CN104520715B - 质谱微生物鉴定过程中对混合物的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过计算样本质谱和质谱库中参考质谱的相似度来鉴定样本中的微生物；特别涉及微生物混合物的检测。如果不存在近缘关系的多个微生物物种位于包含最相似参考质谱的分值列表中，则很有可能存在微生物混合物。提出的方法可(1)通过关系列表来操作，(2)确定分值列表中不同微生物物种参考质谱间的相似度，或(3)始终按照文件DE 10 2009 007 266 A1，通过生成组合质谱，借助分值列表进行混合物分析，并仅向后检查组合质谱的相似度从而检查相关微生物株系间的关系。

Description

质谱微生物鉴定过程中对混合物的检测
技术领域
本发明涉及通过计算样本质谱和质谱库中参考质谱的相似度来鉴定样本中的微生物；特别涉及微生物混合物的检测。
背景技术
日常快速无误的多微生物样本鉴定在临床和临床外感染诊断、在医院或用于游泳的河流或湖泊的卫生监测、食品分析、生物技术工艺监测和控制以及微生物研究中发挥重要作用。这里的“微生物种”可简称为“微生物”，通常是用显微镜看见的小生物体，例如单细胞真菌(例如酵母)、藻类或原生动物(例如引起疟疾的疟原虫)。但是，此处的鉴定主要针对细菌。
微生物鉴定主要是指确定其种类从而将微生物分入分类体系，其中包括最高级别、域(细菌、古细菌和真核生物)，一直到目、科、属和种。
最初将微生物种分类为种的方式是采用主要通过生物化学反应的生物分类方法。这在许多情况下都不够准确，并且经常不能按照统一基因关系进行分类。将各个种区分开的传统生物学定义对于相同种的成员间的有性繁殖能力是没有限制的，而在不同种的成员间是有限制的。这一定义自然不适用于微生物，因此对物种的分类通常比较武断。分子生物学的现代方法将许多物种纠正划分为属、科甚至目，将许多物种组合，并定义了新的物种。对于细菌，则在物种之下进一步引入了分类学中的纲或亚种。而且，医学和细胞生物学领域的研究又纳入了血清变型或血清型，可按照细胞膜附着行为的不同类型加以区分，但并不构成一个单独物种或亚种。
众多新定义以及将物种重新划分为属和科，产生了同样多的新微生物名称，但这在日常实践中尚未被人们普遍接受。因此，微生物之间的关系程度并非始终都能够通过常用(有时比较陈旧)的名称来辨别。关于重新划分的某些发现物和更正确的关系结构还未被普遍接受。确定这些关系需要知识渊博的专家。
与传统的微生物鉴定相比，新的分子生物学鉴定法多年来已经为人们所熟知。例如，这些方法可基于通过聚合酶链式反应(PCR)或微生物特定分子细胞成分的质谱检测来放大特定基因片段，之后再进行DNA或RNA序列分析。在针对性(真阴性率)、灵敏度(真阳性率)、其他错误率和分析速度方面，这些新方法远远优于传统方法。
按照本文中的定义，通过质谱测量鉴定微生物样本通常需要确定物种，实际上由此物种的名称来表示，这在微生物实验室或临床应用中是较为常见的方法。在某些情况下，仅能确定属，由常用的属名称来表示。仅在少数情况能确定亚种，或在比较顺利的情况下，能确定血清型或株系。在广义上，鉴定还可能表示对其他特征的确定，例如一种微生物种的病原性(能够导致疾病)或一种微生物种对抗生素的耐药性，但这些类型的鉴定并不是本文要讨论的问题。
