JP4789540B2 - 大腸菌群の汚染源特定方法及びその検出に使用する大腸菌群検出用培地セット - Google Patents

Description

本発明は、食品中より大腸菌群が検出された場合、どの箇所から大腸菌群に汚染されたのかを特定するための汚染源の特定方法及びその検出に使用する大腸菌群検出用培地セットに関する。

従来より、食品中より大腸菌群が検出された場合、その食品が製造された工場での原材料、水、各種装置、大気、人、動物・昆虫類、床等の構築物、その他のどの箇所が汚染源となったのかを特定し、該汚染源における大腸菌群を根絶している。そのためにはまず検出された大腸菌群がどの汚染源に由来するものであるかを特定するため、製造過程中で汚染源となる可能性のある全ての箇所で大腸菌群を検査し、大腸菌群の検出の有無から汚染源の推定を行なっていた。そして、当該箇所を清浄化し汚染源を除去した後の製品中から大腸菌群が根絶するまで、これらの検査、清浄化を繰り返していた。

また、加工食品に混入した雑菌の汚染源を特定するため、食品から検出された乳酸菌と製造工程中から分離された乳酸菌のＤＮＡを比較分析する手法も行なわれている。
特開２００２−１０１８８３号公報

上記のように、大腸菌群は食品製造工程における様々な箇所を汚染源とするもので、食品より新たに大腸菌群が検出された時点で汚染源となり得る可能性のある全ての箇所において大腸菌群の菌類の調査を行なうことは早急に汚染源を特定することが要求される検査にもかかわらず多くの時間と労力を必要としていた。また、菌類のＤＮＡの特徴を比較して検査を行なうには高価な設備と専門の技術を必要とし、食品工場にそれらの設備や人材を整えることは経済的ではなかった。

本発明は上記欠点を解決したもので、簡単な手段により早期に大腸菌群による汚染源を特定することを可能としたものである。本発明の特徴は、食品工場の大腸菌群の汚染源となる原材料、水、各種装置、大気、人、動物・昆虫類、床等の構築物、その他の各箇所より採取した大腸菌群を選択培地により分類した構成を、該箇所と関連付けてデータベース化し、他方、当該食品工場の食品より新たに検出された大腸菌群を上記培地によりその構成を分類し、予め各箇所毎にデータベース化されている大腸菌群の構成と新たに検出された大腸菌群の構成とを比較し、両構成が同一或いは所定の誤差範囲内の場合、当該箇所を汚染源とする大腸菌群の汚染源特定方法である。

また、本発明の特徴は、食品工場の大腸菌群の汚染源となる原材料、水、各種装置、大気、人、動物・昆虫類、床等の構築物、その他の各箇所より採取した大腸菌群を選択培地により分類した構成を、該箇所と関連付けて数値化或いは図形化したデータベースをコンピュータに記憶させ、他方、当該食品工場の食品中より新たに検出された大腸菌群を上記培地によりその構成を分類し、その特徴を数値化或いは図形化したデータをコンピュータに入力し、両データをコンピュータにより照合し、予め各箇所毎にデータベースにより記憶されている大腸菌群の構成と新たに検出された大腸菌群の構成とが同一或いは所定の誤差範囲内の場合、当該箇所を汚染源として出力する大腸菌群の汚染源特定方法である。

更に、上記に使用する培地として、重量でＤ−ラクトース（ＬＡＣ）０．１〜５．０％に糖類を含まない基礎培地のパープルブロースベース（ＰＢＢ）１．０〜４．０％と寒天１．０〜３．０％を加えたＬＡＣ基礎培地、
Ｄ−アラビノース（ＤＡＲＡ）０．１〜５．０％と、基礎培地のパープルブロースベース（ＰＢＢ）１．０〜４．０％と、寒天１．０〜３．０％を加えたＤＡＲＡ基礎培地、
Ｄ−アラビトール（ＤＡＲＬ）０．１〜５．０％と該基礎培地１．０〜４．０％と、寒天１．０〜３．０％とを加えたＤＡＲＬ基礎培地、
ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地にセフェム系抗生物質セファゾリン（ＣＥＺ）０．００１〜０．０１％を加えたＬＡＣ−ＣＥＺ培地、ＤＡＲＡ−ＣＥＺ培地及びＤＡＲＬ−ＣＥＺ培地、
ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地にペニシリン系抗生物質アンピシリン（ＡＢＰＣ）０．００１〜０．０１％を加えたＬＡＣ−ＡＢＰＣ培地、ＤＡＲＡ−ＡＢＰＣ培地及びＤＡＲＬ−ＡＢＰＣ培地、
ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地に大腸菌群構成菌に対して選択的な生育阻害能を有する他の抗生物質を加えた選択培地、
ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地に食塩０．５〜６．０％を加えたＬＡＣ食塩培地、ＤＡＲＡ食塩培地及びＤＡＲＬ食塩培地、
ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地に高級アルコール類、界面活性剤等の有機物、重金属を加えた選択培地、
から選択された複数の培地をセットとした大腸菌群の汚染源特定に使用する大腸菌群検出用培地セットを特徴とする。
なお、基礎培地に用いたパープルブロースベース（ＰＢＢ）の組成は、ゼラチン消化物（１０ｇ／Ｌ）、食塩（５ｇ／Ｌ）及びｐＨ指示薬ブロムクレゾールパープル（２０ｍｇ／Ｌ）であり、酸生成によるｐＨ変化により紫色から黄色に変化するものである。

