DE69627346T2

DE69627346T2 - 4-aryl-thio-pyridin-2(1h)-onen, diese enthaltende arzneimittel und ihre anwendungen bei der behandlung von mit hiv zusammenhängenden krankheiten

Info

Publication number: DE69627346T2
Application number: DE69627346T
Authority: DE
Inventors: Emile Bisagni; Valerie Dolle; Hung Chi Nguyen; Michel Legraverend; Anne-Marie Aubertin; Andre Kirn; Line Marie ANDREOLA; Laura Tarrago-Litvak; Michel Ventura
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1995-07-31
Filing date: 1996-07-30
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2016-07-31
Also published as: US6015820A; WO1997005113A1; EP0843663B9; DE69627346D1; JPH11510797A; FR2737496B1; ATE236879T1; FR2737496A1; EP0843663A1; JP3988152B2; EP0843663B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft 4-Arylthiopyridin-2(1H)-one und ihre Anwendung als Medikamente.
Sie bezieht sich insbesondere auf ihre Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten, die mit dem humanen Immunschwächevirus (HIV) verbunden sind.
Derivate von 1-[(2-Hydroxyethoxy)methyl]-6-(phenylthio)thymin (HEPT) und Pyridinone sind für ihre Eigenschaften der Hemmung der Reversen Transcriptase von HIV-1 bekannt.
HEPT und ein anderes Derivat derselben Familie, das als E-EPU (5-Ethyl-1-ethoxymethyl-6-(phenylthio)uracil) bezeichnet wird, sind in 1 durch Formel (1a) bzw. (1b) dargestellt. Pyridinone, die hemmende Wirkungen auf die Reverse Transcriptase aufweisen, sind in 2 durch die Formeln (2a) und (2b) dargestellt.
Andere Inhibitorverbindungen der Reversen Transcriptase des Virus HIV, darunter Pyridinone, sind auch in der Patentanmeldung EP 0 462 800 (Merck) beschrieben. Diese Anmeldung beschreibt allgemein eine Gruppe von Pyridinonen, die eine besondere Struktur aufweisen, in der die Gruppe R₄ auf Position 4 des Cyclus ein Alkylthio- oder Alkylaminorest ist und die Gruppe auf Position 3 obligatorisch durch einen gegebenenfalls substituierten Aryl- oder Heterocyclylrest substituiert ist, der über eine Kette X-CHnR₃, bei der es sich nicht um NHCO handeln kann, mit dem Pyridinonkern verbunden ist. Doch wurden nur solche Verbindungen synthetisiert, bei denen der Rest R₄ ein Wasserstoffatom ist. Jedenfalls erwähnt dieses Dokument nicht, dass die Verbindungen in das Viruspartikel eindringen.
Diese Verbindungen weisen den Nachteil auf, dass sie ein schnelles Auftreten von resistenten HIV-1-Stämmen bewirken, und ihre langfristige Verwendung in einer Monotherapie beim Menschen bei der Behandlung von Krankheiten, die mit dem HIV-Virus verbunden sind, ist dadurch also schwierig.
Ein weiteres Problem, das sich bei der Behandlung der mit dem HIV-Virus verbundenen Krankheiten stellt, liegt in der Blockierung der Umwandlung der genomischen RNA in provirale DNA, ein unverzichtbarer Schritt bei der Integration in das eukaryontische Genom. Neuere Arbeiten zeigen eindeutig, dass dieser Schritt der Retrotranscription im Virion selbst stattfinden kann, wenn es noch in der extrazellulären Phase ist. So können im Fall von Samenflüssigkeit bis zu 2% der viralen Teilchen ihre Retrotranscription beendet haben, bis sie mit der Zielzelle verschmelzen. Es ist also unerlässlich, dass die Inhibitoren der Reversen Transcriptase (RT) in das Virion eindringen können, bevor es die Zelle erreicht hat.
Die Studien von Perelson et al. (1996, Science 271, 1582–1586) über die virale Dynamik zeigen, dass die mittlere Lebensdauer eines Viruspartikels im Blutplasma in der Größenordnung von 8 Stunden liegt, das ist fast ein Viertel der geschätzten Lebensdauer von HIV-1 in vivo. Das Virion ist in seiner extrazellulären Phase also ein potentielles Ziel für diese Inhibitoren.
Man wird feststellen, dass auch andere Thiopyridinone, die keine Anti-HIV-1-Aktivität aufweisen, beschrieben wurden.
So beschreibt der Artikel von Croisy-Delcey et al. (1983, J. Med. Chem., Vol. 26, Nr. 9, 1329–1333) die Synthese von Analoga von Lucanthon, die antitumorale und bakterizide Aktivitäten aufweisen. Die Zwischenverbindungen 7b, 17a und 17b sind Pyridinone.
Der Artikel von Rivalle et al. (1980, J. Heterocycl. Chem., Vol. 17, Nr. 2, 245– 248) beschreibt die Synthese von Pyridochinoleinen über Zwischenverbindungen, von denen einige Pyridinone sind. Es wird keine Aktivität erwähnt, weder für die End- noch für die Zwischenverbindungen.
Der Artikel von Upton (1986; J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, Nr. 7, 1225–1229) beschreibt die Synthese von Anthracenen, insbesondere über Hydroxypyridine und nicht über Pyridinone.
Die Anmelderin hat sich bemüht, neue Moleküle zu finden, die eine starke hemmende Aktivität aufweisen, d. h. in geringen Dosen aktiv sind, eine geringe Cytotoxizität haben und in das Viruspartikel eindringen.
Sie hat gezeigt, dass substituierte 4-Arylthiopyridin-2(1H)-one eine starke hemmende Aktivität und eine geringe Cytotoxizität aufweisen, wobei sie zugleich in das Viruspartikel eindringen.
Die vorliegende Erfindung betrifft also Verbindungen der Formel (3), wobei:

– R₁ und R₂ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine aliphatische Gruppe oder eine Alkyloxyalkylgruppe, in der die Alkylketten C₁- bis C₄-Gruppen sind, darstellen oder zusammen einen aromatischen Ring bilden;
– R₃ eine NH₂-, NHCOCH₃-, NO₂-, oder COOC₂H₅-Gruppe darstellt;
– R₄ eine Phenyl-, Pyrimidin-, Benzimidazol-, Benzoxazol-, Benzothiazol-, Thiazolin-, Imidazol- oder Pyridingruppe darstellt, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren aliphatischen Gruppen und/oder mit einer oder mehreren Hydroxygruppen substituiert ist;

Vorteilhafterweise stellen R₁ und R₂ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C₁- bis C₄-Alkylgruppe oder eine Alkyloxymethylgruppe, vorzugsweise Ethoxymethylgruppe, dar.
R₆ kann eine C₁- bis C₆-Alkylgruppe sein, die gegebenenfalls mit einer Phenylgruppe substituiert ist, oder R₆ kann eine Benzylgruppe sein.
R₇ kann eine C₁- bis C₆-Alkylgruppe, insbesondere eine Ethylgruppe, sein.
R₄ ist vorteilhafterweise eine Phenylgruppe, die mit Alkylgruppen, vorzugsweise mit zwei Methylgruppen, substituiert ist, und besonders bevorzugt eine Phenylgruppe, die mit zwei Methylgruppen in meta-Stellung substituiert ist.
Besonders vorteilhafte Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Verbindungen:
5-Ethyl-6-methyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Formel 7c);
5-Ethoxymethyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Formel 7g)
3-Amino-5-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Formel 8a);
3-Amino-5-ethyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Formel 8b);
3-Amino-5-ethoxymethyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Formel 89);
5-Ethyl-6-methyl-3-carbethoxy-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Formel 15).
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Gewinnung der Verbindungen gemäß der Erfindung. So können die Verbindungen, in denen R₃ NO₂ darstellt (Formel 7 und 9), erhalten werden, indem man ein Chlornitropyridinon der Formel (6) mit einem gegebenenfalls substituierten Thiophenol oder Mercaptoderivat eines Heterocyclus der Formel R₄SH umsetzt.
Zur Herstellung von Verbindungen, bei denen R₃ NH₂ darstellt (Formel 8 und 10), kann das erhaltene Nitropyridinon mit Zinn(II)chlorid-Hydrat oder durch katalytische Hydrierung reduziert werden.
So wurden die Verbindungen der Formeln 7 und 8 gemäß der Erfindung nach dem in 4 dargestellten Reaktionsschema ausgehend von den entsprechenden Hydroxypyridin-2(1H)-onen (Verbindungen 4) synthetisiert.
Die Verbindungen 9a bis 9f wurden gemäß dem in 5 dargestellten Schema erhalten.
Die Verbindungen der Formel 4 sind ihrerseits entweder so erhältlich, wie es von Legraverend et al. beschrieben wurde (Nucleosides and Nucleotides, 1986, 5(2), 125–134), oder durch Reaktion von Ethyl-2-ethyl-3-aminocrotonat (Verbindung 12) mit Diethylmalonat, um die Zwischenverbindung 13 zu erhalten, die ihrerseits mit Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert wird.
Die Nitropyridinone (Verbindungen 5) wurden durch Reaktion mit Salpetersäure HNO₃ hergestellt und dann so, wie es von C. N. Nguyen et al. beschrieben wird (Anti-Cancer Drug Design, 1992, 7, 219–233), durch Reaktion der Verbindungen der Formel (5) mit einem POCl₃/Benzyltriethylammoniumchlorid/CH₃CN-Gemisch, das unter Rückfluss erhitzt wurde, in Chlornitropyridinone (Verbindungen 6) umgewandelt.
Die Kondensation der Verbindung (6a) mit 3,5-Dimethylthiophenol, die in Gegenwart von Triethylamin in Ethanol bei Raumtemperatur durchgeführt wird, führt zu 4-(3',5'-Dimethylphenyl)thio-5-methyl-3-nitropyridin-2(1H)-on (Verbindung 7a). Die Reduktion mit Zinn(II)chlorid-Dihydrat in siedendem Ethylacetat führt zum Amin der Formel 8a.
Die Verbindungen 7d, 7e und 8e wurden durch Kondensation von Chlornitropyridinon (6a) mit Thiophenol oder m-Thiocresol, gefolgt von der Reduktion der Nitro-Funktion (im Fall von Verbindung 8e), erhalten.
Aminopyridinon (10) wurde durch Reduktion der Verbindung 9d in Gegenwart von Zinn(II)chlorid-Dihydrat in Ethylacetat unter Rückfluss erhalten.
Die Verbindungen, bei denen R₃ NHCOR₆ darstellt und R₄ eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe darstellt, können erhalten werden, indem man eine Verbindung der Formel (R₆CO)₂O oder R₆COZ, wobei Z ein Rest ist, der freige setzt werden und die Bildung einer Amidbindung ermöglichen kann, mit einem Aminopyridinon umsetzt.
So werden die Amide 11a bis lle und 11g gemäß dem in 6 dargestellten Reaktionsschema durch Modifikation der Aminofunktion von 3-Amino-5-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 8a) oder 3-Amino-5-ethyl-6-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 8c) synthetisiert. Die Reaktion wurde in Gegenwart von Ethylformiat, Essigsäureanhydrid, Propionylchlorid, Heptansäureanhydrid oder Phenylacetylchlorid durchgeführt.
Das Derivat 3-N-(Ethoxycarbamyl) (Verbindung 11f) wurde unter ähnlichen Bedingungen mit Ethylchlorformiat synthetisiert.