Van Baar在评论中详细说明了如何借由质谱测量进行细菌鉴定，例如(FEMS Mi crobiolgy Reviews(FEMS微生物学评论)，24，2000，193-219：“Characteri zation of bacteria by matrix-assistedlaser desorption/ioni zati on and electrospray massspectrometry”(《借由基质辅助激光解吸/电离和电喷雾质谱的细菌定性》))。通过分析待鉴定细菌的质谱和已知细菌的参考质谱(以下简称参考质谱)之间的相似度来完成鉴定。在相似度分析期间，为各参考质谱分配一个相似度指标，以确定参考质谱和样本质谱之间的一致程度。例如，如果相似度指标明显高于所有其他参考质谱的相似度指标，或高于指定的最小分值，则可视为该细菌已鉴定。在以下内容中，相似度指标也称为“相似度分值”或简称为“相似度”。
通常会在一个或多个集合(以下称为“库”)中比较参考质谱。因而库中包含一个或多个参考质谱集合。在医学诊断应用中，必须按照法律规定来验证这些参考质谱库。验证参考质谱库要求各条目均可追踪，并且进行十分准确地归档。参考质谱可通过已经精确确定特征的株系获得。
全世界众多研究所采用冷冻或冻干株系的形式来收集活性微生物。“株系”一词是指从单一生物体繁殖而来、并在专门实验室中得到公认准确鉴定的群体。由于人们在全世界的不同地点收集和储存微生物，因此世界范围内也会存在属于相同物种或亚种的许多株系。尽管这些株系被分类为相同物种或亚种，但有时表现出的质谱会略有不同，这说明存在个体差异(同一物种的动物或植物就是这类情况)。继物种或亚种之后，株系成为国际上同意的又一名称。
通常，因为各株系的质谱略有不同，所以参考质谱库不仅包含某一微生物物种(或亚种)的一个参考质谱，还包含不同株系的多个参考质谱。在向库中输入新的参考质谱时，它应当与该物种的现有参考质谱有所不同，这一点至关重要，以便能够清晰地反映出该物种或亚种质谱变化的幅度。某物种的微生物如果参考质谱相同，即使来源于不同株系，也无法提供更好的鉴定结果。一个微生物物种应具有至少五种参考质谱，甚至十种、十五种或更多才更好，尤其是在各株系质谱彼此存在明显差异时。但是在有些情况下，由于缺乏经过明确鉴定的株系，库中可能仅包含一种或两种参考质谱。
生成微生物质谱通常需要通过清晰地分离菌落(“分离物”)，在固态(通常为凝胶)培养基上开始。在日常操作中，通常使用小棉棒(例如卫生清洁的木制牙签)将微量微生物从选定菌落转移到质谱样本载板上。在载板上，采用已知方法对样本进行细胞破碎并添加基质，并使用飞行时间质谱仪通过基质辅助激光解析来分析样本。每个激光脉冲产生的离子将生成独立的质谱，但这在统计学上并不可靠，而且携带有相关大量噪声。为了获得可靠且无噪声的质谱，将添加数百个此类单独质谱以形成总质谱。“微生物质谱”一词或简称“微生物质谱”应始终表示该总质谱。
微生物分离物的质谱是可溶性微生物材料离子质量值的丰度分布曲线。在微生物细胞内部的数万种物质中，仅测量出大约50至200种含量最多(或最易于电离)的成分大于测量阈值。这些离子绝大部分是蛋白离子，特别是核糖体中所含不同类型蛋白质的离子。核糖体始终含有相同数量的约40至60种物种特有的同种蛋白质。每个微生物细胞包含远远超过10,000个的完全相同核糖体，即在每个细胞中，有10,000个以上物种特有的蛋白质分子。通常这些核糖体蛋白质属于质谱最突出的峰值。这种微生物质谱再现的蛋白质分布曲线具有所讨论的微生物物种的显著特征，因为每个物种都将产生由基因预先决定的蛋白质，这些蛋白质具有各自的质量特征。同样，该微生物内各个蛋白质的丰度在能够由质谱测量的最大范围内，同样由基因或细胞结构(与核糖体相同)预先决定。这几乎与培养基或菌落成熟度完全不相关。因此鉴定极为稳定，并且与培养的类型或持续时间或样本预制几乎无关。蛋白质分布曲线是微生物的特征，正如指纹是人的特征一样。在质谱中，可在约3,000道尔顿至15,000道尔顿的质量范围内找到对鉴定最具帮助的信息。
