CN103159686A

CN103159686A - 一种hiv-1蛋白酶的脲类抑制剂

Info

Publication number: CN103159686A
Application number: CN2011104104330A
Authority: CN
Inventors: 饶子和; 杨诚; 路支超; 唐延婷; 田珍; 刘伟
Original assignee: Tianjin International Joint Academy Of Biotechnology & Medicine
Current assignee: Tianjin International Joint Academy Of Biotechnology & Medicine
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2013-06-19

Abstract

一种HIV-1蛋白酶的脲类抑制剂，本发明涉及式(1)所示的芳香基脲类化合物，所述化合物具有HIV-1蛋白酶抑制活性，可用于制备HIV-1蛋白酶抑制剂，式(1)化合物的结构式为：

Description

一种HIV-1蛋白酶的脲类抑制剂

技术领域

本发明涉及一类芳香基脲类化合物，所述化合物具有HIV-1蛋白酶抑制活性，属于药物化学领域。

背景技术

艾滋病(AIDS)是本世纪对人类社会威胁最大的传染性疾病之一。引发AIDS的人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)于20世纪80年代中期发现以来，随着分子生物学技术的不断完善，世界各国陆续开展针对其基因结构的分类研究。根据血清学和基因序列的差异，HIV分为HIV-1型和HIV-2型。HIV-1广泛分布于世界各地，是造成全世界HIV/AIDS流行的主要原因，HIV-2主要分布于非洲西部。根据免疫印迹结果可以将HIV-1和HIV-2明确区分。在确认HIV感染的过程中就能确定感染者携带的HIV型，由于HIV-2毒株流行的局限性，而HIV-1的感染力较强，是当今世界HIV流行的主要病毒株，因此HIV-1亚型是目前的研究重点对象。

HIV在复制过程中编码2种多聚蛋白p55和p60，这两种蛋白前体在HIVpol基因编码蛋白酶(protease，PR)作用下分别裂解成具有结构蛋白活性和病毒特异性的酶。HIV PR的特异性裂解活性对该病毒复制周期正常运转和病毒毒粒成熟至关重要，是病毒复制必需的酶，可以作为抗HIV的药物靶点。蛋白酶根据其作用机制不同分为4种：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酰基蛋白酶。HIV蛋白酶属于天冬氨酰基蛋白酶，它有天冬氨酰基蛋白酶共有的DTG活性序列。HIV蛋白酶是由含99个氨基酸的多肽链形成的C 2对称的均二聚体，诸如血管紧张肽原酶等其它天冬氨酰基蛋白酶类的研究大大促进了HIV蛋白酶抑制剂的设计和筛选进程，迄今为止，不仅获得了一系列具有一定疗效的化学合成产物，而且筛选到许多具有抗HIV蛋白酶活性的天然产物。

目前艾滋病治疗的手段包括：抗病毒疗法，治疗性疫苗和基因治疗。其中抗病毒疗法又称“鸡尾酒疗法”，是通过三种或三种以上的抗病毒药物联合使用来治疗艾滋病。该疗法的应用可以减少单一用药产生的抗药性，最大限度地抑制病毒的复制，使被破坏的机体免疫功能部分甚至全部恢复，从而延缓病程进展，延长患者生命，提高生活质量。该疗法把蛋白酶抑制剂与多种抗病毒的药物混合使用，从而使艾滋病得到有效的控制。而HIV疫苗被认为是预防艾滋病的最有效工具。目前尚无有效的HIV疫苗问世，而新出现的HIV病毒株又表现出对临床治疗药物越来越明显的耐药性。于是开发新一代的HIV蛋白酶抑制剂就具有更加紧迫的现实意义。

现有的HIV蛋白酶抑制剂属多肽类化合物，药物合成工艺难度大，也是导致抗HIV治疗费用居高不下的主要原因，被称为″必须跨越壁垒″。这类抑制剂主要有：奈非那韦、沙奎邦韦、茚地那韦、安泼那韦、利托那韦、洛匹那韦及复合制剂等。

