JPH10504517A - 抗レトロウイルス剤および抗腫瘍剤として有用なアデノシンジホスホリボースポリメラーゼ結合性ニトロソ芳香族化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ウイルスを不活性化するための新規な化合物を提供する。これらの化合物は、６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン、３−ニトロソベンズアミド、５−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、２−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンを包含する。本発明はさらに、前記の１又は複数の化合物を含んで成る「組成物、並びに本発明の化合物及び組成物によりウイルス感染、癌、感染性ウイルス濃厚物を処理する方法」を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 抗レトロウイルス剤および抗腫瘍剤として有用なアデノシンジホスホリボースポ リメラーゼ結合性ニトロソ芳香族化合物 関係する出願に対する相互参照 本発明は、1991年10月22日提出の米国特許出願第07/780,809号の一部継続出願 でありそして発明の名称：抗腫瘍および抗レトロウイルス剤として有用なアデノ シンジホスホリボースポリメラーゼ結合性ニトロソ芳香族化合物を有する、1992 年６月４日提出の米国特許出願第07/893,429号の一部継続出願である、1992年11 月２日提出の米国特許出願第07/965,541号の一部継続出願である。 発明の分野 本発明は、一般に、レトロウイルスの治療剤および不活性化剤およびレトロウ イルスの感染および癌の処置におけるそれらの使用に関する。さらに詳しくは、 本発明は亜鉛フィンガーを脱安定化する治療用および不活性化性Ｃ−ニトロソ化 合物に関する。 発明の背景 酵素の ADP−リボーストランスフェラーゼ(ADPRT)（E.C.4.2.30）は、ほとん どの真核細胞の核の中に位置するクロマチン結合酵素である。この酵素は、ポリ (ADP−リボソーム)を形成するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD⁺)の ADP−リボース部分の重合を触媒する。このポリマーは、ポリメラーゼそれ自体 を包含する、種々の核タンパク質に共有結合する。 ADP−リボシル化が細胞の代謝において役割を果たす多数の変化 した役割は、ADPRT を新形成およびウイルスの感染を防除するために本質的に有 用な薬物のための標的としてした。多数の生理学的活性は、ADPRT のポリメラー ゼ活性を阻害する化合物について検出された。このような活性は次のものを包含 する：ヒト線維芽の発癌性物質誘発の悪性形質転換の細胞サイクル依存性防止(K un，E．Kirstein，E.，Milo，G．E．Kurian，P.およびKumari，H．L.（1983）Pr oc ．Natl．Acad．Sci．USA 80：7219-7223)、また、発癌性物質耐性を付与する (Milo，G．E.，Kurian，P.，Kirsten，E.およびKun，E.(1985)FEBS Lett.，179 ：332-336)、ハムスター胚およびマウスC3II 10T1/2細胞培養物における悪性形 質転換の阻害(Borek，C.，Morgan，W．F.，Ong，A．およびCleaver，J．E.（198 4）Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 81：243-247)、NIH 3T3 細胞からのトランス フェクションされた腫瘍遺伝子の欠失(Nakayashu，M.，Shima，H.，Aonuma，S. ，Nakagama，H.，Nagao，M．およびSugimara，T.（1988）Proc ．Natl．Acad．Sc i．USA 85：9066-9070)、腫瘍プロモーターの有糸分裂誘発性刺激の抑制(Roman o，F.，Menapace，L.およびArmato，V.（1983）Carcinogenesis ９：2147-2154 )、非正統的組換えDNA 組換えの阻害(Waldman，B．C.およびWaldman，A.(1990)N ucl ．Acids Res. 18：5981-5988)および組込み(Farzaneh，F.，Panayotou，G． N.，Bowler，L．D.，Hardas，B．D.，Broom，T.，Walther，C.およびShall，S． （1988）Nucl ．Acids Res. 16：11319-11326)、姉妹染色分体の交換の誘発(Iku shima，T.（1990）Chromosoma 99：360-364)およびある種の増幅された腫瘍遺 伝子の損失(Grosso，L．E．およびPitot，H．C.（1984）Biochem ．Biophys．Res ．Comm. 119 ：473-480 ；Shima，H.，Nakayasu，M.，Aonums，S.，Sugimura， T．およびNagao，M.(1989)Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86：7442-7445)。 ADPRT ポリメラーゼ活性を阻害することが知られている化合物は、次のものを 包含する：ベンズアミド(Kun，E.，Kirstein，E.，Milo，G．E．Kurian，P．お よびKumari，H．L.(1983)Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 80：7219-7223)、置換 ベンズアミド(Borek，C.，Morgan，W．F.，Ong，A．およびCleaver，J．E.（198 4）Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 81：243-247 ：Romano，F.，Menapace，L.お よびArmato，V.（1983）Carcinogenesis ９：2147-2154 ；Farzanoh，F.，Pana yotou，G．N.，Bowler，L．D.，Hardas，B．D.，Broom，T.，Walther，C.および Shall，S.(1988)Nucl ．Acids Res. 16：11319-11326 ；Grosso，L．E．およびP itot，H．C.（1984）Biochem ．Biophys．Res．Comm. 119 ：473-480 ；Shima， H.，Nakayasu，M.，Aonums，S.，Sugimura，T．およびNagao，M.(1989)Proc ．Na tl．Acad．Sci．USA 86：7442-7445)、３−アミノナフチルヒドラジド(Waldman ，B．C.およびWaldman，A.(1990)Nucl ．Acids Res. 18：5981-5988)、イソキノ リン、クエルセチン、およびクマリン（１，２−ベンゾピロン）（Milo，G．E. ，Kurian，P.，Kirsten，E.およびKun，E.(1985)FEBS Lett. 179 ： 332-336) 。１，２ベンゾピロンの抗形質転換および抗新形成作用は生体内および生体外で 証明された(Tsengら、(1987)Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 84：1107-1111)。 他の既知のADPRT ポリメラーゼ活性インヒビターは、米国特許出願第 600,593 号、1990年10月19日提出、発明の名称「新規な５−ヨード−６−アミノ−１，２ −ベンゾピロン類および細胞増殖抑制性および抗ウイルス剤として有用なそれら の代謝物質」に記載されているように抗腫瘍および抗ウイルス剤として使用する ための５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロンを包含する。引用した特 許は、抗腫瘍または抗ウイルス剤として５−ヨード−６−アミノ− １，２−ベンゾピロンを使用する可能性を論じている。 ６−ニトロソ−ベンゾピロン類は従来知られておらず、あるいは記載されてき ていない。文献の中に見出される唯一の遠く関係する化合物は６−ニトロソ−１ ，２−ベンゾピロンおよび６−アミノ−１，２−ベンゾピロン(6-ABP)であり(J ．Pharm．Soc．Jap. 498：615(1923))それらについて、わずかにまれな医学的 評価が報告されている。とくに、試験は鎮静および催眠作用(J ．Pharm．Soc.Jap . 73：351(1953)：前掲、74：271(1954))、微温作用(Yakugaku Zasshi 78：49 1(1958))、および解熱、催眠、降圧および抗アドレナリン作用(前掲、83：1124( 1963))について実施された。これらの化合物のいずれについての有意な応用も6- ABP を除外して記載されてきていない。 ２−ニトロソベンズアミド(Irne-Rasa，K．M.およびKoubek，E.（1963）J ．Or g．Chm. 28：3240-3241)、および４−ニトロソベンズアミド（Wubbels，G．G. ，Kalhorn，T．F.，Johnson，D．E.および Cmplell，D.（1982）J ．Org．Chm. 47：4664-4670 は化学文献の中に報告されたが、これらの異性体の商業的使用は 知られていない。これらの文献のいずれもニトロソベンズアミドをADPRT インヒ ビターとして使用することを示唆していない。 置換および非置換の６−アミノ−１，２−ベンゾピロンおよび５−ヨード−６ −アミノ−１，２−ベンゾピロンの抗レトロウイルスおよび抗腫瘍発生作用は、 同時継続米国出願第585,231号、1990年９月21日提出、発明の名称「ウイルス疾 患の処置に有用な６−アミノ−１，２−ベンゾピロン類」および同時継続米国出 願第 600,593号、1990年10月19日提出、発明の名称「細胞増殖抑制および抗ウイ ルス剤として有用な新規な５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン類お よびそれらの代謝物質」（これらをここに引用によっ て加える）の主題である。 前駆体分子、１，２−ベンゾピロン（クマリン）は、アデノシンジホスホリボ シルトランスフェラーゼ(ADPRT)の阻害リガンド、すべての哺乳動物細胞の中に 存在するDNA 結合性核タンパク質であることが示された(Tsengら、(1987)Proc ． Natl．Acad．Sci．USA ，84：1107-1111)。 Hakam ら、 FEBS Lett． 212；73（1987）は、６−アミノ−１，２−ベンゾピ ロン(6-ABP)が、また、DNA に結合する部位においてADRPT に特異的に結合する ことを示し、6-ABP およびDNA の両方がADPRT の同一部位について競争すること を示した。ADPRT の合成リガンドは、とくに腫瘍発生性細胞において、DNA の増 殖を阻害する(Kirstenら、（1991）Exp ．Cell．Res. 193 ：1-4)。引き続いて 、これらのリガンドはウイルスの複製を阻害することが発見され、そして同時継 続米国出願第 585,231号、1990年９月21日提出、発明の名称「ウイルス疾患の処 置に有用な６−アミノ−１，２−ベンゾピロン類」（これをここに引用によって 加える）の主題である。 既知のレトロウイルスのすべての株からのレトロウイルスのヌクレオカプシド （NC）タンパク質およびそれらのそれぞれのgag 前駆体は、型Cys-X₂-Cys-X₄-Hi s-X₄-Cys（CCHC）の亜鉛結合性ポリペプチド配列(Hendersonら、Biol ．Chem． 2 56：8400-8406)、すなわち、亜鉛フィンガードメインの少なくとも１つのコピー を含有する。このCCHC配列はレトロウイルスの感染性を維持するために必須であ り（Gorelickら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 85：8420-8424(1988)、Gorelic kら、J ．Virol．64：3207-3211(1990)）、したがって、それはレトロウイルスの 化学療法のための魅力的標的を表す。HIV-1 gag タンパク質はHIV-1 RNA に特異 的に結合し、発芽のための細胞膜またはウイルス粒子にそれを定着させることに よって機能 する(Mericら、J ．Virol．63：1558-1658(1989)、Gorelickら、Proc ．Natl．Aca d．Sci．USA 85：8420-8424(1988)、Aldvini ら、J ．Virol．64：1920-1926(19 90)、Lever ら、J ．Virol．63：4085-4087(1989))。部位特異的突然変異誘発の 研究は、Cys またはHis 残基の修飾が欠陥のあるRNA パッケージングを生じそし て非感染性ウイルス粒子が形成することを証明した（Aldoviniら、J ．Virol．64 ：1920-1926(1990)、Lever ら、J ．Virol．63：4085-4087(1989)）。真核生物の 高度に豊富な非ヒストンの核タンパク質、ポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼ（E .C.2.4.4.30）は、また、部位特異的突然変異誘発により分析して、基本的な末 端のポリペプチドドメインの中に位置する２つのCCHC型亜鉛フィンガーを含有す る（Gradwohlら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 87：2990-2992(1990)）。 発表された実験は、ポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼの芳香族Ｃ−ニトロソ リガンドが２つの亜鉛フィンガーの一方を脱安定化すると同時に酵素活性を損失 するが、酵素タンパク質のDNA 結合能力を損失しないことを示した（Bukiら、FE BS Lett. 290：181-185(1991)）。