JP4020640B2 - 微生物識別方法および微生物識別装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物識別方法および微生物識別装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、家庭等から排出される有機系廃棄物（いわゆる生ゴミ）等をコンポスト化（肥料化）する生ゴミ処理機が活発に研究開発されている。生ゴミ処理機では、細菌、原生動物等の微生物群が有機物を分解することにより肥料が作成される。
【０００３】
このような生ゴミ処理機によるコンポスト化では、そのコンポスト化過程（有機物分解過程）において、温度等をモニタすることによりコンポスト化の度合いを評価する。そして、その評価に基づき良質な肥料が作成されるように生ゴミ処理機の状態を調節する。
【０００４】
しかしながら、より良質な肥料を作成するためには、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物群（少なくとも微生物の種類）の情報が必要である。この微生物群の情報は、微生物により生ゴミの分解を良好に制御するためにも必要である。また、作成された肥料の添加により土壌の改良を進める上では、土壌中の微生物群の情報を知ることも重要である。
【０００５】
生ゴミ処理機内において、生ゴミに含まれる各種成分は、種類の異なる微生物が共同して分解を進めることによりコンポスト化される。それぞれの細菌はお互いに何らかの関係を維持しており、生ゴミ処理機内において全体的に１つの生態系を構成している。したがって、生ゴミ処理機内の菌叢を調べれば、生ゴミの処理状態をいち早く知ることが可能となる。例えば、活性の高い細菌が生ゴミ処理機内に多く存在するときには生ゴミの処理状態が良好であるのに対し、嫌気性細菌が多くなると生ゴミの処理が進まず、生ゴミ処理機内への空気供給が必要であることなどがわかる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来、微生物群の情報、例えば細菌群の情報を得る方法としては、細菌群に含まれる個々の細菌を単離して生化学検査する方法等が用いられる。しかし、この方法は時間がかかる上に、単離の難しい細菌については調べることが困難であった。
【０００７】
一方、ＤＮＡ分析を行うことにより微生物群の情報を得る方法も考えられる。ＤＮＡ分析を行うにはＤＮＡを増幅する必要がある。ＤＮＡを増幅する方法としてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction;ポリメラーゼ連鎖反応）法が用いられている（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，９６５，１８８号、第５，０３８，８５２号および第５，３３３，６７５号）。このＰＣＲ法は、増幅しようとするＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）の両端の塩基配列に相補な塩基配列を有するプライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、熱変性工程、アニーリング（熱処理）工程および伸長反応工程の３段階からなるサイクルを繰り返すことにより、鋳型ＤＮＡとほぼ同じＤＮＡ断片を増幅することを可能にするものである。このＰＣＲ法を用いると、微量にしか存在しない細菌の１個のＤＮＡ中の所定の断片を例えば１０万〜１００万倍に増幅することができる。
【０００８】
しかしながら、このＰＣＲ法を用いるためには、鋳型ＤＮＡの一領域の少なくとも両端の塩基配列が既知であることが必要である。したがって、従来のＰＣＲ法では、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物や土壌に存在する微生物の種類および塩基配列が知られていないと、それらの微生物のＤＮＡ断片を増幅することはできない。
【０００９】
そこで、単一のプライマーで塩基配列の情報なしに一種類のＤＮＡから同時に多数の種類のＤＮＡ断片を増幅するＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic ＤＮＡ）法もしくはＡＰ−ＰＣＲ（Arbitrarily Primed-Polymerase Chain Reaction) 法が提案されている。これらの方法では、ＰＣＲの反応時にプライマーのアニーリング温度を下げ、さらに反応液中のマグネシウムイオン濃度を上げることにより、プライマーの結合時の配列特異性を下げる。すると、プライマーはミスマッチを伴って微生物の染色体ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ断片が複製される。
【００１０】
これらのＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ法によれば、増幅しようとするＤＮＡの塩基配列の情報がなくても、単一のプライマーにより何らかのＤＮＡ断片が多量に増幅される。増幅されたＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により分離することによりＤＮＡフィンガープリントが得られる。このＤＮＡフィンガープリントを分析することにより微生物の状態を分析することが可能となる。
【００１１】
その反面、従来のＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ法を複数の微生物から構成される微生物群に適用する場合、増幅されるＤＮＡ断片の種類数が多すぎるために、増幅されたＤＮＡ断片と鋳型となった微生物との対応付けが困難となり、微生物群が形成する生態系を把握することが困難となる。また、増幅されたＤＮＡ断片から微生物群を構成する微生物を識別することはできない。
【００１２】
生ゴミ処理機は、処理槽の温度が例えば３０℃以上かつ含水率が例えば４０％となるように設定調整を行うとともに、撹拌機能を設けることで処理状態を安定に保つことができる。しかし、適切な微生物測定技術がないため、装置の小型化、悪臭防止、良質な堆肥生成などの機能向上を行うことは困難である。
【００１３】
このように、生ゴミ処理機に代表される微生物利用の商品およびシステムでは、内部で活動している微生物の状態、例えば微生物の種類や経時変化等を評価する適切な方法がないため、開発や改良を進める上で大きな障害が生じる。
【００１４】
本発明の目的は、微生物群を構成する複数の微生物を同時にかつ容易に識別することが可能な微生物識別方法および微生物識別装置を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段および発明の効果】
第１の発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、複数のプライマーを準備し、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する出力信号を得るステップと、出力信号に基づいて各プライマーに対応する波形データを求めるステップと、照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する出力信号に関する情報が予め記憶されたデータベースを検索し、データベースに記憶された情報に基づいて照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する波形データを求め、識別対象となる微生物について求められた波形データと照合対象となる微生物について求められた波形データとの相関関係を求めるステップと、相関関係に基づいて識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、相関関係を求めるステップは、識別対象となる微生物について求められた波形データの各点における信号出力値および照合対象となる微生物について求められた波形データの対応する各点における信号出力値のうち低い方の信号出力値を選択することによりクリッピング信号ＣＳを求めるステップと、クリッピング信号と照合対象となる微生物について求められた波形データとの相関係数ＣＣを次式により算出するステップとを含み、
【数４】
式（２）において、ＣＳ ｉ はクリッピング信号ＣＳのｉ番目の点における信号出力値、ａ ｉ は照合対象となる微生物の波形データのｉ番目の点における信号出力値であり、ｎは各波形データにおける点数であり、識別するステップは、相関係数ＣＣに基づいて識別対象となる微生物が照合対象となる微生物であるか否かを判定するステップを含むものである。
【００１６】
本発明に係る微生物識別方法によれば、単一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群のいずれを識別対象として用いる場合にも、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可能となる。
【００１７】
特に、微生物群を識別対象として用いる場合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時に識別し、さらに同定することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００１８】
本発明の微生物識別方法は、微生物群と微生物群の間の比較に用いることもできる。例えばある生ごみ処理機の微生物群から得られた電気泳動像の輝度分布を示す波形データと別の生ごみ処理機から得られた電気泳動像の輝度分布を示す波形データとを比較することで、個々の微生物の違いを調べなくとも両者の微生物群としての違いを見ることができる。
【００１９】
一方、単一の微生物を識別対象として用いる場合においては、識別対象となる微生物とデータベースの照合対象となる微生物との多型を検出することも可能となる。また、識別対象となる微生物と類似した微生物を見いだすこともできる。
【００２０】
ここで、この微生物識別方法においては、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００２１】
さらに、この微生物識別方法においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
【００２８】
