(DMSO-d6) δ 13,10 (1H, breit, NH-1), 7,41
(1H, s, H-6), 4,21 (2H, t, J = 8 Hz, H-4'), 3,45 (2H, t, J = 8 Hz,
H-5'), 2,20 (3H, s, CH3-5). Anal. C9H9N3O3S2 ·0,25CZHSOH (C, H, N).
-
Beispiel 29:
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Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(N-methylimidazol-2-yl)thio-pyridin-2(1H)-on
(Verbindung 9g).
-
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,50 g,
2,6 mmol) in 20 ml Ethanol und 0,55 ml Triethylamin (4,0 mmol) bis
zur Homogenität
gerührt.
Es wird 2-Mercapto-1-methyl-imidazol
(0,30 g, 2,6 mmol) hinzugefügt,
und das Gemisch wird 6 h lang unter Rückfluss und 15 h lang bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Lösungsmittel
wird verdampft, und man gibt 15 ml Wasser hinzu. Die Suspension
wird 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der Feststoff wird durch
Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über P2O5 getrocknet, was
das Produkt 9g (0,60 g, 85%) in Form von gelben Kristallen ergibt:
Schmelzpunkt 260–265°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 9,45 (1H,
s, NH-1), 7,51 (1H, s, H-6), 7,38 (1H, t, ) = 1 Hz, H-5'*), 7,04 (1H, d,
) = 1 Hz, H-4'*), 3,61 (3H, s, N-CH3), 1,82
(3H, s, CH3-5). Anal. C10H10N4O3S
(C, H, N, S).
-
Beispiel 30:
-
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(2-pyridyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 9h).
-
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung
7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,10 g,
0,5 mmol) in 10 ml Ethanol und 10 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es
wird 2-Mercaptopyridin (0,06 g, 0,5 mmol) hinzugefügt, und
das Gemisch wird 48 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das
Lösungsmittel
wird verdampft, und man gibt 10 ml Wasser hinzu. Die Suspension
wird 3 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der Feststoff wird durch
Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über P2O5 getrocknet, was
das Produkt 9h (0,09 g, 66%) in Form von braunen Kristallen ergibt:
Schmelzpunkt 195–196°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,89 (1H,
breit, NH-1), 8,47–8,44
(1H, m, H-6'), 7,85–7,76 (1H,
m, H-4'), 7,73 (1H, s, H-6), 7,41–7,28 (2H, m, H-3' und -5'),
1,93 (3H, s, CH3-5). Anal. C11H9N3O3S
(C, H, N, S).
-
Beispiel 31:
-
Herstellung von 3-Amino-5-methyl-4-(benzoxazol-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung
10).
-
Wie in Beispiel 17 für die Verbindung
8a beschrieben wurde, gibt man Zinn(II)chlorid-Dihydrat (420 mg, 1,9
mmol) zu einer Suspension von Verbindung 9d (110 mg, 0,4 mmol) in
Ethylacetat (10 ml). Das Gemisch wird 6 h lang unter Rückfluss
erhitzt. Nach Abkühlung
auf 0°C
gibt man 10 ml Wasser hinzu und macht die Lösung mit einer gesättigten
Natriumcarbonatlösung
basisch. Die beiden Phasen werden getrennt, und man extrahiert die
wässrige
Phase mit 3 × 20
ml Ethylacetat. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(3 × 10
ml) gewaschen, über
Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Der Rückstand
wird mit Dichlormethan gewaschen, was das Produkt 10 (10 mg, 10%)
in Form eines braunen Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 296–297°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,3δ (1H, breites
s, NH-1), 9,98 (1H, s, NH2-3), 9,83 (1H,
s, NH2-3), 8,35 (1H, d, J = 7 Hz, H-5'*),
6,99 (1H, s, H-6), 6,94–6,82
(3H, m, H-6', -7' und -8'*), 2,16 (3H, s, CH3-5).
Anal. C13H11N3O2S·H2O (C, H, N).
-
Beispiel 32:
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Herstellung von 3-Formamido-5-methyl-4-(3',5'-dimethlphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 11a).
-
Man gibt Ameisensäure (2 ml) zu einer Lösung des
Amins 8a (0,10 g, 0,4 mmol) in Ethylformiat (zuvor über Calciumhydrid
destilliert) (8 ml). Das Gemisch wird 12 h lang unter Rückfluss
erhitzt. Nach dem Verdampfen der flüchtigen Substanzen wird der
Rückstand
zweimal mit Ethanol und einmal mit Ethylacetat gewaschen. Er wird
durch Säulenchromatographie
gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (95 : 5)
und am Ende Ethylacetat als Eluent verwendet, was die Verbindung
11a (0,06 g, 58%) in Form eines weißen Pulvers ergibt: Schmelzpunkt
221–222°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,96 (1H,
s, NH-1 ), 8,28 (1H, s, NH-3), 7,23 (1H, s, H-6), 6,88 (1H, s, H-4'),
6,78 (2H, s, H-2' und -6'), 2,23 (6H, s, CH3-3'
und -5'), 1,85 (3H, s, CH3-5). Anal. C15H16N2O2S (C, H, N, S).