本発明の大腸菌群の汚染源特定方法によれば、食品中より大腸菌群が検出された場合、予め作成された食品製造ラインの各箇所の大腸菌群の特徴を示すデータベースとのみ照合することで汚染源を高確率で早期に特定することができるので、慌てて各種検査を始める必要がなく、新たに検出された大腸菌群の構成の特定のみの検査で汚染源を除去し、安全な食品の生産を再開するまでの時間及び労力を大幅に削減することが可能となった。

また、予め各箇所における大腸菌群の特徴を数値化或いは図形化してデータベースとしてコンピュータに記憶させ、他方、食品中より検出された大腸菌群を培地によりその特徴を数値化し或いは図形化したデータをコンピュータに入力し、両データをコンピュータにより比較することにより人の判断のみに頼ることなく自動的に汚染源を特定することが可能となった。

更に、上記比較の手段として使用する培地をその食品工場から発生する確率が高い各箇所特有の大腸菌群の構成を検出でき、且つ一般的な大腸菌群が検出できる材料によりその組成を特定して培地セットとしたので効率よく大腸菌群の判別が可能となった。

大腸菌群として確認されているものは数十種類にも及んでいるが、その大腸菌群には様々な特徴があり、発生源となる環境によって異なっている。食品中より大腸菌群が検出された場合、検出された大腸菌群がどの汚染源に由来するものであるかを特定するため、製造過程中で汚染源となる可能性のある全ての箇所で大腸菌群を検査し、大腸菌群の検出の有無から汚染源の推定を行なっていた。そして、当該箇所を清浄化し汚染源を除去した後の製品中から大腸菌群が根絶するまで、これらの検査、清浄化を繰り返し行なっている。

食品より大腸菌群が検出された場合、図１に示すように、その汚染源となり得る食品製造工程における食品の原材料、使用している水や汚水、各種装置、工場内の大気、作業員、動物・昆虫類、床等の構築物、その他の各箇所のいずれかが汚染源であるのかを早急に特定しなければならない。

そこで本実施例では、事前に上記食品工場の各箇所から検体を採取し、それらから大腸菌群が発見された場合、該大腸菌群を検査し、その構成の特徴を図２に示すようにいくつかの要素に分析して特定する。大腸菌群には多くの種類が存在するが、その主たるものは数種類に限定することができ、且つ汚染源による特徴もあり、その特徴を各箇所毎に予め把握しておくことは可能である。

上記事前の検査により、食品工場から検出した大腸菌群を本発明の培地を使用した検査方法によりその大腸菌群の特徴を原材料、水、各種装置、大気、作業員、動物・昆虫類、床等の構築物、その他のいずれかに分けて把握し、且つそれらと大腸菌群の構成の特徴とを予め関連付けてデータベース化しておくことができる。

また、上記各箇所より大腸菌群を事前に検出することができなかった場合においては、汚染源による特徴或いは当該食品工場が稼働した結果、食品から大腸菌群が検出され、それらを検査により汚染源が特定された場合、該箇所と大腸菌群の構成とを関連付けてデータベース化しておき、それらを蓄積しておくことができる。

他方、食品検査によって新たに大腸菌群が発見された場合、該大腸菌群を下記する特定の培地に接種する。接種した一定の時間（１２〜２４時間）後、該培地に生じたコロニーの発生を検査する。大腸菌群は食品工場内が汚染源なので、上記した予め検査し、データベース化されているいずれかの箇所の大腸菌群の構造特性と同一か或いは類似した特性を有することになる。従って、上記蓄積された大腸菌群のデータベースと、今回検出された大腸菌群の構造とを比較することによりその汚染源を突きとめることが可能となる。仮に、新たに検出された大腸菌群の特徴が図３に示す構造の場合、事前に検査されデータベース化されていた汚水とほぼ同一の構造を有していることになり、その汚染源が汚水であることが特定できるものである。

