CN1656237A - 衣壳蛋白的抗病毒抑制 - Google Patents

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Abstract

提供了评价待测化合物的抗病毒活性的方法。这些方法的其它方面涉及HIV－1的逆转录病毒衣壳蛋白。另一方面，提供了用一种化合物降低与AIDS相关的死亡率的方法，该化合物能够结合靠近HIV－1衣壳蛋白N端结构域之C端的顶端裂隙。描述了CAP－1、CAP－2、CAP－3、CAP－4、CAP－5、CAP－6和CAP－7的衍生物，它们能够结合至HIV－1衣壳蛋白N端结构域的顶端裂隙，并抑制核心颗粒的适当装配。

Description

衣壳蛋白的抗病毒抑制
相关申请的交叉引用
本申请要求2002年4月22日提交的美国临时申请号60/374,557、2002年4月25日提交的美国临时申请号60/375,852和2002年8月16日提交的美国临时申请号60/404,043的优先权。
政府许可权
美国政府拥有本发明的费用付清的许可，以及在有限的情况下要求本专利拥有者根据国立卫生研究院授予的授权号AI30917的条款规定的合理期限内许可其他人使用的权利。
发明领域
本发明涉及获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的治疗。具体而言，本发明涉及通过1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)衣壳蛋白的抑制治疗AIDS。
发明背景
病毒是只能在适当宿主细胞中复制的非细胞传染物。病毒一般比细菌小，能够感染动物、植物或细菌细胞。许多病毒是重要的病原体。传染性颗粒(病毒体)由核酸核心以及有时还有的外包膜组成，该核心围绕着蛋白质衣壳。
逆转录病毒是感染动物的有包膜单链RNA病毒。该家族由以三组组成：泡沫病毒，如人泡沫病毒；慢病毒，如1型和2型人免疫缺陷病毒，以及绵羊髓鞘脱落病毒；和肿瘤病毒。
逆转录病毒颗粒由两个相同的RNA分子组成。每个基因组都是正义、单链RNA分子，其5’端加帽，3’尾处聚腺苷酸化。原型C型肿瘤病毒RNA基因组含有三个开放阅读框，称为gag、pol和env，其边界为含有病毒基因表达必需的信号之区域。gag区编码病毒衣壳的结构蛋白。pol区编码病毒蛋白酶以及用来加工基因组的蛋白质，包括逆转录酶、核糖核酸酶H和内切核酸酶酶活性。env区确定病毒包膜的糖蛋白。除了这三个开放阅读框之外，慢病毒和泡沫病毒的更复杂的基因组还携带其它一些开放阅读框，它们编码与基因组表达控制有关的调节蛋白。
病毒与逆转录病毒的衣壳蛋白之间有实质上的同源性。本领域技术人员通过搜索任何标准生物技术搜索引擎，能够容易地确定这些同源性。
AIDS是一种逆转录病毒疾病，其特征在于导致机会性感染、继发肿瘤和神经表现的深度免疫抑制。这种现代瘟疫的严重性确实是惊人的。在美国，AIDS是25-44岁男性死亡的首要原因，是该年龄组女性死亡的第三位原因。尽管最早在美国发现并报道，但是现在全世界超过193个国家已经有报道。在非洲和亚洲，HIV感染人群庞大且快速增长。在有利于交换含有病毒或病毒感染细胞的血液或体液的条件下发生HIV的传播。因此，三个主要的传播途径是性接触、肠胃外接种和感染的母亲将病毒传给她们的婴儿。由于AIDS具有几乎相同的致死后果，因此寻找对该疾病的有效治疗仍然是一个严重的医学问题。
几乎不用怀疑AIDS是由HIV引起的，HIV是一种非转化人逆转录病毒，属于慢病毒家族。O′Brien等人，HIV导致AIDS：遵循柯赫氏法则，Curr Opin Immunol 8：613(1996)。已经从AIDS患者中分离出两种遗传学不同但是相关的HIV形式，称为HIV-1和HIV-2。HIV-1是美国、欧洲和中非最常见的与AIDS有关的类型，而HIV-2主要在西非引起类似的疾病。
与大多数逆转录病毒类似，HIV-1病毒体呈球形，含有一个电子致密的圆锥形核心，其围绕着由宿主细胞膜衍生的脂质包膜。病毒核心含有(1)主要衣壳蛋白p24(CA)，(2)核壳蛋白p7/p9，(3)两个拷贝的基因组RNA，和(4)三种病毒酶(蛋白酶(PR)、逆转录酶(RT)和整合酶)。病毒核心围绕着一种被称为p17的基质蛋白，该蛋白位于病毒体包膜之下。散布于病毒包膜上的是两种病毒糖蛋白，gp 120和gp 41，它们对于细胞感染HIV至关重要。
对于其它逆转录病毒，HIV原病毒基因组含有gag、pol和env基因，它们编码不同的病毒蛋白质。gag和pol基因的产物最初被翻译为大的前体蛋白，该蛋白质必须被病毒蛋白酶切割，产生成熟蛋白质。
CA最早合成，作为55kDa Gag前体多蛋白内的一个结构域。约4,000个拷贝的Gag在质膜处装配，芽生形成不成熟的病毒颗粒。芽生后，Gag的蛋白水解切割释放CA，触发可促进衣壳颗粒装配的构象改变。Gitti等人，HIV-1衣壳蛋白的氨基端核心结构域的结构，Science，273：231-35(1996)；von Schwedler等人，HIV-1衣壳蛋白氨基端的蛋白水解折叠促进病毒核心装配，EMBO J.，17：1555-68(1998)；Gross等人，人免疫缺陷病毒衣壳蛋白的N端延伸将体外装配表型由管形转变为球形颗粒，J.Virol.，72：4798-4810(1998)。两个拷贝的病毒基因组和传染性所需的酶被包装于成熟病毒体的中心圆锥形衣壳中。
最近的几项研究表明，适当的衣壳装配对于病毒的传染性至关重要。抑制装配的CA突变是致死性的，改变衣壳稳定性的突变可严重削弱复制，使CA成为一个有吸引力的潜在抗病毒靶标。Tang等人，显示异常核心形态学的1型人免疫缺陷病毒N端衣壳突变体在感染细胞中逆转录开始时即被阻断，J.Virol.75：9357-66(2001)；Reicin等人，Gag在1型人免疫缺陷病毒病毒体形态发生和病毒生命周期早期阶段中的作用，J.Virol.，70：8645-52(1996)；和Forshey等人，具有最佳稳定性的1型人免疫缺陷病毒核心的形成对于病毒复制至关重要，J.Virol.76：5667-5677(2002)。
尽管已经开发了可与微小RNA病毒的衣壳蛋白结合并且通过抑制衣壳的解装配抑制传染性的抗病毒剂，Smith等人，人鼻病毒14对于抑制脱壳的抗病毒剂的附着位点，Science，233：1286-93(1986)，但是HIV衣壳装配或解装配的抑制剂尚未鉴定。当前可用的治疗HIV感染的药物集中于RT和PR酶，它们是病毒基因组编码的15种蛋白质中的两种。当这些药物独立施用时，由于在不完全病毒抑制条件下选择的抗性株迅速出现，这些药物基本无效。Richman，D.D.，HIV的化学治疗，Nature410：995-1001(2001)。尽管在以适当组合使用抑制剂时病毒载量持续减少(非常有效的抗逆转录病毒治疗，HAART)，Richman，D.D.，HIV的化学治疗，Nature 410：995-1001(2001)；Pillay等人，对批准的抗逆转录病毒药物的耐药性的发生率和影响，Rev Med Virol，10：231-53(2000)，但是顺应性较差、耐药性以及与其它药物或饮食相互作用所致的不充分抑制是限制HAART治疗对许多患者的有效性的一个重要问题，能够导致耐药株的扩散。Mansky等人，药物与耐药性逆转录酶的组合使1型人免疫缺陷病毒突变体频率倍增，J.Virol.，76：9253-59(2002)；Coffin，J.，体内HIV群体动力学：基因变异、发病机理和治疗的意义，Science，267：483-89(1995)；Kuritzkes，D.R.，耐药性在HIV-1感染中的临床意义，AIDS，10：S27-33(1996)。
尽管可以采用HAART治疗，但是与AIDS有关的死亡率和发病率仍然很严重，并且现有的治疗不能解决。这就需要能够减少或改善不利事件并且改善AIDS临床后果(包括，例如：降低死亡率，改善罹患该疾病的患者的生活质量)的新的治疗化合物和方法。
发明概述
本发明提供评价待测化合物的抗病毒活性的新方法。该方法包括：(a)使一种待测化合物接触Gag283或其片段，(b)检测待测化合物结合于靠近衣壳蛋白N端结构域之C端的顶端裂隙的能力，和(c)评价待测化合物的抗病毒作用。衣壳蛋白可以是病毒衣壳蛋白或逆转录病毒衣壳蛋白。逆转录病毒衣壳蛋白包括但不限于HIV-1和HIV-2。衣壳蛋白可以是未成熟的或成熟的。另外，抗病毒作用包括但不限于病毒成熟过程中衣壳装配的抑制和传染过程中解装配的抑制。
本发明还提供一种降低与AIDS有关的死亡率的方法。该方法包括对AIDS患者施用治疗有效量的化合物，该化合物能够结合于靠近HIV衣壳蛋白N端结构域之C端的顶端裂隙。本发明的化合物包括但不限于：N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙酰胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N’-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