除了稳定性，它还证明有利于将培养和样本预制尽可能的标准化。通过制备特定微生物菌落、准确归档同族并从中获得质谱来生成质谱库的参考质谱。出于统计原因，始终需要获得大量总质谱并进行评估以获得一种参考质谱。虽然由于对质谱信号的搜索被设置较高的敏感度而导致微生物的总质谱中有一些是纯噪声，但是微生物的总质谱通常包含约50至200个被质谱中的分隔空间明显分隔的质谱信号。因此参考质谱通常被减少为最多70或100个质量信号，例如通过移除噪声信号和强度过低的信号。专家们甚至考虑将质量信号限制为50个就已经足够。对于一个具有50个质量信号，其质谱范围介于3,000至15,000道尔顿的质谱，即使降低质量分辨能力，并且不考虑强度差异(理论上，存在200050≈10165个互不相同的模式)，其信息内容仍远远多于2,000个可辨别的质谱信号。
将以相似方式从重复质谱中生成待鉴定的微生物质谱(以下简称为“样本质谱”)，其质谱信号将被限制为预先确定的数量，以便尽可能排除噪声信号。在这些样本质谱中选择质量信号时，其数量通常略高于参考质谱中的质量信号数量。
根据样本质谱和库中参考质谱的相似度分析鉴定微生物。存在不同类型的相似度分析，它们通常基于不同形式的参考质谱。文献中多种类型的鉴定算法和参考库已经为人们所知，这里不再进一步阐述。通常使用“相似度指标”(以下也称为“相似度分值”或简称“相似度”)来表示两种质谱之间的相似度。本申请人的公司开发出一种十分简单快速的质谱鉴定方法，具有极高的成功率，并且已经过独立研究小组的无数次研究予以验证。由于质量信号强度差异较大，所以相似度指标主要基于质量信号的质量；对强度仅稍加考虑。
上述鉴定方法基于相似度指标的特殊计算方法。由于相似度指标在下文中十分重要，因而在此简要解释我们在公司对其执行的计算。这种计算方法基于三个单因素度量。相似度指标的第一个单因素度量，由微生物质谱和参考质谱(符合质量容差范围)中的质量信号数量(“命中数”)除以参考质谱中的质量信号数量来表示，但所有质量信号均按其存在率的比例加权。存在率是重复测量时这一质量在参考质谱中出现的百分比。质量容差范围可以为给定的绝对值(单位为道尔顿)或是相对值(ppm，百万分率)。第二个单因素度量由命中数除以微生物质谱中的质量信号数，还是按参考质谱中的存在率比例加权。第一个和第二个单因素度量的最大值均为1.00。第三个单因素度量通过符合的质量信号各自强度间的相似度计算得出，还是以相乘的方式考虑存在率。第三个单因素度量将针对所有质量信号进行标准化，从而在所有强度相等时，使该单因素度量值为1.00。
现在只需将这三个单因素度量相乘，即可获得参考质谱和微生物质谱间的相似度指标。由于每个单因素度量的最大值均为1.00，因而相似度指标的最大值同样为1.00。通过这种相似度计算得出了数十万次经过验证的鉴定，这些鉴定表明，实际上，可靠鉴定的相似度分值始终大于0.10。为推导出更易于处理的数值，可通过乘以1000进行转换，然后使用对数值，可获得相同质谱的最大相似度指标S＝3.00，物种鉴定所需的最小相似度指标S＝2.00。这种转换并非必不可少，但可获得较高的心理值；如果证明任何其他转换更加可行，也可应用其他转换。
这些相似度指标的计算可采用非常快速的算法来执行。如今，将质谱仪和计算机结合使用，仅需几毫秒即可完成比例调整和相似度指标的计算。
结果通常用“分值列表”来表示，至少可作为中间结果，其中，给出最相似的参考质谱，按照相似度指标排序，并列出相应微生物物种、亚种和株系的名称。成千上万次经过验证的鉴定表明，确定性通常远远超过95％，介于Sf＝1.70和Sg＝2.00之间的相似度指标可至少确定科，有可能确定属，而介于Sg＝2.00和Ss＝2.30之间的相似度指标则可准确确定属，有可能确定物种。高于Ss＝2.30的相似度指标可确定单独物种，并且确定性水平较高。上述范围值在细菌分类中的准确度惊人；不同研究小组开展的很多大规模研究已经对上述范围值予以确认。这些相似度分值可用于最常用的质谱鉴定系统Bruker Daltonics的“MALDI”中。对于其他系统，必要时还需进行转换。