-
Beispiel 33:
-
Herstellung von 3-Acetamido-5-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 11 b).
-
Eine Lösung des Amins 8a (0,10 g,
0,4 mmol) und Essigsäureanhydrid
(0,05 ml, 0,39 mmol) in Essigsäure
(20 ml) wird 1 h 30 unter Rückfluss
erhitzt. Nach dem Verdampfen der Lösungsmittel gibt man 10 ml Wasser
hinzu und neutralisiert das Gemisch bei 0°C mit einer verdünnten wässrigen
Ammoniaklösung.
Nach der Filtration wird der Rückstand
mit Cyclohexan (2 × 5
ml) gewaschen. Man erhält
das Produkt l1b (0,10 g, 86%) in Form eines hellbeigen Feststoffs:
Schmelzpunkt 138°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,84 (1H,
s, NH-1), 9,41 (1H, s, NH-3), 7,20 (1H, s, H-6), 6,87 (1H, s, H-4'),
6,81 (2H, s, H-2' und -6'), 2,22 (6H, s, CH3-3'
und -5'), 1,99 (3H, s, CH3-5), 1,81 (3H,
s, CH3CO). Anal. C16H18N2O2S·H2O (C, H, N, S).
-
Beispiel 34:
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Herstellung von 5-Methyl-3-propionamido-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 11c).
-
Zu einer Lösung des Amins 8a (0,10 g,
0,40 mmol) und Triethylamin (0,04 ml, 0,38 mmol) in Dichlormethan
(5 ml) wird bei 0°C
frisch destilliertes Propionylchlorid (0,04 ml, 0,41 mmol) gegeben
(das Gefäß ist mit einer
Falle ausgestattet, die CaCl2 enthält). Das
Gemisch wird 5 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird verdampft,
es wird Wasser hinzugefügt,
und der Feststoff wird durch Filtration isoliert. Der Rückstand
wird durch Säulenchromatographie
gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (94 : 6)
und am Ende Ethylacetat als Eluent verwendet, was die Verbindung
11c (0,10 g, 90%) in Form eines weißen Pulvers ergibt: Schmelzpunkt
186–188°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,86 (1H,
s, NH-1), 8,60 (1H, s, NH-3), 7,21 (1H, s, H-6), 6,88 (1H, s, H-4'),
6,80 (2H, s, H-2' und -6'), 4,04 (2H, q, J = 7 Hz, COCH
2CH3),
2,22 (6H, s, CH3- 3' und -5'), 1,82 (3H, s, CH3-5), 1,20 (3H, t, J = 7 Hz, COCH2
CH
3). Anal. C17H20N2O2S·1,25H2O (C, H, N, S).
-
Beispiel 35:
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Herstellung von 3-Heptanamido-5-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 11d).
-
Eine Lösung des Amins 8a (100 mg,
0,38 mmol) und Heptansäureanhydrid
(0,14 g, 0,58 mmol) in Toluol (4 ml) wird 1 h 30 bei 100°C erhitzt.
Nach dem Verdampfen des Toluols gibt man 5 ml Diethylether hinzu. Sobald
der Niederschlag erhalten wurde, wird das Lösungsmittel mit Hilfe einer
Pipette entfernt. Der Feststoff wird zweimal in dieser Weise mit
Diethylether gewaschen. Nach der Filtration wird der Rückstand
aus Ethylacetat umkristallisiert. Man erhält das Produkt 11d (17 mg,
50%) in Form von gelben Mikrokristallen: Schmelzpunkt 212–213°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,86 (1H,
s, NH-1), 9,34 (1H, s, NH-3), 7,19 (1H, s, H-6), 6,86 (1H, s, H-4'),
6,76 (2H, s, H-2' und -6'), 2,28 (2H, t, J = 7 Hz, COCH2),
2,22 (6H, s, CH3-3' und -5'), 1,81 (3H,
s, CH3-5), 1,53 (2H, dd, J = 7 Hz, COCH2
CH
2), 1,28–1,21
(6H, m, (CH2)3),
0,86 (3H, t, J = 6,5 Hz, (CH2)5CH3). Anal. C21H28N2O2S
(C, H, N, S).
-
Beispiel 36:
-
Herstellung von 5-Methyl-3-phenylacetamido-4-(3',5'-dimethylphenvl)-thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 11e).
-
Man gibt ein Moläquivalent Triethylamin (0,035
ml, 0,25 mmol) zu einer Suspension des Amins 8a (65 mg, 0,25 mmol)
in Dichlormethan (5 ml). Zu diesem Gemisch, das in Eiswasser abgekühlt wird,
gibt man tropfenweise eine destillierte Lösung von Phenylacetylchlorid
(39 mg, 0,25 mmol) in Dichlormethan (1 ml). Das Gemisch wird 2 h
lang bei Raumtemperatur gerührt.
Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels
gibt man 10 ml Wasser hinzu. Nach der Filtration wird der Rückstand
durch Säulenchromatographie
gereinigt, wobei man ein Dichlor methan/Ethanol-Gemisch (95 : 5)
als Eluent verwendet. Man erhält
die Verbindung 11e (53 mg, 56%) in Form von grünen Kristallen: Schmelzpunkt
200– 202°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,88 (1H,
s, NH-1), 9,67 (1H, s, NH-3), 7,37– 7,21 (5H, m, C6H5), 6,87 (1H, s, H-4'), 6,76 (2H, s, H-2'
und -6'), 3,67 (2H, s, CH2), 2,22 (6H, s, CH3-3' und -5'), 1,80 (3H, s, CH3-5).
Anal. C22H22N2O2S (C, H, N).
-
Beispiel 37:
-
Herstellung von 5-Methyl-3-N-ethoxycarbamoyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 11f).
-
Man gibt Triethylamin (0,10 g, 0,50
mmol) zu einer Lösung
des Amins 8a (0,05 g, 0,20 mmol) in Ethanol (2 ml). Zu diesem Gemisch,
das in Eiswasser abgekühlt
wird, gibt man tropfenweise frisch destilliertes Ethylchlorformiat
(0,65 g, 6,00 mmol). Das Gemisch wird 48 h lang bei Raumtemperatur
gerührt.
Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels
gibt man 5 ml Wasser hinzu. Nach der Filtration wird der rote Feststoff
durch Säulenchromatographie
gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (98 : 2)
als Eluent verwendet, was das zurückgewonnene Amin 8a (0,005
g, 10%) und die Verbindung 11f (0,01 g, 26%) in Form eines weißen Feststoffs
ergibt: Schmelzpunkt 208– 210°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,83 (1H,
s, NH-1), 8,60 (1H, s, NH-3), 7,21 (1H, s, H-6), 6,88 (1H, s, H-4'),
6,80 (2H, s, H-2' und -6'), 4,04 (2H, q, J = 7 Hz, OCH2CH3), 2,22 (6H, s, CH3-3'
und -5'), 1,82 (3H, s, CH3-5), 1,19 (3H,
t, J = 7 Hz, OCH2CH3).
Anal. C17H20N2O3S (C, H, N, S).
-
Beispiel 38:
-
Herstellung von 3-Acetamido-5-ethyl-6-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 11 g).
-
Eine Lösung des Amins 8c (0,20 g,
0,7 mmol) und Essigsäureanhydrid
(0,09 ml, 0,9 mmol) in Essigsäure
(40 ml) wird 5 h 30 unter Rückfluss
erhitzt. Nach dem Verdampfen der Lösungsmittel gibt man 20 ml Eiswasser
hinzu und neutralisiert das Gemisch bei 0°C mit einer verdünnten wässrigen
Ammoniaklösung.
Das Gemisch wird über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Nach der Filtration wird der Rückstand
mit Cyclohexan (2 × 10
ml) gewaschen. Man erhält
das Produkt llg (0,17 g, 74%) in Form eines hellbraunen Feststoffs: Schmelzpunkt
238– 239°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,90 (1H,
breites s, NH-1), 9,18 (1H, breites s, NH-3), 6,83 (1H, s, H-4'),
6,77 (2H, s, H-2' und -6'), 2,22 (9H, s, CH3-5,
-3' und -5'), 1,87 (3H, s, CH3CO), 0,85
(3H, t, J = 7 Hz, CH3CH2).
Das Signal von CH2CH3 und
das Signal des DMSO überlappen
sich. Anal. C18H2
2N2O2S·0,45H2O (C, H, N, S).
-
Beispiel 39:
-
Herstellung von 4-Chlor-5-ethyl-6-methyl-3-carbethoxypyridin-2(1H)-on (Verbindung 14).
-
Wie bei dem Verfahren, das von Nguyen
et al. (1992, siehe oben) zur Gewinnung der Verbindung 6a beschrieben
wurde, gibt man Phosphoroxidchlorid (5,4 ml, 56,8 mmol) zu einer
Lösung
der Verbindung 13 (3,00 g, 13,3 mmol) und Benzyltriethylammoniumchlorid
(12,12 g, 53,2 mmol) in Acetonitril (60 ml). Das erhaltene Gemisch
wird 6 h lang unter Rückfluss
erhitzt, was eine rote Lösung
ergibt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gibt man 20 ml
Eiswasser hinzu und rührt
das Gemisch 4 h lang bei 0°C.
