JPH10337187A - 新規ペクチン酸リアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 配列番号１に示すアミノ酸配列又は該ア
ミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペクチン酸リ
アーゼ、これをコードする遺伝子、組換えベクター、形
質転換体及びこれを用いたペクチン酸リアーゼの製法。 【効果】 ペクチン酸リアーゼ活性が高く、かつ洗浄剤
等に有用なペクチン酸リアーゼが得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規ペクチン酸リア
ーゼ及びその遺伝子に関し、さらに詳細には洗浄剤、食
品加工剤、繊維処理剤等として有用なペクチン酸リアー
ゼ及びその遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】ペクチンは、高等植物細胞壁の主要成分
の一つで、細胞壁間の接着固定に関与しているといわれ
る。食品工業では古くから、果汁の清澄化にペクチン質
分解酵素を用いており、搾汁率の向上、柑橘ジュースパ
ルプからの可溶性固形分の回収、野菜単細胞食品の製
造、みかん内果皮の剥皮などに広く用いられてきた。

【０００３】ペクチン質分解酵素の基質はプロトペクチ
ン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸などに分けら
れるが、いずれもＤ−ガラクツロン酸がα−１，４結合
したポリガラツクロン酸を基本骨格としている。プロト
ペクチンは水不溶性の重合度１，０００〜２，０００の
ポリガラクツロン酸単位からなり、５０〜８０％のメト
キシル基を有している。一方、ペクチンとペクチニン酸
は水溶性で、ポリガラクツロン酸がメトキシル化された
ものであり、後者の場合、そのメトキシル基が少量のも
のを言う。ペクチン酸はメトキシル基を含まないポリガ
ラクツロン酸そのものである。これらの基質に対して作
用する酵素は大きく分類すると、４種類存在する。すな
わち（１）ペクチンのメチルエステルを加水分解するペ
クチンメチルエステラーゼ、（２）ペクチンとペクチン
酸のα−１，４結合を加水分解するエンド型とエキソ型
のポリガラクツロナーゼ、（３）ペクチンとペクチン酸
に対しβ−脱離反応でα−１，４結合を切断し、基質の
非還元末端にＣ４−Ｃ５不飽和結合を形成するエンド型
とエキソ型のペクチンリアーゼとペクチン酸リアーゼ、
そして（４）オリゴガラクツロン酸を主な基質とするオ
リゴガラクツロナーゼである（伊崎，バイオサイエンス
とインダストリー，50, 315-321, 1992）。この他、プ
ロトペクチンに対して作用するプロトペクチナーゼも知
られるようになってきている（Sakai & Okushima, Agri
c. Biol. Chem.,42, 2427-2429, 1978;Sakai & Okushim
a, Agric. Biol. Chem., 46, 667-676, 1982;Sakai & S
akamoto, Agric. Biol. Chem., 54, 879-889, 1990）。
この酵素はポリガラクツロナーゼあるいはペクチン酸リ
アーゼ活性を有するＡ−タイプと、セルロースとペクチ
ン質を結び付けている介在多糖のアラビナンのα−１，
５結合性ガラクタンのα−１，４結合を加水分解するＢ
−タイプのプロトペクチナーゼに分類されるという（坂
井と阪本，繊維工学，45, 19-32, 1992）。

【０００４】ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）は、１
９６１年、バチルス ポリミキサ（Bacillus polymyx
a）の培養液に初めて見い出されたもので、反応にカル
シウムイオンを必要としている（Nagel & Vaughn, Arc
h. Biochem. Biophys., 94, 328-332, 1961）。一般にP
seudomonas属、Erwinia属、Bacillus属などの細菌由来
のペクチン酸リアーゼの最適反応pHは８〜９．５付近に
ある（Rombouts & Pilnik,Eco. Microbiol., 5, 227-28
2, 1980）。さらに、微生物由来のいくつかのペクチン
酸リアーゼは最適pH１０〜１０．５であることが知られ
ている。例えばFusarium oxysporum f. sp. ciceriの生
産する２種の酵素（いずれも分子量はゲル濾過法で37kD
a）（Arte's & Tena, Physiol. Mol. Plant Pathol., 3
7, 107-124,1990）とBacillus sp. YA-14の酵素（ゲル
濾過法とソディウムドデシルサルフェイト（ＳＤＳ）−
ポリアクリルアミド電気泳動法で分子量が43kDa）（Han
et al., Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 20,
655-662, 1992）は最適pHが１０〜１０．５に存在する
が、これらの酵素の場合、pH７〜８付近にも最適pHのピ
ークが存在する。一方、Fusarium solani f. sp. pisi
の酵素（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法で分子
量が29kDa;PelB）の最適pHは１０付近であることが知ら
れている（Guo et al., J. Bacteriol., 177, 7070-707
7, 1995）、また、放線菌のAmycolataのある種の株が生
産する酵素（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で31
kDa,質量分析で30kDa）の最適pHは１０．２５であると
いう（Bruhlmann, Appl. Environ. Microbiol., 61, 35
80-3585, 1995）。

【０００５】遺伝子学的、生化学的に充分研究されてい
るBacillus属細菌のペクチン酸リアーゼについては、比
較的報告例が少ない。Nagel とVaughnが最適pHが８．９
〜９．４のBacillus polymyxaの培養液にペクチン酸リ
アーゼを発見して以来（Arch.Biochem. Biophys., 93,
344-352, 1961）、Bacillus pumilusで最適pHが８．０
〜８．５の酵素（ゲル濾過法で約20kDa）（Dave & Vaug
hn, J. Bacteriol., 108, 166-174, 1971）、Bacillus
subtilisで最適pHが８．５の酵素（ゲル濾過法で分子量
が31〜35kDa）（Chesson & Codner, J. Appl. Bacterio
l., 44, 347-364, 1978）、好熱性Bacillus属細菌の一
種が生産する最適pHが８．５〜９．３の酵素（分子量は
不明）（Karbassi & Luh, J. Food Sci., 44, 1156-116
1, 1979）が知られている。Bacillus subtilis SO 113
株の生産する酵素は分子量がＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法で４２ｋＤａであり、最適pHが８．４であ
るがさらにpH１０以上にもう一つの活性ピークが存在す
る（Nasser et al., Biochimie, 72, 689-695, 199
0）。最近、Sakamoto ら（Biosci. Biotech. Biochem.,
58, 353-358, 1994）は、プロトペクチナーゼ活性を有
するペクチン酸リアーゼをBacillus subtilisＩＦＯ３
１３４から精製しているが（protopectinase-N）、最適
pHが８．０で、分子量がＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動法で４３ｋＤａ、ゲル濾過法で３２ｋＤａである
という。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
従来のペクチン酸リアーゼは、生産性が低く、高価であ
るため、工業的利用ができない、酵素活性も充分でない
等の問題があり、広く産業界で応用されていない。従っ
て本発明の目的は、ペクチン質を含む植物性の細胞壁あ
るいはその断片を含む物質中からペクチン自体を分解す
る作用に優れ、かつ大量生産可能なペクチン酸リアーゼ
及びその遺伝子を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、ペク
チン酸リアーゼを産生する微生物を自然界から探索し、
遺伝子工学技術を利用してその遺伝子、その特性及びそ
の大量生産技術を確立すべく種々検討してきたところ、
土壌から分離したバチルス属細菌が産生する新規な酵素
学的性質を有するペクチン酸リアーゼを見出し、さらに
その遺伝子のクローニング、遺伝子組換えによる生産技
術の確立、その変異体の調製及びそれら特性の解明に成
功し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、配列番号１に示すア
ミノ酸配列又は該アミノ酸配列の１若しくは２以上のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を
有するペクチン酸リアーゼを提供するものである。ま
た、本発明は、上記のペクチン酸リアーゼをコードする
遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター及び該組換
えベクターを含む形質転換体を提供するものである。さ
らにまた、本発明は上記の形質転換体を培養し、培養物
からペクチン酸リアーゼを採取することを特徴とする上
記のペクチン酸リアーゼの製造法を提供するものであ
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明のペクチン酸リアーゼは、
配列番号１に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の
１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列を有する。欠失、置換若しくは付加
（以下、変異ということがある）は、ペクチン酸リアー
ゼ活性を失なわない限り特に制限されないが、配列番号
１における１０７位リジン、１２９位リジン及び１３２
位アルギニンを保存するような変異であるのが望まし
い。また、変異の程度は特に制限されないが、上記１０
７位、１２９位及び１３２位を保存する限り、配列番号
１中のアミノ酸番号３６〜１３２のうち５５．７％以上
の相同性を有しているのが好ましく、７０％以上の相同
性を有しているのがより好ましく、８０％以上の相同性
を有しているのが特に好ましい。また、配列番号１のア
ミノ酸配列におけるＮ末端には、１〜数個のアミノ酸が
付加していてもよい。該Ｎ末端に付加していてもよいア
ミノ酸としては、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ、Ｇｌｎ−Ａｌａ等が挙げられる。

【００１０】本発明のペクチン酸リアーゼは、前記の如
く土壌から分離したバチルス属に属する微生物（例えば
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ１５株やそれらの変異
株）を培養し、得られた培養物から採取することによっ
て製造できるが、該ペクチン酸リアーゼを産生する微生
物から、該ペクチン酸リアーゼをコードする遺伝子を取
得し、これを用いて組換えベクターを作製し、該組換え
ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた形質
転換体を培養し、培養物からペクチン酸リアーゼを採取
することによっても得られる。

【００１１】本発明ペクチン酸リアーゼ遺伝子は、例え
ばＫＳＭ−Ｐ１５株からクローニングすることができ
る。該クローニング手段としては、既知の手段、例えば
（１）適当な制限酵素による染色体ＤＮＡの全分解又は
部分分解で得られたＤＮＡ断片を適当なベクターに組み
込み、大腸菌や枯草菌などに導入し発現させるショット
ガン法、（２）適当なプライマーを合成してＰＣＲ法で
目的とする遺伝子をクローニングする方法等が挙げられ
る。

【００１２】本発明ペクチン酸リアーゼ遺伝子の塩基配
列の一例を配列番号１に示す。該塩基配列は、配列番号
１に限定されるものではなく、配列番号１のアミノ酸配
列又はその前記変異体をコードするものであればよい
が、配列番号１で示される塩基配列、又は該塩基配列の
１若しくは２以上の塩基が欠失、置換若しくは付加され
た塩基配列を有するものが好ましい。ここで欠失、置換
若しくは付加は、前記アミノ酸配列の変異の範囲内であ
ることが好ましい。