本发明还提供一种治疗AIDS患者的方法。该方法包括以有效减少与AIDS有关的发病数量和严重性的量施用化合物，其能够结合于靠近HIV衣壳蛋白N端结构域之C端的顶端裂隙。本发明的化合物包括但不限于：N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙酰胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N’-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
本发明还提供一种评价待测化合物抑制Gag283形成β-发夹的能力的方法。该方法包括：(a)使一种待测化合物接触Gag283或其片段，和(b)检测该化合物干扰Gag283的β-发夹形成的能力。
本发明还提供一种根据抑制Gag283的β-发夹形成的能力筛选待测化合物的方法。该方法包括：(a)使待测化合物接触Gag283或其片段，和(b)检测该化合物干扰Gag283的β-发夹形成的能力。
本发明还提供一种根据抑制Gag283的β-发夹形成的能力鉴定待测化合物的方法。该方法包括：(a)利用Gag283分子坐标产生Gag283的3D计算机模型，和(b)利用该模型鉴定可与Gag283结合的待测化合物。
本发明还提供一种方法，用于鉴定可结合于靠近衣壳蛋白N端结构域之C端的顶端裂隙的待测化合物。该方法包括：(a)利用Gag283分子坐标产生Gag283的3D计算机模型，和(b)利用该模型鉴定可结合顶端裂隙的待测化合物。该衣壳蛋白可以是病毒衣壳蛋白或逆转录病毒衣壳蛋白。逆转录病毒衣壳蛋白包括但不限于HIV-1和HIV-2。
本发明还提供具有以下所述通式I的CAP-1、CAP-2、CAP-3、CAP-4、CAP-5、CAP-6或CAP-7的任何衍生物或药学可接受的盐，它是一种抗病毒化合物，能够结合于靠近HIV-1衣壳蛋白N端结构域之C端的顶端裂隙，并抑制核心颗粒的适当装配。具体而言，本发明提供CAP-1或其相关分子的衍生物或药学可接受的盐，其含有脲基，它在一个氮上含有取代的芳香取代基，在另一个氮上含有与第二个芳基连接的柔性链(tether)。
附图简述
图1显示独立测定的Gag283的MA和CAN域的扩散张量。Dzz是指轴对称的扩散张量的主要分量。
图2是迄今为止测定的HIV-1衣壳蛋白CAN域的X射线和NMR结构的比较。
图3显示在HIV-1衣壳蛋白的顶端裂隙中停靠的CAP-1。
图4显示与CAP-1结合HIV-1衣壳蛋白的顶端裂隙有关的近程相互作用。
图5显示2H，15N-标记的Gag283样品获得的分辨率提高的1H-15N HSQC谱。
图6显示确定结构区和迁移率的NMR弛豫和化学位移数据。
图7列表显示20种最低能量Gag283构象异构体的结构统计学。
图8显示对于既不显示显著内部迁移率也不显示构象交换的残基，测定的骨架15N R2/R1值。
图9是测定的CAN与Gag283的NMR结构的比较，显示与螺旋6有关的构象差异。
图10显示螺旋6的位移和CypA结合环位置的同时改变。
图11显示对于未成熟和成熟的CAN域的骨架原子，所见的化学位移差异。
图12显示用CAP-1滴定后获得的HIV-1衣壳蛋白N端结构域的2D1H-15N HSQC谱覆盖图。
图13显示用CAP-1、CAP-2、CAP-3和CAP-4滴定后获得的HIV-1衣壳蛋白N端结构域的2D1H-15N HSQC谱覆盖图。
图14显示用CAP-5、CAP-6和CAP-7滴定后获得的HIV-1衣壳蛋白N端结构域的2D1H-15N HSQC谱覆盖图。
图15显示残基Ser 33(方形)、Val 59(菱形)和Gly 60(星形)的15N NMR化学位移滴定数据，与1∶1结合等温线拟合(Kd＝0.82±0.18mM)。
图16是浊度测定结果的图示，显示CA结合化合物对体外衣壳装配的影响。
图17是潜伏感染的U1培养物随添加的CAP-1改变的病毒传染性(菱形)、细胞生存力(正方形)和病毒产量(三角形)的图示。
图18是在感染的U1和MAGI细胞与100μM CAP-1温育72小时后获得的细胞生存力、与病毒颗粒有关的RT和CA水平和传染单位的图示。
图19显示衣壳蛋白Western印迹测定，显示游离的、Gag多蛋白和部分加工状态的细胞内和细胞外病毒CA随加入的CAP-1而改变的相对浓度。
发明详述
成熟HIV-1的CA含有一个N末端β-发夹，后者是衣壳核心颗粒形成所必需的。在病毒成熟过程中，Gag前体多蛋白的蛋白水解切割产生CA。迄今为止，高分辨率的结构研究集中于成熟病毒的蛋白质。成熟的HIV-1 CA蛋白由N末端核心(CAN)和C末端二聚体(CAC)结构域组成，它们独立折叠并且通过一个柔性接头连接。CAN核心域含有一个13残基的N末端β-发夹，该发夹被Pro1的末端NH2 +基与Asp51的侧链羧基之间的盐桥部分稳定。这些残基高度保守，除了泡沫病毒之外，可能其它所有逆转录病毒都含有类似的N末端β-发夹。诱变研究表明，β-发夹是形成HIV-1衣壳核心颗粒所需的，它可能通过直接参与分子间CA-CA相互作用起作用。
Gag的CA域也负责包装约200个拷贝的宿主蛋白质CypA(它是一种脯氨酰异构酶)和HIV-1感染性必需的一种侣伴蛋白质。尽管CypA的确切功能还不清楚，但是怀疑该蛋白质有利于感染过程中衣壳核心的解装配。
冷冻-电子显微镜(EM)法已经用来研究未成熟病毒体和病毒样颗粒中Gag多蛋白的结构。在低分辨率下，装配的Gag蛋白表现为与病毒膜结合的电子致密层。最近的许多研究表明，该电子致密层实际上由几个球形密度壳组成，包括对应于Gag蛋白MA域的直接与脂双层结合的外壳，对应于CAN和CAC域的两个壳，和对应于Gag的NC域和结合的RNA基因组的最内层的第四个壳。MA和CAN壳的厚度严格对应于折叠的结构域的长度(从N端到C端测量)(图1)。令人感兴趣的是，MA与CAN壳的间距只有40，即使本发明人曾表明，在Gag283的展开形式中，这些结构域能够相距80以上。如果MA的柔性C端螺旋度部分展开，这种间距可能更大。这表明，除柔性接头长度之外的其它因素决定了未成熟颗粒中壳的间距，证实MA和CA域形成具有明确的蛋白质-蛋白质相互作用的有序壳。
在蛋白水解成熟后，未成熟病毒体的球形CA壳浓缩形成特有的圆锥形衣壳核心颗粒。N端β-发夹是形成衣壳核心颗粒所需的。用来抑制体内β-发夹形成的突变，包括Pro 133突变为Leu和Asp 183突变为Ala，导致形成不能形成正常衣壳核心并且无传染性的病毒颗粒。另外，天然CA分子也能够装配为具有类似于天然衣壳核心的某些特征的管形，而在CA的N端添加残基，或者Asp 183突变为Ala，导致形成一种不均匀的结构混合物，这些结构通常呈球形，类似于未成熟病毒体的衣壳。β-发夹使得在与抗体片段结合的完整CA蛋白和与CypA结合的CAN域的晶体结构中存在广泛的晶格接触，提示β-发夹通过直接参与分子间CA-CA相互作用促进衣壳装配。
β-发夹在未成熟的蛋白质中是未折叠的，在Gag的蛋白水解切割之后发生β-发夹的形成，触发衣壳装配。随后能够在Pro133-NH2 +与保守Asp 183的COO-侧链之间形成的盐桥，以及在未成熟蛋白质中不存在的大量其它相互作用，能够稳定发夹的形成。所述其它的相互作用不仅包括β-链间的氢键键合和包装，而且包括发夹与CAN域其余部分之间的相互作用，包括Ile 134的骨架NH与Gly 178的羰基之间的新氢键，以及Ile 134(β-发夹)与Thr 180(螺旋3)和Ile 247与Met 250(螺旋6)的侧链之间的疏水包装。因此，衣壳装配机制与通过丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶家族进行酶激活所用的机制具有极其类似的特征，其中无活性酶原的蛋白水解切割产生一个新的N端NH3 +基，它与埋藏的羧基形成盐桥，并且激活该酶。
脱壳过程依赖于CypA的存在，HIV-1包装CypA对于传染性至关重要。含有使CypA不能结合的CA突变的病毒体能够装配并成熟，在冷冻-EM图像中显示正常。然而，尽管这些颗粒能够融合并穿入靶细胞，但是它们不能逆转录它们的基因组，表明在对于最可能在病毒成熟和膜融合后发生的复制循环的早期事件中CypA是必需的。令人感兴趣的是，不能有效包装CypA的突变病毒体在含有异常内在高浓度CypA的细胞系中具有传染性，在环孢霉素类似物存在下自发产生的回复突变体的传染性取决于这些CypA抑制剂。总之，这些发现表明，衣壳装配和解装配过程被精细调节，细胞条件中相对较小的突变或改变能够影响衣壳核心的稳定性。
以下所述的NMR数据表明，β-发夹的形成诱导螺旋-6约2的位移和CypA结合位点的同时位移。鉴于以下事实：(i)β-发夹对于衣壳装配显然至关重要，和(ii)CypA可能参与解装配，这些位点之间的构象偶联与CypA介导的脱壳相关事件有关。因此，CypA与暴露环的结合移动了螺旋-6的位置，导致β-发夹以去稳定衣壳及促进脱壳的方式去稳定或复位。NMR化学位移作图实验表明，在CypA与成熟CAN域结合后，螺旋6的骨架酰胺信号大大位移。尽管成熟CAN的β-发夹相对是可移动的，但是其位置在自由结构域的NMR结构中确定。