部位特異的突然変異誘発により得られた結果 に対する類似性（Gradwohlら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 87：2990-2992(19 90)）に基づいて、Ｃ−ニトロソリガンドの主要な攻撃は亜鉛フィンガーＦ１に おいて起こったように思われる（Bukiら、FEBS Lett. 290：181-185(1991)）。 Ｃ−ニトロソ基を含有するポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼのリガンドの癌細 胞への選択的細胞致死作用が引き続いて発見された（Riceら、Proc ．Natl．Acad ．Sci．USA 89：7703-7707。 レトロウイルスのNCタンパク質およびポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼの両 方におけるCCHC型亜鉛フィンガーの同時発生および癌 細胞へのＣ−ニトロソ含有リガンドの観察される化学治療作用に基づいて、Ｃ− ニトロソ化合物が、また、NCを含有するレトロウイルスに対して抗ウイルス作用 を有するどうかを試験するために、実験を開始した。ここに記載するように、HI V-1 NCタンパク質のＮ 末端のCCHC亜鉛フィンガーに相当するポリペプチド、Zn （HIV 1 F1）(Southら、Am ．Chem．Soc. 111：395-396(1989)、South ら、Bioch em ．Pharm ．40：329-340(1990))、無傷のHIV-1 ヴィリオンを使用してこの仮説 および培養におけるヒトリンパ球中のHIV-１の増殖について試験する実験を実施 した。 発明の要約 本発明は、新規な抗腫瘍化合物、抗レトロウイルス化合物およびレトロウイル ス不活性化化合物を提供する。これらの化合物は、６−ニトロソ−１，２−ベン ゾピロン、３−ニトロソベンズアミド、２−ニトロソベンズアミド、４−ニトロ ソベンズアミド、５−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、７−ニトロソ− １（２Ｈ）−イソキノリノン、８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンを包 含する。 本発明は、また、１種または２種以上の前記化合物を含有する組成物、および これらの化合物および組成物でレトロウイルスの感染および癌を処置する方法を 提供する。 また、２−ニトロソベンズアミド、３−ニトロソベンズアミドおよび４−ニト ロソベンズアミドで癌およびレトロウイルスの感染を処置する方法が提供される 。 １種または２種以上のこれらの化合物を含有する組成物が、また、提供される 。 本発明の他の面は、６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン、２− ニトロソベンズアミド、３−ニトロソベンズアミド、４−ニトロソベンズアミド 、５−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、７−ニトロソ−１（２Ｈ）−イ ソキノリノンおよび８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンを包含する種々 のニトロソ化合物を添加することによって、生物学的物質、例えば、血液中のウ イルス、ことにレトロウイルスを不活性化する方法を提供することである。 本発明の他の面は、６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン、２−ニトロソベン ズアミド、３−ニトロソベンズアミド、４−ニトロソベンズアミド、５−ニトロ ソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、７−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン および８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンを包含する種々のニトロソ化 合物を添加することによって、AZT 耐性ウイルス、とくにHIV およびSIV を不活 性化する方法を提供することである。 本発明の他の面は、６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン、２−ニトロソベン ズアミド、３−ニトロソベンズアミド、４−ニトロソベンズアミド、５−ニトロ ソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、７−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン および８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンを包含する種々のニトロソ化 合物を添加することによって、宿主のゲノムからの組込まれたウイルスDNA、と くに哺乳動物宿主におけるHIV DNA のレベルを減少する方法を提供することであ る。 本発明の追加の面は、生物学的物質および主題の方法において使用する化合物 を含んでなる生物学的物質の新規な組成物を提供することである。 図面の説明 第１図は、異なる濃度の６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン、 ３−ニトロソ−ベンズアミド、およびニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン(N OQ)（５および７ニトロソ異性体の混合物）により示されるADRPT ポリメラーゼ 活性(ADPRP)の不活性化の程度を比較するグラフである。 第２Ａ図〜第２Ｆ図は、(第２Ａ図)855-2細胞（ヒトＢ細胞系の急性リンパ芽 球性白血病の細胞系）、（第２Ｂ図）Ｈ９細胞（ヒトＴ細胞系の急性リンパ芽球 性白血病の細胞系）、（第２Ｃ図）HL-60 細胞（ヒト急性非リンパ芽球性白血病 の細胞系）および（第２Ｄ図）Ｋ562 細胞（ヒト慢性骨髄性白血病の細胞系）へ のADRPT リガンドの阻害作用を表示するグラフの複合である。これらの細胞を10 ％の胎児ウシ血清(FCS)中の成長因子の影響下に培養したが、（第２Ｅ図）およ び（第２Ｆ図）において、855−２細胞を、それぞれ、オートクリン成長因子活 性(AGF)または低分子量のＢ細胞成長因子（BCGF，Ｔ細胞誘導リンホカイン）の 存在下に培養した。 第３図は、６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン（NOBP）および３−ニトロソ ベンズアミド（NOBA）による 855-2細胞の白血病細胞の成長の増加するレベルの 阻害(FCSの増加する濃度に対して応答する)を示すグラフである。 第４図は、NOBPおよびNOBAが半固体の培地中の単細胞からのコロニーを形成す るヒト白血病細胞(855-2およびHL-60)の能力を阻害することを示すグラフである 。 第５Ａ図〜第５Ｂ図は、（第５Ａ図）正常アカゲザル骨髄幹細胞または（第５ Ｂ図）ヒト末梢血幹細胞が柔寒天中でコロニーを形成する能力へのADRPT リガン ドの抗白血病投与量の相対阻害作用のグラフを示す。NOBPおよびNOBAは正常細胞 に対して最小の作用を有したことに注意すべきである。 第６Ａ図〜第６Ｄ図６は、４つのヒト脳腫瘍細胞系へのNOBP，NO BAおよびNOQ の阻害作用を表示するグラフを示す。 第７図は、NOBPとビンクリスチンとの作用の比較のグラフである。 第８図は、ヒト乳腫瘍細胞系MDA 468 へのNOBP，NOBAおよびNOQ の作用を表示 するグラフである。 第９図は、ネズミ白血病細胞系Ｌ 1210 へのNOBP，NOBAおよびNOQ の作用を表 示するグラフである。 第10図は、Zn(HIV1-F1)（D₂O中溶液中の１mM，PH＝6.2, Ｔ＝30℃）（下部） についておよびNOBA(2mM)の添加のとき得られた¹H NMRスペクトルのダウンフィ ールド領域を示す。＊および＋の記号は、亜鉛配位および亜鉛不含のHis 9 残基 の芳香族のプロトンの信号を意味する。亜鉛の完全な注入により反映される（ｔ ＝90分）、反応が完結したとき、NOBAの50％は未反応のままであり、１：１の反 応の化学量論を示す。この出願のどこかで記載するNOBA（３−ニトロソベンズア ミド）は合成された。 第11図は、Zn(HIV１-F1)（下部）およびHIV-1 Psi−パッケージング信号の領 域に相当する配列をもつ合成オリゴヌクレオチド、d(ACGCC)（下部から２番目） について得られた¹H NMRスペクトルの選択した領域を示す。スペクトルのダウン フィールド領域は芳香族およびリボースのＨ１のプロトンの信号を示し、そして アップフィールド領域はメチル基のプロトンの信号を含有する。劇的なスペクト ルの変化はオリゴヌクレオチドをZn(HIV1-F1)に添加するときに起こり、Phe 2 およびIle 10の側鎖＝ｎ信号の大きいアップフィールドのシフトおよびグアノシ ン−Ｈプロトンの信号のダウンフィールドのシフトおよび広がり（上部から２番 目）を含む。２当量のNOBAとのインキュベーション後、スペクトルの特色は金属 不含ペプチドおよび解離した核酸（上部）の特徴を示し、NOBA誘発亜鉛の放出 が高い親和性の核酸結合機能の損失に導くことを示す。 第12図は、NOBA（３−ニトロソベンズアミド）によるZn(HIV1-F1)からのZn⁺² の放出についてのメカニズムを示す。 第13Ａ図は、NOBAおよびNOBP（６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン）を使用 するHIV-1 不活性化アッセイを示す。HIV-1 ストック(HIV-1 100,000 TCID₅₀を3 0分間 100μＭのNOBAまたは 100μＭのNOBPで22℃において処理し、この混合物 を系統的に10倍希釈しそしてPBL 培養物の中に接種した。９日後、培養の上澄み 液を収獲し、そして感染した培養物の頻度をイムノアッセイにより測定した。次 いで、培養物の陽性の百分率をウイルスのインプット力価の関数としてプロット した。50％の感染した培養物を発生させるために有効な感染性ウイルスの相対量 は、NOBAとともに４log 単位で減少した。NOBPは後述する方法により合成された 。 第13Ｂ図は、異なる温度におけるNOBAを使用するHIV-1 不活性化アッセイを示 す。このアッセイは第13Ａ図に記載するように実施したが、ただしNOBPとのウイ ルスの30分間の前インキュベーションを０，22または37℃において実施した。 第13Ｃ図は、PHA-PBL の生活能力へのNOBPの投与量−応答作用を示す。PHA-PB L（10⁶／ml）をMTT 基質の存在下に増加する投与量のNOBPで24時間処理し、そし て550nm における相対吸収は細胞の代謝活性を反映する。NOBPの不存在下の生産 物の形成のレベルは 100％であると考えられ、そしてすべての実験値はその対照 値に対して正規化した。 第14Ａ図〜第14Ｂ図。SIV_mac239 の複製（第14Ａ図）および CEM×174 細胞の 生活能力（第14Ｂ図）へのNOBAの作用。各バーは、±10％異ならない（示されて いない）３回の独立の試験の平均を表す。第14Ａ図において、縦座標＝第10日に 実施したｐ27抗原のアッ セイ(ELISA)；横座標＝NOBAまたはDMSOの濃度。第14Ｂ図において、細胞の生活 能力は第10日にテトラゾリウムアッセイにより決定した、第１線のバー＝NOBAの 存在下のウイルス感染細胞(SIV)；第２線のバー（対照）＝NOBAで処理した未感 染細胞。 第15Ａ図および第15Ｂ図。SIV 感染および未感染の培養物の細胞ゲノムのPCR による分析。第14Ａ図〜第14Ｂ図に記載する実験の６日の培養物からの CEM×17 4 細胞をDNA 抽出のために使用した。（６日の培養物を10日の培養物の代わりに 使用して十分な抽出可能なDNA の存在を確実にした）。第15Ａ図は、gag 選択プ ライマーをもつSIV p27 コア抗原タンパク質の増幅を示す。第15Ｂ図は、偏在す るＢ−アクチン遺伝子の増幅を示す。 第16Ａ図〜第16Ｂ図。SIV のAZT 耐性株へのNOBAの作用。SIV_mac239 感染アカ ゲザルのマカク(MMU 23740)からの末梢血単核細胞(1.2×10⁶)を、24ウェルの組 織培養プレート中で３×10⁵の CEM×174 細胞／mlとともに６日間同時培養した 。同時培養の上澄み液のアリコート(500μｌ)を３×10⁵の新鮮な CEM×174 細胞 ／mlに添加した。NOBAまたはAZT の添加前に、細胞を37℃においてさらに２日間 インキュベーションした（シンシチウムが出現するまで）。第９日に薬物を含有 する新しい培地を培養物に補充した。新鮮な CEM×174 細胞（1.75×10⁵／ウェ ル）および薬物を第13日に添加した。（第16Ａ図）SIV p27 コア抗原の捕捉ELIS A により決定した、最初の同時培養から16日の培養物の上澄み液中のウイルスの 力価。（第16BB図）MTT アッセイにより決定した、最初の同時培養から16日の細 胞培養物の生活能力。表されるデータは二重反復実験のウェルの平均である。 第17図。ヒトリンパ球中でアッセイしたSIV へのNOBAの作用。SIV_sum（TCID₅₀ ＝3300）の濃ストックを50μＭのNOBAと37℃におい て30分間インキュベーションした。次いで、この混合物を系統的に10倍に希釈し て、10^-1，10^-2，10^-3，10^-4および10^-5の希釈物を生成した。各希釈物を使用し て10⁶PHA-PBL を37℃において18時間感染し、次いで遊離のウイルスおよび薬物 を除去した。次いで細胞のアリコートを96ウェルのプレートに入れた（10⁵細胞 ／ウェル、10の複製／希釈）。抗原捕捉ELISA において培養物の 490nmにおける 吸収が10の未感染の培養物の平均吸収を超えて＞３S．D．である場合、培養物を 感染について陽性と記録した。未処理ウイルス（□）は10⁴程度に低い希釈で陽 性の培養物と記録されたが、NOBA処理したウイルス（■）はいずれの培養物でも 陽性と記録されなかった。 第18図。NOBAによる HIV-1_wejoの複製の阻害。