JPS63146795A - 分枝鎖脂肪族アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は分枝鎖脂肪族アミノ酸の製造法に関し、詳しく
は特定の微生物を利用してα−ヒドロキシカルボン酸前
駆体から、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリ
ンなどの分枝鎖脂肪族アミノ酸を製造する方法に関する
。

［従来の技術および発明が解決しようとする問題点］ 微生物を利用してα−ヒドロキシカルボン酸前駆体から
Ｌ−ロイシン、Ｌ−インロイシン、Ｌ−バリンなどの分
枝鎖脂肪族アミノ酸を製造する方法としては、α−ヒド
ロキシカルボン酸にシュードモナス属、ミクロコツカス
属、他１２属の細菌およびアスペルギルス属、他４属の
糸状菌（金敷線菌）の中から選ばれた微生物を作用させ
る方法（特公昭３９−５０１２号）；トルラ属の酵母を
作用させる方法（米国特許第３．１３３，８８８号）；
シュードモナス属類似菌を作用させる方法（農化誌、４
８゜２９７　（１９７４）、農化誌、す、　３５９　（
１９７４））　；ブレビバクテリウム属の微生物を作用
させる方法（Ｊ、　Ｆｅｒｒａｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎａ
ｌ、、　５３．４４３（１９７５））などが知られてい
る。

しかしながら、これらの方法は安定的にＬ−口・ｆシン
、Ｌ−インロイシン、Ｌ−バリンなどの分枝鎖脂肪族ア
ミノ酸を製造することにおいて必ずしも満足しうるもの
でなく、また製造効率の立場から改善の余地がある等の
問題点がある。

［問題を解決するための手段］ 本発明者らは、Ｌ−ロイシン、Ｌ−インロイシン、Ｌ−
バリンなどの分枝鎖脂肪族アミノ酸の効率的な製造法を
確立すべく、使用する微生物について検討したところ、
前記刊行物に記載された微生物以外の特定微生物を用い
、ざらにα−ヒドロキシカルボン酸前駆体を原料とする
ことによりＬ−ロイシン、Ｌ−インロイシン、Ｌ−バリ
ンなどの分枝鎖脂肪族アミノ酸を効率よく製造できるこ
とを見出し、かかる知見に基いて本発明を完成したので
ある。

すなわち本発明は、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏ−
ｂａｃｔｅｒ）属、シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏｂａｃ
ｔｅｒ）属。

ｘ７テσバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エ
ルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、バラコツカス（Ｐａ　
ｒａｃｏｃｃｕｓ）属、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属およびミ
クロバクテリウム（Ｎｉｃｒｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
属の中から選ばれた１種または２種以上の細菌を、アミ
ノ基供与体の存在下、２−ヒドロキシ−４−メチルペン
タン酸、２−ヒドロキシ−３−メチルペンタン酸および
２−ヒドロキシ−３−メチルブタン酸のうちから選ばれ
た１種のα−ヒドロキシカルボン酸前駆体に接触させる
ことを特徴とする分枝鎖脂肪族アミノ酸の製造法に関す
る。

本発明に使用できる微生物は、上記各種の属に属し、ア
ミノ基供与体の存在下、α−ヒドロキシカルボン酸前駆
体を分枝鎖脂肪族アミノ酸に変換する能力を有するもの
である。具体的にはアースロパクター・シンプレックス
（ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓＩｒｎｐｌｅｘ）　Ａ丁
ＣＣ６９４６，シトロバクタ−・フロインＪＡＮ　１５
２８．　エルビニア・ハービコラ　（Ｅｒｗｉｎｉａｈ
ｅｒｂｉｃｏｌａ）　Ａｒｃ：Ｃ２１４３４，バラコツ
カス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｄ
ｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＩＦＯ１３３０１，クレブ
シェラ・ニューモニアエ３８４９、　　ミクロバクテリ
ウム・アンモニアフイラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　ａ＋ｏ＋ａｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）などを挙げる
ことができ、これらを単独で、もしくは２種以上を組合
せて用いることができる。

