MXPA04010450A - Inhibicion antiviral de la proteina del recubrimiento capsomerico. - Google Patents

Inhibicion antiviral de la proteina del recubrimiento capsomerico.

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Abstract

Se porporcionan metodos para evaluar la actividad antiviral de compuestos de prueba. Aspectos adicionales de los metodos involucran la proteina del recubrimiento capsomercio retroviral de HIV-1. en otro aspecto, se proporcionan metodos de reducir la mortalidad asociada con AIDS con un compuesto que enlaza a la fisura apical cerca del extremo C-terminal de la region N-terminal de la proteina del recubrimiento capsomerico de HIV-1. Se describen derivados de CAP-1, CAP-2, CAP-3, CAP-4, CAP-5, CAP-6 Y CAP-7 que enlazan a la fisura apical de la region N-terminal de la proteina del recubrimiento capsomerico de HIV-1 e inhiben el acoplamiento apropiado de la particula nuclear.

Description

INHIBICION ANTIVIRAL DE LA PROTEINA DEL RECUBRIMIENTO CAPSOMÉRICO CAMPO DE LA INVENCION La invención concierne al tratamiento del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (AIDS) . En particular, la invención concierne al tratamiento del AIDS por inhibición del recubrimiento capsomérico del virus de tipo 1 de la Inmunodeficiencia Humana (HIV-1) .
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los virus son agentes infecciosos no celulares que son capaces de reproducirse solamente en una célula huésped apropiada. Los virus son típicamente más pequeños que las bacterias, y pueden infectar células animales, vegetales, o bacterianas. Muchos virus son agentes importantes de enfermedades . La partícula infecciosa (virión) consiste de un ácido nucleico circundado por un recubrimiento proteináceo y, en algunos casos, una envoltura externa. Los retrovirus son virus de una sola hebra envueltos que infectan animales . La familia consiste de tres grupos : los espumavirus tales como el virus espumoso humano; los lentivirus tales como el virus de la inmunodeficiencia humana de tipos 1 y 2, así como también visna virus de oveja; y los oncovirus. La partícula del retrovirus está compuesta de dos moléculas de RNA idénticas. Cada genoma es una molécula de R A de una sola hebra, de sentido positivo, que está cubierta en el extremo 5' y poliadenilada en el extremo 3' . El prototipo del genoma del RNA oncoviral de tipo C contiene tres marcos de lectura abiertos llamados gag, pol y env, enlazados por regiones que contienen señales esenciales para la expresión de los genes virales. La región gag codifica a las proteínas estructurales del recubrimiento viral. La región pol codifica a una proteinasa viral así como también a las proteínas para el procesamiento del genoma que incluyen las actividades enzimáticas de transcriptasa inversa, ribonucleasa H y endonuclesa. La región env especifica las glicoproteínas de la envoltura viral. Además, de estos tres marcos de lectura abiertos, los genomas más complejos de los lentivirus y los espumavirus portan marcos de lectura abiertos que codifican a las proteínas reguladoras involucradas en el control de la expresión del genoma. Hay homologías substanciales entre las proteínas del recubrimiento capsomérico tanto de virus como de retrovirus. Un experto en la materia puede identificar fácilmente estas homologías por medio de la búsqueda en cualquiera de los equipos de búsqueda de biotecnología estándar . La AIDS es una enfermedad retroviral caracterizada por profunda inmunosupresión que conduce a infecciones oportunistas, neoplasmas secundarios y manifestaciones neurológicas . La magnitud de esta plaga moderna es verdaderamente creciente. En los estados Unidos, la AIDS es la causal de muertes en hombres entre 25 y 44 años de edad, y es la tercera causal de muertes de mujeres en este grupo de edad. Aunque inicialmente se reconoció y reportó en los estados Unidos, actualmente se ha reportado desde más de 193 países alrededor del mundo. El grupo de personas infectadas con HIV en Africa y Asia es grande y se expande rápidamente. La transmisión del HIV tiene lugar bajo condiciones que facilitan el intercambio de sangre o de fluidos corporales que contienen el virus o células infectadas por el virus. Por consiguiente, las tres rutas principales de transmisión son contacto sexual, inoculación parenteral, y paso del virus de madres infectadas a sus neonatos. A causa de los resultados fatales casi uniformemente del AIDS, que encuentran tratamiento efectivos para la enfermedad, prevalece un problema médico serio . Hay pocas dudas de que la AIDS sea causada por el HIV, un retrovirus humano no transformante que pertenece a la familia de lentivirus. O'Brien, y colaboradores, HIVr causes AIDS: Koch's postulates fullfilled, Curr Opin. Immunol 8: 613 (1996) .Dos formas de HIV relacionadas pero genéticamente diferentes, llamadas HIV-1 y HIV-2, se han aislados de pacientes con AIDS. El HTV-1 es el tipo más común asociado con AlDs en los Estados Unidos, Europa, y Africa Central, mientras que el HIV-2 causa enfermedades similares en Africa del Oeste. Similar a la mayoría de los retrovirus, el virión del HIV-1 es esférico y contiene un electrón denso, un núcleo conformado en cono circundado por una envoltura lipidica derivada de la membrana de la célula huésped. El núcleo del virus contiene (1) el la proteina del recubrimiento capsomérico principal p24 (CA) , (2) la proteina del recubrimiento capsomérico nuclear p7/p9, (3) dos copias de KNA genómica, y (4) las tres enzimas virales (proteasa (PR) , transcriptasa inversa (RT) , e integrasa) . El núcleo viral es circundado por una proteina matriz llamada pl7, la cual está situada en la parte inferior de la envoltura del virión. El armazón de la estructura viral, son dos glicoproteínas virales, gp 120 y gp 41, las cuales son criticas para la infección de células por HIV. Como con otros retrovirus, el genoma proviral de HIV contiene los genes gag, pol, y env, las cuales codifican para varias proteínas virales. Los productos de los genes gag y pol son trasladados inicialmente en grandes proteínas precursoras que deben de ser fragmentadas por la proteasa viral para producir las proteínas maduras. La CA es sintetizada inicialmente como una región en una poliproteína precursora de Gag de 55 kDa. Aproximadamente 4,000 copias del conjunto Gag en la meiabrana plasmática y brotan para formar una partícula de virus inmadura. Subsecuente al brote, el CA es liberado por fragmentación proteolítica de Gag, la cual activa un cambio conformacional que promueve el acoplamiento de la partícula del recubrimiento capsomérico . Gitti, y colaboradores, Structure of the amino-terminal core domain of the HIV-1 capsid protein, Science, 273: 231-35 (1996); Sc wendler, y colaboradores, Proteolytic xefolding of the HIV-1 capsid protein amino-terminus facilitates viral core assemblyr EMBO J., 17: 1555 - 58 (1998); Gross, y colaboradores, N- terminal extensión of human immunodeficiency virus capsid protein converts the in vitro assemhly phenotype f om tabular to spherical partióles, J. Virol., 72: 4798-4810 (1998). Dos copias del genoma viral y de enzimas esenciales para infección se convierten en recubiertas de capsómeros en el recubrimiento capsomérico central, conformado en cono, del virión maduro. Varios estudios recientes han mostrado que el acoplamiento apropiado del recubrimiento capsomérico es critico para la infecciosidad viral. Las mutaciones en el CA que inhibe el acoplamiento son letales y las mutaciones que alteran la estabilidad del recubrimiento capsomérico atenúan severamente la replicación que hace a la CA un objetivo antiviral potencial atractivo. Tang y colaboradores, Human immunodeficiency virus type 1 N-ter inal capsld mutants that exhibit aberrant core morphology are blocked in initiation of reverse transcriptlon in ínfected cells, J. Virol. 75: 9357-66 (2001) ; Reicin, y colaboradores, The role of Gag in human immunodeficiency virus type 1 virion morphogenesis and early steps of the viral life cycle, J. Virol., 70: 8645-52 (1996) ; and Forshey, y colaboradores, Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replicationr J. Virol. 76: 5667-5677 (2002) . Aunque se han desarrollado agentes antivirales que enlazan al recubrimiento capsomérico de picorna irus y suprime la infectividad al inhibir el desacoplamiento de la envolvente del recubrimiento capsomérico, Smith, y colaboradores, The site of attachement in human rhinovirus 14 for antiviral agentes that inhibit uncoating, Science, 233; 1286-93 (1986), no se han identificado aún inhibidores del acoplamiento o desacoplamiento del recubrimiento capsomérico de HIV. Fármacos actualmente disponibles para el tratamiento de infecciones por HIV terminan con las enzimas RT y PR, dos de quince proteínas codificadas por el genoma viral. Estos fármacos son efectivos marginalmente cuando se administran independientemente debido al surgimiento rápido de cepas resistentes que son seleccionadas bajo condiciones de supresión viral incompleta. Richman, D. D., HIV Chemotherapy, Nature 410: 995-1001 (2001). Aunque las reducciones sostenidas en la carga viral pueden lograrse cuando se usan los inhibidores en combinaciones apropiadas (terapia anti-retroviral efectiva, HAART) , Ric man, D. D. HIV Chemotherapy, Nature 410: 995-1001 (2001); Pillay, y colaboradores, Incidence and impact of resistance against approved antiretroviral drugs, Rev Med Virol, 10: 231-53 (2000) , la supresión inadecuada debida a pobre adaptabilidad, resistencia, e interacciones con otros fármacos o dieta, es un problema significativo que limita la efectividad de la terapia de HñART para muchos pacientes y puede conducir a la diseminación de cepas resistentes al fármaco. Mansky y colaboradores, Combination of drugs an drug-resistant reverse transcriptase results in a ultlplicative increase of human immunodeficiency virus type 1 mutants frequencies, J. Virol., 76: 9253-59 (2002); Coffin, J., HTV population dynamic in vivo: ímplícatíons for genetic variationr pathogenesis, and therapy, Science, 267: 483-89 (1995); Kuritzkes, D. R. , Clinical significance of drug resistance in HIV-1 infection, AIDS, 10: S27-33 (1996). A pesar de la disponibilidad de la terapia de BAART, la mortalidad y las morbilidades asociadas con AIDS permanece significativa y sin resolver por medio de las terapias actuales. Se necesitan nuevos compuestos y métodos terapéuticos que podrían reducir o mejorar los eventos adversos y mejora de los resultados clínicos del AIDS/ que incluyen , por ejemplo, reducir la mortalidad y mejorar la calidad de vida de aquellos que sufren de la enfermedad.