【００１３】前記ペクチン酸リアーゼ遺伝子を含む組換
えベクターを作製するには、目的とする宿主内で遺伝子
を発現するのに適した任意のベクターにペクチン酸リア
ーゼ遺伝子を組み込めばよい。かかるベクターとして
は、大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１９等が挙げられ、枯草菌を宿主とする場
合、ｐＵＢ１１０等が挙げられる。

【００１４】かくして得られた組換えベクターを用いて
宿主を形質転換するには、常法、例えばプロトプラスト
法、コンピテントセル法等により行われる。宿主として
は、特に制限されないが、微生物が好ましく、バチルス
ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス リケ
ニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルスブ
レビス（Bacillus brevis）、バチルス ステアロサー
モフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチル
ス レンタス（Bacillus lentus）、バチルスアルカロ
フィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス アミ
ロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、
バチルス サーキュランス（Bacillus circulans）、バ
チルス ロータス（Bacillus lautus）、バチルス フ
ァーマス（Bacillus firmus）、ストレプトマイセス
ムリナス（Streptomyces murinus）等のグラム陽性菌；
大腸菌（Escherichia coli）等のグラム陰性菌；サッカ
ロマイセス属酵母、アスペルギルス属カビ等の真菌等が
挙げられる。

【００１５】得られた形質転換体を培養して本発明ペク
チン酸リアーゼを採取するには、例えば前記のＫＳＭ−
Ｐ１５株を用いた培養、採取、精製の手段に準じればよ
い。ここで、ＫＳＭ−Ｐ１５株又は上記の形質転換体を
用いて本発明ペクチン酸リアーゼを生産するには、菌株
を同化性の炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培
地に接種し、常法に従い培養すれば良い。炭素源、窒素
源は特に制限はなく、資化しうる炭素源、例えばペクチ
ン質、ガラクトース、グルコース、蔗糖、でんぷん ま
た、クエン酸、酢酸等があげられる。窒素源としては、
無機のアンモニウム塩や硝酸塩、肉エキス、魚肉エキ
ス、コーンスティープリカー、ペプトン、大豆粉、綿実
油粕、酵母エキス、尿素等が利用できる。その他、リン
酸塩、Ｍｇ ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｎ²⁺、 Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 等の金
属塩など有機、無機微量栄養源を培地中に適宜添加でき
る。培地のpHの調整には、炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム等を用い、本酵素の最適生産pHに調整することが望ま
しい。

【００１６】かくして得られた培養液中からのペクチン
酸リアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精
製方法に準じて行うことができる。即ち、培養液から遠
心分離又はろ過することで菌体を除き、培養上清液から
常法の精製手段、例えば塩析法、溶媒沈殿法、等電点沈
殿法によってタンパク質を沈殿させたり、限外ろ過によ
り濃縮させて目的酵素を得る。塩析法の例として硫安
（３０〜９０％飽和画分）、溶媒沈殿法の例としてエタ
ノール（５０％以上）中で酵素を沈殿させた後、遠心分
離、脱塩処理し、凍結乾燥粉末を得ることができる。こ
こで脱塩方法としては、透析あるいはセファデックスＧ
−１０等を用いるゲルろ過の方法が用いられる。このよ
うにして得られる酵素液は、そのまま用いることもでき
るがさらに公知の方法により精製、結晶化することもで
きる。

【００１７】かくして得られる本発明のペクチン酸リア
ーゼは、前記のようなアミノ酸配列を有し、かつペクチ
ン酸リアーゼ活性を有する限り特に制限されないが、最
適反応pHが１０．３〜１０．７であり、またプロトペク
チンに対しても強く作用するという特性を有する。

【００１８】本発明のペクチン酸リアーゼのより詳細な
酵素学的性質は、以下の通りである。

【００１９】 （１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応に よってエンド的にα−１，４結合を切断すると共に非 還元末端のＣ４−Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和ジ ガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニ ドを生成する。 （２）基質特異性 プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸） 、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。 （３）最適反応pH pH１０．３〜１０．７（50mMグリシン−水酸化ナトリ ウム緩衝液） （４）安定pH pH５〜１１．５（３０℃、６０分間処理） （５）最適反応温度 ４５〜５５℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化 ナトリウム緩衝液） （６）耐熱性 約５０℃（pH７．５、５０mMトリス−塩酸緩衝液） （７）分子量 約２０．３±１ｋＤａ（超遠心平衡沈降法；ＳＤＳポ リアクリルアミド電気泳動法では約２６ｋＤａ） （８）等電点 pH９．５〜１０．５（等電点電気泳動法） （９）阻害剤 エチレンジアミンテトラアセテート（EDTA）等のキレ ート剤によって阻害される。 （１０）金属イオン 反応にＣａ²⁺を必要とする。

【００２０】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれに制限されるものではない。

【００２１】実施例１：ペクチン酸リアーゼ生産菌のス
クリーニング 日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したもの、あるいは花王
（株）の微生物保存室に保有の菌株を下記の組成を有す
る寒天平板培地に塗布し、３０℃で３〜５日間培養を行
った。菌が生育した後、１％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ溶液
（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）を流し込
み１０分間靜置した。ポリガラクツロン酸の分解に起因
してコロニーの周辺に溶解斑を形成した菌を選抜してペ
クチン酸リアーゼ生産能を検定した。その結果、ペクチ
ン酸リアーゼ生産菌としてバチルスエスピー ＫＳＭ−
Ｐ１５株を得た。

【００２２】

【表１】 スクリーニング用寒天平板培地の組成 イーストナイトロジェンベース（Ｄｉｆｃｏ製） ０．１７ ％（ｗ／ｖ） 硫酸アンモニウム ０．２ リン酸１カリウム ０．３ リン酸２ナトリウム ０．６ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ製） ０．１ ポリガラクツロン酸（Ｓｉｇｍａ製） ０．５ 寒天 １．５ トリス−塩酸緩衝液（pH８） ０．１ Ｍ（別滅菌）

【００２３】ＫＳＭ−Ｐ１５株の菌学的性質を以下に示
す。

【００２４】Ａ 形態学的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ 桿菌 ０．３〜０．
５×１．６〜２．１μｍ （ｂ）多形性 無し （ｃ）運動性 有り （ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の有無）０．６〜
０．７×１．２〜１．４μｍ，中央、準端，膨潤有り （ｅ）グラム染色 陽性 （ｆ）抗酸性 陰性 （ｇ）肉汁寒天平板培地上での生育（培地１）黄白色、
点状、隆起状、全縁のコロニーを形成 （ｈ）リトマスミルク（培地２） 僅かに赤色を呈する
が凝固はしない

【００２５】Ｂ 生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元（培地３） 陽性 （ｂ）脱窒反応 （培地３） 陰性 （ｃ）ＭＲテスト（培地４） 陽性（pH５．５） （ｄ）ＶＰテスト（培地４） 陽性 （ｅ）インドール生成（培地５） 陰性 （ｆ）硫化水素生成（培地６） 陰性 （ｇ）デンプン加水分解（培地７）陽性 （ｈ）クエン酸の利用（培地８） 陽性 （ｉ）無機窒素の利用（培地９） 硝酸塩、アンモニウ
ム塩を利用しない。 （ｊ）色素の生成（培地１０） 無し （ｋ）ウレアーゼ（培地１１） 陰性 （ｌ）オキシダーゼ（培地１２） 陽性 （ｍ）生育の温度範囲（培地１３）２０℃〜４５℃ （ｎ）生育のpH範囲（培地１４） pH７〜１０ （ｏ）生育における酸素の影響 （培地１５） 嫌気
条件下で生育する。 （ｐ）ＯＦテスト （培地１６） 生育するが色調の変
化は認められない。 （ｑ）グルコースからのガス産生（培地１７） 無し （ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性（培地１８） ３％
塩化ナトリウム含有培地上で生育できない。 （ｓ）糖からの酸生成（培地１９） 下表に結果を示
す。

【００２６】

【表２】 糖類 酸生成 ガラクトース ＋ キシロース ＋ アラビノース ＋ シュークロース ＋ グルコース ＋ マンニトール ＋ マンノース ＋ イノシトール − ソルビトール − トレハロース ＋ ラクトース ＋ グリセリン ＋ マルトース ＋ フラクトース ＋ ラフィノース ＋ メリビオース ＋ 可溶性でんぷん ＋ ＋，酸生成有り ； −，酸生成無し

【００２７】 培地１ ニュートリエントアガー（Ｄｉｆｃｏ社製）、
指示量 培地２ バクトリトマスミルク （Ｄｉｆｃｏ社製）、
１０．５重量％ 培地３ ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）、
０．８重量％；硝酸カリウム、０．１重量％ 培地４ ＶＰ−ＭＲ ブロス（ＢＢＬ社製）、指示量 培地５ ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）、
指示量；インドール試験紙( 日水製薬社製） 培地６ ＴＳＩ寒天培地（栄研化学社製）、指示量 培地７ ニュートリエントアガー（Ｄｉｆｃｏ社製）、
指示量；可溶性デンプン、１．０重量％ 培地８ クリステンセン培地（栄研化学社製）、指示量 培地９ 酵母エキス、０．０５重量％；硫酸ナトリウ
ム、０．１重量％；リン酸１カリウム、０．１重量
％，；グルコース、０．１重量％；硝酸ナトリウム、又
は亜硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、０．０２５重量％ 培地１０ キングＡ培地、キングＢ培地（栄研化学社
製）、指示量 培地１１ バクトペプトン、０．１重量％；塩化ナトリ
ウム、０．３重量％；リン酸１カリウム、０．２重量
％；酵母エキス、０．０５重量％；グルコース、０.1重
量％；フェノールレッド、０．００１重量％；尿素、
２．０重量％ 培地１２ チトクロムオキシダーゼ試験濾紙（日水製薬
社製） 培地１３ ＳＣＤ培地（日本製薬社製） 培地１４ ニュートリエントブロスに炭酸ナトリウム、
塩酸を別滅菌後に添加し、pHを調整した。 培地１５ アナエロビック アガー（Ｄｉｆｃｏ社
製）、指示量 培地１６ ＯＦ基礎培地（Ｄｉｆｃｏ社製）、指示量；
グルコース、１．０重量％ 培地１７ ＳＣＤ培地（日本製薬社製）、指示量；グル
コース、０．５重量％ 培地１８ ニュートリエントアガー（Ｄｉｆｃｏ社
製）、指示量；塩化ナトリウム、３．０〜１０．０重量
％ 培地１９ リン酸二アンモニウム、０．１；塩化カリウ
ム、０．０２重量％；硫酸マグネシウム、０．０２重量
％；酵母エキス、０．０２重量％；寒天、１．５重量
％；ブロムクレゾールパープル、０．０００６重量％；
糖類（別滅菌）、０．５重量％