相反，在CypA-CAN二聚体的X射线晶体结构中，两个β-发夹中只有一个观察到确定的电子密度。X射线结构中丢失的电子密度可能因此至少部分是由于CypA的结合。此外，迄今为止检测的HIV-1 CAN域的5种X射线和NMR结构的比较也表明，根据结构研究使用的条件不同，螺旋-6的位置也可能不同(图2)。在成熟CAN：CypA复合物的高分辨率X射线结构(2.36)中，螺旋-6的骨架原子报告的温度因素通常高于其它螺旋。总之，这些数据表明，螺旋-6是相对可移动的，其位置对于CypA的结合和β-发夹的形成敏感。最后，CypA对Gag的亲和力比它对成熟衣壳蛋白的亲和力大1000倍。通过β-发夹与CypA结合位点的构象偶联能够解释亲和力的这些差异。
利用下列常用方法检测HIV-1 Gag多蛋白的N端一半(残基2-283)的三维结构。利用聚合酶链反应(PCR)由pNL4-3质粒扩增编码HIV-1 Gag前体蛋白的N端283个残基和附加的C端His6尾的DNA。用携带Gag283的质粒转化BL21 codon plus RIL细胞系(Stratagene，La Jolla，CA)。转化的细胞在M9基本培养基上生长，该培养基含有溶于H2O或99％2H2O(Martek，Columbia，MD)的15NH4Cl和/或UL-[13C]葡萄糖(CambridgeIsotope Laboratories，Andover，MA)作为唯一氮源和/或碳源。蛋白质利用钴亲和树脂(Clontech，Palo Alto，CA)一步纯化。一般而言，一升生长培养基产生20mg Gag283。其分子量通过ESI-MS证实。
用1mM蛋白质样品采集NMR数据，该样品中含有50mM pH 5.0的乙酸钠缓冲液、100mM NaCl、5mM β-巯基乙醇和1×蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem，San Diego，CA)。所有NMR研究都用装备xyz-梯度三共振探头的600 MHZ Bruker AVANCE DRX分光计进行；T＝30℃，骨架归属使用2D15N HSQC、3D恒时HNHA、HN(CO)CA、HNCO和4D15N/15N-编辑的NOESY(4DNN)数据。U-2H/15N标记的样品获得4DNN数据；Tmix＝200ms。对U-13C/15N标记的样品采集的其它NOE数据包括4D13C/15N-编辑的NOESY(Tmix＝120ms)和4D13C/13C-编辑的NOESY(Tmix＝100ms，在2H2O中记录)。NMR数据用NMRPipe处理，用NMRView分析。信号用标准归属策略归属。
NOE交叉峰根据量值分类为强、中、弱，分别用来归属2.7、3.2和5.0的距离上限。分别增加0.5、0.8、2.3、1.5补偿亮氨酸或缬氨酸的甲基、简并germinal亚甲基、简并芳基质子和非立体特异性归属的甲基的距离。根据特征性NOE模式和化学位移指数实施骨架氢键约束(H-O距离为1.8-2.7，N-O距离为2.4-3.2)，补充典型二级结构。
利用程序TALOS，通过13Cα、13Cβ、1Hα、13C和15N化学位移的分析获得骨架二面角约束。用DYANA进行的结构计算最初只用由NOE数据得出的距离约束进行。随后加入氢键和二面角约束，进一步使目标函数最小化。用Procheck-NMR评价产生的结构的质量。用Chimera和MolScript获得并用Raster 3D提供图像。
15N弛豫数据是在上述条件下制备的U-2H/15N标记的Gag283样品的数据。骨架15N核的{1H}-15N稳态异核NOE(XNOE)用反向检测的水flip-back脉冲序列测定。通过以交错模式和不同的延迟采集8个二维谱，确定纵向弛豫率R1和横向弛豫率R2。15N T1(＝1/R1)的8个延迟是10.04、120.49、512.09、763.12、1004.11、1506.16、2008.21、2510.26ms，15N T2(＝1/R2)的延迟是21.10、36.70、52.30、67.89、83.49、99.09、114.69、130.29ms；回复延迟为4s。
由质子饱和下(I)与没有质子饱和下(I0)的15N/1H相关峰的强度比(I/I0)得出指定残基的XNOE值。由基线噪声估计误差。使用商业软件Orgin 6.0(microcal，Northampton，MA)，通过将8个谱的峰强度与两参数(R2)或三参数指数(R1)衰减相拟合，获得每个良好解析的峰的弛豫率。在弛豫数据的填充过程中计算报告的误差。根据旋转扩散计算排除了显示ps-ns级显著内部运动(XNOE＜0.70)或μs-ms级化学交换的NH基(R2显著提高，而R1不提高)，其余的弛豫数据用Quadric Diffusion1.12(A.G.Palmer，Columbia University)分析。
Gag283的NMR化学位移归属已经被BioMagResBank(http：//bmrb.wisc.edu)保藏，保藏号为5316。具有最低目标函数的20种构象异构体的坐标，和有关的约束列表，保藏于蛋白质数据库(Protein Data Bank)(http：//www.rcsb.org/pdb)，保藏号为1L6N。成熟CAN域的优化结构的约束列表和坐标也已经保藏，保藏号为(1GWP)。
HIV-1 Gag多蛋白的N端一半(残基2-283)的三维结构显示，有一个表面裂隙暴露于未成熟蛋白质的CA域上，但是在蛋白水解成熟后被CA蛋白的N端β-发夹的残基填充。与β-发夹裂隙结合的化合物抑制病毒的成熟并且具有抗病毒活性。
进一步的研究揭示，靠近CA的N端结构域的C端有另外一个结合位点(顶端裂隙)。与β-发夹口袋不同，该顶端裂隙在CA的N端结构域的成熟和未成熟形式上均存在。可结合该顶端裂隙的化合物抑制衣壳装配，并且具有抗病毒特性。其骨架酰胺信号被抑制剂结合顶端裂隙最明显地干扰的CA的残基在HIV序列概要的93个基因组序列中严格保守(Glu 35，Val 36，Val 59，Gly 60，His 62，Gln 63，Ala 65，Tyr 145)或者极少且保守地置换(括号中为发生数：E29D(2)，K30R(1)，A31G(16)，A31N(1)，F32L(1)，SeeN(13)，G61E(1)，M144T(1))。大多数保守残基都暴露于N端结构域的表面上，提示具有可能的大分子相互作用功能。N端结构域的顶端裂隙的残基参与体外衣壳形成后的分子间CA(N末端结构域)-CA(C末端结构域)界面。这与此处所述的其它公开内容一起，提供了抑制剂化合物通过抑制适当衣壳装配所需的分子间CA-CA相互作用机械作用的有力证据。
残基Trp 23和Val 59在抑制剂配体结合后显示显著的化学位移改变，但是事实是它们埋藏于CA单体的螺旋1、2、3之间。因此，装配抑制剂可能改变衣壳蛋白的局部结构，从而可能竞争性抑制CA-CA相互作用，或者促进结构扭曲的衣壳的形成。
衣壳装配的抑制不需要具有极高CA亲和力的配体。这可能是由于装配的病毒体中局部高浓度的Gag分子(14mM)，这有利于被具有适度亲和力的配体结合，例如N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)。因此保守地假设，芽生病毒和细胞中胞质药物浓度相等(100μM)，与CA结合的病毒CAP-1分子的百分比可以通过标准质量作用计算来估计，获得结合的CAP-1([CA：CAP-1])的浓度值为94μM。这表明在未成熟的病毒体中有94％的CAP-1分子(100μM剂量)与Gag结合，少到与每个病毒体约25个分子结合即足以抑制病毒成熟过程中的核心装配。
图3显示停靠在衣壳蛋白结构中的小分子配体CAP-1。利用实验测定的衣壳蛋白的NMR结构产生Connoly表面。该配体的网架(wireframe)模型用绿色表示。配体结构用适当的从头开始的方法最小化。衣壳结构用颜色显示疏水性(蓝色，疏水性最强；红色，亲水性最强；白色，中度疏水性)。
图4显示了实验确定的重要的相互作用。值得注意的是Tyr 145的芳环与CAP-1的呋喃间的相互作用；CAP-1的芳环的氯与Ile 37的疏水侧链间的相互作用；该分子的二硫成分中的硫与Ser 146的羟基的相互作用；Ser 33的羟基侧链与CAP1呋喃5-位点上的二甲基氨甲基取代基的氮之间的相互作用。
其它一些脲，包括本发明描述的所有脲，通过实验确定具有功能上极其类似的与衣壳蛋白的相互作用。根据以下图13-14所示的二维NMR数据，这是显而易见的。
在配体CAP-1及其结构同源物的存在下通过检查衣壳蛋白的多维NMR谱获得的数据证实存在可能高亲和力的配体结合位点。意外地发现了多种特异性且选择性的相互作用，这不仅证明了这个位点的存在，而且有助于建议如何为该位点设计极高亲和力的配体。
发现配体需要有几个结构特征。在分子的一侧含有取代的苯基或另一个芳基是必要的，其含有相对较大的取代基。在这种情况下，氯原子可用于此目的。然而，实验数据与模型拟合结合起来，提示使用Br原子或I原子可以提高结合亲和力。该芳环上的其它取代基未清楚地指出其位置，但是按照我们的观点，在卤素的邻位含有取代基，如氰基或二烷基氨基，将对结合位点模型有积极作用。3，4-二氯苯基或3-氯-4-溴苯基部分也能够起作用。