ヒトPBMCのアリコートを96ウェ ルのプレート（10⁵／ウェル）の中に入れ、そして種々の量のNOBPを添加し、そ して直ちに HIV-1_wejoの 250TCID₅₀を添加し、次いで７日間培養した。ウイルス の生産をｐ24抗原の捕捉（−▲−）により測定し、そして薬物の不存在下に感染 した細胞中の抗原の百分率として表す（10複製／点）。細胞の生活能力（−■− ）をBCECF アッセイにより決定し、そして活性を薬物不含およびウイルス不含の 対照における信号の百分率として表す（10複製／点）。 第19図。大腸菌(E．coli)発現ベクターを介して生産されたHIV-1 インテルグ ラーゼ（intergrase）タンパク質（２pmol／反応）を−70℃において１ＭのNaCl ，20mMのHEPES(pH7.6)，1mMのEDTA，１mMのジチオスレイトール、および20％の グリセロール（Ｗ／Ｖ）の中に貯蔵した。−◇−NOBA、前インキュベーション、 DNA 切断アッセイ；−▲−NOBA、前インキュベーション、組込みアッセイ；−◇ −NOBA、前インキュベーションなし、組込みアッセイ；− −カフェイン酸（フ ェネチルエステル）、前インキュベーションなし、切 断アッセイ；−■−カフェイン酸（フェネチルエステル）、前インキュベーショ ンなし、組込みアッセイ。 第20図。PBMC中のHIV-1 プロウイルスDNA 形成へのNOBAの作用のPCR 分析。種 々の濃度のNOBAをHIV-1 の濃ストックに添加し（37℃において30分）、次いでこ れを３×10⁶PBMC のペレットと混合し、そして24時間インキュベーションした。 最終混合物中の薬物の濃度を示す。インキュベーション後、試料を材料および方 法に記載されているようにPCR により分析した。対照として、細胞を抗T4モノク ローナル抗体(T4A)の存在下にウイルスに対して暴露して感染をブロックした。 陰性の対照はプライマーの不存在下に実施したPCR 反応を表す。陽性の対照はHI V-1_LAVで感染した患者からの 8E5骨髄単離物である。 第21図。HIV-1 ヴィリオン中の内因性逆転写のNOBAによる阻害。透過性とした HIV-1 ヴィリオンが、種々の濃度のNOBAの不存在または存在下に、それらの天然 RNA をウイルスDNA に逆転写するようにさせた。対照はウイルス単独（Ｃ）また は１％DMSOの存在下のウイルス（０薬物）であった。〔³²Ｐ〕-dCTP 標識化転写 体は１％ゲル上のオートラジオグラフィーにより見えた。特定の実施態様の記述 定義 本書中で使用する「生物学的物質」という語は、血漿、脳脊髄液、器官などを 含む生体から抽出したあらゆる生物学的物質ならびに生体から抽出された生物学 的物質の加工生成物のことを意味する。 本書中で使用する「生物学的組成物」という語は、問題の生物学的物質及び化 合物を含む組成物のことを意味する。 本書中で使用する「ガン」という語は、増殖又は位置づけについての正常な制 御シグナルに従がわない細胞から成る腫瘍のことを言 う。 本書で使用する「レトロウイルス」という語は、感染性RNA 鎖をDNA 補体へと 転写するために酵素逆トランスクリプターゼを利用するRNA ウイルスのことをい う。 「ジンクフィンガー」（zincfinger）という語は、亜鉛原子を結合することの できるタンパク質の構造的ドメインのことを指す。ジンクフィンガータンパク質 ドメインの性質については、例えばKlug及びRhodes著「生化学の傾向」12：464- 469(1987)といった文献の中で充分に記述されている。 発明 本発明は、ADPRT ポリメラーゼ活性阻害物質である複数のニトロソ化合物を提 供する。これらの化合物は、抗腫瘍及び抗ウイルス化合物として使用される。 化合物（Ｉ）は次のような構造式をもつ： なお式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅及びＲ₆は、水素及びニトロソから成るグ ループの中から選択され、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅及びＲ₆のうちの１つのみが ニトロソ基である。 化合物Ｉの好ましい一実施態様においては、Ｒ₄はニトロソ基すなわち分子６ −ニトロソ−１，２−ベンゾピロンである。 化合物IIは次のような構造式を有する： なお式中、Ｒ₁，Ｒ₂及びＲ₃は、水素及びニトロソから成るグループの中から 選択され、Ｒ₁，Ｒ₂及びＲ₃のうちのわずか１つのみがニトロソ基である。 化合物IIIは、以下のような構造式をもつ： なお式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄及びＲ₅は、水素及びニトロソから成るグルー プの中から選択され、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄及びＲ₅のうちわずか１つのみがニト ロソ基である。 化合物IIIの好ましい実施態様においては、Ｒ₂又はＲ₄のいずれかがニトロソ 基すなわちそれぞれ７−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン及び５−ニトロ ソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンである。 ５−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンについての開示されている合成は 、２つの密に関係する構造的異性体つまり７−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノ リノン及び８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンを産生することができる 。５−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンの生物学的活性を試験する実験に は多大な量の ８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン又は７−ニトロソ−１（２Ｈ）−イ ソキノリノンが含まれていた可能性があるものの、３つの異性体は全てその密な 構造的類似性に基づき類似の抗腫瘍及び抗ウイルス活性を有すると考えられてい る。これらの仮説は、薄層クロマトグラフィ又は類似の方法により異性体を分離 し、分離された化合物の抗腫瘍及び抗ウイルス活性を比較することによって、適 切にテストすることができる。 ６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン、３−ニトロソ−ベンズアミド、５−ニ トロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、７−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリ ノン及び８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンの合成の詳細について、以 下の実施例の項で記す。 一般に、本発明の対象となっているニトロソ化合物は、酢酸エチル、ハロカー ボン溶剤又は相対的に濃縮されたジメチルホルムアミド内溶液の中の３−クロロ ペルオキシ安息香酸（又はその他のペルオキシ酸）での酸化による本発明の化合 物へと対応するアミノ化合物を酸化させることによって、合成することができる 。 ３−ニトロソベンズアミドの合成の詳細については、以下の実施例の項で記述 する。その他の前駆物質アミノ化合物の合成については、化学文献に記述されて いる。これらの化合物のいくつかは市販されている。本発明のニトロソ化合物へ の酸化のためのいくつかの前駆物質アミノ化合物は、次のようなものである：３ −アミノ−１，２−ベンゾピロン（Spectrum Chemical Mfg．Corp．Gardena，CA 90248）；４−アミノ−１，２−ベンゾピロン（Aldrich，Rare Chemical Catal og）：５−アミノ−１，２−ベンゾピロン(５−ニトロ−１，２−ベンゾピロン の還元による、Chem ．Abst．57，16536d(1962))；７−アミノ−１，２−ベンゾ ピロン(Gottlieb et al.，J ．Chem．Soc．Perkin．Trans．II 435(1979)；８− アミノ−１， ２−ベンゾピロン(８−アミノ−１，２−ベンゾピロンの還元による、Abdel-Meg id， et al.，Egypt J．Chem．20 : 453-462(1977))及び対応する４−ニトロ類 似体の還元による４−アミノ−１（２Ｈ）−イソキノリノン（Horning et al., （1971）Can ．J．Chem．49 : 2785-2796） 化合物（Ｉ）〜（III）に加えて、本発明では、類似の制ガン及び／又は抗ウ イルス活性をもつ構造的に関係するさまざまな化合物が考慮されている。これら の構造的に関係する化合物は、ADPRT ポリメラーゼ活性に対するそのきわめて効 力の高い阻害効果に基づいて適当にスクリーニングすることができる。有利な構 造的に関係する化合物としては、付加的なニトロソ基及び小さな、例えばＣ₁− Ｃ₃のアルキル基により置換された誘導体がある。同様に有利なのは、３，４− ジヒドロ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、ニコチンアミド、フタルヒドラジド、 及び１，３−ベンゾキサジン−２，４−ジオンといったさまざまなニトロソ置換 された構造的に関係する複素環である。 本発明の化合物のもう１つの面は、それらが細胞膜に容易に浸透すること、そ してタンパク質及び核酸に対する非特異的結合が比較的欠如していることに表わ れている。 実際には、本発明のADPRT ポリメラーゼ阻害物質すなわち化合物（Ｉ）〜（II I）及びその薬学的に受容可能なあらゆる塩は、単独で又は互いに組合わせた形 で、又、哺乳動物宿主の体内での新生物成長又はウイルス複製を阻害するか又は ガン成長又はウイルス感染の発達を妨げるために充分かつ効果的な量及び薬学的 形態で、投与することのできるものである。 本書に記述されている活性化合物及び塩の投与は、治療用作用物質のための受 容されている投与様式のいずれによっても行なうこと ができる。これらの方法には、経口、非経口、経皮、皮下又は局所投与様式とい った全身的又は局所的投与が含まれる。これらの薬剤の好ましい投与方法は静脈 内投与である。ただし患者が局所的な腫瘍又は病巣を有する場合には局所的投与 が適切でありうる。その他の場合においては、その他の非経口形態さらには経口 形態で組成物を投与することが必要となる可能性もある。 意図される様式に応じて、組成物は、例えば好ましくは単位用量の注射可能薬 物、錠剤、座薬、丸薬、時間放出カプセル、粉末、液体、懸濁液などのような固 体、半固体又は液体用量形態をしていると考えられる。組成物は、化合物（Ｉ） 〜（III）のうちの少なくとも１つ又はその薬学的に受容可能な塩を有効量含ん でおり、それに加えて、薬学分野で慣習的であるような、従来のあらゆる薬学的 賦形剤及びその他の医薬用薬剤又は作用物質、担体、アジュバント、希釈剤など を含んでいることも考えられる。 固体組成物については、化合物（Ｉ）〜（III）に加えて、例えば薬学等級の マンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン ナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムな どの賦形剤を用いることができる。本発明の化合物は同様に、担体として例えば プロピレングリコール、ポリアルキレングリコールを用いて座薬としても処方す ることができる。 液体特に注射可能な組成物は、例えば水、食塩水、デキストロース水溶液、グ リセロール、エタノール、DMSOなどの薬学的溶液中に活性化合物（Ｉ）〜（III ）の少なくとも１つを溶解、分散などさせて、かくして注射可能な溶液又は懸濁 液を形成することにより、調製することができる。 望まれる場合には、投与されるべき薬学組成物は又、湿潤剤又は 乳化剤、pH緩衝剤及びその他の物質、例えば酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエ タノールアミンなどの非毒性補助物質も少量含んでいてよい。 望まれる場合には、投与すべき薬学組成物には、コレステロール、コレステロ ールの脂肪酸エステル又は不飽和脂肪酸の中から選ばれた化合物、リン脂質、負 に帯電したリン脂質を含むリポソーム製剤が含まれていてよい。化合物Ｉ，II又 はIIIは、本書に参考として内含されている1993年２月19日に提出された「リポ ソーム製剤及びその作製及び使用方法」という題の米国特許出願明細書第08／02 0035号に従って、リポソーム製剤のリポソーム２層構造体の中に被包又は分割さ せることができる。 皮下、筋内又は静脈内注射剤及び注入剤のためには、一般に非経口で注射可能 な投与が用いられる。注射可能剤は、注射に先立って液体中に溶解させるのに適 した液体溶液又は懸濁液又は固体形態で調製できる。 非経口投与のためのさらに最近考案されたアプローチでは、本書に参考として 内含されている米国特許第 3710795号に従って一定の用量レベルが確実に維持さ れるようにする緩効系又は持続放出系の植込みが利用される。 上述の薬学組成物のいずれも0.01〜99％、好ましくは１〜70％の有効成分を含 むことができる。 かかる用量形態を調製する実際の方法は既知のものであるか、或いは又当業者 にとって明白なものであり、「レミントンの薬学」、Mack Publishing Company ，Easton，Pennsylvania、第17版、1985年、の中で詳述されている。投与すべき 組成物又は製剤は、いかなる場合であれ、治療上有効な量が患者に送り出される ようにするような活性化合物量を含んでいる。治療上有効な量というのは、治療 を受けている患者の既存の症状の進行を妨げるか又はこの症候を軽減するのに有 効な量のことを意味している。 投与される活性化合物の量は当然、治療を受けている患者、この患者の体重、 病気の重症度、投与の要領及び処方する医師の判断によって左右される。