Der Niederschlag wird isoliert, mit Cyclohexan (2 × 4 ml)
gewaschen und aus Ethylacetat kristallisiert, was die Verbindung
14 (2,3 g, 71%) in Form von weißen
Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 167°C; 1H-NMR
(DMSO-d6) δ 12,24 (1H, s, NH-1), 4,28 (2H,
q, J = 7 Hz, COOCH
2CH3), 2,31 (3H, s, CH3-6),
1,29 (3H, t, J = 7 Hz, COOCH2
CH
3), 1,06 (3H,
t, J = 7 Hz, CH2
CH
3), das Signal von CH2CH3 und das Signal des DMSO überlappen
sich. Anal. C11H14NO3Cl (C, H, N, Cl).
-
Beispiel 40:
-
Herstellung von 5-Ethyl-6-methyl-3-carbethoxy-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on
(Verbindung 15).
-
Wie bei dem Verfahren, das in Beispiel
10 zur Gewinnung der Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch
von Verbindung 15 (1,00 g, 4,1 mmol) in 10 ml Ethanol und 1 ml Triethylamin
bis zur Homogenität gerührt. Man
gibt 3,5-Dimethylthiophenol
(0,61 ml, 4,5 mmol) hinzu. Nach 12 h unter Rückfluss wird der weiße Niederschlag
durch Filtration isoliert und aus Ethylacetat kristallisiert. Man
erhält
das Produkt 15 (1,05 g, 82%) in Form von weißen Kristallen: Schmelzpunkt
202°C; 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,17 (1H,
s, NH-1), 7,22 (1H, s, H-4'),
6,92 (1H, s, H-2' und -6'), 4,09 (2H, q, J = 7 Hz, COOCH
2CH3),
2,45 (2H, q, J = 7 Hz, CH
2CH3), 2,27 (3H, s,
CH3-6), 2,25 (6H, s, CH3-3'
und -5'), 1,15 (3H, t, J = 7 Hz, COOCH2CH3), 0,85 (3H, t, J = 7 Hz, CH2
CH
3). Anal.
C19H23NO3S (C, H, N, S).
-
Beispiel 41:
-
Herstellung von 5-Ethyl-6-methyl-4-(3',5'-dimethlphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung
16).
-
Man löst die Verbindung 15 (120 mg,
0,34 mmol) in 6 ml eines Gemischs von Tetrahydrofuran/H2O/37%ige
HCl (18 : 3 : 4). Das Gemisch wird 10 Tage lang bei 75°C gerührt. Das
Tetrahydrofuran wird verdampft, und 5 ml Wasser werden hinzugefügt. Man
rührt das
Gemisch und entfernt das Wasser. Der Rückstand wird aus Ethanol (25
ml) kristallisiert, was das Produkt 16 (50 mg, 59%) in Form von
farblosen Flocken ergibt: Schmelzpunkt 277–278°C; 1H-NMR
(DMSOd6) δ 11,26
(1H, s, NH-1), 7,22 (3H, s, H-2', -4' und -6'), 5,25 (1H, s, H-3),
2,36 (6H, s, CH3-3' und -5'), 2,21 (3H,
s, CH3-6), 1,13 (3H, t, J = 7,5 Hz, CH2CH3). Das Signal
von CH2CH3 und das
Signal des DMSO überlappen
sich. Anal. C16H19NOS·0,25H2O (C, H, N, S)
-
Beispiel 42:
-
Biologische
Aktivität
der Verbindungen gemäß der Erfindung
-
1.) Geräte und Verfahren
-
Bewertung der
antiviralen Aktivität
der Verbindungen
-
Die Wirkungen der Verbindungen auf
die Replikation von HIV-1 (siehe Tabelle 2) wurden anhand von CEM-55-Zellen
(einer Zelllinie des lymphocytischen Zellreihe), die stark mit HIV-1
infiziert waren, bewertet, wie es von Moog et al. beschrieben wurde
(Antiviral Research (1994), 24, 275–288). Die CEM-SS sowie HIV-1, das
gegenüber
Nevirapin (N119) resistent ist und eine Punktmutation am Codon 181
der RT trägt,
wurden von P. Nara bzw. D. Richman über die Vermittlung des AIDS
Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID,
NIH (USA) (Katalognummern: Nr. 776 und Nr. 1392) zur Verfügung gestellt.
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Die Virusproduktion wurde gemessen,
indem man die Aktivität
der Reversen Transcriptase quantifizierte, die mit den in den Kulturüberstand
freigesetzten Viruspartikeln verbunden ist. Kurz gesagt: Die Zellen wurden
30 min lang mit 100 TCID50 infiziert; nach
der Adsorption des Virus wurden die nicht gebundenen Partikel durch
zweimaliges Waschen entfernt, und die Zellen wurden vor der Bestimmung
der Virusproduktion 5 Tage lang in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen
an getesteten Verbindungen kultiviert. Die Konzentration, die die
virale Vermehrung auf 50% hemmte (IC50),
stammt aus der EDV-Linie der Medianwirkung der Dosis-Wirkungs-Ergebnisse
(Chou et al., Elsevier Science Publishers, Cambridge, UK (1985),
19–28).
