JPS63126490A - Ｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明はＬ−フェニルアラニンの製造法に関し、詳しく
は特定の微生物を利用して陽気的条件下にフェニルピル
ビン酸からＬ−フェニルアラニンを製造する方法に関す
る。

［従来の技術１発明が解決しようとする問題点］微生物
を利用してフェニルピルビン酸からＬ−フェニルアラニ
ンノ駈製造する方法としては、エネルギー源、無機アン
モニウム化合物または尿素および酸素の存在下にフェニ
ルピルビン酸に特定の微生物を作用させる方法（特開昭
８０−１８０８９０号公報）、フマール酸、アンモニウ
ムイオンまたは尿素の存在下にフェニルピルビン酸に特
定の微生物を作用させる方法（特開昭８１−１５８９７
号公報）、アミノ供与体の存在下フェニルピルビン酸に
トランスアミナーゼ活性を有する固定化細胞を作用させ
る方法（特開昭６０−１０２１９４号公報）などが知ら
れている。

しかしながら、これらの方法は安定的にＬ−フェニルア
ラニンを製造することが困難である等の問題点がある。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、Ｌ−フェニルアラニンの効率的な製造法
を確立すべく、使用する微生物について検討したところ
、特定微生物を用い、特定の条件下でフェニルピルビン
酸と接触させることによりＬ−フェニルアラニンを効率
よく製造できることを見出し、かかる知見に基いて本発
明を完成したのである。

すなわち本発明は、シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏ−ｂａ
ｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム　（Ｃ’ｏｒｙｎｅ
−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム　（旧
ｃｒｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム
　（Ｂｒｅｖｉ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリヒ
ア（Ｅｓｃｈｅｒ　１ｃｈｉａ）属。

フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅ
ｒｒａｔｉａ）属、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅ！　
ｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびエン
テロバクタ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属のうちの
いずれかに属し、アミノ基供与物質の存在下、かつ妹気
的条件下フェニルピＩＶビン酸をＬ−フェニルアラニン
に変換する能力を有する微生物を、アミ７基供与物質の
存在下フェニルピルビン酸に嫌気的に接触させることを
特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造法に関する。

本発明に使用できる微生物は、上記各種の属に属し、ア
ミノ基供与物質の存在下、かつ嫌気的条件下にフェニル
ピルビン酸をＬ−７エニルアラニンに変換する使方を有
するものである。具体的にはシトロバクタ−・フロイン
ディ　（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ）　
ＡＴＣＣＢ２Ｓ３．＋リネバクテリウム・グルタミカム
　（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍ）　ＡＴＣＣ１３０３２、ミクロバクテリウム・
アンモニアフィラプレビバクテリウム・ロゼラム（１３
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｏｓｅｕｔａ）　ＡＴＣ
ｏ　１３Ｂ２５．−Ｚシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＡＴＣＣ１１３０３，７ラボ
バクテリウム・スアベオレンス　（Ｆｌａｖｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｓｕａｖｅａｌｅｎｓ）　ＡＴＣｏ　９５８
．　ｘルビニア・ハービコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒ
ｂｉｃｏｌａ）　ＡＴＣＣ２１４３４，セラチア−Ｆ／
Ｌ／　セ−，−１！　ンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒ
ｃｅｓｅｅｎｓ）　ＩＡＭ　１２０５゜クレブシェラ・
ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕ＋５ｏ
ｎｉａｅ）　ＡＴＣＣ８７２４，バチノ＃ｃ　ｉ　Ｉ　
Ｉ　ｕ　５ｃｅｒｅｕｓ）　ＩＦＯ３１３１，ｘンテロ
バクター・クロアカｘ　（Ｅｎｔｒｒｏｂａｃｔｅｒ　
ｃｌｏａｃａｅ）　ＩＡＭ　１５２８などを挙げること
ができ、これらを単独で、もしくは２種以上を組合せ用
いることができる。

微生物は様々な形態で使用することができ、たとえば増
殖期の菌体、休止期の菌体、固定化された菌体などのい
ずれであってもよく、さらには微生物菌体かも抽出処理
して得た酵素系を含む抽出処理物であってもよい。とり
わけ、休止期の菌体を用いる反応は反応制御が容易であ
り、好ましい、ここで、微生物菌体の固定化は、担体結
合法、架橋法、包括法などの常法の固定化技術を適用し
て行なうことができる。また、抽出処理としては、微生
物菌体の懸濁液を超音波、フレンチプレス、高圧ホモジ
ナイザーなどにより破砕したのち遠心分離等によって可
溶性抽出物を得る方法などを採用することができる。

フェニルピルビン酸に上記微生物を接触させてＬ−フェ
ニルアラニンを製造する場合、アミノ基供与物質の存在
が必要である。アミノ基供与物質としては種々の化合物
を使用できるが、安価かつ容易に入手できる無機アンモ
ニウム化合物、たとえばアンモニアガス、アンモニア水
、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム。

炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどや酢酸アン
モニウム等の有機アンモニウム化合物や尿素などが好適
である。

上記微生物を培養してＬ−フェニルアラニンを得るため
の培地としては、炭素源、窒素源などのエネルギー源と
なる物質を含む培地を用いることが必要であり、炭素源
としてはグルコース。

シュークロース等の糖類やエタノール、プロパツール、
エチレングリコール、マンニトール等のアルコール類、
ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアル
デヒド等のアルデヒド類、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、
コハク酸、乳酸等のカルボン酸類などが好適に使用でき
る。また、窒素源としては前記アミノ基供与物質のほか
肉エキス、ペプトンなどが用いられる。さらに、必要に
応じてリン酸カリウム塩、硫酸鉄塩、硫酸マンガン塩な
どの無機塩類や微生物の生育に必要な栄養物質を培地に
適宜加えることができる。

