JPH052314B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は微生物を用いるＬ−フエニルアラニン
の製造法に関する。 従来の技術 従来、フエニルピルビン酸を基質とする酵素法
によるＬ−フエニルアラニンの製法としては、各
種微生物菌体にフエニルピルビン酸とアミノ基供
与体としての各種アミノ酸類を作用せしめる方法
（Amino Acids、第２巻、18貢、1960年；特公昭
37−10672号公報、Amino Acids、第５巻、61
貢、1962年；特公昭45−20556号公報）、コリネバ
クテリウム属細菌の菌体にフエニルピルビン酸と
ナイロン環状オリゴマー（特公昭44−17991号公
報）、ナイロン６加水分解物（特公昭44−17992号
公報）あるいはラクタム（特公昭44−17990号公
報）を作用せしめる方法が知られている。 発明が解決しようとする問題点 従来の方法においては、用いるアミノ供与体原
料が高価である上に、Ｌ−フエニルアラニンの収
量もまだ満足すべきものではない。常に優れたＬ
−フエニルアラニンの製造方法が求められてい
る。 問題点を解決するための手段 本発明によると、フマール酸及びアンモニウム
イオン又は尿素の存在下、フエニルピルビン酸を
Ｌ−フエニルアラニンに変換する能力を有する微
生物を用いることにより著量のＬ−フエニルアラ
ニンを得ることができる。 本発明に用いられる微生物としては、フマール
酸及びアンモニウムイオン又は尿素の存在下に、
フエニルピルビン酸をＬ−フエニルアラニンに変
換できる能力を有する。 セラチア属、エツシエリヒア属、シユードモナ
ス属、エンテロバクター属、サルモネラ属、エル
ビニア属、プロテウス属、シトロバクター属又は
パラコツカス属に属する微生物であれば、野生
株、変異株、細胞融合法あるいは遺伝子操作法そ
の他の遺伝的手法で誘導される組換え株等いずれ
も用いられ、具体的には、セラチア・マルセツセ
ンス（Serratia marcescens）IAM1205、エツシ
エリヒア・コリ（Escherichja coli）
ATCC11303、シユードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida）NRRL−Ｂ−11064、エ
ンテロバクター・クロアセー（Enterobacter
cloacae）IAM1528、サルモネラ・チフイムリウ
ム（Salmonella typhimurium）ATCC19585、
エルビニア・ヘルビコラ（Erwinia herbicola）
ATCC21434、プロテウス・ミラビリス
（Proteus mirabilis）IFO3849、シトロバクタ
ー・フロインデイ（Citrobacter freundii）
ATCC6750、パラコツカス・デニトリフイカンス
（Paacoccus denitrificans）ATCC19367等があ
げられる。 シユードモナス・プチダ NRRL−Ｂ−11064
は、工業技術院微生物工業技術研究所にも
Pseudomonas putida KY4667として寄託されて
おり、その受託番号は微工研菌寄第3879号であ
る。 これらの微生物を培地に培養して、Ｌ−フエニ
ルアラニンを得る培地としては、炭素源、窒素
源、無機塩などを含む培地であれば、天然培地、
人工培地のいずれでもよい。 炭素源としては、グルコース、シユークロー
ス、廃糖蜜などの糖類、グリセロール、ソルビト
ール、マンニトール等の糖アルコール類、酢酸、
ギ酸、フマール酸、リンゴ酸、クエン酸、グルコ
ン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、プ
ロパノール等のアルコール類が使用される。窒素
源としては、アンモニア水、塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アン
モニウム、燐酸アンモニウム等のアンモニウム化
合物、尿素等の窒素化合物、グルタミン酸、アス
パラギン酸、メチオニン、グリシン、リジン、ア
ルギニン、オルニチン等のアミノ酸類、ペプト
ン、酵母エキス、カゼイン加水分解物、脱脂大豆
あるいはその消化物等の天然栄養物が使用され
る。 無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸
第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネ
シウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン
ガン、炭酸カルシウムなどを使用する。勿論、本
発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養