5-Ethylpyridinon und 5-Ethyl-6-methylpyridinon wurden entweder ausgehend von 5-Ethyl-4-hydroxypyridin-2(1H)-on (Verbindung 4b) oder ausgehend von 5-Ethyl-4-hydroxy-6-methylpyridin-2(1H)-on (Verbindung 4c) erhalten. 7 zeigt das Reaktionsschema für die Gewinnung von Verbindung 4c durch eine Abfolge von zwei Schritten ausgehend von Ethyl-2-ethylaminocrotonat (Verbindung 12). Die Nitrierung, die Monochlorierung, die Substitution mit 3,5-Dimethylthiophenol und die Reduktion der Nitrofunktion erfolgen anschließend gemäß dem Reaktionsschema der 4; sie führen zu den 3-Nitro- bzw. 3-Aminopyridinonderivaten 7b und 8b bzw. 7c und 8c. In derselben Weise wurden auch die analogen Benzo[e]pyridinone 7f und 8f erhalten, indem man als Ausgangsverbindung das kommerziell erhältliche Chinolein-2,4-diol (Verbindung 4f) verwendete.
Die Verbindungen, bei denen R₃ eine COOR₇-Gruppe darstellt und R₄ eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe darstellt, wurden erhalten, indem man ein 4-Chlorpyridinon der Formel 14 gemäß dem Schema der 7 mit einem gegebenenfalls substituierten Thiophenol umsetzt. Das 4-Chlorpyridinon der Formel 14 kann seinerseits durch Reaktion des Hydroxypyridinons der Formel 13 in Gegenwart von POCl₃ gemäß dem Schema von 7 erhalten werden.
So wurde das 3-Carbethoxy-5-ethyl-4-hydroxy-5-methylpyridin-2(1H)-on (Verbindung 13), das im Laufe der Herstellung des Pyridinons (4c) als Zwischenprodukt erhalten wurde, nacheinander in 4-Chlorpyridinon (Verbindung 14) und 4-Phenylthiopyridinon (Verbindung 15) umgewandelt. Die Hydrolyse des 3-Carbethoxypyridinons 15 führt durch Decarboxylierung zum Pyridinon (Verbindung 16), das in Position 3 nicht substituiert ist.
Die Gewinnung der Verbindungen gemäß der Erfindung ist nicht auf die oben beschriebenen Verfahren beschränkt. Sie können mit allen dem Fachmann bekannten Mitteln erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf Verbindungen, die bei der Synthese der Verbindungen der Formel (3) als Zwischenprodukte auftreten und bei denen R₁ und R₂ unabhängig voneinander Ethyl- oder Methylgruppen sind und R₃ NO₂ oder NH₂ ist und die der Formel (6) entsprechen, in der R₁ und R₂ so definiert sind.
Sie bezieht sich außerdem auf Verbindungen, die bei der Synthese der Verbindungen der Formel (3) als Zwischenprodukte auftreten und bei denen R₁ und R₂ unabhängig voneinander Ethyl- und Methylgruppen sind und R₃ die Gruppe CO₂C₂H₅ ist und die der in 8 dargestellten Formel (17) entsprechen, in der R₁ und R₂ so definiert sind.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge einer Verbindung gemäß der Erfindung, wie sie oben beschrieben wurde, im Gemisch mit verträglichen Trägerstoffen enthalten.
Sie betrifft auch ein Medikament, das diese Verbindungen enthält.
Schließlich bezieht sie sich auf die Verwendung einer dieser Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, die mit HIV verbunden sind.
Obwohl die vorliegenden Verbindungen auf jedem dem Fachmann bekannten Weg verabreicht werden können, werden sie den Patienten vorzugsweise oral, parenteral (einschließlich subkutaner, intravenöser, intramuskulärer, intrasterna- ler Injektionen), rektal und durch Inhalation verabreicht.
Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden so zubereitet, dass sie den Anforderungen der vorgenannten Verabreichungswege genügen, und liegen zum Beispiel in Form von Tabletten, Gelatinekapseln, injizierbaren sterilen Lösungen, zum Beispiel injizierbaren sterilen wässrigen Suspensionen oder Ölsuspensionen, Nasalpräparaten oder Suppositorien vor.
Wenn sie oral in Form von Suspensionen verabreicht werden, können diese Zusammensetzungen nach den Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden und können mikrokristalline Cellulose als Füllstoff, Alginsäure oder Natriumalginat als Suspensionsmittel, Methylcellulose als Viskositätsverbesserer sowie Aromastoffe enthalten.
Wenn sie nasal oder durch Inhalation verabreicht werden, können diese Zusammensetzungen in Form von Kochsalzlösungen vorliegen und Benzylalkohol oder jedes andere geeignete Konservierungsmittel, Substanzen zur Resorptionsverbesserung, um die Bioverfügbarkeit zu verbessern, Fluorkohlenstoffe und jedes andere dem Fachmann bekannte Dispersionsmittel oder Lösungsvermittler enthalten.
Die injizierbaren Lösungen oder die Suspensionen können zubereitet werden, indem man nichttoxische Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel verwendet, die für den parenteralen Weg annehmbar sind, wie Mannit, 1,3-Butandiol, Wasser, Ringer-Lösung oder eine isotonische Natriumchloridlösung oder jedes andere Dispersions-, Netz- oder Suspensionsmittel, wie sterile Öle, insbesondere synthetische Diglyceride oder Monoglyceride, und Fettsäuren, wie Oleinsäure.
Wenn sie rektal, d. h. in Form von Suppositorien, verabreicht werden, können diese Zusammensetzungen durch Mischen einer Verbindung gemäß der Erfin dung mit einem geeigneten nicht-irritierenden Trägerstoff, wie Kakaobutter, synthetischen Glycerinestern oder Polyethylenglycolen, die bei normalen Temperaturen fest sind, sich aber im Rektalraum verflüssigen oder auflösen, um die Verbindung freizusetzen, hergestellt werden.
Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung können in Mengen zwischen 1 und 100 mg/kg Körpergewicht oral verabreicht werden. Dennoch variieren die spezifischen Dosen und die Häufigkeit der Behandlung von Patient zu Patient und können von verschiedenen Faktoren abhängen, einschließlich der Aktivität der eingesetzten Verbindung, ihrer metabolischen Stabilität, ihrer Wirkungsgeschwindigkeit sowie des Alters, Gewichts und Allgemeinzustands des Patienten zum Zeitpunkt der Verabreichung, der Clearance, den anderen verwendeten Medikamenten und jedes anderen Faktors, der dem behandelten Patienten inhärent ist.
Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung dien zur Hemmung der Reversen Transcriptase von HIV, zur Prävention und Behandlung der Infektion durch HIV sowie zur Behandlung von pathologischen Folgen einer solchen Infektion, wie AIDS. Die Behandlung von AIDS oder die Prävention oder Behandlung der Infektion durch HIV kann als Behandlung eines wesentlichen Bereichs der Infektion durch HIV, wie AIDS oder ARC (AIDS-related Complex) definiert werden, ohne dass diese Definition jedoch einschränkend sein soll.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, ohne jedoch durch diese eingeschränkt zu sein.
Die folgenden Figuren veranschaulichen die Erfindung:
Die 1 bis 3 stellen die Formeln der Verbindungen (1), (2) bzw. (3) dar.
Die 4 bis 7 stellen Reaktionsschemata für die Gewinnung der Verbindungen gemäß der Erfindung dar.
Die 8 stellt die Formel der Verbindung (17) dar.
Die 9 zeigt die Wirkung der Verbindung 7c auf die Aktivität der Reversen Transcriptasen der Viren HIV-1 und HIV-2 in Gegenwart von zwei Matrizen-Primer-Paaren.
10 zeigt die dosisabhängige Wirkung der Verbindung 7c auf die Hemmung der Reversen Transcriptase von HIV-1. Die erwartete komplementäre DNA mit einer Länge von 147 Nucleotiden ist auf der linken Seite des Gels (Napf 1) angezeigt. Die Näpfe 2 bis 5 entsprechen abnehmenden Konzentrationen der Verbindung 7c (Napf 2: 400 nM; Napf 3: 300 nM; Napf 4: 100 nM; und Napf 5: 40 nM). Napf 6 enthält keine Verbindung 7c.
11 ist ein Schema der Sonde, die verwendet wurde, um die komplementäre DNA der 10 nachzuweisen.
12 ist eine doppelt-reziproke (Linewear-Burk) Darstellung der Hemmung der Reversen Transcriptase von HIV-1 durch die Verbindung 7c mit Poly-C-OligodG als Matrizen-Primer-Paar und dGTP als Substrat.
13 ist eine doppelt-reziproke Darstellung, ähnlich wie 9, wobei Poly-A-Oligo-dT als Matrizen-Primer-Paar und dTTP als Substrat verwendet werden.
14 zeigt die Messung der Aktivität der Reversen Transcriptase (RT) nach Filtration über Anopore.
15 zeigt die Messung der Infektiosität nach Filtration über Anopore.
Charakterisierung der Produkte: Es wurde eine Dünnschichtchromatographie (DC) auf Platten, die zuvor mit Silicagel 60F254 (Merck) beschichtet wurden, durchgeführt. Um die Verbindungen sichtbar zu machen, wurden die DC-Platten UV-Licht ausgesetzt. Dann wurden Reinigungen auf Silicagelsäulen (40–60 μm) durch Mitteldruckchromatographie durchgeführt. Alle Schmelzpunkte wurden mit einem Electrothermal 9200 gemessen und sind nicht korrigiert. Die ¹H-NMR-Spektren wurden in den angegebenen Lösungsmitteln mit Hilfe eines Bruker AC 200 mit CHCl₃ (δ = 7,25 ppm) oder DMSO (δ = 2,54 ppm) als internen Standards aufgenommen (*,# = austauschbare Zuordnungen). Die Elementaranalysen (Tabelle 1) wurden vom Service Central de Microanalyses du CNRS, 91190 Gif-sur-Yvette, Frankreich, durchgeführt.
Beispiel 1:
Herstellung von Ethyl-2-ethyl-3-aminocrotonat (Verbindung 12).
Ethyl-2-ethylacetoacetat (150 g, 0,95 mol) und Ammoniumnitrat (84 g, 1,04 mol) werden in 1,1 l wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Das Gemisch wird 5 Tage lang gerührt, während man Ammoniak durchleitet. Das Lösungsmittel wird bei Raumtemperatur verdampft, und es wird 1 l Wasser hinzugefügt. Das Gemisch wird 30 min lang gerührt. Der farblose feste Rückstand wird durch Filtration isoliert und in Hexan umkristallisiert, was das Produkt 12 (107 g, 72%) in Form von farblosen Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 61°C; ¹H-NMR (CDCl₃): δ = 4,11 (2H, q, J = 7 Hz, OCH₂CH₃), 2,17 (2H, q, J = 7 Hz, CH₂CH₃), 1,93 (3H, s, CH₃), 1,24 (3H, t, J = 7 Hz, OCH₂CH₃), 0,94 (3H, t, ) = 7 Hz, CH₂CH₃). Anal. C₈H₁₅NO₂ (C, H, N).
Beispiel 2:
Herstellung von 4-Hydroxy-5-ethyl-6-methyl-3-carbethoxypyridin-2(1H)-on (Verbindung 13).
Natrium (48,34 g, 2,10 mol, in Stücken in Kerosin) wird während 3 h unter Stickstoffatmosphäre langsam in 530 ml Ethanol gelöst. Das Gemisch wird zum Rückfluss erhitzt, und während 30 min wird tropfenweise Diethylmalonat (335 ml, 2,20 mol, frisch destilliert) hinzugefügt. Immer noch unter Rückfluss wird tropfenweise Aminocrotonat (Verbindung 13) (150 g; 0,96 mol) in 200 ml Ethanol hinzugefügt. Das Gemisch wird 72 h lang unter Rückfluss gerührt, was eine blassgelbe Suspension ergibt. Diese Suspension wird auf Raumtemperatur abgekühlt, und der Niederschlag wird durch Filtration isoliert. Der Feststoff wird in Wasser gelöst, auf 0°C abgekühlt und mit Salzsäure bis auf pH 1 angesäuert. Der Niederschlag wird durch Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und in Toluol kristallisiert, was das Produkt 13 (109,6 g, 51%) in Form von weißen Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 196–197°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,52 (1H, s, NH*-1), 11,32 (1H, s, OH*), 4,34 (2H, q, J = 7 Hz, COOCH₂CH₃), 2,39 (2H, q, J = 7,5 Hz, CH₂CH₃), 2,23 (3H, s, CH₃-6), 1,31 (3H, t, J = 7 Hz, COOCH₂CH₃), 1,02 (3H, t, J = 7 Hz, CH₂CH₃). Anal. C₁₁H₁₅NO₄ (C, H, N).