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In Parallelexperimenten wurde die
Cytotoxizität
der Moleküle
gegenüber
nicht infizierten Zellen nach 5 Tagen Inkubation in Gegenwart dieser
Moleküle
gemessen, indem man eine kolorimetrische Titration (MTT-Nachweis)
auf der Basis der Kapazität
der mitochondrialen Dehydrogenasen der lebenden Zellen zur Reduktion
von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid zum
Formazan verwendete (Mosmann et al., J. Immunol. Methods (1983),
65, 55–63).
Die cytotoxische Konzentration bei 50% (CC50)
ist die Konzentration, bei der die OD540 auf
die Hälfte
reduziert wurde und wird unter Verwendung des oben genannten Programms
berechnet.
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Expression und Reinigung
des RT-Enzyms von rekombinantem HIV-1
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Mit dem Vektor pAB 24/TI-4 transformierte
Hefezellen wurden verwendet, um das RT-Enzym des rekombinanten HIV-1
zu reinigen, wie es von Sallafranque-Andreola et al. beschrieben wird (1989,
Eur. J. Biochem. 184, 364–374).
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Das System für die Expression der RT von
HIV-2 in E. coli (B. Müller
et al. (1991, J. Biol. Chem. 266, 14709–14713) wurde von Dr. R. Goody
zur Verfügung
gestellt. Die RT des HIV-2 wurde wie die RT des HIV-1 gereinigt.
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Titrationen
der Reversen Transcriptase
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Eine Inkubation bei 37°C wurde 10
min lang in Gegenwart verschiedener Matrizen-Primer durchgeführt.
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- a) Poly-C-Oligo-dG: das Reaktionsgemisch enthielt ein Endvolumen
von 0,05 ml, Tris-HCl, 50 mM, pH 8,0, MgCl2,
5 mM, Dithiothreit 4 mM, 0,48 A260/ml Poly-C-Oligo-dG (5 : 1),
1,0 μCi
[3H]dGTP (28 Ci/mmol), dGTP 2 μM, KCl 80
mM, 1 μg
Rinderserumalbumin und RT 20–50
nM.
- b) Poly-A-Oligo-dT: dieselben Bedingungen wie unter a), außer dass
0,48 A260/ml Poly-A-Oligo-dT (5 : 1), 0,5 μCi [3H]dTTP (46 Ci/mmol), dTTP 20 μM verwendet
wurden.
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Die Reaktionen wurden abgebrochen,
indem man in der Kälte
1 ml 10%ige Trichloressigsäure
plus 0,1 M Natriumpyrophosphat hinzufügte. Die Niederschläge wurden über Nitrocellulosemembranen
filtriert, mit 2%iger Trichloressigsäure gewaschen, getrocknet und
in einem PPO/POPOP/Toluol-Szintillationsgemisch gezählt.
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Reverse Transcription
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Das Plasmid pmCG6, das das Nucleotidfragment
1-4005 des HIV-1 (pmal) in psP64 unter der Kontrolle des Bakteriophagen-T7-Promotors
enthält,
wurde von Dr. J. L. Darlix zur Verfügung gestellt. Für die Amplifikation
des Plasmids wurde ein Stamm von E. coli HB 101 (1035) recA– verwendet.
Nach dem Abbau dieses Klons mit HincII und in-vitro-Transcription
unter Verwendung der RNA-Polymerase
von T7 erhielt man RNA ausgehend von der Position +50 der pmal-Sequenz. Die in-vitro-Transcription
und die Reverse Transcription wurden in der von B. Bordier et al.
(1992, Nucleic Acids Res. 20, 5999–6006) beschriebenen Weise
durchgeführt.
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Hemmungsexperimente
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Alle Verbindungen wurden in Dimethylsulfoxid
(DMSO) aufgelöst.
Die Kontrollen wurden in Gegenwart der gleichen DMSO-Endkonzentration
hergestellt. IC50 ist die Konzentration,
die notwendig ist, um die Aktivität der RT des rekombinanten
HIV-1 auf 50% zu hemmen.
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2.) Ergebnisse
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Hemmung der Vermehrung des
HIV-1
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Zweiunddreißig Verbindungen gemäß der Erfindung
wurden auf ihre biologische Anti-HIV-1-Wirkung getestet. Mehrere
Moleküle
wiesen beträchtliche
antivirale Eigenschaften auf (siehe Tabelle 2). Von den besten Inhibitoren,
die einen Selektivitätsindex
von über
20 aufweisen, wurden mehrere an einem gegen Nevirapin resistenten
Stamm getestet (siehe Tabelle 3). Es hat sich herausgestellt, dass
die Verbindung 7c eine gute Anti-HIV-1-Wirkung mit einem IC50 von 260 nM auf diesen resistenten Stamm
beibehält.
Diese Verbindung wurde dann gegenüber anderen Stämmen und
anderen Zelllinien getestet (Tabelle 4).