しかし ながら、有効用量は、１回の治療サイクルで１〜２日だけ与えられるものとして 、１〜12mg／kg／日好ましくは１〜５mg／kg／日の範囲内にありうる。一般に、 薬剤用量決定の上限は、その考えられる毒性と均衡されたその効能である。 本発明は、ウイルスを不活性化させることにより感染性レトロウイルス特に生 物学的物質中のレトロウイルス（レトロウイルス HIV-1を含む）の力価を減少さ せる方法を提供する。ウイルスは問題の化合物とウイルスの間の接触によって不 活性化させることができる。「減少する」という語には、問題の感染性ウイルス 全てを完全に除去することならびに伝染性ウイルスの力価を低減することが含ま れる。感染の可能性を減少させるべく生体内に導入される生物学的物質の中の感 染性ウイルスの数を減少させることが特に有利である。同様に、生体と接触する ことになる非生物学的物質の中又は上に存在する可能性のある感染性ウイルスの 力価を減少させることも有利であり、かかる非生物学的物質としては、外科器具 、歯科器具、皮下注射針、公衆衛生設備などが含まれる。 本発明の好ましい一実施態様は、血中の感染性ウイルス濃度の減少である。 本発明のもう１つの好ましい実施態様は、AZT 耐性ウイルス及びレトロウイル スの不活性である。 本発明のさらにもう１つの態様は、宿主のゲノムからの組込まれたレトロウイ ルスDNA の除去である。 本発明の方法において用いられるウイルス不活性化化合物の有効 量は問題の生物学的又はその他の特定の物質及び化合物の性質に従って変動する ものの、３−ニトロソベンズアミドの好ましい濃度は、約15ミクロモルである。 問題のウイルスを含む組成物のウイルス力価に対する化合物の濃度範囲の効果を テストすることによって、有効量を容易に決定することができる。 生物学的物質内の感染性ウイルス濃度を減少させる当該方法は、化合物Ｉ，II 又はIII又はそれらの組合せを有効量付加する段階を利用することによってウイ ルスを不活性化する。これらのニトロソ化合物はZn⁺²フィンガーを不安定にする ことすなわちウイルス特にレトロウイルスのヌクレオカプシドタンパク質のZn⁺² を駆出することができる。ウイルスを不活性化する上で使用するための化合物Ｉ ，II及びIIIの好ましい実施態様は、６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン、３ −ニトロソベンズアミド、５−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリン、７−ニト ロソ−１（２Ｈ）−イソキノリン、８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリン及 び３−ニトロソベンズアミドである。３′−ニトロソベンズアミドの使用が特に 好まれる。 本発明のもう１つの態様は、ニトロソ化合物Ｉ，II及びIII又はそれらの組合 せを有効量含む生物学的物質から成る新規の組成物を提供することにある。当該 組成物中で使用するための化合物Ｉ，II及びIIIの好ましい実施態様は、６−ニ トロソ−１，２−ベンゾピロン、３−ニトロソベンズアミド、５−ニトロソ−１ （２Ｈ）−イソキノリン、７−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリン、８−ニト ロソ−１（２Ｈ）−イソキノリン、２−ニトロソベンズアミド、４−ニトロソベ ンズアミド及び３−ニトロソベンズアミドである。３−ニトロソベンズアミドの 使用が特に好まれる。当該生物学的組成物はウイルス濃度が低減されている可能 性があり、従って、匹敵する生物学的物質よりも低い感染危険性で投与可能であ る。 本発明は同様に、ウイルス力価に対するZn⁺²フィンガー不安定化つまりZn⁺²駆 出用化合物の効果をテストすることによりウイルス、特定のレトロウイルスを不 活性化することのできる化合物の検出方法をも提供する。ウイルス力価は、問題 のウイルスの力価を測定するのに適した周知の方法により測定できる。ジンクフ ィンガードメインからのZn⁺²の駆出は、なかでも、本書に記述されておりしかも Buki，et.al.，FEBS Lett.，290 : 181-185(1991)内に記述されている通りNMR 及び／又は⁶⁵Zn⁺²により測定できる。 以上で本発明について記述してきたが、制限的な意味のない例示として本発明 を説明するべく以下の実施例を提供する。 実施例 Ｉ−６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロンの合成及び特徴づけ ６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロンの調製のための方法の一例が以下のとお り提供される： 22℃の水中（40ml）の６−アミノ−１，２−ベンゾピロン塩酸塩の撹拌溶液（ 4.00ｇ，20mmol）に対して、水中タングステン酸ナトリウム溶液（5.93ｇ，20mm ol）とそれに続いて30％の過酸化水素水溶液（５ml）を加え、1.5時間撹拌し続 けた。100ml体積の酢酸エチル２体積を用いて緑色混合物から酸化生成物を抽出 し、組合わせ抽出物を 0.1NaHCl(50ml)で洗浄し、次に水(100ml)で洗浄した。回 転式蒸発により酢酸エチルを除去し、残留物を温かいエタノール(250ml)から再 度結晶化させた。 反応生成物の分析 再結晶段階から得られた緑色結晶（1.48ｇ，42％収量）は、単量体アリルニト ロソ化合物の特徴である 750nmでの吸光を示した。質量スペクトル：ｍ／ｚ（相 対強度）：175(Ｍ⁺,100)，161(16.88) ，145(33.77)，133(10.38)，117(56.09)，89(79.71)，63（57.13）。Ｍ⁺ピーク についての高解像度データ：C₉H₅NO₃についての計算値：175.0268；実際値：175 .0271（偏差−1.1ppm）。TMS からの¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δ(ppm)：Ｈ−３に より分割された２重線(6.572及び6.604)Ｈ−４；Ｈ−７により分割された２重線 (7.472及び7.501)Ｈ−８；Ｈ−８により分割されＨ−５により細かく分割された ２重線の２重線(7.860／7.866 及び 7.889／7.798)Ｈ−７；Ｈ−４により分割さ れた２重線(7.910及び7.942)Ｈ−３；Ｈ−７により細かく分割された２重線(8.3 08及び8.315)。エタノール中のUV/VISスペクトル、最大λ（ε）：750nm(46)，3 16nm(8.96×10³)，274nm(2.24×10⁴)。融点：化合物は 160℃以上で重合し、黒 くなって 325〜340 ℃の範囲内で溶融する。 このニトロソ化合物は同様に、酢酸エチル又はハロカーボン溶剤中で３−クロ ロペルオキシ安息香酸と（遊離塩基としての）６−アミノ−１，２−ベンゾピロ ンを反応させることによっても調製することができる。 II ３−ニトロソベンズアミドの合成 大気温の酢酸エチル（50ml）中の３−アミノベンズアミドの撹拌溶液(0.476ｇ ，3.50mmol)に対して、1.208ｇの３−クロロペルオキシ安息香酸(商業等級、50 〜60％の純度、Aldrich)を付加し、その時点で溶液は緑色に変わった。10分後に 、0.14Ｍの重炭酸ナトリウム水溶液（58ml）を用いて混合物を抽出し連続３回に わたり40ml分量の水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次に回転蒸発によ り20mLまで体積を縮減させ、冷凍装置（−20℃）の中に入れ、その時点で生成物 を72時間明黄色の固体としてゆっくりと析出させた(0.180ｇ，34％収量)。 それぞれ２−アミノベンズアミド及び４−アミノベンズアミドを 酸化させることによって、同様に、２−ニトロソベンズアミド及び４−ニトロソ ベンズアミド異性体も調製することができる。 反応生成物の分析 融点：物質は 135℃以上で薄黒くなり、柔かくなって見かけ上 150〜160 ℃の 範囲内で重合し、240〜250 ℃で溶融する（分解を伴う）。溶解状態で化合物は 緑青色をしている。質量スペクトル：ｍ／ｚ（相対的強度）：150(Ｍ⁺,100)，13 6(10.9)，120(77.2)，103(31.6)，92(46.5)，85(22.8)，71(33.3)。Ｍ⁺ピークに ついての高解像度データ：C₇H₆N₂O₂についての計算値：150.042928；実際値：15 0.042900（偏差＝0.2ppm）。NMR スペクトル：TMS からの¹H-NMR（DMSO-d₆，300 MHz）δ（ppm）：広い１重線(7.737)Ｎ−Ｈ；Ｈ−４及びＨ−６により分割され たｔ(7.824，7.850，7.875)Ｈ−５；Ｈ−５により分割されたｄ(8.059及び8.086 )Ｈ−６；Ｈ−５により分割されたｄ(8.357及び8.383)；ｓ(8.472)Ｈ２。7.737 における一重線は１プロトンに対応する；この化合物中スペクトル上等価でない 第２のＮ−Ｈプロトンには、Ｈ−４の２重線が重ね合わされている。この２重線 は２つのプロトンへと統合し、DMSO溶液に対するD₂O の付加により解像できる。 無水エタノール中のUV-VIS吸収スペクトル、λmax(ε)： 750nm(37.6)，304nm(5 .35×10³)及び 218nm(1.50×10⁴)。750nmにおける最大吸収が、単量体アリルニ トロソ化合物の特徴である。 もう１つの実施態様においては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド(DMF)溶剤（2 5ml）中に３−アミノベンズアミド(5.0ｇ)を溶解することにより、３ニトロソベ ンズアミドが合成され、その後氷浴中で深冷される。３−クロロペルオキシ安息 香酸(2.1等量)は同様に、攪拌器及び温度計そして必要とあらば氷浴を備えた 25 0ml入りフラスコ中のDMF 溶剤の中で溶解される。この溶液を０〜５℃まで深 冷させ、氷浴を除去し、これに対して撹拌しながら深冷済み３−アミノベンズア ミド溶液を全て一度に付加する。混合物は直ちに透明褐色になるが、0.5分以内 に深緑色に変わり、1.0分以内に温度は70℃まで上昇し、その時点で反応フラス コに氷浴を再度適用しそこで温度は下降し始め、これを25℃まで下降するままに しておき、合計５分間撹拌を続ける。幾分かの沈降が起こり（３，３′−アゾキ シベンズアミド副生成物）、その後混合物を10分間５℃まで深冷させる。アゾキ シ沈殿物を除去するべく、深冷混合物をろ過し（吸引）、緑色ろ液を、深冷され （５〜10℃）撹拌された水性0.40Ｍ Na₂CO₃（200ml）の中に注ぎ込み、結果とし て明緑色懸濁液を得、懸濁液を５〜10℃でさらに10分間撹拌して最大の生成物沈 降を確保する。この懸濁液のpHが約 8.5でありこのため、ナトリウム塩として水 溶液中に３−クロロ安息香酸が確実に保持されるようになっているという点に留 意されたい。次に沈殿物を吸引漏斗上に収集し、脱イオン水(100ml)で洗浄する 。残留３，３′−アゾキシベンズアミド副生成物不純物を含む3-NOBA（大部分、 黄褐色の２量体として）であるこの物質を次に、湿っているうちに適切なフラス コに移し、これに対し50％の酢酸水溶液(200ml)を加える。混合物を65〜70℃ま で暖めて可溶性単量体3-NOBA（緑色）内に２量体を溶解させ、65℃で５分間撹拌 する。アゾキシ不純物（黄色）は可溶性が低く、溶解しない状態にとどまる。暖 かい混合物をろ過（重力）して透明な緑色ろ液を得、これを冷却する。次にこれ を深冷し、一晩冷蔵庫の冷凍室（−20℃）に入れて3-NOBAが明黄褐色の固体２量 体として再度析出するようにする。翌日、固体生成物を吸引フィルター上で収集 し、新鮮な溶剤で洗い、次に生成物ケークを数時間緩やかな加熱下で真空乾燥さ せる。標準的には、微量のアゾキシ不純物を含む2.24ｇの乾燥3-NOBAが得られる 。50％の酢酸水溶液(120ml)中で再び溶 解させ冷凍装置内で一晩再度析出させることにより、生成物を再結晶化させる。 収集、洗浄及び真空乾燥の後、重量は2.08ｇである（全体収量37％）。TLC は、 この物質がアゾキシ不純物を微量含む3-NOBAであることを示している。 III．ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン（５−ニトロソ及び７−ニトロ ソ−異性体の混合物）の合成 イソキノリン化合物のための一般的方法(C.G．LeFevre及びR.J．W．LeFevre，J ．Chem．Soc ．1470(1935))を用いて、１（２Ｈ）−イソキノリン（イソカーボ スチリル）(Aldrich)を硝化した。硝化生成物（Ｙ．カワゾエ及びＹ．ヨシオカ によりChem．Pharm．Bull．（東京）16：715-720(1968)で指定されている通りの ５−ニトロ及び７−ニトロ異性体の混合物、ただしこれらの異性体のうち１つは ８−ニトロ異性体であってよい）を、次に、メタノール水溶液中の水素化ホウ素 （KBH₄）及び炭素上パラジウム触媒の組合せを用いて、対応するアミノ−１（２ Ｈ）−イソキノリノンへと還元した。30℃の酢酸エチル(175mL)中の結果として 得られたアミノ−１（２Ｈ）−イソキノリノン（遊離塩基として）(0.560ｇ，3. 50mmol)に対し、1.208ｇの３−クロロペルオキシ安息香酸(Aldrich)を付加した 。混合物は濁った状態になり、20分後これをろ過し、0.14Ｍの重炭酸ナトリウム （58mL）で抽出し、２分量の50mL水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶 液の体積を回転式蒸発により50mLまで縮減させ、次に冷凍装置（−20℃）内に入 れ、この時点でオレンジ色の固体生成物を析出させた(0.102ｇ)。 反応生成物の分析 融点：物質は 175℃以上で薄黒くなり、195℃を超えると柔軟になり、黒くな って見かけ上重合し、最終的に 310〜335 ℃の範囲内で溶融する。NMR 分析：TM S からの¹H-NMR(DMSO−d₆／D₂O，300MH ₂ )δ(ppm)：ｍ(6.723，6.741，6.752)：ｍ（7.511，7.518，7.533，7.539，7.54 7，7.559，7.577，7.585）；ｍ(7.663，7.674，7.686，7.698，7.707)；ｄ（7.8 18，7.846）。