Beispiel 3:
Herstellung von 5-Ethyl-4-hydroxy-6-methyl-pyridin-2(1H)-on (Verbindung 4c).
Der in Beispiel 2 hergestellte Ester (13) (17,2 g, 76,4 mmol) wird in 1,2 l einer 1 N Salzsäure gelöst, und das Gemisch wird 36 h lang unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gibt man 100 ml Wasser hinzu und neutralisiert das Gemisch mit einer wässrigen Ammoniaklösung. Der Niederschlag wird durch Filtration isoliert und mit Wasser gewaschen. Man erhält das Produkt 4c (11,2 g, 96%) in Form eines weißen Feststoffs: Schmelzpunkt 360°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,75 (1H, s, NH-1), 5,46 (1H, s, H-3), 2,32 (2H, q, J = 7 Hz, CH₂CH₃), 2,13 (3H, s, CH₃-6), 0,99 (3H, t, J = 7 Hz, CH₂CH₃). Anal. C₈H₁₁N₁O₂ (C, H, N).
Beispiel 4:
Herstellung von 5-Ethyl-4-hydroxy-3-nitropyridin-2(1H)-on (Verbindung 5b).
Eine Suspension von Verbindung 4b, die so erhalten wurde, wie es von Legraverend et al. (Nucleosides and Nucleotides, 1986, 5(2), 125–134) beschrieben wurde (5,00 g, 36,0 mmol), in 40 ml Salpetersäure (d = 1,33) wird 10 min lang bei Raumtemperatur und 12 min lang bei 75°C gerührt. Es werden sofort 150 ml Eiswasser hinzugefügt, der gelbe Niederschlag wird durch Filtration isoliert und in Wasser umkristallisiert, was das Nitropyridinon 5b (5,4 g, 82%) in Form von gelben Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 213–214°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,85 (1H, s, NH-1), 7,39 (1H, s, H-6), 2,42 (2H, q, J = 7 Hz, CH₂), 1,10 (3H, t, J = 7 Hz, CH₃). Anal. C₇H₈N₂O₄·0,25H₂O (C, H, N).
Beispiel 5:
Herstellung von 5-Ethyl-4-hydroxy-6-methyl-3-nitropyridin-2(1H)-on (Verbindung 5c).
Wie in Beispiel 4 für die Verbindung 5b beschrieben wurde, wird eine Suspension von Verbindung 4c (4,00 g, 26,0 mmol) in 32 ml Salpetersäure (d = 1,33) 10 min lang bei Raumtemperatur und 10 min lang bei 80°C gerührt. Es werden sofort 80 ml Eiswasser hinzugefügt, und der Niederschlag wird durch Filtration isoliert und in Wasser umkristallisiert, was das Nitropyridinon 5c (4,4 g, 85%) in Form von gelben Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 255–256°C; ¹H-NMR (DMSOd₆) δ 11,90 (1H, s, NH-1), 2,47 (2H, q, J = 7 Hz, CH₂CH₃), 2,27 (3H, s, CH₃-6), 1,03 (3H, t, J = 7 Hz, CH₂CH₃). Anal. C₈H₁₀N₂O₄ (C, H, N).
Beispiel 6:
Herstellung von 4-Hydroxy-3-nitrochinolin-2(1H)-on (Verbindung 5f).
Wie in Beispiel 4 für die Verbindung 5b beschrieben wurde, wird eine Suspension von Verbindung 4f (9,00 g, 55,8 mmol) in 70 ml Salpetersäure (d = 1,33) 15 min lang bei Raumtemperatur und 15 min lang bei 80°C gerührt. Es werden sofort 250 ml Eiswasser hinzugefügt, der gelbe Niederschlag wird durch Filtration isoliert und mit Wasser gewaschen sowie im Vakuum über P₂O₅ getrocknet, was das Nitropyridinon 5f (11,3 g, 98%) in Form eines gelben Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 250°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,85 (1H, s, NH-1), 8,06 (1H, d, J = 8 Hz, H-8), 7,68 (1H, td, J₁ = 8 Hz, J₂ = 1 Hz, H-5), 7,37–7,26 (2H, m, H-6 und 7). Anal. C₉H₆N₂O₄ (C, H, N).
Beispiel 7:
Herstellung von 4-Chlor-5-ethyl-3-nitropyridin-2(1H)-on (Verbindung 6b).
Man gibt Phosphoroxidchlorid (6,7 ml, 39,1 mmol) zu einer Lösung von Verbindung 5b (3,00 g, 16,3 mmol) und Benzyltriethylammoniumchlorid (14,90 g, 65,2 mmol) in Acetonitril (60 ml). Das erhaltene Gemisch wird 30 min lang bei 40°C gerührt und 1 h lang unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gibt man 60 ml Wasser hinzu und rührt das Gemisch 3 h lang bei Raumtemperatur. Der gelbe Niederschlag wird isoliert, mit Cyclohexan (3 × 6 ml) gewaschen und dann getrocknet, was Verbindung 6b (2,4 g, 74%) in Form von blassgelben Kristallen ergibt: ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 13,19 (1H, s, NH-1), 7,73 (1H, s, H-6), 2,56 (2H, q, J = 7,5 Hz, CH₂CH₃), 1,16 (3H, t, J = 7,5 Hz, CH₂CH₃).
Beispiel 8:
Herstellung von 4-Chlor-5-ethyl-6-methyl-3-nitropyridin-2(1H)-on (Verbindung 6c).
Wie in Beispiel 7 für die Verbindung 6b beschrieben wurde, wird Phosphoroxidchlorid (8,3 ml, 88,8 mmol) zu einer Lösung von Verbindung 5c (4,00 g, 20 mmol) und Benzyltriethylammoniumchlorid (18,40 g, 80,8 mmol) in Acetonitril (80 ml) gegeben. Das erhaltene Gemisch wird 30 min lang bei 40°C gerührt und 1 h lang unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gibt man 150 ml Wasser hinzu und rührt das Gemisch 48 h lang bei Raumtemperatur. Der braune Niederschlag wird isoliert, mit Cyclohexan (3 × 10 ml) gewaschen und aus Ethanol umkristallisiert, was Verbindung 6c (1,5 g, 34%) in Form von blassgelben Kristallen ergibt: ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,98 (1H, s, NH-1), 2,58 (2H, q, J = 7,5 Hz, CH₂CH₃), 2,38 (3H, s, CH₃-6), 1,08 (3H, t, J = 7,5 Hz, CH₂CH₃).
Beispiel 9:
Herstellung von 4-Chlor-3-nitro-2-chinolein-2(1H)-on (Verbindung 6f).
Wie in Beispiel 7 für die Verbindung 6b beschrieben wurde, wird Phosphoroxidchlorid (4,0 ml, 46,6 mmol) zu einer Lösung von Verbindung 5f (4,00 g, 19,4 mmol) und Benzyltriethylammoniumchlorid (17,68 g, 77,6 mmol) in Acetonitril (80 ml) gegeben. Das erhaltene Gemisch wird 30 min lang bei 45°C unter Stickstoffatmosphäre gerührt und 20 min lang unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gibt man 120 ml Eiswasser hinzu. Das Gemisch wird bei 0°C mit 12 ml einer verdünnten wässrigen Ammoniaklösung (14%) neutralisiert und 1 h lang bei dieser Temperatur gerührt. Der gelbe Niederschlag wird isoliert und 1 h lang in 120 ml Hexan gerührt. Nach der Filtration wird Verbindung 6f (2,9 g, 67%) im Vakuum über P₂O₅ getrocknet, was einen gelben Feststoff ergibt: ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,10 (1H, s, NH-1), 8,04 (1H, d, J = 8 Hz, H-8), 7,84 (1H, t, J = 8 Hz, H-5), 7,54–7,43 (H, m, H-6 und 7).
Beispiel 10:
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 7a).
Ein Gemisch von Verbindung 6a, die nach Nguyen et al. (1992, siehe oben) erhalten wurde (1,88 g, 10,0 mmol), in 20 ml Ethanol und 2 ml Triethylamin wird bis zur Homogenität gerührt. Es wird tropfenweise 3,5-Dimethylthiophenol (1,39 g, 10,1 mmol) hinzugefügt. Nach 1 h Rühren bei Raumtemperatur wird der Niederschlag durch Filtration isoliert und mit Cyclohexan (20 ml) gewaschen. Man erhält das Produkt 7a (2,66 g, 92%) in Form eines gelben Feststoffs: Schmelzpunkt 235°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,27 (1H, s, NH-1), 7,63 (1H, s, H-6), 7,01 (1H, s, H-4'), 6,96 (2H, s, H-2' und 6'), 2,27 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 1,89 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₄H₁₄N₂O₃S·0,25H₂O (C, H, N, S).
Beispiel 11:
Herstellung von 5-Ethyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 7b).
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6b (2,42 g, 11,9 mmol) in 20 ml Ethanol und 2 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es wird tropfenweise 3,5-Dimethylthiophenol (1,64 ml, 12,1 mmol) hinzugefügt. Nach 4 h Rühren bei Raumtemperatur wird der Niederschlag durch Filtration isoliert und aus Ethanol (15 ml) umkristallisiert. Man erhält das Produkt 7b (1,94 g, 53%) in Form von gelben Kristallen: Schmelzpunkt 197°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,29 (1H, s, NH-1), 7,59 (1H, s, H-6), 7,00 (1H, s, H-4'), 6,94 (2H, s, H-2' und -6'), 2,36 (2H, q, J = 8 Hz, CH₂CH₃), 2,26 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 1,03 (3H, t, J = 7 Hz, CH₂CH₃). Anal. C₁₅H₁₆N₂O₃S (C, H, N, S).
Beispiel 12:
Herstellung von 5-Ethyl-6-methyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethylphenylthiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 7c).
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6c (0,90 g, 4,1 mmol) in 16 ml Ethanol und 9 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es wird tropfenweise 3,5-Dimethylthiophenol (0,57 ml, 4,2 mmol) hinzugefügt. Nach 3 h Rühren bei Raumtemperatur wird der Niederschlag durch Filtration isoliert und aus Ethanol (50 ml) umkristallisiert. Man erhält das Produkt 7c (1,07 g, 81%) in Form von gelben Kristallen: Schmelzpunkt 236–237°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,28 (1H, s, NH-1), 6,98 (1H, s, H-4'), 6,94 (2H, s, H-2' und -6'), 2,26 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 2,12 (3H, s, CH₃-6), 0,87 (3H, t, J = 7 Hz, CH₂CH₃), das Signal von CH₂CH₃ und das Signal des DMSO überlappen sich. Anal. C₁₆H₁₈N₂O₃S (C, H, N, S).
Beispiel 13:
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-phenylthiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 7d).
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,20 g, 1,1 mmol) in 2 ml Ethanol und 0,2 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es wird Thiophenol (0,12 ml, 1,1 mmol) hinzugefügt. Nach 15 h Rühren bei Raumtemperatur wird der gelbe Niederschlag durch Filtration isoliert und mit Ethanol gewaschen, was das Produkt 7d (0,13 g, 47%) in Form eines gelben Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 214–216°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,86 (1H, s, NH-1), 7,65 (1H, s, H-6), 7,45–7,36 (5H, m, H-2', -3', -4', -5' und -6'), 1,89 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₂H₁₀N ₂O₃S·0,125H₂O (C, H, N, S).