上記により、食品から新たに検出された大腸菌群の特徴を把握し、その汚染源を特定すべく各箇所から検体を採取して大腸菌群を探し当て、且つその検査をし、新たに検出されたものと比較をするという作業を繰り返し行なうことなく、大腸菌群の汚染源を早期に特定することが可能となった。

上記汚染源の特定をコンピュータにより自動的に行なうことも可能である。特定した培地により食品工場における各箇所の大腸菌群の特徴を予め把握し、それを各箇所と関連付けて数値化或いは図形化してデータベースとしてコンピュータに記憶させる。次に、食品から新たに検出した大腸菌群を上記培地に各々接種し、各培地におけるコロニーの数量等よりその特徴を読み取り、それを数値化或いは図形化してコンピュータに入力する。更に、上記予め記憶されているデータベースの大腸菌群の構造の特徴と新たに発見された大腸菌群の構造の特徴とを比較し、その類似度をコンピュータが判定する。

同一であればその箇所を汚染源とすることができるし、その構造比較の結果、所定の範囲内の誤差であれば、例えば±２０％〜±３０％以内、その汚染源が当該箇所であることを特定することが可能である。上記判定により大腸菌群の汚染源を自動的に特定することが可能であり、作業員の判定ミスを防ぐことができる。

上記大腸菌群の汚染源特定方法を下記する具体的な培地により実験した。
下記の組成の培地セットを製造した。
重量でＤ−ラクトース（ＬＡＣ）０．１〜５．０％に糖類を含まない基礎培地のパープルブロースベース（ＰＢＢ）１．０〜４．０％と寒天１．０〜３．０％を加えたＬＡＣ基礎培地、
Ｄ−アラビノース（ＤＡＲＡ）０．１〜５．０％と、基礎培地のパープルブロースベース（ＰＢＢ）１．０〜４．０％と、寒天１．０〜３．０％を加えたＤＡＲＡ基礎培地、
Ｄ−アラビトール（ＤＡＲＬ）０．１〜５．０％と該基礎培地１．０〜４．０％と、寒天１．０〜３．０％とを加えたＤＡＲＬ基礎培地、
ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地にセフェム系抗生物質セファゾリン（ＣＥＺ）０．００１〜０．０１％を加えたＬＡＣ−ＣＥＺ培地、ＤＡＲＡ−ＣＥＺ培地及びＤＡＲＬ−ＣＥＺ培地、
ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地にペニシリン系抗生物質アンピシリン（ＡＢＰＣ）０．００１〜０．０１％を加えたＬＡＣ−ＡＢＰＣ培地、ＤＡＲＡ−ＡＢＰＣ培地及びＤＡＲＬ−ＡＢＰＣ培地、
ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地に大腸菌群構成菌に対して選択的な生育阻害能を有する他の抗生物質を加えた選択培地、
ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地に食塩０．５〜６．０％を加えたＬＡＣ食塩培地、ＤＡＲＡ食塩培地及びＤＡＲＬ食塩培地、
ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地に高級アルコール類、界面活性剤等の有機物、重金属を加えた選択培地、
から選択された複数の培地セット。

食品中の大腸菌群検査の結果、ＸＭ−Ｇ培地上に生育したコロニーをＤＡＲＬ基礎培地、ＬＡＣ食塩培地及びＤＡＲＬ食塩培地の３種の選択培地にレプリカ法により転写して、１２〜２４時間、３７℃で培養し、各培地に生育した黄色のコロニー数を計数することで大腸菌群を４種のタイプに分類し、構成を調べることができる。
タイプ１はＤＡＲＬ食塩培地に生育するコロニー数であり、Ｄ−アラビトールを資化することができ、且つ食塩耐性を有する分類である。
タイプ２はＤＡＲＬ基礎培地に生育するコロニー数からタイプ１のコロニー数を除いたものであり、Ｄ−アラビトールを資化することはできるが、食塩耐性を有しない分類である。
タイプ３はＬＡＣ食塩培地に生育するコロニー数からタイプ１のコロニー数を除いたものであり、Ｄ−アラビトールを資化できず、食塩耐性を有する分類である。
タイプ４はＸＭ−Ｇ培地上の全コロニーからタイプ１、タイプ２及びタイプ３の合計を除いたもので、Ｄ−アラビトールを資化することはできるが、食塩耐性を有しない分類である。

即ち、ＤＡＲＬ食塩培地にはタイプ１のみが生育し、ＤＡＲＬ基礎培地にはタイプ１とタイプ２が生育する。また、ＬＡＣ食塩培地にはタイプ１とタイプ３が生育する。
これらの３種の培地を用いて食品製造工程中の汚染源各所の大腸菌群を４種に区分し、その構成割合を調べることができる。以下にデータベースの一部を示す。