CAP-1中硫原子的相对位置非常重要。在该体系中使用不同氧化态的硫可能不会产生活性。砜或磺胺是这样。呋喃能够被侧链上含有不同取代基的多种杂环基团同样地替换。除了二甲基氨甲基之外，该基团被替换为如胍、N-氰基胍、N-硝基胍等的基团可能产生活性化合物。
对胞质Gag有较高亲和力的化合物在装配的病毒中浓缩，对CA有较高亲和力的化合物是更强的体外装配抑制剂。因此，能够合理地设计效能提高的药物作为HIV-1衣壳装配的抗病毒抑制剂。
也公开了CAP-1、CAP-2、CAP-3、CAP-4、CAP-5、CAP-6或CAP-7的衍生物，它们是抗病毒化合物，可以结合HIV-1衣壳蛋白N端结构域的顶端部位，并且抑制核心颗粒的适当装配。具体而言，本发明提供CAP-1或其相关分子的衍生物，它们含有脲基，在一个氮上含有一个取代的芳族取代基，在另一个氮上含有与第二个芳基连接的柔性链。例如，这些衍生物是通式I的化合物或药学可接受的盐：
Figure A0381212400241
其中：
(a)R1代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(b)R2代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(c)R3代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(d)R4代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(e)R5代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(f)卤素只限于氟、氯、溴和碘；
(g)R8和R9独立地是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、新戊基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丁基甲基、环丁基乙基、环戊基甲基、环己基甲基或环己基乙基；
(h)字母n、m和p独立地代表1-6中的任何一个整数；
(i)R6和R7独立地选自氢或烃基，该烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多6个碳原子；
(j)X选自O或S；
(k)Y是杂环、碳环或任选取代的苯基；
(l)杂环选自任何稳定的5、6或7元单环或双环或7、8、9或10元双环杂环，它是饱和的、部分不饱和的或不饱和的(芳族)，由碳原子和1、2、3或4个独立选自N、NH、O和S的杂原子组成，包括任何双环基团，其中上述任何杂环都与苯环稠合。氮和硫杂原子任选地可以被氧化。杂环可以在任何杂原子或碳原子处以产生稳定的结构的方式与其侧基连接。如果获得的化合物稳定，此处所述的杂环可以在碳或氮原子上被取代。如果特别指出，杂环中的氮任选地可以被季铵化。优选地，当杂环中S和O原子的总数超过1时，这些杂原子不彼此相邻。此处所用的术语“芳族杂环系统”是指一种稳定的5-7元单环或双环或7-10元双环杂环芳环，它由碳原子和1-4个独立选自N、O、S的杂原子组成。杂环的例子包括但不限于：1H-吲唑、2-吡咯烷基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、2H-吡咯基、3H-吲哚基、4-哌啶酮基、4aH-咔唑、4H-喹嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、吖啶基、吖辛因基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并苯硫基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、benzimidazalonyl、咔唑基、4aH-咔唑基、β-咔啉基、苯并二氢吡喃基、苯并吡喃基、噌啉基、十氢喹啉基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、二氢呋喃[2，3-b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、假吲哚基(indolenyl)、二氢吲哚基、中氮茚基、吲哚基、异苯并呋喃基、异苯并二氢吡喃基、异吲唑基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基(苯并咪唑基)、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基、1，5-二氮杂萘基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1，2，3-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、噁唑烷基啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩吡嗪基、吩嗪基、吩噻嗪基、phenoxathiinyl、吩噁嗪基、2，3二氮杂萘基、哌嗪基、哌啶基、喋啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、喋啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶噁唑、吡啶咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹噁啉基、奎宁环基、咔啉基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、6H-1，2，5-噻二嗪基、1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、苯硫基、三嗪基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，2，5-三唑基、1，3，4-三唑基、四唑基和呫吨基。优选的杂环包括但不限于：吡啶基、苯硫基、呋喃基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并苯硫基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、喹啉基、异喹啉基、咪唑基、吲哚基、异吲哚基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、吡唑基(pyrrazolyl)、1，2，4-三唑基、1，2，3-三唑基、四唑基、噻唑基、噁唑基、吡嗪基和嘧啶基，和含有上述杂环的稠环和螺环化合物；
(m)碳环是指任何稳定的3、4、5、6或7元单环或双环或7、8、9、10、11、12或13元双环或三环，它们均可以是饱和的、部分不饱和的或芳族的。这些碳环的例子包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、金刚烷基、环辛基；[3.3.0]双环辛烷、[4.3.0]双环壬烷、[4.4.0]双环癸烷(萘烷)、[2.2.2]双环辛烷、芴基、苯基、萘基、2，3-二氢化茚基、金刚烷基或四氢萘基(四氢化萘)；
(n)通式II定义的取代的苯基
Figure A0381212400271
其中：
(o)R10代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(p)R11独立地代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(q)R12独立地代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(r)R13独立地代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(s)R14独立地代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(t)R8和R9独立地是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、新戊基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丁基甲基、环丁基乙基、环戊基甲基、环己甲基或环己基乙基；
(u)卤素只限于氟、氯、溴和碘。
含有可结合HIV-1衣壳蛋白顶端裂隙的化合物的治疗组合物可以全身或局部施用。全身施用途径包括口服、静脉内、肌肉内或皮下注射(包括在长效制剂(depot)内长期释放)、眼内和眼球后、鞘内、腹膜内(例如腹膜内灌洗)、使用雾化或喷雾药物的肺内或经皮途径。局部途径包括以油膏剂、滴眼剂、滴耳剂、灌洗液(例如用于伤口灌洗)或含药洗发剂的形式施用。对于含有可结合HIV-1衣壳蛋白顶端裂隙的化合物的治疗组合物，本领域技术人员根据良好的医疗实践和个体患者的临床条件，能够容易地优化其有效剂量和施用方案。