Beispiel 14:
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(3'-methylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 7e).
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,50 g, 2,6 mmol) in 10 ml Ethanol und 0,3 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es wird tropfenweise m-Thiocresol (0,35 g, 2,8 mmol) in 5 ml Ethanol hinzugefügt. Nach 15 h Rühren bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel verdampft, und es werden 15 ml Wasser hinzugefügt. Die Suspension wird 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der gelbe Niederschlag wird durch Filtration isoliert, mit 6 × 2 ml Wasser gewaschen, getrocknet und aus Ethanol umkristallisiert, was das Produkt 7e (0,52 g, 71%) in Form von gelben Nadeln ergibt: Schmelzpunkt 222–223°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,85 (1H, s, NH-1), 7,64 (1H, s, H-6), 7,27(1H, t, J = 8 Hz, H-5'), 7,20–7,14 (3H, m, H-2', -4' und -6'), 2,31 (3H, s, CH₃-3'), 1,89 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₃H₁₂N₂O₃S·0,25H₂O (C, H, N, S).
Beispiel l5:
Herstellung von 3-Nitro-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiochinolein-2(1H)-on (Verbindung 7f).
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6f (1,40 g, 6,2 mmol) in 50 ml Ethanol und 1,3 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Während 15 min wird tropfenweise 3,5-Dimethylthiophenol (0,86 ml, 6,3 mmol) in 30 ml Ethanol hinzugefügt. Das Gefäß ist mit einer Falle ausgestattet, die CaCl₂ enthält. Nach 2 h 30 Rühren bei 50°C wird das Lösungsmittel verdampft, und es werden 100 ml Wasser hinzugefügt. Das Gemisch wird mit einer verdünnten wässrigen Ammoniaklösung neutralisiert, und es wird 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der braune Niederschlag wird durch Filtration isoliert, mit Hexan gewaschen und aus Ethanol (200 ml) umkristallisiert. Man erhält das Produkt 7f (1,19 g, 59%) in Form von orangegelben Kristallen: Schmelzpunkt 294°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,89 (1H, breit, NH-1), 7,96 (1H, dd, J₁ = 8 Hz, J₂ = 1 Hz, H-8), 7,70 (1H, td, J₁ = 8 Hz, J₂ = 1 Hz, H-5), 7,48 (1H, d, J = 8 Hz, H-6*), 7,31 (1H, td, J₁ = 8 Hz, J_Z = 1 Hz, H-7*), 7,05 (2H, s, H-2' und -6'), 6,98 (1H, s, H-4'), 2,23 (6H, s, CH₃-3' und -5'). Anal. C₁₇H₁₄N₂O₃S (C, H, N,S).
Beispiel 16:
Herstellung von 5-Ethoxymethyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethlphenl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 7g):
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6g, die nach C. H. Nguyen et al. (1992, siehe oben) erhalten wurde (0,15 g, 0,6 mmol) in 5 ml Ethanol und 0,1 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es wird tropfenweise 3,5-Dimethylthiophenol (0,09 g, 0,6 mmol) in 3 ml Ethanol hinzugefügt. Nach 2 h Rühren bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel verdampft, und es werden 10 ml Wasser hinzugefügt. Das Gemisch wird durch Zugabe von 0,5 ml verdünnter wässriger Ammoniaklösung (14%) basisch gemacht, und die Suspension wird 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der gelbe Niederschlag wird durch Filtration isoliert, mit Wasser und Hexan gewaschen und dann getrocknet, was das Produkt 7 g (0,16 g, 74%) in Form eines cremefarbigen Pulvers ergibt: Schmelzpunkt 143–144°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,25 (1H, s, NH-1), 7,75 (1H, s, H-6), 7,01 (1H, s, H-4'), 6,98 (2H, s, H-2' und -6'), 4,23 (2H, s, OCH₂-5), 3,37 (2H, q, J = 7 Hz, CH ₃ CH ₂0), 2,26 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 1,08 (3H, t, J = 7 Hz, CN₃CH₂O). Anal. C₁₆H₁₈N₂O₄S (C, H, N, S).
Beispel 17:
Herstellung von 3-Amino-5-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 8a).
Man gibt Zinn(II)chlorid-Dihydrat (9,75 g, 43,0 mmol) zu einer Suspension von Verbindung 7a (2,50 g, 8,6 mmol) in Ethylacetat (150 ml). Das Gemisch wird 1 h lang unter einer Argonatmosphäre unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlung auf 0°C gibt man Eiswasser (110 ml) und eine gesättigte Natriumcarbonatlösung hinzu, bis man einen basischen pH-Wert erhält. Man entfernt den Niederschlag durch Filtration. Die filtrierten Phasen werden getrennt, und man extrahiert die wässrige Phase mit Ethylacetat. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung (3 × 120 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/ Ethanol-Gemisch (9 : 1) als Eluent verwendet, was das Produkt 8a (2,02 g, 87%) in Form eines blassgelben Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 208°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,46 (1H, s, NH-1), 6,82 (1H, s, H-4'), 6,72 (2H, s, H-2' und -6'), 6,62 (1H, s, H-6), 5,46 (2H, s, NH₂-3), 2,22 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 1,97 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₄H₁₆N₂OS (C, H, N, S).
Beispiel 18:
Herstellung von 3-Amino-5-ethyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 8b).
Wie in Beispiel 17 für die Verbindung 8a beschrieben wurde, gibt man Zinn(II)chlorid-Dihydrat (6,67 g, 29,6 mmol) zu einer Suspension von Verbindung 7b (1,80 g, 5,9 mmol) in Ethylacetat (100 ml). Das Gemisch wird 1 h lang unter einer Argonatmosphäre auf 70°C erhitzt. Nach Abkühlung auf 0°C neutralisiert man die Lösung mit einer gesättigten Natriumcarbonatlösung (90 ml). Man entfernt den Niederschlag durch Filtration. Die filtrierten Phasen werden getrennt, und man extrahiert die wässrige Phase mit Dichlormethan. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung (3 × 120 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (9 : 1) als Eluent verwendet, was das Produkt 8b (1,04 g, 64%) in Form eines hellbeigen Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 208– 209°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,51 (1H, s, NH-1), 6,81 (1H, s, H-4'), 6,68 (2H, s, H-2' und -6'), 6,56 (1H, s, H-6), 5,43 (2H, s, NH₂-3), 2,40 (2H, q, J = 7,5 Hz, CH₂CH₃), 2,21 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 1,04 (3H, t, J = 7 Hz, CH₂CH₃). Anal. C₁₅H₁₈N₂OS·0,25H₂O (C, H, N, S).
Beispiel 19:
Herstellung von 3-Amino-5-ethyl-6-methyl-4-(3',5'-dimethlphenyl)-thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 8c).
Wie in Beispiel 17 für die Verbindung 8a beschrieben wurde, gibt man Zinn(II)chlorid-Dihydrat (3,11 g, 13,2 mmol) zu einer Suspension von Verbindung 7c (1,00 g, 3,1 mmol) in Ethylacetat (50 ml). Das Gemisch wird 1 h lang unter einer Argonatmosphäre auf 70°C erhitzt. Nach Abkühlung auf 0°C neutralisiert man die Lösung mit einer gesättigten Natriumcarbonatlösung (60 ml). Man entfernt den Niederschlag durch Filtration. Die filtrierten Phasen werden getrennt, und man extrahiert die wässrige Phase mit Dichlormethan. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung (3 × 120 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (95 : 5) und am Ende Ethylacetat als Eluent verwendet, was das Produkt 8c (0,80 g, 88%) in Form eines blassgelben Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 188–189°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,52 (1H, s, NH-1), 6,80 (1H, s, H-4'), 6,70 (2H, s, H-2' und -6'), 5,17 (2H, s, NH₂-3), 2,21 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 2,12 (3H, s, CH₃-6), 0,93 (3H, t, J = 7 Hz, CH₂CH₃), das Signal von CH₂CH₃ und das Signal des DMSO überlappen sich. Anal. C₁₆H₂₀N₂OS (C, H, N, S).
Beispiel 20:
Herstellung von 3-Amino-5-methyl-4-(3'-methylphenvl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 8e).
Wie in Beispiel 17 für die Verbindung 8a beschrieben wurde, gibt man Zinn(II)chlorid-Dihydrat (1,12 9, 5,0 mmol) zu einer Suspension von Verbindung 7e (0,36 g, 1,3 mmol) in Ethylacetat (25 ml). Das Gemisch wird 20 h lang unter einer Argonatmosphäre auf 80°C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur neutralisiert man die Lösung mit einer gesättigten Natriumcarbonatlösung (30 ml). Die gelbe Farbe des Gemischs wird rot. Nach 15 min Rühren entfernt man den Niederschlag durch Filtration über Celite. Die filtrierten Phasen werden getrennt, und man extrahiert die wässrige Phase mit Dichlormethan. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei man ein Ethylacetat/Heptan-Gemisch (2 : 1 bis 4 : 1) als Eluent verwendet, was das Produkt 8e (0,18 g, 56%) in Form eines braunen Pulvers ergibt: Schmelzpunkt 170–171°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,48 (1H, s, NH-1), 7,20 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-5'), 6,97–6,92 (3H, m, H-2', -4' und -6'), 6,62 (1H, s, H-6), 5,49 (2H, s, NH₂-3), 2,27 (3H, s, CH₃-3'), 1,97 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₃H₁₄N₂O₃S (C, H, N, S).
Beispiel 21:
Herstellung von 3-Amino-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiochinolein-2(1H)-on (Verbindung 8f).
Wie in Beispiel 17 für die Verbindung 8a beschrieben wurde, gibt man Zinn(II)chlorid-Dihydrat (1,04 g, 4,6 mmol) zu einer Suspension von Verbindung 7f (0,30 g, 0,9 mmol) in Ethylacetat (10 ml). Das Gemisch wird 1 h lang auf 70°C erhitzt. Nach Abkühlung auf 0°C gibt man 10 ml Eiswasser hinzu und macht die Lösung mit einer gesättigten Natriumcarbonatlösung basisch. Man entfernt den gelben Niederschlag durch Filtration. Die filtrierten Phasen werden getrennt, und man extrahiert die wässrige Phase mit 3 × 10 ml Ethylacetat. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung (3 × 10 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Der erhaltene Feststoff wird aus Ethylacetat kristallisiert, was das Produkt 8f (0,14 g, 52,5%) in Form von grünen Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 235– 236°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,01 (1H, s, NH-1), 7,72 (1H, d, J = 8 Hz, H-8), 7,33–7,09 (3H, m, H-5, -6 und -7), 6,80 (1H, s, H-4'), 6,77 (2H, s, H-2' und -6'), 6,06 (2H, s, NH₂), 2,18 (6H, s, CH₃-3' und -5'). Anal. C₁₇H₁₆N₂OS·0,25H₂O (C, H, N, S).
Beispiel 22:
Herstellung von 3-Amino-5-ethoxymethyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 8g):
Verbindung 7g (150 mg, 0,45 mmol) wird in absolutem Ethanol (5 ml) gelöst. Der Katalysator (Palladium auf Kohle 10%, 50 mg) wird hinzugefügt, und das Gemisch wird 24 Stunden lang bei Raumtemperatur unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Der Katalysator wird durch Filtration entfernt, und das Lösungsmittel wird verdampft. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (1 : 0 bis 96 : 4) als Eluent verwendet, was das Produkt 8g (32 mg, 23%) in Form von braunen Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 149–150°C; ¹N-NMR (CDCl₃): 12,27 (1H, breites s, NH-1), 6,90 (1H, s, H-6), 6,76 (1H, s, H-4'), 6,73 (2H, s, H-2' und -6'), 4,91 (2H, s, NH₂-3), 4,35 (2H, s, CH₂O-5), 3,48 (2H, q, J = 7 Hz, CH ₃ CH ₂0), 2,22 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 1,14 (3H, t, J = 7 Hz, CH₃CH₂0). Anal. C₁₆H₂₀N₂O₂S₁ (C, H, N, S).