既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて、参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、ポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより、参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、参照用プライマーを用いて増幅された参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、参照用ＤＮＡに対応する出力信号を得るステップと、参照用ＤＮＡに対応する出力信号に基づいて識別対象となる微生物に対応する出力信号を補正するステップとをさらに備えてもよい。
【００２９】
この場合、参照用プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法により、参照用ＤＮＡからＤＮＡ断片が確実に増幅される。このようにして増幅された参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データに基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応における参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の増幅効率を求めることが可能になる。このようにして求めた増幅効率は、識別対象となる微生物のＤＮＡ断片においても適用可能である。したがって、求めた増幅効率に基づいて識別対象となる微生物のＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データを補正し、ＤＮＡ断片の量を分析することが可能になる。
【００３２】
電気泳動像の画像データにおいてバンドの背景の輝度のむらを補正するステップをさらに備えてもよい。
【００３３】
データベースには複数種類の微生物についての出力信号に関する情報が記憶されてもよい。
【００４９】
出力信号に関する情報は、その出力信号の強度を示す波形データであってもよい。
【００５０】
出力信号に関する情報は、その出力信号の強度におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積を示すデータであり、相関関係を求めるステップは、出力信号の強度におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積を示すデータに基づいて出力信号の強度を示す波形データを求めるステップを含んでもよい。
【００５１】
相関関係を求めるステップは、出力信号の強度を示すデータに基づいて出力信号の強度を示す波形データを求めるステップを含んでもよい。
【００５２】
相関関係を求めるステップは、識別対象となる微生物について求められた複数のプライマーに対応する波形データを連結し、かつ照合対象となる微生物について求められた複数のプライマーに対応する波形データを連結し、識別対象となる微生物についての連結された波形データと照合対象となる微生物についての連結された波形データとの相関関係を求めるステップを含んでもよい。
【００５３】
これにより、識別対象となる微生物について求められた複数のプライマーに対応する波形データと照合対象となる微生物について求められた複数のプライマーに対応する波形データとの相関関係を容易かつ短時間に求めることができる。
【００５７】
ＤＮＡサイズマーカの出力信号を得るステップと、出力信号に基づいてＤＮＡサイズマーカに対応する出力信号の強度を示す波形データを求めるステップと、ＤＮＡサイズマーカに対応する波形データに基づいて識別対象となる微生物に対応する波形データを補正するステップとをさらに備えてもよい。
【００５８】
波形データを補正するステップは、ＤＮＡサイズマーカに対応する波形データに基づいて識別対象となる微生物に対応する波形データにおけるピークの位置を補正するステップを含んでもよい。
【００５９】
データベースには複数種類の微生物についての出力信号に関する情報が記憶されてもよい。これにより、識別対象となる種々の微生物を識別することができる。
【００６８】
第２の発明に係る微生物識別装置は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、増幅手段により複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段と、電気泳動手段により得られた各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換する画像データ変換手段と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における輝度分布を示す波形データを求める波形データ生成手段と、照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する電気泳動像に関する情報が予め記憶されたデータベースを検索し、データベースに記憶された情報に基づいて照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する電気泳動像における輝度分布を示す波形データを求め、識別対象となる微生物について求められた波形データと照合対象となる微生物について求められた波形データとの相関関係を作成する相関関係作成手段と、相関関係作成手段により作成された相関関係に基づいて識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、相関関係作成手段は、識別対象となる微生物について求められた波形データの各点における信号出力値および照合対象となる微生物について求められた波形データの対応する各点における信号出力値のうち低い方の信号出力値を選択することによりクリッピング信号ＣＳを求める手段と、クリッピング信号と照合対象となる微生物について求められた波形データとの相関係数ＣＣを次式により算出する手段とを含み、
【数５】
式（２）において、ＣＳ ｉ はクリッピング信号ＣＳのｉ番目の点における信号出力値、ａ ｉ は照合対象となる微生物の波形データのｉ番目の点における信号出力値であり、ｎは各波形データにおける点数であり、識別手段は、相関係数ＣＣに基づいて識別対象となる微生物が照合対象となる微生物であるか否かを判定する手段を含むものである。
【００６９】
本発明に係る微生物識別装置によれば、第１の発明に係る微生物識別方法を容易に行うことができる。そのため、単一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群のいずれを識別対象として用いる場合にも、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可能となる。
【００７０】
特に、微生物群を識別対象として用いる場合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時に識別し、さらに同定することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００７１】
本発明の微生物識別装置は、微生物群と微生物群の間の比較に用いることもできる。例えばある生ごみ処理機の微生物群から得られた電気泳動像の輝度分布を示す波形データと別の生ごみ処理機から得られた電気泳動像の輝度分布を示す波形データとを比較することで、個々の微生物の違いを調べなくとも両者の微生物群としての違いを見ることができる。
【００７２】
一方、単一の微生物を識別対象として用いる場合においては、識別対象となる微生物とデータベースの照合対象となる微生物との多型を検出することも可能となる。また、識別対象となる微生物と類似した微生物を見いだすこともできる。
【００７３】
この微生物識別装置においては、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００７４】
さらに、この微生物識別装置においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
【００７５】
第３の発明に係る微生物識別装置は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、増幅手段により複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する出力信号を得る電気泳動手段と、出力信号に基づいて各プライマーに対応する波形データを求める波形データ生成手段と、照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する出力信号に関する情報が予め記憶されたデータベースを検索し、データベースに記憶された情報に基づいて照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する波形データを求め、識別対象となる微生物について求められた波形データと照合対象となる微生物について求められた波形データとの相関関係を作成する相関関係作成手段と、相関関係作成手段により作成された相関関係に基づいて識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、相関関係作成手段は、識別対象となる微生物について求められた波形データの各点における信号出力値および照合対象となる微生物について求められた波形データの対応する各点における信号出力値のうち低い方の信号出力値を選択することによりクリッピング信号ＣＳを求める手段と、クリッピング信号と照合対象となる微生物について求められた波形データとの相関係数ＣＣを次式により算出する手段とを含み、
【数６】
式（２）において、ＣＳ ｉ はクリッピング信号ＣＳのｉ番目の点における信号出力値、ａ ｉ は照合対象となる微生物の波形データのｉ番目の点における信号出力値であり、ｎは各波形データにおける点数であり、識別手段は、相関係数ＣＣに基づいて識別対象となる微生物が照合対象となる微生物であるか否かを判定する手段を含むものである。
【００７６】
本発明に係る微生物識別装置によれば、第２の発明に係る微生物識別方法を容易に行うことができる。そのため、単一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群のいずれを識別対象として用いる場合にも、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可能となる。
【００７７】