正如以上所做的简要说明，在这种质谱鉴定方法的发展历史中，它已经成为一种惯例，用来创建微生物株系名称的分值表，通过该微生物株系的参考质谱可获得最佳的相似度分值，以此作为鉴定的中间结果。该列表按照样本质谱的相似度排序。相似度分值高于S＝1.50的所有参考质谱将以表格形式显示，例如，如果存在30种以上最为相似的参考质谱，则该表格将被缩减。若不使用任何相似度阈值，则该分值列表通常只是包含20至30种最为相似的参考质谱。如果相似度分值大幅跳跃，例如ΔS＝0.60的跳跃幅度，则该表格还可再缩减。随后应由专家来评估该分值列表，通过他/她的经验来做出最后的鉴定。当分值列表中列出多个微生物物种时，专家必须特别评估样本是否为不同微生物物种的混合物。
由于质谱鉴定方法如今普遍用于数百个常规实验室内，因而让专家评估的要求已经不再适用。人们对于这样一种方法的需求愈发迫切，该方法能够尽可能自动运行，并且当存在微生物混合物时，仍具有较高鉴定确定性。因此分值列表评估在很大程度上必须转移给计算机程序执行；仅在少数情况下，结果可能无法确定。
在大多数情况下，可明确鉴定琼脂表面上干净分离菌落中的微生物。但无法保证在琼脂上清晰分离的菌落中不存在微生物混合物。在培养期内，存在微生物，它们通常在琼脂表面上不可见的薄层中移动并扩散。如果外来菌落分泌的代谢废物对其不具有吸引力，则可避开其他菌落；但是，如果代谢废物具有吸引力，则迁移的微生物也可能在此聚集，从而形成含原有菌落微生物的混合物。迁移的微生物数量增长甚至可能超过原有菌落的微生物。
但微生物样本也可来源于液体培养菌；例如血液培养菌。通过离心来净化和分离之后，微生物样本将通常以颗粒形式存在。在70％以上的这种情况中，同样不存在微生物混合物，因为仅存在一个物种，或一个物种的增长远远超过所有其他微生物物种。如果两个物种能够彼此相容或者甚至共生，也会存在例外情况。因此，样本包含两种或者甚至多种微生物物种的可能性可达百分之十以上。
如果分值列表中前20或30个最佳匹配项中的参考质谱至少有两种不同的微生物物种，则可怀疑存在混合物。如果怀疑存在混合物，则可按照文件DE 102009007266 A1(M.Kostrzewa等著，对应于GB 2467636 A或US-2010-0248298-A1)中所述，使用在混合物中鉴定微生物的方法。本文已包含这些文件以供参考。文件描述了在混合物中鉴定微生物物种的方法，以下称为“通过组合质谱进行混合物分析”。对于这种确定混合物中微生物物种的方法，将生成所有可能的组合质谱，每个组合质谱均包含分值列表中不属于相同微生物物种的两种质谱。如果与样本质谱相关的一个组合质谱的相似度分值大于所使用单独质谱的相似度分值，则很有可能，但无法确定，该样本是包含最相似组合质谱中微生物物种的混合物。如果在一定程度上可确定样本为混合物，则其质谱产生最佳组合的这两种(或多种)微生物物种可以被视作混合物的成分。
然而，这种方法具有自我确认的特点，这也可能更让人认为，较相似的组合质谱始终就是混合物。但也可能发生这种情况，即分值列表包含两种微生物物种的参考质谱，但样本并非混合物。近缘微生物物种有时具有十分相似的质谱，从而使第二种微生物物种的参考质谱不可避免地出现最佳相似度的匹配。如果此时生成组合质谱，并与样本质谱相比较，则几乎能够肯定至少一种组合质谱可提供更好的相似度分值，从而造成存在混合物的假象。
