JPS63146794A - 分枝鎖脂肪族アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は分枝鎖脂肪族アミノ酸の製造方法に関し、詳し
くは特定の微生物を利用してα−ケトカルボン酸前駆体
から、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンな
どの分枝鎖脂肪族アミノ酸を製造する方法に関する。

［従来の技術および発明が解決しようとする問題点］ 微生物を利用してα−ケトカルボン酸前駆体からＬ−ロ
イシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−／＜リンなどの分枝鎖
脂肪族アミノ酸を製造する方法としては、アミノ基供与
体の存在下でα−ケトカルボン酸またはその前駆体にエ
シェリヒア属、シトロバクタ−属、アエロモナス属およ
びアグロバクテリウム属、他１８属の細菌を作用させる
方法（特開昭８１−２８３９８号公報および特開昭８１
−３１０９３号公報）、ブレビバクテリウム属の細菌を
作用させる方法（＃開開５７−５４５９４号公報）、ブ
レビへクテリウム属およびコリネバクテリウム属のうち
のいずれかの細菌を作用させる方法（特開昭６ｏ−４３
３ａｏ号公報および特開昭Ｇｏ−２５６３９３号公報）
、シュードモナス属およびバチルス属、他５属の細菌お
よびキャンディダ属の酵母のいずれかを作用させる方法
（特開昭６１−２１０９１号公報）、バチルス属の細菌
を作用させる方法（特開昭５６−８４７９２号公報）お
よびエシェリヒア属およびクレブシェラ属、他３属の細
菌を作用させる方法（特開昭８０−９１９９３号公ｆ！
ｉｌ）などが知られている。

しかしながら、これらの方法は安定的にＬ−ロイシン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンなどの分枝鎖脂肪族アミ
ノ酸を製造することにおいて必ずしも満足しうるちので
なく、また製造効率の立場から改善の余地がある等の問
題点がある。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−
バリンなどの分枝鎖脂肪族アミノ酸の効率的な製造方法
を確立すべく、使用する微生物について検討したところ
、前記刊行物に記載された微生物以外の特定の微生物を
用いることによって、α−ケトカルボン酸前駆体を原料
としてＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンな
どの分枝鎖脂肪族アミノ酸を効率よく製造できることを
見出し、かかる知見に基づいて本発明を完成したのであ
る。

すなわち本発明は、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属お
よびミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属から選ばれた１種または２種以上の細菌を、アミ
ノ基供与体の存在下、４−メチル−２−オキソペンタン
酸、３−メチル−２−オキソペンタン酸および３−メチ
ル−２−オキソブタン酸のうちから選ばれた１種のα−
ケトカルボン酸前駆体に接触させることを特徴とする分
枝鎖脂肪族アミノ酸の製造方法に関する。

本発明に使用できる微生物は、上記属に属するものであ
って、アミノ基供与体の存在下α−ケトカルボン酸前駆
体を分枝鎖脂肪族アミノ酸に変換する能力を有する微生
物である。具体的にはプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏ
ｔｅｕｓ　＋＊１ｒａｂｉｌｉｓ）　ＩＦ０３８４９、
　　ミクロバクテリウム・アンモニアフイラム（Ｍｉｃ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ
）　ＡＴＣＣ１５３５４などがあり、これらを単独で、
もしくは組合わせて用いることができる。

微生物は様々な形態で用いることができ、たとえば増殖
期の菌体、休止期の菌体、固定化された菌体などのいず
れであってもよく、さらには微生物菌体からの抽出処理
物であってもよい、ここで、微生物菌体の固定化は、担
体結合法、架橋法、包括法などの常法の固定化技術を適
用して行なうことができる。また、抽出方法としては、
微生物菌体の懸濁液を超音波、フレンチプレス、高圧ホ
モジナイザーなどにより破砕したのち、遠心分離等によ
って可溶性抽出物を得る方法などを採用することができ
る。

α−ケトカルボン酸前駆体に微生物を接触させて分枝鎖
脂肪族アミノ酸を製造する場合、アミノ基供与体の存在
が必要である。アミノ基供与体としては種々の化合物を
使用できるが安価かつ容易に入手できる無機アンモニウ
ム化合物、たとえばアンモニアガス、アンモニア水、塩
化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム
、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどや酢酸ア
ンモニウム等の有機アンモニウム化合物、グルタミン酸
、アスパラギン酸、ロイシン等のアミノ酸類や尿素など
が好適である。

上記微生物を培養して分枝鎖脂肪族アミノ酸を得るため
の培地としては、炭素源、窒素源などのエネルギー源と
なる物質を含む培地を用いることが望ましい、炭素源と
してはグルコース、シュークロース等の糖類やエタノー
ル、プロパツール。