特に、微生物群を識別対象として用いる場合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時に識別し、さらに同定することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００７８】
本発明の微生物識別装置は、微生物群と微生物群の間の比較に用いることもできる。例えばある生ごみ処理機の微生物群から得られた出力信号を示す波形データと別の生ごみ処理機から得られた出力信号を示す波形データとを比較することで、個々の微生物の違いを調べなくとも両者の微生物群としての違いを見ることができる。
【００７９】
一方、単一の微生物を識別対象として用いる場合においては、識別対象となる微生物とデータベースの照合対象となる微生物との多型を検出することも可能となる。また、識別対象となる微生物と類似した微生物を見いだすこともできる。
【００８０】
この微生物識別装置においては、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００８１】
さらに、この微生物識別装置においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
【００９２】
【発明の実施の形態】
図１は本発明に係る微生物識別装置を示す図である。
【００９３】
図１に示すように、微生物識別装置は、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１、電気泳動イメージ入力部２、解析用コンピュータ３、データベース格納部４および結果表示手段５からなる。
【００９４】
ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１については後述する。電気泳動イメージ入力部２は、例えばＣＣＤカメラおよびスキャナにより構成される。解析用コンピュータ３は、後述する構成を有するパーソナルコンピュータからなる。データベース格納部４はハードディスク装置等からなり、結果表示手段５はディスプレイ等からなる。
【００９５】
なお、ＳＳＣ−ＰＣＲとはSingle Strain Counting Polymerase Chain Reactionのことであり、特定の塩基配列を有するプライマーを複数用いて未知の塩基配列を有する微生物群または単一の微生物からＤＮＡ断片を連鎖反応的に増幅する反応のことである。なお、ＳＳＣ−ＰＣＲの詳細については後述する。
【００９６】
図２は、図１の微生物識別装置を用いた微生物識別方法の一例を示すフローチャートである。
【００９７】
図２に示すように、まず図１のＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１を用いて、後述のＳＳＣ−ＰＣＲ法により、微生物の解析実験を行う（ステップＳ１）。なお、この解析実験においては、単離した単一の微生物をサンプルとして用いてもよく、また、複数の微生物を含む微生物群をサンプルとして用いてもよい。
【００９８】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法による微生物の解析実験の詳細を図３に示す。まず、図３に示すように、微生物のＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応用バッファ溶液、プライマー、耐熱性の好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ2 および４種の基質となる５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）を所定量ずつ混合し、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する（ステップＳ１−１）。
【００９９】
なお、複数の微生物を含む微生物群をサンプルとして用いる場合においては、複数の微生物のＤＮＡが混合されたものを用いてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。
【０１００】
ここで、ＤＮＡポリメラーゼとは、４種の５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質とし、鋳型ＤＮＡに相補な塩基配列を有するＤＮＡ鎖の重合反応を触媒する酵素である。ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の重合の方向性は５’から３’の方向である。また、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼが作用するために不可欠な３’−ＯＨ基を末端に有するＤＮＡ断片（短鎖オリゴヌクレオチド）である。本発明では、特定の塩基配列および塩基長を有するプライマーを用いる。
【０１０１】
なお、後述するようにＳＳＣ−ＰＣＲ法においては複数のプライマーを用いるため、各々のプライマーについてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。なお、各ＰＣＲ用反応溶液は全て同時に調製するものとする。
【０１０２】
上記のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製と同時に、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを調製する（ステップＳ１−２）。
【０１０３】
なお、この場合においては、ＳＳＣ−ＰＣＲ法において、長さが１２塩基対（ｂｐ）のプライマーをそれぞれ用いている。それにより、各プライマーにおいては、確率的に４12（約１０7 ）に１回ＤＮＡ断片が出現するように調整することができ、一般に１本のＤＮＡの長さが約１０7 塩基対といわれている微生物ＤＮＡから１種類のＤＮＡ断片だけを増幅するように設定することができる。このため、後述するように、増幅されたＤＮＡ断片と微生物とを対応させることが可能となる。
【０１０４】
ここで、ポジティブコントロールとは、後述のＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において生じる誤差を除去するためのコントロール実験に用いる試料である。一般に、ＤＮＡ断片の増幅反応における増幅効率は、一連の工程において生じる誤差、例えばＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製時におけるＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム等の濃度の誤差、用いた試薬の活性の度合い、ＤＮＡ断片増幅時における温度の誤差等により影響を受けると考えられる。このような誤差を除去するために、ポジティブコントロールとして、増幅されるＤＮＡ断片の種類が既知で定量可能なＤＮＡ断片を増幅するプライマーと、このプライマーに相補な塩基配列を有する鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液を調製する。ポジティブコントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動法により定量することが可能である。したがって、ポジティブコントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片の量から、ＤＮＡ断片の増幅効率を求めることができる。このようにして求めた増幅効率をもとにして複数種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のＤＮＡ断片の量を補正することにより、ＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において生じる誤差の影響を除去することが可能となる。その結果、増幅されたＤＮＡ断片の量的な比較が可能となる。
【０１０５】
一方、ネガティブコントロールとは、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象とする微生物群または微生物のものであることを確認するためのコントロール実験に用いる試料である。一般に、細菌等の微生物は空気中等の様々な場所に存在する。このため、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製時において反応溶液に微生物が混入する可能性がある。微生物が反応溶液に混入した場合、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象とする微生物群由来のＤＮＡ断片かあるいは混入した微生物由来のＤＮＡ断片か判別不可能となる。そのため、ネガティブコントロールとして、プライマーを含むが鋳型ＤＮＡを含まないＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。このネガティブコントロールを用いてＳＳＣ−ＰＣＲおよび電気泳動を行い、ネガティブコントロールの電気泳動像においてはバンドが現れないことを確認する。これにより、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象である微生物群または微生物由来のものであることが確認できる。
【０１０６】
なお、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールに用いるプライマーは、前述のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液に用いたプライマーのうちの１つもしくは２つと同じ塩基配列であってもよい。
【０１０７】
上記のようにしてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製した後、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１により、ＤＮＡ断片の増幅反応を行う（ステップＳ１−３）。
【０１０８】
図４は、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１のＤＮＡ断片増幅装置の例を示す模式図である。図４のＤＮＡ断片増幅装置は、タイタプレートと呼ばれる支持プレート５０により構成される。
【０１０９】
支持プレート５０の上面に複数の孔部５１が形成されている。この場合には、複数の孔部５１に、前述のプライマーをそれぞれ含むＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液がプライマーの増幅確率の順に連続的に配置される。また、孔部５１ａには、前述のネガティブコントロールが配置され、孔部５１ｂには、前述のポジティブコントロールが配置される。