【００２８】以上の菌学的性質について「Berger's Man
ual of Systematic Bacteriology」（Williams & Wilki
ns社、1984年）の記載に準じ検討したところ、本菌株は
バチルス サーキュランス（Bacillus circulans）に属
させることが妥当である。しかし、バチルス サーキュ
ランスは、一般的に非常に多様性に富む菌株であり、本
菌株の諸性質は既知のバチルス サーキュランスの諸性
質とは完全に一致しない新規な微生物である。そこで、
本菌株を工業技術院生命工学研究所にバチルスエスピー
（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ１５（ＦＥＲＭ Ｐ−１
５９８７）として寄託した。

【００２９】実施例２：ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養 上述のスクリーニングにより得られたバチルス エスピ
ー ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養は、坂口フラスコに５０ml
の液体培地を加えて３０℃、２日間振盪培養を行った。
培地組成は、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５％
酵母エキス、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸２カリ
ウム、０．００１％塩化カルシウム、０．５％ペクチ
ン、０．５％炭酸ナトリウムとした。

【００３０】実施例３：ＫＳＭ−Ｐ１５株の精製 バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養液を遠心
分離（１２，０００×ｇ、１５分）し、その上澄液（１
２５０ml）に硫酸アンモニウムを９０％飽和となるよう
に徐々に添加した。５℃で一昼夜放置した後、遠心分離
（１２，０００×ｇ、１５分）を行い沈殿物を回収し
た。これを少量の１mM塩化カルシウムを含む１０mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH７．０）に溶解し、同緩衝液に対し
て一昼夜透析を行った。得られた透析内液（９００ml）
のうち１００mlずつをあらかじめ１mM塩化カルシウムを
含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡化
しておいたスーパーＱトヨパール６５０Ｍ（東ソー社
製）カラム（２．５×１０cm）へ添着した。平衡化緩衝
液にて洗浄溶出される画分に活性が認められ、これを集
めた（１１００ml）。次にＢｉｏ Ｃａｄ ６０ ＨＰ
ＬＣシステム（日本パーセプティブ社製）を用いて０．
２mM塩化カルシウムを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液
（pH７．０）にて平衡化しておいたスルホプロピルカラ
ムへ上記の非吸着画分を２００mlずつ添着した。０から
０．２M の塩化ナトリウムを用いた濃度勾配溶出法によ
り、タンパク質を溶出させた。ペクチン酸リアーゼ活性
は０．１M 付近の塩化ナトリウム濃度で単一ピークとし
て溶出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいても均一なタンパ
ク質として検出された。上記の操作を繰り返し、精製酵
素を得た（以下、ここで得られたペクチン酸リアーゼを
ＢＰＡＬということがある）。活性収率は約６０％であ
り、精製倍率は５０倍であった。

【００３１】実施例４：ＫＳＭ−Ｐ１５株由来ペクチン
酸リアーゼの酵素学的性質及びその測定法 （１）標準酵素活性測定法 試験管に０．３mlの０．５M グリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（pH１０．５）、０．３mlの６mM 塩化カルシ
ウム溶液、１．７mlの脱イオン水を加え、３０℃で５分
間恒温した後、０．１mlの適当に希釈した酵素液（希釈
は１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝
液、pH７．５により行った）を加えさらに５分間恒温し
た。反応は、０．６mlの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロ
ン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Ｌｏｔ １４４８２、水酸化
ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したもの）を添加し
開始した。３０℃で１０分間恒温した後、３mlの５０mM
塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽和ポリガラ
クツロン酸量は２３５nmにおける吸光度を測定し、不飽
和ジガラクツロニドの分子吸光係数４６００（Hasegawa
＆ Nagel, J. Food Sci., 31, 838-845, 1966）を用い
て求めた。なお、ブランクは酵素液を加えずに処理した
反応液に３mlの５０mM塩酸を加え、その後に０．１mlの
酵素液を添加したものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）
は、上記反応条件下において１分間に１μmol の不飽和
ジガラクツロニド相当の不飽和ポリガラクツロニドを生
成する量とした。

【００３２】（２）最適反応pH ５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９）、又は５０mMグ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８．５〜１１．
０）を用いて最適反応pHを調べたところ、本酵素はグリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１０．５中で最も反応
速度が高く、pH１０．３〜１０．７の範囲内において最
高活性の９０％以上の活性を示した。さらにpH１０．０
〜１１．０の範囲内において最高活性の７０％以上の活
性を示した。

【００３３】（３）pH安定性 ４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液（pH３〜１
２）中に１mMの塩化カルシウムを添加した系と無添加の
系を用い、酵素液を加えて３０℃、１時間恒温した後の
残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、
本酵素は、カルシウムの存在の有無に拘らずpH５〜１
１．５の範囲で極めて安定であった。

【００３４】（４）最適反応温度 ５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．
５）中にて１０℃〜７０℃の各温度で酵素反応を行い、
最適反応温度を調べた。その結果、本酵素は、１０℃−
６５℃の広範囲において作用し、その最適反応温度は５
０〜５５℃であった。

【００３５】（５）耐熱性 ５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）に１mMの塩化カ
ルシウムを添加した系及び無添加系を用意し、酵素を加
えて１０℃〜７０℃の各温度で３０分間放置した。その
後氷中で急冷し、残存活性を標準酵素活性測定法にて調
べた。その結果、本酵素は、５０℃まで極めて安定であ
った。また、カルシウムイオンによる安定化効果は高温
側で若干認められた。

【００３６】（６）分子量 ａ．平衡沈降法による本酵素の分子量は次のように求め
た。超遠心機（日立製作所製ＳＣＰ−７０Ｈ型、 ＲＡ
Ｐ６０型ローター）を用いダブルセクターセルの一方に
酵素サンプル（０．２，０．３，０．４及び０．６mg／
ml）を０．１ml、もう一方に０．１mlの脱イオン水を注
入し、２０℃、２００００rpm で２０−２４時間回転さ
せ平衡状態に達した後、ＵＶスキャナ（日立製作所製
ＡＢＳ−７型）を用いて酵素の分布状態を測定し、デー
タ解析装置（日立製作所製 ＤＡ−７型）により分子量
を求めた。部分比容値は、０．７４を用い、タンパク質
濃度を０に外挿し分子量を求めた結果、本酵素の分子量
は、２０．３±１．０ｋＤａであった。

【００３７】ｂ．ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
法（１５％ゲル）により、本酵素の分子量は約２６ｋＤ
ａと見積られた。尚、標準タンパク質としてバイオラッ
ド社製の分子量マーカー（ホスホリラーゼｂ（９７．４
ｋＤａ）；牛血清アルブミン（６６．２ｋＤａ）；オボ
アルブミン（４５ｋＤａ）；カルボニックアンヒドラー
ゼ（３１ｋＤａ）；トリプシンインヒビター（２１．５
ｋＤａ）α−ラクトアルブミン（１４．４ｋＤａ）を用
いた。

【００３８】（７）等電点 pH８−１０．５のアンフォライン（ファルマライト，フ
ァルマシア社製）を含む５％ポリアクリルアミドゲルを
用いた等電点電気泳動法により、本酵素の等電点はpH１
０．３付近であった。

【００３９】（８）アミノ末端配列 本酵素をＰｒｏＳｏｒｂフィルター（パーキンエルマー
社製）にブロッティングし、プロテインシークエンサー
（６７４型，アプライドバイオシステム社製）を用いて
アミノ末端配列を２０番目のアミノ酸まで決定した結
果、ＡＰＴＶＶＨＥＴＩＲＶＰＡＧＱＴＦＤＧＫであっ
た。

【００４０】（９）プロトペクチンに対する作用 基質として品質管理用作業手袋（４０スムス晒指付き・
綿、中田久吉商店製）を細かく裁断（１〜２mm四方）し
た木綿繊維片１０mg（１％ｗ／ｖ）を０．６mM塩化カル
シウムを含む１００mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH１０．５）中に懸濁し、酵素を添加した後、３０
℃、６０分間、１２０rpm で反応させた。反応液を遠心
分離し上澄液中に遊離したペクチンをカルバゾール硫酸
法により定量した（Sakai, Methods Enzymol., 161, 33
5-350, 1988）。その結果、０．１U の酵素を用いた場
合１０mgの木綿繊維あたりガラクツロン酸として２０〜
５０μｇのペクチン遊離量が認められた。このことは、
本酵素が木綿繊維表面のプロトペクチンに対して作用し
ていることを示唆し、さらに上澄液中の２３５nmにおけ
る吸光度の上昇が認められたことから、本酵素はＡタイ
プに属するプロトペクチナーゼ活性を有していることが
判った。さらにＷａｒｄとＦｏｇａｒｔｙの方法（J. G
en. Microbiol., 73, 439-446, 1972）に従い調製した
酸可溶性ペクチン酸を基質として用いた場合、ペクチン
酸に対する反応速度と同程度の反応速度で分解した。

【００４１】（１０）基質の分解様式 オストワルド粘度計（イワキガラス社製、Ｎｏ．１）に
終濃度が５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
１０．５）、０．６mM塩化カルシウム、０．７５％ポリ
ガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Lot 14482、水酸
化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したもの）となる
ように調製した反応液を加えて、３０℃で恒温した。こ
れに酵素を０．１U添加し、３０℃で１時間反応させ
た。一定時間ごとに粘度を測定しながら、反応液を１ml
ずつ採取し、０．５Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）を０．０４ml加えた後、２３５nmにおける吸光度を
測定した。その結果、反応時間に伴い粘度は低下し、初
期粘度を１００％とした場合、３０分後には６０％、６
０分後には４０％まで減少した。この時の不飽和ジガラ
クツロニド相当の不飽和物生成量は、基質の構成ガラク
ツロン酸量を１００％とした場合、６０分後で２％程度
であったことから、本酵素はエンド型のペクチン酸リア
ーゼであることが判った。