SUMARIO DE LA INVENCION La invención proporciona nuevos métodos para evaluar la actividad antiviral de compuestos de prueba. El método incluye (a) poner en contacto un compuesto de prueba con 783 Gag o un fragmento del mismo, determinar la habilidad del compuesto de prueba para enlazar la fisura apical cerca del extremo C-terminal de la región N- terminal del recubrimiento capsomérico, y (c) evaluar el efecto antiviral del compuesto de prueba. La proteína de recubrimiento . puede ser un recubrimiento capsomérico proteínico viral o un recubrimiento capsomérico retroviral . El recubrimiento capsomérico retroviral puede ser maduro o inmaduro. Además, el efecto antiviral incluye, pero no se limita a, la inhibición del acoplamiento del recubrimiento capsomérico durante la maduración viral y la inhibición del desacoplamiento durante la in ectividad. La invención también proporciona un método de reducir la mortalidad asociada con AIDS. El método incluye administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de un compuesto que enlaza a la fisura apical cerca del extremo C-terminal de la región C-terminal del recubrimiento capsomérico del HIV en un humano que sufre de AIDS. Los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a N- (3- cloro- 4- metilfenil) - Nr— [2- tioetil- 2'- [5- (dimetilaminometil)]- 2- metilfuril] urea (CAP-1) , N- (4-N- acetamidofenil] - W- (3- nitro- 4- metilfenil) urea (CAP-2), N- (2- propil)- '- (3- nitro- 4- metilfenil) urea (CAP-3) , N- (3- cloro- 4- metil fenil)- N'- (4-cianofenil) urea (CAP-4), N- (3- cloro- 4- metil fenil) -N'- [4- (1,1,1- triclorometil) fenil] urea (CAP-5] , N- (3-nitro- 4- fluorofenil) - N'-[3- (1,1,1- trifluorofenil) fenil] urea (CAP-6) , N- [(3- cloro- 4- metil fenil)- N' , N'- propil] urea (CAP-7) . La invención también proporciona un método para tratar a un humano que sufre de AIDS. El método incluye administrar un compuesto que enlace la fisura apical cerca del extremo C-terminal de la región C-terminal del recubrimiento capsomérico del HIV en una cantidad efectiva para reducir el número y la severidad de morbilidades asociadas con AIDS. Los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a, N- (3- cloro- 4-metilfenil) - N' - [2- tioetil- 2'- [5- (dimetilaminometil) ]-2- metilfuril] urea (CAP-1), N- (4- N- acetamidofenil) - N' - (3- nitro- 4- metil fenil) urea (CAP-2), N- (2- propil)-N' - (3- nitro- 4- metilfenil) urea (CAP-3) , N- (3- cloró4- metil fenil)- N' - (4- cianofenil) urea (CAP-4) , N- (3-cloro- 4- metil fenil)- N'- [4- (1,1,1- triclorometil) fenil] urea (CAP-5) , N- (3- nitro- 4- fluorofenil) - Nr-[3- (1,1,1- trifluorofenil) fenil] urea (CAP-6) , N- [(3- cloro-4- metil fenil)- N' , N'- propil] urea (CAP-7) . La invención también proporciona un método de evaluar un compuesto de prueba por la habilidad para inhibir la formación de horquilla ß de Gag 283. El método incluye (a) poner en contacto un compuesto de prueba con Gag283 o un fragmento del mismo, y (b) determinar la habilidad del compuesto para interferir con la formación de la horquilla ß de Gag283. La invención también proporciona un método de cribar un compuesto de prueba por la habilidad para inhibir la formación de la horquilla-ß de Gag283. El método incluye (a) poner en contacto el compuesto de prueba con Gag283 o un fragmento del mismo, y (b) determinar la habilidad del compuesto para interferir con la formación de la horquilla ß de Gag283. La invención proporciona adicionalmente un método de identificar un compuesto de prueba por la habilidad para inhibir la formación de la horquilla ß de Gag 283. El método incluye (a) generar un modelo de computadora en 3D de Gag283 usando coordinados moleculares de Gag283, y (b) usar el modelo para identificar un compuesto de prueba que enlaza a Gag283. La invención proporciona adicionalmente un método de identificar un compuesto de prueba que enlaza en la fisura apical cerca del extremo C-terminal de la región N-terminal de un recubrimiento capsomérico. El método incluye (a) generar un modelo de computadora en 3D de Gag283 usando coordinados moleculares de Gag283, y (b) usando el modelo para identificar un compuesto de prueba que enlaza en la fisura apical. El recubrimiento capsomérico puede ser un recubrimiento capsomérico viral o un recubrimiento capsomérico retroviral. El recubrimiento capsomérico retroviral incluye, pero no se limita a HIV-1 y HIV-2. La invención también se proporciona para cualquier derivado o sal aceptable farmacéuticamente de CAP-1, CAP-2, CAP-3, CAP- , CAP-5, CAP-6 o CAP-7 que tenga la fórmula I descrita posteriormente que sea un compuesto antiviral que enlace en el sitio apical de la región N-terminal de el recubrimiento capsomérico HIV-1 e inhiba el acoplamiento apropiado de la partícula del núcleo. En particular, la invención proporciona derivados o sales aceptables farmacéuticamente de CAP-1 o sus moléculas relacionadas que contienen un grupo urea que contiene un substituyente aromático substituido en un nitrógeno y una atadura flexible fijada a un segundo grupo aromático en el otro nitrógeno .
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1, es una representación de tensores de difusión determinados independientemente para las regiones MA y CAN de Gag283. Dzz denota el componente de principio del tensor de difusión simétrico axialmente. La Figura 2, es una comparación de rayos-X y de estructuras determinadas a la fecha para la región CAN del recubrimiento capsomérico de HIV-1. La Figura 3, es una representación gráfica de CAP-1 punteada en la fisura apical del recubrimiento capsomérico de HIV. La Figura 4, es una representación de la interacción en intervalo corto involucrada en el enlace de CAP-1 en la fisura apical del recubrimiento capsomérico de HIV-1.
La Figura 5, representa un espectro de ^i-^N HSQC de resolución mejorada para una muestra de Gag283 marcado con 15N, 2H. La Figura 6, es una representación del relajamiento por NMR y los datos del desplazamiento químico que identifican regiones de estructura y de movilidad. La Figura 7, es una representación tabular de estadísticas estructurales para 20 conformadores de Gag283 de energía inferior. La Figura 8, es una representación de los valores de 15NR2/Ri de la estructura principal determinados por residuos que ni exhiben movilidad interna significativa ni intercambio conformacional . La Figura 9, es una comparación de las estructuras de NMR determinadas por CAN y Gag283 que muestran diferencias conformacionales asociadas con la helicoidal 6. La Figura 10, es una representación del desplazamiento de la helicoidal 6 y el cambio concomitante en la posición del bucle de enlace de la CypA. La Figura 11 es una representación de las diferencias de desplazamiento químico observadas para los átomos de la estructura principal de las regiones de CAN madura e inmadura . La Figura 12, es una representación de una superposición del espectro de 2D1H-15N HSQC obtenido para la región N-terminal del recubrimiento capsomerico de HIV-1 por titulación con CAP-1. La Figura 13 , es una representación de una superposición del espectro de 1H-15N HSQC en 2D obtenido para la región N-terminal del recubrimiento capsomerico de HIV-1 por titulación con CAP-1, CAP-2, CAP-3 y CAP-4. La Figura 14, es una representación de una superposición del espectro de 1H-15N HSQC en 2D obtenido para la región N-terminal del recubrimiento capsomerico de HIV-1 por titulación con CAP-5, CAP-6 y CAP-7. La Figura 15, es una representación de los datos de titulación del desplazamiento químico por 15N NMR para los residuos Ser 33 (cuadrados) , Val 59 (diamantes) y Gly 60 (estrellas) y adaptados para isotermas de enlace 1:1 (¾ = 0.82 ± 0.18 mM) . La figura 16 es una representación gráfica de los resultados del ensayo de turbidez que muestran los efectos de los compuestos de enlace con CA sobre el acoplamiento del recubrimiento in vi tro. La Figura 17, es una representación gráfica de infectividad viral (diamantes) , viabilidad celular (cuadrados) y producción de virus (triángulos) de cultivos de Ul infectados de manera latente como una función de la adición de CAP-1. La Figura 18, es una representación gráfica de viabilidad celular, partículas virales asociadas a los niveles de RT y de CA y unidades infecciosas obtenidas por incubación de células Ul y MAGI infectadas por 72 horas con 100 µ? de CAP-1. La Figura 19 es una representación de ensayos por tinción Western de recubrimiento capsomérico que muestra concentraciones relativas de CA viral intra- e extracelular en la poliproteína de Gag, libre y estados procesados parcialmente como una función de la adición de CAP-1.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La CA del HIV-1 maduro contiene una horquilla ß N-terminal que es esencial para la formación de la partícula del recubrimiento nuclear . CA es generada por fragmentación proteolítica de la poliproteína precursora de Gag durante la maduración viral. A la fecha, estudios estructurales de alta resolución se han enfocado sobre las proteínas del virus maduro. La proteína CA del HIV maduro consiste de las regiones del núcleo N-terminal (CAN) y de dimerización C-terminal (CAC) que son plegadas independientemente y conectadas por un enlazador flexible. La región del núcleo CAN contiene una horquilla ß N-terminal en el residuo 13 que es estabilizada en parte por un puente salino entre el grupo NH2+ de Pro 1 y el grupo carboxilo de la cadena lateral de Asp 51. Estos residuos son muy conservados y es probable que todos los otros retrovirus excepto el espumavirus contenga una horquilla ß N-terminal similar. Estudios de mutagénesis indican que la horquilla ß se requiere para la formarán de la partícula del recubrimiento nuclear del HIV-1 y que probablemente funciona por participación directa en interacciones CA-CA intermoleculares. La región CA de Gag es también responsable del empaque de aproximadamente 200 copias de la proteina huésped, CypA, la cual es una prolil isómerasa y una proteína compañera que es esencial para la infectividad de HIV-1. Aunque la función precisa de CypA no es conocida, se sospecha que la proteína facilita el desacoplamiento del recubrimiento nuclear durante la infectividad. Se han usado métodos microscópicos crio-electrónicos (EM) , para estudiar la estructura de la poliproteína de Gag en viriones inmaduros y en partículas similares a virus. A baja resolución, las proteínas de Gag acopladas parecen como una capa densa de electrones asociada con la membrana viral. Estudios más recientes han mostrado que la capa densa de electrones está actualmente compuesta de varias envolventes esféricas de densidad, que incluye una envolvente externa asociada directamente con la bicapa lipídica que corresponde a las regiones MA de las proteínas de Gag, dos envolventes que corresponden a las regiones CAN y CAC, y una cuarta envolvente más interna que corresponde a la región NC de Gag y el genoma de RNA asociado. Los espesores de las envolturas de MA y de CAN corresponden estrechamente a las longitudes (medidas desde N- a C- terminus} de las regiones plegadas (Fig. 1) . De manera interesante, la separación entre las envolventes de MA y de CAN es solamente de 40 Á, aunque los inventores indicaron que estas regiones pueden estar separadas por encima de 80 Á en formas extendidas de Gag283. La separación podría ser aún mayor si la helicoidal C-terminal flexible de MA está parcialmente desplegada. Esto indica que' factores diferentes de la longitud del enlazador flexible definen la separación de las envolventes en las partículas inmaduras y demuestra que las regiones MA y CA forman envolventes ordenadas con interacciones proteína-proteína definidas. A partir de la maduración proteolítica, las envolventes de CA esféricas del virión inmaduro se condensan para formar la partícula del recubrimiento nuclear conformada en cono característica. La horquillap N-terminal se requiere para la formación de la partícula del recubrimiento nuclear. Las mutaciones diseñadas para inhibir la formación d el horquillan vivo, que incluyen Pro 133 a Leu y Asp 183 a Ala, dan como resultado la formación de partículas virales que son incapaces de formar " recubrimientos nucleares normales y no son infecciosos. Además, mientras que moléculas de CA nativas pueden acoplarse de manera tubular que tienen algunos aspectos parecidos a los del recubrimiento capsomérico nuclear nativo, adición de residuos en el N-terminus de CA, o mutación de Asp 183 a Ala, conducen a la formación de una mezcla heterogénea de estructuras que son generalmente esféricas y que aparecen en las envolventes del recubrimiento capsomérico de viriones inmaduros . La horquilla ß elabora iatla extensiva se pone en contacto con las estructuras del cristal tanto de la proteina de CA intacta enlazada a un fragmento de anticuerpo como a la región de CAN enlazada a CypA, lo que sugiere que la horquilla ß promueve el acoplamiento del recubrimiento capsomérico al participar directamente en interacciones CA-CA intermoleculares. La horquilla ß es desplegada en la prorsia inmadura y la formación de la h^rqutüLdiae lugar posteriormente a la fragmentación proteolítica de Gag, activando el acoplamiento del recubrimiento capsomérico. La formación de la horquilla es estabilizada por el puente de la sal que se puede subsecuentemente formar entre Pro 133-NH2+ y la cadena lateral de C00- de Asp 183 conservado, así como también por numerosas interacciones adicionales que no están presentes en la proteina inmadura. Estas interacciones adicionales involucran no solamente hidrógeno inter- -hebra de enlace y de empaque, pero también interacciones entre la horquilla y el resto de la región de CAN, que incluyen el nuevo hidrógeno enlazado entre la estructura principal de NH de lie 134 y el carbonilo de Gly 178 y el empaque hidrofóbico entre las cadenas laterales de lie 134 (horquilla ß) , Thr 180 (helicoidal 3) e lie 247 y Met 250 (helicoidal 6) . Asi, El mecanismo de acoplamiento del recubrimiento capsomérico tiene aspectos que parecen muy similares a los empelados para la activación enzimática por la familia tripsina de serina proteasas, en la cual la fragmentación proteolitica del zimógeno inactivo da como resultado un nuevo grupo N¾+ N- terminal que forma un puente salino con un grupo carboxilo enmascarado y activa a la enzima. El proceso de retirar el recubrimiento capsomérico es dependiente de la presencia de CypA y CypA empacado por HIV-1 es esencial para la infectividad. Los viriones que contienen mutaciones en CA que neutralizan el enlace CypA son capaces de acoplamiento y maduración y parecen normales en imágenes de crio-EM. No obstante, aunque estas partículas pueden fundir y de penetrar células objetivo, son incapaces de transcripción inversa de sus genomas, indicando que CypA es necesaria para un evento previo en el ciclo de replicación que más probablemente tiene lugar después de la maduración del virus y la fusión de la membrana. De manera interesante, viriones mutantes que no empacan eficientemente CypA son infecciosos en lineas celulares que contienen concentraciones intrínsecas anormalmente altas de CypA, y mutantes transformantes que aumentan espontáneamente en la presencia de análogos de ciclosporina son dependientes de estos inhibidores de CypA para infectividad. Tomados juntos, estos hallazgos indican que los procesos de acoplamiento y desacoplamiento del recubrimiento capsomérico son finamente ajustados y que mutaciones o alteraciones relativamente menores en las condiciones celulares pueden afectar la estabilidad del recubrimiento capsomérico nuclear Los datos de MR descritos posteriormente indican que la formación de la horquilla ß induce un desplazamiento de aproximadamente 2 Á de la helicoidal-6 y un desplazamiento concomitante del sitio de enlace de CypA. En vista del hecho de que (i) la horquilla ß es claramente importante para el acoplamiento del recubrimiento capsomérico, y (ii) CypA está probablemente involucrado en el desacoplamiento, el acoplamiento conformacional entre estos sitios es relevante para eventos asociados con el retiro del recubrimiento capsomérico mediado por CypA. Así, el enlace de CypA al bucle expuesto desplaza la posición de la helicoidai-6, dando como resultado la desestabilización o reposicionamiento de la horquilla ß de una manera que desestabiliza el recubrimiento capsomérico y promueve el retiro del recubrimiento capsomérico. Experimentos de mapeo del desplazamiento químico por NMR revelaron desplazamientos substanciales para las señales de la amida de la estructura principal de la helicoidal-6 a partir del enlace de CypA a la región CAN madura. Aunque la horquilla ß de CAN madura es relativamente móvil, su posición está bien definida en la estructura de NMR de la región libre.