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Hemmung der
Reversen Transcriptase
-
Verbindungen, die sich in Zellkultur
als aktiv gegen HIV-1 herausgestellt haben, wurden mit einer RT von
rekombinantem HIV-1 getestet. Die Konzentration, die 50% der RT-Aktivität hemmt
(IC50), ist für jede Verbindung in Tabelle
5 angegeben. Die Verbindungen 7c und 8c sind die besten Inhibitoren
mit IC50-Werten von 30 nM bzw. 15 nM. Ein
Derivat von HEPT, 1-Benzyloxymethyl-6-(phenylthio)thymin oder BPT
(Baba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 2356– 2360),
das unter denselben Bedingungen getestet und als Bezugsverbindung
der nicht-nucleosidischen Inhibitoren verwendet wurde, ergab einen
IC50-Wert von 400 nM.
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Komplementäre Untersuchungen wurden durchgeführt, um
die Natur der Hemmung aufzuklären.
Diese Untersuchungen wurden hauptsächlich mit den Verbindungen
7c und 8c durchgeführt.
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Die Hemmung der RT wurde unter Verwendung
von verschiedenen Matrizen-Primer-Paaren
bestimmt. Es ist bekannt, dass die nicht-nucleosidischen Inhibitoren
der RT in Abhängigkeit
von dem zur Messung der RT-Aktivität verwendeten Matrize/Primer
verschiedene Hemmungsniveaus aufweisen (De Clercq et al. (1993),
Medicinal Research Reviews, 13, 229–258).
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Die Dosis-Wirkungs-Kurven für die Verbindung
7c in Gegenwart von zwei verschiedenen Matrizen/Primern sind in 9 dargestellt. In Gegenwart
von Poly-C-Oligo-dG wurde eine bessere Hemmung erhalten als bei
Poly-A-Oligo-dT. Die Verbindung 8c ergab dasselbe Resultat. Eine
starke Hemmung wurde auch bei Verwendung der RNA von HIV-1 als natürliche Matrize
erhalten (10).
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Alle bisher identifizierten nicht-nucleosidischen
Inhibitoren sind spezifisch für
HIV-1 und hemmen die RT des HIV-2 nicht. Die Verbindungen 7c und
8c wurden mit beiden RT getestet. Wie 9 zeigt,
wird die Aktivität
der RT des HIV-2 bei Konzentrationen, bei denen die RT von HIV-1
gut gehemmt wird, nicht beeinflusst. Dieses diskriminierende Verhalten
gegenüber
der RT des HIV-1 in Bezug auf die RT des HIV-2 ist eine gängige Eigenschaft
der nicht-nucleosidischen Inhibitoren.
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Analysen der Enzymkinetik zeigen,
dass die Hemmung der RT des HIV-1 durch die Verbindungen 7c (oder
8c) bezüglich
des Substrats dGTP in Gegenwart des Matrizen-Primer-Paars Poly-C-Oligo-dG
nicht kompetitiv ist (12).
Wenn man Poly-A-Oligo-dT als Matrizen-Primer-Paar verwendet, erhält man eine
Hemmung des kompetitiven Typs (13).
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Beispiel 43:
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Untersuchung der Permeabilität des isolierten
Virions gegenüber
Inhibitoren der Reversen Transcriptase des HIV-1
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1. Geräte und Verfahren
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1.1 Herstellung von viralen Überständen:
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Chronisch mit HIV-1LAI infizierte
H9-Zellen (106/ml) werden 48 Stunden lang
mit MT4-Zellen (106/ml) in RMPI-Medium,
dem 10% fetales Kälberserum
(FCS) zugesetzt wurde, cokultiviert. Dann werden die Zellen durch
Zentrifugation entfernt, und dann wird der Überstand filtriert (0,45 μm), um die
restlichen Zellen und Zeltrümmer
zu entfernen.
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1.2 Abtrennung von Viruspartikeln:
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Nachdem sie mit verschiedenen Inhibitoren
inkubiert wurden, werden die Virusüberstände (200 μl) im filtrierenden Teil eines
VectaSpin-Röhrchens
(Whatman) abgesetzt, das mit einer Anopore-Membran der Porosität 0,02 μm ausgestattet
ist. Sie werden 10 Minuten lang einer Zentrifugation ausgesetzt,
deren Beschleunigung auf dem Niveau der Filtermembran 6000 × g erreicht.
Die so erhaltenen Virusrückstände (10–15 μl) werden
dreimal unter denselben Bedingungen mit 500 μl RPMI gewaschen und dann mit
RPMI, das 10% FCS enthält,
auf ihre ursprünglichen
Volumina zurückgebracht.
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1.3 Zellkultur:
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Die HT4LacZ-l-Zellen werden in DMEM-Medium
(Glucose 4,5 g/l), dem 10% fetales Kälberserum zugesetzt wurde,
in Gegenwart von Gentamycin (50 mg/l) gehalten. Diese Zellen sind
aus HeLa-Zellen hervorgegangen, in denen folgende Gene kloniert
wurden: einerseits das Gen, das für humanes CD4 codiert, um die anfällig für eine HIV-Infektion
zu machen (Chesebro und Wehrly, 1988, J. Virol. 62, 3779–3788),
andererseits das Gen der (3-Galactosidase, das unter die Kontrolle
des LTR von HIV-1 gebracht wird und so als Marker für die Virusinfektion
dient (Rocancourt et al. (1990), J. Virol. 1990, 64-6, 2660–2668).