【００４２】（１１）金属イオンの影響 本酵素は、反応にカルシウムイオンを必要とし、そのＫ
ｍ値は０．１４mMであった。１mMのＥＤＴＡにより処理
をした酵素（脱イオン水に対して透析したもの）につい
てカルシウムイオン以外の金属イオンの影響を調べた結
果、マンガン、ストロンチウム、コバルトの各イオンを
添加した場合に若干の分解反応が認められたが、いずれ
もカルシウムイオンの場合の１０％以下の反応速度であ
った。次に１mMのＥＤＴＡ を含む１０mM ＭＯＰＳ緩
衝液（pH７．５）にて希釈した酵素液を最終濃度が５０
mM ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）、５mMの各金属塩とな
るように調製した処理液に１／１０量添加し、３０℃で
３０分間放置した。処理した酵素液を２０mMトリス−塩
酸緩衝液（pH７．５）にて希釈し、標準酵素活性測定法
により残存活性を測定した。本酵素は、上記の処理にお
いて各種金属イオンに対し極めて安定であったが、水銀
イオン及び亜鉛イオンにより若干阻害された（表３）。

【００４３】

【表３】 各種金属イオンの酵素活性に及ぼす影響 金属塩 濃度（ｍＭ） 残存活性（％） 塩化カルシウム ５ ９８ 塩化ストロンチウム ５ ９６ 塩化カドミウム ５ ９１ 塩化バリウム ５ ９２ 塩化マンガン ５ ８８ 塩化亜鉛 ５ ７３ 塩化第一鉄 ５ ９９ 塩化第ニ鉄 ５ ９２ 塩化マグネシウム ５ ９５ 塩化ニッケル ５ ８１ 硝酸銀 ５ ８４ 塩化銅 ５ １０９ 塩化水銀 ５ ７６ 塩化コバルト ５ ９６ 塩化アルミニウム ５ ９８ 無添加 − １００

【００４４】（１２）各種化合物の影響 本酵素の活性に及ぼす各種化合物の影響を調べた。ま
ず、標準酵素活性測定法に各種化合物を添加して酵素反
応を行ったところ、１mM ＥＤＴＡ、１mMエチレングリ
コールテトラアセテート（ＥＧＴＡ）、０．０１％ニト
リロ三酢酸（ＮＴＡ）、０．１％トリポリリン酸ナトリ
ウムによって完全に阻害された。これは、本酵素がカル
シウムイオンを反応に必要とするためにキレーターであ
る上記化合物によってカルシウムイオンが捕捉されるこ
とで起きたと考えられた。次に所定濃度の各種化合物を
５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）中に添加し、酵
素液を加えて３０℃、１時間恒温した後に残存活性を標
準酵素活性測定法にて調べた。その結果、本酵素は、界
面活性剤、キレート剤、他の化合物により阻害されるこ
とはなかった（表４）。

【００４５】

【表４】 各種化合物の酵素活性に及ぼす影響 化合物 濃度 残存活性（％） ＥＤＴＡ ５ ｍＭ ８９ ＥＧＴＡ ５ ｍＭ ９１ トリポリリン酸ナトリウム ０．１％ ９１ クエン酸 ０．１％ ９５ ゼオライトＡ−３ ０．１％ １０３ アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム ０．０１％ ９１ ドデシル硫酸ナトリウム ０．０２％ ９８ ポリオキシエチレンアルキル ０．１％ ９７ 硫酸ナトリウム ソフタノール７０Ｈ ０．１％ １０１ アルキルグルコシド ０．１％ １０１ ｐ−クロロマーキュリ安息香酸 ０．５ｍＭ ９１ Ｎ−エチルマレイミド １ｍＭ ９３ モノヨード酢酸 １ｍＭ ９６ ジチオスレイトール １ｍＭ ９９ ２−メルカプトエタノール １ｍＭ ９７ 無添加（コントロール） − １００

【００４６】実施例５：ＫＳＭ−Ｐ１５株由来ペクチン
酸リアーゼのＣ末端配列 ２８０nmの吸光度が２〜３の本酵素を脱塩した後、５０
μｌを１５０μｌの８M 尿素溶液に加え３７℃で１時間
保持した。この処理液１００μｌにｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
ｂｕｆｆｅｒ（島津製作所）１５０μｌ、３．３pmol
／μｌのリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬）５μｌ
を加えて、３７℃で１３時間保持した。酵素処理液４０
μｌにｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５
μｌを加え、ＤＩＴＣポリマービーズ・カラム（三菱化
学）に注入した後、Ｃ末端フラグメント自動分取装置
（ＣＴＦＦ−１：島津製作所）によりＣ末端フラグメン
トを分取した。このサンプルをＰｒｏＳｏｒｂフィルタ
ーにブロッティングし、プロティン シークエンサーに
よりＮ−末端アミノ酸配列を決定したところ、ＶＶＩＧ
ＡＰＡＡＤＧＶＨであった。

【００４７】実施例６：ペクチン酸リアーゼ遺伝子のク
ローニング （１）Ｐ１５株染色体ＤＮＡの調製 Ｐ１５株を液体培地（ペクチン０．５％；ポリペプトン
３．０％；肉エキス１．０％、酵母エキス（Difco）
０．５％；リン酸二カリウム０．１５％；塩化カルシウ
ム０．００１％、炭酸ナトリウム０．５％（別滅菌））
５０mlで１５時間３０℃で振とう培養した培養液を遠心
し、菌体を回収した。得られた菌体からＳａｉｔｏとＭ
ｉｕｒａの方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-62
9,1963）で染色体ＤＮＡを調製した。

【００４８】（２）プライマーの調製 実施例４（８）及び実施例５の結果から、プライマー１
及びプライマー２を合成した（図１）。 （３）クローニング このプライマー１と２を用い、バチルス エスピー Ｋ
ＳＭ−Ｐ１５の染色体ＤＮＡ（０．５μｇ）を鋳型とし
て、ＰＣＲの条件を解離９４℃（１分間）、アニーリン
グ３７℃（１分間）、伸長７２℃（１分間）を３０サイ
クル行って増幅を行った。得られた増幅断片をＰＣＲ断
片精製キット（ベーリンガー・マンハイム社）で精製し
た後、プラスミドベクターｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に
導入してクローン化した。得られたクローン５０個の塩
基配列を決定したところ、目的とするペクチン酸リアー
ゼ遺伝子配列の一部が検出され、推定アミノ酸配列も推
定できた（図２参照）。次に、上述のＰＣＲ増幅断片の
上流と下流の領域を増幅するためにインバースＰＣＲ
（inverse PCR）を行った。図２中に認められる塩基配
列、プライマー３とプライマー４を用いた。ＫＳＭ−Ｐ
１５株の染色体（１μｇ）を、あらかじめＰｓｔＩで消
化し、フェノール／クロロホルム抽出して、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて分子内結合（環状化ＤＮＡ結合）させ
て鋳型とした。ＰＣＲは、解離９４℃（１分）、アニー
リング５０℃（１分）、伸長６８℃（３分）を３０サイ
クルの条件で、Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｓｙｓｔ
ｅｍ ＰＣＲキット（TaKaRa社）を用いて行った。その
結果約２．０kbp の増幅断片が検出され、ダイレクトシ
ークエンスによってこのＤＮＡ断片の配列を行ったとこ
ろ、Ｎ−末端アミノ酸配列から終止コドン（TAA）の前
のアミノ酸までの１９７アミノ酸からなるペクチン酸リ
アーゼのアミノ酸配列及び塩基配列（配列番号１）を決
定した。ＫＳＭ−Ｐ１５株の生産するペクチン酸リアー
ゼ（分泌型成熟酵素）の分子量は、この配列から２０９
２４Ｄａ（約21kDa）と推定される。

【００４９】実施例７ まず、ＫＳＭ−Ｐ１５株の産生するペクチン酸リアーゼ
のＮ−末端アミノ酸Ａｌａの直上流に存在する、推定シ
グナルペクチナーゼ認識配列Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ
と、用いた宿主のベクター由来のシグナル配列が連結す
るように上流側のプライマー（プライマー５，図３参
照）をデザインした。下流側のプライマー（プライマー
６，図３参照）は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子の終止コ
ドン（TAA）から３７２bp下流に位置する２６bpからな
る配列をデザインした。使用したベクターｐＨＳＰ６４
（Sumitomo et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56,
872-877, 1992）のシグナル配列コード部分の３′側に
存在するＳａｌＩ部位とその１１bp下流に存在するＳｍ
ａＩ部位間に、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を挿入することと
した。

【００５０】すなわち、プライマー５と６を用い、ＫＳ
Ｍ−Ｐ１５株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行
い、約１kbｐＤＮＡ断片が増幅された。これをＳａｌＩ
で消化しておき、ＳａｌＩとＳｍａＩで切断されたｐＨ
ＳＰ６４とリガーゼで連結した（図４を参照）。この組
換えプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質転換させ、実
施例１の寒天平板培地で生育させたところ、溶解斑を集
落の囲りに形成した。得られた本発明の遺伝子をコード
する組換えプラスミドをｐＨＳＰ−Ａ１５６と命名し
た。

【００５１】次にｐＨＳＰ−Ａ１５６で枯草菌ＩＳＷ１
２１４を形質転換し、以下に示した液体培地中で３０℃
で３日間培養したところ菌体外に著量のペクチン酸リア
ーゼを生産した。

【００５２】

【表５】 ＜組換え枯草菌発酵用液体培地＞ ポリペプトンＳ（日本製薬製） ２．８％ 酵母エキス（Difco製） ０．０５％ 肉エキス ０．５％ リン酸１カリウム ０．１％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０２％ マルトース（別滅菌） ４％ テトラサイクリン １５μｇ／ml

【００５３】実施例８ 実施例７で得られたペクチン酸リアーゼの粗酵素液を実
施例３に従って完全精製した（以下、ここで得られたペ
クチン酸リアーゼをｒＰＡＬということがある）。実施
例４と同じ手法でこの酵素のＮ−末端アミノ酸配列を決
定したところ、ＡＰＴＶＶＨＥＴＩＲＶＰＡＧＱＴＦＤ
ＧＫを含む配列が検出された。

【００５４】実施例９ 実施例３と８で得られたペクチン酸リアーゼのpH−活性
曲線を調べた。その結果を図５に示したがポリガラクツ
ロン酸を基質とした時、両酵素のpH−活性曲線は、ほぼ
完全に一致し、最適反応pHは両方ともに、グリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液中でpH１０．３〜１０．７であっ
た。