因此，以上为确定混合物成分而引用的文件DE 102009007266A1建议，应该确定不同类型微生物之间的关系程度。如果关系密切，则可认为样本不是混合物。出于上述原因，名称通常并不能反映关系程度，因而此时又需要经验丰富的专家来执行这一任务。常规实验室中很难找到这种专家。在对中间结果进行目视评估时，缺乏经验的实验室人员很容易错误地认为样本为混合物。
对于微生物的质谱鉴定，具有，尽可能可靠地自动辨别样本是否为微生物物种的混合物的需求。
在下文中使用“分值列表”一词时，表示参考质谱与样本质谱以及相关微生物株系和微生物物种的名称最为相似，即使它们不是列表形式，例如只是计算机内存中数据集合的形式。可按照指定的相似度阈值，或按照最相似参考质谱的指定数量，或按照相似度分值与下个最相似参考质谱超过指定值的差异来区分最相似参考质谱和库中的所有其他参考质谱。在分值列表中，可仅使用单一参考质谱(例如，如果仅存在一个此微生物物种的参考质谱)表示微生物物种，或如果库中确实存在10或15个此微生物物种株系的参考质谱、并且它们均与样本质谱相似，也可以用这10或15个参考质谱来表示微生物物种。
发明内容
本发明的目的是，在微生物样本质谱鉴定时提供用来辨别两个或更多个微生物物种的混合物以及鉴定相关微生物物种的方法。
这种鉴定混合物中微生物物种的方法被称为“通过组合质谱进行混合物分析”，如果分值列表包含几个微生物物种的参考质谱，则该方法建议首先研究分值列表中的不同微生物物种是否存在近缘关系。本文建议，如果分值列表中的不同微生物物种为近缘关系，则应认为不存在混合物。
这种关系通常无法从微生物的名称推断出。因此，该研究需要经验丰富的专家，且通常无法在常规实验室中经常执行。出于这个原因，本发明的第一个实施例提出让经验丰富的专家一次性确定质谱库中所有参考质谱的微生物之间的关系，并向质谱库中添加一个类母体关系列表，列表含有参考质谱的微生物物种名称。此处，该列表被称为“排除列表”，因为它表明不含混合物。可用数字r描述这种关系，r＝1.0表示相同物种的近缘株系，r＝0.0表明没有任何关系。借助该列表，用于评估质谱的计算机程序可确定是否存在这种近缘关系，如果存在近缘关系，则否定存在混合物。目前已发现，该排除列表不仅能表示微生物物种之间的关系，还能以复杂方式表示一种微生物物种的株系和其他微生物物种的株系之间的关系。
但是，这种方法存在一个主要缺点，即在扩展参考库时，必须总要更新和扩展关系列表。虽然在原则上，可以在常规实验室中向质谱库添加更多参考质谱，但是需要专家来确保该关系列表完整。
本发明的第二个实施例基于一项发现，即重要因素并非分类学确定的微生物之间的关系，而仅是其参考质谱之间的相似程度。如果不同微生物物种的两个株系的参考质谱非常相似(无论其是否存在近缘关系)，假设相似度足够高，当存在其中一个微生物株系时，两个微生物株系的参考质谱不可避免地出现在分值列表中。如果其中一个微生物株系参考质谱与样本质谱的相似度分值较高，则第二个微生物株系一定也有相似度相对较高的参考质谱。
在分值列表中存在两个或更多个微生物物种时，为了回答样本是否为混合物的问题，本发明的第二个实施例提出，研究分值列表中的不同微生物物种参考质谱的互相相似度，例如利用评估程序评估分值列表本身。可使用多种数学方法完成这一步骤，但是最简单的方法是使用与鉴定相同的相似度计算。如果它们非常相似，相似度分值高于通过实验确定的相似度阈值，则不存在混合物。另一方面，如果不同微生物物种的参考质谱互相并不相似，则向用户指出该样本一定是混合物。然后可执行上述通过组合质谱进行混合物分析的方法，以确定组成混合物的微生物。