【０１１０】
このようなＤＮＡ断片増幅装置により、各ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールにおいて、以下のようなＳＳＣ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅が同時に行われる。
【０１１１】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、従来のＰＣＲ法と同様に、次の３段階の工程を繰り返し行う。ただし、ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、未知の塩基配列を有する微生物または微生物群に対して特定の塩基配列を有するプライマーを用いることにより分析可能な量のＤＮＡ断片を増幅する。
【０１１２】
（１）熱変性工程
ＤＮＡ（初期時）またはＤＮＡ断片を加熱変性し、１本鎖（ＤＮＡ鎖）にする。
【０１１３】
（２）プライマーのアニーリング工程（プライマーの結合工程）
プライマーがＤＮＡ鎖の増幅領域の端に結合するように熱処理を行う。
【０１１４】
（３）ポリメラーゼによる伸長反応工程（ポリメラーゼによる複製工程）
プライマーを起点としてポリメラーゼによって相補鎖を合成し、２本鎖化する。
【０１１５】
上記（１）〜（３）の工程を１サイクルとしてこのサイクルを繰り返し行う。第１のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で２分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程、および上記反応溶液を例えば７２℃で３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行う。なお、本サイクルの熱変性工程は、長い完全ＤＮＡを１本鎖に完全に分離するために下記サイクルの熱変性工程よりも長めに設定する。
【０１１６】
引続き、第２のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程および上記反応溶液を例えば７２℃で３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で例えば３３回繰り返す。
【０１１７】
最後に、第３のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程および上記反応溶液を７２℃で１０分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行う。なお、本サイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程は、最後に複製を完全化するために第１および第２のサイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程よりも長めに設定する。
【０１１８】
ここで、上記第１のサイクル、第２のサイクルの第１回目のサイクル、および第２のサイクルの第２回目のサイクルを図５〜図７を用いて説明する。なお、図は模式的に示しており、ＤＮＡの１本鎖等はプライマーと結合する部分の塩基配列を示している。
【０１１９】
図５〜図７では、ＧＧＣＴＴＣＧＡＡＴＣＧの塩基配列（配列番号１５）を有するプライマーを用いている。なお、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示す。
【０１２０】
図５（ａ）に示すように最初、上記反応溶液中には複数の異なる微生物に含まれていた長いＤＮＡ（完全ＤＮＡ）１１が存在する。ここでは、１個の完全ＤＮＡに着目して説明する。
【０１２１】
最初に、図５（ｂ）に示すように、第１のサイクルでは、第２および第３のサイクルの熱変性工程より長い熱変性工程を行うことにより、上記の長いＤＮＡ１が加熱変性し、２本鎖が互いに離れ、２つの１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｂの状態になる。
【０１２２】
次に、図５（ｃ）に示すように、プライマーのアニーリング工程でプライマー２１ａがその塩基配列に適合する各１本鎖１２ａ，１２ｂの適合位置に配置（相補な配列）するように結合する。ここで、適合位置とはプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位置およびプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列と類似の塩基配列の位置である。上記ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、プライマーのアニーリング工程のアニール温度を低く設定することにより、プライマーは、その塩基配列と類似の塩基配列を有するＤＮＡ鎖の部分にも結合する。すなわち、プライマーは、その塩基配列に完全に相補な塩基配列を有する１本鎖の位置に結合することができるのみならず、多少のミスマッチを伴って１本鎖に結合することもできる。なお、図５〜図７では、簡単のためにプライマーがその塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位置に結合する場合を図示している。
【０１２３】
続いて、図５（ｄ）に示すように、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ａ，１２ｂにそれぞれ沿って１本鎖１２ｃ，１２ｄが伸長して２本鎖化した鎖１３ａ，１３ｂが形成される。
【０１２４】
第２のサイクルの１回目のサイクルでは、第１のサイクルで２本鎖化した鎖１３ａ，１３ｂが熱変性工程でそれぞれ１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｃおよび１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ｂ，１２ｄとなるが、ここでは、鎖１３ａから分かれた１本鎖１２ｃに着目して説明する。
【０１２５】
図６に示すように、熱変性工程で分離した１本鎖１２ｃには次のプライマーのアニーリング工程でプライマー２１ｂが適合位置に配置するように結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ｅに沿って１本鎖１２ｅが伸長して２本鎖化した鎖１３ｄとなる。
【０１２６】
その後、図７に示すように、第２のサイクルの第２回目のサイクルでは、上記２本鎖化した鎖１３ｄが熱変性工程でそれぞれ１本鎖１２ｃ，１２ｅとなるが、ここでは、鎖１３ｄから分かれた１本鎖１２ｅに着目して説明する。
【０１２７】
図７に示すように、熱変性工程で分離した１本鎖１２ｅには、次のプライマーのアニーリング工程で、同様に、プライマー２１ｃが適合位置に配置するように結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ｅに沿って１本鎖１２ｆが伸長して２本鎖化した鎖（ＤＮＡ断片）１３ｅが形成される。
【０１２８】
このようにＤＮＡ断片が形成され、このＤＮＡ断片からＤＮＡ断片が形成されるとともに他の同種のＤＮＡからもＤＮＡ断片が形成され、同様の反応が連鎖反応的に続くので、この方法によりＤＮＡ断片が増幅される。
【０１２９】
その後、図３に示すように、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを用いて、電気泳動法により、各反応溶液において増幅されたＤＮＡ断片をサイズ（塩基対数）ごとに分画する。このとき、濃度が既知で定量可能なＤＮＡサイズマーカを同時に電気泳動させサイズごとに分画する（ステップＳ１−４）。
【０１３０】
さらに、電気泳動法により得られた電気泳動像を蛍光色素で染色し（ステップＳ１−５）、紫外線照射したときの蛍光像を撮影する（ステップＳ１−６）。撮影には、例えばＣＣＤカメラを用いる。このようにして得られた電気泳動像において、ＤＮＡ断片がバンド（帯）として現れる。
【０１３１】
なお、ここで、ネガティブコントロールの電気泳動像においてバンドが現れない場合、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象である微生物または微生物群由来のものであることが確認できる。
【０１３２】
続いて、図２に示すように、撮影した電気泳動像を電気泳動イメージ入力部２（図１）のスキャナで解析用コンピュータ３（図１）に画像データとして取り込み（ステップＳ２）、画像データに基づいて各プライマーについての電気泳動像の輝度分布（発光強度分布）を示す波形データを生成する（ステップＳ３）。
【０１３３】
なお、上記の方法においては、電気泳動像が歪んでいるために輝度分布を示す波形データを正確に生成できない場合がある。したがって、このような電気泳動像の歪みを補正するため、電気泳動像にアフィン変換を含む種々の画像補正を行ってもよい。
【０１３４】
ところで、上記の方法においては、電気泳動像を染色する際に染色むらが生じるおそれがある。このため、電気泳動像の背景にむらが生じるおそれがある。電気泳動像の背景にむらが生じた場合には、電気泳動像の輝度分布を正確に検出することができない。したがって、生成された波形データの信頼性が低下する。
【０１３５】
また、ＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅する際において、所定の塩基配列を有する鋳型ＤＮＡの適合位置にプライマーが強く結合して配置する場合は、ＤＮＡ断片の増幅効率が高い。このようなプライマーにより増幅されたＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性の高い明瞭なバンドとして現れる。一方、プライマーと鋳型ＤＮＡの適合位置との結合が弱い場合、鋳型ＤＮＡの適合位置よりも結合が強い他の位置にプライマーが結合する。このように、ＤＮＡ断片の増幅反応においては競争的に反応が進行するため、プライマーと鋳型ＤＮＡとの結合が弱い場合にはＤＮＡ断片の増幅効率が低くなる。このような結合の弱いプライマーにより増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性が低く不明瞭バンドとして現れる。上記のような再現性の低いＤＮＡ断片を含むことにより、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータは全体の信頼性が低くなる。