【００５５】実施例１０ 実施例３と８で得られたペクチン酸リアーゼをＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動法（１５％アクリルアミ
ド）により、分子量を測定したところ、いずれの酵素の
分子量も２４〜２７ｋＤａの範囲にあることが判明した
（図６）。用いた標準タンパク（バイオラッド社製）は
ホスホリラーゼｂ（９７．４kDa）、牛血清アルブミン
（６６．２kDa）、オボアルブミン（４５kDa）、カルボ
ニックアンヒドラーゼ（３１kDa）、トリプシンインヒ
ビター（２１．５kDa）、α−ラクトアルブミン（１
４．４kDa）である。又、超遠心機（日立ＳＣＰ−７０
Ｈ型，ＲＡＰ６０型ロータを使用）を用い、２０℃で２
０〜２４時間、２０，０００rpmで平衡化させた後、偏
比容０．７４（ｇ／ml）として両酵素の分子量を算出し
たところ２０．３±１．０ｋＤａとなり、推定アミノ酸
配列から計算した分子量（２０９２４Da）とほぼ一致し
た。この様にＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（約
２５kDa）と平衡沈降法（約２０．３kDa）や推定アミノ
酸配列から計算される分子量（２０９２４Da）には解離
が認められる。このような測定法による分子量の解離は
他のペクチン酸リアーゼでもしばしば観察されている。
Amycolataの一株が生産する酵素の場合、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミド電気泳動法では３１ｋＤａであるが、ゲ
ル濾過法は１９ｋＤａである（Bruhlmann, Appl. Envir
on. Microbiol., 61, 3580-3585, 1995）。Erwinia chr
ysanthemiのＰｅｌＢとＰｅｌＥと称される酵素の場
合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法では４４ｋ
Ｄａであるが、遺伝子配列から推定される分子量はいず
れも約３８ｋＤａである（Keenan & Tamaki, J. Bacter
iol., 168, 595-606, 1986）。同様な報告は、Erwinia
chrysanthemiの酸性ペクチン酸リアーゼ（PLa）（Favey
et al., J. Gen. Microbiol, 138, 499-508, 1992）、
Aspergillus nigerの酵素（PLA）（Kusters-van Somere
n et al., Curr.Genet., 20, 293-299, 1991）やBacill
us subtilisの酵素（protopectinase-N）（Sakamoto et
al., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 353-358, 199
4）などでも知られている。

【００５６】実施例１１ 基質として品質管理用作業手袋（４０スムス晒指付き・
綿，中田久吉商店製）を細かく裁断した木綿繊維片１０
mgを０．６mM ＣａＣｌ₂を含む０．１M グリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）中に懸濁し、実施
例３及び８で得られたペクチン酸リアーゼを添加後、３
０℃、１時間、１２０rpm で反応させた。反応終了液を
遠心分離し、上澄液中に遊離したペクチンをカルバゾー
ル硫酸法（Sakai, Methods Enzymol., 161, 335-350, 1
988）で定量した。その結果、０．１Uの酵素を用いた場
合、いずれの酵素でも１ｇの木綿繊維あたりガラクツロ
ン酸として２〜５mgのペクチン遊離量が認められた。
又、市販木綿糸４０mg（カネボウ社製カタン糸３０番
手）に１．９mlの５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．
０）を加え、実施例３及び８で得られたペクチン酸リア
ーゼを０．１ml（０．２４U）添加し、３０℃、１時間
反応させた。その結果、木綿糸１ｇあたり０．５〜１．
５mgのペクチン遊離量が認められた。このことは両酵素
が木綿繊維表面のプロトペクチンに作用していることを
意味しており、さらに上澄液の２３５nmにおける吸光度
も上昇していることが判明したので、Ａ−タイプのプロ
トペクチナーゼ活性を有していると判定される。さら
に、ＷａｒｄとＦｏｇａｒｔｙの方法（J. Gen. Microb
iol., 73, 439-446, 1972）に準じて調製した酸可溶性
ペクチン酸を基質として用いた場合、実施例３及び８の
ペクチン酸リアーゼはペクチン酸と同じ速度で分解し
た。

【００５７】実施例１２ 実施例３及び８で得られたペクチン酸リアーゼの木綿繊
維（スムス織木綿手袋）からのペクチン遊離活性のpH依
存性を次の様にして検定した。すなわち、５００μｌの
８０mMブリットン・ロビンソン緩衝液（pH４〜pH１
３）、６０μｌの１０mM ＣａＣｌ₂、標準測定した（p
H１０．５，５０mMグリシン−水酸化ナトリウム）２U
ペクチン酸リアーゼ／mlの溶液１００μｌ、１０mg木綿
繊維、３４０μｌの脱イオン水の反応系で３０℃、１時
間反応させた。各pHにおけるペクチン遊離量をカルバゾ
ール硫酸法で定量し、最大活性値を与えるpHのペクチン
量を１００として、図７に表示した。図からもわかるよ
うに、両酵素共に、プロトペクチナーゼ活性の最適反応
pHは４０mMブリットン・ロビンソン緩衝液中で、pH１０
近傍であり、それぞれの相対活性曲線はほぼ完全に一致
している。同様の条件下で０．１M グリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液中での最大活性は、いずれもpH９．５近
傍に観察された（図８）。これらの結果から、本発明の
遺伝子産物であるペクチン酸リアーゼと天然型ペクチン
酸リアーゼはアルカリペクチン酸リアーゼ活性と同時に
アルカリプロトペクチナーゼ活性を有することがわか
る。

【００５８】実施例１３ 実施例３と８のペクチン酸リアーゼを用いて、特異的阻
害剤の影響を調べた。すなわち、５０mM トリス−塩酸
緩衝液（pH７．５）中で、酵素標品を各阻害剤（適当濃
度）で３０℃、１時間処理した後、残存活性を常法によ
り測定した。その結果、両酵素は２，４，６−トリニト
ロベンゼンスルホン酸（１mM）で約７５〜８０％、Ｎ−
ブロモスクシミド（０．１mM）で３０〜４０％の阻害を
受けた。一方、ｐ−クロロマーキューリ安息香酸（０．
５mM）、Ｎ−エチルマレイミド（１mM）、ヨード酢酸
（１mM）、ジエチルピロカーボネート（１mM）、５，
５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（１mM）、ジ
チオスレイトール（１mM）、グリオキサール（１mM）で
は若干阻害されるか、又は全く影響を受けなかった。

【００５９】実施例１４ 実施例３と８のペクチン酸リアーゼに及ぼすＨ₂Ｏ₂の影
響を調べた。両酵素の溶液２５０μｌ、Ｈ₂Ｏ₂（０〜３
０％）５０μｌ、５０mM トリス−塩酸緩衝液（pH７．
５）２５０μｌを混合し、３０℃で３０分間保温した。
その後０．５mg／mlのカタラーゼ（ベーリンガー社製）
１００μｌを加えて、５分間保持しＨ₂Ｏ₂を分解除去し
た。この処理液を常法により、残存活性を測定したとこ
ろ、両酵素とも、少なくとも３％以上のＨ₂Ｏ₂が存在し
ても全く失活しなかった。

【００６０】実施例１５ 本発明のペクチン酸リアーゼと既知のペクチン酸リアー
ゼとのアミノ酸配列の相同性について検討した。配列番
号１中、アミノ酸番号３６〜１３２の間で、他の酵素と
の相同性を検討すると、図９に示すように、カビのFusa
riumに由来するＰｅｌＡ（Crawford & Kolattukudy, Ar
ch. Biochem. Biophys., 258, 196-205, 1987、Gonzale
z-Candelas & Kolattukudy, J. Bacterirol., 174, 634
3-6349, 1992)、ＰｅｌＢ（Guo et al., J. Bacterio
l., 177, 7070-7077, 1995）、ＰｅｌＣ（Guo et al.,
Arch. Biochem. Biophys., 323, 352-360, 1995）、Ｐ
ｅｌＤ（Guo et al., Arch. Biochem. Biophys., 332,
305-312, 1996）で、それぞれ５４．６％、５２．６
％、５０．５％、５４．６％の相同性があるにすぎな
い。従って、本発明酵素のアミノ酸配列とアミノ酸番号
３６から１３２の間で適切にアライメントした時、これ
ら以上の相同性がある酵素は、本発明に含まれると解す
べきである。すなわち、本発明で用いる原料ＤＮＡとそ
れから推定されるアミノ酸配列の相同性は図１０に示し
たアミノ酸配列（配列番号１におけるアミノ酸番号３６
〜１３２）に対して５５．７％以上が好ましい。

【００６１】この中で最も相同性の高いＰｅｌＡと本発
明ペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列を通常の相同性を
調べる方法でマッチングすると、相同性はさらに低くな
る。すなわち、アミノ酸番号１１のＶａｌから１３２の
Ａｒｇまでの本発明の酵素のアミノ酸配列に対し、Ｐｅ
ｌＡは４５．５％の相同性しかなく、全アミノ酸配列
（アミノ酸番号１のＡｌａから１９７のＴｙｒ）と比較
すると３３．０％の相同性まで低下する（図１１）。

【００６２】実施例１６ 図１０に示したアミノ酸残基中、活性発現と立体構造維
持に必須なアミノ酸残基を特定することによって、本発
明酵素の特徴をさらに明確にすることが可能である。従
来、Ｙｏｄｅｒら（Science, 260, 1503-1307, 1993）
がErwinia ch rysanthemiのＰｅｌＣアイソザイムの立
体構造から類推しているように、特定のアミノ酸残基
（Ａｓｐ−１３１，Ｇｌｕ−１６６とＡｓｐ−１７０）
が活性発現に必須なＣａ²⁺イオンの結合部位である。Ba
cillus subtilisのＰＬではそのアミノ酸残基がＡｓｐ
−２１０、Ａｓｐ−２４４とＡｓｐ−２４７と想定され
ている（Nasser at al., EEBS Lett., 335, 319-326, 1
993）その後のＰＬの立体構造解析から推定されるＣａ
²⁺結合部位はＡｓｐ−１８４、Ａｓｐ−２２３とＡｓｐ
−２２７であることがわかっている（Pickersgill et a
l., Struct. Biol. USA., 1, 717-723, 1994）又、Ｙｏ
ｄｅｒらによると、このＣａ²⁺イオンの結合部位近傍に
あるＴｙｒ残基を含む“領域Ｉ”とＨｉｓ残基を含む
“領域II”が触媒部位であると推定しており、Bacillus
subtilisのペクチン酸リアーゼでも同様の二つの領域
が存在する。しかしながら本発明酵素のアミノ酸配列
は、通常のコンピューター支援検索では「相同性無し」
と判定され、これらのＣａ²⁺イオン結合部位と２領域を
比較することは不可能である。さらに、Bacillus subti
lisのペクチン酸リアーゼには一個のＣｙｓを含んでお
り（Ｃｙｓ−２２０）、ＳＨ阻害剤で活性が阻害される
ことより、このＣｙｓ−２２０のＳＨ基が触媒に関与し
ていると推定されている（Nasser et al., FEBS Lett.,
335, 319-326, 1993）。ところが、本発明の成熟分泌
酵素（実施例３と７）はＣｙｓを３個含んでおり、Ｃｙ
ｓ−６７、Ｃｙｓ−７１とＣｙｓ−１４８、この３個の
残基の機能は全くわかっていない。又、Bacillus subti
lisのペクチン酸リアーゼ（ＢｓＰｅｌ）の立体構造か
ら、Ｐｉｃｋｅｒｓｇｉｌｌら（Struct. Biol., U.S.
A., 1, 717-723, 1994）は、Ａｒｇ２７９−Ａｌａ２８
０−Ｐｒｏ２８１（ＲＡＰ配列）のＡｒｇ２７９が触媒
に関与していると推定しているが、本発明の酵素のアミ
ノ酸配列の中にそのようなものは存在していない。従っ
て、活性発現（触媒作用）と立体構造維持などに係わる
必須アミノ酸残基を確定することによって、本発明をさ
らに明確にすることができるので、以下にその詳細を記
述する。