En contraste, en la estructura del cristal por rayos-X del dímero CypA-CAN, se observó la densidad de electrones bien definida para solamente una de las dos horquillas ß. La densidad de electrones faltante en la estructura por rayos X podría por consiguiente ser al menos parcialmente debido al enlace de CypA. Además, la comparación de las cinco estructuras de NMR y de rayos X que se han determinado asi para la región CAN de HIV-1 reveló que la posición de la helicoidal-6 puede variar, dependiendo de las condiciones empeladas para los estudios estructurales (Figura 2) . Los factores de temperatura reportados para los átomos de la estructura principal de la helicoidal-6 son generalmente mayores que los de otras helicoidales en la estructura de rayos X de alta resolución (2.36 Á) del complejo CAN-CypA. Tomados juntos, estos datos indican que la helicoidal-6 es relativamente móvil y que su posición es sensible al enlace de CypA y de la formación de la horquilla ß. Finalmente, la afinidad de CypA por Gag es 1000 veces mayor que su afinidad por el recubrimiento capsomérico madura. Estas diferencias en afinidad pueden explicarse por medio del acoplamiento conformacional de la horquilla ß y los sitios de enlace de CypA. La estructura tridimensional de la mitad N-terminal (residuos 2-283) de la poliproteina de Gag de HIV-1 se determinó usando los siguientes métodos generales. El DNA que codifica a los 283 residuos N-terminales de la proteina precursora de Gag del HIV-1 y un His6 marcado C-terminal anexo se amplificó desde el plásmido pNL4-3 usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . El plásmido portador del Gag283 se transformó en el codón de BL21 más la linea celular RIL (Stratagene, La Jolla, CA) . Las células transformadas fueron desarrolladas en medio mínimo de M9 que contenía 15NHC1 y/o UL-[13C]glucosa (Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA) como su única fuente de carbono y/o de nitrógeno ya sea en ¾0 o en 2¾0 al 99 % (Martek, Columbia, MD) . La proteína fue purificada con la resina de afinidad de cobalto (Clontech, Palo alto, CA) en una sola etapa. Típicamente, un litro de medio de crecimiento produce 20 mg de Gag283. Se confirmó su peso molecular por ESI-MS. Se colectaron los datos de NMR con muestras de proteina de 1 mM que contenia 50 mM de regulador de acetato de sodio a pH de 5.0, 100 mM de NaCl, 5 mM de ß- ercaptoetanol y coctel inhibidor de proteasa IX (Calbiochem, San Diego, CA) . Todos los estudios de NMR se llevaron a cabo con un espectrómetro Brucker AVANCE DRX de 600 MHz equipado con sonda de triple resonancia de gradientes xyz; T = 30 °C, 2D 15N HSQC, HNHA de tiempo constante de 3D, HN(CO)CA, HNCO, y NOESY editado por I5N/15N en 4D (4DNN) los datos se usaron para la asignación de la estructura principal. Los datos de 4DNN se obtuvieron por medio de una muestra marcada con U-2H/15N; Tmezc = 200 ms. Otros datos de NOE colectados sobre muestras marcadas con U-13C/1N incluyeron NOESY editado por 15N/13C en 4D [Tmezci = 120 ms) y NOESY editado por i3C/13C en 4D (Tmezci = 100 ms registrado en 2H20) . Se procesaron los datos de NMR con NMR Tubular y se analizaron por NMR Visual. Se asignaron las señales usando las estrategias de asignación estándares. Se categorizaron cuantitativamente los picos entrecruzados como fuertes, medios y débiles y se usaron para asignar límites superiores de distancia de 2.7, 3.2 y 5.0 Á, respectivamente. La distancia que involucra grupos metilo, grupos metileno germinales degenerados, protones aromáticos degenerados y grupos metilo asignados específicamente no estéreo de leucina o valina fueron compensados por adición de 0.5, 0.8, 2.3 y 1.5 A, respectivamente. Las restricciones del enlace hidrógeno de la estructura principal (1.8 - 2.7 Á para las distancias H-0 y 2.4 - 3.2 Á para las distancias N-0) fueron implementadas para reforzar estructuras secundarias canónicas basadas en patrones de NOE y en Indices de desplazamiento químico característicos. Se obtuvieron las restricciones del ángulo diedro de la estructura principal por medio del análisis de los desplazamientos químicos por X3Ca, 13CP, 13C y 15N usando el programa TALOS. Los cálculos de la estructura efectuados con DYANA se llevaron a cabo usando solamente las restricciones de distancia derivadas de los datos por NOE. Las restricciones del enlace hidrógeno y del ángulo diedro fueron subsecuentemente incorporadas y se minimizaron adicionalmente las funciones objetivo. La calidad de las estructuras generadas se evaluó con Procheck-NMR. Las imágenes fueron generadas con Cimera y MolScript y se convirtieron con Ráster 3D. Los datos de relajamiento de 15N fueron para muestras de Gag283 marcado con U-2H/15N preparadas bajo las condiciones descritas anteriormente. Se midieron por NOE {¾}- 15N en estado estacionario heteronuclear (XNOE) para el núcleo 15N de la estructura principal con secuencia de impulso de retroceso en agua detectada de manera inversa. Las velocidades de relajación R y las velocidades de relajación transversal R2 fueron medidas al colectar ocho espectros bidimensionales en diferentes estratos en una modalidad interdesplazada. Las ocho capas para 1ONTI (= 1/Ri) son 10.04, 120.49, 512.09, 763.12, 1004.11, 1506.16, 2008.21, 2510.26 ms y para 15NT2 (=1/R2) son 21.10, 36.70, 52.30, 67.89, 83.49, 99.09, 114.69, 130.29 ms; capa de recuperación en 4s. El valor de XNOE de un residuo dado se derivó de proporción de la intensidad (I/Io) del pico de correlación de 15N/1H en la presencia de saturación protónica (I) y en ausencia de saturación protónica (lo) . Se estimaron los errores de interferencia de la linea base. Las velocidades de relajación para cada pico de buena resolución se obtuvieron al adaptar las intensidades de pico de los ocho espectros en dos parámetros (R2) de la decadencia exponencial {RX) de tres parámetros usando el programa comercial Origin 6.0 (microcal, Northampton, ??) . Los errores reportados se calcularon durante el llenado de los datos de relajación. Los grupos NH que exhibieron movimientos internos significativos a escalas de tiempo ps-ns (XNOE < 0.70) o intercambio químico en escala de tiempo µe-ms (incremento significativo de R2 sin incremento concomitante en ¾) se excluyeron de los cálculos de difusión rotacional, y los datos de relajación remanentes se analizaron con Quadric Difusión 1.12 (A.G. Palmer, Columbra University) . Las asignaciones de los desplazamiento químicos por NMR para Gag283 se depositaron con el BioMaResBank ( ), número de acceso 5316. Las coordenadas para los 20 conformadores con funciones objetivo inferiores, y la lista de restricciones asociadas, han sido depositadas en el Protein Data Bank ( ) , número de acceso 1L6N. La lista de restricciones y las coordenadas para la estructura refinada de la región CAN madura se han depositado también, número de acceso (1GWP) . La estructura tridimensional de la mitad N-terminal (residuos 2-283) de la poliproteina Gag de HIV-1 reveló una fisura superficial que está expuesta en la región CA de la proteína inmadura pero se vuelve a llenar con los residuos de una horquilla ß N-terminal de la proteína de CA a partir de la maduración proteolitica. Los compuestos que enlazan a la fisura de la horquilla ß inhiben la maduración viral y poseen actividad antiviral. Estudios adicionales revelaron un sitio de enlace de adición (fisura apical) cerca del extremo C-terminal de la región N-terminal de CA. De manera diferente, el núcleo aislado de la horqilla ß, la fisura apical eástpresente tanto en las formas maduras como inmaduras de la región N-terminal de CA. Los compuestos que enlazan a esta fisura apical inhiben el acoplamiento del recubrimiento capsomérico y tienen propiedades antivirales. Los residuos de CA con señales amida de la estructura principal que son perturbados más significativamente por medio del enlace de inhibidores en la fisura apical son ya sea estrictamente conservados (Glu 35, Val 36, Val 59, Gly 60, His 62, Gln 63, Ala 65, Tyr 145 ( o raramente y conservadoramente substituidos (número de ocurrencias entre paréntesis: E29D (2), 30R (1), A31G(16), A31N (1), F32L (1), S N(13), G61E (1), M144T (1)) entre las 96 secuencias genómicas en el HIV Compendium Sequence. La mayoría de los residuos conservados son expuestos sobre la superficie de la región N- Terminal lo que sugiere una posible función interactiva macromolecular . Los residuos de la fisura apical de la región N-terminal participan en una interfase CA(región C-terminal) -CA (región N-terminal) intermolecular a partir de la formación del recubrimiento capsomérico in vitro. Esto, en combinación con las otras descripciones contenidas en la presente, proporciona evidencia irrebatible de que los compuestos inhibidores funcionan mecánicamente al inhibir las interacciones intermoleculares CA-CA necesarias para el acoplamiento apropiado del recubrimiento capsomérico.
Los residuos Trp 23 y Val 59 exhiben cambios en el desplazamiento químico significativos a partir del enlace del ligando inhibidor a pesar del hecho de que están ocultos entre las helicoidales 1, 2 y 3 del monómero de CA. Es, por consiguiente/ probable que los inhibidores del acoplamiento alteren la estructura local del recubrimiento capsomérico y puedan así ya sea inhibir comparativamente las interacciones CA-CA para promover la formación de una envolvente del recubrimiento capsomérico distorsionada estructuralmente. La inhibición del acoplamiento del recubrimiento capsomérico no requiere ligandos con excepcxonalmente alta afinidad por CA. Esto es probablemente debido a la alta concentración local de moléculas de Gag en viriones acoplados (14 mM) , los cuales favorecen el enlace por medio de ligandos con aún modestas afinidades, por ejemplo, N- (3- cloro- 4- metilfenil) - N'- [2-tioetil- 2'~ [5- (dimetilaminometil)]- 2- metilfuril] urea (CAP-1) . Suponiendo así conservadoramente que las concentraciones del fármaco citosólico en el virus y células que brotan son iguales (100 µ?) , 1 porcentaje de moléculas de CAP-1 virales enlazadas a CA puede ser estimado por medio de cálculos de la acción másica estándar, que dan como resultado un valor para la concentración de CAP-1 enlazado ([CA-CAP-1]) de 94 uM. Esto indica que 94 % de las moléculas de CAP-1 en viriones inmaduros (dosis de 100 uM) enlazarían a Gag, y que el enlace de tan pocas como aproximadamente 25 moléculas de Gag por virión es suficiente para inhibir el acoplamiento nuclear durante la maduración viral. La Figura 3, muestra el ligando de molécula pequeña CAP-1 suprimido en la estructura del recubrimiento capso érico. La estructura por NMR determinada experimentalmente del recubrimiento capsomérico es utilizado para generar la superficie de Connoly. El modelo de transparencia del ligando es ilustrado en verde. La estructura del ligando es minimizada con métodos ab initio apropiados. La estructura del recubrimiento capsomérico es coloreada para representar hidrofobicidad (azul, , más hidrofóbica; rojo, más hidrofilico; blanco, hidrofobicidad intermedia) . Las interacciones importantes determinadas experimentalmente se muestran en la Figura 4. Es notable la interacción entre el anillo aromático de Tyr 145 y el furano de CAP_1; el cloro del anillo aromático en CAP-1 y la cadena lateral hidrofóbica de lie 37; la interacción del azufre en el componente disulfuro de la molécula y el grupo hidroxilo de Ser 146; y la cadena lateral hidroxilo de Ser 33 y el nitrógeno del substituyente dimetilaminometilo en la posición 5 del furano de CAP-1.