【０１３６】
そこで、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータの信頼性を向上させるために、解析コンピュータ３（図１）を用いて、以下のような電気泳動像の輝度分布を示す波形データの補正を行う（ステップＳ４）。
【０１３７】
図８は波形データの補正の工程の一例を示すフローチャートである。図８に示すように、波形データの補正の工程（ステップＳ４）は以下の４つの工程（Ｓ４−１〜Ｓ４−４）から構成される。
【０１３８】
図８に示す一連の波形データの補正の工程（ステップＳ４）においては、まず、電気泳動像の背景むらの補正を行う（ステップＳ４−１）。以下、背景むらの補正工程（ステップＳ４−１）について説明する。
【０１３９】
図９（ａ）は、染色むらが生じたために背景にむらが生じた電気泳動像を示す図である。図９（ａ）においては、レーンＡおよびレーンＢにそれぞれ３つのバンド▲１▼〜▲３▼，▲４▼〜▲６▼が表れている。この場合、電気泳動像の対角線左上側の輝度が最も低く右下側が最も高く、レーンＡ側の輝度がレーンＢ側の輝度に比べて低くなっている。このため、図９（ｂ）に示す輝度分布において、レーンＡおよびレーンＢの各バンド▲１▼〜▲６▼に対応するピークのうち、特にレーンＢのバンド▲５▼，▲６▼のピークにおいて背景の輝度の影響が大きくなる。このように背景の輝度の影響が大きくなると、正確にバンド▲１▼〜▲６▼に対応する輝度分布のピークを検出することができない。
【０１４０】
そこで、電気泳動像における背景の輝度の影響を補正するために、図９（ｃ）に示すように、画像処理により、レーンＡおよびレーンＢのバンド▲１▼〜▲６▼を含む矩形領域を除去し、除去した矩形領域の周辺の輝度に基づいて図９（ｄ）に示すように除去した矩形領域の補間を行う。このようにして得られた図９（ｄ）に示す電気泳動像の背景のデータをもとに、下記式（１）に基づいて、背景の輝度の影響を取り除いたバンド▲１▼〜▲６▼に対応する輝度分布の波形データを求める。
【０１４１】
Ｚnew ＝Ｚmax ・（Ｚ1 −Ｚ0 ）／（Ｚmax −Ｚ0 ） ・・・（１）
なお、式（１）中のＺnew は電気泳動像の補正後の輝度分布における輝度値を示しており、Ｚmax は電気泳動像の輝度分布における最大輝度値を示し、Ｚ0 は電気泳動像の輝度分布における最小輝度値を示し、Ｚ1 は電気泳動像の輝度分布におけるある点の輝度値を示している。（Ｚ1 −Ｚ0 ）／（Ｚmax −Ｚ0 ）によりある点の全体に対する相対輝度の割合が得られ、これにＺmax を乗算することにより相対輝度が得られる。
【０１４２】
また、全体的にむらの少ない場合には、各サンプルのレーンの輝度値から対応するネガティブコントロールの輝度値を引き算したり、各レーンに隣接するレーン間隙の輝度値を引き算することによって、補正することも可能である。
【０１４３】
以上のようにして電気泳動像における背景のむらを補正することにより、背景の輝度の影響を除去して、電気泳動像の輝度分布を示す波形データを正確に生成することが可能となる。
【０１４４】
図８に示すように、輝度分布を示す波形データにおいて、ポジティブコントロールのバンドの発光強度と量が既知であるＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度とを比較することにより、ポジティブコントロールにおいて増幅されたＤＮＡ断片を定量する。さらにこの定量した値を用いてＤＮＡ断片増幅反応の増幅効率を求める。この増幅効率に基づいて各ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の波形データの輝度を補正する（ステップＳ４−２）。それにより、ＤＮＡ増幅反応時における反応条件等の誤差がＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響が除去される。なお、ここでの発光強度とは、輝度分布におけるピークの高さのことである。
【０１４５】
また、ポジティブコントロールの定量方法としては、ＤＮＡ断片精製後に２６０ｎｍの紫外線吸収量を測定するなどの他の方法を用いることもできる。
【０１４６】
さらに、定量可能なＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度を基準として用い、複数種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液に対応する波形データの輝度を補正する。このようにして、電気泳動像の波形データの補正を行う（ステップＳ４−３）。
【０１４７】
一般に、エチジウムブロマイド染色時の染色度合いおよび写真撮影時の露光の程度によって、得られる電気泳動像の階調に誤差が生じる。しかしながら、濃度が既知のＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づいて電気泳動像の画像データの階調補正を行うことにより、このような誤差を除去することができる。
【０１４８】
続いて、ＤＮＡサイズマーカの波形データに基づいて以下に示す軸合わせおよび濃度調整を行う（ステップＳ４−４）。なお、上記のような画像補正は、解析用コンピュータ３（図１）により行う。
【０１４９】
図１０（ａ），（ｂ）は電気泳動像の例を示す図である。図１０（ａ），（ｂ）において、レーン１，８は、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を示している。また、レーン２〜７およびレーン９〜１４は、１２種類の各プライマーにおける電気泳動像をそれぞれ示している。
【０１５０】
なお、上記において、図１０（ａ）はゲルＡを用いて電気泳動させた場合の電気泳動像を示しており、図１０（ｂ）はゲルＢを用いて電気泳動させた場合の電気泳動像を示している。
【０１５１】
ゲルＡおよびゲルＢは同一種類のゲルであり、いずれのゲルを用いる場合においても電気泳動の条件は同一とする。また、ゲルＡ上およびゲルＢ上で電気泳動させるＤＮＡサイズマーカ（レーン１，８）としては同一のものを用いている。
【０１５２】
ここで、図１０（ａ）に示されたＤＮＡサイズマーカの電気泳動像（レーン１）と図１０（ｂ）に示されたＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の（レーン８）とを比較すると明らかなように、同一のＤＮＡサイズマーカを異なるゲル上（この場合はゲルＡ上およびゲルＢ上）で電気泳動させる場合においては、同一のものを同一の条件で電気泳動させたにもかかわらず、同一サイズのバンドが各ゲル上においてそれぞれ異なる位置に現れる。
【０１５３】
このように、電気泳動に用いるゲルが異なると、同一の条件で電気泳動させたにもかかわらず、用いたゲルによりバンドの移動度が異なってくる。このため、異なるゲル間においては、バンドの位置とＤＮＡサイズとの関係が異なる。そこで、本例においては、以下の方法により、異なるゲル間でも波形データの比較が可能となるように、波形データの標準化を行う。この波形データの標準化を軸合わせと呼ぶ。
【０１５４】
波形データの軸合わせを行う方法としては、ＤＮＡサイズマーカの波形データに基づいて所定の変換式のパラメータを決定し、この変換式に基づいて各ゲルごとに波形データを補正する。このような変換式としては、例えば以下の式（２）を用いる。
【０１５５】
ｙ＝ｍ１＋ｌｏｇ（ｍ２−ｍ３・ｘ）/（ｍ４−ｍ５・ｘ） ・・・（２）
ここで、式（２）中のｘは電気泳動のスタート位置からの距離、すなわち泳動距離（画素/１０００ )を示しており、ｙはＤＮＡのサイズを対数値（ｌｏｇ（ｂｐ））で示している。
【０１５６】
図１１（ａ）は、図１０（ａ）に示したゲルＡについて、ＤＮＡサイズマーカの各バンドをプロットしたものである。また、図１１（ｂ）は、図１０（ｂ）に示したゲルＢについて、ＤＮＡサイズマーカの各バンドをプロットしたものである。
【０１５７】
図１１（ａ）および図１１（ｂ）の各点のｘおよびｙの値を用いて最小二乗法により、ゲルＡおよびゲルＢの各々について各パラメータｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４およびｍ５を求める。この場合においては、例えば下記表１に示すようなパラメータｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４およびｍ５がゲルＡおよびゲルＢについて求められる。
【０１５８】
【表１】
【０１５９】
求めた各パラメータｍ１〜ｍ５を代入した変換式（２）により表される曲線とＤＮＡサイズマーカの各バンドをプロットした点との相関係数は、ゲルＡおよびゲルＢともに０．９９９８６となる。図１１（ａ）および（ｂ）に示すように、ＤＮＡサイズマーカの各バンドの点はほぼ変換式（２）で表される曲線上にのる。
【０１６０】
図１２（ａ）は上記の変換式（２）による軸合わせを行う前のＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示す波形データを示す図であり、図１２（ｂ）は上記の変換式（２）による軸合わせを行ったのちのＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示す波形データを示す図である。図１２において、太線はゲルＡにおけるＤＮＡサイズマーカの波形データであり、細線はゲルＢにおけるＤＮＡサイズマーカの波形データである。
【０１６１】
図１２（ａ）に示すように、同一のＤＮＡサイズマーカを用いて同一の条件で電気泳動を行った場合においても、異なるゲル間（ゲルＡおよびゲルＢ）においては、波形データのピーク（バンドに相当）が異なる位置に現れる。これは、前述のように、異なるゲル間（ゲルＡおよびゲルＢ）においては、バンドの移動度に差が生じるためである。
【０１６２】
そこで、前述の図１１に示す方法により、ゲルＡおよびゲルＢにおいてそれぞれパラメータｍ１〜ｍ５を求めるとともに、各ゲルにおいて求めたパラメータｍ１〜ｍ５を代入した変換式（２）に基いて波形データの軸合わせを行う。その結果、図１２（ｂ）に示すように、ゲルＡおよびゲルＢを用いた場合の波形データのピークの位置を一致させることができる。
【０１６３】