D₂O が無い場合、化合物は同様に11.90ppmで広い１重線を示す。 異性体成分を薄層クロマトグラフィ（シリカゲルプレート、酢酸エチル溶剤）に より分析的に解像し、２つの帯Rf0.82及びRf0.72を得た。Rf0.82についての質量 スペクトル：ｍ／ｚ（相対的強度）：174(Ｍ⁺,100)，160(26.8)，144(93.0)，11 7(90.8)，97(21.9)，89(96.1)，71(24.1)。Ｍ⁺ピークについての高解像度データ ：C₉H₆N₂O₂についての計算値：174.042928；実際値：174.043200（偏差＝−0.3p pm）。Rf0.72を有する成分については、C₉H₆H₂O₂についてのＭ⁺計算値：174.042 928；実際値：174.043200（偏差＝−1.6ppm）。これらのデータは、化合物がモ ノニトロソ異性体であることを確認している。 IV．ADPRT 不活性化 本発明に基づく化合物は、アデノシンジホスホリボシル・トランスフェラーゼ (ADPRT)のポリメラーゼ活性を不活性化するその能力についてテストされた。検 定は、仔牛胸腺ADPRT を用いてBuki and Kun，Biochem ．27：5990-5995(1988) の方法に従って行なわれた。表Ｉに示されているような検定結果は、ニトロソ前 駆物質（６−アミノ−１，２−ベンゾピロン）及びより効力の高い５−ヨード− 誘導体（表Ｉ、それぞれ化合物１及び２）のADPRT に対するＩ₅₀（酵素活性を50 ％阻害する化合物の濃度）値を提供している。ニトロソ化合物（表Ｉ中３，４， ５）は全て（後の順で示す通り）抗腫瘍及び抗HIV 分子として非常に活性であり 、30分程の短時間細胞を露出しただけでも有効である。これらの研究において５ −Ｉ−６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン（化合物６）は、比較的弱いADRPT 阻害物質であることが示され（ヨード置換誘導体がNO基を求電子体 として不活性化すると考えられている）ており、その生物学的作用は６−NO．− １，２−ベンゾピロンのものより10分の１弱い。これらの理由から、本発明の組 成物は、透過性の低い分子であることがわかった５−Ｉ−６−ニトロソ−１，２ −ベンゾピロンよりも優れていると考えられている。 検定条件：ADPRT，0.4μｇ； coDNA，４μｇ；阻害物質は、50μｌの50mMトリ ス-HCl，50mM KCl，５mM ２−メルカプトエタノール、0.5mM EDTA，0.1mM NAD （〔32−Ｐ〕−標識付けされたもの）、pH7.5 の中で 0.8〜600 μＭの間で希釈 される。重合は４分間25℃。 図１は、複数の濃度でのニトロソ化合物阻害物質を用いた２時間のインキュベ ーションの後観察されたADPRT ポリメラーゼ活性の不活性化％を示す。 ⁶⁵Zn⁺²とADPRT 結合Zn⁺²の間の均衡化が関与する付加的な実験によると、ニト ロソ化合物のADPRT 阻害活性が、Zn⁺²の駆出を通してタンパク質を不安定化する ことによって作用すると思われるという ことが示唆されている（Buki K.G.，Bauer P.T.，Mendeleyev，F.；Hakam，H及 びKun E.（1991）FEBS Lett. 290 : 181-185）。ADPRT 阻害物質についての上述 の作用メカニズムは推論的なものであり、請求されている主題に対するいかなる 制限も構成するものではない。 Ｖ．ニトロソベンゾピロン、ニトロソベンズアミド及びニトロソ−イソキノリ ノンの生物学的抗癌活性 種々のヒト白血病細胞株を漸増濃度の６−アミノ−１，２−ベンゾピロン(ABP )、５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン（IABP）、６−ニトロ−１ ，２−ベンゾピロン（NO₂BP）、６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン（NOBP） 、３−ニトロソベンズアミド（NOBA）又は５（７）−ニトロソ−１（２Ｈ）−イ ソキノリノン(NOQ)（５−ニトロソ及び７−ニトロソ異性体の混合物）に曝露し 、〔³Ｈ〕チミジン取込みレベルを細胞増殖の測定値として確定する実験を実施 した。図２に示すように、試験した各細胞株(855-2細胞、図２Ａ；Ｈ９細胞、図 ２Ｂ；HL-60 細胞、図２Ｃ；Ｋ 562細胞、図２Ｄ）に関して、ニトロソ含有配位 子(NOBP，NOBA，NOQ)は他の化合物より低モル濃度で³Ｈ−チミジン取込みを阻害 し得た。NOBP，NOBA及びNOQ は10μＭの濃度で³Ｈ−チミジン取込みを強力に阻 害したが、これに比して他の化合物はこの濃度ではわずかな阻害作用を示した。 10％ウシ胎児血清(FCS)中で増殖させたＨ９細胞を用いた実験（図２Ｂ）から 、NOQ は、10μＭレベルでほぼ完全な阻害を示す最も強力な阻害剤であることが 判った。NOBPは10μＭでのチミジン取込みにおいて約30％の減少を示し、100μ Ｍではほぼ完全な取込み阻害を示した。NOBAは10μＭで約75％レベルの阻害、10 0μＭで約85％阻害、250μＭでほぼ完全な阻害を示した。残りのアミノ酸ニト ロ化合物は阻害力は有意に低く、濃度が1000μＭに達するまで完全阻害を示さな かった。 10％ウシ胎児血清中で増殖させたＫ 562細胞を用いた実験（図２Ｄ）から、NO Q 及びNOBPは、細胞増殖の最も強力な阻害剤であることが判った。NOQ 及びNOBP はともに、10μＭの濃度でほぼ完全な阻害を生じた。NOBPはNOQ とほぼ同じ位強 力で、10μＭの濃度で約90％阻害、100μＭの濃度でほぼ完全な阻害を生じた。 試験した他の３つの化合物の阻害力は有意に低かった。 10％ウシ胎児血清中で増殖させた 855-2細胞を用いた実験（図２Ａ）から、NO Q 及びNOBPは、10μＭ濃度でほぼ完全な阻害を生じることが判った。１μＭの濃 度では、NOQ はNOBPより多少高い阻害を生じ、NOBPはNOBAより多少高い阻害を生 じた。HL-60 細胞を用いた実験（図２Ｃ）は、同様の結論を示した。試験した他 の３つの化合物の阻害力は有意に低かった。 NOBPの成長阻害効力に及ぼす異なる成長因子の作用を調べた。（１）10％ウシ 胎児血清中、（２）自己分泌成長因子(AGF)及び（３）低分子−BCGF（Ｔ細胞出 来リンフォカイン）を含有する培地中で増殖させた 855-2細胞を漸増濃度のADRP T 配位子に曝露した。結果を図２（Ａ，Ｅ，Ｆ）に示す。各成長因子中で増殖し た細胞はすべて、ニトロソ含有化合物により強力に阻害され、５〜10μＭの濃度 で 100％阻害を引き起こした。したがって、NOBP、NOBA及びNOQ は、成長因子活 性の供給源のいかんにかかわらず、強力な阻害効力を発揮する。 NOBP及びNOBAが成長因子の不活性化によりそれらの成長阻害効力を表現する可 能性を排除するために、漸増濃度のウシ胎児血清(FCS)の存在下で 855-2細胞に 及ぼす10μＭ NOBP又はNOBA（定濃度）の効力を調べた（FCS は 855-2のための 成長因子を含有した）。デ ータを図３に示す。成長停止は、FCS の濃度に関係なく起きた。したがって、NO BPの作用様式は成長因子の拮抗作用によるものと思われるが、しかしADPRT 部位 ではDNA 複製に関連があると思われる。 予備実験では、Ｌ1210マウス白血病の伝播をin vivo で試験したが、その結果 は、６連続日間に１日２回、２mg／kgの用量で腹腔内注射したNOBAは有毒作用を 引き起こさず、BDF マウスの寿命を10日（未処置）から35日（観察終了）まで延 長し、したがって非常に有意のin vivo 化学療法的反応を発揮することを示した 。これらの結果は、マウス中に存在する高レベルのアスコルビン酸にかんがみて やや意外である。強力な還元剤であるアスコルビン酸は、3-NOBAを還元する。そ の還元形態において、3-NOBAは、亜鉛フィンガーから亜鉛を除去する場合に有効 であるようには有効でない。ゆえに、3-NOBAが高レベルのアスコルビン酸の存在 下で有効な化学療法剤として存在することは期待できない。 NOBP及びNOBAの腫瘍細胞阻害濃度は、正常細胞の生存能力に悪影響を及ぼさな いことが示された。種々の癌細胞(855-2及びHL-60 白血病細胞、Ｄ32，Ｄ37及び CRL 7712グリア芽細胞腫細胞株、186髄質腫瘍細胞株、Ｌ1210マウス白血病細胞 株、MDA-468 ヒト乳癌細胞株)及び正常細胞（好中球及び骨髄又は末梢血流細胞 ）の機能を化合物の非存在下又は存在下で評価する実験を実施した。その結果を 図４〜９に示す。同時に、データは、10μＭの濃度のニトロソ含有配位子は癌細 胞を有効に抑圧したがしかし正常細胞における機能には適度にしか作用しないこ とを立証したことを示す。 VI．NOBP の毒性 正常ヒト幹細胞（PBSC）のコロニー形成（CFU-GM）に及ぼす化合物の効力を調 べることにより、０，２μＭ，４μＭ，８μＭ及び10μＭのNOBPの細胞毒性を測 定した。実験結果を図５Ｂに示す。855 -2細胞増殖を完全に遮断するのに十分なレベルのNOBPを試験した場合でさえ、毒 性は検出されなかった。 同様のCFU 幹細胞毒性検定を実施して、（ABP）６−アミノ−１，２−ベンゾ ピロン １mM,（IABP）５−Ｉ−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン 250μＭ, （NO₂BP）６−ニトロ−１，２−ベンゾピロン（弱活性）250μＭ，NOBP 10μＭ 及びNOBA 10μＭを比較した。実験結果を図５Ａに示す。６−アミノ−１，２− ベンゾピロン，５−Ｉ−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン及び６−ニトロ誘導 体は試験指定用量で有毒であったが、一方ほとんど効力のない（腫瘍細胞に対し て）６−ニトロ誘導体、並びに非常に有効な（腫瘍細胞に対して）NOBP及びNOBA は非毒性であった。 正常ヒト末梢血好中球によるスーパーオキシド発生に及ぼす10μＭNOBP及びNO BAの効力を調べた。その結果を表IIに示す。スーパーオキシド発生の最少度の減 少しか観察されなかった。 VII．比較効力試験 白血病及び他の悪性疾患の治療には、非常に有毒な化学療法化合物であるビン クリスチンが一般に用いられる。In vitroで増殖させた 855-2白血病細胞に関し て検定した場合の10μＭ NOBPと同レベルの成長阻害を生じるビンクリスチンの 濃度を確定するために、試 験を実施した。ビンクリスチンは 0.1，１，10及び 100μＭの用量で試験した。 図７に示すように、10μＭ NOBP と同レベルの阻害を生じるには 100μＭのビン クリスチン（高毒性濃度）を要し、したがってNOBPは等濃度のビンクリスチンよ り約10倍強力であって、正常細胞に対して有毒でない。 したがって、低毒性と結びついたその効力のゆえに、ADPRT ポリメラーゼ活性 を有する同じく阻害剤である、ある種の芳香族ニトロソ分子は有用な化学療法的 細胞増殖抑制剤である。 VIII．刺激ヒトリンパ芽球に及ぼすNOBP，NOBA及びNOQ の抗HIV 作用 Journal of Immunological Method 76：171-183(1985)に記載された方法を用 いて、HIV 感染を阻止するNOBP（６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン）及びNO BA（３−ニトロソベンズアミド）の能力を調べた。ウイルス感染開始時に30分だ け２つの薬剤に暴露させ、薬剤を決して再付加しなかった。表IIIの結果は、HIV を細胞培養に感染させた10日後のHIV 力価のID₅₀を示す。表IIIのデータは、10 μＭのニトロソ含有配位子がHIV 感染性力価の３対数減少を引き起こすことを立 証している。 IX．ADRPT 配位子の殺細胞活性−MTT 検定 培養中及び軟寒天中で観察された 855-2細胞の増殖の阻害がニトロソ化合物 NOBP，NOBA及びNOQ の細胞増殖抑制又は殺細胞作用に依るものか否かを確定する ために、実験を実施した。１×10⁵／ml（骨髄検定に用いた濃度）の細胞を1，2. 5，５及び10μＭのNOBP，NOBA及びNOQ で２時間処理し、次いで10％ウシ胎児血 清で刺激して、24時間インキュベートした。次に１mg／mlのMTT(臭化３−〔４， ５−ジメチル−２−イル〕−２，５−ジフェニルテトラゾリウム)を16時間付加 した。DMSOを付加して細胞を可溶化した後、550nmでペレット化細胞の吸光度を 測定した。 結果：10μＭ NOBP，NOBA及びNOQ を用いた場合、完全殺細胞は 100,000／ml の 855-2で観察された。 Ｘ．Zn(HIV1-F1) からのZn⁺⁵放出のNMR 試験 NOBAがレトロウイルス型亜鉛フィンガーから亜鉛を放出し得るか否かを測定す るために、HIV-1 NC タンパク質のＮ末端CCHC亜鉛フィンガー Zn(HIV1-F1)に 対応するアミノ酸配列を有するペプチドに関してNMR 試験を実施した（South，e t al.，J．Am．Chem．Soc．111：395-396(1989)，South，et al.，Biochem．Pha rm.40：123-129(1990)，Summers，et al.，Biochemistry 29：329-340(1990)） 。Zn（HIV-F1）のNMR スペクトルを、NOBA（３−ニトロソベンズアミド）付加の 前及び後に実施した。従来のNMR 試験は、このペプチドが亜鉛を化学量論的に結 合し、高親和性を有することを立証しており（South，et al.，J．Am．Chem．So c．111：395-396（1989））、三次元構造試験は、ペプチドが無傷NCタンパク質 中の対応する領域の構造と本質的に等しい構造をとることを示した（South，et al.，Biochemistry 29：7786-7789(1990)）。Zn（HIV-F1）のNMR スペクトルを 、NOBA（３−ニトロソベンズアミド）付加の前及び後 に実施した。His 9 及びPhe 2 の芳香族プロトンによる信号を示す¹H NMRのダウ ンフィールド領域を図10（底部）に示す。