Otras ureas incluyendo todas las descritas en la presente solicitud se determinan experimentalmente por poseer interacciones funcionalmente muy similares con el recubrimiento proteinico. Esto es evidente de los datos de RMN bidimensional presentados en las Figuras 13-14, posteriores . Los datos del examen del espectro de NMR multidimensional del recubrimiento capsomérico en la presencia de los ligandos CAP-1 y sus homólogos estructurales demuestran la existencia de un sitio de enlace potencialmente de alta afinidad por los ligandos. Se encontraron inesperadamente una multiplicidad de interacciones selectivas y especificas, las cuales no solamente demuestran la existencia de un sitio tal, sino que ayudan a sugerir como ligandos de muy alta afinidad deben de ser diseñados para el sitio. Se observó que varios aspectos estructurales representan requerimientos para el ligando. Es necesario tener un grupo diferente de arilo o fenilo substituido en un lado de la molécula, el cual contiene un substituyente relativamente voluminoso. En la situación actual, el átomo de cloro sirve para este propósito. No obstante, los datos experimentales combinados con el modelo de ajuste sugieren que el uso de un átomo de Br- o aún I- debe de incrementar la afinidad de enlace. Otros substituyentes en este anillo aromático no son como se indicó claramente en términos de posición, sino que el modelo del sitio de enlace seria afectado positivamente, en nuestra vista, con la inclusión de un substituyente tal como ciano o dialquilamino orto- en el halógeno. Las porciones 3, 4-diclorofenil o 3- 4- bromo fenilo también serian activas.
La posición relativa del átomo de azufre en CAP-1 es muy significativa. Es probable que usando un estado de oxidación diferente del azufre no condujo por si mismo a la actividad en el sistema actual. Esto es cierto para una sulfota o sulfonamida. El furano podría igualmente ser reemplazado con una variedad de grupos heterocíclicos con varios substituyentes en la cadena lateral. Además en el dimetilaminometilo, el reemplazo de este grupo con grupos tales como guanidina, N-cianoguanidina, N- nitroguanidina, y los mismos producirían probablemente compuestos activos .
Los compuestos con afinidad más alta por Gag citosólico serán concentrados al acoplar los virus, y compuestos con afinidad más grande por CA son inhibidores más potentes del acoplamiento in vitro. Por consiguiente, es posible diseñar racionalmente agentes con potencia creciente como inhibidores antivirales del acoplamiento del recubrimiento capsomérico de HIV-1. Se describen también derivados de CAP-1, CAP-2, CAP-3, CAP-4, CAP-5, CAP-6 o CAP-7 que son compuestos antivirales que enlazan en el sitio apical de la región N-terminal del recubrimiento capsomérico de HIV-1 e inhibe el acoplamiento apropiado de la partícula nuclear. En particular, la invención proporciona derivados de CAP-l o sus moléculas relacionadas que contienen un grupo urea que contiene un substituyente aromático substituido en un nitrógeno y una ligadura flexible fijada a un segundo grupo aromático en el otro nitrógeno. Por ejemplo, dichos derivados son compuestos o sales aceptables farmacéuticamente que tengan la fórmula I: en donde : (a) Ri representa hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -OR8, -SR8, NHR8, -NR8R9, -NHC00H, ~NHCH2COOH, - HCHRgCOOH, NHCR8R9COOH, -NR8COOR9, -COOR8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (b) R2 representa hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -0R8, -SR8, -NHR8, -NR8R9, -NHC00H, -NHCH2C00H, -NHCHRgCOOH, -NHCR8R9COOH, -NR8COOR9, -COORg o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (c) R3 representa hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -0R8, -SR8, -NHR8, -NR8R9, -NHCOOH, -NHCH2COOH, -NHCHR8COOH, -NHCR8R9COOH, -NR8COOR9, -COOR8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (d) R4 representa hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -OR8, -SR8, -NHR8, - R8Rg, -NHCOOH, -NHC¾COOH, -NHCHRgCOOH, -NHCRBR9COOH, -NRsCOORg, -COOR8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (e) R5 representa hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -OR8, -SR8, -NHRa, -NR8R9, -NHCOOH, -NHC¾COOH, -NHCHR8COOH, -NHCR8RsCOOH, -NR8COOR9, -COOR8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (f) El halógeno se limita a flúor, cloro, bromo, y yodo (g) R8 y R9 son independientemente metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo, sec-butilo, t-butilo, pentilo, hexilo, neo-pentilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclopropilmetilo, ciclopropiletilo, ciclobutilmetilo, ciclobutiletilo, ciclopentilmetilo, ciclohexilmetilo, o ciclohexiletilo (h) Las letras rx, m y p representan independientemente cualquier entero de 1 a 6 (i) ¾ y R7 son seleccionados independientemente del grupo que consiste de hidrógeno o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 6 átomos de carbono (j) X es seleccionado del grupo que consiste de 0 o S. (k) Y es heterociclico, carboxílico, o fenilo opcionalmente substituido . (1) El heterociclico es seleccionado de cualquier anillo estable de 5, 6, o 7 elementos monocíclico o bicíclico o de 7, 8, 9 o 10 elementos bicíclico heterociclico, el cual es saturado, parcialmente insaturado o insaturado (aromático) , y que consiste de átomos de carbono y 1, 2, 3, o 4 heteroátomos independientemente seleccionados del grupo que consiste de N, NH, 0 y S y que incluye cualquier grupo bicíclico en el cual cualquiera de los anillos heterocíclicos definidos anteriormente está fusionado a un anillo benceno. Los heteroátomos nitrógeno y azufre pueden ser opcionalmente oxidados. El anillo heterociclico puede estar fijado a su grupo suspendido en cualquier eteroátomo o átomo de carbono, lo cual da como resultado una estructura estable. Los anillos heterocíclicos descritos en la presente pueden ser substituidos en un átomo de carbono o de nitrógeno si el compuesto resultante es estable. Si se hace notar específicamente, un nitrógeno en el heterociclo puede ser cuaternizado opcionalmente . Se prefiere que cuando el número total de átomos de S y de 0 en el heterociclo exceda 1, entonces estos heteroátomos no son adyacentes entre si. Como se hizo notar en la presente, el término "sistema heterociclico aromático" se pretende que signifique un anillo aromático estable de 5- a 7-elementos monociclico o biciclico o de 7- a 10- elementos biciclico heterociclico que consiste de átomos de carbono y desde 1 a 4 heteroátomos independientemente seleccionado del grupo que consiste de N, 0 y S. Ejemplos de heterociclos incluyen, pero no se limitan a, 1H- indazol, 2- pirrolidonilo, 2H, 6H- 1, 5, 2- ditiazinilo, 2H-pirrolilo, 3H- indolilo, 4- piperidonilo, 4aH-carbazol, 4H- quinolizinilo, 6H- 1, 2, 5- tiadiazinilo, acridinilo, azocinilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, benzotiofuranilo, benzotiofenilo, benzoxazolilo, bencitiazolilo, bencitriazolilo, bencitetrazolilo, bencisoxazolilo, bencisotiazolilo, bencimidazalonilo, carbazolilo, 4aH-carbazolilo, ß- carbolinilo, cromanilo, cromenilo, cinolinilo, decahidroquinolinilo, 2H, 6H- 1, 5, 2- ditiazinilo, dihidrofuro[2, 3-b]tetrahidrofurano, furanilo, furazanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, imidazolilo, IH-indazolilo, indolenilo, indolinilo, indolizinilo, indolilo, isobenzofuranilo, isocromanilo, isoindazolilo, isoirtdolinilo, isoindolilo, isoquinolinilo (bencimidazolilo) , isotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo, naftiridinilo, octahidroisoquinolinilo, oxadiazolilo,- 1, 2, 3-oxadiazolilo, 1, 2, 4- oxadiazolilo, 1, 2, 5-oxadiazolilo, 1, 3, 4- oxadiazolilo, oxazolidinilo, oxazolilo, oxazolidinilperimidinilo, fenantridinilo, fenantrolinilo, feixarsazinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxatiinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, piperazinilo, piperidinilo, pteridinilo, piperidonilo, 4- piperidonilo, pteridinilo, purinilo, piranilo, pirazinilo/ pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinilof piridazinilo, piridooxazol, piridoimidazol, piridotiazol, piridinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, 4H-quinolizinilo, quinoxalinilo, q inuclidinilo, carbolinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, 6H- 1, 2, 5- tiadiazinilo/ 1, 2, 3-tiadiazolilo, 1, 2, 4- tiadiazolilo, 1, 2, 5-tiadiazolilo, 1, 3, 4- tiadiazolilo, tiantrenilo, tiazolilo, tienilo, tienotiazolilo, tienooxazolilo, tienoimidazolilo, tiofenilo, triazinilo, 1, 2, 3-triazolilo, 1, 2, 4- triazolilo, 1, 2, 5- triazolilo, 1, 3, 4- triazolilo, tetrazolilo, y xantenilo. los heterociclos preferidos incluyen pero no se limitan a, piridinilo, tiofenilo, furanilo, indazolilo, benzotiazolilo, bencimidazolilo, benzotiafenilo, benzofuranilo, benzooxazolilo, benciisoxazolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, imidazolilo, indolilo, isoindolilo, piperidinilo, piperidonilo, 4- piperidonilo, piperonilo, pirrazolilo, 1, 2, 4- triazolilo, 1, 2, 3-triazolilo, tetrazolilo, tiazolilo, oxazolilo, pirazinilo, y pirimidinilo, y anillos fusionados y compuestos espiro que contengan los heterociclos anteriores. (m) Con carboxilico, se pretende querer decir cualquier anillo estable de 3, 4, 5, 6 o 7- elementos monociclico o biciclico 0 de 7, 8, 9, 10, 11, 12, o 13 elementos biciclico o triciclico, cualquiera de los cuales puede ser saturado, parcialmente insaturado, o aromático. Ejemplos de dichos carbociclos incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, adamantilo, ciclooctilo; [3.3.0] biciclooctano, [4.3. Ojbiciclononano, [4.4. Ojbiciclodecano (decalin) , [2.2.2]biciclooctano, fluórenlo, fenilo, naftilo, indanilo, adamantilo, o tetrahidronaftilo (tetralin) . (n) El fenilo substituido se define por medio de la fórmula II en donde: (o) Rio representa hidrógeno/ halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -0R8, -SR8, -NHR8, -NR8R9, -NHCOOH, -NHC¾COOH, -NR8COOR9, -COOR8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono ; (P) Rii representa independientemente hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -0R8, -SR8, -NHR8, -NR8RS, -NHCOOH, -NHC¾COOH, - R8COOR9, -COORa o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (q) R12 representa independientemente hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -OR8, -SR8, -NHR8, -NR8R9, -NHCOOH, -NHCH2C00H, -NR8COOR9, -C00R8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (r) Rj.3 representa hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -0RB, -SR8, -NHR8, -NR8R9, -NHCOOH, -NHCH2C00H, -NR8COOR9, -COOR8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (s) Ri4 representa hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -0R8, -SR8, - HR8, -NR8Rg, -NHCOOH, -NHCH2CO0H, -NR8COOR9, -COOR8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (t) R8 y Rg son independientemente metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo, sec-butilo, t-butilo, pentilo, hexilo, neo-pentilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclopropilmetilo, ciclopropiletilo, ciclobutilmetilo, ciclobutiletilo, ciclopentilmetilo, ciclohexilmetilo, o ciclohexiletilo (u) El halógeno se limita a flúor, cloro, bromo, y yodo . Composiciones terapéuticas que comprenden compuestos que enlazan en la fisura apical del recubrimiento proteínico del HIV-1 pueden ser administradas de manera generalizada o tópicamente. Las rutas generalizadas de administración incluyen oral, inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea (incluyendo en un depósito para liberación a largo plazo), intraocular y retrolobular, intrarráquidea, intraperitoneal (por ejemplo, por lavado intraperitoneal) , intrapulmonar usando eí fármaco nebulizado o aerosolizado, o transdérmica . Las rutas tópicas incluyen la administración en la forma de salvas, gotas oftálmicas, gotas auditivas, fluidos para irrigación (para, por ejemplo, irrigación de heridas) o champús medicados. Los expertos en la materia pueden optimizar fácilmente dosificaciones efectivas y regímenes de administración para composiciones terapéuticas que comprenden compuestos que enlazan a la fisura apical del recubrimiento capsomérico de HIV-1, como se determina por las buenas prácticas médicas y las condiciones clínicas del paciente individual . La administración de compuestos que enlazan a la fisura apical del recubrimiento proteínico de HIV-1, se logra preferiblemente con una composición farmacéutica que comprende un compuesto tal y un diluyente, adyuvante o portador aceptable farmacéuticamente. El compuesto puede ser administrado sin o conjuntamente con surfactantes conocidos, otros agentes quimioterapéuticos o agentes antivirales conocidos. Otros aspectos y ventajas de la invención se comprenderán a partir de consideraciones de los ejemplos ilustrativos siguientes. El Ejemplo 1, describe la estructura completa y las dinámicas de Gag283. El ejemplo 2, describe la estructura de la región CA de Gag283. El ejemplo 3, describe la estructura de la región CAN de Gag283. El ejemplo 4, describe la identificación del sitio de enlace del ligando en la región N-terminal de CA. El Ejemplo 5, describe la inhibición in vitro del acoplamiento del recubrimiento capsomérico por medio de compuestos que enlazan a la fisura apical de la proteina del recubrimiento de HIV-1. El ejemplo 6 describe la inhibición de la infectividad viral por medio de compuestos que enlazan a la fisura apical de la proteina del recubrimiento del HIV-1. El ejemplo 1, describe la inhibición in vivo del acoplamiento del recubrimiento proteinico. EJEMPLO 1 La Estructura Completa y la Dinámica de Gag283 Se clonó un polipéptido recombinante de 32.2 kD (Gag283) correspondiente a los 283 residuos N-terminales de HIV-lpNL4_3 (más una hexahistidina marcada C-terminal) y se preparó para estudios por NMR (MRcalc = 32216.6 Daltones, MRexp = 32216.1 ± 0.8 Daltones. Se obtuvieron espectros por NMR de alta calidad (Fig. 5), que facilita estrechamente completar las señales del a?, 15N y 13C NMR. Los desplazamientos químicos por NMR de los átomos de la estructura principal son indicadores de una estructura muy helicoidal (Figura 6) . Los residuos Gly 2- Ser 6, Gly 123- Val 143 y Pro 279-Leu 283 exhibe valores de NOE (XNOE) heteronuclear por 15N- [lE] y valores de relajación relativamente bajos (Figura 6) , asi como también poco o ningún ^?