Beispiel 23:
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(4',6'-dimethylpyrimidin-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 9a).
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,14 g, 0,72 mmol) in 10 ml Ethanol und 0,26 ml Triethylamin (1,80 mmol) bis zur Homogenität gerührt. Es wird 2-Mercapto-4,6-di-methylpyrimidin (0,09 g, 0,67 mmol) hinzugefügt. Nach 3 h Rühren unter Rückfluss wird das Lösungsmittel verdampft. Man fügt 10 ml Wasser hinzu und rührt die Suspension 1 h lang bei Raumtemperatur. Der Feststoff wird durch Filtration isoliert und im Vakuum über P₂O₅ getrocknet, was das Produkt 9a (0,12 g, 58%) in Form eines blassgelben Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 238–239°C; ¹H-NMR(DMSO-d6) δ 13,02 (1H, s, NH-1), 7,75 (1H, s, H-6), 7,15 (1H, s, H-5'), 2,36 (3H, s, CH₃-4' und -6'), 2,03 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₂H₁₂N₄O₃S·0,125H₂O (C, H, N, S).
Beispiel 24:
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(4'-hydroxy-6'-methylpyrimidin-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 9b).
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,50 g, 2,6 mmol) in 20 ml Ethanol und 0,55 ml Triethylamin (4,0 mmol) bis zur Homogenität gerührt. Es wird 4-Hydroxy-2-mercapto-6-methylpyrimidin (0,38 g, 2,7 mmol) hinzugefügt. Die Suspension wird 4 h 30 unter Rückfluss und 15 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird verdampft, und man gibt 10 ml Wasser hinzu. Das Gemisch wird mit einer verdünnten wässrigen Ammoniaklösung basisch gemacht, und es wird 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der Niederschlag wird durch Filtration entfernt. Man neutralisiert die wässrige Phase durch Zugabe von Salzsäure, und man extrahiert mit 3 × 150 ml Ethylacetat. Die organische Phase wird konzentriert, und der Rückstand wird durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei man ein Hexan/Ethylacetat-Gemisch (1 : 1 bis 0 : 1) und ein Ethylacetat/Ethanol-Gemisch (95 : 5 bis 9 : 1) als Eluenten verwendet, was das Produkt 9b (0,23 g, 30%) in Form von blassgrünen Kristallen ergibt: Schmelzpunkt > 350°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 13,02 (1H, s, NH-1), 7,86 (1H, s, H-6), 6,04 (1H; s, H-5'), 2,22 (3H, s, CH₃-6'), 1,90 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₁H₁₀N₄O₄S (C, H, N, S).
Beispiel 25:
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(benzimidazol-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 9c).
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,10 g, 0,5 mmol) in 10 ml Ethanol und 0,11 ml Triethylamin (0,8 mmol) bis zur Homogenität gerührt. Es wird 2-Mercaptobenzimidazol (0,08 g, 0,5 mmol) hinzugefügt, und das Gemisch wird 6 h 30 unter Rückfluss und 72 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird verdampft, und man gibt 10 ml Wasser hinzu. Die Suspension wird 3 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der erhaltene gelbe Feststoff wird durch Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über P₂O₅ getrocknet, was das Produkt 9c (0,11 g, 66%) in Form von gelben Kristallen ergab: Schmelzpunkt 272–275°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,93 (1H, s, NH-1), 7,72 (1H, s, H-6), 7,56 (2H, m, H-5' und -8'), 7,25–7,21 (2H, m, H-6' und -7'), 1,88 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₃H₁₀N₄O₃S·0,25H₂O·0,25C₂H₅OH (C, H, N).
Beispiel 26:
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(benzoxazol-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 9d).
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,50 g, 2,6 mmol) in 20 ml Ethanol und 0,55 ml Triethylamin (4,0 mmol) bis zur Homogenität gerührt. Es wird 2-Mercaptobenzoxazol (0,40 g, 2,6 mmol) hinzugefügt, und das Gemisch wird 3 h lang unter Rückfluss und 15 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird verdampft, und der Rückstand wird aus Ethanol kristallisiert, was das Produkt 9d (0,22 g, 27%) in Form eines braunen Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 180–181°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,91 (1H, breit, NH-1), 7,85 (1H, s, H-6), 7,81–7,70 (2H, m, H-5' und -8'), 7,50–7,39 (2H, m, H-6' und -7'), 2,10 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₃H₉N₃O₄S·0,5C₂H₅OH (C, H, N, S).
Beispiel 27:
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(benzothiazol-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 9e).
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,10 g, 0,5 mmol) in 10 ml Ethanol und 10 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es wird 2-Mercaptobenzothiazol (0,09 g, 0,5 mmol) hinzugefügt, und das Gemisch wird 15 h lang bei Raumtemperatur und 4 h lang unter Rückfluss gerührt. Alle flüchtigen Substanzen werden verdampft, und man gibt 10 ml Wasser hinzu. Die Suspension wird 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der gelbe Feststoff wird durch Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über P₂O₅ getrocknet, was das Produkt 9e (0,10 g, 60%) in Form von gelben Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 240°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,90 (1H, breit, NH-1), 8,09 (1H, dd, J₁ = 7 Hz, J₂ = 1 Hz, H-8'#), 7,96 (1H, dd, J₁ = 7 Hz, Jz = 1 Hz, H-5'#), 7,88 (1H, s, H-6), 7,56 (1H, td, J₁ = 7 Hz, Jz = 1 Hz, H-7'*), 7,47 (1H, td, J₁ = 7 Hz, J₂ = 1 Hz, H-6'*), 2,10 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₃H₉N₃O₃S₂ (C, H, N).
Beispiel 28:
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(thiazolin-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 9f).
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,50 g, 2,6 mmol) in 10 ml Ethanol und 20 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es wird 2-Mercaptothiazolin (0,32 g, 2,6 mmol) hinzugefügt, und das Gemisch wird 8 h lang unter Rückfluss und 15 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Alle flüchtigen Substanzen werden verdampft, und man gibt 20 ml Wasser hinzu. Die Suspension wird 48 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der Feststoff wird durch Filtration isoliert und mit Wasser gewaschen. Er wird durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (1 : 0 bis 9 : 1) als Eluent verwendet, was das Produkt 9f (0,05 g, 7%) in Form von braunen Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 177°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 13,10 (1H, breit, NH-1), 7,41 (1H, s, H-6), 4,21 (2H, t, J = 8 Hz, H-4'), 3,45 (2H, t, J = 8 Hz, H-5'), 2,20 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₉H₉N₃O₃S₂ ·0,25C_ZH_SOH (C, H, N).
Beispiel 29:
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(N-methylimidazol-2-yl)thio-pyridin-2(1H)-on (Verbindung 9g).
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,50 g, 2,6 mmol) in 20 ml Ethanol und 0,55 ml Triethylamin (4,0 mmol) bis zur Homogenität gerührt. Es wird 2-Mercapto-1-methyl-imidazol (0,30 g, 2,6 mmol) hinzugefügt, und das Gemisch wird 6 h lang unter Rückfluss und 15 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird verdampft, und man gibt 15 ml Wasser hinzu. Die Suspension wird 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der Feststoff wird durch Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über P₂O₅ getrocknet, was das Produkt 9g (0,60 g, 85%) in Form von gelben Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 260–265°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 9,45 (1H, s, NH-1), 7,51 (1H, s, H-6), 7,38 (1H, t, ) = 1 Hz, H-5'*), 7,04 (1H, d, ) = 1 Hz, H-4'*), 3,61 (3H, s, N-CH₃), 1,82 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₀H₁₀N₄O₃S (C, H, N, S).
Beispiel 30:
Herstellung von 5-Methyl-3-nitro-4-(2-pyridyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 9h).
Wie in Beispiel 10 für die Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 6a (0,10 g, 0,5 mmol) in 10 ml Ethanol und 10 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Es wird 2-Mercaptopyridin (0,06 g, 0,5 mmol) hinzugefügt, und das Gemisch wird 48 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird verdampft, und man gibt 10 ml Wasser hinzu. Die Suspension wird 3 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der Feststoff wird durch Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über P₂O₅ getrocknet, was das Produkt 9h (0,09 g, 66%) in Form von braunen Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 195–196°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,89 (1H, breit, NH-1), 8,47–8,44 (1H, m, H-6'), 7,85–7,76 (1H, m, H-4'), 7,73 (1H, s, H-6), 7,41–7,28 (2H, m, H-3' und -5'), 1,93 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₁H₉N₃O₃S (C, H, N, S).
Beispiel 31:
Herstellung von 3-Amino-5-methyl-4-(benzoxazol-2-yl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 10).
Wie in Beispiel 17 für die Verbindung 8a beschrieben wurde, gibt man Zinn(II)chlorid-Dihydrat (420 mg, 1,9 mmol) zu einer Suspension von Verbindung 9d (110 mg, 0,4 mmol) in Ethylacetat (10 ml). Das Gemisch wird 6 h lang unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlung auf 0°C gibt man 10 ml Wasser hinzu und macht die Lösung mit einer gesättigten Natriumcarbonatlösung basisch. Die beiden Phasen werden getrennt, und man extrahiert die wässrige Phase mit 3 × 20 ml Ethylacetat. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung (3 × 10 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wird mit Dichlormethan gewaschen, was das Produkt 10 (10 mg, 10%) in Form eines braunen Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 296–297°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,3δ (1H, breites s, NH-1), 9,98 (1H, s, NH₂-3), 9,83 (1H, s, NH₂-3), 8,35 (1H, d, J = 7 Hz, H-5'*), 6,99 (1H, s, H-6), 6,94–6,82 (3H, m, H-6', -7' und -8'*), 2,16 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₃H₁₁N₃O₂S·H₂O (C, H, N).
Beispiel 32:
Herstellung von 3-Formamido-5-methyl-4-(3',5'-dimethlphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 11a).
Man gibt Ameisensäure (2 ml) zu einer Lösung des Amins 8a (0,10 g, 0,4 mmol) in Ethylformiat (zuvor über Calciumhydrid destilliert) (8 ml). Das Gemisch wird 12 h lang unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Verdampfen der flüchtigen Substanzen wird der Rückstand zweimal mit Ethanol und einmal mit Ethylacetat gewaschen. Er wird durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (95 : 5) und am Ende Ethylacetat als Eluent verwendet, was die Verbindung 11a (0,06 g, 58%) in Form eines weißen Pulvers ergibt: Schmelzpunkt 221–222°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,96 (1H, s, NH-1 ), 8,28 (1H, s, NH-3), 7,23 (1H, s, H-6), 6,88 (1H, s, H-4'), 6,78 (2H, s, H-2' und -6'), 2,23 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 1,85 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₁₅H₁₆N₂O₂S (C, H, N, S).
Beispiel 33:
Herstellung von 3-Acetamido-5-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 11 b).
Eine Lösung des Amins 8a (0,10 g, 0,4 mmol) und Essigsäureanhydrid (0,05 ml, 0,39 mmol) in Essigsäure (20 ml) wird 1 h 30 unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Verdampfen der Lösungsmittel gibt man 10 ml Wasser hinzu und neutralisiert das Gemisch bei 0°C mit einer verdünnten wässrigen Ammoniaklösung. Nach der Filtration wird der Rückstand mit Cyclohexan (2 × 5 ml) gewaschen. Man erhält das Produkt l1b (0,10 g, 86%) in Form eines hellbeigen Feststoffs: Schmelzpunkt 138°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,84 (1H, s, NH-1), 9,41 (1H, s, NH-3), 7,20 (1H, s, H-6), 6,87 (1H, s, H-4'), 6,81 (2H, s, H-2' und -6'), 2,22 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 1,99 (3H, s, CH₃-5), 1,81 (3H, s, CH₃CO). Anal. C₁₆H₁₈N₂O₂S·H₂O (C, H, N, S).