【００６３】（１）本発明ペクチン酸リアーゼの変異タ
ンパクの創製 ＴａＫａＲａ社のＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐ
ｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＫＭ ｋｉｔのプロトコールに
従って、本発明の遺伝子の任意の変異タンパクを人工的
に創製した。

【００６４】変異導入用プラスミドベクターｐＫＦ１
９Ｋへの本発明遺伝子の導入。 本発明ペクチン酸リアーゼを高生産するｐＨＡＰＡＬ上
の高発現プロモーター領域から構造遺伝子を含む約１．
５kbp 断片をＲＣＲによって増幅した後、プラスミドｐ
ＫＦ１９ＫのＳｍａＩ部位に挿入した（これをｐＫＦＰ
ＡＬと命名）。

【００６５】変異導入ＰＣＲ まず、リアクションチューブ（０．５ml）に以下の反応
液を調製した。反応液組成は鋳型ＤＮＡ（ｐＫＦＰＡ
Ｌ）１０ng、セレクションプライマー５pmol、リン酸化
済み変異導入プライマー ５pmol、１０×ＬＡ ＰＣＲ
ＢｕｆｆｅｒII５μｌ、ｄＮＴＰ混合液（各２．５m
M）８μｌ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ０．５μｌ、
計５０μｌ。解離９４℃、１分間、アニール５５℃、１
分間、伸長７２℃、３分間を２５サイクル、その後４
℃、１０分間の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ断片精製
キット（ベーリンガーマンハイム社）によって増幅ＤＮ
Ａを精製し形質転換に用いた。

【００６６】大腸菌ＭＶ１１８４株への導入と変異の
確認 大腸菌ＭＶ１１８４コンピテントセル（ＴａＫａＲａ
社）を用い通常のコンピテントセル法でＰＣＲ産物を大
腸菌ＭＶ１１８４株へ導入した。カナマイシン（５０μ
ｇ／ml）を含むＬＢ寒天培地（バクトトリプトン１％、
酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天１．５
％）上に生育してきたコロニー数個からプラスミドＤＮ
Ａを調製し、配列解析を行って変異導入プラスミドを選
択した。

【００６７】変異に用いたプライマー配列は次の通りで
ある。（アミノ酸番号は配列番号１に従っており、略記
号の左側は本来のアミノ酸残基、右側は変異されたアミ
ノ酸残基を示している）。 Ｌｙｓ４１Ａｌａ ５′ＧＣＧＧＡＧＡＡＴＣＡＧＧＣＧＣＣＧＡＴＣＴＴ ＴＣＧ３′ Ｃｙｓ６７Ａｌａ ５′ＣＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＣＣＴＡＣＧＧＧＧＡＴＴ ＧＴＡＣ３′ Ｃｙｓ７１Ａｌａ ５′ＴＡＣＧＧＧＧＡＴＧＣＴＡＣＧＡＴＴＡＣＡＡＡ ＴＧＴＣ３′ Ｌｙｓ８９Ａｌａ ５′ＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＴＧＣＡＴＣＧＴＣＣＧＧ ＡＡＣＧ３′ Ｌｙｓ１０７Ａｌａ ５′ＡＡＧＧＣＧＴＡＴＧＡＣＧＣＧＧＴＧＴＴＣＣＡ ＡＡＴＣ３′ Ｌｙｓ１２９Ａｌａ ５′ＧＡＴＧＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＧＣＴＧＧＴＴＣＧ ＧＣＡＧ３′ Ａｒｇ１３２Ａｌａ ５′ＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＧＣＡＧＡＡＣＧＧ ＡＧＧＣ３′ （塩基配列中下線のトリプレットコドンが置換されるア
ミノ酸をコードしている）

【００６８】次に変異遺伝子を含むペクチン酸リアー
ゼ遺伝子でBacillus subtilisを形質転換して、各変異
ペクチン酸リアーゼを著量菌体外に生産させた後、精製
して活性の検定を行った（実施例７参照）。以上の変異
タンパク創製の手順を図４に示した。

【００６９】（２）変異タンパクの活性の検定 得られたｒＰＡＬ、Ｌｙｓ４１Ａｌａ、Ｃｙｓ６７Ａｌ
ａ、Ｃｙｓ７１Ａｌａ、Ｌｙｓ８９Ａｌａ、Ｌｙｓ１０
７Ａｌａ、Ｌｙｓ１２９Ａｌａ、Ａｒｇ１３２Ａｌａは
いずれも、立体構造を維持したまま組換え生産され、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによっても明瞭なタンパクのバンドとし
て検出される（図６）。これらの変異タンパクを精製し
（実施例３参照）、それぞれの活性を実施例１に記載の
標準測定法によって検討した。

【００７０】

【表６】 変異酵素の酵素活性（Ｉ） 変異酵素 精製酵素の比活性（Ｕ／mgタンパク） Ｃｙｓ６７Ａｌａ １８３ Ｃｙｓ７１Ａｌａ ２０１ 実施例８の酵素（ｒＰＡＬ：対照） ２２０

【００７１】表６に示したように、配列番号１に存在す
る二つのＣｙｓをＡｌａに置換しても、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅでみる限り立体構造は維持され、かつ活性も充分有し
ており、少なくとも活性発現と立体構造に対して本質的
な役割をになっていないことがわかる。ネイティブなタ
ンパクの中でこれらの内、たとえジスルフィド結合を形
成していようがいまいが活性に対して本質的なアミノ酸
残基ではないとを示している。Ｃｙｓ残基が本発明酵素
の活性発現に関与していないことは、ＳＨ阻害剤によっ
て酵素活性阻害がかからないことが、証拠となるであろ
う。すなわち、本発明酵素に対して、実施例１３に示し
た様に各種ＳＨ阻害剤（ｐ−クロロマーキュリー安息香
酸、Ｎ−エチルマレイミド、ヨード酢酸など）を添加し
ても、ほとんど阻害されない。又、Ｈ₂Ｏ₂はＭｅｔとＣ
ｙｓの側鎖の含硫基を強力に酸化して、しばしば酵素活
性を消失させることがあるが（例えばStauffer & Etso
n.J. Biol. Chem., 244, 5333-5338, 1969;Estel et a
l., J. Biol. Chem., 260,6518-6521, 1985;秦田ら、特
願平9-80299号）、本発明の酵素は高濃度のＨ₂Ｏ₂で処
理しても失活しない（実施例１４参照）。

【００７２】

【表７】 変異酵素の酵素活性（II） 変異酵素 精製酵素の比活性（Ｕ／mgタンパク） Ｌｙｓ４１Ａｌａ ２１２ Ｌｙｓ８９Ａｌａ ４８ Ｌｙｓ１０７Ａｌａ ＜１ Ｌｙｓ１２９Ａｌａ ＜１ 実施例８のペクチン酸リアーゼ（ｒＰＡＬ；対照）

【００７３】一方、アミノ酸配列Ｉに存在する４個のＬ
ｙｓ残基から、他のアミノ酸への置換は、本発明に決定
的な特徴付けを与える。すなわち、表７に示したよう
に、Ｌｙｓ８９Ａｌａ、Ｌｙｓ１０７ＡｌａとＬｙｓ１
２９Ａｌａの各変異酵素は、著しい酵素比活性の低下が
認められる。特にＬｙｓ１０７ＡｌａとＬｙｓ１２９Ａ
ｌａの変異酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで立体構造が維持
されているにもかかわらず、酵素活性は認められず、こ
れらの位置におけるＬｙｓ残基には触媒活性に対する本
質的な関与があることを示している。又、Ｌｙｓ８９Ａ
ｌａも活性が残存するものの、実施例８のペクチン酸リ
アーゼ（ｒＰＡＬ；未変異）の比活性の約２０％までに
低下している。この変異酵素もＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
から単一のタンパクとして完全精製され、分子量も何ら
他の変異体あるいは未変異体と変わることはない。従っ
て、何らかの機構で、ペクチン酸リアーゼ活性に影響を
与えるＬｙｓ残基であることを示している。これらＬｙ
ｓ残基の触媒に係わる重要性は、本発明酵素と相同性が
認められないErwinia chrysanthemi EC16（Kita et a
l., J. Biol. Chem., 271, 26529-26535, 1996）以外の
過去の如何なるペクチン酸リアーゼを含むペクチン分解
酵素群でも知られておらず、本発明で初めて明らかにし
たものである。このＬｙｓ残基の本質的役割は、Ｌｙｓ
残基の特異的阻害剤であるトリニトロベンゼンスルホン
酸を本発明ペクチン酸リアーゼに加えると、大幅に活性
が低下することからも（実施例１３）疑いの余地の無い
こととなった。

【００７４】次にＬｅｖｙらの方法（J. Biol. Chem.,
238, 3654-3651,1963）に従って、本発明酵素活性とト
リニトロベンゼンスルホン酸濃度の関係を調べた。活性
の半減期の長さ（ｔ_1/2）の逆数の対数〔ｌｏｇ（１／
ｔ_1/2）〕とｌｏｇ〔トリニトロベンゼンスルホン酸〕
の傾きから０．７３という値が得られ、特定のアミノ
酸、Ｌｙｓ、１個が少なくとも関与していることが判明
した。従って、部位特異変異の結果（表７）とも考え合
わせると、少なくとも４個のＬｙｓ残基のうち、少なく
とも１個以上のＬｙｓ残基が活性発現に関与しているこ
とは、ここでも明白な事実となった。