２モル当量のNOBAを付加すると、亜鉛 結合ヒスチジン（＊で示す）による信号の喪失及び亜鉛無含有ヒスチジン（＋で 示す）を表現する広範な信号の出現が生じる。スペクトル中の他の信号は、NOBA プロトンに依る。90分後、亜鉛結合His に関与する信号はまったく検出されなか った（図10参照）。90分後、未反応NOBAによる信号は反応済NOBA信号と比較して 等強度を有したが、これはNOBAがZn(HIV1-F1)と化学量論的に反応することを示 している；この所見は、１当量のNOBAを用いた付加的試験により確証された。比 較すると、Zn(HIV1-F1)から亜鉛を除去するには10倍以上のモル数のEDTAを要す る（Summers，et al.，J．Cell Biochem 45：41-48(1991)）。 ＸＩ．Zn(HIV1-F1) 核酸結合のNMR 試験 Zn(HIV1-F1)は配列特異性を有する１本鎖核酸と結合することが示されており 、HIV-1 Psiパッケージング信号の一部の配列を含有する５−残基オリゴヌクレ オチド d（CACGCC）との高度安定複合体が、高分解能構造試験のために調製され た。このタンパク質−オリゴヌクレオチド複合体にNOBAを付加すると、亜鉛の放 出が生じ、亜鉛フィンガー核酸複合体の付随的解離を伴う（図11）。これらのデ ータは、HIV-1 NCタンパク質のCCHC列（Cys-X₂-Cys-X₄-His-X₄-Cys）がNOBAに よる特異的作用をうけて核酸基質との機能的結合が弱められることを示す。図12 に模式的に説明した反応機序は、図10及び11のNMR 分析の結果と一致する。図12 に提示した反応機序は有用なモデルであるが、しかし本発明の範囲を限定するも のではない。 ＸII．NOBA による HIV-1ビリオンの処理に起因する亜鉛喪失 NOBAが無傷ビリオンから亜鉛を放出し得るか否かを測定するために実験を実施 した。Bess et al.，J．Virol．66 : 840-847（1992 ）に記載されているように HIV-1（MN鎖）を生成し、精製して濃縮した。濃縮ウ イルスをTNE 緩衝液(0.01 M Tris-HCl，0.1 M NaCl，1mM EDTA，pH 7.2)中の培 養液の60倍に希釈し、3000又は6000μＭ NOBAと一緒に37℃でインキュベートし た。次にウイルスをペレット化し、TNE 緩衝液で洗浄して、弱結合亜鉛を除去し た。その結果生じたウイルスペレット中の亜鉛の量を、Bess et al.，J．Virol ．66 ：840-847(1992)に記載されているように確定した。ペレット中のウイルス タンパク質の有意の損失は、ｐ24及びgp120 競合ラジオイムノアッセイ及びComa ssie染色ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によっては検 出されなかった。 表IV中のデータは、NOBAを用いてHIV-1 の濃縮懸濁液（培養溶液に関して60ｘ ）を処理するとウイルス亜鉛の50〜83％の喪失及び感染性の完全喪失が生じるこ とを立証する。エッジＸ線吸収微細構造分光分析法は無傷レトロウイルス中の亜 鉛の大多数がCCHC配位子により配位されることを示した（Summers，et al.，Pro tein Science 1： 563-574（1992）及びChance et al.，Proc．Natl．Acad．Sci ．89：（1992）印刷中）ため、NOBAによるビリオンからの亜鉛の放出はヌクレオ キャプシドCCHC亜鉛フィンガーの不安定化に直接関与する。ポリ(ADP−リボース )ポリメラーゼのR-NH₂型配位子に対する抗HIV 活性(Cole et al.，Biochem．Bio phys．Rec．Commun．180： 504-514(1991))は、R-NH₂化合物がR-NO型分子の代謝 前駆体である(Buki，et al.，FEBS Lett.，290： 181-185(1991))ために、レト ロウイルスCCHC亜鉛フィンガーの不安定化に部分的に関与し得る。 ＸIII．NOBP 及びNOBAのin vivo 試験 ヒト末梢リンパ球(PBL)におけるHIV-1（LAV株）のウイルス増殖に関して、NOB P（６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン）及びNOBAの両方を以下のように試験 した。100,000TCID₅₀の感染性力価を有するHIV-1 ストックをどちらかの薬剤と ともに22℃で30分間インキュベートした。薬剤を含有しない対照HIV サンプルを 同一方法でインキュベートした。図13（Ａ，Ｂ）の下部横座標に示すようなHIV- 1 力価を生じる10倍の逐次希釈後、PBL にHIV-1 希釈液を加えて９日間インキュ ベートすることによりウイルス増殖を開始させた。このインキュベーションの終 了時に、HIV-1 抗原に対するイムノアッセイにより，並びにMcDougal，et al.， J．Immunol．Methods 76：171-183(1985)に記載されているような逆転写酵素に より、生産的感染に関して培養を検定した。Ｃ−ニトロソ剤で予備インキュベー ションされていないHIV 希釈液を含有する対照と比較した百分位数値（パーセン ト感染培養）としてウイルス力価を表した。別々のシリーズの実験において、HI V-1 希釈液及びＣ−ニトロソ剤（上部横座標参照）を予備インキュベートしなか ったが、しかし前記のように（即ち予備インキュベーション後）同一濃度で正確 にリンパ球に同時に加え、９日後にウイルス増殖をモニタリングした。図13に説 明したように（South，et al., J ．Am．Chem．Soc. 111：395-396(1989)，South ，et al., Biochem ．Pharm. 40 ：123-129(1990)，Summers，et al., Biochemis try 29：329-340(1990)）、Ｃ−ニトロソ剤が予備インキュベートされた場合にH IV-1 増殖の阻害は顕著であり、一方薬剤及びウイルスをともに同時に付加した 場合にはHIV-1 増殖に及ぼす極わずかな効力だけしか生じなかった。２つのＣ− ニトロソ剤間では、NOBAはHIV-１増殖のより大きな低下を誘発した。 NOBAを用いたインキュベーションを０℃，22℃及び37℃で実施する実験を行な った。図13Ｂから、NOBAによるHIV-1 の不活性化は37℃で最大に起きることは明 らかであり、これは単離ポリペプチド中に存在するZn（HIV1-F1）と比較した場 合（図10及び11）、薬剤に対するウイルス亜鉛フィンガーの起こり得る低アクセ シビリティーを示唆する。本出願の他所に記載した非腫瘍細胞に及ぼすＣ−ニト ロソ剤のわずかな細胞毒性効力と一致して、ヒトリンパ球は、Mosaran，J．Imm ．Methods 65：55-63(1983)に記載されているような定量的染料還元により検定 される細胞代謝の大きな変化を伴わずに50μＭまでのNOBAを耐容した。 HIV-1 ウイルスそれ自体の臨界分子構造、即ちNCタンパク質の亜鉛フィンガー に及ぼすＣ−ニトロソの直接作用は、これらの薬剤を現在公知のあらゆる化学療 法剤と区別する。ポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼのR-NH₂型配位子であるＣ− ニトロソ剤の代謝前駆体は、MT-2及びAa-2の両細胞のHIV-1 複製を抑制する（Co le．et al.，Biochem．Biophys．Res．Comm．10 ：504-514(1991)）。これらのR -NH₂配位子のポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼとの抑制結合及びそれらの抗HIV 間の相関は、抗ウイルス剤としてこれらの分子の作用様式でこの核酵素が関与 することを有効に示す。しかしなが ら、HIV-1 複製を遮断するのに要するR-NH₂剤の濃度は、Ｃ−ニトロソ剤の有効 抗ウイルス濃度より約10³高い。細胞中でのＣ−ニトロソ分子に対して相対的に 低率のR-NH₂剤の酸化（Buki，et al.，FEBS Letters 290：181-185(1991)）を考 えた場合、相対的に高濃度（ミリモル）のR-NH₂剤は、マイクロモル濃度で有効 なＣ−ニトロソ型分子の“プレドラッグ”又は供給源としてのその役割に対応す る。したがって、それらの前駆体から形成されるＣ−ニトロソ剤の直接作用は実 行可能であるが、しかしこれらの薬剤が、ここに示したようにHIV-1 に直接作用 する他に、癌細胞中でアポプトシス誘発剤賭してＣ−ニトロソ剤の作用に関連し 得るさらに別の様式の作用を有し得ることは、現時点では除外できない。 ＸIV．3-NOBA による牛及び３′−アジド−２′，３′−ジデオキシチミジン(A ZT) 耐性サル免疫不全ウイルス(SIV)の複製阻害 CEM x174細胞は、ヒトＢ細胞株 721,174及びヒトＴ細胞株CEM(12)の融合生成 物である。SIV_mac(SIV_mac239)の分子クローンは、New England Primate Researc h Center のDr．R．Desrosiers がご親切に提供してくださった。AZT(３′−ア ジド−２′，３′−ジデオキシチミジン)はBurroughs Wellcome Co.製であった 。化合物３−ニトロソベンズアミド（NOBA）は、実施例IIに記載されているよう に合成した。Ｌ−グルタミンを補充したRPMI 1640は、Gibco Labs，Inc.から購 入した。 3-NOBA を用いた予備インキュベーション CEMx174 細胞を４×10⁵細胞／mlで懸濁し、23穴組織培養プレート中に分配し た。培養を種々の濃度の被験物質（対照としてDMSOと一緒に）で処理し、CO₂イ ンキュベーター中で37℃で１時間インキュベートした。細胞を300 TC ID₅₀／ml （細胞懸濁液１ml当たり50％組織培養感染薬剤）のSIV_mac239 のストック溶液５ μｌで感染 させた。テトラゾリウム塩(MTT)検定により細胞生存能力を測定し、薬剤を含有 する培地中に３〜４日毎に培養を１：４に分けた。シンシアチウムの存在に関し て光学顕微鏡により培養を定期的に検査した。上清SIV p27 コア抗原タンパク質 又は逆転写酵素（RT）レベルの分析により、ウイルス力価を確定した。 ウイルスを用いた予備インキュベーション 上記のようにCEMx174 細胞を24穴組織培養プレート中に分配した。細胞をウイ ルスと一緒に２日間（シンシチウムが現れるまで）インキュベートし、その後NO BAで処理した。シンシアチウムの存在に関して培養を定期的に検査した。SIV p2 7 又はRT検定によりウイルス力価を確定した。 逆転写酵素検定 逆転写酵素活性に関して調べるために、感染細胞上清10μｌを総容量50μｌ中 に溶解した50mM tris-HCl(pH 8.0)，５mM MgCl₂，10mMジチオトレイトール(DTT) ，20mM KCl及び１％ Triton X-100 を含有する反応混合物に加えた。ポリ（rA） オリゴ(dT)_12-18は 100μｇ／mlで、そして³H-TTP は2.4μＭで存在した。反応 混合物を37℃で１時間インキュベートし、TCA 沈殿性放射能をニトロセルロース フィルター上に濾過し、次にこれを洗浄し、乾燥して、計数した。 テトラゾリウム塩(MTT)検定 発表された手法(Hansen et al.，J．Immunol．Methods 119：203210(1989))に より細胞生存能力を測定した。手短に言えば、MTT(３−（４，５−ジメチルチア ゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムプロミド）を５mg／ml の濃度で滅菌リン酸塩緩衝食塩水(PBS)中に溶解した。MTT 溶液 20μｌを細胞 培養 100μｌを含有する各マイクロ滴定ウエル中に加えた。37℃で２時間イン キュベーション後、100μｌの可溶化培地（13と比較）を加えた。37℃で一夜イ ンキュベーション後、マイクロ滴定プレート読み取り器を用いて 570nmで光学濃 度を測定した。 Coulter Corp.（Hialeah，FL）により提供された酵素イムノアッセイにより S IV_macp27 コア抗原レベルを確定した。検定はメーカーの仕様書に従って実施し た。 感染細胞ゲノムのポリメラーゼ鎖反応(PCR)分析 薬剤処理SIV 感染CEMx174 細胞から又は対照細胞から抽出されたDNA を、SIV gag 遺伝子に対応して別々に設計したプライマーを用いて発表された方法（Blac kbourn et al.，J．Virol．Methods 37：109-118(1992)）によりSIV 配列の存 在に関してスクリーニングした。ノザンハイブリダイゼーションは、プライマー が主要コア抗原タンパク質ｐ27をコードする領域と相補的であることを示した。 実施例ＸIIIに記載されているように、ヒトリンパ球に関する検定を実施した 。 CEMx174 細胞中でSIV_mac239 複製を阻害する場合のNOBAの効力を、ウイルスに 感染させる前に37℃で１時間種々の濃度のNOBA中で細胞を予備インキュベートす ることにより測定した。図14Ａで説明したように、０〜20μＭのNOBAでCEMx174 細胞を前処理し、全実験期間中薬剤濃度を保持した結果、SIV_mac239 複製は20μ ＭのNOBAで著しく損なわれただけで、低薬剤濃度では効果を示したNOBAは検出さ れなかった。無効力（15μＭ以下）NOBA濃度と十分有効（20μＭ）NOBA濃度との 間の明瞭な移り変りに対する明確な理由は不明であるが、しかし細胞内NOBA不活 性化系の量はこの現象を説明し得るし、これは15μＭ以上のNOBAによって克服を 得る。20μＭNOBAの抗ウイルス作用と一致して、細胞生存能力はウイルス無含有 対照のレベルで保持された（図14Ｂ）。しかしながら、SIV p27 レベルが高 い場合は、SIV_mac239 の殺細胞作用は予測通りに細胞生存能力の有意の低減に反 映された。 ウイルス複製はCEMx174 細胞のゲノム中の組込みウイルスDNA の出現と一致す ると予期されたため、特異的に設計した gag−選択SIV プライマーの助けを借り てポリメラーゼ鎖反応(PCR)法により細胞DNA を検定した（Blackbourn et al.