微生物は様々な形態で使用することができ、たとえば増
殖期の菌体、休止期の菌体、固定化された菌体などのい
ずれであってもよく、さらには微生物菌体からの抽出処
理物であってもよい。ここで微生物菌体の固定化は、担
体結合法、架橋法。

包括法などの常法の固定化技術を適用して行なうことが
でＪる。また、抽出方法としては、微生物菌体の懸濁液
を超音波、フレンチプレス、高圧ホモジナイザーなどに
より破砕したのち遠心分離等によって可溶性抽出物を得
る方法などを採用することができる。

α−ヒドロキシカルボン酸前駆体に上記微生物を接触さ
せて分枝鎖脂肪族アミノ酸を製造する場合、アミノ基供
与体の存在が必要である。アミン基供与体としては種々
の化合物を使用できるが、安価かつ容易に入手できる無
機アンモニウム化合物、たとえばアンモニアガス、アン
モニア水、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
などや酢酸アンモニウム等の有機アンモニウム化合物、
グルタミン酸、アスパラギン酸、ロイシン等のアミノ酸
類や尿素などが好適である。

上記微生物を培養して分枝鎖脂肪族アミノ酸を得るため
の培地としては、炭素源、窒素源などのエネルギー源と
なる物質を含む培地を用いることが必要であり、炭素源
としてはグルコース。

シュークロース等の糖類やエタノール、プロパツール、
エチレングリコール、マンニトール等のアルコール類、
ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアル
デヒド等のアルデヒド類、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、
コハク酸、乳醸等のカルボン酸などが好適に使用できる
。また、窒素源としては前記アミノ基供与体のほか肉エ
キス。

ペプトンなどが用いられる。さらに、必要に応じてリン
酸カリウム塩、硫酸鉄塩、硫酸マンガン塩などの無機塩
類や微生物の生育に必要な栄養物質を培地に適宜加える
ことができる。

α−ヒドロキシカルボン酸前駆体は培地に最初から加え
てもよく、培養を開始してから適当な時期に添加しても
よい、また、その添加は一度に行なってもよく、あるい
は数回に分割して行なってもよい。

上記微生物とα−ヒドロキシカルボン酸前駆体との反応
は好気的条件下および嫌気的条件下のいずれで行なって
もよく、使用する微生物の性質を考慮して適宜決定すれ
ばよい、たとえば増殖期の菌体を培養しながら反応させ
る場合、２０〜５０°Ｃ１好ましくは２５〜４０℃の温
度、ＰＩ（３〜１ｏ、好ましくは６〜９の範囲で１０〜
１７０時間、好ましくは２０〜８０時間反応させること
によりα−ヒドロキシカルボン酸前駆体から分枝鎖脂肪
族アミノ酸を製造することができる。また、休止菌体を
用いて反応させる場合、１０〜６０℃、好ましくは２０
〜５０℃の温度、　ｐＨ５〜１０．好ましくは６〜９の
範囲で適当な時間反応させればよい。