図１３（ａ）は、上記の変換式（２）による軸合わせを行う前のＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示す波形データおよびある細菌についての電気泳動像の輝度分布を示す波形データを示す図である。また、図１３（ｂ）は、上記の変換式（２）による軸合わせを行った後のＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示す波形データおよびある細菌についての電気泳動像の輝度分布を示す波形データを示す図である。さらに、図１３（ｃ）は、後述する濃度調整を行った後のＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示す波形データおよびある細菌についての電気泳動像の輝度分布を示す波形データを示す図である。
【０１６４】
図１３（ａ），（ｂ），（ｃ）には、図１０（ａ）に示すゲルＡを用いた場合の波形データおよびゲルＢを用いた場合の波形データが示される。
【０１６５】
図１３（ａ）に示すように、ゲルＡおよびゲルＢを用いて電気泳動を行った場合、ＤＮＡサイズマーカおよび細菌の電気泳動像の輝度分布を示す波形データにおいてピークが異なる位置に現れる。
【０１６６】
そこで、上記の波形データの軸合わせを行うと、図１３（ｂ）に示すように、ゲルＡおよびゲルＢを用いた場合の波形データのピークの位置を一致させることができる。
【０１６７】
この場合、図１１（ａ），（ｂ）からわかるように、泳動距離の中間付近（軸合わせ前の４００付近）では、泳動距離とＤＮＡサイズとの関係が直線に近いが、両端では、泳動距離とＤＮＡサイズとの関係が直線にならず、泳動距離に対するＤＮＡサイズの変化量が増大する。これにより、変換式（２）に基いて波形データの軸合わせを行うと、波形データの両端に近い領域において「引き伸ばし」が起こり、ピークの幅が広くなる。その結果、波形データの両端に近い領域においてピークの面積が大きくなる。このピークの面積は、ＤＮＡの濃度に相当する。そこで、軸合わせ前の波形データとピークの面積が等しくなるように、軸合わせ後の波形データのピークの高さを補正する。この補正を濃度調整と呼ぶ。
【０１６８】
ここで、濃度調整の方法を説明する。上記の軸合わせにおいて変換式（２）のパラメータｍ１〜ｍ５を確定する。確定したパラメータｍ１〜ｍ５を代入した変換式（２）をｙ＝ｆ（ｘ）とする。次に、変換式（２）の１次微分（傾き）ｙ’＝ｆ’（ｘ）を求める。さらに、変換式（２）の２次微分ｙ”＝ｆ（ｘ）を求める。そして、２次微分が０となる変曲点ｘ０を求める。変曲点ｘ０における傾きｆ’（ｘ０）から各点での引き伸ばし率ｆ’（ｘ）／ｆ”（ｘ０）を求める。波形データの各点での輝度値を引き伸ばし率ｆ’（ｘ）／ｆ”（ｘ０）で割る。これにより、波形データの両端に近い領域においてピークの高さが低減され、図１３（ｃ）に示すように、ピークの面積が軸合わせ前と等しくなるように補正される。
【０１６９】
このようにして、軸合わせおよび濃度調整を行うことにより、ゲルの違いによるバンドの移動度の差を補正することが可能となり、異なるゲル間においても波形データを標準化することが可能となる。
【０１７０】
なお、上記においては、図１１に示すように、各ゲル上のＤＮＡサイズマーカのバンドの泳動距離をｘとするとともにＤＮＡサイズの対数値をｙとして上記の変換式（２）に基づいて最小二乗法によりパラメータｍ１〜ｍ５を求める場合について説明したが、波形データの標準化のための変換式は泳動距離とＤＮＡサイズとの関係を近似することができれば、任意の変換式を用いることができる。例えば、平方根、立方根、整関数等を含む式を変換式として用いてもよい。
【０１７１】
上記のようにしてＤＮＡサイズマーカの波形データの軸合わせおよび濃度調整を行った後、ゲルＡおよびゲルＢ上のレーン２〜７，９〜１４の各プライマーの波形データについても、上記と同様の方法により、各ゲルについて求めたパラメータｍ１〜ｍ５を用いて変換式（２）により軸合わせおよび濃度調整を行う。それにより、異なるゲルを用いて電気泳動を行ったプライマーの全ての波形データを標準化することができる。
【０１７２】
なお、上記のような波形データの標準化は、解析用コンピュータ３（図１）により行う。
【０１７３】
図１４（ａ）は図１０（ａ）に示すゲルＡ上で電気泳動させた６種類のプライマー（レーン２〜７）の波形データを示す図である。また、図１４（ｂ）はゲルＢ上で電気泳動させた６種類のプライマー（レーン９〜１４）の波形データを示す図である。なお、波形データにおけるピークの高さはバンド強度に相当する。
【０１７４】
上記のような波形データの補正を行った後、図２に示すように、複数のプライマーについての波形データを連結する（ステップＳ５）。例えば、上記のようにして作成した図１４（ａ）に示すレーン２〜７の各プライマーの波形データを連結し、サンプルの微生物の波形データとする。同様に、図１４（ｂ）に示すレーン９〜１４の各プライマーの波形データを連結し、サンプルの微生物の波形データとする。
【０１７５】
なお、図１の微生物識別装置の解析用コンピュータ３において、このようにして作成されたサンプルの微生物の波形データは、後述するように、データ格納部４（図１）に格納されたデータベース中の微生物の波形データとの比較に用いられる。
【０１７６】
次に、上記のようにして作成したサンプルの微生物の波形データに基づいてサンプルの微生物の識別・同定を行う方法について説明する。
【０１７７】
図１５（ａ）はサンプルの微生物に図２に示すステップＳ１およびステップＳ２の工程により得られた電気泳動像の一例を示す図である。
【０１７８】
なお、図１５（ａ）において、レーン１はＤＮＡサイズマーカＭの電気泳動像を示しており、レーン２はプライマーｐ０１における電気泳動像を示しており、レーン３はプライマーｐ０３における電気泳動像を示しており、レーン４はプライマーｐ０４における電気泳動像を示しており、レーン５はプライマーｐ０６における電気泳動像を示しており、レーン６はプライマーｐ０７における電気泳動像を示している。
【０１７９】
図１５（ｂ）は、図１５（ａ）に示す各プライマーｐ０１，ｐ０３，ｐ０４，ｐ０６，ｐ０７について、図２に示すステップＳ３からステップＳ５の工程により得られた波形データを示す図である。図１５（ｂ）に示すように、各プライマーｐ０１，ｐ０３，ｐ０４，ｐ０６，ｐ０７の波形データが連結されて１つの波形データが作成されている。
【０１８０】
続いて、図２に示すように、解析用コンピュータ３（図１）を用いて、サンプルの微生物の波形データ（図１５（ｂ））に基づいて、データベース格納部４のデータベースを検索する（ステップＳ６）。
【０１８１】
以下に、データベース検索（ステップＳ６）の詳細について、順を追って説明する。
【０１８２】
図１に示すように、微生物識別装置のデータベース格納部４のデータベースには、生化学検査等により同定された複数の微生物の各々に関して、ＳＳＣ−ＰＣＲのデータ、例えば、複数のプライマーについての波形データおよび電気泳動像の画像データが登録されている。
【０１８３】
データベースに登録されている微生物の波形データの一例を図１６（ａ）に示す。図１６（ａ）においては、Escherichia coli（大腸菌）（以下、E.coliと略記する）およびBacillus subtilis （枯草菌）（以下、B.sub と略記する）についてのプライマーｐ０１〜ｐ０７に関する波形データが示されている。
【０１８４】
データベース格納部４には、上記に示すE.coli（大腸菌）およびB.sub （枯草菌）以外の微生物についても、上記のような波形データが登録されている。
【０１８５】
図１６（ｂ）は、サンプルの微生物の波形データとの比較のために、データベース格納部４に格納されているE.coli（大腸菌）、B.sub （枯草菌）およびStaphylococcus aureus （黄色ブドウ球菌）（以下、S.aur と略記する）の波形データからプライマーｐ０１，ｐ０３，ｐ０４，ｐ０６，ｐ０７に関する波形データを抽出して連結したものである。
【０１８６】
なお、データベースに一部のプライマーのデータがなかった場合には、ピークなしの波形データとして連結された波形データを作成するか、あるいはサンプルと同じピークを補って連結された波形データを作成する。前者のようにピークなしの波形データとして連結された波形データを作成する場合においては、後述の相関係数が小さくなる。一方、後者のようにサンプルと同じピークを補って連結された波形データを作成する場合においては、後述の相関係数が大きくなる。
【０１８７】
図１６（ｂ）に示すE.coli（大腸菌）、B.sub （枯草菌）およびS.aur （黄色ブドウ球菌）以外のデータベースに登録されている複数の微生物についても、それぞれ図１６（ｂ）に示すような連結された波形データを作成する。
【０１８８】
さらに、図１７に示すように、上記において作成した図１５（ａ）に示すサンプルの微生物の波形データと、図１６（ａ）に示すようなデータベース格納部４に格納されている複数の既知の微生物の波形データとを比較し、両者の相関関係を調べる。
【０１８９】
ここでは、一例として、サンプルの微生物の波形データとE.coli（大腸菌）、B.sub （枯草菌）およびS.aur （黄色ブドウ球菌）の波形データとを比較した場合について説明する。
【０１９０】
図１７に示すように、サンプルの微生物の波形データとE.coli（大腸菌）、B.sub （枯草菌）およびS.aur （黄色ブドウ球菌）の波形データとを比較してサンプルの微生物の波形データと各微生物の波形データとの相関係数を計算する。この例では、E.coli（大腸菌）との間の相関係数は０．５６８となり、B.sub （枯草菌）との間の相関係数は０．３６８となり、S.aur （黄色ブドウ球菌）との間の相関係数は０．１２１となる。相関係数が１に近いほど相関関係が高い。
【０１９１】
したがって、波形データより求めた相関係数から、サンプルの微生物はE.coli（大腸菌）である確率が最も高い。このように、サンプルの微生物の波形データとデータベース格納部４に格納された各微生物の波形データとを比較することにより、サンプルの微生物を識別することが可能となる。なお、このような相関係数の計算は、解析用コンピュータ３（図１）を用いて行う。
【０１９２】
最後に、図２に示すように、結果表示手段５（図１）により、微生物の名称を相関係数の高い順に検索結果として表示する（ステップＳ７）。
【０１９３】
なお、必要に応じて以下の工程（ステップＳ８）を設けてもよい。
例えば、図２に示すように、画像データの比較等による確認の工程を設けてもよい。この工程においては、検索結果として表示された微生物がサンプルの微生物と同一であること、あるいはサンプルを構成する微生物の１つであることを以下のような方法により確認する。
【０１９４】
例えば、サンプルの微生物の電気泳動像の画像データを読み出すとともに、検索された微生物の電気泳動像の画像データをデータベース格納部４から読み出し、両者の電気泳動像の画像データの比較を行ってもよい。また、サンプルの微生物の波形データと検索された微生物の波形データとの相関図を表示することにより、両者の相関の状態を調べてもよい。これらの方法により、検索結果の確認を行うことが可能となる。