Beispiel 34:
Herstellung von 5-Methyl-3-propionamido-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 11c).
Zu einer Lösung des Amins 8a (0,10 g, 0,40 mmol) und Triethylamin (0,04 ml, 0,38 mmol) in Dichlormethan (5 ml) wird bei 0°C frisch destilliertes Propionylchlorid (0,04 ml, 0,41 mmol) gegeben (das Gefäß ist mit einer Falle ausgestattet, die CaCl₂ enthält). Das Gemisch wird 5 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird verdampft, es wird Wasser hinzugefügt, und der Feststoff wird durch Filtration isoliert. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (94 : 6) und am Ende Ethylacetat als Eluent verwendet, was die Verbindung 11c (0,10 g, 90%) in Form eines weißen Pulvers ergibt: Schmelzpunkt 186–188°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,86 (1H, s, NH-1), 8,60 (1H, s, NH-3), 7,21 (1H, s, H-6), 6,88 (1H, s, H-4'), 6,80 (2H, s, H-2' und -6'), 4,04 (2H, q, J = 7 Hz, COCH ₂CH₃), 2,22 (6H, s, CH₃- 3' und -5'), 1,82 (3H, s, CH₃-5), 1,20 (3H, t, J = 7 Hz, COCH₂ CH ₃). Anal. C₁₇H₂₀N₂O₂S·1,25H₂O (C, H, N, S).
Beispiel 35:
Herstellung von 3-Heptanamido-5-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 11d).
Eine Lösung des Amins 8a (100 mg, 0,38 mmol) und Heptansäureanhydrid (0,14 g, 0,58 mmol) in Toluol (4 ml) wird 1 h 30 bei 100°C erhitzt. Nach dem Verdampfen des Toluols gibt man 5 ml Diethylether hinzu. Sobald der Niederschlag erhalten wurde, wird das Lösungsmittel mit Hilfe einer Pipette entfernt. Der Feststoff wird zweimal in dieser Weise mit Diethylether gewaschen. Nach der Filtration wird der Rückstand aus Ethylacetat umkristallisiert. Man erhält das Produkt 11d (17 mg, 50%) in Form von gelben Mikrokristallen: Schmelzpunkt 212–213°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,86 (1H, s, NH-1), 9,34 (1H, s, NH-3), 7,19 (1H, s, H-6), 6,86 (1H, s, H-4'), 6,76 (2H, s, H-2' und -6'), 2,28 (2H, t, J = 7 Hz, COCH₂), 2,22 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 1,81 (3H, s, CH₃-5), 1,53 (2H, dd, J = 7 Hz, COCH₂ CH ₂), 1,28–1,21 (6H, m, (CH₂)₃), 0,86 (3H, t, J = 6,5 Hz, (CH₂)₅CH₃). Anal. C₂₁H₂₈N₂O₂S (C, H, N, S).
Beispiel 36:
Herstellung von 5-Methyl-3-phenylacetamido-4-(3',5'-dimethylphenvl)-thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 11e).
Man gibt ein Moläquivalent Triethylamin (0,035 ml, 0,25 mmol) zu einer Suspension des Amins 8a (65 mg, 0,25 mmol) in Dichlormethan (5 ml). Zu diesem Gemisch, das in Eiswasser abgekühlt wird, gibt man tropfenweise eine destillierte Lösung von Phenylacetylchlorid (39 mg, 0,25 mmol) in Dichlormethan (1 ml). Das Gemisch wird 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gibt man 10 ml Wasser hinzu. Nach der Filtration wird der Rückstand durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei man ein Dichlor methan/Ethanol-Gemisch (95 : 5) als Eluent verwendet. Man erhält die Verbindung 11e (53 mg, 56%) in Form von grünen Kristallen: Schmelzpunkt 200– 202°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,88 (1H, s, NH-1), 9,67 (1H, s, NH-3), 7,37– 7,21 (5H, m, C₆H₅), 6,87 (1H, s, H-4'), 6,76 (2H, s, H-2' und -6'), 3,67 (2H, s, CH₂), 2,22 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 1,80 (3H, s, CH₃-5). Anal. C₂₂H₂₂N₂O₂S (C, H, N).
Beispiel 37:
Herstellung von 5-Methyl-3-N-ethoxycarbamoyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 11f).
Man gibt Triethylamin (0,10 g, 0,50 mmol) zu einer Lösung des Amins 8a (0,05 g, 0,20 mmol) in Ethanol (2 ml). Zu diesem Gemisch, das in Eiswasser abgekühlt wird, gibt man tropfenweise frisch destilliertes Ethylchlorformiat (0,65 g, 6,00 mmol). Das Gemisch wird 48 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gibt man 5 ml Wasser hinzu. Nach der Filtration wird der rote Feststoff durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei man ein Dichlormethan/Ethanol-Gemisch (98 : 2) als Eluent verwendet, was das zurückgewonnene Amin 8a (0,005 g, 10%) und die Verbindung 11f (0,01 g, 26%) in Form eines weißen Feststoffs ergibt: Schmelzpunkt 208– 210°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,83 (1H, s, NH-1), 8,60 (1H, s, NH-3), 7,21 (1H, s, H-6), 6,88 (1H, s, H-4'), 6,80 (2H, s, H-2' und -6'), 4,04 (2H, q, J = 7 Hz, OCH₂CH₃), 2,22 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 1,82 (3H, s, CH₃-5), 1,19 (3H, t, J = 7 Hz, OCH₂CH₃). Anal. C₁₇H₂₀N₂O₃S (C, H, N, S).
Beispiel 38:
Herstellung von 3-Acetamido-5-ethyl-6-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 11 g).
Eine Lösung des Amins 8c (0,20 g, 0,7 mmol) und Essigsäureanhydrid (0,09 ml, 0,9 mmol) in Essigsäure (40 ml) wird 5 h 30 unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Verdampfen der Lösungsmittel gibt man 20 ml Eiswasser hinzu und neutralisiert das Gemisch bei 0°C mit einer verdünnten wässrigen Ammoniaklösung. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Filtration wird der Rückstand mit Cyclohexan (2 × 10 ml) gewaschen. Man erhält das Produkt llg (0,17 g, 74%) in Form eines hellbraunen Feststoffs: Schmelzpunkt 238– 239°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 11,90 (1H, breites s, NH-1), 9,18 (1H, breites s, NH-3), 6,83 (1H, s, H-4'), 6,77 (2H, s, H-2' und -6'), 2,22 (9H, s, CH₃-5, -3' und -5'), 1,87 (3H, s, CH₃CO), 0,85 (3H, t, J = 7 Hz, CH₃CH₂). Das Signal von CH₂CH₃ und das Signal des DMSO überlappen sich. Anal. C₁₈H₂ ₂N₂O₂S·0,45H₂O (C, H, N, S).
Beispiel 39:
Herstellung von 4-Chlor-5-ethyl-6-methyl-3-carbethoxypyridin-2(1H)-on (Verbindung 14).
Wie bei dem Verfahren, das von Nguyen et al. (1992, siehe oben) zur Gewinnung der Verbindung 6a beschrieben wurde, gibt man Phosphoroxidchlorid (5,4 ml, 56,8 mmol) zu einer Lösung der Verbindung 13 (3,00 g, 13,3 mmol) und Benzyltriethylammoniumchlorid (12,12 g, 53,2 mmol) in Acetonitril (60 ml). Das erhaltene Gemisch wird 6 h lang unter Rückfluss erhitzt, was eine rote Lösung ergibt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gibt man 20 ml Eiswasser hinzu und rührt das Gemisch 4 h lang bei 0°C. Der Niederschlag wird isoliert, mit Cyclohexan (2 × 4 ml) gewaschen und aus Ethylacetat kristallisiert, was die Verbindung 14 (2,3 g, 71%) in Form von weißen Kristallen ergibt: Schmelzpunkt 167°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,24 (1H, s, NH-1), 4,28 (2H, q, J = 7 Hz, COOCH ₂CH₃), 2,31 (3H, s, CH₃-6), 1,29 (3H, t, J = 7 Hz, COOCH₂ CH ₃), 1,06 (3H, t, J = 7 Hz, CH₂ CH ₃), das Signal von CH₂CH₃ und das Signal des DMSO überlappen sich. Anal. C₁₁H₁₄NO₃Cl (C, H, N, Cl).
Beispiel 40:
Herstellung von 5-Ethyl-6-methyl-3-carbethoxy-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 15).
Wie bei dem Verfahren, das in Beispiel 10 zur Gewinnung der Verbindung 7a beschrieben wurde, wird ein Gemisch von Verbindung 15 (1,00 g, 4,1 mmol) in 10 ml Ethanol und 1 ml Triethylamin bis zur Homogenität gerührt. Man gibt 3,5-Dimethylthiophenol (0,61 ml, 4,5 mmol) hinzu. Nach 12 h unter Rückfluss wird der weiße Niederschlag durch Filtration isoliert und aus Ethylacetat kristallisiert. Man erhält das Produkt 15 (1,05 g, 82%) in Form von weißen Kristallen: Schmelzpunkt 202°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,17 (1H, s, NH-1), 7,22 (1H, s, H-4'), 6,92 (1H, s, H-2' und -6'), 4,09 (2H, q, J = 7 Hz, COOCH ₂CH₃), 2,45 (2H, q, J = 7 Hz, CH ₂CH₃), 2,27 (3H, s, CH₃-6), 2,25 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 1,15 (3H, t, J = 7 Hz, COOCH₂CH₃), 0,85 (3H, t, J = 7 Hz, CH₂ CH ₃). Anal. C₁₉H₂₃NO₃S (C, H, N, S).
Beispiel 41:
Herstellung von 5-Ethyl-6-methyl-4-(3',5'-dimethlphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Verbindung 16).
Man löst die Verbindung 15 (120 mg, 0,34 mmol) in 6 ml eines Gemischs von Tetrahydrofuran/H₂O/37%ige HCl (18 : 3 : 4). Das Gemisch wird 10 Tage lang bei 75°C gerührt. Das Tetrahydrofuran wird verdampft, und 5 ml Wasser werden hinzugefügt. Man rührt das Gemisch und entfernt das Wasser. Der Rückstand wird aus Ethanol (25 ml) kristallisiert, was das Produkt 16 (50 mg, 59%) in Form von farblosen Flocken ergibt: Schmelzpunkt 277–278°C; ¹H-NMR (DMSOd₆) δ 11,26 (1H, s, NH-1), 7,22 (3H, s, H-2', -4' und -6'), 5,25 (1H, s, H-3), 2,36 (6H, s, CH₃-3' und -5'), 2,21 (3H, s, CH₃-6), 1,13 (3H, t, J = 7,5 Hz, CH₂CH₃). Das Signal von CH₂CH₃ und das Signal des DMSO überlappen sich. Anal. C₁₆H₁₉NOS·0,25H₂O (C, H, N, S)
Beispiel 42:
Biologische Aktivität der Verbindungen gemäß der Erfindung
1.) Geräte und Verfahren
Bewertung der antiviralen Aktivität der Verbindungen
Die Wirkungen der Verbindungen auf die Replikation von HIV-1 (siehe Tabelle 2) wurden anhand von CEM-55-Zellen (einer Zelllinie des lymphocytischen Zellreihe), die stark mit HIV-1 infiziert waren, bewertet, wie es von Moog et al. beschrieben wurde (Antiviral Research (1994), 24, 275–288). Die CEM-SS sowie HIV-1, das gegenüber Nevirapin (N119) resistent ist und eine Punktmutation am Codon 181 der RT trägt, wurden von P. Nara bzw. D. Richman über die Vermittlung des AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH (USA) (Katalognummern: Nr. 776 und Nr. 1392) zur Verfügung gestellt.