さらに、上記培養法と休止菌体反応法を組合せたり、他
の固定化菌体、菌体抽出処理物を単独で、もしくは上記
培養法などと適宜組合せて行なうことも回部である。

反応終了後、培養液などから分枝鎖脂肪族アミノ酸を回
収、精製するには、固液分離、イオン交換樹脂、活性炭
などを用いる常法によって行なえばよい。

［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１ ペプトン肉エキス寒天斜面培地上で３０℃、２４時間培
養したミクロバクテリウム・アンモニアフィラム　（Ｍ
ｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌ
ｕｍ）　ＡＴＣＣ１５３５４の菌体１白金耳を、表１に
示す組成の培地５０ｍｊ）を分注した５００　＋ａｊ！
容坂ロフラスコ３８個に接種し、３０℃で２４時間振盪
培養を行なった。培養終了後、培養液を５℃、　ＩＩ、
０ＯＯＸ　ｇで１０分間遠心分離して得た生菌体を、表
２に示す組成のリン酸緩衝液で洗浄後、表３の組成の反
応液中に菌体が５　ｇ／Ｒとなるように懸濁した。上記
菌体懸濁液５０ｍｊ）を５００　ｒａＩ！容坂ロフラス
コに入れ、３０°Ｃで２時間振盪反応を行なった０反応
後、除菌液を高速液体クロマトグラフィーにより定量分
析したところ、Ｄ、Ｌ−２−ヒドロキシ−３−メチルペ
ンタン酸、塩化アンモニウムの両方を添加した条件では
１４ＢのＬ−インロイシンが生成していた。それに対し
て、Ｄ、Ｌ−２−ヒドロキシ−３−メチルペンタン酸無
添加条件、および塩化アンモニウム無添加条件のいずれ
の条件においてもＬ−イソロイシンは不検出であった。

この結果を表４に示す。

表　　１ グ　　ル　　コ　　−　　ス　　　　　　　　　　　　
　　１０　　　ｇＬ−グルタミン酸ｌナトリウム　　５
ｇ肉　　　エ　　　キ　　　ス　　　　　　　　　　　
　　　　５　　ｇペ　　　ブ　　　　ト　　　　ン　　
　　　　　　　　　　　　　　　５　　　ｇ塩化ナトリ
ウム　　　　　　　３ｇ Ｌ　　−ロ　　イ　　シ　　ン　　　　　　　　　　　
　　　　　　１．５ｇＬ−インロイシン　　　　　　　
　１．５ｇＬ　　−バ　　リ　　ン　　　　　　　　　
　　　　　　　１．５ｇ本ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７，０
に調整後、蒸留水でｌｆ！にする。

表　　２ リン＃２ナトリウム　　　　　１３．５　　ｇリン酸１
カリウム　　　　　０．５３　ｇよ蒸留水でＩ！！とす
る。ＣｐＨ約８．０）表　　３ リン酸２ナトリウム　　　　　　　　１３．５　　ｇリ
ン酸１カリウム　　　　　　０．５３　ｇ塩化アンモニ
ウム　　　　　　１０　　　ｇ［１，Ｌ−２−ヒドロキ
シ−３−メチルペンタ漕　　　　　１０　　　　ｇオＮ
ａＯＨ水溶液でｐＨ８，０に調整後、蒸留水でｉｆ！に
する。

実施例２〜８ 実施例１において菌株を表４に示したものに変え１反応
時間を一部表４に示したように変えたこと以外は実施例
１と同様に反応を行なった。結果を表４に示す。

表　　４ 実施例９〜１６ 実施例１〜８のり、Ｌ−２−ヒドロキシ−３−メチルペ
ンタン酸をり、Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタ
ン酸に変えたこと以外は実施例１〜８と同様に反応を行
なった。結果を表５に示す。

表　　５ 実施例１７〜２４ 実施例１〜８のり、Ｌ−２−ヒドロキシ−３−メチルペ
ンタン酸をり、Ｌ−２−ヒドロキシ−３−メチルブタン
酸に変えたこと以外は実施例１〜８と同様に反応を行な
った。結果を表６に示す。

表　　６ 実施例２５ 実施例１において使用菌をシトロバクタ−・７ａインデ
イ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）　Ａ
ＴＣＣ６７５０に変え、また反応液を表７に示したもの
に変えたこと以外は実施例１と同様に反応を行なったと
ころ、３１ｍｇのＬ−インロイシンが生成していた。そ
れに対してり、ｌ、−２−ヒドロキシ−３−メチルペン
タン酸無添加条件およびグルタミン酸１ナトリウム、ア
スパラギン酸１ナトリウム無添加条件のいずれの条件に
おいてもＬ−イソロイシンは不検出であった。

