JPS6352895A - Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はＤ，Ｌ−フェニル乳酸から生化学的反応によっ
てＬ−フェニルアラニンを製造する方法に関する。

［従来の技術とその問題点コ 従来、微生物を利用してＤ，Ｌ−フェニル乳酸からＬ−
Ｔフェニルアラニンを製造する方法として、フラボバク
テリウム属に属する細菌を使用するもの（特公昭３９−
５０１２号）、シュードモナス属。

アグロバクテリウム属等に属する細菌を使用するもの（
特開昭５２−７９０８０号）、シゾサツカロミセス属、
ピチア属等に属する酵母を使用するもの（特開昭５２−
９８７９２号）などが知られている。

しかしながら、これらの方法はＬ−フェニルアラニンの
安定的な製造法として十分に満足しうるちのではなかっ
た。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、Ｌ−フェニルアラニンを効率よく製造す
る方法について検討を重ねたところ、上記Ｄ，Ｌ−フェ
ニル乳酸を原料として、これに前記微生物以外の微生物
を作用させることによって目的を達成しうることを見出
し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、Ｄ、、Ｌ−フェニル乳酸に、パラＤ
−７カス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、エルビニア（Ｅ
ｒｗｉｎｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、
クレプシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバ
クタ−（Ｅ　ｎ　ｔ　ｅ　ｒ　ｏ−ｂａｃｔｓｒ）属、
シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属およびミ
クロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
の中から選ばれた１種または２種以上の細菌を接触させ
ることを特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造方法で
あり、上記微生物には野生株、変異株。

細胞融合法あるいは遺伝子操作法その他の遺伝子的手法
で誘導される組換え株のいずれもが包含される。

本発明に使用できる微生物を具体的に例示すると、バラ
コツカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａ−ＩＦＯ３８
４９，クレブシェラ・ニューモニアエＩＡＭ　１５２８
．シトロバクタ−・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔ
ｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）　ＡＴＣＣ８７５０，ミクロ
バクａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）　ＡＴＣＣ１５３５
４などがあり、これらを単独で、もしくは２種以上を組
合せて使用する。

微生物は様々な形態で使用することができ、たとえば増
殖期の菌体、休止期の菌体、固定化された菌体などのい
ずれであってもよく、さらには微生物菌体から抽出処理
して得た酵素系を含む抽出処理物であってもよい。ここ
で、微生物菌体の固定化は、担体結合法、架橋法、包括
法などの常法の固定化技術を適用して行なうことができ
る。また、抽出処理としては、微生物菌体の懸゛濁液を
超音波、フレンチプレス、高圧ホモジナイザーなどによ
り破砕したのち遠心分離等によって可溶性抽出物を得る
方法などを採用することができる。

Ｄ、Ｌ−フェニル乳酸に上記微生物を接触させてＬ−フ
ェニルアラニンを製造する場合、アミン基供与物質の存
在が必要である。アミノ基供与物質としては種々の化合
物を使用できるが、安価かつ容易に入手できる無機アン
モニウム化合物、たとえばアンモニアガス、アンモニア
水、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム。

リン酸アンモニウムなどや酢酸アンモニウム等の有機ア
ンモニウム化合物、グルタミン酸、アスパラギン酸等の
アミノ酸類が好適である。

上記微生物を培養してＬ−フェニルアラニンを得るため
の培地としては、炭素源、窒素源などのエネルギー源と
なる物質を含む培地を用いることが望ましい。炭素源と
してはグルコース、シュークロース等の糖類やエタノー
ル、プロパツール。

エチレングリコール等のアルコール類、ホルムアルデヒ
ド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド等のアル
デヒド類、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等のカルボン酸類
などが好適に使用できる。また、窒素源としては前記ア
ミノ基供与物質のほか肉エキス、ペプトンなどが用いら
れる。さらに、必要に応じてリン酸カリウム塩、硫酸鉄
塩、硫酸マンガン塩などの無機塩類や微生物の生育に必
要な栄養物質を培地に適宜加えることができる。