Die Virusproduktion wurde gemessen, indem man die Aktivität der Reversen Transcriptase quantifizierte, die mit den in den Kulturüberstand freigesetzten Viruspartikeln verbunden ist. Kurz gesagt: Die Zellen wurden 30 min lang mit 100 TCID₅₀ infiziert; nach der Adsorption des Virus wurden die nicht gebundenen Partikel durch zweimaliges Waschen entfernt, und die Zellen wurden vor der Bestimmung der Virusproduktion 5 Tage lang in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen an getesteten Verbindungen kultiviert. Die Konzentration, die die virale Vermehrung auf 50% hemmte (IC₅₀), stammt aus der EDV-Linie der Medianwirkung der Dosis-Wirkungs-Ergebnisse (Chou et al., Elsevier Science Publishers, Cambridge, UK (1985), 19–28).
In Parallelexperimenten wurde die Cytotoxizität der Moleküle gegenüber nicht infizierten Zellen nach 5 Tagen Inkubation in Gegenwart dieser Moleküle gemessen, indem man eine kolorimetrische Titration (MTT-Nachweis) auf der Basis der Kapazität der mitochondrialen Dehydrogenasen der lebenden Zellen zur Reduktion von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid zum Formazan verwendete (Mosmann et al., J. Immunol. Methods (1983), 65, 55–63). Die cytotoxische Konzentration bei 50% (CC₅₀) ist die Konzentration, bei der die OD₅₄₀ auf die Hälfte reduziert wurde und wird unter Verwendung des oben genannten Programms berechnet.
Expression und Reinigung des RT-Enzyms von rekombinantem HIV-1
Mit dem Vektor pAB 24/TI-4 transformierte Hefezellen wurden verwendet, um das RT-Enzym des rekombinanten HIV-1 zu reinigen, wie es von Sallafranque-Andreola et al. beschrieben wird (1989, Eur. J. Biochem. 184, 364–374).
Das System für die Expression der RT von HIV-2 in E. coli (B. Müller et al. (1991, J. Biol. Chem. 266, 14709–14713) wurde von Dr. R. Goody zur Verfügung gestellt. Die RT des HIV-2 wurde wie die RT des HIV-1 gereinigt.
Titrationen der Reversen Transcriptase
Eine Inkubation bei 37°C wurde 10 min lang in Gegenwart verschiedener Matrizen-Primer durchgeführt.

a) Poly-C-Oligo-dG: das Reaktionsgemisch enthielt ein Endvolumen von 0,05 ml, Tris-HCl, 50 mM, pH 8,0, MgCl₂, 5 mM, Dithiothreit 4 mM, 0,48 A₂₆₀/ml Poly-C-Oligo-dG (5 : 1), 1,0 μCi [³H]dGTP (28 Ci/mmol), dGTP 2 μM, KCl 80 mM, 1 μg Rinderserumalbumin und RT 20–50 nM.
b) Poly-A-Oligo-dT: dieselben Bedingungen wie unter a), außer dass 0,48 A₂₆0/ml Poly-A-Oligo-dT (5 : 1), 0,5 μCi [³H]dTTP (46 Ci/mmol), dTTP 20 μM verwendet wurden.

Die Reaktionen wurden abgebrochen, indem man in der Kälte 1 ml 10%ige Trichloressigsäure plus 0,1 M Natriumpyrophosphat hinzufügte. Die Niederschläge wurden über Nitrocellulosemembranen filtriert, mit 2%iger Trichloressigsäure gewaschen, getrocknet und in einem PPO/POPOP/Toluol-Szintillationsgemisch gezählt.
Reverse Transcription
Das Plasmid pmCG6, das das Nucleotidfragment 1-4005 des HIV-1 (pmal) in psP64 unter der Kontrolle des Bakteriophagen-T7-Promotors enthält, wurde von Dr. J. L. Darlix zur Verfügung gestellt. Für die Amplifikation des Plasmids wurde ein Stamm von E. coli HB 101 (1035) recA^– verwendet. Nach dem Abbau dieses Klons mit HincII und in-vitro-Transcription unter Verwendung der RNA-Polymerase von T7 erhielt man RNA ausgehend von der Position +50 der pmal-Sequenz. Die in-vitro-Transcription und die Reverse Transcription wurden in der von B. Bordier et al. (1992, Nucleic Acids Res. 20, 5999–6006) beschriebenen Weise durchgeführt.
Hemmungsexperimente
Alle Verbindungen wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelöst. Die Kontrollen wurden in Gegenwart der gleichen DMSO-Endkonzentration hergestellt. IC₅₀ ist die Konzentration, die notwendig ist, um die Aktivität der RT des rekombinanten HIV-1 auf 50% zu hemmen.
2.) Ergebnisse
Hemmung der Vermehrung des HIV-1
Zweiunddreißig Verbindungen gemäß der Erfindung wurden auf ihre biologische Anti-HIV-1-Wirkung getestet. Mehrere Moleküle wiesen beträchtliche antivirale Eigenschaften auf (siehe Tabelle 2). Von den besten Inhibitoren, die einen Selektivitätsindex von über 20 aufweisen, wurden mehrere an einem gegen Nevirapin resistenten Stamm getestet (siehe Tabelle 3). Es hat sich herausgestellt, dass die Verbindung 7c eine gute Anti-HIV-1-Wirkung mit einem IC₅₀ von 260 nM auf diesen resistenten Stamm beibehält. Diese Verbindung wurde dann gegenüber anderen Stämmen und anderen Zelllinien getestet (Tabelle 4).
Hemmung der Reversen Transcriptase
Verbindungen, die sich in Zellkultur als aktiv gegen HIV-1 herausgestellt haben, wurden mit einer RT von rekombinantem HIV-1 getestet. Die Konzentration, die 50% der RT-Aktivität hemmt (IC₅₀), ist für jede Verbindung in Tabelle 5 angegeben. Die Verbindungen 7c und 8c sind die besten Inhibitoren mit IC₅₀-Werten von 30 nM bzw. 15 nM. Ein Derivat von HEPT, 1-Benzyloxymethyl-6-(phenylthio)thymin oder BPT (Baba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 2356– 2360), das unter denselben Bedingungen getestet und als Bezugsverbindung der nicht-nucleosidischen Inhibitoren verwendet wurde, ergab einen IC₅₀-Wert von 400 nM.
Komplementäre Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Natur der Hemmung aufzuklären. Diese Untersuchungen wurden hauptsächlich mit den Verbindungen 7c und 8c durchgeführt.
Die Hemmung der RT wurde unter Verwendung von verschiedenen Matrizen-Primer-Paaren bestimmt. Es ist bekannt, dass die nicht-nucleosidischen Inhibitoren der RT in Abhängigkeit von dem zur Messung der RT-Aktivität verwendeten Matrize/Primer verschiedene Hemmungsniveaus aufweisen (De Clercq et al. (1993), Medicinal Research Reviews, 13, 229–258).
Die Dosis-Wirkungs-Kurven für die Verbindung 7c in Gegenwart von zwei verschiedenen Matrizen/Primern sind in 9 dargestellt. In Gegenwart von Poly-C-Oligo-dG wurde eine bessere Hemmung erhalten als bei Poly-A-Oligo-dT. Die Verbindung 8c ergab dasselbe Resultat. Eine starke Hemmung wurde auch bei Verwendung der RNA von HIV-1 als natürliche Matrize erhalten (10).
Alle bisher identifizierten nicht-nucleosidischen Inhibitoren sind spezifisch für HIV-1 und hemmen die RT des HIV-2 nicht. Die Verbindungen 7c und 8c wurden mit beiden RT getestet. Wie 9 zeigt, wird die Aktivität der RT des HIV-2 bei Konzentrationen, bei denen die RT von HIV-1 gut gehemmt wird, nicht beeinflusst. Dieses diskriminierende Verhalten gegenüber der RT des HIV-1 in Bezug auf die RT des HIV-2 ist eine gängige Eigenschaft der nicht-nucleosidischen Inhibitoren.
Analysen der Enzymkinetik zeigen, dass die Hemmung der RT des HIV-1 durch die Verbindungen 7c (oder 8c) bezüglich des Substrats dGTP in Gegenwart des Matrizen-Primer-Paars Poly-C-Oligo-dG nicht kompetitiv ist (12). Wenn man Poly-A-Oligo-dT als Matrizen-Primer-Paar verwendet, erhält man eine Hemmung des kompetitiven Typs (13).
Beispiel 43:
Untersuchung der Permeabilität des isolierten Virions gegenüber Inhibitoren der Reversen Transcriptase des HIV-1
1. Geräte und Verfahren
1.1 Herstellung von viralen Überständen:
Chronisch mit HIV-1LAI infizierte H9-Zellen (10⁶/ml) werden 48 Stunden lang mit MT4-Zellen (10⁶/ml) in RMPI-Medium, dem 10% fetales Kälberserum (FCS) zugesetzt wurde, cokultiviert. Dann werden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und dann wird der Überstand filtriert (0,45 μm), um die restlichen Zellen und Zeltrümmer zu entfernen.
1.2 Abtrennung von Viruspartikeln:
Nachdem sie mit verschiedenen Inhibitoren inkubiert wurden, werden die Virusüberstände (200 μl) im filtrierenden Teil eines VectaSpin-Röhrchens (Whatman) abgesetzt, das mit einer Anopore-Membran der Porosität 0,02 μm ausgestattet ist. Sie werden 10 Minuten lang einer Zentrifugation ausgesetzt, deren Beschleunigung auf dem Niveau der Filtermembran 6000 × g erreicht. Die so erhaltenen Virusrückstände (10–15 μl) werden dreimal unter denselben Bedingungen mit 500 μl RPMI gewaschen und dann mit RPMI, das 10% FCS enthält, auf ihre ursprünglichen Volumina zurückgebracht.
1.3 Zellkultur:
Die HT4LacZ-l-Zellen werden in DMEM-Medium (Glucose 4,5 g/l), dem 10% fetales Kälberserum zugesetzt wurde, in Gegenwart von Gentamycin (50 mg/l) gehalten. Diese Zellen sind aus HeLa-Zellen hervorgegangen, in denen folgende Gene kloniert wurden: einerseits das Gen, das für humanes CD4 codiert, um die anfällig für eine HIV-Infektion zu machen (Chesebro und Wehrly, 1988, J. Virol. 62, 3779–3788), andererseits das Gen der (3-Galactosidase, das unter die Kontrolle des LTR von HIV-1 gebracht wird und so als Marker für die Virusinfektion dient (Rocancourt et al. (1990), J. Virol. 1990, 64-6, 2660–2668). Wenn das Virus nach seiner Integration in das zelluläre Genom solche Zellen infiziert, aktiviert die Produktion des regulatorischen TAT-Proteins das LTR des HIV. Daraus resultiert eine Aktivierung des Gens der β-Galactosidase, was zu ihrer Produktion im intrazellulären Medium und insbesondere im Zellkern führt. Dieses Protein dient als Markeρ für die Infektion.
1.4 Messung der Infektiosität:
Am Abend des Tages 0 werden die HT4LacZ-l-Zellen auf 75 000 Zellen pro ml Medium verdünnt. 100 μl dieser Suspension werden dann auf eine 96-Napf-Flachbodenplatte verteilt und über Nacht bei 37°C (5% CΟ₂) kultiviert.
Am Morgen des Tages 1 wird der Überstand durch Absaugen entfernt. Jeder Napf wird dann mit 200 μl der Verdünnungen der zu testenden viralen Überstände versetzt. Jede Verdünnung wird in DMEM-Medium (Glucose 4,5 g/l), das mit 10% FCS versetzt ist, hergestellt. Dann werden die Platten bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert.