表　　７ リン酸２ナトリウム　　　　　　　１３．５　　ｇリン
酸１カリウム　　　　　　０．５３　ｇグルタミン酸ｌ
ナトリウム　　　　５ｇアスパラギン酸１ナトリウム　
　５ｇ Ｄ、Ｌ−２−ヒドロキシ−３−メチルペンタ’４　　　
１０　　　　ｇ木ＮａＯＨ水溶液でｐＨ８，０に調整後
、蒸留水でｌりにする。

実施例２８ ペプトン肉エキス寒天斜面培地上で３０°Ｃにて２４時
間培養したバラコツカス・デニトリフィカンス　（Ｐａ
ｒａｃｏｃｃｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）　Ｉ
ＦＯ１３３０１の菌体１白金耳を、表８に示す組成の培
地５０ｍｊ？を分注した５００ｍρ容坂ロフラスコ２本
に接種して３０℃で振盪培養を行なった。培養後期の培
養６４時間目にフラスコ１本についてのみり、Ｌ−２−
ヒドロキシ−３−メチルペンタン酸２８３　ｙａｇを無
菌的に添加し、さらに培養７１時間目まで培養を行なっ
た。培養終了後、培養液を５℃で１１，０ＯＯＸ　ｇ、
１０分間遠心分離して得た上清液について実施例１と同
様に定量分析を行なった結果、Ｄ、Ｌ−２−ヒドロキシ
−３−メチルペンタン酸添加条件では９１１ｇのし一イ
ンロイシンが生成していた。それに対して無添加条件で
は不検出であった。

表　　８ 乳　　　　　　酸　　　　　　　　　　　　　　　　　
５ｇグ　　　ル　　　コ　　　−　　　ス　　　　　　
　　　　　　　　５　　ｇ硝酸アンモニウム　　　　　
１０　　ｇリン酸２ナトリウム・１２水塩　　　　１．
５ｇリン酸１カリウム　　　　　　０．５ｇ硫酸マグネ
シウム・７　水塩０　、２　ｇ塩化カルシウム・２水塩
　　　　　５０　　Ｂ硫酸マンガン・４水塩　　　　　
　　５　　ｒａｇ硫酸第１鉄・７水塩　　　　　　５　
　Ｂ硫酸コバルト・７水塩　　　　　　　５　　ｒａｇ
硫酸銅・５水塩　　　　５　ｔａｇ 酵　　　母　　　エ　　　キ　　　ス　　　　　　　　
　　　　０．２ｇ本ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７，０に調整
後、蒸留水でＩｆ！にする。

［発明の効果］ 本発明によれば、α−ヒドロキシカルボン酸前駆体から
分枝鎖脂肪族アミノ酸を特定の微生物を用いて効率よく
製造することができる。また、得られた分枝鎖脂肪族ア
ミノ酸は医薬品工業の分野において有用である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）
   属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エ
   ンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エル
   ビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、パラコッカス（Ｐａｒａ
   ｃｏｃｃｕｓ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂ’ｓｉｅｌ
   ｌａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属およびミク
   ロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の
   中から選ばれた１種または２種以上の細菌を、アミノ基
   供与体の存在下、２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン
   酸、２−ヒドロキシ−３−メチルペンタン酸および２−
   ヒドロキシ−３−メチルブタン酸のうちから選ばれた１
   種のα−ヒドロキシカルボン酸前駆体に接触させること
   を特徴とする分枝鎖脂肪族アミノ酸の製造法。
2. （２）アミノ基供与体が無機アンモニウム化合物、有機
   アンモニウム化合物、アミノ酸または尿素である特許請
   求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）微生物が増殖期の菌体、休止期の菌体、固定化菌
   体および菌体抽出処理物のうちのいずれかである特許請
   求の範囲第１項記載の方法。