【００７５】一方、本発明のアミノ酸配列中、図９中に
示した箇所で、ＰｅｌＡ〜ＰｅｌＤまでの配列と相同性
があるのが４１位のＬｙｓである（配列番号１参照）。
当然、この位置のＬｙｓも触媒に関係する可能性があっ
たが、図６で示したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一な
タンパクバンドを与えるにもかかわらず、酵素の比活性
は、何ら天然型酵素と変わることは無い。従って、本発
明においてこの位置のＬｙｓ残基は、触媒に直接係って
いない基であることを示唆している。この推定は以下の
様にして、証明した。実施例８で得たペクチン酸リアー
ゼ（ｒＰＡＬ）をイオン交換水で脱塩濃縮し、２８０nm
における吸光度が約４になるように調整した。この酵素
液１００μｌ（約０．６mgのタンパクを含む）、１００
μｌの０．５M ホウ酸緩衝液（pH９．５）、３００μｌ
の脱イオン水を順次加え、次いで５０μｌの０．２２M
トリニトロベンゼンスルホン酸を加えて３０℃で３０分
間、暗所に保持した。この処理液をＤＣカラム（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ社製）で脱塩して、過剰のトリニトロベンゼン
スルホン酸と緩衝液を除去した。脱塩サンプル（５００
μｌ）に５０μｌの１Mリン酸緩衝液（pH８．０）、２
０μｌの０．１M ＥＤＴＡ（pH７．０）、１０μｌの１
mg／mlのＶ８プロテアーゼを加えて３７℃で５時間処理
して、消化した。沸騰水中で５分間処理して反応を停止
し、遠心分離（１２，０００×ｇ，１０分間）で不溶物
を除去した後、上清２００μｌをＯＤＳカラム（TSK ge
l ODS 80Ts, φ4.6mm×300mm;東ソー社製）に注入し
た。アセトニトリルの０→６０％／６０分、次いで６０
→１００％／２０分間の２段階濃度勾配法で溶出分画
（１ml／画分）したところ、３５０nmに吸収を存する画
分が３つ得られた（画分５５，６４，７３）。これらの
画分について、５００μｌをＰｒｏ Ｓｏｒｂフィルタ
ーにブロッティングしてＡＢＩ社の６７４型プロテイン
・シークエンサーでＮ−末端アミノ酸配列を決定した。
その結果、画分５５と７３からは明瞭なアミノ酸配列が
読み取ることができなかったが、これからは、トリニト
ロフェニル化されたＬｙｓ残基がＮ−末端に存在してい
ることが予想された。一方、画分６４からはＡｓｎ−Ｇ
ｌｎ−Ｘ−Ｐｒｏのアミノ酸配列が認められた。このＸ
がトリニトロフェニル化Ｌｙｓ残基とすると、これは４
１位Ｌｙｓ残基である。この様に、４１位のＬｙｓ残基
は、トリニトロベンゼンスルホン酸により、トリニトロ
フェニル化されているにもかかわらず、表７に示した様
にこの位置でのＡｌａへの置換による比活性の低下が全
く認められないのであるから、本発明において、この位
置のＬｙｓは触媒に関与していないと結論した。

【００７６】一方、図９のアミノ酸配列中、１３２位の
Ａｒｇ残基が他の比較した酵素のアミノ酸配列の相当位
置のＡｒｇ残基と完全に相同性が認められる。このこと
は、Ｌｙｓと同じ塩基性アミノ酸であるＡｒｇも、本発
明の酵素の触媒に直接関係している可能性があった。

【００７７】

【表８】 変異酵素の酵素活性（III） 変異酵素 精製酵素の比活性（Ｕ／mgタンパク） Ａｒｇ１３２Ａｌａ ＜１ 実施例７のペクチン酸リアーゼ（対照） ２３７

【００７８】事実、図６と表８で示されるように、１３
２位のＡｒｇをたとえばＡｌａに置換すると、驚いたこ
とに、変異酵素は、ほとんど活性を失なう。従って、上
述のＬｙｓ同様、この位置のＡｒｇが触媒機能発現のた
めに必須の残基と考えざるを得ない。そこで、アルギニ
ン修飾剤である２，３−ブタンジオンを実施例１３の方
法に従って、未変異ペクチン酸リアーゼに加えて、その
影響を調べた。すなわち、両酵素を０．１M ホウ酸緩衝
液（pH９．５）中で２mMの２，３−ブタンジオンを加え
て、３０℃で３０分間保持して、残存活性を測定したと
ころ、両酵素とも約４０％以上の阻害を受けることが判
明した。この結果は、同じ塩基性アミノ酸残基の１０７
位と１２９位のＬｙｓ残基が、Ａｒｇ又はＨｉｓでも良
い可能性を想起する。また、１３２位のＡｒｇ残基を他
の塩基性アミノ酸残基に代えても活性を保持可能性あ
る。そこで、これらのＬｙｓ残基とＡｒｇ残基を以下の
変異プライマーを用いて、それぞれの位置に他の塩基性
アミノ酸残基で置換した変異酵素を、前述の方法で発現
させた後、完全精製した。

【００７９】 Ｌｙｓ１０７Ａｒｇ ５′ＡＡＧＧＣＧＴＡＴＧＡＣＡＧＡＧＴＧＴＴＣＣＡ ＡＡＴＣ３′ Ｌｙｓ１０７Ｈｉｓ ５′ＡＡＧＧＣＧＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＴＣＣＡ ＡＡＴＣ３′ Ｌｙｓ１２９Ａｒｇ ５′ＧＡＴＧＡＣＡＴＣＧＧＧＡＧＡＣＴＧＧＴＴＣＧ ＧＣＡＧ３′ Ｌｙｓ１２９Ｈｉｓ ５′ＧＡＴＧＡＣＡＴＣＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＴＴＣＧ ＧＣＡＧ３′ Ａｒｇ１３２Ｌｙｓ ５′ＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＴＴＡＡＧＣＡＧＡＡＣＧＧ ＡＧＧＣ３′ Ａｒｇ１３２Ｈｉｓ ５′ＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＣＣＡＧＡＡＣＧＧ ＡＧＧＣ３′

【００８０】その結果、少なくとも１０７位と１２９位
のＬｙｓ残基は、ＡｒｇとＨｉｓに置換すると、ほとん
ど活性を失ない、また１３２位のＡｒｇ残基をＬｙｓに
置換するともはや活性は認められないことが判明した。

【００８１】

【表９】 変異酵素の酵素活性（IV） 変異酵素 精製酵素の比活性（Ｕ／mgタンパク） Ｌｙｓ１０７Ａｒｇ ＜１ Ｌｙｓ１０７Ｈｉｓ ＜１ Ｌｙｓ１２９Ａｒｇ ＜１ Ｌｙｓ１２９Ｈｉｓ ＜１ Ａｒｇ１３２Ｌｙｓ ＜１ Ａｒｇ１３２Ｈｉｓ ＜１ 実施例８のペクチン酸リアーゼ（ｒＰＡＬ；対照）２３７

【００８２】従って、少なくとも１０７位と１２９位の
Ｌｙｓ残基及び１３２位のＡｒｇ残基は、他のアミノ酸
に置き換えが不可能であり、それぞれＬｙｓ、Ｌｙｓ及
びＡｒｇ残基が特異的に活性発現に関与すると言える。

【００８３】一方、Ｔｒｐ残基は配列番号１中には一個
しか存在せず、ＰｅｌＡ〜ＰｅｌＤとの相同性との比較
においてよく保存されている（図９）。最近、種々の酵
素で、Ｔｒｐ残基が触媒部位や基質結合部位にあって、
何らかの機構により、活性発現に必要であることが示さ
れている（例えば、Kawaminami et al., J. Biol. Che
m., 269, 28752-28756, 1994;Ara et al., Biosci. Bio
tech. Biochem., 56, 62-65, 1992など）。事実、本発
明の酵素も、特異的トリプトファン酸化剤であるＮ−ブ
ロモスクシミドを処理すると大幅に阻害される。そこで
当該Ｔｒｐ残基（７８位）を下記のプライマーを用い
て、Ａｌａ、Ｐｈｅ及びＴｙｒ残基に置換した。

【００８４】 Ｔｒｐ７８Ａｌａ ５′ＡＡＴＧＴＣＡＴＣＧＣＧＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＴ ３′ Ｔｒｐ７８Ｐｈｅ ５′ＡＡＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＴ ３′ Ｔｒｐ７８Ｔｙｒ ５′ＡＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＴ ３′

【００８５】その結果、変異タンパクはＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで均一に精製されるが（図６）、表１０に示したよう
にＴｒｐ残基をＡｌａ残基に置換すると完全に活性を失
なうが、Ｐｈｅ残基又はＴｙｒ残基に置換すると天然型
酵素に匹敵する酵素活性を維持していることが判明し
た。他のアミノ酸では活性を有さないことから、７８位
のアミノ酸残基には芳香族アミノ酸が必要であることを
示している。

【００８６】

【表１０】 変異酵素の酵素活性（Ｖ） 変異酵素 精製酵素の比活性（Ｕ／mgタンパク） Ｔｒｐ７８Ａｌａ ＜１ Ｔｒｐ７８Ｐｈｅ ２１３ Ｔｒｐ７８Ｔｙｒ ２２５ 実施例８のペクチン酸リアーゼ（ｒＰＡＬ；対照）２３０

【００８７】さらに、本発明酵素のアミノ酸配列の比較
図（図９）で、１２０位にＡｒｇ残基がＰｅｌＡ〜Ｐｅ
ｌＤに相異して特徴的に存在する。本アミノ酸残基が他
の塩基性アミノ酸と置換可能か否かは非常に興味深い。
そこで以下の変異プライマーを作製し、前述の方法で変
異タンパクの完全精製品を調製した。

【００８８】 Ａｒｇ１２０Ｌｙｓ ５′ＧＣＡＧＣＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡ ＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＣＣ３′

【００８９】その結果を図６と表１１に示したが、１０
７位と１２９位のＬｙｓ残基、１３２位のＡｒｇ残基と
は異なり、１２０位のＡｒｇ残基は少なくともＬｙｓ残
基に置換しても同等の活性を有していた。