， J．Virol．Methods 37 ：109-118(1992)）。PCR 検定の結果を図15Ａ〜Ｂに示す 。図15Ａのレーン１は分子マーカー(Hind III消化φX 174DNA)であり、レーン２ はgag 特異的プライマーにより増幅されたSIV p27 コア抗原タンパク質をコード するプラスミドDNA である。レーン３は非感染対照からの特異的増幅DNA の非存 在を説明し、レーン４〜７は、NOBA非存在下（レーン４）での、0.1％DMSOを用 いた（レーン５）、並びに10μＭ NOBAによる予備インキュベーション及び処理 後の（レーン６）、及び最後に感染性DNA に対する信号を完全に壊滅させた20μ ＭのNOBAを用いた（レーン７）SIV 感染細胞におけるPCR 検定の結果を示す（図 14Ａと比較）。SIV gag DNA の非存在が不完全DNA 抽出技術によるものであると いった考え得る人為結果を除外するために、図15Ｂに示したような遍在するβ作 用遺伝子に関しても我々は調べたが、この場合、レーン１は分子マーカー(Hind III消化φX 174DNA)であり、レーン２はβ作用特異的プライマーにより増幅され たβ作用セグメントであり、レーン３〜７は、非感染対照細胞培養から抽出され たDNA のβ作用プライマー増幅（レーン３）、並びに０μＭ NOBAで処理した（ レーン４）、0.1％ DMSO を含有する０μＭ NOBA(レーン５)、10μＭ NOBA(レー ン６)、及び20μＭのNOBA（レーン７）で処理した感染細胞培養である。これら の結果は、20μＭ NOBA で処理した感染細胞中のSIV ゲノムの非存在が抽出可能 なDNA の欠如に依るものでなかったことを確証する。 AZT 耐性SIV 株を同定するために、SIV 感染アカゲザルからウイルスを単離し 、AZT に対するそれらの耐性を調べた。分子クローン SIV_mac239 はAZT 感受性 であったが、しかし感染後14か月目の SIV_mac239 感染アカゲザル(MMU 23740)か らのウイルス単離物はAZT 耐性であった；AZT はSIV_mac239 と比較してSIV 2374 0 の成長を一部のみ阻害したが、これはアカゲザルウイルスが原感染ウイルス(S IV_mac239)と他の突然変異化ウイルスの混合物を含有したことを示唆する。AZT 処理ウエル中に形成されたシンシチウムの数を比較することにより、SIV 23740 に対比してSIV_mac239 は細胞変性効力をまったく有していないことが明らかにな った（表Ｖ）。 AZT 耐性SIV 菌株の複製に対するNOBAの阻害作用を、MMU 23740PBMCとCEMx174 および新鮮なCMEx174 細胞で構成されている６日間の共培養系(6-day-old co-c ultivation system)の上澄み液をインキュベートすることによって検定した。こ の系は生体内に存在する状態をシミュレートしている。初期の共培養を行ってか ら16日後に ELISA法でｐ27コア抗原を検定したところ、NOBA投与量依存性のSIV 23740 産生の抑圧現象を示したが、AZT の抗ウイルス作用は全く起こらなかった （図16Ａ）。NOBAまたはAZT による、細胞活性の有意な医薬依存性の低下は全く なかった（図16Ｂ）。 NOBAの強力な抗SIV 作用とは逆に、逆転写酵素活性に対する直接の作用は全く 確認できなかった（表VI）。 またNOBAの直接抗SIV 作用は、実施例ＸIIIにおいてHIV について記載したの と同様にしてフィトヘマグルチニンで刺激したヒト末梢リンパ球で検定した(PHA -PBL)。この試験は同じ試験系でのSIV とHIV の直接比較を示す。図17に示すよ うに、37℃で30分間、50μＭNOBAとともに SIV_smmを前インキュベートすると、P HA-PBLにおけるSIV の複製が完全に抑圧された。PBMC中でのSIV の複製に対する NOBAの投与量応答性作用を定量するために設計した別の試験で測定したところ、 EC₅₀値（ウイルスの複製を50％抑圧する薬剤の濃度）は、SIV_smmとSIV_mmbiの菌 株それぞれに対して17〜８μＭ NOBAの間で変動した。 ＸＶ．ヒトリンパ球におけるHIV の感染プロセスにに対する３−ニトロソベン ズアミドの抗ウイルス作用の部位 ウイルス複製阻害作用の検定 フィトヘマグルチニンで刺激したヒト末梢血液の単核細胞（PBMC）を、指定濃 度のNOBAおよびヒトPBMC中でのみ増殖したHIV-1_wjo小児の臨床単離株の 250TCID₅₀ の存在下、96ウエルプレート中に分配した（10⁵／ウエル）。７日後、ｐ24抗 原捕獲キット（米国、フロリダ州、ハイアリーア所在のCoulter Immunology社） を用いて、培養物のｐ24抗原の含量を検定した。細胞生育能は、すでに報告され ているようにして（Gulakowskiら，J．Virol．Methods，40 巻， 347〜356 頁， 1991年）、ビスカルボキシエチル−５（６）−カルボキシフルオレセインアセト キシメチルエステル(BCECF)(米国、オレゴン州、ユージーン所在のMolecular Pr obes Inc．社)を用いて定量した。酵素の検定 RTの生体内活性をBoehringer Mannheim ELISA キットを用いて測定した。そし て３′−アジド−３′−デオキシチミジン−５′−三リン酸(AZTTP)がRTの阻害 に対す正の対照として含まれている。内因性逆転写検定を行う場合、10μｇのウ イルスHIV-1_IIIB（米国、メリーランド州、ロックビル所在のUniversal Biotech nology Inc．社）を、25℃で10分間指定濃度のNOBAで処理し、続いてメリチン(m elittin)(米国、ミズーリ州、セントルイス所在のSigma Chemical Co.社)でウイ ルスの透過性を増大し、次いでさきに報告されているようにして（Yongら，AIDS ，４巻， 199〜206 頁，1990年）39℃で６時間反応混合物をインキュベートした 。反応は 0.1％ SDS／10mM EDTA を用いて終了させ、次に 0.7％アガロースゲル 上で電気泳動を実施し、そのゲルを乾燥し次いでオートラジオグラフィーに付 した。HIV-1プロテアーゼの活性をすでに報告されているようにして（Wondrak ら，FEBS Lett，280巻， 347〜350 頁，1991年）、逆相HPLC検定法で定量し、そ して HIV-1インテグラーゼの活性をすでに報告されているようにして（Fcsen ら ，P.N.A.S.，90巻，2399〜2403頁，1993年）測定した。比較のため、トポイソメ ラーゼＩとIIを、すでに報告されているのと同様にして(Jaxelら，J.Biol.Chem. 266巻， 20418〜20423 頁，1991年)検定した。DNA の増幅法 NOBVまたはDMSO溶媒と予め混合した未希釈の HIV-1_IIIB株を用い、この混合物 に３×10⁶のPBMCを加えて24時間培養して、プロウイルスのDNA 合成を監視した 。次に細胞を洗浄し、DNA を抽出し、LTR／gag パライマー対（M667／M661）を 用いてPCR 増幅を行い、次いでその産物を２％のアガロースゲルで分析し、すで に報告されているようにして（Zackら，Cell，61巻， 213〜222 頁，1990年）そ のゲルを乾燥してオートラジオグラフィーに付して可視化した。ウイルス付着の検定法 HIV-1_RFのPBMCとの結合をｐ24ベースの検定法で測定した。簡単に述べると、 ５×10⁵のPBMCを、ウイルスの濃縮株とともに30分間インキュベートし、未結合 のウイルスを洗い流し、次いで細胞性ウイルス(cell-associated virus)を可溶 化してｐ24抗原捕獲検定法によって分析した。HIV-1とPBMCの結合は、デキスト ラン硫酸によって濃度依存方式でブロックした（表VII照。HIV-1_LAVとPBMCの細 胞表面結合も、すでに報告されている（McDougalら，J.Immunol.，135 巻，3151 〜3162頁，1985年）ようにして、FITC−抗−HIV-1_LAVを用いるフローサイトメト リーで定量した。 ３−ニトロソベンズアミドは実施例IIに記載したようにして合成した。ウイルスの複製に対するNOBAの阻害作用 p7NCタンパク質（HIV-1 のヌクレオキャプシドタンパク質）は、ウイルスのゲ ノムRNA 詰めこむためだけでなく、ウイルス複製の早期事象のために必要な二つ の別個の亜鉛のフィンガー配列を含有しているが、このことは、NOBAがウイルス 感染の早期段階で特異的な阻害作用を誘発する可能性があることを示唆している 。この抗ウイルス作用を規定するため、標的細胞（PBMC）を、HIV-1_wejo小児の 臨床単離株および各種濃度のNOBAと同時に混合する条件下で、HIV-1の複製に対 する医薬の濃度依存性作用を測定する試験を計画した。図18に示すように、NOBA は、1.56μＭのEC₅₀（感染を50％阻害する医薬のレベル）で、ｐ24ウイルス抗原 の産生を阻害した。そして50μＭのNOBAでリンパ球の抑圧が見られる。リンパ球 を生体外で培養するにはフィトヘマグルチニンを要し、ある程度の人工性を導入 する必要があるので、NOBAの生体外での効力は人工的な増殖刺激剤を全く必要と しない細胞型で試験しなければならない。これらの理由のためNOBAの見掛けの効 力は、刺激されたリンパ球の場合、約32と推定されるが過小評価かもしれない。 HIV-1の細胞への結合、ならびに逆転写酵素、HIV-1プロテアーゼおよびインテ グラーゼのNOBAへの結合の不感受性。HIV-1のPBMCに対する結合、ならびに HIV- 1のすなわち逆転写酵素（RT）、プロテアーゼ（PR）およびインテグラーゼ（IN ）に対する生体外活性に対するNOBAの影響を測定した。ウイルスを 100μＭのNO BAで前処理した場合、ｐ24とPBMCの結合で定量したところ、ウイルスの付着に対 して全く作用がなかったが（表VI）、10μｇ／mlのデキストラン硫酸によってほ ゞ完全に阻害された。ウイルスの付着に対してＣ−ニトロソ薬剤が作用しないこ とは、FITC−抗− HIV-1検定法に基づいたサイトメトリー法でも確認した（記載 せず）。人工的なホモポ リマーの鋳型プライマー〔ポリ（rA）、オリゴ（dT）〕を用いた場合、RTの活性 に対するNOBAの阻害作用はなかったが（表VI照）、３−アジド−３′−デオキシ チミジン−５′−三リン酸(AZTTP)はRT活性を有効に阻害した。同様に、A-74704 合成PRインビター（chowら、Nature，361 巻， 560〜564 頁，1993年）は１μ Ｍの濃度でPRを抑圧したが、NOBA(100μＭ)はPR活性の阻害を全く示さなかった （表Ｉ）。前インキュベーションを行った後でもNOBAがINの活性に対して全く作 用しなかったこと（19図）は特に興味深い。このタンパク質は“古典的”なタイ プの亜鉛フィンガー配列（レトロウイルスのCCHC型ではないCCHH型）をもってい る（Khanら，Nucleic Acids Research，19巻， 851〜860 頁，1991年）。正の対 照として、INに対するカフェー酸（フェネチルエステル）のINに対する阻害作用 も示す。主要なDNA 結合核酵素のトポイソメラーゼＩとIIは亜鉛を含有している ので、NOBAの作用もこれらの酵素に対して試験した。HIVの感染性またはプロウ イルスDNA の形成を完全にブロックするNOBAの濃度で、トポメラーゼＩとIIに対 る作用は、１時間前インキュベーションを行った後でも確認できなかった（図19 ）。したがってNOBAは、HIV-1 の四つの主な標的（付着、RT，PRおよびIN）に対 する作用なしでレトロウイルスの亜鉛フィンガー構造に対して特異性を示した。 NOBAはプロウイルスのDNA の合成をブロックする。プロウイルスDNA のPBMC内 での形成は、HIV-1_LAVの濃縮株懸濁液を薬剤と混合し次にPBMCの培養物を添加す ることによって測定した。24時間培養後、細胞を、全長もしくはほゞ全長のプロ ウイルスDNA の存在について、プローブに対する LTR／gag(M667／M661)プライ マー対を用いて PCR法によって分析した（Zackら，Cell，61巻， 213〜222 頁， 1990年）。逆転写の産物は、PCR で検定すると、10μＭのNOBAに よって完全にブロックされていた（図20）。ウイルスの複製も同じ条件下でブロ ックされた（図示せず）。未変性のRNA 鋳型、tRNA^lys,3プライマー、RTおよびN Cのタンパク質で構成されている透過可能にされた HIV-1ビリオンで検定すると 、NOBAによる逆転写プロセスの阻害が見られた（図21）。この“内因性”検定で は、図20に示す試験の 100倍の濃度の HIV-1_IIIB株を含有していたので、NOBAの 濃度とレトロウイルスの亜鉛フィンガーの濃度との間には化学量論的関係がある から、より高濃度のNOBAが必要であった（実施例Ｘ参照）。NOBAは、たとえRT酵 素に直接影響しなくても、細胞ゲノムDNA 中に組込む必要がある成熟プロウイル スDNA の形成を防止する。 さきに引用した刊行物、特許および特許願はすべて本願に援用す るものである。 上記の明細書によって、当該技術分野の当業者は本発明を充分に実施できると 考えられる。実際に、本発明を実施する上記の態様の各種変形は、医薬配合の技 術分野または関連分野の当業者にとって明らかでありかつ後記の特許請求範囲の 範囲に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 217/24 Ｃ０７Ｄ 217/24 311/08 311/08 311/14 311/14 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 メンデレイェブ，ジェローム アメリカ合衆国，カリフォルニア 94117, サンフランシスコ，スタンヤン ストリー ト 1292 (72)発明者 ライス，ウィリアム シー. アメリカ合衆国，メリーランド 21701, フレデリック，ロックウェル テラス 203