在第三个实施例中，如果分值列表中包含几个微生物物种，则根据DE 102009007266 A1、GB 2467636 A或US-2010-0248298-A1，总是执行“通过组合质谱进行混合物分析”方法，但不断定存在混合物。计算机程序从最相似的参考质谱开始检查分值列表。当库中存在微生物物种几个株系的参考质谱时，最相似的参考质谱通常全部属于一个微生物物种。如果程序发现第二种微生物物种，则组合质谱由第一种微生物物种的所有参考质谱组成。然后研究这些组合质谱与样本质谱的相似度。相同方法可应用于第二种微生物物种的更多参考质谱，还可应用于第三种微生物物种的参考质谱(若存在)。如果获得的组合质谱与样本质谱的相似度高于分值列表中所有参考质谱的相似度，则可能存在混合物。为明确确定是否存在微生物混合物，应检查在所有情况下生成最相似组合的成对参考质谱彼此之间的相似度。如果相似度足够低，低于通过实验确定的阈值，则向用户表明很有可能存在混合物。产生最佳组合质谱的参考质谱微生物被认为是混合物的成分。一个组合的两个参考质谱的相似度甚至可以用来说明混合物存在的概率。
附图说明
图1是第二个混合物检测实施例的过程示意图。
图2是第三个混合物检测实施例的过程示意图。
具体实施方式
本发明提出了辩别微生物混合物的方法，该方法通过计算微生物样本质谱(“样本质谱”)和参考质谱之间的相似度指标实现，可用于微生物样本的质谱鉴定程序。这种鉴定方法总是需要首先确定最相似的参考质谱并将其输入分值列表中。分值列表可能包含两种或多种微生物物种，它们或者构成混合物，或者源自近缘微生物。
本发明方法的第一个实施例，通过编制分值列表，在微生物样本质谱鉴定过程中检测微生物混合物，其特点是，如果分值列表中存在两个或多种微生物物种，可借助排除列表来确定微生物株系之间的关系程度。可用数字r描述关系程度，例如，r＝1.0表示同物种的近缘株系，r＝0.8表示同属的近缘物种，r＝0.6表示同科的近缘属，r＝0.0表明没有任何关系。如果关系程度足够低，关系程度r低于指定值，则表明微生物样本是微生物混合物。可执行上述通过组合质谱进行混合物分析的方法，以确定组成混合物的微生物。
排除列表必须由专家制定。专家可将关系程度研究范围限制在，不同微生物物种的不同微生物株系具有非常相似的质谱。可通过适当的计算机程序对比所有参考质谱和所有其他参考质谱，自动选出这些微生物株系。然后专家仅检查其质谱彼此非常相似的所有成对微生物株系的列表。
现已发现，必须考虑到一个微生物物种的各个株系与另一个微生物物种的所有株系之间的关系，而不仅仅是各个微生物物种本身之间的关系，这会使排除列表非常复杂。例如，大肠杆菌的一些株系与志贺氏杆菌属的株系存在近缘关系，与大肠杆菌其他株系的相关度却较低。二者都属于肠杆菌科。志贺氏杆菌可导致杆菌性痢疾或志贺氏菌病，但是大肠杆菌的大多数亚种却是肠道菌丛的有益成分；因此正确的鉴定对诊断至关重要。在这里，我们应该注意，当今一些微生物学学者认为志贺氏杆菌本身一定不是具有四个微生物物种的属，也不是独立的物种，实际上只是大肠杆菌的亚种。这种观点也得到了一项发现的支持，该发现表明存在大肠杆菌的更多亚种，它们产生的毒素与志贺氏杆菌属的四个微生物物种相同。这个例子表明的确需要专家来确定关系和编制排除列表。这进一步表明微生物分类学仍然处于持续变化的状态，需要进一步重新划分。
即使无法通过所比较的微生物物种的名称辨别，或相对另一微生物物种株系，甚至同一微生物物种的不同株系之间也不同，但排除列表仍可让计算机程序确定关系程度。但是，添加更多参考质谱到库中时，必须不断更新该列表。如果参考库的此类扩展并非由制造商执行，而是由没有合适专家可用的常规实验室执行，则这是一个小缺点。即使巨大的参考质谱库也无法涵盖各种各样的微生物。在常规实验室中就能够向库中加入参考质谱是该质谱鉴定方法最大优点之一，一定要保留。