エチレングリコール等のアルコール類、ホルムアルデヒ
ド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデＬド等のアル
デヒド類、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、乳酸
等のカルボン酸類などが好適に使用できる。また、窒素
源としては前記アミノ基供与体のほか肉エキス、ペプト
ンなどが用いられる。さらに、必要に応じてリン酸カリ
ウム塩。

硫酸鉄塩、硫酸マンガン塩などの無機塩類や微生物の生
育に必要な栄養物質を培地に適宜加えることができる。

α−ケトカルボン酸前駆体は培地に最初から加えてもよ
く、培養を開始してから適当な時期に添加してもよい、
また、その添加は一度に行なってもよく、あるいは数回
に分割して行なってもよい。

上記微生物とα−ケトカルボン酸前駆体との反応は好気
的条件下に行なわれる。たとえば増殖期の菌体を培養し
ながら反応させる場合、２０〜５０℃、好ましくは２５
〜４０℃の温度、　Ｉ）Ｈ３〜ｌＯ１好ましくは６〜９
の範囲で１０〜１７０時間、好ましくは２０〜８０時間
反応させることによりα−ケトカルボン酸前駆体から分
枝鎖脂肪族アミノ酸を製造することができる。また、休
止菌体を用いて反応させる場合、　１０〜６０℃、好ま
しくは２０〜５０℃の温度、ｐＨ５〜ｌＯ１好ましくは
６〜９の範囲で適当な時間反応させればよい。

さらに、上記培養法と休止菌体反応法を組合せたり、他
の固定化菌体、菌体抽出処理物を単独で、もしくは上記
培養法などと適宜組合せて行なうことも可能である。

反応終了後、培養液などから分枝鎖脂肪族アミノ酸を回
収、精製するには、固液分離、イオン交換樹脂、活性炭
などを用いる常法により行なえばよい。

［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１ ペプトン肉エキス寒天斜面培地上で３０℃、２４時間培
養したミクロバクテリウム・アンモニアフイラム（Ｍｉ
ｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌ
ｕｍ）　ＡＴＣＣ１５３５４の菌体１白金耳を、表１に
示す組成の培地５０ｍ２を分注した５００　ｔａＲ容坂
ロフラスコ３８個番こ接種し、３０℃で２４時間振盪培
養を行なった。培養終了後、培養液を５℃、１１，０Ｏ
ＯＸ　ｇ、１０分間遠心分離して得た生菌体を表２に示
す組成のリン酸緩衝液で洗浄後、表３の組成の反応液中
に菌体力≦５　ｇ／Ｉ！どなるように懸濁した。

上記菌体懸濁液５０ｍＲを５００　ｒａρ容坂ロフラス
コ番こ入れ、３０°Ｃで２時間振盪反応を行なった。反
応後、除菌液を高速液体クロマトグラフィ一番こより定
量分析したところ、３−メチル−２−オキソペンタン酸
と塩化アンモニウムの両方を添加した条件では１０２　
ｍｇのＬ−インロイシンを生成してしまた。それに対し
て、３−メチル−２−オキソペンタン酸無添加条件、お
よび塩化アンモニウム無添加条件のいずれの条件におい
ても、Ｌ−インロイシンは不検出であった。結果を表４
に示す。

表　　１ グ　　ル　　コ　　−　　ス　　　　　　　　　　　　
　　　１０　　　ｇＬ−グルタミン酸１ナトリウム　　
５ｇ肉　　　エ　　　キ　　　ス　　　　　　　　　　
　　　　　５　　ｇペ　　　プ　　　　ト　　　　ン　
　　　　　　　　　　　　　　　５　　ｇ塩化ナトリウ
ム　　　　　　３ｇ Ｌ　　−ロ　　イ　　シ　ン　　　　　　　　　　　　
　　　　　１．５ｇＬ−インロイシン　　　　　　　　
１．５ｇＬ　　−バ　　リ　　ン　　　　　　　　　　
　　　　　　１・５ｇ’ｔ　ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７，
０に調整後、蒸留水で１ｇ表　　２ リン酸２ナトリウム　　　　　１３．５　　ｇリン酸ｌ
カリウム　　　　　０．５３　ｇ才蒸留水でｌりにする
。（ｐＨ約８．０）表　　３ リン酸２ナトリウム　　　　　１３．５　　ｇリン酸ｌ
カリウム　　　　　０．５３　ｇ塩化アンモニウム　　
　　１０　　　ｇ３−メチル−２−オキソペンタ糧　　
　　　１０　　　　ｇ’Ｘ　ＮａＯＨ水溶液でｐＨ８，
０に調整後、蒸留水で１でにする。