【００９０】

【表１１】 変異酵素の酵素活性（VI） 変異酵素 精製酵素の比活性（Ｕ／mgタンパク） Ａｒｇ１２０Ｌｙｓ ２１６ 実施例８のペクチン酸リアーゼ（ｒＰＡＬ；対照）２２１

【００９１】以上の結果から、本発明ペクチン酸リアー
ゼは、そのアミノ酸配列中、１０７位Ｌｙｓ残基、１２
９位Ｌｙｓ残基及び１３２位Ａｒｇ残基がその酵素活性
発現に強く関与しており、この位置を保存するように変
異させることが望ましい。

【００９２】

【発明の効果】本発明によれば、アルカリ側に最適反応
pHを有する、全く新しいペクチン酸リアーゼ、その遺伝
子及びその製造法が提供される。この酵素は、プロトペ
クチンに対しても作用し、洗浄剤、食品加工剤、繊維処
理剤として有用である。

【００９３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５９１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：バチルス エスピー（Bacillus sp.） 株名：ＫＳＭ−Ｐ１５ 配列 GCG CCG ACG GTC GTT CAT GAA ACG ATT CGT GTG CCT GCC GGT CAG ACG 48 Ala Pro Thr Val Val His Glu Thr Ile Arg Val Pro Ala Gly Gln Thr 5 10 15 TTT GAC GGA AAA GGG CAG ACC TAT GTG GCT AAT CCG AAT ACA TTG GGG 96 Phe Asp Gly Lys Gly Gln Thr Tyr Val Ala Asn Pro Asn Thr Leu Gly 20 25 30 GAC GGA TCG CAG GCG GAG AAT CAG AAG CCG ATC TTT CGT CTG GAG GCT 144 Asp Gly Ser Gln Ala Glu Asn Gln Lys Pro Ile Phe Arg Leu Glu Ala 35 40 45 GGG GCA AGC CTG AAA AAT GTA GTG ATT GGC GCT CCT GCC GCT GAC GGG 192 Gly Ala Ser Leu Lys Asn Val Val Ile Gly Ala Pro Ala Ala Asp Gly 50 55 60 GTG CAC TGC TAC GGG GAT TGT ACG ATT ACA AAT GTC ATC TGG GAG GAT 240 Val His Cys Tyr Gly Asp Cys Thr Ile Thr Asn Val Ile Trp Glu Asp 65 70 75 80 GTT GGT GAG GAT GCG CTG ACG CTT AAA TCG TCC GGA ACG GTG AAC ATC 288 Val Gly Glu Asp Ala Leu Thr Leu Lys Ser Ser Gly Thr Val Asn Ile 85 90 95 TCG GGC GGG GCA GCC TAC AAG GCG TAT GAC AAG GTG TTC CAA ATC AAT 336 Ser Gly Gly Ala Ala Tyr Lys Ala Tyr Asp Lys Val Phe Gln Ile Asn 100 105 110 GCA GCG GGG ACG ATC AAC ATT CGT AAC TTC AGG GCC GAT GAC ATC GGG 384 Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ile Arg Asn Phe Arg Ala Asp Asp Ile Gly 115 120 125 AAG CTG GTT CGG CAG AAC GGA GGC ACC ACC TAC AAA GTG GTG ATG AAC 432 Lys Leu Val Arg Gln Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Lys Val Val Met Asn 130 135 140 GTG GAA AAC TGC AAC ATT TCC AGA GTG AAG GAT GCG ATC CTG AGA ACG 480 Val Glu Asn Cys Asn Ile Ser Arg Val Lys Asp Ala Ile Leu Arg Thr 145 150 155 160 GAC AGC AGC ACA AGC ACA GGA CGA ATT GTG AAT ACC CGC TAT TCT AAC 528 Asp Ser Ser Thr Ser Thr Gly Arg Ile Val Asn Thr Arg Tyr Ser Asn 165 170 175 GTG CCA ACA TTG TTC AAA GGC TTT AAA TCA GGC AAT ACC ACC GCA TCC 576 Val Pro Thr Leu Phe Lys Gly Phe Lys Ser Gly Asn Thr Thr Ala Ser 180 185 190 GGA AAT ACG CAG TAT 591 Gly Asn Thr Gln Tyr 195

【図面の簡単な説明】

【図１】ペクチン酸リアーゼ遺伝子クローニング用プラ
イマー１及び２のＤＮＡ配列を示す図である。

【図２】プライマー１とプライマー２の間のＤＮＡ配列
と推定アミノ酸配列及びプライマー３とプライマー４の
位置を示す図である。

【図３】本発明ペクチン酸リアーゼ全領域を増幅するた
めのプライマー５とプライマー６を示す図である。実施
例５で示したＰＣＲ増幅用プライマーで、生成する増幅
断片（約１kbp）はＳａｌＩで消化された後、ＳａｌＩ
とＳｍａＩで消化されたｐＨＳＰ６４に連結される。

【図４】ペクチン酸リアーゼ（ＢＰＡＬ）遺伝子の分泌
ベクター（ｐＨＳＰ６４）への導入と創製されたペクチ
ン酸リアーゼ発現分泌ベクターｐＨＳＰ−Ａ１５６を示
す図である。 Ａｍｐ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子 Ｔｅｔ：テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子

【図５】本発明ペクチン酸リアーゼである、ＢＰＡＬ
（実施例３）とｒＰＡＬ（実施例８）の完全精製標品の
pH−活性曲線を示す。５０mM グリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液で最大活性を示すpH約１０．５の値をそれぞ
れ１００％として、相対活性を表示した。 −○−：ｒＰＡＬ、・・・●・・・：ＢＰＡＬ

【図６】本発明ペクチン酸リアーゼと各種変異ペクチン
酸リアーゼの完全精製標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を
示す。それぞれの酵素のタンパクバンドの横にある矢印
は、分子量測定用に用いた標準タンパクの分子量を示し
ている。各レーンの酵素は次の通り。１：実施例３のＢ
ＰＡＬ、２：実施例８のｒＰＡＬ、３：Ｃｙｓ６７Ａｌ
ａ、４：Ｃｙｓ７１Ａｌａ、５：Ｔｒｐ７８Ａｌａ、
６：Ａｒｇ１２０Ｌｙｓ、７：Ｌｙｓ４１Ａｌａ、８：
Ｌｙｓ８９Ａｌａ、９：Ｌｙｓ１０７Ａｌａ、１０：Ｌ
ｙｓ１２９Ａｌａ、１１：Ａｒｇ１３２Ａｌａ

【図７】本発明ペクチン酸リアーゼ（ＢＰＡＬ（実施例
３）とｒＰＡＬ（実施例８））による木綿からのペクチ
ン遊離活性のpH依存性（ブリットン−ロビンソン緩衝液
中）を示す。それぞれの酵素を４０mMの各pHに設定した
ブリットン−ロビンソン緩衝液中で木綿に反応させた。
ＢＰＡＬとｒＰＡＬのプロトペクチナーゼ活性は最適pH
が約１０であり、これを１００％として相対活性で表示
している。 −○−：ＢＰＡＬ、−●−：ｒＰＡＬ

【図８】本発明ペクチン酸リアーゼ（ＢＰＡＬ（実施例
３）とｒＰＡＬ（実施例８））による木綿からのペクチ
ン遊離活性のpH依存性（グリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液中）を示す。図７と同じ条件で、０．１M グリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液中で反応させ、両酵素の最適
pH９．５の活性を１００％として表示している。 −○−：ＢＰＡＬ、−●−：ｒＰＡＬ

【図９】本発明ペクチン酸リアーゼと他の酵素のアミノ
酸配列の相同性を示す図である。アミノ酸番号は、配列
番号１の３６から１３２を基準として、他のアミノ酸配
列と相同性を合わせた。＊印は５種の酵素で保存されて
いるアミノ酸残基を示す。 ＢＰＡＬ：本発明のペクチン酸リアーゼ ＰｅｌＡ：Fusarium solani f. sp. pisi由来のペクチ
ン酸リアーゼＡ ＰｅｌＢ：Fusarium solani f. sp. pisi由来のペクチ
ン酸リアーゼＢ ＰｅｌＣ：Fusarium solani f. sp. pisi由来のペクチ
ン酸リアーゼＣ ＰｅｌＤ：Fusarium solani f. sp. pisi由来のペクチ
ン酸リアーゼＤ

【図１０】本発明ペクチン酸リアーゼと他の酵素との相
同性の比較に用いた部分アミノ酸配列を示す図である。

【図１１】本発明ペクチン酸リアーゼ（ＢＰＡＬ）とＰ
ｅｌＡのアミノ酸配列のマッキシマムマッチングによる
アミノ酸配列の相同性を示す図である。ＰＡＬのアミノ
酸番号１は、成熱酵素のＮ−末端アミノ酸Ａｌａ残基か
ら数える。ＰｅｌＡはオープン・リーディングフレーム
のＮ−末端Ｍｅｔ残基を１としている。＊は相同部位を
示し、縦の破線はコンピューターが計算した相同領域を
示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１１Ｄ 7/42 Ｃ１１Ｄ 7/42 Ｃ１２Ｓ 11/00 Ｃ１２Ｓ 11/00 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 凉松 淳 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 伊藤 進 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示すアミノ酸配列又は該ア
   ミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換
   若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペクチン酸リ
   アーゼ。
2. 【請求項２】 アミノ酸の欠失、置換若しくは付加が、
   配列番号１中１０７位リジン、１２９位リジン及び１３
   ２位アルギニンを保存するようになされたものである請
   求項１記載のペクチン酸リアーゼ。
3. 【請求項３】 配列番号１中アミノ酸番号３６〜１３２
   の間で５５．７％以上の相同性を有するものである請求
   項１又は２記載のペクチン酸リアーゼ。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項記載のペク
   チン酸リアーゼをコードする遺伝子。
5. 【請求項５】 配列番号１に示す塩基配列又は該塩基配
   列の１若しくは２以上の塩基が欠失、置換若しくは付加
   された塩基配列を有するものである請求項４記載の遺伝
   子。
6. 【請求項６】 請求項４又は５記載の遺伝子を含有する
   組換えベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
8. 【請求項８】 宿主が、微生物である請求項７記載の形
   質転換体。
9. 【請求項９】 請求項６又は７記載の形質転換体を培養
   し、培養物からペクチン酸リアーゼを採取することを特
   徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載のペクチン酸
   リアーゼの製造法。