Wenn das Virus nach seiner Integration in das zelluläre Genom
solche Zellen infiziert, aktiviert die Produktion des regulatorischen
TAT-Proteins das LTR des HIV. Daraus resultiert eine Aktivierung
des Gens der β-Galactosidase,
was zu ihrer Produktion im intrazellulären Medium und insbesondere
im Zellkern führt.
Dieses Protein dient als Markeρ für die Infektion.
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1.4 Messung der Infektiosität:
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Am Abend des Tages 0 werden die HT4LacZ-l-Zellen
auf 75 000 Zellen pro ml Medium verdünnt. 100 μl dieser Suspension werden dann
auf eine 96-Napf-Flachbodenplatte
verteilt und über
Nacht bei 37°C
(5% CΟ2) kultiviert.
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Am Morgen des Tages 1 wird der Überstand
durch Absaugen entfernt. Jeder Napf wird dann mit 200 μl der Verdünnungen
der zu testenden viralen Überstände versetzt.
Jede Verdünnung
wird in DMEM-Medium (Glucose 4,5 g/l), das mit 10% FCS versetzt
ist, hergestellt. Dann werden die Platten bei 37°C in Gegenwart von 5% CO2 inkubiert.
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Nach 48 Stunden Kultur wird der Überstand
abgesaugt, und dann wird jeder Napf dreimal mit PBS gewaschen, bevor
er mit 200 μl
Nachweispuffer (Tris-HCl 50 mM, pH = 8,5, ONPG 5 mg/ml, β-Mercaptoethanol 7 μl/ml, Triton
X100, 0,05%) versetzt wird. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wird die
optische Dichte jedes Napfes gemessen.
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2. Ergebnisse
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2.1 Bewertung der viralen
Ultrafiltration
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Die weiter oben beschriebene Vorschrift
wurde auf einen viralen Überstand
angewendet, der aus einer H9-MT4-Cokultur stammte. Nach jeder Zentrifugation
wird der virale Rückstand
mit Hilfe von RMPI-Medium 16/40, das 10% fetales Kälberserum
enthält,
in seinem ursprünglichen
Volumen aufgenommen, und dann wird ein Aliquot für Analysen entnommen (da das
ursprüngliche
Volumen der sukzessiven Zentrifugationen modifiziert wird, wird
das Waschvolumen bei jedem Schritt neu eingestellt). Drei Viruskonzentrate
sowie drei Filtrate werden auf diese Weise erhalten. Diese wurden
einerseits durch Messung der Aktivität der Reversen Transcriptase
(spiegelt die vorhandene Menge des Virus wider) und andererseits
durch Messung ihres Infektionsvermögens (hängt direkt von der Integrität jedes
Partikels ab) analysiert.
-
2.1.1 Messung der Aktivität der Reversen
Transcriptase (RT)
-
Jedes der viralen Konzentrate und
Filtrate, die wieder auf ihr Ursprungsvolumen eingestellt wurden, wird
auf seine RT-Aktivität
analysiert. Dazu werden 50 μl Überstand
in Gegenwart eines Matrizen/Primer-Duplex, der aus Poly-rA und Oligo-dT
besteht, in Gegenwart von dTTP-3H getestet.
Die Ergebnisse sind in 14 ausgedrückt.
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Die Messungen der RT-Aktivität der drei
Konzentrate zeigen nach drei Filtrationen einen Aktivitätsverlust
in der Größenordnung
von 5%. Die bei den drei Filtraten beobachteten Werte heben sich
nicht vom Hintergrundrauschen ab, was die ausgezeichnete Homogenität der Anopore-Membranen
anzeigt.
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2.1.2 Messung der Infektiosität
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Um die eventuelle Toxizität des Verfahrens
gegenüber
dem Viruspartikel zu bewerten, wurden Infektiositätsmessungen
durchgeführt.
Dazu werden verschiedene Verdünnungen
der viralen Konzentrate in 200 μl RMPI-Medium,
dem 10% fetales Kälberserum
zugesetzt war, mit den MT2-Zellen in Kontakt gebracht. Nach 3 Stunden
Inkubation werden die Zellen zweimal gewaschen und dann 96 Stunden
lang in Kultur zurückgebracht.
Zu diesem Zeitpunkt wird der Überstand
entnommen, die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und dann wird
der Überstand
auf seine Aktivität
der Reversen Transcriptase getestet. Die in 15 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass
das Infektionsvermögen
durch die Ultrafiltrationsschritte nicht wesentlich beeinflusst
wird.