本发明方法的第二个实施例，通过编制分值列表，在微生物样本质谱鉴定过程中检测微生物混合物，其特点是，如果分值列表中存在两种或多种相同微生物物种，将研究不同微生物物种参考质谱之间的相似度，如果相似度足够低，低于指定的相似度阈值，则表明微生物样本是微生物混合物。在这里也可以利用上述组合质谱执行混合物分析的方法，以确定组成混合物的微生物。
在第二个实施例中，确定分值列表中两种或多种微生物物种的参考质谱之间的相似度，而非关系程度。本发明的第二个实施例基于一项发现，即重要因素并非分类学确定的微生物之间的关系，而仅仅是其参考质谱之间的相似程度。这还解决了微生物株系和其关系的复杂问题。为了排除混合物，可指定相似度阈值，并设置参考质谱之间的相似度。本阈值最好通过实验确定，例如在人工制造混合物的试验中。通常，仅在不同微生物物种参考质谱之间的相似度全部低于该指定相似度阈值时才存在混合物。通过这些相似度，甚至可能推断出混合物存在的概率：相似度越低，混合物存在的概率越高。如果根据本发明的方法检测混合物，则必须利用上述“通过组合质谱进行混合物分析”方法确定所包含的微生物物种。
本发明方法的第三个实施例，不仅可检测微生物混合物，而且能够立刻鉴定混合物中包含的微生物。与上述示例实施例一样，通过比较样本质谱和库中所有参考质谱之间的相似度，在质谱鉴定过程中编制分值列表。另一种方法包括下列步骤：
a)通过分值列表中不同微生物物种的参考质谱形成组合质谱；b)确定这些组合质谱和样本质谱之间的相似度；c)选择其与样本质谱之间的相似度高于样本质谱和纯参考质谱之间的所有相似度的组合质谱；d)计算构成所选最相似组合质谱的经组合参考质谱之间的相似度；e)如果经组合的参考质谱的相似度低于指定的相似度阈值，则表明存在混合物；并且根据需要，f)在参考质谱组合的相似度高于样本质谱的相似度时，确定混合物的微生物。
在这里，最好也通过实验方法确定第三个实施例中步骤e)中指定的相似度阈值的最佳值。
如果在相似度最高的参考质谱中存在几个微生物物种，则本方法的第三个实施例首先使用上述“通过组合质谱进行混合物分析”的程序来辨别混合物，但不断定存在混合物。这听起来可能很复杂、耗时，但并非如此。大约100个组合质谱(通常会少很多)的组成和相似度计算仅需几分之一秒，与计算样本质谱和库中成千上万参考质谱之间的相似度相比，这个时间几乎可以忽略不计。
第三个混合物辨别的实施例具体执行步骤如下：首先，通过计算样本质谱和参考质谱之间的所有相似度分值来进行鉴别，根据微生物物种和微生物株系制定最相似参考质谱的分值列表。分值列表不必一定在屏幕上显示；将其储存在计算机储存器中足以。然后计算机程序从相似度最高的参考质谱开始检查分值列表。通常，如果库中存在微生物物种几个株系的参考质谱，则列表顶部最相似的几个参考质谱通常全部属于该微生物物种。如果程序发现第二种微生物物种，则组合质谱由第二种微生物物种的第一个参考质谱和第一个微生物物种的所有参考质谱组成，分别研究它们与样本质谱的相似度。相同方法可应用于第二种微生物物种的更多参考质谱，还可应用于第三种微生物物种的参考质谱(若存在)。将第三种微生物物种的参考质谱与第一种和第二种微生物物种的所有参考质谱相结合。如果得到的组合质谱与样本质谱的相似度高于分值列表中的最高相似度，则可能存在混合物，但这并不是结论。若要确定是否存在混合物，需检查组成每个最佳组合的两个参考质谱之间的相似度。只有在它们低于指定的相似度阈值时，计算机程序才会向用户表明这很可能是混合物。根据组合的参考质谱之间的相似度，甚至可以说明混合物存在的概率。
因此本发明提出了让分值列表的自动评估程序来辨别微生物混合物存在与否，该方法确定性相对较高。