目前利用环脲的羰基氧原子模拟HIV蛋白酶二聚体活性中心的结构水分子，合成了一系列的环脲抑制剂。这类抑制剂引入脲基，不但加强了水溶性，而且具有较高的选择性。此外，它们还有分子量低、生物利用度好等优点。芳香基脲类同时包含氢键受体和给体，而氢键受体和给体的同时存在能够增加底物与靶点的作用机会，因而可能提高底物与蛋白靶点的结合度，达到增加底物活性的作用，已被广泛证明具有多种生理活性，最近受到很多关注。同时脲类化合物被报道有抗肿瘤活性。药理学实验证明，脲类化合物对于人体肺癌、人体肾癌、人体结肠癌、人体肝癌、人体胃癌、人体乳腺癌都具有良好的抗肿瘤效果。例如：索拉非尼是一种新颖的双芳基尿素类口服多激酶抑制剂，临床上使用的是其甲苯磺酸盐，它具有双重抗肿瘤作用，其结构式如下：

索拉菲尼

最近，脲类衍生物作为各种酶抑制剂被报道，这其中包括HIV-1蛋白酶抑制剂、p38丝裂原活化蛋白(p38MAP)激酶抑制剂、酪氨酸激酶(PTK)抑制剂、RAF激酶抑制剂、NPYY5受体抑制剂、P13K/AKT信号途径抑制剂、香草素亚型1(VR1)受体等。

因此，充分发掘脲类化合物的药用价值，尤其是作为新的、克服耐药性的HIV-1蛋白酶抑制剂是非常有意义的。

发明内容

本发明提供一类芳香基脲类化合物，这些化合物具有有效抑制HIV-1蛋白酶活性的作用，可以作为HIV-1蛋白酶抑制剂。

本发明的技术方案如下：

一种式(1)所示的芳香基脲类化合物，其结构式为：

式(1)

其中，

m是0-5的整数；

R1各自独立选自卤素，C1-4烷基，C2-4烯基，C2-4炔基，卤代C1-4烷基，卤代C2-4烯基，卤代C2-4炔基，C1-4烷基-O-，C1-4烷基-S-，羟基，硝基；

R2是单环或双环的5-10元芳基或杂芳基，所述杂芳基任选含有一个或多个选自N、O或S的杂原子；所述芳基、杂芳基任选被一个或多个以下基团所取代：C1-4烷基，C2-4烯基，C2-4炔基，卤代C1-4烷基，卤代C2-4烯基，卤代C2-4炔基，C1-4烷基-C(＝O)-，C1-4烷基-S(＝O)-，C6-10芳基-C(＝O)-，C6-10杂芳基-C(＝O)-，羟基，硝基；

并且，式(1)化合物不是以下化合物

本发明优选的技术方案为：

一种式(1)所示的芳香基脲类化合物，结构式如上所述，

其中，

m是0-5的整数；

R1各自独立选自卤素，C1-4烷基，卤代C1-4烷基，C1-4烷基-O-，C1-4烷基-S-，羟基，硝基；

R2是单环或双环的6-9元芳基或杂芳基，所述杂芳基任选含有一个或多个选自N、O或S的杂原子；所述芳基、杂芳基任选被一个或多个以下基团所取代：C1-4烷基，C2-4烯基，C2-4炔基，卤代C1-4烷基，C6-10芳基-CO-，C6-10杂芳基-C(＝O)-，羟基，硝基；

并且，式(1)化合物不是以下化合物

本发明进一步优选的技术方案为：

一种式(1)所示的芳香基脲类化合物，结构式如上所述，

其中，

m是0、1、2；

R1各自独立选自氟，氯，溴，甲基，乙基，正丙基，异丙基，三氟甲基，2，2，2-三氟乙基，甲氧基，乙氧基，甲巯基，硝基；

R2是苯基、吡啶基、吡嗪基、1H-吲唑基，苯并噻唑基；上述基团任选被一个或多个以下基团所取代：甲基，乙基，乙烯基，乙炔基，三氟甲基，苯甲酰基；

并且，式(1)化合物不是以下化合物

本发明最优选的技术方案为：

一种式(1)所示的芳香基脲类化合物，其为以下化合物：

本发明还提供以下技术方案：

式(1)化合物用于制备HIV-1蛋白酶抑制剂的用途。

式(1)化合物在制备用于治疗由HIV-1蛋白酶介导的疾病的药物中的用途。

一种HIV-1蛋白酶抑制剂，其包含式(1)化合物作为活性成分和药用载体。

一种用于治疗由HIV-1蛋白酶介导的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含式(1)化合物作为活性成分和药用载体。