フェニルピルビン酸は培地に最初から加えてもよく、培
養を開始してから適当な時期に添加してもよい、また、
その添加は一度に行なってもよく、あるいは数回に分割
して行なってもよい。

上記微生物とフェニルピルビン酸との反応は嫌気的条件
下で行ない、使用する微生物の性質、形態などを考慮し
て適切な反応条件を決定すればよい、たとえば増殖期の
菌体を培養しながら反応させる場合、１０〜５０℃、好
ましくは２５〜４０℃の温度、ｐＨ３〜１０、好ましく
は６〜９の範囲にて１〜４日間鴎気的に反応させること
によりフェニルピルビン酸からＬ−フェニルアラニンを
製造することができる。また、休止菌体を用いて反応さ
せる場合、５〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃の温度
、ｐＨ３〜１０、好ましくは６〜９の範囲で適当な時間
反応させればよい。

さらに、上記培養法と休止菌体法を組合せたり、他の固
定化菌体、菌体抽出処理物を単独で、もしくは上記培養
法などと適宜組合せて行なうことも可能である。また、
妹気的条件は窒素雰囲気下とする等の常法を採用すれば
よい。

反応終了後、培養液などからＬ−フェニルアラニンを回
収、精製するには、固液分離、イオン交換樹脂、活性炭
などを用いる常法により行なえばよい。

［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１ ペプトン・肉エキス寒天斜面培地上で３０℃。

２４時間培養した所定の微生物の１白金耳を、表１に示
す組成の培Ｊｌｊ２１００ｍｊ＞を分注し、１２０℃で
１５分間加圧滅菌した５０ｈｊ）容坂ロフラスコに各々
接種し、３０℃で２４時間振盪培養を行なった。培養終
了後、培養液を５℃、　ｉｔ、ｏｏｏｘ　ｇで１０分間
遠心分離して得た菌体を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐ）１７
で３回洗浄後、表２に示す組成の反応液５ｍｊ）に菌体
儂度が１５ｇ／Ｒになるように懸濁した０次いで、窒素
奪回りＬ−フェニルアラニンを定量分析した。結果を表
４に示す、なお、フェニルピルビン酸無添加の場合は、
いずれもＬ−フェニルアラニンは検出されなかった。

ペプトン　１５ｇ　　　　　　ＮＨａＣ１’　　　　　
１０ｓｒ水で１ｇにする。　　　　　　る。

実施例２〜９ 表２のグルコースを表３に示すエネルギー源に変えたこ
と以外は実施例１と同様に反応を行なった。蓄積したＬ
−フェニルアラニンの量は表４に示す通りであった。な
お、フェニルピルビン酸無添加の場合は、いずれもＬ−
フェニルアラニンは検出されなかった。

表　　３ 実施例１０ 実施例１と同様にしてシトロバクタ−・フロインディ　
ＡＴＣＣ８７５０を３０℃、２４時間培養した５００ｍ
１’容ミゾイアボトル１本にプロピレングリコール１、
［ｉｇ　、フェニルピルビン酸０．８ｇおよびＮ）Ｉ４
Ｃｊ’０．８ｇを無菌的に添加し、窒素で嫌気的条件に
し、さらに３０℃で２４時間培養した。

培養液を５℃、　１１，０ＯＯＸ　ｇにて１０分間遠心
分離して得た上清液について定量分析したところ、２．
１ｍｇ／ｍＩ！のＬ−フェニルアラニンを生成していた
。一方、フェニルピルビン酸を添加しなかった区分では
Ｌ−フェニルアラニンは検出されなかった。

実施例１１ シトロバクタ−・フロインディ　ＡＴＣＣ８７５０につ
いて表２のグルコース２０ｇの代りに酢醸ナトリウム２
０ｇに、ＮＨａＣ１’　　１０　ｇを尿素８ｇに変えた
こと以外は実施例１と同様に反応を行なった。

蓄植したＬ−フェニルアラニンは４　ｔａｇ／ｒｘＲで
あった。一方、フェニルピルビン酸を添加しなかった区
分では、Ｌ−フェニルアラニンは検出されなかった。

［発明の効果］ 本発明によれば、ジペプチド甘味料であるアスパルチル
フェニルアラニンメチルエステルなどの原料として食品
工業、医薬品工業等の分野において有用なＬ−フェニル
アラニンを特定の微生物を用いて効率よく製造できる。

しかも、反応を嫌気的条件で行なえるため、通気操作等
が不要で簡便な操作で実施できる。また嫌気的条件下で
原料のフェニルピルビン酸は安定である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、
   コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
   ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉ
   ｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
   ｒｉｕｍ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
   ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ
   ｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア
   （Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉ
   ｅｌｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属および
   エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属のう
   ちのいずれかに属し、アミノ基供与物質の存在下、かつ
   嫌気的条件下フェニルピリビン酸をＬ−フェニルアラニ
   ンに変換する能力を有する微生物を、アミノ基供与物質
   の存在下フェニルピルビン酸に嫌気的に接触させること
   を特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造法。
2. （２）アミノ基供与物質が無機アンモニウム化合物、有
   機アンモニウム化合物または尿素である特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
3. （３）微生物が増殖期の菌体、休止期の菌体、固定化菌
   体および菌体抽出処理物のうちのいずれかである特許請
   求の範囲第１項記載の方法。