素を必要とする場合にはその栄養素を適当量培地
中に存在させなければならないが、これらの物質
は窒素源として例示した天然物に含まれて添加さ
れる場合もある。 フエニルピルビン酸、フマール酸及びアンモニ
ウムイオン又は尿素は前記培地に最初から加えら
れてもよいし、又微生物の培養途中でくわえられ
てもよい。 フエニルピルビン酸およびフマール酸は、アン
モニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシ
ウム塩等の各種の塩として使用される。 アンモニウムイオンは、硫酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウ
ム、フマール酸アンモニウム、リンゴ酸アンモニ
ウム等の塩類として、あるいはアンモニア水ある
いはアンモニアガスとして供給される。 培養は、温度20〜40℃、PH５〜８で１〜５日間
行う。かくして、培養液中にＬ−フエニルアラニ
ンが生成する。 次に、前記微生物の菌体を得る場合の培地組成
及び培養条件としては、前記組成の培地及び培養
条件が用いられる。 かくして、得られる微生物菌体はそのまま反応
に使用できるし、さらに該菌体を種々処理して得
られる処理物を反応に用いても良い。 微生物菌体としては、菌体そのもの又は菌体を
含む培養液が用いられる。 菌体処理物としては、菌体の機械的摩砕処理
物、超音波処理物、凍結乾燥処理物、溶媒処理
物、酵素処理物、乾燥処理物、界面活性剤処理
物、菌体の蛋白質分画、菌体及び菌体処理物の固
定化物等が用いられる。 反応は水性液中、前記で得られる菌体もしくは
その処理物をフエニルピルビン酸、フマール
酸及びアンモニウムイオン又は尿素に作用する
ことによつて行われる。 反応に使用するフエニルピルビン酸、フマール
酸及びアンモニウムイオンとしては前記と同じも
のが用いられる。 反応に使用するフエニルピルビン酸の濃度とし
ては0.01〜１モル、フマール酸の濃度としては
0.01〜２モル、アンモニウムイオンもしくは尿素
の濃度としては0.01〜10モルの範囲である。これ
らの原料は、一括または間歇的に供給される。 作用条件としては、温度20〜60℃、好ましくは
25〜45℃、PH６〜10好ましくは７〜９で行う。 かくして、水性液中にＬ−フエニルアラニンが
生成する。 培養液もしくは水性液中からＬ−フエニルアラ
ニンを回収する方法としては、イオン交換樹脂
法、沈澱法等が用いられる。 以下に実施例を示す。 実施例 １ グルコース0.5％、酵母エキス0.3％、粉末肉エ
キス1.5％（PH7.0）の組成の培地10mlを含む試験
管に、第１表に示す微生物を１エーゼ宛接種し、
210rpmの振盪条件、28℃の温度条件下で18時間
振盪培養する。 培養終了後、遠心分離により集菌し、菌体を凍
結保存（−20℃）する。１日凍結保存後、10mlの
0.85％食塩溶液を試験管に加え、融解後遠心、洗
浄を行う。得られた菌体を、下記組成の反応液15
mlに懸濁し、40℃、静置条件下で18時間反応させ
たところ、各々の微生物が第１表に示す濃度のＬ
−フエニルアラニンを生成した。 反応液の組成ほは次のとおり：β−フエニルピ
ルビン酸ナトリウム100ｍＭ、ピリドキサールリ
ン酸200μM、トリスバツフアー100ｍＭ（PH8.4）、
フマル酸アンモニウム200ｍＭ。

【表】 実施例 ２ プロテウス・ミラビリスIFO3849を使用し、反
応液の組成を下記のとおりに変えた他は実施例１
と同様に実施した結果反応液中に8.3mg／mlのＬ
−フエニルアラニンが生成した。 反応液組成：β−フエニルピルビン酸ナトリウ
ム100ｍＭ、ピリドキサールリン酸200μM、フマ
ル酸ナトリウム100ｍＭ、尿素100ｍＭ、トリスバ
ツフアー100ｍＭ（PH8.4）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ セラチア属、エツシエリヒア属、シユードモ
   ナス属、エンテロバクター属、サルモネラ属、エ
   ルビニア属、プロテウス属、シトロバクター属又
   はパラコツカス属に属し、フマール酸及びア
   ンモニウムイオン又は尿素の存在下フエニルピル
   ビン酸をＬ−フエニルアラニンに変換する能力を
   有する微生物を Ａ (イ)フエニルピルビン酸(ロ)フマール酸及び(ハ)ア
   ンモニウムイオン又は尿素の存在下に培地に培
   養することにより、又は Ｂ 培地に培養して得られる菌体もしくはその処
   理物及び前記(イ)、(ロ)及び(ハ)を含有する水性液中
   で反応させ、 培養液もしくは水性液中にＬ−フエニルアラニ
   ンを生成させこれを採取することを特徴とするＬ
   −フエニルアラニンの製造法。