一种用于治疗AIDS的药物组合物，所述药物组合物包含式(1)化合物作为活性成分和药用载体。

在本发明的技术方案中，

m是0、1、2、3、4、5；

卤素包括氟、氯、溴、碘；

C1-4烷基是指直链或支链的含有1、2、3或4个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等；

C2-4烯基是指直链或支链的含有2、3或4个碳原子的烯基，例如乙烯基，丙烯基，烯丙基，2-正丁烯基，3-正丁烯基等；

C2-4炔基是指直链或支链的含有2、3或4个碳原子的炔基，例如乙炔基，丙炔基等；

芳基是指单环或双环的5-10元芳基，例如苯基，萘基等；

杂芳基是指单环或双环的5-10元杂芳基，优选6-9元；任选含有一个或多个选自N、O、S的杂原子，优选还有1或2个杂原子；例如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吲哚基、异吲哚基、1H-吲唑基、3H-吲唑基、苯并噻唑基、苯并恶唑基等。

附图说明

图1：实施例2化合物剩余活性值与化合物浓度的对数值的曲线图

图2：实施例3化合物剩余活性值与化合物浓度的对数值的曲线图

图3：实施例4化合物剩余活性值与化合物浓度的对数值的曲线图

图4：实施例5化合物剩余活性值与化合物浓度的对数值的曲线图

图5：实施例7化合物剩余活性值与化合物浓度的对数值的曲线图

具体实施方式

实例1

N-(3-甲氧基苯基)-N’-(4-甲基吡啶-2-基)脲

合成步骤：

1、将溶于20ml二氯甲烷的三光气(10mmol)逐滴加入溶于20ml二氯甲烷的间甲氧基苯胺(10mmol)中，然后逐滴加入溶于10ml二氯甲烷的三乙胺(3ml)。

2、溶液转移至旋转蒸发仪中，所得残渣溶于20ml二氯甲烷中，加入溶于20ml二氯甲烷的2-氨基-4-甲基吡啶(10mmol)，混合物回流30min。

3、溶液转移至旋转蒸发仪中，所得残渣用30ml丙酮溶解，并加入30ml水，沉淀物抽滤，用水-丙酮(1∶1，4×5ml)洗涤，得到产物。

收率为89％。白色粉末，M.p.138℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，δinppm)：10.63(s，1H)，9.37(s，1H)，8.15(d，J＝5.4Hz，1H)，7.31(s，1H)，7.27(t，J＝2.4Hz，1H)，7.22(t，J＝7.8Hz，1H)，7.01(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)，6.86(d，J＝4.8Hz，1H)，6.61(m，1H)，3.76(s，3H)，2.30(s，3H)；ESI-MS m/z：258.16([M+H⁺])。

实例2

N-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-N’-(吡嗪-2-基)脲

实验步骤同实施例1。收率为88％。白色粉末，M.p.226-227℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：10.00(s，1H)，9.70(s，1H)，9.02(d，J＝1.2Hz，1H)，8.33(m，1H)，8.28(d，J＝2.4Hz，1H)，8.12(d，J＝2.4Hz，1H)，7.71(dd，J＝2.4，8.8Hz，1H)，7.64(d，J＝8.8Hz，1H)；ESI-MS m/z 317.08([M+H⁺])。

实例3

N-(4-溴苯基)-N’-(吡嗪-2-基)脲

实验步骤同实施例1。收率为86％。白色粉末，M.p.225-227℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：10.50(s，1H)，9.07(s，1H)，8.87(s，1H)，8.33(m，1H)，8.28(d，J＝3Hz，1H)，8.05(t，J＝1.8Hz，1H)，7.55(m，1H)，7.26(m，2H)；ESI-MS m/z 293.03([M+H⁺])。

实例4

N-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-N’-(1H-吲唑-6-基)脲

实验步骤同实施例1。收率为86％。白色粉末，M.p.330-331℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：13.02(s，1H)，8.53(s，1H)，8.29(s，1H)，8.21(s，1H)，8.04(m，1H)，8.01(d，J＝1.2Hz，1H)，7.78(dd，J＝2.4，8.4Hz，1H)，7.55(m，2H)，7.44(m，1H)；ESI-MS m/z 355.07([M+H⁺])。

实例5

N-(4-溴苯基)-N’-(4-苯甲酰基苯基)脲

实验步骤同实施例1。收率为82％。粉红色粉末，M.p.221-222℃。¹HNMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：8.66(s，1H)，8.47(s，1H)，7.98(t，J＝2Hz，1H)，7.77(m，6H)，7.66(m，1H)，7.57(m，2H)，7.44(m，1H)，7.22(m，2H)，ESI-MSm/z 395.08([M+H⁺])。