可结合HIV-1衣壳蛋白顶端裂隙的化合物的施用优选地用药物组合物实现，该组合物含有这种化合物和药学可接受的稀释剂、佐剂或载体。该化合物施用时可以不含或者含有已知的表面活性剂、其它化疗剂或已知的其它抗病毒剂。
在参看下列说明性实施例后将理解本发明的其它方面和优点。实施例1描述Gag283的总体结构和动力学。实施例2描述Gag283的MA域的结构。实施例3描述Gag283的CAN域的结构。实施例4描述CA的N端结构域上配体结合位点的鉴定。实施例5描述可结合HIV-1衣壳蛋白顶端裂隙的化合物对衣壳装配的体外抑制。实施例6描述可结合HIV-1衣壳蛋白顶端裂隙的化合物对病毒传染性的抑制。实施例7描述衣壳装配的体内抑制。
                    实施例1
            Gag283的总体结构和动力学
克隆并制备对应于HIV-1pNL4-3的283个N端残基(加一个C端六组氨酸尾)的一种32.2kD重组多肽(Gag283)进行NMR研究(Mrcalc＝32216.6道尔顿，Mrexp＝32216.1±0.8道尔顿。获得高质量的NMR谱(图5)，能够进行几乎全部的1H，15N和13C NMR信号归属。骨架原子的NMR化学位移表明它是一种高度螺旋的结构(图6)。
残基Gly 2-Ser 6、Gly 123-Val 143和Pro279-Leu 283显示相对较低的{1H}-15N异核NOE(XNOE)和T2弛豫值(图6)，以及极少或者没有中间范围的1H-1H NOE，表明这些残基的构象是不稳定的。相对稳定的残基Val 7-Thr 122和His 144-Ser 278使用总共2376个通过实验获得的约束(2046个距离约束和332个扭转角约束，相当于每个约束的残基17.7个约束)。用DYANA产生20种优化结构，其具有1.50±0.242的目标函数和良好的结构统计学(图7)。MA的残基VAL 7-Thr 122和CAN的His 144-Ser 278显示良好的收敛性，这两个螺旋的骨架重原子的配对RMS偏差分别为0.41±0.09和0.72±0.14。由于连接折叠结构域的移动残基(Gly 123-Val 143)不使用约束，在这些结构域之间未见NOE，MA和CAN域的相对方向没有确定。计算表明，当残基Gly 123-Val143完全展开时，两个结构域能够分开可达80。
获得的骨架NH基的T1/T2比表明，MA和CAN域以不同的旋转相关时间翻滚(tumble)。对于这两个结构域，不同螺旋的残基的T1/T2(＝R2/R1)比通常聚簇，表明各向异性旋转扩散(图8)。与CAN域的T1/T2比有关的误差略微大于MA域，因为CAN信号的谱线宽度较大(相应的信噪比较低)(图6)。对于CAN域的某些螺旋(特别是螺旋7)可见相对较少的聚簇，这可能是由于存在弱CAN-CAN分子间相互作用。实际上，当样品浓度由1.0mM降至0.25mM时，指定螺旋的T1/T2比的分散减少，但是平均T1/T2比基本不受影响。MA和CAN域的旋转扩散特性独立计算。用长轴对称扩散模型获得最佳统计学拟合，这使得MA和CAN域的旋转相关时间分别为10.0±0.1ns和13.2±0.2ns。扩散张量的主轴(即它周围的旋转扩散最快的轴)几乎与连接折叠结构域的N端与C端残基的载体一致(图1)。
                    实施例2
              Gag283的MA域的结构
Gag283的MA域的结构与分离的成熟蛋白质基本相同。成熟和未成熟的MA NMR结构的刚性残基的骨架重原子的重叠使得配对RMS偏差为1.27±0.005。由于在当前的NMR研究中使用更现代的方法学(即基于化学位移的约束和使用4D NMR数据)，该结构与成熟MA三聚体的X射线结构非常一致(1.14±0.09)。当从X射线结构拟合中除去三聚化后构象改变的310螺旋(Pro 66-Gly 71)后，拟合提高为0.90±0.11。1H-1HNOE数据表明，C端螺旋延伸到该结构域的球形部分以外，到达残基Thr122。然而，对于残基Ile 104-Gln 117，Cα化学位移指数逐渐从螺旋值降低为无规卷曲值，而弛豫数据同时表明逐渐从α-螺旋占优势向无规卷曲构象占优势转换(图4)。这一发现与报告的成熟MA三聚体的X射线结构数据一致，其中这些残基的电子密度在6个不同晶胞分子之间大大不同。
                        实施例3
                Gag283的CAN域的结构
Gag283的CAN域的总体结构非常类似于成熟CAN域。为了便于比较，成熟结构域也使用未成熟CAN的氨基酸编号方案(即Pro 133是成熟CAN的N端残基)。残基Ser 148-Lys 162、Ser 165-Ser 176、Thr 180-Val191、His 194-His 216、Arg 232-Ala 237、Thr 242-Thr 251、Val 258-Ser278形成7个α-螺旋(分别是螺旋1-7)，它们以扁平的三角形包装在一起，残基Pro 217-Pro 231(包含CypA结合位点)形成一个构象灵活的环。CANNMR结构的成熟和未成熟形式的螺旋残基骨架重原子的重叠使得配对RMS偏差为1.32±0.13。
相反，Gag283的残基Pro 133-Val 143的构象与成熟CAN蛋白所见大大不同。这些残基未见远程1H-1H NOE的中间值，化学位移指数数据表明它们以无规卷曲构象存在(图6)。这些残基的15N NMR弛豫特性也表明高度的构象灵活性(图6)。在成熟CAN域中，残基Pro 133-Asn 137与残基Gln 141-Gln 145配对，形成正对螺旋-6包装的β-发夹的反平行链，Pro 133的骨架NH2 +基与Asp 183的部分埋藏的侧链形成一个盐桥。另外，尽管在未成熟和成熟结构中残基His 144-Ile 147与CAN域的球形部分相互作用，但是NOE数据的差异表明存在精细但是重要的结构差异。例如，在成熟CAN域中，His 144-Hβ质子显示中等密度NOE，含有Ile247的侧链甲基质子(螺旋6)，而在成熟结构域中这些基团产生极弱的NOE。
另外，螺旋6相对于它在成熟蛋白质中的位置位移约2(图10和11)。在未成熟结构域中，为螺旋3加帽的Thr 180的侧链包装于螺旋6的Leu 243、Ile 247和Met 250的侧链形成的疏水簇内(图9)，在Thr 180与Ile 247甲基之间观察到极强的1H-1H NOE。然而，在成熟蛋白质中，Ile 134的侧链插入这个疏水口袋中，使Thr 180与Ile 247侧链分离约2，结合的残基间NOE的强度大大降低。
此外，Leu 243侧链的χ2-角有大约90度旋转的不同，Met 250的甲基在未成熟结构域中重新定向，使其部分填充成熟结构域的Ile 134侧链占据的空间(图9)。螺旋6也与CypA结合环接触。尽管该环是柔性的，但是NMR结构的两个总体的定性比较表明，可与CypA的活性位点结合的Pro 222相对于它在成熟CAN域中的位置移动几埃(图10)。对于残基Pro 133-Ile 147观察到显著的1H，15N和13C化学位移差异，它们在未成熟蛋白质中展开，但是在成熟结构域中形成一个β-发夹(图11)。对于可与成熟CAN域中的β-折叠相互作用的Ala 179、Thr 180、Ile 243、Ile 247、Met 250和Leu 243，也观察到显著的位移。这些位移差异与上述结构变化完全一致。
最后，对于Glu 177和Gly 178的骨架酰胺，观察到信号倍增和R2交换展宽(图5和图6)。在可能引起这些效应的这些残基附近没有大芳族侧链。而是，信号倍增是由于与Glu 177-Gly 178-Ala 179肽键有关的ψ和φ扭转角的不均一性。对于成熟蛋白质中的这些残基，未见信号倍增，其中Gly 178的羰基与β-发夹的Ile 134骨架NH形成一个氢键。
                    实施例4
        CA的N端结构域的配体结合位点的鉴定
从HIV-1cDNA质粒pNL-4-3中扩增编码CA的N端结构域的DNA(残基1-151)，向该基因上添加编码C端六组氨酸尾的寡核苷酸。该DNA插入plla表达载体(Novagen，Madison，WI)中，蛋白质产物通过钴亲和层析(Clontech，Palo Alto，CA)纯化；MWcalc＝17523.0道尔顿，MWobs＝17523.10±0.44道尔顿(电喷雾质谱法)。全长天然衣壳蛋白的质粒由Dr.W.I.Sundquist(University of Utah，Salt Lake City，UT)惠赠，蛋白质如上所述纯化。NMR谱用常规三共振法归属。1H-15N NMR HSQC滴定实验获得的结合等温线用ORIGIN 7.0软件(MicroCal，Northampton，MA)计算。