Ｄ、Ｌ−フェニル乳酸は培地に最初から加えてもよく、
培養を開始してから適当な時期に添加してもよい。また
、その添加は一度に行なってもよく、あるいは数回に分
割して行なってもよい。

Ｄ、Ｌ−フェニル乳酸と上記微生物との反応は好気的条
件下および好気的条件下のいずれで行なってもよく、使
用する微生物の性質を考慮して１０〜８０℃、好ましく
は２０〜５０℃の温度、ｐＨ５〜１１、好ましくは６〜
１０の範囲にて１〜５日間培養することによって目的と
するＬ−フェニルアラニンを製造することができる。休
止菌体反応によって、Ｄ、Ｌ−フェニル乳酸からＬ−フ
ェニルアラニンを得る方法も基本的には上記の培養法と
ほぼ同様にとらえることができる。また、本発明では休
止菌体法と培養法を適宜組合せることによって菌体やエ
ネルギー等の反応に必要な成分の供給、再生を行なうこ
とも可能である。さらに、本発明以外の酵素系と組合せ
て反応をより効果的に行なうことも勿論可能である。

反応終了後、培養液などからＬ−フェニルアラニンを回
収するには、イオン交換樹脂や活性炭などを用いる常法
によって行なえばよく、回収した後、必要に応じて精製
処理を行なう。

［発明の効果］ 本発明によれば、ジペプチド甘味料であるアスパルチル
フェニルアラニンメチルエステルなどの原料として食品
工業、医薬品工業等の分野において有用なＬ−フェニル
アラニンを特定の微生物を用いて効率よく製造すること
ができる。

［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１ ペプトン・肉エキス寒天斜面培地上で３０℃。

２４時間培養したバラコツカス・デニトリフィカンスＩ
ＦＯ１３３０１の菌体１白金耳を第１表に示す組成の培
地５０ｍ！！を分注した５００ｍＡ＋容坂ロフラスコに
接種し、３０℃で２４時間振とう培養を行なった。

第１表 乳酸　　　　　　　　　　　２．５ｇ １．２−プロパンジオール　２．５ｇ 肉エキス　　　　　　　　１０　　ｇ ペプトン　　　　　　　　１０　　ｇ 酵母エキス　　　　　　　３ｇ Ｌ−フェニルアラニン　　３ｇ 塩化ナトリウム　　　　　３ｇ ＮａＯＨ水溶液テｐＨ７，０に調整後、蒸留水にて１ρ
にする。

培養終了後、培養液を５℃、　１１０００　Ｘ　ｇにて
１０分間遠心分離して得た生菌体を第２表に示す組成の
リン酸緩衝液で洗浄した。次いで、第３表に示した組成
の反応液中に菌体が５ｇ／２となるように！ｇ濁した。

この菌体懸濁液５０ｆｆｌ！を５００ｆｆｉｐ容坂ロフ
ラスコに入れ、３０℃で２０時間振とう反応を行なった
。

第２表 リン酸二ナトリウム　　　　　７．１　ｇリン酸−カリ
ウム　　　　　　５．２５ｇ蒸留水で１りとする（ｐＨ
約７．０） 第　　３　　表 リン酸二ナトリウム　　　　　７．１ｇリン酸−カリウ
ム　　　　　　５．２５ｇ塩化アンモニウム　　　　　
　１０　　ｇグルタミン酸−ナトリウム　　５ｇ アスパラギン酸−ナトリウム　５ｇ Ｄ、Ｌ−フェニル乳酸　　　　　１０　　ｇ反応終了後
、除菌して得た液体区分について高速液体クロマトグラ
フィーにより定量したところ、１２６ｍｇのＬ−フェニ
ルアラニンが生成していた。一方、第３表中Ｄ，Ｌ−フ
ェニル乳酸を含まない反応液を用いて同様に行なった場
合、液体区分にＬ−フェニルアラニンは検出されなかっ
た。