实例6

N-(4-溴苯基)-N’-(苯并噻唑-2-基)脲

实验步骤同实施例1。收率为82％。白色粉末，M.p.318-319℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：10.28(s，1H)，9.35(s，1H)，8.05(t，J＝2.4Hz，1H)，7.91(d，J＝7.8Hz，1H)，7.70(d，J＝7.8Hz，1H)，7.55(m，1H)，7.43(m，1H)，7.30(m，3H)，ESI-MS m/z 348.02([M+H⁺])。

实例7

N-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-N’-(3-乙炔基苯基)脲

实验步骤同实施例1。收率为89％。棕色液体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：9.07(s，1H)，8.99(s，1H)，8.16(d，J＝3Hz，1H)，8.08(s，1H)，7.76(dd，J＝2.4，8.4Hz，1H)，7.71(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)，7.50(m，2H)，7.32(d，J＝7.8Hz，1H)；ESI-MS m/z 339.07([M+H⁺])。

实例8

N-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-N’-(苯并噻吩-2-基)脲

实验步骤同实施例1。收率为85％。白色粉末，M.p.298-299℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：9.83(s，1H)，9.48(s，1H)，8.18(s，1H)，7.89(d，J＝7.8Hz，1H)，7.81(d，J＝8.4Hz，1H)，7.66(d，J＝8.4Hz，1H)，7.62(d，J＝7.8Hz，1H)，7.41(t，J＝7.8Hz，1H)，7.26(t，J＝7.8Hz，1H)；ESI-MS m/z 372.11([M+H⁺])。

实例9

N-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-N’-(3-三氟甲基苯基)脲

实验步骤同实施例1。收率为90％。无色液体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，δin ppm)：9.30(s，1H)，9.04(s，1H)，8.11(m，1H)，7.65(m，3H)，7.44(m，1H)，7.32(t，J＝8.4Hz，1H)，7.12(d，J＝7.2Hz，1H)；ESI-MS m/z 383.13([M+H⁺])。

HIV-1蛋白酶抑制活性实验

HIV-1蛋白酶抑制活性检测方法如下：

利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)技术测定针对HIV-1蛋白酶的抑制剂的活性，根据HIV-1蛋白酶识别位点设计底物：MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp，当抑制剂对HIV-1蛋白酶没有作用时，HIV-1蛋白酶可以切割底物，淬灭基团(Dnp)远离荧光基团(MCA)，荧光基团吸收320nm波长，激发出405nm的波长，通过检测器检测荧光强度，如果抑制剂对HIV-1蛋白酶有作用，淬灭基团不会被切去，荧光基团吸收320nm的波后一部分能量会转移给淬灭基团，405nm的激发波强度就会减弱，以此来检测抑制剂对HIV-1蛋白酶的抑制效果。根据待测化合物存在或不存在时的荧光强度变化，可以计算化合物对蛋白酶活性的抑制程度或剩余活性，从而完成对蛋白酶抑制剂的初步筛选。具体计算方法是，酶促反应中，根据反映过程产物的生成量(即荧光强度)与反应时间的曲线，曲线的斜率表示单位时间内产物生成量的变化，所以曲线上任何一点的斜率就是该相应时间的反应速率，在底物消耗小于10％(反应开始很短的时间内)范围内，曲线斜率为酶反应的初速率(V0)，有不同抑制剂存在时，酶的反应初速率(Vi)会有不同程度的下降，酶的剩余活性(Vi/V0)低于10％，为阳性结果。本实验利用荧光淬灭的方法来排除假阳性，反应体系加入蛋白酶和底物反应一段时间，荧光值达到最大值Qmax，加入抑制剂后检测荧光值Qave的变化，荧光淬灭率Qi((Qmax-Qave)/Qmax)高于20％为假阳性。利用该方法可以在短时间内完成对大量样品的筛选工作。该模型也可以用于已知有抗HIV-1活性的物质，以检验其作用位点是否是蛋白酶。