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．有効量のZn⁺²フィンガー脱安定化化合物を投与することからなる、Zn⁺²フ ィンガーのヌクレオカプシドタンパク質を有するウイルスを不活性化する方法。 ２．前記化合物がニトロソ含有化合物である請求の範囲１の方法。 ３．前記化合物が、 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆は水素およびニトロソから成る群より 選択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆のただ１つはニトロソ基で ある、 を有する化合物、 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂、およびＲ₃は水素およびニトロソから成る群より選択され、そ してＲ₁，Ｒ₂、およびＲ₃のただ１つはニトロソ基である、 を有する化合物、および 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅は水素およびニトロソから成る群より選 択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅のただ１つはニトロソ基である 、 を有する化合物、 から成る群より選択される請求の範囲２の方法。 ４．前記化合物が６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン、３−ニトロソベンズ アミド、５−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、７−ニトロソ−１（２Ｈ ）−イソキノリノン、および８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンから成 る群より選択される、請求の範囲３の方法。 ５．前記化合物が３−ニトロソベンズアミドである、請求の範囲４の方法。 ６．前記ウイルスがレトロウイルスである請求の範囲３の方法。 ７．前記レトロウイルスが HIV-1である請求の範囲６の方法。 ８．溶液をZn⁺²フィンガー脱安定化化合物とインキュベーションする工程を含 む、溶液中の感染性ウイルスの濃度を減少する方法。 ９．前記化合物がニトロソ基からなる請求の範囲８の方法。 10．前記化合物が、 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆は水素およびニトロソから成る群より 選択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆のただ１つはニトロソ基で ある、 を有する化合物、 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂、およびＲ₃は水素およびニトロソから成る群より選択され、そ してＲ₁，Ｒ₂、およびＲ₃のただ１つはニトロソ基である、 を有する化合物、および 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅は水素およびニトロソ から成る群より選択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅のただ１つは ニトロソ基である、 を有する化合物、 から成る群より選択される請求の範囲９の方法。 11．前記化合物が６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン、３−ニトロソベンズ アミド、５−ニトロソ １（２Ｈ）−イソキノリノン、７−ニトロソ−１（２Ｈ ）−イソキノリノン、および８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンから成 る群より選択される、請求の範囲10の方法。 12．生物学的物質およびウイルスのヌクレオカプシドタンパク質上のZn⁺²フィ ンガーを脱安定化する化合物からなる組成物。 13．前記生物学的物質が血液である、請求の範囲12の組成物。 14．前記化合物が、 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆は水素およびニトロソから成る群より 選択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆のただ１つはニトロソ基で ある、 を有する化合物、 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂、およびＲ₃は水素およびニトロソから成る群より選択され、そ してＲ₁，Ｒ₂、およびＲ₃のただ１つはニトロソ基である、 を有する化合物、および 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅は水素およびニトロソから成る群より選 択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅のただ１つはニトロソ基である 、 を有する化合物、 から成る群より選択される請求の範囲13の方法。 15．前記化合物が３−ニトロソベンズアミドである、請求の範囲13の組成物。 16．Zn⁺²フィンガーを脱安定化する能力について化合物をアッセイすることか らなる、ウイルスを不活性化する化合物を検出する方法。 17．２−アミノベンズアミドの酸化、３−ニトロソベンズアミド および３，３′アゾキシベンズアミドの沈澱および実質的に純粋な３−ニトロソ ベンズアミドの再結晶化からなる、３−ニトロソベンズアミドの製造方法。 18．前記方法が、 ａ．２−アミノベンズアミドを０〜約５℃の範囲の温度においてＮ，Ｎ−ジメ チルホルムアミドの存在下に接触させることによって前記アミドを３−クロロパ ーオキシ安息香酸で酸化して、３−ニトロソベンズアミドおよび３，３′−アゾ キシベンズアミドを生成し、 ｂ．３−ニトロソベンズアミドおよび３，３′−アゾキシベンズミアドの前記 混合物を約５℃に冷却しそして濾過して３，３′−アゾキシベンズアミドの沈澱 を除去し、 ｃ．前記濾液を炭酸ナトリウムと０〜５℃の範囲の温度およびpHほぼ 8.5にお いて接触させて３−ニトロソベンズアミドおよび微量の３，３′−アゾキシベン ズアミドを沈澱させ、 ｄ．前記３−ニトロソベンズアミドおよび３，３′−アゾキシベンズアミドを 濾過しそして乾燥し、 ｃ．前記３−ニトロソベンズアミドおよび３，３′−アゾキシベンズアミドを 50％の水性酢酸中で再結晶化して実質的に純粋な３−ニトロソベンズアミドを得 る、 ことからなる、請求の範囲17の方法。 19．式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆は水素およびニトロソから成る群より 選択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆のただ１つはニトロソ基で ある、 を有する化合物、 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅は水素およびニトロソから成る群より選 択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅のただ１つはニトロソ基である 、 を有する化合物、 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂、およびＲ₃は水素およびニトロソから成る群より選択され、そ してＲ₁，Ｒ₂、およびＲ₃のただ１つはニトロソ基である、 を有する化合物、および から成る群より選択される化合物の有効量を投与する工程からなる癌を処置する 方法。 20．前記化合物が６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン、３−ニ トロソベンズアミド、５−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、７−ニトロ ソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、および８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノ リノンから成る群より選択される、請求の範囲19の方法。 21．前記化合物が３−ニトロソベンズアミドである、請求の範囲20の組成物。 22．式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆は水素およびニトロソから成る群より 選択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆のただ１つはニトロソ基で ある、 を有する化合物、 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅は水素およびニトロソから成る群より選 択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅のただ１つはニトロソ基である 、 を有する化合物、 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂、およびＲ₃は水素およびニトロソから成る群より選択され、そ してＲ₁，Ｒ₂、およびＲ₃のただ１つはニトロソ基である、 を有する化合物、および から成る群より選択される化合物の有効量を投与する工程からなるレトロウイル スの感染を処置する方法。 23．前記化合物が６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン、３−ニトロソベンズ アミド、５−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、７−ニトロソ−１（２Ｈ ）−イソキノリノン、および８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンから成 る群より選択される、請求の範囲22の方法。 24．前記化合物が３−ニトロソベンズアミドである、請求の範囲22の組成物。 25．前記レトロウイルスの感染がHIV の感染である請求の範囲22の方法。 26．請求の範囲22の化合物を含んでなるレトロウイルスの疾患を処置するため の組成物。 27．製剤学的に有効量の請求の範囲22の化合物を含んでなるレトロウイルスの 疾患を処置するための医薬組成物。 28．請求の範囲22の化合物を含んでなるHIV の感染を処置するための組成物。 29．製剤学的に有効量のニトロソ化合物を投与することを含んで なる、AZT 耐性ウイルスを不活性化する方法。 30．前記化合物が、式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆は水素およびニトロソから成る群より 選択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆のただ１つはニトロソ基で ある、 を有する化合物、 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂、およびＲ₃は水素およびニトロソから成る群より選択され、そ してＲ₁，Ｒ₂、およびＲ₃のただ１つはニトロソ基である、 を有する化合物、および 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅は水素およびニトロソから成る群より選 択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅のただ１つはニトロソ基である 、 を有する化合物、 から成る群より選択される請求の範囲29の方法。 31．前記化合物が６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン、３−ニトロソベンズ アミド、５−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、７−ニトロソ−１（２Ｈ ）−イソキノリノン、および８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンから成 る群より選択される、請求の範囲30の方法。 32．前記化合物が３−ニトロソベンズアミドである、請求の範囲31の方法。 33．前記ウイルスがレトロウイルスである請求の範囲32の方法。 34．前記レトロウイルスがHIV である請求の範囲33の方法。 35．製剤学的に有効量のニトロソ化合物を投与することからなる、宿主のゲノ ムからの組込まれたウイルスDNA のレベルを減少する方法。 36．前記化合物が、式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆は水素およびニトロソから成る群より 選択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆のただ１つはニトロソ基で ある、 を有する化合物、 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂、およびＲ₃は水素およびニトロソから成る群より選択され、そ してＲ₁，Ｒ₂、およびＲ₃のただ１つはニトロソ基である、 を有する化合物、および 式： 式中Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅は水素およびニトロソから成る群より選 択され、そしてＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、およびＲ₅のただ１つはニトロソ基である 、 を有する化合物、 から成る群より選択される請求の範囲35の方法。 37．前記化合物が６−ニトロソ−１，２−ベンゾピロン、３−ニトロソベンズ アミド、５−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、７−ニトロソ−１（２Ｈ ）−イソキノリノン、および８−ニトロソ−１（２Ｈ）−イソキノリノンから成 る群より選択される、請求の範囲36の方法。 38．前記化合物が３−ニトロソベンズアミドである、請求の範囲 37の方法。 39．前記ウイルスがレトロウイルスである請求の範囲38の方法。 40．前記レトロウイルスがHIV である請求の範囲39の方法。