実施例２〜７ 供試微生物を変更し、かつ反応液中の菌体濃度１反応時
間を変更したこと以外は実施例１と同様に行なった。結
果を第４表に示す。

実施例８ 実施例１で得た生菌体を第５表または第６表の組成の反
応液中に菌体が５ｇ／ｆｆとなるように懸濁した。この
菌体懸濁液５０！ｌｆ！を５００　ｍｊ）容坂ロフラス
コに入れ、３０℃で２０時間振とう反応を行なった。

第　　５　　表 リン酸二ナトリウム　　　　　７．１ｇリン酸−カリウ
ム　　　　　　５．２５ｇ塩化アンモニウム　　　　　
　１０　　ｇＤ、Ｌ−フェニル乳酸　　　　　１０　　
ｇＮａＯＨＮａＯＨ水溶液チル０に調整後、蒸留水でＩ
Ｉ！にする。

第　　６　　表 リン酸二ナトリウム　　　　　７．１ｇリン酸−カリウ
ム　　　　　　５．２５ｇグルタミン酸−ナトリウム　
　５ｇ アスパラギン酸−ナトリウム　５ｇ Ｄ、Ｌ−フェニル乳酸　　　　　１０　　ｇＮａＯＨＮ
ａＯＨ水溶液チル０に調整後、蒸留水でＩＩ２にする。

反応終了後、除菌して得た液体区分について実施例１と
同様にして定量分析したところ、Ｌ−７エニルアラニン
の生！量は第５表の反応液の場合１０７ｍｇ　、第６表
の反応液の場合１１８＋ａｇであった。

実施例９〜１４ 供試微生物を変更し、かつ反応液中の菌体濃度２反応時
間を変更したこと以外は実施例８と同様に行なった。結
果を第７表に示す。

第　　７　　表 実施例１５ ペプトン・肉エキス寒天斜面培地上で３０℃。

２４時間培養したバラコツカス・デニトリフィカンスＩ
ＦＯ１３３０１の菌体１白金耳を第８表に示す組成の培
地５０ｍｆを分注した５００ｍｊ）容坂ロフラスコ２本
に接種して３０℃で振とぅ培養を行なった。培養後期の
培養８４時間目にフラスコ１本についテノミＤ、Ｌ−フ
ェニル乳酸ナトリウム２８３ｍｇを無菌的に添加し、さ
らに７１時間２目まで培養を行なった。

第　　８　　表 乳酸　　　　　　　　　　　　　　５ｇグルコース　　
　　　　　　　　　　５ｇ硝酸アンモニウム　　　　　
　　　１０ｇリン酸二ナトリウム・１２水Ｗ　　　　１
．５ｇリン酸−カリウム　　　　　　　　０．５　ｇ硫
酸マグネシウム・７水塩　　　　０．２　ｇ塩化カルシ
ウム・２水塩　　　　５０　　ｍｇ硫酸マンガン・４水
塩　　　　　　５ＩＩ１ｇ硫酸第一鉄・７水塩　　　　
　　　５　　ｍｇ硫酸コバルト・７水塩　　　　　　５
　　ｍｇ硫酸銅・５水塩　　　　　　　　　５　　ｍｇ
酵母エキス　　　　　　　　　　　０．２ｇＮａＯＨ水
溶液テｐＨ７，０に調整後、蒸留水でｌρにする。

培養終了後、培養液を５℃、　１１０００　Ｘ　ｇにて
１０分間遠心分離して得た上清液について実施例１と同
様にして定量分析を行なったところ、培養途中でＤ，Ｌ
−フェニル乳酸を添加した区分では５７ｍｇのＬ−フェ
ニルアラニンが生成していた。一方、Ｄ、Ｌ−フェニル
乳酸を添加しなかった区分ではＬ−フェニルアラニンは
検出されなかった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｄ，Ｌ−フェニル乳酸に、パラコッカス（Ｐａｒａ−ｃ
   ｏｃｃｕｓ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、プ
   ロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅ
   ｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏ
   ｂａｃｔｅｒ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃ
   ｔｅｒ）属およびミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａ
   ｃｔｅｒｉｕｍ）属の中から選ばれた１種または２種以
   上の細菌を接触させることを特徴とするＬ−フェニルア
   ラニンの製造方法。