测试优选的实施例1-9中的化合物的IC₅₀值，具体方法为：

测试所用的淬灭荧光底物肽为MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp，HIV-1蛋白酶与淬灭荧光底物肽混合保温会使底物肽中的Tyr-Pro键特异性的断裂，同时荧光强度与底物水解的程度存在一个时间依赖的线性增强关系。测量在96孔板上进行，利用微孔板荧光光度计进行检测(Thermo Scientific Fluoroskan Ascent FL)，激发和发射波长分别为340nm和396nm。

将实施例中的化合物配制成高浓度溶液(一般为100mM)，然后进行1/2浓度梯度稀释成系列浓度溶液，一般测定12个浓度下活性，所有的负对照组在37℃下进行，保温溶液组成为HIV-1蛋白酶检测缓冲溶液(20mM醋酸钠，pH＝5.2，1M氯化钠，1mM二硫苏糖醇及1mM乙二胺四乙酸)、20μM底物肽和500nM HIV-1蛋白酶。所有的实验组在37℃下进行，含有20μM底物肽的蛋白酶检测缓冲溶液中，混入1μL化合物溶液(使用二甲基亚砜做溶剂)，最后再加入500nM HIV-1蛋白酶。整个混合物(100μ1)在加入HIV-1蛋白酶之前，至少提前保温10分钟。一分钟后测试初始速率。初始速度V0可以近似为反应时间与荧光强度线性关系的斜率。每个被测试化合物的浓度都计算出Vi/V0，即HIV-1蛋白酶的剩余活性。当剩余活性低于10％，这个化合物是一个好的结果。IC₅₀值通过GraphPad Prism 5软件计算得到，即，利用软件GraphPad Prism 5软件分析作出剩余活性值与化合物浓度的对数值的曲线，计算出IC₅₀(半数抑制浓度)值，部分化合物的曲线图如附图1-5所示。

表1示出实施例中化合物的活性测定结果。其中剩余活性的测量浓度为1mM。

实施例的化合物的活性测定结果

以上实验数据证明了式(1)化合物具有良好的HIV-1蛋白酶抑制活性，可以用作HIV-1蛋白酶抑制剂，用于治疗相关疾病，具有非常大的开发价值。

Claims

1.一种式(1)所示的芳香基脲类化合物，其结构式为：

式(1)

其中，

m是0-5的整数；

并且，式(1)化合物不是以下化合物

2.根据权利要求1的式(1)化合物，其特征在于：

其他如权利要求1中所定义。

3.根据权利要求1或2的式(1)化合物，其特征在于：

R1各自独立选自氟，氯，溴，甲基，乙基，正丙基，异丙基，三氟甲基，2，2，2-三氟乙基，甲氧基，乙氧基，甲巯基，硝基。

4.根据权利要求1或2的式(1)化合物，其特征在于：

R2是苯基、吡啶基、吡嗪基、1H-吲唑基，苯并噻唑基；上述基团任选被一个或多个以下基团所取代：甲基，乙基，乙烯基，乙炔基，三氟甲基，苯甲酰基。

5.根据权利要求1或2的式(1)化合物，其特征在于：

m是0、1或2。

6.根据权利要求1或2的式(1)化合物，其特征在于是以下化合物：

7.式(1)化合物用于制备HIV-1蛋白酶抑制剂的用途，所述式(1)化合物的结构式为：

式(1)

其中，

m是0-5的整数；

R2是单环或双环的5-10元芳基或杂芳基，所述杂芳基任选含有一个或多个选自N、O或S的杂原子；所述芳基、杂芳基任选被一个或多个以下基团所取代：C1-4烷基，C2-4烯基，C2-4炔基，卤代C1-4烷基，卤代C2-4烯基，卤代C2-4炔基，C1-4烷基-C(＝O)-，C1-4烷基-S(＝O)-，C6-10芳基-C(＝O)-，C6-10杂芳基-C(＝O)-，羟基，硝基。

8.式(1)化合物在制备用于治疗由HIV-1蛋白酶介导的疾病的药物中的用途，所述式(1)化合物如权利要求7中所定义。

9.根据权利要求8的用途，其特征在于：所述疾病是AIDS。

10.一种HIV-1蛋白酶抑制剂，其包含式(1)化合物作为活性成分和药用载体，所述式(1)化合物如权利要求7中所定义。

11.一种用于治疗由HIV-1蛋白酶介导的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含式(1)化合物作为活性成分和药用载体，所述式(1)化合物如权利要求7中所定义。

12.根据权利要求10的药物组合物，其特征在于：所述疾病是AIDS。