異なる工場で生産された２種類の加工食品Ａ及び加工食品Ｂから検出された大腸菌群を上記分類手法により分析した結果は以下の通りであった。

これらの大腸菌群の構成から汚染源を推定することができる。加工食品Ａの大腸菌群の構成は比較的分散し、タイプ１がやや多い構成であり、データベースの中では成形加工機（乾）に近い構成である。従って、加工食品Ａの大腸菌群の汚染源は、比較的乾いた状態で用いられる成形加工機と推定できる。加工食品Ｂの大腸菌群はタイプ４のみの特異な構成であり、これは野菜洗浄場床と一致した。このように食品工場では環境の違いにより大腸菌群の構成が異なり、加工食品中の大腸菌群は汚染箇所の大腸菌群の構成を反映していることがわかり、汚染源の特定が可能であった。これらの汚染源を清浄化し、或いは汚染源からの大腸菌群の持ち込みを防止することにより、加工食品Ａ及び加工食品Ｂでは、大腸菌群の検出を完全になくすことができた。

食品製造工場における汚染源を示す図。 汚染源の大腸菌群の特徴を示す図。 培地によって検出された大腸菌群の特徴を示す図。

Claims (3)

1. 食品工場の大腸菌群の汚染源となる原材料、水、各種装置、大気、人、動物・昆虫類、床等の構築物、その他の各箇所より採取した大腸菌群を選択培地により分類した構成を、該箇所と関連付けてデータベース化し、他方、当該食品工場の食品より新たに検出された大腸菌群を上記培地によりその構成を分類し、予め各箇所毎にデータベース化されている大腸菌群の構成と新たに検出された大腸菌群の構成とを比較し、両構成が同一或いは所定の誤差範囲内の場合、当該箇所を汚染源とすることを特徴とする大腸菌群の汚染源特定方法。
2. 食品工場の大腸菌群の汚染源となる原材料、水、各種装置、大気、人、動物・昆虫類、床等の構築物、その他の各箇所より採取した大腸菌群を選択培地により分類した構成を、該箇所と関連付けて数値化或いは図形化したデータベースをコンピュータに記憶させ、他方、当該食品工場の食品中より新たに検出された大腸菌群を上記培地によりその構成を分類し、その特徴を数値化或いは図形化したデータをコンピュータに入力し、両データをコンピュータにより照合し、予め各箇所毎にデータベースにより記憶されている大腸菌群の構成と新たに検出された大腸菌群の構成とが同一或いは所定の誤差範囲内の場合、当該箇所を汚染源として出力することを特徴とする大腸菌群の汚染源特定方法。
3. 重量でＤ−ラクトース（ＬＡＣ）０．１〜５．０％に糖類を含まない基礎培地のパープルブロースベース（ＰＢＢ）１．０〜４．０％と寒天１．０〜３．０％を加えたＬＡＣ基礎培地、
   Ｄ−アラビノース（ＤＡＲＡ）０．１〜５．０％と、基礎培地のパープルブロースベース（ＰＢＢ）１．０〜４．０％と、寒天１．０〜３．０％を加えたＤＡＲＡ基礎培地、
   Ｄ−アラビトール（ＤＡＲＬ）０．１〜５．０％と該基礎培地１．０〜４．０％と、寒天１．０〜３．０％とを加えたＤＡＲＬ基礎培地、
   ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地にセフェム系抗生物質セファゾリン（ＣＥＺ）０．００１〜０．０１％を加えたＬＡＣ−ＣＥＺ培地、ＤＡＲＡ−ＣＥＺ培地及びＤＡＲＬ−ＣＥＺ培地、
   ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地にペニシリン系抗生物質アンピシリン（ＡＢＰＣ）０．００１〜０．０１％を加えたＬＡＣ−ＡＢＰＣ培地、ＤＡＲＡ−ＡＢＰＣ培地及びＤＡＲＬ−ＡＢＰＣ培地、
   ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地に大腸菌群構成菌に対して選択的な生育阻害能を有する他の抗生物質を加えた選択培地、
   ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地に食塩０．５〜６．０％を加えたＬＡＣ食塩培地、ＤＡＲＡ食塩培地及びＤＡＲＬ食塩培地、
   ＬＡＣ基礎培地、ＤＡＲＡ基礎培地及びＤＡＲＬ基礎培地に高級アルコール類、界面活性剤等の有機物、重金属を加えた選択培地、
   から選択された複数の培地をセットとしたことを特徴とする請求項１又は２に記載の大腸菌群の汚染源特定に使用する大腸菌群検出用培地セット。