为了鉴定抑制衣壳蛋白功能的化合物，为了可能结合衣壳蛋白表面上的裂隙的化合物筛查公开的结构域化学文库，并且利用NMR滴定光谱法检测其结合。筛查实验主要集中于一个β-发夹裂隙，该裂隙暴露于未成熟衣壳蛋白的N端结构域的表面，但是被Gag蛋白水解切割后形成的β-发夹的残基所占据。来自公开结构域化学文库的化合物用DOCK-4.0筛查，通过实验检测40种具有良好理论结合特性(结合能＜-26kCal/mol，接触得分＜-40)的化合物与完整CA蛋白、CA的N端结构域和未成熟Gag多蛋白的283残基片段(Gag283)的结合。鉴定了在对于衣壳装配似乎至关重要的一个位点与衣壳蛋白结合的几种化合物。代表性化合物包括但不限于：N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙酰胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N’-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。一种化合物，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，在细胞培养中尤其良好地耐受，能够用来进行以下所述的体内抗病毒和机械研究。
成熟的N端结构域用N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)滴定。用CAP-1滴定成熟NTD后获得的代表性1H-15N HSQC NMR数据在图12中显示。尽管大多数信号不受滴定的影响，但是有一个亚组的信号随CAP-1浓度的增加而位移，表明存在位点特异性结合。
类似地，滴定可结合HIV-1衣壳蛋白N端结构域顶端裂隙的其它化合物。在图13中列出了CAP-1、CAP-2、CAP-3和CAP-4滴定后获得的1H-15N HSQC NMR数据与HIV-1衣壳NTD的重叠。化合物CAP-1和CAP-2与蛋白质的顶端位点结合，随添加的化合物而改变的特异性化学位移改变证实了这一点。在添加CAP-3和CAP-4后观察到的轻微干扰和信号展宽表明结合极弱。图14显示了在存在及不存在衣壳结合化合物CAP-5、CAP-6和CAP-7的情况下获得的1H-15N HSQC NMR数据与HIV-1衣壳NTD的重叠。结合干扰的信号用圆形表示。为了比较，图14也显示用不与衣壳蛋白结合的两种结构相关的化合物获得的结果。
化学位移改变与1∶1结合等温线拟合，在35℃下平衡解离常数(Kd)为0.182±0.18mM(图15)。对于第二种化合物，1-(4-(N-乙酰胺基)苯基)-3-(4-甲基-3-硝基苯基)脲(CAP-2)，观察到显著更紧密的结合，Kd＝52±27μM。在这两种情况下，被结合干扰的CA残基(1HNΔδ＞0.1ppm；15NΔδ＞0.5ppm；Glu 29、Lys 30、Ala 31、Phe 32、Ser 33、Glu 35、Val 36、Val 59、Gly 60、Gly 61、His 62、Gln 63、Ala 65、Met 144和Tyr 145)位于或靠近螺旋束(螺旋1、2、3、4和7)的顶端。用Gag283和完整的CA滴定获得基本相同的结果，表明在含有天然N端基质(MA)和C端衣壳(CTD)域的Gag样构建体中，结合位点仍然可及，结合对于蛋白质的成熟状态不敏感。
                    实施例5
                衣壳装配的体外抑制
浊度测定在21℃下进行，使用在350nm波长下操作的BeckmanDU650分光光度计。向含有衣壳蛋白的250μl水溶液([CA]＝60μM；[NaH2PO4]＝50mM；pH 8.0)中加入在DMSO(0.2μl)中浓缩的配体。离心除去颗粒，加入浓缩的NaCl溶液(5M，250μl)启动衣壳装配。在经过一个较短的初始延迟使样品平衡后，每10秒进行一次光谱测定。根据吸光度对时间作图的初始斜率估计相对装配率。
在不含其它病毒成分时，HIV-1CA能够装配为管状，其结构特征类似于成熟核心。管状的形成导致样品浊度升高，这能够用分光光度计监测，利用该测定探查CAP化合物对体外衣壳装配的可能的抑制作用。如图17所示，天然HIV-1CA溶解于装配缓冲液(50mM磷酸缓冲液，pH 8.0，2.5M NaCl，0.04％v/v DMSO)中使吸光度以204±36mOD/min的初始速度提高(根据初始斜率确定，报告为三次实验的平均值±标准差)。如预期的，不与CA结合的待测化合物不影响装配速度。然而，CAP-1和CAP-2使装配速度以剂量依赖的方式降低，更紧密结合的CAP-2具有更大的作用。如图16所示，在CAP-1存在下，当CAP-1∶CA比为1∶1和2∶1时，初始装配速度分别降至93±3和67±16mOD/min。为了比较，在更紧密结合的CAP-2存在下，当CAP-2∶CA比为0.5∶1和1∶1时，装配速度分别降至81±2和39±11mOD/min。这些数据证实，可与CA结合的化合物能够抑制体外衣壳装配，装配抑制的相对效能取决于配体对CA蛋白的亲和力。
                        实施例6
                    病毒传染性的抑制
为了激活HIV病毒体的产生，U1细胞(5×105细胞/ml)与TNF-α(10ng/ml，Sigma)混合，并用不同浓度的CAP-1处理。处理72小时后收获培养物。利用MTS细胞增殖测定(CellTiter 96 Aqueous One SolutionCell Proliferation Assay，Promega，Madison，WI)检测细胞的生存力。收集上清液，通过低速离心除去细胞碎片，通过微量离心沉淀上清液中的颗粒。与颗粒结合的感染单位如下所述检测：Kimpton等人，使用敏感细胞系根据整合β-半乳糖苷酶基因的激活检测复制型和假型HIV，J.Virol.66：2232-39，1992，不同之处在于利用Tropix Gal-筛选检测器系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)测定β-gal活性。与颗粒结合的RT活性如下所述测定：Huang等人，p6Gag是表达蛋白酶的全长1型人免疫缺陷病毒分子克隆产生颗粒所需的，J.Virol.，96：6810-18，1995。利用AIDS患者的血清(AIDS Research andReference Regent Program，NIAID，NIH)，对细胞裂解物和沉淀的颗粒进行SDS-PAGE分析。用HIV-1 p24抗原捕获ELISA试剂盒(AIDS疫苗计划，FCRDC/SAIC/NCI，Frederick，MD)进行定量p24(CA)测定。在病毒吸附(HIV-1RF)后用PBS洗涤MAGI细胞，添加不同浓度的含有CAP-1的新鲜培养基。感染72小时后，收获培养上清液，预先澄清。通过微量离心收集上清液中存在的病毒颗粒，随后测定颗粒结合的RT活性和传染性。
利用产生HIV-1的潜伏期感染的U1细胞检测CAP化合物的毒性和抗病毒活性。该测定允许估计对晚期复制事件的抗病毒作用。对于体内评价而言CAP-2毒性太强，但是在使用的条件下CAP-1无毒，其应用使上清液传染性剂量依赖地降低，图17。在100μMCAP-1时，U1细胞完全存活，但是传染性相对于未处理的样品降低约95％，图18和19。
为了确定CAP-1是否影响病毒基因表达和颗粒产生，测定沉淀并除去细胞后的上清液的逆转录酶(RT)活性和CA(p24)水平。如图18所示，CA水平和RT活性都不受CAP-1影响，表明抗病毒活性不是由于病毒产生的抑制。另外，在处理的和未处理的样品获得的Western数据中，发现p24(CA)水平非常相似，图19，表明CAP-1不显著影响Gag的蛋白水解加工。与这一发现一致，CAP-1不影响体外蛋白酶活性。p24 Western数据也表明Gag(p55)细胞内水平随着CAP-1水平升高而降低，而Gag切割产物p24和p41的水平仍然相对地未受影响。这些发现证实，CAP-1促进全长Gag多蛋白的细胞内降解。使用抗gp120抗体也获得上清液的gp120的定量。在处理的与未处理的样品之间未见差异，表明CAP-1不抑制包膜糖蛋白的合成或病毒掺入。
也在第二次细胞测定中使用MAGI细胞培养物检测抗病毒活性。如U1测定所见，用CAP-1处理感染的产生病毒的MAGI细胞使病毒颗粒传染性剂量依赖地降低，在100μM CAP-1时传染单位下降接近2个对数单位，降至不到未处理水平的2％，图18。病毒RT活性未见降低，这进一步证实抗病毒活性不是由于病毒产生的抑制。MAGI细胞或病毒颗粒与CAP-1预温育也不影响病毒的产生，表明CAP-1不是杀病毒的，不能直接抑制早期事件。这些数据综合起来表明，CAP-1的抗病毒活性是由于晚期病毒事件的抑制，晚期事件不同于当前研究的或临床使用的其它抗HIV药物所针对的事件。
                        实施例7
                    衣壳装配的体内抑制