当然，所提出的方法能够以多种方式改变和改进。例如，如果分值列表始终限制为20到30个最相似的参考质谱(通常如此)，我们会非常频繁地观察到，前5到15个最相似的参考质谱全都属于相同微生物物种的不同株系，并且(几乎)全部都具有很高的相似度分值，同时与下一个最相似参考质谱的相似度分值差距很大。很明显，在如此明确的情况下，适合的计算机程序就能够明确鉴定出物种，而不必一定要检查混合物是否存在。因此，可通过分值列表中参考质谱的相似度分值结构来辨别混合物是否存在。通常情况下，如果根据相似度对参考质谱排序，有时连续的参考质谱之间存在较大跳跃的差异，那么便可以忽略后续参考质谱。另一方面，如果分值列表包含两个或更多个不同微生物物种的参考质谱，并且它们与样本质谱的相似度都不高，则这不一定表明存在微生物物种混合物。如果不同物种的参考质谱彼此相似，两种微生物物种可能与样本的微生物物种有关系，但是库中不存在这种微生物物种的参考质谱。通过确定适当的相似度阈值，可将所有这些情况整合到评估程序中。

Claims (14)

1.一种通过编制库中与样本质谱最相似的参考质谱的分值列表而在微生物样本质谱鉴定过程中辨别微生物混合物的方法，其中，如果分值列表中存在两个或更多个微生物物种，则可借助排除列表来确定微生物株系之间的关系，如果这种关系低于指定程度，则表明该微生物样本是微生物混合物。
2.一种通过编制库中与样本质谱最相似的参考质谱的分值列表而在微生物样本质谱鉴定过程中辨别微生物混合物的方法，其中，如果分值列表中存在两个或更多个不同的微生物物种，将研究不同微生物物种参考质谱之间的相似度，如果相似度低于指定相似度阈值，则表明微生物样本是微生物混合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，如果已经确定是微生物混合物，则将使用组合质谱执行混合物分析。
4.一种通过编制库中与样本质谱最相似的参考质谱的分值列表而在微生物样本质谱鉴定过程中检测并鉴定微生物混合物的方法，包括以下步骤：
a)通过分值列表中不同微生物物种的参考质谱形成组合质谱；
b)计算这些组合质谱和样本质谱间的相似度；
c)选择与样本质谱之间相似度高于样本质谱和纯参考质谱之间相似度的组合质谱；
d)计算组成这些所选组合质谱的参考质谱间的相似度；
e)如果经组合的参考质谱之间的相似度低于指定的相似度阈值，则表明存在混合物；
f)指明与样本质谱的最佳相似度的参考质谱组合为混合物的微生物物种。
5.根据权利要求2或4所述的方法，其中，将通过实验来确定指定的相似度阈值。
6.根据权利要求1、2或4所述的方法，其中，通过指定相似度阈值来区分分值列表的参考质谱和库中其他参考质谱。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，通过指定相似度阈值来区分分值列表的参考质谱和库中其他参考质谱。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，通过指定相似度阈值来区分分值列表的参考质谱和库中其他参考质谱。
9.根据权利要求1、2或4所述的方法，其中，分值列表包含特定数量的最相似参考质谱。
10.根据权利要求3所述的方法，其中，分值列表包含特定数量的最相似参考质谱。
11.根据权利要求5所述的方法，其中，分值列表包含特定数量的最相似参考质谱。
12.根据权利要求1、2或4所述的方法，其中，分值列表包含所有参考质谱，直到参考质谱与下个最相似参考质谱的相似度分值发生所指定的大幅跳跃。
13.根据权利要求3所述的方法，其中，分值列表包含所有参考质谱，直到参考质谱与下个最相似参考质谱的相似度分值发生所指定的大幅跳跃。
14.根据权利要求5所述的方法，其中，分值列表包含所有参 考质谱，直到参考质谱与下个最相似参考质谱的相似度分值发生所指定的大幅跳跃。
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