^? NOEs de intervalo medio lo que indica que estos residuos son conformacionalmente lábiles. Se empleó un total de 2,376 restricciones derivadas experimentalmente (2046 restricciones de distancia y 332 restricciones de ángulo de torsión, correspondientes a 17.7 restricciones por residuo restringido) para los residuos relativamente no lábiles Val 7- Thr 122 y His 144-Ser 278. Veinte estructuras refinadas con funciones objetivo de 1.50 ± 0.24 Á y se generaron buenas estadísticas estructurales (Figura 7) con DYANA. Los residuos Val 7- Thr 122 de MA e His 144-Ser 278 de CAN exhibieron buena convergencia, con desviaciones de RMS en parejas para átomos de la estructura principal pesada de las helicoidales de 0.41 ± 0.09 y 0.72 ± 0.14 Á, respectivamente. Ya que no se emplearon para los residuos móviles que conectan a las regiones plegadas (Gly 123-Val 143), y no se observaron NOEs entre las regiones, la orientación relativa de las regiones MA y CAN no se definió. Los cálculos indicaron que las dos regiones pueden separarse por hasta 80 Á cuando los residuos Gly 123-Val 143 están completamente extendidos. ' Las relaciones Ti/T2 obtenidas para los grupos NH de la estructura principal indicaron que las regiones ffi y CA pierden estabilidad con tiempos de correlación rotacional diferentes. Para ambas regiones las relaciones Ti/T2 (= ¾/¾.) para residuos de helicoidales diferentes fueron generalmente aglomeradas, lo cual es indicativo de difusión rotacional anisotrópica, (Figura 8) . Errores asociados con las relaciones Ti/T2 de la región CAN son algo mas grandes que los de la región MA a la linea de anchos más grandes de las señales de CAN (y señales más pequeñas correspondientes a la proporción de fondo) (Figura 6) . Los aglomeramientos relativamente pobres observadas para algunas helicoidales de la región CAN (especialmente la helicoidal 7) es probablemente debido a la presencia de débiles interacciones intermoleculares CAN-CAN. Realmente la dispersión de las relaciones T1/T2 para una helicoidal dada disminuyó cuando se redujeron las concentraciones de la muestra desde 1.0 a 0.25 mM, pero las relaciones ??/?? promedio no fueron afectadas esencialmente. Las propiedades de difusión rotacional de las regiones MA y CA se calcularon independientemente. Se obtuvieron mejores adaptaciones estadísticas usando modelos de difusión simétrica axialmente alargados, que produjeron tiempos de correlación rotacional de 10.0 ± 0.1 ns y 13.2 ± 0.2 ns para las regiones MA. y CAN, respectivamente. Los ejes principales de los tensores de difusión (es decir, los ejes hacia los cuales la difusión rotacional es más estable) son estrechamente coincidentes con vectores que conectan los residuos N— y c- terminales de las regiones plegadas (Figura 1) . EJEMPLO 2 Estructura de la Región MA de Gag283 La estructura de la región MA de Gag283 fue esencialmente idéntica a la observada para la proteína madura, aislada. La superposición de los átomos de la estructura principal pesada de residuos rígidos de las estructuras por NMR de MA madura e inmadura produjeron desviaciones por RMS en parejas de 1.27 ± 0.005 Á . L estructura tuvo mejor concordancia con la estructura de rayos X del trímero de MA maduro (1.14 ± 0.09 Á ) debido al uso de metodologías más modernas en el estudio por NMR corriente (es decir, restricciones basadas en el desplazamiento químico y el uso de datos por NMR en 4D) . El ajuste mejoró a 0.90 ± 0.11 Á cuando una helicoidal de 3¿o que sufrió cambios conformacionales a partir de la trimerización (Pro 66- Gly 71) fue removida de la adaptación con la estructura por rayos X. Los datos de 1H-1H NOE indicaron que la helicoidal C-terminal se extiende más allá de la porción globular de la región al residuo Thr 122. No obstante, los índices de desplazamiento químico Ce diminuyeron progresivamente desde la helicoidal a los valores de la espiral aleatorios para el residuo lie 104-Gln 117, y junto con los datos de relajación indicaron un desplazamiento progresivo desde la helicoidal predominantemente a las conformaciones en espiral aleatorias predominantemente (Figura 4) . Este hallazgo fue consistente con los datos estructurales de rayos X reportados para el trímero de MA maduro, en la cual la densidad electrónica para estos residuos varió substancialmente entre las seis moléculas diferentes de la unidad celular. EJEMPLO 3 Estructura de la Región CAB de Gag283 La estructura completa de la región CAN de Gag283 es muy similar a la observada para la región CAN madura. Para facilitar las comparaciones, el esquema de numeración de aminoácidos de CAN inmadura se usó también para la región madura (es decir, Pro 133 es el residuo N-terminal de CAN madura) . Los residuos Ser 148-Lys 162, Ser 165-Ser 176, Thr 180-Val 191, His 194-His 216, Arg 232-Ala 237, Thr 242- Thr 251, Val 258-Ser 278 forman siete helicoidales a (helicoidales 1 - 7, respectivamente) que son empacados juntos en una forma plana y triangular, y los residuos Pro 217- Pro 231 (que incluyen el sitio de enlace CypA) forman un bucle flexible conformacionalmente . La superposición de los átomos de estructura principal pesada de los residuos helicoidales de las formas madura e inmadura de las estructuras por RMN de CAN produjeron desviaciones por RMN en parejas de 1.32 ± 0.13 Á. En contraste, la conformación de los residuos Pro 133-Val 143 de Gag283 es substancialmente diferente de la observada en la proteina de CAN madura. No se observaron 1H-1H NOEs de intermediarios de intervalo largo para estos residuos, y los datos del Indice de desplazamiento químico indicaron que existen en conformaciones en espiral aleatorias (Figura 6) . También, las propiedades de relajación del 15N-NMR de estos residuos indicaron un alto grado de movilidad conformacional (Figura 6) . En la región CAN madura, los residuos Pro 133-Asn 137 en pareja con los residuos Gln 141-Gln 145 para formar hebras anti-paralelas de una horquilla ß que empaca contra la helicoidal- 6, y el grupo NH2+ de la estructura principal de Pro 133 forma un puente salino con la cadena lateral parcialmente oculta de sp 183. Además, aunque los residuos His 144-Ile 147 interactúan con la porción globular de la región CAN tanto en las estructuras madura como en la inmadura, las diferencias en los datos de NOE indicaron diferencias estructurales sutiles pero significativas. Por ejemplo, en la región CAN madura, los protones de His 144-?ß exhibieron NOEs de intensidad moderada con los protones del metilo de la cadena lateral de Ile-247 (helicoidal 6) , mientras que estos grupos dan origen a NOEs muy débiles en la región madura. Además la helicoidal 6 fue desplazada por aproximadamente 2 Á en relación a su posición en la proteina madura Figuras 10 y 11) . En la región inmadura, la cadena lateral de Thr 180, la cual cubre a la helicoidal 3, empaca en un aglomerado hidrofóbico formado por las cadenas laterales de Leu 243, lie 247 y Met 250 de la helicoidal 6 (Figura 9) , y se observaron 1H-1H NOEs muy fuertes entre los grupos metilo de Thr 189 e lie 247. No obstante, en la proteina madura, la cadena lateral de lie 134 es insertada en su vesícula hidrofóbica, dando como resultado una separación de aproximadamente de 2 Á de las cadenas laterales de Thr 180 e lie 247 y una reducción substancial en las intensidades de los NOEs de los inter-residuos asociados. Además, el ángulo X2 de la cadena lateral de Leu 243 difiere por aproximadamente una rotación de 90°, y el grupo metilo de Met 250 es reorientado en la región inmadura de manera de llenar parcialmente el espacio ocupado por la cadena lateral de lie 134 de la región madura (Figura 9) . La helicoidal 6 también hace contacto con el bucle de enlace CypA. Aunque el bucle es flexible, una comparación cuantitativa de los dos conjuntos de estructuras de RMN indicó que Pro 222, el cual enlaza en el sitio activo de CypA, fue desplazado por varios Angstroms en relación a su posición en la región CAN madura (Figura 10) . Se observaron diferencias significativas en los desplazamiento químicos por ??, 15N y 13C para los residuos Pro 133-Ile 147, los cuales se extendieron en la proteína inmadura pero forman una horquilla ß en la región madura (Figura 11) . Se observaron también desplazamientos significativos para Ala 179, Thr 180, lie 243, lie 247, Met 250 y Leu 243, los cuales interactúan con la lámina ß en la región CA N madura. Estas diferencias de desplazamientos fueron completamente consistentes con los cambios estructurales descritos anteriormente. Finalmente, se observaron doblaje de señal e intercambio de amplitud R2 para las amidas de estructura principal de Glu 177 y Gly 178 (Figuras 5 y 6) . No hubo cadenas laterales aromáticas voluminosas en la vecindad de estos residuos que deban causar estos efectos. A diferencia, el doblaje de señal fue debido a la heterogeneidad en los ángulos de torsión F y ? asociados con los enlaces peptídicos de Glu 177-Gly 178-ala 179. No se observaron señales dobles para estos residuos en la proteína madura en la cual el carbonilo de Gly 178 forma un enlace hidrógeno con el NH de la estructura principal de lie 134 de la horquilla ß. EJEMPLO 4 Identificación de un sitio de enlace de ligando de la región N-terminal de CA El DNA que codifica a la región N-terminal de CA (residuos 1 - 151) fue amplificado desde el plásmido pNL-4-3 del cDNA de HIV-1 y un oligonucleótido que codifica a una hexahistidina terminal marcada fue anexada al gen. El DNA fue insertado en un vector de expresión pila (Novagen, Madison, WI) , y el producto proteinico fue purificado por cromatografía por afinidad con cobalto (Clontech, Palo alto, CA) ; PMcalc = 175230.0 daltones, PMobs = 17523.10 ± 0.44 daltones (espectrometría de Masa por electronebulización) . El plásmido para la proteina del recubrimiento nativa, de extensión total fue amablemente proporcionado por el Dr. W.I. Sundquist (ühiversity of Utah, Salt Lake City, UT) , y la proteína fue purificada como se describió. El espectro de NMR fue asignado usando métodos de triple resonancia convencionales . Las isotermas de enlace de los experimentos de titulación con 1H-15N NMR HSQC fueron calculados con el programa ORIGIN 7.0 (MicroCal, Northhampton, MA) . Para identificar compuestos que inhiban las funciones de la proteína del recubrimiento, se cribaron bibliotecas públicas de regiones químicas para compuestos que deben de enlazar a fisuras sobre la superficie de la proteína del recubrimiento y se probaron para enlace usando espectroscopia de titulación por NMR. Los esfuerzos del cribado se enfocaron principalmente sobre una fisura de horquilla ß que se expuso sobre la superficie de la región N-terminal de la proteína del recubrimiento capsomérico inmaduro pero se convierte en ocupado por los residuos de un ahorquilla ß que se forma después de fragmentación proteolítica de Gag. Se cribaron compuestos de bibliotecas públicas de regiones químicas usando DOCK-4.0, y 40 compuestos con buenas propiedades teóricas de enlace (energía de enlace < - 26 kCal/mol, Calificación de Contacto < - 40) fueron experimentalmente probados por enlace a la proteína de CA intacta, la región N-terminal de CA, y un fragmento de 283 residuos de la poliproteína de Gag inmadura (Gag283) . Se identificaron varios compuestos que enlazan ala proteína del recubrimiento capsomérico en un sitio que parece ser importante para el acoplamiento del recubrimiento capsomérico. Los compuestos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, N- (3- cloro-4- metilfenil) - N' - [2- tioetil- 2'- [5- (dimetilaminometil) ]- 2- metilfuril] urea (CAP-1) , N- (4-N- acetamidofenil) - N' - (3- nitro- 4- metilfenil) urea (CAP-2) , N- (2- propil)- N' - (3- nitro- 4- metilfenil) urea (CAP-3) , N- (3- cloro- 4- metil fenil)- N' - (4-cianofenil) urea (CAP-4), N- (3- cloro- 4- metil fenil) -N'- [4- (1,1,1- triclorometil) fenil] urea (CAP-5) , N- (3-nitro- 4- fluorofenil) - Nf-[3- (1,1,1- trifluorometil) fenil] urea (CAP-6) , N- [(3- cloro- 4- metil fenil)- N' , '- propil] urea (CAP-7) . Un compuesto, N- (3- cloro- 4-metilfenil) - W- [2- tioetil- 2'- [5- (dimetilaminometil) ]-2- metilfuril] urea (CAP-1) fue particularmente bien tolerado en cultivos celulares que facilitan los estudios mecánicos y antivirales dn vdvo descritos posteriormente.