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Die Ultrafiltration auf Anapore-Membran
0,02 μm
erlaubt also eine schnelle, wirksame und unversehrte Abtrennung
der Viruspartikel.
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2.2 Aktivität der Inhibitoren
der RT von HIV-1 auf das isolierte Virion
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Die Konzentration jedes der Inhibitoren
der RT von HIV-1 wird mit DMSO auf 50 mM eingestellt. Die nachträglichen
Verdünnungen
werden mit RPMI 1640 realisiert. Von jedem dieser Inhibitoren werden
2 μl der adäquaten Verdünnungen
zu 198 μl
einer frisch aufgetauten Virussuspension gegeben. Nach 3 Stunden
Inkubation bei Raumtemperatur werden diese Suspensionen mit VecraSpin-Röhrchen 0,02 μm filtriert,
dann dreimal mit 500 μl
RPMI 1640 gewaschen. Dann werden die viralen Rückstände mit Kulturmedium (RPMI – 10% FCS)
auf 200 μl
eingestellt und dann auf ihre Infektiosität gegenüber HT4-LacZ-Zellen getestet.
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Die in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse
zeigen eindeutig, dass sich mit Ausnahme der Verbindung 7c keiner
der Inhibitoren als aktiv gegenüber
dem isolierten Virion gezeigt hat. Um zu bestätigen, dass diese Wirkungen
nicht auf eventuelle Zersetzungen zurückzuführen sind, wurde jeder dieser
Inhibitoren gleichzeitig gegenüber
HT4LacZ in Gegenwart des Virus bewertet. Alle haben Aktivitäten gezeigt,
die mit den in der Literatur beschriebenen vergleichbar sind. Die
Ergebnisse, die für
10 und 1 μM
Nevirapin erhalten wurden, hängen
im derzeitigen Stadium der Versuche wahrscheinlich mit experimentellen
Schwankungen zusammen. Es ist außerdem hinzuzufügen, dass
erhebliche Hemmungen der Infektiosität mit TIBO R82913 bei einer
Konzentration von 100 μM
beobachtet wurden. Wie dem auch sei, nur die Verbindung 7c hat sich
als wirklich aktiv gegenüber dem
isolierten Virion erwiesen, und zwar bei Konzentration, die bis
zu 100 nM hinunterreichen.
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2.3 Hemmung der RT am isolierten
Virion
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Um zu bestätigen, dass die Hemmung der
Infektiosität
wirklich auf die Anti-Reverse-Transcriptase-Aktivität der Verbindung
7c zurückzuführen ist,
haben wir die RT-Aktivität
an einem Matrize-Primer Poly-rA/Oligo-dT gemessen, nachdem die isolierten
Virionen 3 Stunden lang mit dieser Verbindung inkubiert worden waren.
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Die Verbindung 7c scheint also in
die Hülle
und das Viruscapsid einzudringen, um sich an die RT zu heften und
deren Aktivität
zu blockieren.
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Andererseits zeigen vorläufige Experimente
zur Kinetik des Eindringens der Verbindung 7c an, dass Inkubationen
von 45 Minuten ausreichen, um Hemmungen der Infektiosität von über 98%
zu induzieren.
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3. Schlussfolgerung
-
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen,
dass die hauptsächlichen
Inhibitoren, die in der Humanklinik verwendet werden, gegenüber dem
isolierten Virion völlig
inaktiv sind (AZT, d4T, 3TC, ddl, TIBO R82913, HEPT Nevirapin).
Die Verbindung der Formel 7c hat sich als fähig erwiesen, nach Eindringen
in das Viruspartikel die Reverse Transcriptase zu hemmen und die
virale Infektiosität
zu unterdrücken.
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Diese Verbindung verhält sich
also bezüglich
ihrer Fähigkeit,
in das isolierte Virion einzudringen, wie eine perfekt originale
Verbindung.
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Tabelle
1
Elementaranalysen der Verbindungen gemäß der Erfindung
-
Tabelle
1 (Fortsetzung)
Elementaranalysen der Verbindungen gemäß der Erfindung
-
Tabelle
2
Anti-HIV-1-Aktivität
der Verbindungen gemäß der Erfindung
-
Tabelle
3
Anti-HIV-1-Aktivität
der Verbindungen gemäß der Erfindung
gegenüber
einem Nevapirin-resistenten Stamm
-
Tabelle
4
Anti-HIV-1- und Anti-HIV-2-Aktivität von Verbindung 7c
Tabelle
5
Hemmung der Reversen Transcriptase von HIV
-
Tabelle 6
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Aktivität der isolierten Virionen nach
Behandlung mit verschiedenen Inhibitoren
-
Die viralen Suspensionen werden mit
100 TCID50.B getestet. Die Ergebnisse sind auf einen viralen Überstand,
der dieselben Behandlungen erfahren hat, bezogen und entsprechen
dem Mittelwert von 1 bis 4 Experimenten.
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Tabelle
7
Inhibition der endogenen RT durch die Verbindung 7c ex vivo