実施例２ 実施例１の菌株に代えてプロテウス・ミラどリス（Ｐｒ
ｏｔｅｕｓ　ｍ１ｒａｂｉｌｉＳ）　ＩＦＯ３８４９を
用ｌ／）、かつ反応時間を５時間にしたこと以外は実施
例１と同様に反応を行なった。この結果を表４１こ示す
。

表　　４ 実施例３，４ 実施例１，２の３−メチル−２−オキソペンタン酸を４
−メチル−２−オキソペンタン酸に変えたこと以外は実
施例１．２と同様に反応を行なった。結果を表５に示す
。

表　　５ 実施例５，６ 実施例１．２の３−メチル−２−オキソペンタン酸を３
−メチル−２−オキソブタン酸に変えたこと以外は、実
施例１．２と同様に反応を行なった。結果を表６に示す
。

表　　６ 実施例７ 実施例１において１反応液を表７に変えたこと以外は実
施例１と同様に反応を行なったところ、１１３１１１８
のし一インロイシンが生成していた。それに対して３−
メチル−２−オキソペンタン酸無添加条件およびグルタ
ミン酸１ナトリウム、アスノぐラギン酸１ナトリウム無
添加条件のいずれの条件においてもＬ−イソロイシンは
不検出であった。

表　　７ リン酸２ナトリウム　　　　　１３．５　　ｇリン酸１
カリウム　　　　　０．５３　ｇグルタミン酸１ナトリ
ウム　　　５ｇ アスパラギン酸１ナトリウム　５ｇ ３−メチル−２−オキンペンタ図り　　　　　　１０　
　　　ｇ寡ＮａＯＨ水溶液でｐ）１８．０に調整後、蒸
留水で１ｆ！にする。

実施例８ ペプトン肉エキス寒天斜面培地上で３０℃にて２４時間
培養したミクロへ′クテリウム・アンモニアフィラム（
ＭｉｃｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉ
ｌｕｍ）　ＡＴＣＧ１５３５４の菌体ｌ白金耳を、表８
に示す組成の培地５０＋ｓｊ２を分注した５００１容坂
ロフラスコ２本に接種して３０℃で振盪培養を行なった
。培養後期の培養６４時間目にフラスコ１本についての
み３−メチル−２−オキソペンタン酸３００　ｒａｇを
無菌的に添加し、さらに培養７１時間目まで培養を行な
った。培養終了後、培養液を５℃、１１，０ＯＯＸ　ｇ
、１０分間遠心分離して得た上清液について実施例１と
同様に定量分析を行なった結果、３−メチル−２−オキ
ソベンタン酸添加条件ではＩ　Ｓｌ１ｇのＬ−インロイ
シンが生成していた。それに対して３−メチル−２−オ
キソペンタン酸無添加条件では不検出であった。

表　　８ 乳　　　　　　酸　　　　　　　　　　　　　　５ｇグ
　　　ル　　　コ　　　−　　　ス　　　　　　　　　
　　５　　　ｇ硝酸アンモニウム　　　　１０　　ｇ リン酸２ナトリウム・１２水塩　　　１．５ｇリン酸ｌ
カリウム　　　　０．５ｇ 硫酸マグネシウム・７水塩　　　０．２ｇ塩化カルシウ
ム・２水塩　　　　５０　　ｒａｇ硫酸マンガン・４水
塩　　　　　　５ＩＩｇ硫酸第一鉄・７水塩　　　　　
５Ｉ１ｇ硫酸コバルト・７水塩　　　　　　５　　ｍｇ
硫酸銅・５水塩　　　５　Ｂ 酵　　母　　エ　　キ　　ス　　　　　　　　　　　　
　０．２ｇ＊　ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７，０に調整後、
蒸留水テ１２にする。

［発明の効果］ 本発明によれば、α−ケトカルボン酸前駆体から分枝鎖
脂肪族アミノ酸を特定の微生物を用いて効率よく製造す
ることができる。また、得られた分枝鎖脂肪族アミノ酸
は医薬品工業等の分野において有用である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属およびミクロバ
   クテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属から選
   ばれた１種または２種以上の細菌を、アミノ基供与体の
   存在下、４−メチル−２−オキソペンタン酸、３−メチ
   ル−２−オキソペンタン酸および３−メチル−２−オキ
   ソブタン酸のうちから選ばれた１種のα−ケトカルボン
   酸前駆体に接触させることを特徴とする分枝鎖脂肪族ア
   ミノ酸の製造方法。
2. （２）アミノ基供与体が無機アンモニウム化合物。 有機アンモニウム化合物、アミノ酸または尿素である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）微生物が増殖期の菌体、休止期の菌体、固定化菌
   体および菌体抽出処理物のうちのいずれかである特許請
   求の範囲第１項記載の方法。