沉淀处理的(CAP-1)和未处理的产生病毒的U1细胞，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤，重悬浮于至少10倍细胞沉淀体积的固定剂(100mM二甲胂酸钠，pH 7.2，2.5％戊二醛，1.6％低聚甲醛，0.5％苦味酸)中。细胞固定24-48小时，之后除去固定剂，用PBS洗涤细胞两次，在eppendorf离心管中沉淀。洗涤的细胞沉淀在溶于100mM二甲胂酸钠，pH 7.2的1％四氧化锇+0.8％铁氰化钾中后固定1小时。用水充分漂洗后，细胞在4％乙酸双氧铀中预染色1小时，充分漂洗，脱水，在1∶1丙酮：Epon 812中浸润过夜，用100％Epon 812树脂浸润1小时，包埋于树脂中。聚合后，用Reichertuntra切片机切成60-80nm厚的切片，在柠檬酸铅中染色5分钟，漂洗，在乙酸双氧铀中后染色30分钟，漂洗，干燥。在装备有1024×1024 Gatan多扫描CCD的Philips CM120/Biotwin上以60kV进行EM，在25,880×-36,960×的原始放大倍数下获取图像，相应的t分辨率分别为8.9和6.5/像素。每个样品观察4个不同的EM网格，至少收集47个，对应于35μm2的最小总面积。
由于CAP-1不抑制病毒产生，因此能够通过EM检查处理的细胞产生的病毒体的形态缺陷。成熟病毒体的衣壳通常呈现中心圆锥形(颗粒的约30％)或球形(约40％)结构，这取决于薄切片样品制备过程中圆锥体的方向，EM制品中约30％的病毒体一般显示一种不成熟的表型，其特征在于缺乏中心电子密度。来自未处理的U1细胞培养物的病毒体产生这些典型结果。然而，处理的细胞产生的颗粒显示较大的大小不均一性，这表明Gag装配缺陷。另外，来自处理的细胞的颗粒中只有35％含有致密的、位于中心的核心，与之相比，未处理的细胞有70％。最显著的是，来自处理的细胞的颗粒均不显示HIV的标志——圆锥形核心，表明CAP-1抑制成熟核心的装配。对于用来破坏分子间CA-CA相互作用的CA突变产生的病毒体，以前观察到它们有基本相同的表型。因此，该EM数据表明，CAP-1抑制病毒成熟过程中的衣壳装配，并且一定程度地干扰未成熟颗粒装配过程中正常的Gag-Gag相互作用。
本领域技术人员应当了解上述发明的大量修饰和改变。因此，只应当设置权利要求书所述的限制。

Claims (44)

1.一种评价待测化合物的抗病毒活性的方法，包括：
a)使该待测化合物接触Gag283或其片段，
b)检测待测化合物结合至靠近衣壳蛋白N端结构域之C端的顶端裂隙的能力，和
c)评价该化合物的抗病毒作用。
2.权利要求1的方法，其中所述衣壳蛋白选自病毒衣壳蛋白和逆转录病毒衣壳蛋白。
3.权利要求2的方法，其中所述逆转录病毒衣壳蛋白是HIV-1。
4.权利要求1的方法，其中所述衣壳蛋白是成熟的。
5.权利要求1的方法，其中所述衣壳蛋白是不成熟的。
6.权利要求3的方法，其中所述HIV-1衣壳蛋白是成熟的。
7.权利要求3的方法，其中所述HIV-1衣壳蛋白是不成熟的。
8.权利要求1的方法，其中所述抗病毒活性选自病毒成熟过程中衣壳装配的抑制和传染过程中解装配的抑制。
9.一种降低与AIDS相关的死亡率的方法，包括对AIDS患者施用治疗有效量的一种化合物的步骤，该化合物能够结合至靠近HIV衣壳蛋白N端结构域之C端的顶端裂隙。
10.权利要求9的方法，其中所述衣壳蛋白是HIV-1衣壳蛋白。
11.权利要求9的方法，其中所述化合物选自：N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙酰胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N’-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
12.权利要求11的方法，其中所述化合物是N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)。
13.权利要求11的方法，其中所述化合物是N-(4-N-乙酰胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)。
14.权利要求11的方法，其中所述化合物是N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)。
15.权利要求11的方法，其中所述化合物是N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)。
16.权利要求11的方法，其中所述化合物是N-(3-氯-4-甲基苯基)-N’-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)。
17.权利要求11的方法，其中所述化合物是N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)。
18.权利要求11的方法，其中所述化合物是N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
19.一种治疗AIDS患者的方法，包括以有效减少发病数量和严重性的量施用能够结合靠近HIV衣壳蛋白N端结构域之C端的顶端裂隙之化合物的步骤。
20.权利要求19的方法，其中所述HIV衣壳蛋白是一种HIV-1衣壳蛋白。
21.权利要求19的方法，其中所述化合物选自：N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙酰胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N’-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
22.权利要求21的方法，其中所述化合物是N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)。
23.权利要求21的方法，其中所述化合物是N-(4-N-乙酰胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)。
24.权利要求21的方法，其中所述化合物是N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)。
25.权利要求21的方法，其中所述化合物是N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)。
26.权利要求21的方法，其中所述化合物是N-(3-氯-4-甲基苯基)-N’-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)。
27.权利要求2 1的方法，其中所述化合物是N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)。
28.权利要求21的方法，其中所述化合物是N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
29.一种评价化合物抑制Gag283β-发夹形成的能力的方法，包括：
a)使该化合物接触Gag283或其片段，和
b)检测该化合物干扰Gag283的β-发夹形成的能力。
30.一种筛选候选化合物之抑制Gag283的β-发夹形成的能力的方法，包括：
a)使该化合物接触Gag283或其片段，和
b)检测该化合物干扰Gag283的β-发夹形成的能力。
31.一种鉴定化合物之抑制Gag283的β-发夹形成的能力的方法，包括：
a)利用Gag283分子坐标产生Gag283的3D计算机模型，和
b)利用该模型鉴定可与Gag283结合的化合物。
32.一种鉴定能够结合至靠近病毒衣壳蛋白N端结构域之C端的顶端裂隙的化合物的方法，包括：
a)利用Gag283分子坐标产生Gag283的3D计算机模型，和
b)利用该模型鉴定可与顶端裂隙结合的化合物。
33.权利要求32的方法，其中所述衣壳蛋白是HIV-1衣壳蛋白。
34.一种用化合物抑制衣壳装配的方法，该化合物可以结合至靠近衣壳蛋白N端结构域之C端的顶端裂隙。
35.权利要求34的方法，其中所述衣壳蛋白选自病毒衣壳蛋白和逆转录病毒衣壳蛋白。
36.权利要求35的方法，其中所述衣壳蛋白是HIV-1衣壳蛋白。
37.权利要求34的方法，其中所述化合物选自：N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙酰胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N’-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
38.权利要求36的方法，其中所述化合物选自：N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙酰胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N’-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