La región N-terminal madura fue titulada con N- (3-cloro- 4- metilfenil)- N'- [2- tioetil- 2'- [5- (dimetilaminometil) ]- 2- metilfuril] urea (CAP-1). Los datos de 1H-15N HSQC NMR representativos a partir de la titulación de NTD madura con CAP-1 se muestran en la Figura 12. Aunque la mayoría de las señales no fueron afectadas por la titulación, un subgrupo de señales desplazadas como una función de la concentración creciente de CAP-1, que indican el enlace en sitio especifico. De manera similar, se titularon otros compuestos que enlazan a la fisura apical de la región N-terminal de la proteina del recubrimiento capsomérico de HIV-1. En la Figura 13, se proporciona la superposición de los datos de 1H-15N HSQC NMR obtenidos a partir de la titulación de los compuestos CAP-1, CAP-2, CAP-3, y CAP-4 con la NTD del recubrimiento capsomérico de HIV-1. Los compuestos CAP-1 y CAP-2 enlazan al sitio apical de la proteína, como es obvio por los cambios en el desplazamiento químico específico como una función del compuesto añadido. Ligeras perturbaciones y ampliaciones de señal se observaron a partir de la adición de CAP-3 y de CAP-4, indicador de enlace muy débil. En la Figura 14 se proporciona, la superposición de los datos de 1H-15N HSQC NMR obtenidos en la presencia y en ausencia de compuestos de enlace del recubrimiento capsomérico CAP-5, CAP-6, y CAP-7 con la NTD del recubrimiento capsomérico de HIV-1. Las señales perturbadas por el enlace se muestran en círculos. Para comparación, los resultados obtenidos con dos compuestos relacionados estructuralmente que no enlazan a la proteína del recubrimiento capsomérico se muestran también en la Figura 14. Los cambios en el desplazamiento químico ajustados a las isotermas de enlace 1:1 produjeron una constante de disociación de equilibrio (¾) de 0182 ± 0.18 mM a 35 °C (Figura 15) . Se observó enlace significativamente más cerrado para un segundo compuesto, 1- (4- (N- metil-acetamido) fenil)- 3- (4- metil- 3- nitrofenil) urea (CAP-2), ¾ = 52 ± 27 uM. En ambos casos, los residuos de CA perturbados por el enlace (1HN ?d > 0.1 ppm; 15N ?d > 0.5 ppm; Glu 29, Lys 30, Ala 31, Phe 32, Ser 33, Glu 35, Val 36, Val 59, Gly 60, His 62, Gln 63, Ala 65, Met 144, y Tyr 145) se localizaron en o cerca del ápex de un haz de helicoidal (helicoidales 1, 2, 3, 4 y 7) . Se obtuvieron resultados esencialmente idénticos por titulaciones con Gag283 y CA intacto, lo que indica que el sitio de enlace permanece inaccesible en construcciones similares a Gag que contienen las regiones de la matriz N-terminal nativa (??) y C-terminal del recubrimiento capsomérico (CTD) , y el enlace es insensible al estado de maduración de la proteina. E.TEMPLO 5 Inhibición ln vitro del acoplamiento del Recubrimiento Capsomérico Se efectuaron ensayos de turbidez a 21 °C usando un espectrofotómetro Beckman DU650 que operó a 350 nm de longitud de onda. Se añadió el ligando concentrado en DMSO (0.2 µ?) a 250 µ? de una solución acuosa que contenia la proteina del recubrimiento capsomérico ([CA] = 60 uM [NaH2P04] = 50 mM; pH 8.0) . Se removieron las partículas por centrifugación, y el acoplamiento del recubrimiento capsomérico se inició por adición de una solución concentrada de NaCl (5 M, 250 µ?) .Se hicieron mediciones espectrales cada 10 s, después de un corto lapso inicial para permitir el equilibrio de la muestra. Se estimaron las velocidades relativas del acoplamiento de las pendientes iniciales de las gráficas de la absorbancia vs . El tiempo. En ausencia de otros constituyentes virales, la CA de HIV-1 puede acoplarse en tubos con aspectos estructurales que parecen núcleos maduros. La formación del tubo conduce al incremento de la turbidez de la muestra que puede ser monitoreada espectrofotométricamente, y se usó este ensayo para sondear los efectos inhibidores potenciales de los compuestos CAP sobre el acoplamiento del recubrimiento capsomérico in v tro. Como se muestra en la Figura 17, la disolución de la CA de HIV-1 nativa en regulador de acoplamiento (50 mM de regulador de fosfato, pH 8.0, NaCl 2.5 M , 0.04 % en volumen de DMSO) condujo a un incremento en la absorbancia a una velocidad inicial de 204 ± 36 mOD/min (determinado de la pendiente inicial y reportado como la media ± la desviación estándar de los tres experimentos) . Como se esperó, los compuestos probados que no enlazaron a CA no afectaron la velocidad de acoplamiento. No obstante, la velocidad de acoplamiento disminuyó de una manera dependiente de la dosis tanto para CAP-1 como para CAP-2, con el más cerrado enlace de CAP-2 que tuvo un efecto más pronunciado. Como se muestra en la Figura 16, las velocidades de acoplamiento inicial en la presencia de CAP-1 disminuyó a 93 ± 3 y 67 ± 16 mOD/min a proporciones de CAP-1 : CA de 1:1 y 2:1 respectivamente.
Para comparación, las velocidades de acoplamiento en la presencia del enlace más cerrado de CAP-2 disminuyeron a 81 í 2 y 39 + 11 mOD/min a las proporciones de CAP-2 : CA de 0.1:1 y 1:1 respectivamente. Estos datos confirmaron que los compuestos que enlazan a CA pueden inhibir el acoplamiento del recubrimiento capsomérico in-vitro, y que la eficiencia relativa de la inhibición del acoplamiento es dependiente de la afinidad de los ligandos para la proteina de CA. EJEMPLO 6 Inhibición de la Infectividad Viral Se mezclaron células UI (5 x 105 células/mi) con TNF-a (10 ng/ml, Sigma) para la activaáii de la producción del virión de HIV y se trataron con CAP-1 a concentraciones diferentes. Se cosecharon los cultivos 72 horas después del tratamiento. La viabilidad celular se midió usando el ensayo de proliferación celular MTS (CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI) . Se colectaron los sobrenadantes, se removieron los desechos celulares por centrifugación a baja velocidad, y las partículas en los sobrenadantes se compactaron por microcentrifugación. Unidades infecciosas asociadas con las partículas fueron medidas como se describe en Kimpton y colaboradores, Detection of replication-competent and pseudotyped HIV it a sensitive cell line on the basis of activation of an integrated ß-galactosidasa gene, J. Virol. 66: 2232-39, 1992, excepto que las actividades ß-galactosidasa fueron medidas usando un sistema detector Trópica Gal-Screen (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Se determinaron las actividades RT asociadas con partículas como se describe en Huang, y colaboradores, p6Gag is required for particle production from full length human immunodeficiency virus type 1 molecular clones expressing proteasa, J. Virol-, 96: 6810-18, 1995. Los lisados celulares y las partículas compactadas fueron sometidas a análisis por SDS-PAGE usando suero de pacientes de AIDS (AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIH) . Se efectuaron ensayos cuantitativos con p24 (CA) con el equipo Antigen Capture ELISA para p24 de HIV-1 (programa de vacuna para AIDS, FCRDC/SAIC/NCI, Frederick, MD) . Se lavaron células MAGI después de adsorción viral (HIV-IRF) con PBS y se alimentó medio recientemente preparado que contenía CAP-1 a concentraciones diferentes. 72 horas post-infección, los sobrenadantes del cultivo se cosecharon y se pre-clarificaron. Las partículas de virus presentes en los sobrenadantes fueron colectadas por microcentrifugación y se midieron subsecuentemente la infectividad y la actividad RT asociada a las partículas. Los compuestos de CAP fueron probados para toxicidad y actividad antiviral usando HVI-1 que produjo células UI infectadas latentes . Este ensayo permite la evaluación de los efectos antivirales en eventos de replicación en fase tardía. Aunque CAP-2 fue también citotóxico para evaluaciones in vivo, CAP-1 no fue tóxico bajo las condiciones empleadas, y su aplicación condujo a reducciones dependientes de la dosis en la infectividad del sobrenadante, Figura 17. A 100 uM de CAP-1, las células UI fueron completamente viables, pero se redujo la infectividad en aproximadamente 95 % en relación con muestras no tratadas, Figuras 18 y 19. Para determinar si CAP-1 afecta la expresión genética viral y la producción de partículas, actividad transcriptasa inversa (RT) y los niveles de CA (p24) se midieron para los sobrenadantes después de compactación y remoción de las células. Como se muestra en la Figura 18, tanto los niveles de CA como las actividades RT no fueron afectados por CAP-1, lo que indica que la actividad antiviral no es debida a la producción del virus inhibido. Además, los niveles de p24 (CA) observados en los datos de Western para muestras tratadas y sin tratar fueron muy similares, Figura 19, que indica que CAP-1 no afecta significativamente el procesamiento proteolítico de Gag. Consistente con este descubrimiento, CAP-1 no afecta la actividad proteasa in vitro. Los datos de Western de p24 también indicaron una reducción en los niveles intracelulares de Gag (p55) como una función de los niveles crecientes de CAP-1, mientras que los niveles de los productos de fragmentación de Gag p24 y p41 permanecieron relativamente sin afectar. Estos descubrimientos demostraron que CAP-1 promueve la degradación intracelular de la poliproteina de Gag de extensión total. La cuantificación de gpl20 fue también obtenida para el sobrenadante usando anticuerpos contra gpl20. No se observaron diferencias entre las muestras tratadas y sin tratar, lo que indica que CAP-1 no inhibe la síntesis o la incorporación viral de la glicoproteína de envoltura. La actividad antiviral fue probada también en un segundo ensayo celular usando cultivos celulares de MAGI . Como se observó en el ensayo con UI, el tratamiento de células MAGI que produjeron virus, infectadas con CAP-1 condujeron a reducciones dependientes de la dosis en la infectividad de partículas de virus, con unidades infecciosas que caen casi dos unidades logarítmicas a menos de 2 % de los niveles sin tratar a 100 uM de CAP-1, Figura 18. No se observaron reducciones en la actividad RT viral, proporcionando evidencia adicional de que la actividad antiviral no es debida a la producción de virus inhibida. La producción de virus tampoco fue afectada por la pre-incubación ya sea de células MAGI o de partículas virales con CAP-1, lo que indica que CAP-1 no es virucida y no inhibe directamente eventos en fase precoz. Estos datos indican colectivamente que la actividad antiviral de CAP-1 es debida a la inhibición de un evento viral en fase tardía que es diferente de eventos llevados a cabo por otros agentes anti-HIV corrientemente bajo investigación o en uso clínico. EJEMPLO 7 Inhibición in vivo del Acoplamiento del Recubrimiento Capsomérico Se compactaron células UI productoras de virus sin tratar y tratadas (CAP-1) , se lavaron en solución salina regulada con fosfato (PBS) y se resuspendieron en al menos diez volúmenes de compactado celular de fijador (100 mM de cacodilato de sodio, pH 7.2, 2.5 % de glutaraldehido, 1.6 % de paraformaldehido, 0.5 % de ácido pícrico) . Se fijaron las células por 24 - 48 horas, después de lo cual se