Nach 48 Stunden Kultur wird der Überstand abgesaugt, und dann wird jeder Napf dreimal mit PBS gewaschen, bevor er mit 200 μl Nachweispuffer (Tris-HCl 50 mM, pH = 8,5, ONPG 5 mg/ml, β-Mercaptoethanol 7 μl/ml, Triton X100, 0,05%) versetzt wird. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wird die optische Dichte jedes Napfes gemessen.
2. Ergebnisse
2.1 Bewertung der viralen Ultrafiltration
Die weiter oben beschriebene Vorschrift wurde auf einen viralen Überstand angewendet, der aus einer H9-MT4-Cokultur stammte. Nach jeder Zentrifugation wird der virale Rückstand mit Hilfe von RMPI-Medium 16/40, das 10% fetales Kälberserum enthält, in seinem ursprünglichen Volumen aufgenommen, und dann wird ein Aliquot für Analysen entnommen (da das ursprüngliche Volumen der sukzessiven Zentrifugationen modifiziert wird, wird das Waschvolumen bei jedem Schritt neu eingestellt). Drei Viruskonzentrate sowie drei Filtrate werden auf diese Weise erhalten. Diese wurden einerseits durch Messung der Aktivität der Reversen Transcriptase (spiegelt die vorhandene Menge des Virus wider) und andererseits durch Messung ihres Infektionsvermögens (hängt direkt von der Integrität jedes Partikels ab) analysiert.
2.1.1 Messung der Aktivität der Reversen Transcriptase (RT)
Jedes der viralen Konzentrate und Filtrate, die wieder auf ihr Ursprungsvolumen eingestellt wurden, wird auf seine RT-Aktivität analysiert. Dazu werden 50 μl Überstand in Gegenwart eines Matrizen/Primer-Duplex, der aus Poly-rA und Oligo-dT besteht, in Gegenwart von dTTP-³H getestet. Die Ergebnisse sind in 14 ausgedrückt.
Die Messungen der RT-Aktivität der drei Konzentrate zeigen nach drei Filtrationen einen Aktivitätsverlust in der Größenordnung von 5%. Die bei den drei Filtraten beobachteten Werte heben sich nicht vom Hintergrundrauschen ab, was die ausgezeichnete Homogenität der Anopore-Membranen anzeigt.
2.1.2 Messung der Infektiosität
Um die eventuelle Toxizität des Verfahrens gegenüber dem Viruspartikel zu bewerten, wurden Infektiositätsmessungen durchgeführt. Dazu werden verschiedene Verdünnungen der viralen Konzentrate in 200 μl RMPI-Medium, dem 10% fetales Kälberserum zugesetzt war, mit den MT2-Zellen in Kontakt gebracht. Nach 3 Stunden Inkubation werden die Zellen zweimal gewaschen und dann 96 Stunden lang in Kultur zurückgebracht. Zu diesem Zeitpunkt wird der Überstand entnommen, die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und dann wird der Überstand auf seine Aktivität der Reversen Transcriptase getestet. Die in 15 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass das Infektionsvermögen durch die Ultrafiltrationsschritte nicht wesentlich beeinflusst wird.
Die Ultrafiltration auf Anapore-Membran 0,02 μm erlaubt also eine schnelle, wirksame und unversehrte Abtrennung der Viruspartikel.
2.2 Aktivität der Inhibitoren der RT von HIV-1 auf das isolierte Virion
Die Konzentration jedes der Inhibitoren der RT von HIV-1 wird mit DMSO auf 50 mM eingestellt. Die nachträglichen Verdünnungen werden mit RPMI 1640 realisiert. Von jedem dieser Inhibitoren werden 2 μl der adäquaten Verdünnungen zu 198 μl einer frisch aufgetauten Virussuspension gegeben. Nach 3 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur werden diese Suspensionen mit VecraSpin-Röhrchen 0,02 μm filtriert, dann dreimal mit 500 μl RPMI 1640 gewaschen. Dann werden die viralen Rückstände mit Kulturmedium (RPMI – 10% FCS) auf 200 μl eingestellt und dann auf ihre Infektiosität gegenüber HT4-LacZ-Zellen getestet.
Die in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse zeigen eindeutig, dass sich mit Ausnahme der Verbindung 7c keiner der Inhibitoren als aktiv gegenüber dem isolierten Virion gezeigt hat. Um zu bestätigen, dass diese Wirkungen nicht auf eventuelle Zersetzungen zurückzuführen sind, wurde jeder dieser Inhibitoren gleichzeitig gegenüber HT4LacZ in Gegenwart des Virus bewertet. Alle haben Aktivitäten gezeigt, die mit den in der Literatur beschriebenen vergleichbar sind. Die Ergebnisse, die für 10 und 1 μM Nevirapin erhalten wurden, hängen im derzeitigen Stadium der Versuche wahrscheinlich mit experimentellen Schwankungen zusammen. Es ist außerdem hinzuzufügen, dass erhebliche Hemmungen der Infektiosität mit TIBO R82913 bei einer Konzentration von 100 μM beobachtet wurden. Wie dem auch sei, nur die Verbindung 7c hat sich als wirklich aktiv gegenüber dem isolierten Virion erwiesen, und zwar bei Konzentration, die bis zu 100 nM hinunterreichen.
2.3 Hemmung der RT am isolierten Virion
Um zu bestätigen, dass die Hemmung der Infektiosität wirklich auf die Anti-Reverse-Transcriptase-Aktivität der Verbindung 7c zurückzuführen ist, haben wir die RT-Aktivität an einem Matrize-Primer Poly-rA/Oligo-dT gemessen, nachdem die isolierten Virionen 3 Stunden lang mit dieser Verbindung inkubiert worden waren.
Die Verbindung 7c scheint also in die Hülle und das Viruscapsid einzudringen, um sich an die RT zu heften und deren Aktivität zu blockieren.
Andererseits zeigen vorläufige Experimente zur Kinetik des Eindringens der Verbindung 7c an, dass Inkubationen von 45 Minuten ausreichen, um Hemmungen der Infektiosität von über 98% zu induzieren.
3. Schlussfolgerung
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die hauptsächlichen Inhibitoren, die in der Humanklinik verwendet werden, gegenüber dem isolierten Virion völlig inaktiv sind (AZT, d4T, 3TC, ddl, TIBO R82913, HEPT Nevirapin). Die Verbindung der Formel 7c hat sich als fähig erwiesen, nach Eindringen in das Viruspartikel die Reverse Transcriptase zu hemmen und die virale Infektiosität zu unterdrücken.
Diese Verbindung verhält sich also bezüglich ihrer Fähigkeit, in das isolierte Virion einzudringen, wie eine perfekt originale Verbindung.
Tabelle 1 Elementaranalysen der Verbindungen gemäß der Erfindung
Tabelle 1 (Fortsetzung) Elementaranalysen der Verbindungen gemäß der Erfindung
Tabelle 2 Anti-HIV-1-Aktivität der Verbindungen gemäß der Erfindung
Tabelle 3 Anti-HIV-1-Aktivität der Verbindungen gemäß der Erfindung gegenüber einem Nevapirin-resistenten Stamm
Tabelle 4 Anti-HIV-1- und Anti-HIV-2-Aktivität von Verbindung 7c
Tabelle 5 Hemmung der Reversen Transcriptase von HIV
Tabelle 6
Aktivität der isolierten Virionen nach Behandlung mit verschiedenen Inhibitoren
Die viralen Suspensionen werden mit 100 TCID50.B getestet. Die Ergebnisse sind auf einen viralen Überstand, der dieselben Behandlungen erfahren hat, bezogen und entsprechen dem Mittelwert von 1 bis 4 Experimenten.
Tabelle 7 Inhibition der endogenen RT durch die Verbindung 7c ex vivo

Claims

Verbindungen der Formel (3):
wobei: – R₁ und R₂ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine aliphatische Gruppe oder eine Alkyloxyalkylgruppe, in der die Alkylketten C₁- bis C₄-Gruppen sind, darstellen oder zusammen einen aromatischen Ring bilden; – R₃ NH₂, NHCOCH₃, NO₂ oder COOC₂H₅ darstellt; – R₄ eine Phenyl-, Pyrimidin-, Benzimidazol-, Benzoxazol-, Benzothiazol-, Thiazolin-, Imidazol- oder Pyridingruppe darstellt, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren aliphatischen Gruppen und/oder mit einer oder mehreren Nydroxygruppen substituiert ist; wobei die Verbindung ausgeschlossen ist, bei der R₁ ein Wasserstoffatom darstellt, R₂ CH₃ darstellt, R₃ CO₂C₂H₅ darstellt und R₄ eine Phenylgruppe darstellt.
Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ und R₂ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine C₁- bis C₄-Alkylgruppe oder eine Alkyloxymethylgruppe darstellen.
Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass R₄ eine Phenylgruppe ist, die mit zwei Methylgruppen substituiert ist.
Verbindungen gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich die zwei Methylgruppen in meta-Stellung der Phenylgruppe befinden.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um 5-Ethyl-6-methyl-3-carbethoxy-4-(3',5'-dimethylphenyl)-thiopyridin-2(1H)-on handelt.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um 5-Ethyl-6-methyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on handelt.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um 3-Amino-5-ethyl-6-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on handelt.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um 3-Amino-5-methyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on handelt.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um 3-Amino-5-ethyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on handelt.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um 3-Amino-5-ethoxymethyl-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Formel 8g) handelt.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um 5-Ethoxymethyl-3-nitro-4-(3',5'-dimethylphenyl)thiopyridin-2(1H)-on (Formel 7g) handelt.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei R₃ NO₂ darstellt, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Chlornitropyridon der folgenden Formel (6):
mit einem gegebenenfalls substituierten Thiophenol oder Mercaptoderivat eines Heterocyclus der Formel R₄SH umsetzt.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei R₃ NH₂ darstellt, dadurch gekennzeichnet, dass man ein gemäß Anspruch 12 erhaltenes Nitropyridinon in Gegenwart von Zinn(II)chlorid-Hydrat oder durch katalytische Hydrierung reduziert.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₃ NHCOCH₃ darstellt und R₄ eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe darstellt, dadurch gekennzeichnet, dass man eine gemäß Anspruch 13 erhaltene Verbindung in Gegenwart einer Verbindung der Formel (CH₃-CO)₂O oder CH₃COZ umsetzt, wobei Z ein Rest ist, der freigesetzt werden und die Bildung einer Amidbindung ermöglichen kann.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₃ eine COOC₂H₅-Gruppe darstellt und R₄ eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe darstellt, dadurch gekennzeichnet, dass man ein 4-Chlorpyridinon der folgenden Formel (14):
mit einem gegebenenfalls substituierten Thiophenol umsetzt.
Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das 4-Chlorpyridinon durch Reaktion von Hydroxypyridinon der folgenden Formel (13):
in Gegenwart von POCl₃ erhalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Chlornitropyridinon der Formel (6) durch Behandlung des entsprechenden Nitropyridinons mit POCl₃ erhalten wird.
Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgende Formel (6) darstellt, wobei R₁ und R₂ unabhängig voneinander Ethyl- oder Methylgruppen darstellen:
Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgende Formel (17) darstellt, wobei R₁ und R₂ unabhängig voneinander Ethyl- oder Methylgruppen darstellen:
Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine wirksame Menge einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder einer Verbindung, die durch ein Verfahren gemäß einem der An sprüche 12 bis 17 erhalten wurde, im Gemisch mit verträglichen Trägerstoffen enthält.
Medikament, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder eine Verbindung, die durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17 erhalten wurde, enthält.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder einer Verbindung, die durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17 erhalten wurde, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, die mit HIV verbunden sind.