【０１９５】
また、データベースへの登録工程を設けてもよい。この工程は、単一の微生物をサンプルに用いて波形データの検索を行った結果、データベースに同じ微生物の波形データが存在しないことが明らかとなった場合に、このサンプルの微生物に関する波形データを新たにデータベース格納部４のデータベースに登録するものである。それにより、検索可能な微生物の範囲がより広がる。
【０１９６】
また、パラメータ等を変更して再び検索を行う工程を設けてもよい。この工程においては、例えば、データベース検索の工程（ステップＳ６）において説明した相関係数の計算方法を変更し、再検索を行う。それにより、サンプルの微生物に適した検索を行って結果を得ることができる。
【０１９７】
ここで、サンプルに単一の微生物を用いて１種類の微生物が検索された場合においては、サンプルの微生物の波形データと検索された微生物の波形データとの間の不一致ピークが、サンプルの微生物と検索された微生物との区別を可能にする多型（異なる性質）に相当する可能性がある。一方、サンプルが複数の微生物の混合物である場合、サンプルの微生物の波形データと検索された微生物の波形データとの間の不一致ピークは、データベースに登録されていない微生物のバンドである可能性が高い。このように、不一致ピークはサンプルの微生物に関する重要な情報となり得るので、データとして残すことが好ましい。
【０１９８】
なお、上記においては、各プライマーにおける波形データを連結して１つの波形データを作成しているが、各プライマーにおける波形データを個々に比較してもよい。この場合においては、各プライマーについて相関係数を求めるとともに、求められた各相関係数の平均を求めてサンプルの微生物を識別する。
【０１９９】
以上のような本発明に係る微生物識別方法によれば、単一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群のいずれをサンプルとして用いる場合においても、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可能となる。
【０２００】
特に、微生物群をサンプルとして用いる場合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時に識別し、さらに同定することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。この方法によれば、１００種類程度の微生物を同時に識別することが可能となる。
【０２０１】
一方、単一の微生物をサンプルとして用いる場合においては、サンプルの微生物とデータベースの微生物との多型を検出することも可能となる。また、サンプルの微生物と類似した微生物を見い出すこともできる。
【０２０２】
ここで、この微生物識別方法においては、ＳＳＣ−ＰＣＲによりサンプルの微生物（または微生物群）のＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。この方法によれば、混在する多数の微生物を数時間で識別することが可能となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になる。また、このような方法においては、単離が困難な微生物の識別および同定も可能になる。さらに、ＳＳＣ−ＰＣＲは塩基配列が未知のサンプルに対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなくサンプルの微生物の識別および同定を行うことができる。
【０２０３】
したがって、この微生物識別方法は全ての微生物に適用可能であり、さらに、この方法によれば、微生物の種の違いだけでなく、株の違いまで検出することが可能となる。
【０２０４】
さらに、この微生物識別方法においては、複数のプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ反応を行い、複数のＰＣＲ反応の結果を用いて分析を行うため、諸条件によって個々のＰＣＲ反応が良好に進まない場合においても、個々のＰＣＲ反応の影響は小さい。このため、良好な分析を安定して行うことが可能となる。
【０２０５】
例えば、上記の微生物識別方法を生ごみ処理機の処理槽内または土壌中から採取した複数の微生物に適用することにより、生ごみ処理機の処理槽内または土壌中の微生物を同定することができる。また、この結果にしたがって生ごみ処理機の処理槽の条件を変えることにより、生ごみの処理を良好に行えるとともに良好な肥料を作製することができる。
【０２０６】
実際に生ゴミ処理機の菌叢に本発明に上記の微生物識別方法を適用した結果、生ゴミ処理機には約４０種類の微生物が存在して菌叢を構成しており、この菌叢は経時的に変化することが明らかとなった。また、処理状態が良好な生ゴミ処理機においては２０〜３０種類の微生物が処理槽内に定着することが明らかとなった。
【０２０７】
さらに、このような微生物識別方法は、水銀、砒素、ダイオキシン、環境ホルモン等の有害な汚染物質に汚染された土壌、食品等の発見、およびこれらの汚染状態を知るのに有効である。すなわち、この微生物識別方法により検索された微生物の中に汚染物質に関係のある微生物が含まれている場合には、微生物を採取した土壌等にこの汚染物質が含まれる可能性が示唆される。また、汚染物質に関係のある微生物の存在の程度により、汚染状態が示唆される。
【０２０８】
大便・唾液・たんなどからの病原性細菌の検出、水質浄化設備などの移動状況の把握なども可能である。
【０２０９】
図１８は図１の解析用コンピュータ３として用いられるパーソナルコンピュータの構成を示すブロック図である。
【０２１０】
図１８のパーソナルコンピュータは、ＣＰＵ（中央演算処理装置）３１０、ディスプレイ３２０、入力装置３３０、ＲＯＭ（リードオンリメモリ）３４０、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）３５０、記録媒体駆動装置３６０、スキャナ３７０および外部記憶装置３８０を備える。
【０２１１】
ディスプレイ３２０は、液晶表示パネル、ＣＲＴ（陰極線管）等からなり、図１の結果表示手段５として用いられる。入力装置３３０は、キーボード、マウス等からなり、各種データおよび各種指令を入力するために用いられる。ＲＯＭ３４０にはシステムプログラムが記憶される。
【０２１２】
記録媒体駆動装置３６０は、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、フロッピィディスクドライブ等からなり、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピィディスク等の記録媒体３９０に対してデータの読み書きを行う。記録媒体３９０には、図２の微生物識別方法におけるステップＳ２〜Ｓ８の処理を行う微生物識別プログラムが記録されている。
【０２１３】
スキャナ３７０はＣＣＤカメラにより撮影された電気泳動像を画像データとして入力し、外部記憶装置３８０に格納する。スキャナ３７０は図１の電気泳動イメージ入力部２として働く。
【０２１４】
外部記憶装置３８０は、ハードディスク装置等からなり、記録媒体駆動装置３６０を介して記録媒体３９０から読み込まれた微生物識別プログラムを記憶する。また、外部記憶装置３８０は、上記のデータベースを記憶する。図１のデータベース格納部４は外部記憶装置３６０により構成される。ＣＰＵ３１０は、外部記憶装置３８０に記憶された微生物識別プログラムをＲＡＭ３５０上で実行する。
【０２１５】
なお、微生物識別プログラムを記録する記録媒体３９０として、ＲＯＭ等の半導体メモリ、ハードディスク等の種々の記録媒体を用いることができる。また、微生物識別プログラムを通信回線等の通信媒体を介して外部記憶装置３６０にダウンロードし、ＲＡＭ３５０上で実行してもよい。この場合、通信媒体が記録媒体に相当する。
【０２１６】
本実施の形態では、図１のＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１が増幅手段に相当し、電気泳動イメージ入力部２が画像データ変換手段に相当し、解析用コンピュータ３が波形データ生成手段、相関関係作成手段および識別手段を構成する。
【０２１７】
なお、データベース格納部４に格納されるデータベースは、照合対象となる微生物について図２のステップＳ１〜Ｓ４の処理を行うことにより作成される。
【０２１８】
本実施の形態では、データベース格納部４に電気泳動像の輝度分布を示す波形データが格納されているが、データベース格納部４に電気泳動像の輝度分布におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積を示すデータを格納してもよい。この場合には、解析用コンピュータ３がデータベース格納部４に格納された電気泳動像の輝度分布におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積を示すデータに基づいて電気泳動像の輝度分布を示す波形データを作成し、サンプルの微生物についての電気泳動像の輝度分布を示す波形データと比較して相関係数を計算する。例えば、データベース格納部４に格納された電気泳動像の輝度分布におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積に基づいて個々のピークをガウス関数、デルタ関数、矩形等で表現する。
【０２１９】
また、データベース格納部４に電気泳動像を示す画像データを格納してもよい。この場合には、解析用コンピュータ３がデータベース格納部４に格納された電気泳動像の画像データに基づいて電気泳動像の輝度分布を示す波形データを作成し、サンプルの微生物についての電気泳動像の輝度分布を示す波形データと比較して相関係数を計算する。
【０２２０】
一般的に、電気泳動法としては、大きく分けて２種類の方法が知られている。アガロースゲル等の平板ゲルを用いる方法と、ゲルを詰めた細管（キャピラリ）を用いる方法とがある。ＤＮＡ断片の分離の原理は、いずれの方法でも同じであり、大きな分子はゲル内を移動しにくく、小さな分子ほど移動しやすいことを利用している。
【０２２１】
平板ゲル法では、一定時間の電気泳動後のＤＮＡ断片の移動距離を画像データから測定するのに対して、細管法では、ＤＮＡ断片が一定距離の細管を通って出てくるまで、あるいは細管中で一定距離を移動するまでの時間をセンサを用いて測定している。なお、平板ゲルを用いてＤＮＡ断片が一定距離を移動する時間をセンサにより測定する場合もあり、あるいは細管に沿ってセンサを並べておいてＤＮＡ断片の一定時間の移動距離を測定することも可能である。