removió el fijador y las células se lavaron dos veces en PBS y se compactaron en tubos Eppendorf de centrífuga. Los compactados celulares fueron post fijados una hora en tetróxido de osmio al 1 % más ferricianuro de potasio al 0.8 % en 100 mM de cacodilato de sodio, pH de 7.2. Después de enjuagar a fondo con agua, las células fueron pre-teñidas en acetato de uranilo al 4 % una hora, se enjuagaron profundamente, se deshidrataron, se infiltraron toda la noche en 1:1 de acetona-.Epon 812, se infiltraron una hora con resina de Epon 812 al 100 %, y se impregnaron en la resina. Después de polimerización, se cortaron secciones finas de 60 - 80 nm en un untramicrotomo de Reichert, se tiñeron 5 minutos en citrato de plomo, se enjuagaron, se post-tiñeron 30 minutos en acetato de uranilo, se enjuagaron y se secaron. Se efectuó la EM a 60 kV en un Philipsl20/Biotwin equipado con un 1024 x 1024 Gátan multiexplorador CCD, y se colectaron las imágenes en agrandamiento original de 25,880 x -36,960x, correspondiente a t resoluciones de 8.9 y 6.5 Á/pixel, respectivamente. Por cada muestra, se visualizaron 4 rejillas para EM separadas, y se colectaron al menos 47, correspondientes a un área total mínima de 35 micrones2. Ya que CAP-1 no inhibió la producción del virus, fue posible examinar los viriones producidos de células tratadas por defectos morfológicos por EM. Los recubrimientos capsoméricos de viriones maduros generalmente aparecen como estructuras centrales, cónicas (aproximadamente 30 % de las partículas) o esféricas (aproximadamente 40 %), dependiendo de la orientación del cono durante la preparación de la muestra en sección delgada, y aproximadamente 30 % de los viriones en preparaciones de EM típicamente exhibieron un fenotipo inmaduro caracterizado por la falta de densidad electrónica central. Los viriones de cultivos de células UI sin tratar generaron estos resultados típicos. No obstante, las partículas generadas de las células tratadas exhibieron mayor heterogeneidad de tamaño, lo cual es indicador de un defecto de acoplamiento de Gag. Además, solamente 35 % de las partículas de las células tratadas contuvieron un núcleo denso, localizado centralmente, en comparación con el 70 % de las células sin tratar. Más impresionantemente, ninguna de las partículas de células tratadas exhibió un núcleo con forma de cono que es la marca de contraste de HIV, lo que indica que CAP-1 inhibe el acoplamiento de un núcleo maduro. Se observaron fenotipos esencialmente idénticos previamente para viriones generados con mutaciones de CA diseñadas para interrumpir las interacciones CA-CA intermoleculares. Así, estos datos de EM, indican que CAP-1 inhibe el acoplamiento del recubrimiento capsomérico durante la maduración viral e interfiere en alguna medida con las interacciones Gag-Gag normales durante el acoplamiento de la partícula inmadura. Los expertos en la materia esperan que tengan lugar numerosas modificaciones y variaciones de la invención descrita anteriormente. Por consiguiente, solamente las limitaciones como aparecen en las reivindicaciones anexas se pondrían en ésta.
S 0 S 0

Claims (43)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un método de evaluar la actividad antiviral de un compuesto de prueba caracterizado porque comprende: a) poner en contacto el compuesto de prueba con Gag238 o un fragmento del mismo, b) determinar la habilidad del compuesto de prueba para enlazar a la fisura apical cerca del extremo C-terminal de la región N-terminal de una proteina del recubrimiento capsomérico, y c) evaluar el efecto antiviral del compuesto.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina de recubrimiento capsomérico es seleccionada del grupo que consiste de proteínas del recubrimiento capsomérico viral y proteínas del recubrimiento capsomérico retroviral.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína del recubrimiento capsomérico retroviral es HIV-1.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína del recubrimiento capsomérico es madura.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína del recubrimiento capsomérico es inmadura.
6. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la proteína del recubrimiento capsomérico de HIV-1 es madura.
7. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la proteína del recubrimiento capsomérico de HIV-1 es inmadura.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la actividad antiviral es seleccionada del grupo que consiste de la inhibición del acoplamiento del recubrimiento capsomérico durante la maduración viral y la inhibición del desacoplamiento durante la infectividad.
9. Un método de reducir la mortalidad asociada con AIDS, caracterizado porque comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de un compuesto que enlaza a la fisura apical cerca del extremo C-terminal de la región N-terminal de la proteína del recubrimiento capsomérico de HIV a un humano que sufre de AIDS.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la proteína del recubrimiento capsomérico es una proteína del recubrimiento capsomérico de HIV-1.
11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el compuesto es seleccionado del grupo que consiste de N- [3- cloro- 4- metilfenil) - N' - [2-tioetil- 2'- [5- (diiaetilaminometil)]- 2- metilfuril] urea (CAP-1), N- (4- N- acetamidofenil) - N'- (3- nitro- 4-metilfenil) urea (CAP-2) , N- (2- propil)- N' - (3- nitro-4- metilfenil) urea (CAP-3) , N- (3- cloro- 4- metil fenil)- N'- (4- cianofenil) urea (CAP-4) , N- (3- cloro- 4-metil fenil)- N'- [4- (1,1,1- triclorometil) fenil] urea (CAP-5) , N- (3- nitro- 4- fluorofenil) - N'-[3- (1,1,1-trifluorometil) fenil] urea (CAP-6) , N- [(3- cloro- 4-metil fenil)- Nr , N' - propil] urea (CAP-7) .
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto es N- (3- cloro- 4-metilfenil)- N' - [2- tioetil- 2r- [5- (dimetilaminometil)]-2- metilfuril] urea (CAP-1) .
13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto es N- (4- N-acetamidofenil)- N' - (3- nitro- 4- metilfenil) urea (CAP-2) .
14. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto es N- (2- propil) -N'- (3- nitro- 4- metilfenil) urea (CAP-3) .
15. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto es M- (3- cloro- 4-metil fenil)- '- (4- cianofenil) urea (CAP-4) .
16. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto es N- (3- cloro- 4-metil fenil)- Nr- [4- (1,1,1- triclorometil) fenil] urea (CAP-5) .
17. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el compuesto es N- (3- nitro- 4-fluorofenil) - N'-[3- {1,1,1- trifluorometil) fenil] urea (CAP-6) .
18. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto es N- [(3- cloro- 4-metil fenil)- N' , N"'- propil] urea (CñP-7) .
19. Un método de tratar a un humano que sufre de AIDS, caracterizado porque comprende la etapa de administrar un compuesto que enlaza a la fisura apical cerca del extremo C-terminal de la región N-terminal de la proteina del recubrimiento capsomérico de HIV en una cantidad efectiva para reducir el número y la severidad de morbilidades .
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la proteina del recubrimiento capsomérico de HIV es una proteina del recubrimiento capsomérico de HIV-1.
21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto es seleccionado del grupo que consiste de N- (3- cloro- 4- metilfenil) - N' - [2-tioetil- 2r- [5- (dimetilaminometil) ]- 2- metilfuril] urea (CAP-1), N- (4- N- acetamidofenil) - Nr- (3- nitro- 4-metilfenil) urea (CAP-2) , N- (2- propil)- '- (3- nitro-4- metilfenil) urea (CAP-3) , N- (3- cloro- 4- metil fenil)- '- (4- cianofenil) urea (CAP-4), N- (3- cloro- 4-metil fenil)- Nr - [4- (1,1,1- triclorometil) fenil] urea (CAP-5) , N- (3- nitro- 4- fluorofenil) - N'-[3- (1,1,1-trifluorometil) fenil] urea (CAP-6) , N- [(3- cloro- 4-metil fenil)- N' , W- propil] urea (CAP-7) .
22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el compuesto es N- (3- cloro- 4-metilfenil) - N'- [2- tioetil- 2'- [5- (dimetilaminometil) ]-2- metilfuril] urea (CAP-1) .
23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el compuesto es N- (4- N-acetamidofenil) - N' - (3- nitro- 4- metilfenil) urea (CAP-2) .
24. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el compuesto es N- (2- propil) -N'~ (3- nitro- 4- metilfenil) urea (CAP-3).
25. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el compuesto es N- (3- cloro- 4-metil fenil)- N'- (4- cianofenil) urea (CAP-4).
26. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado por ue el compuesto es N- (3- cloro- 4-metil fenil)- W - [4- (1,1,1- triclorometil) fenil] urea (CAP-5) .
27. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el compuesto es N- (3- nitro- 4-fluorofenil) - Nf-[3- (1,1,1- trifluorometil) fenil] urea (CAP-6) .
28. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el compuesto es N- [(3- cloro- 4-metil fenil)- N' , N' - propil] urea (CAP-7) .
29. Un método de evaluar un compuesto por la habilidad para inhibir la formación de la horquillé de Gag283, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto el compuesto con Gag283 o un fragmento del mismo, y b) determinar la habilidad del compuesto para interferir con la formación de la horquilla ß de Gag283.
30. Un método de cribar un compuesto candidato por la habilidad para inhibir la formación de la horquillé de Gag283, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto el compuesto con Gag283 o un fragmento del mismo, y b) determinar la habilidad del compuesto para interferir con la formación de la horquilla ß de Gag283.
31. Un método de identificar un compuesto por la habilidad para inhibir la formación de la horquillé de Gag2BJ, caracterizado porque comprende: a) generar un modelo de computadora en 3D de Gag283 usando las coordenadas moleculares de Gag283, y b) usar el modelo para identificar un compuesto que enlace a Gag283.
32. Un método de identificar un compuesto que enlaza a la fisura apical cerca del extremo C-terminal de la región N-terminal de una proteina del recubrimiento capsomérico viral, caracterizado porque comprende: a) generar un modelo de computadora en 3D de Gag283, usando las coordenadas moleculares de Gag283, y b) usar el modelo para identificar un compuesto que enlaza a la fisura apical.
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porgue la proteína del recubrimiento capsomérico es una proteína del recubrimiento capsomérico de HIV-1.
34. Un método de inhibir el acoplamiento del recubrimiento capsomérico con un compuesto que enlaza a la fisura apical cerca del extremo C-terminal de la región N-terminal de una proteína de recubrimiento capsomérico.
35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la proteína del recubrimiento capsomérico es seleccionada del grupo que consiste de proteínas de recubrimiento capsomérico viral y proteínas de recubrimiento capsomérico retroviral.
36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la proteína de recubrimiento capsomérico es una proteína del recubrimiento capsomérico de HIV-1.
37. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el compuesto es seleccionado del grupo que consiste de N- [3- cloro- 4- metilfenil) - N' - [2-tioetil- 2'- [5- (dimetilaminometil) ]- 2- metilfuril] urea (CAP-1), N- (4- N- acetamidofenil}- N' - (3- nitro- 4-metilfenil) urea (CAP-2) , N- (2- propil) - 2sT - (3- nitro-4- metilfenil) urea (CAP-3) , N- [3- cloro- 4- metil fenil)- N'- (4- cianofenil) urea (CAP-4) , N- (3- cloro- 4-metil fenil)- N'- [4- {1,1,1- triclorometil) fenil] urea (CAP-5), N- (3- nitro- 4- fluorofenil) - N'-[3- (1,1,1-trifluorometil) fenil] urea (C7AP-6) , N- [(3- cloro- 4-metil fenil) - N' , W~ propil] urea (CAP-7).
38. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el compuesto es seleccionado del grupo que consiste de N- (3- cloro- 4- metilfenil)- W - [2-tioetil- 2'- [5- (dimetilaminometil)]- 2- metilfuril] urea (CAP-1), N- (4- N- acetamidofenil)- N'- (3- nitro- 4-metilfenil) urea (CAP-2) , N- (2- propil)- N'~ (3- nitro-4- metilfenil) urea (CAP-3) , N- (3- cloro- 4- metil fenil)- ?'- (4- cianofenil) urea (CAP-4), N- (3- cloro- 4-metil fenil)- N' - [4- (1,1,1- triclorometil) fenil] urea (CAP-5), N- (3- nitro- 4- fluorofenil) - N' -[3- (1,1,1-trifluorometil) fenil] urea (CAP-6) , N- [(3- cloro- 4-metil fenil)- N' , N' - propil] urea (CAP-7) .
39. Un método de inhibir el acoplamiento del recubrimiento capsomerico durante la infectividad con un compuesto que enlaza a la fisura apical cerca del extremo C-terminal de la región N-terminal de una proteina de recubrimiento capsomérico.
40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la proteína de recubrimiento capsomérico es seleccionado del grupo que consiste de proteínas de recubrimiento capsomérico viral y proteínas de recubrimiento capsomérico retroviral.
41. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la proteína de recubrimiento capsomérico es una proteína del recubrimiento capsomérico de HIV-1.
42. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el compuesto es seleccionado del grupo que consiste de N- (3- cloro- 4- metilfenil)- N' - [2-tioetil- 2'- [5- (dimetilamxnometil)]- 2- metilfuril] urea (CAP-1), N- (4- N- acetamidofenil) - W- (3- nitro- 4-metilfenil) urea (CAP-2), M- (2- propil)- N' - (3- nitro-4- metilfenil) urea CCAP-3) , N- (3- cloro- 4- metil fenil)- '- (4- cianofenil) urea (CAP-4) , N- (3- cloro- 4-metil fenil)- N'- [4- (1,1,1- triclorometil) fenil] urea (CAP-5) , N- (3- nitro- 4- fluorofenil) - N' -[3- (1,1,1-trifluorometil) fenil] urea (CAP-6), N- [(3- cloro- 4-metil fenil) - N' , N'- propil] urea (CAP-7) .
43. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el compuesto es- seleccionado del grupo que consiste de N- (3- cloro- 4- metilfenil)- N' - [2-tioetil- 2 ' - [5- (dimetilaminometil)]- 2- metilfuril] urea (CAP-1), N- (4- N- acetamidofenil)- W - (3- nitro- 4-metilfenil) urea (CAP-2) , N- (2- propil)- N' - (3- nitro-4- metilfenil) urea (CAP-3) , N- (3- cloro- 4- metil fenil)- W - (4- cianofenil) urea (CAP-4), N- (3- cloro- 4-metil fenil)- N'- [4- (1,1,1- triclorometil) fenil] urea (CAP-5), N- (3- nitro- 4- fluorofenil) - N' -[3- (1,1,1-trifluorometil) fenil] urea (CAP-6), N- [(3- cloro- 4-metil fenil) - Nf , W - propil] urea (CAP-7). 44.Un compuesto o su sal aceptable farmacéuticamente que tenga la fórmula I : en donde : (a) Ri representa hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -OR8, -SR8, NHR8, -NRsRg, -NHCOOH, -NHCH2C00H, -NHCHRaCOOH, NHCR8RsCOOH, -NR8COORg, -COORs o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (b) R2 representa hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -0R8, -SR8, -NHR8, -NR8R9, -NHCOOH, -NHCH2C00H, -NHCHR8COOH, -NHCR8R9COOH, -NR3C00Rg, -C00R8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (c) R3 representa hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro- r-0R8, -SR8, -NHR8, -NR8R9/ -NHCOOH, -NHCHzCOOH, -NHCHR8COOH, -NHCR8R9COOH, -ER8C00Rg, -COOR8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (d) R4 representa hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -OR8, -SR8, -NHR8, ~NR8Rs, -NHCOOH, -NHCH2C00H, -NHCHR8COOH, -NHCR8R9COOH, -NRgCOORg, -COORa o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (e) R-5 representa hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -0R8, -SR8, -NHR8, -NR8R9, - HCOOH, -NHCH2C00H, - HCHR8COOH, ~NHCR8R9COOH, -NR8COORg, -COOR8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (f) El halógeno se limita a flúor, cloro, bromo, y yodo ; (g) R8 y R9 son independientemente metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo, sec-butilo, t-butilo, pentilo, hexilo, neo-pentilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclopropilmetilo, ciclopropiletilo, ciclobutilmetilo, ciclobutiletilo, ciclopentilmetilo, ciclohexilmetilo, o ciclohexiletilo (h) las letras n, m y p representan independientemente cualquier entero de 1 a 6 (i) Re y Ri son seleccionados independientemente del grupo que consiste de hidrógeno o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclica que contenga cada uno hasta 6 átomos de carbono (j ) X es seleccionado del grupo que consiste de O o S . (k) Y es heterocíclico, carboxílico, o fenilo opcionalmente substituido. (1) El heterocíclico es seleccionado de cualquier anillo estable de 5, 6, o 7 elementos monociclico o biciclico o de 7, 8, 9 o 10 elementos biciclico heterocíclico, el cual es saturado, parcialmente insaturado o insaturado (aromático) , y que consiste de átomos de carbono y 1, 2, 3, o 4 eteroátomos independientemente seleccionados del grupo que consiste de N, NH, O y S y que incluye cualquier grupo biciclico en el cual cualquiera de los anillos heterociclicos definidos anteriormente está fusionado a un anillo benceno. Los heteroátomos nitrógeno y azufre pueden ser opcionalmente oxidados. El anillo heterocíclico puede estar fijado a su grupo suspendido en cualquier heteroátomo o átomo de carbono, lo cual da como resultado una estructura estable. Los anillos heterociclicos descritos en la presente pueden ser substituidos en un átomo de carbono o de nitrógeno si el compuesto resultante es estable. Si se hace notar específicamente, un nitrógeno en el heterociclo puede ser cuaternizado opcionalmente. Se prefiere que cuando el número total de átomos de S y de O en el heterociclo exceda 1, entonces estos heteroátomos no son adyacentes entre sí. Como se usa en la presente, el término "sistema heterocíclico aromático" se pretende que signifique un anillo aromático estable de 5- a 7- elementos monociclico o biciclico o de 7- a 10- elementos biciclico heterocíclico que consiste de átomos de carbono y desde 1 a 4 heteroátomos independientemente seleccionados del grupo que consiste de N, O y S. Ejemplos de heterocilos incluyen, pero no se limitan a, 1H- indazol, 2-pirrolidonilo, 2H, 6H- 1, 5, 2- ditiazinilo, 2H-pirrolilo, 3H- indolilo, · 4- piperidonilo, 4aH-carbazol, 4H-quinolizinilo, 6H- 1, 2, 5- tiadiazinilo, acridinilo, azocinilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, benzotiofuranilo, benzotiofenilo, benzoxazolilo, bencitiazolilo, bencitriazolilo, bencitetrazolilo, bencisoxazolilo, bencisotiazolilo, bencimidazalonilo, carbazolilo, 4aH-carbazolilo, ß- carbolinilo, cromanilo, cromenilo, cinolinilo, decahidroquinolinilo, 2H, 6H- 1, 5, 2- ditiazinilo, dihidrofuro[2, 3-bJtetrahidrofurano, furanilo, furazanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, imidazolilo, IH-indazolilo, indolenilo, indolinilo, indolizinilo, indolilo, isobenzofuranilo, isocromanilo, isoindazolilo, isoindolinilo, isoindolilo, isoquinolinilo (bencimidazolilo) , isotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo, naftiridinilo, octahidroisoquinolinilo, oxadiazolilo, 1, 2, 3- oxadiazolilo, 1, 2, 4- oxadiazolilo, 1, 2, 5-oxadiazolilo, 1, 3, 4- oxadiazolilo, oxazolidinilo, oxazolilo, oxazolidinilperimidinilo, fenantridinilo, fenantrolinilo, fenarsazinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxatiinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, piperazinilo, piperidinilo, pteridinilo, piperidonilo, 4- piperidonilo, pteridinilo, purinilo, piranilo/ pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinxlo, piridazinilo, piridooxazol, piridoimidazol, piridotiazol, piridinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, 4H-quinolizinilo, quinoxalinilo, quinuclidinilo, carbolinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, 6H- 1, 2, 5- tiadiazinilo, 1, 2, 3-tiadiazolilo, 1, 2, 4- tiadiazolilo, 1, 2, 5-tiadiazolilo, 1, 3, 4- tiadiazolilo, tiantrenilo, tiazolilo, tienilo, tienotiazolilo, tienooxazolilo, tienoimidazolilo, tiofenilo, triazinilo, 1, 2, 3-triazolilo, 1, 2, 4- triazolilo, 1, 2, 5- triazolilo, 1, 3, 4- triazolilo, tetrazolilo, y xantenilo. Los heterociclos preferidos incluyen, pero no se limitan a, piridinilo, tiofenilo, furanilo, indazolilo, benzotiazolilo, bencimidazolilo, benzotiafenilo, benzofuranilo, benzooxazolilo, benciisoxazolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, imidazolilo, indolilo, isoindolilo, piperidinilo, piperidonilo, 4- piperidonilo, piperonilo, pirrazolilo, 1, 2, 4- triazolilo, 1, 2, 3-triazolilo, tetrazolilo, tiazolilo, oxazolilo, pirazinilo, y pirimidinilo, y anillos fusionados y compuestos espiro que contengan los heterociclos anteriores. (m) Con carboxilico, se quiere decir cualquier anillo estable de 3, 4, 5, 6 o 7- elementos monociclico o biciclico o de 7, 8, 9, 10, 11, 12, o 13 elementos biciclico o triciclico, cualquiera de los cuales puede ser saturado, parcialmente insaturado, o aromático. Ejemplos de dichos carbociclos incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, adamantilo, ciclooctilo; [3.3.0] biciclooctano, [4.3. Ojbiciclononano, [4. .0]biciclodecano (decalin) , [2.2.2]biciclooctano, fluórenilo, fenilo, naftilo, indanilo, adamantilo, o tetrahidronaftilo (tetralin) . (n) El fenilo substituido se define por medio de la fórmula II en donde: (o) Rio representa hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, ~OR8, -SR8, -NHR8 , -NR8R9, - HCOOH, -NHCH2C00II, - R8COOR9, -COOR8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (p) n representa independientemente hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -0R8, -SR8, - HR8, -NRBR9, -NHCOOH, -NHCH2C00H, -NR8COOR9, -COOR8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (q) R12 representa independientemente hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -0RB, -SR8, -NHR8, -NR8R9, -NHCOOH, -NHCH2COOH, -NR8COOR9, -COOR8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (r) R13 representa independientemente hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -OR8/ -SR8, -NHR8, -NR8R3, -NHCOOH, -NHCH2COOH, -NRgCOORg, -C00R8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (s) RI4 representa independientemente hidrógeno, halógeno, ciano, trifluorometilo, triclorometilo, nitro-, -OR8, -SR8, -NHR8, -NRBR9, -NHCOOH, -NHCH2COOH, -NR8COOR9, -COOR8 o un grupo hidrocarburo que comprenda un grupo de cadena recta, ramificada o cíclico que contenga cada uno hasta 9 átomos de carbono; (t) R8 y R9 son independientemente metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo, sec-butilo, t-butilo, pentilo, hexilo, neo-pentilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclopropilmetilo, ciclopropiletilo, ciclobutilmetilo, ciclobutiletilo, ciclopentilmetilo/ ciclohexilmetilo, o ciclohexiletilo (u) El halógeno se limita a flúor, cloro, bromo, y yodo .
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