39.一种用化合物抑制感染过程中衣壳解装配的方法，该化合物可以结合至靠近衣壳蛋白N端结构域之C端的顶端裂隙。
40.权利要求39的方法，其中所述衣壳蛋白选自病毒衣壳蛋白和逆转录病毒衣壳蛋白。
41.权利要求39的方法，其中所述衣壳蛋白是HIV-1衣壳蛋白。
42.权利要求39的方法，其中所述化合物选自：N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙酰胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N’-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
43.权利要求41的方法，其中所述化合物选自：N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙酰胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N’-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
44.一种化合物或其药学可接受的盐，其具有通式I：
Figure A038121240006C1
其中：
(a)R1代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(b)R2代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(c)R3代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(d)R4代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(e)R5代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(f)卤素只限于氟、氯、溴和碘；
(g)R8和R9独立地是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、新戊基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丁基甲基、环丁基乙基、环戊基甲基、环己基甲基或环己基乙基；
(h)字母n、m和p独立地代表1-6中的任何-个整数；
(i)R6和R7独立地选自氢或烃基，该烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多6个碳原子；
(j)X选自O或S；
(k)Y是杂环、碳环或任选取代的苯基；
(l)杂环选自任何稳定的5、6或7元单环或双环或7、8、9或10元双环杂环，它是饱和的、部分不饱和的或不饱和的(芳族)，由碳原子和1、2、3或4个独立选自N、NH、O和S的杂原子组成，包括任何双环基团，其中上述任何杂环都与苯环稠合。氮和硫杂原子任选地可以被氧化。杂环可以在任何杂原子或碳原子处与其侧基以产生稳定的结构的方式连接。如果获得的化合物稳定，此处所述的杂环可以在碳或氮原子上被取代。如果特别指出，杂环中的氮任选地可以被季铵化。优选地，当杂环中S和O原子的总数超过1时，这些杂原子不彼此相邻。此处所用的术语“芳族杂环系统”是指一种稳定的5-7元单环或双环或7-10元双环杂环芳环，它由碳原子和1-4个独立选自N、O、S的杂原子组成。杂环的例子包括但不限于：1H-吲唑、2-吡咯烷基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、2H-吡咯基、3H-吲哚基、4-哌啶酮基、4aH-咔唑、4H-喹嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、吖啶基、吖辛因基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并苯硫基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑酮基(benzimidazalonyl)、咔唑基、4aH-咔唑基、β-咔啉基、苯并二氢吡喃基、苯并吡喃基、噌啉基、十氢喹啉基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、二氢呋喃[2，3-b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、假吲哚基(indolenyl)、二氢吲哚基、中氮茚基、吲哚基、异苯并呋喃基、异苯并二氢吡喃基、异吲唑基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基(苯并咪唑基)、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基、1，5-二氮杂萘基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1，2，3-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、噁唑烷基啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩吡嗪基、吩嗪基、吩噻嗪基、phenoxathiinyl、吩噁嗪基、2，3二氮杂萘基、哌嗪基、哌啶基、喋啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、喋啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹噁啉基、奎宁环基、咔啉基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、6H-1，2，5-噻二嗪基、1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、苯硫基、三嗪基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，2，5-三唑基、1，3，4-三唑基、四唑基和呫吨基。优选的杂环包括但不限于：吡啶基、苯硫基、呋喃基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并苯硫基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、喹啉基、异喹啉基、咪唑基、吲哚基、异吲哚基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、吡唑基(pyrrazolyl)、1，2，4-三唑基、1，2，3-三唑基、四唑基、噻唑基、噁唑基、吡嗪基和嘧啶基，和含有上述杂环的稠环和螺环化合物；
(m)碳环是指任何稳定的3、4、5、6或7元单环或双环或7、8、9、10、11、12或13元双环或三环，它们均可以是饱和的、部分不饱和的或芳族的。这些碳环的例子包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、金刚烷基(adamantyl)、环辛基；[3.3.0]双环辛烷、[4.3.0]双环壬烷、[4.4.0]双环癸烷(萘烷)、[2.2.2]双环辛烷、芴基、苯基、萘基、2，3-二氢化茚基、金刚烷基或四氢萘基(四氢化萘)；
(n)结构II定义的取代的苯基
其中：
(o)R10代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(p)R11独立地代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(q)R12独立地代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基含有直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(r)R13独立地代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(s)R14独立地代表氢、卤素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烃基，所述烃基包括直链、支链或环形基团，每个基团含有至多9个碳原子；
(t)R8和R9独立地是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、新戊基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丁基甲基、环丁基乙基、环戊基甲基、环己基甲基或环己基乙基；
(u)卤素只限于氟、氯、溴和碘。
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