【０２２２】
図１９は細管型の電気泳動装置を用いた微生物識別装置を示すブロック図である。図１９の微生物識別装置が図１の微生物識別装置と異なるのは、電気泳動イメージ入力部２の代わりに電気泳動・信号検出装置２ａが設けられている点である。電気泳動・信号検出装置２ａは、細管型の電気泳動装置を含む。この電気泳動・信号検出装置２ａでは、例えばＤＮＡ断片を蛍光色素で染色し、ゲルを詰めた細管に、その色素を励起させる波長の光を発光する発光部とその光を受光する受光部とを対応させて設けることにより、電気泳動法を実行している最中に受光部からＤＮＡ断片の移動に応じた出力信号を得ることができる。
【０２２３】
図２０は図１９の電気泳動・信号検出装置２ａにより得られるセンサ出力波形の一例を示す図である。図２０の横軸は、ＤＮＡ断片の移動時間であり、縦軸はセンサの信号強度である。マーカー１および２は、標準化のために用いられる。ＤＮＡ断片１〜４は増幅されたＤＮＡ断片である。センサの信号強度を示す波形データを標準化することにより、図１の微生物識別装置と同様の方法で微生物の識別を行うことができる。
【０２２４】
以下の実施例では、平板ゲルを用いて電気泳動を行った結果を画像データとして採取し、その画像データを波形データに加工したが、図１９の微生物識別装置を用いる場合には、細管型の電気泳動装置から直接波形データを得ることができる。
【０２２５】
【実施例】
［実施例１］
実施例１においては、以下に示す１６種類の細菌についてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行い、得られた結果に基づいて波形データを作成した。さらに、この１６種類の細菌の波形データを検索用の波形データとしてデータベースに登録した。以下に、詳細について説明する。
【０２２６】
１．データベースの作成
▲１▼１６種類の細菌のＤＮＡ分析
ここでは、まず表２に示す１６種類の細菌を用意するとともに、各細菌の染色体ＤＮＡを調製してＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製を行った。
【０２２７】
【表２】
【０２２８】
なお、各細菌の染色体ＤＮＡはCurrent Protocols in Molecular Biology (published by Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience) の2.4.1 〜2.4.2 に記載の“Preparation of Genomic DNA from Bacteria”の方法に従って調製した。
【０２２９】
次に、上記のようにして調製した反応溶液を用いて、PE Applied Biosystemの PCR System 9700および三洋電機株式会社製ＤＮＡ増幅器ＭＩＲ−Ｄ４０により、以下に示すＳＳＣ−ＰＣＲ法で各細菌についてＤＮＡ分析を行った。
【０２３０】
本実施例のＳＳＣ−ＰＣＲ法においては、１６種類のプライマー（配列番号１〜１６）を用いた。なお、以下においては、配列番号１のプライマーをＰ０１、配列番号２のプライマーをＰ０２と表し、以下、配列番号３から配列番号１６のプライマーまでを同様にしてＰ０３〜Ｐ１６と表すものとする。
【０２３１】
本実施例のＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いた反応溶液の組成を表３に示す。
【０２３２】
【表３】
【０２３３】
表３において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのＴｒｉｓは、Tris(hydroxymethyl)aminomethane の略である。ｄＮＴＰｍｉｘはｄＡＴＰ(2--デオキシアデノシン-5--三燐酸）、ｄＣＴＰ(2--デオキシシチジン- 5-- 三燐酸) 、ｄＧＴＰ(2--デオキシグアノシン-5--三燐酸) 、ｄＴＴＰ(2--デオキシチミジン-5--三燐酸) の等濃度混合溶液である。反応溶液量は２０μＬとした。
【０２３４】
ここでは、１６種類の細菌の各々について、プライマーとして配列番号１〜１６の各プライマー（Ｐ０１〜Ｐ１６）をそれぞれ含む１６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を同時に調製した。また、配列番号１のプライマー（Ｐ０１）とこれに対応する塩基配列を有する鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液をポジティブコントロールとして、また、配列番号１のプライマー（Ｐ０１）を含むがＤＮＡを含まない反応溶液をネガティブコントロールとして各細菌の１６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液と同時に調製した。
【０２３５】
次に、１６種類の細菌の各々について、上記のようにして調製した１６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を図４に示すＤＮＡ断片増幅装置の孔部５１にそれぞれ収納するとともに、孔部５１ａおよび孔部５１ｂにネガティブコントロールおよびポジティブコントロールをそれぞれ収納した。このＤＮＡ断片増幅装置を用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行った。ＳＳＣ−ＰＣＲのサイクルを表４に示す。
【０２３６】
【表４】
【０２３７】
続いて、ＳＳＣ−ＰＣＲ後の反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの１０μＬを１％アガロースゲル電気泳動法で分析した。電気泳動条件は、３．６Ｖ／ｃｍ定電圧とした。また、この場合においては、増幅されたＤＮＡ断片のバンドサイズを測定するために、濃度が既知で定量可能なＤＮＡサイズマーカ（ニッポンジーン株式会社製Smart Ladder）を反応溶液と同時に電気泳動させた。
【０２３８】
電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色し、波長２５４ｎｍの紫外線を照射したときのエチジウムブロマイド蛍光像をポラロイドカメラまたはＣＣＤカメラで撮影した。
【０２３９】
▲２▼各プライマーについての波形データの生成
次に、１６種類の細菌の各々について、電気泳動写真をスキャナでコンピュータに取込んだ後、電気泳動像の画像データから、ソフトウェア（Genomic Solutions Advanced Quantifier 1-D Match ）を用いて、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示す波形データ、各プライマーについての電気泳動像の輝度分布を示す波形データ、ポジティブコントロールについての電気泳動像の輝度分布を示す波形データおよびネガティブコントロールについての電気泳動像の輝度分布を示す波形データを生成した。
【０２４０】
ここでは、ネガティブコントロールの電気泳動像においてバンドが検出されなかった。このことから、現れたバンドはサンプルとして用いた細菌由来のものであることが確認できた。
【０２４１】
この場合においては、行っていないが、電気泳動像の歪みを補正するためにアフィン変換を行ってもよい。
【０２４２】
また、ポジティブコントロールのバンドの発光強度をもとにして他のバンドの発光強度を補正してもよい。例えば、測定したポジティブコントロールのバンドの発光強度が７０％であった場合、このバンドの発光強度が１００％になるように補正するとともに、他のバンドの発光強度も同様の割合で補正する。これにより、ＤＮＡ断片増幅反応時における反応条件等の誤差がＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響を除去することができる。
【０２４３】
また、各々の電気泳動像の画像データにおいて、測定により求めたＤＮＡサイズマーカの１０００ｂｐのバンドの発光強度が１００％になるような割合で補正するとともに、他のバンドの発光強度についても同様の割合で補正を行ってもよい。このように画像データの階調の補正を行うことにより、各々の画像データにおける階調の誤差を除去することができる。
【０２４４】
▲３▼各プライマーについての波形データの補正
各プライマーについての波形データに対して図２に示した波形データの補正（ステップＳ４）を行った。ここでは、図８のステップＳ４−１の背景むらの補正ならびにステップＳ４−４の軸合わせおよび濃度調整を行った。
【０２４５】
なお、前述のように、この場合においては、電気泳動像の画像データの各バンドについてポジティブコントロールのバンドの発光強度をもとにして他のバンドの発光強度を補正することは行わず、また、ＤＮＡサイズマーカの発光強度による補正は行わなかった。
【０２４６】
▲４▼各プライマーについての波形データの連結
細菌ごとに１６種類のプライマーＰ０１〜Ｐ１６についての波形データをデータベースに登録した。そして、細菌ごとに１６種類のプライマーＰ０１〜Ｐ１６についての波形データを連結した。細菌ごとの１６種類のプライマーＰ０１〜Ｐ１６についての連結された波形データを図２１に示す。
【０２４７】
２．単離した単一細菌をサンプルとして用いた場合のデータ検索
ここでは、単一細菌をサンプルとしてを用いた検索をテストするために、単離した細菌E.coli（大腸菌）について前述のＳＳＣ−ＰＣＲを行ってＤＮＡの分析を再度行い、１６種類のプライマーＰ０１〜Ｐ１６について得られたサンプルの波形データを連結した。
【０２４８】
サンプルの細菌の１６種類のプライマーＰ０１〜Ｐ１６についての連結された波形データを図２２に示す。
【０２４９】
３．相関係数の計算
この場合においては、図２３に示すように、サンプルから作成した波形データとデータベースから作成した１６種類の細菌についての波形データとを比較し、相関係数を次式により求めた。
【０２５０】
Ｒa,s ＝Σａn ・Ｓn ／｛√(Σａn 2)√(ΣＳn 2)｝
ここで、Ｒa,s はデータベース中の微生物ａとサンプルＳの相関係数、ａn はデータベース中の微生物の波形データのｎポイント目の輝度値、Ｓn はサンプルＳの微生物の波形データのｎポイント目の輝度値である。
【０２５１】
なお、相関係数の計算は、本発明者がMicrosoft Visual Basicで作成したソフ３トウェアを用いて行った。上記のようにして相関係数を計算したところ、細菌E.coli K12Ga（大腸菌）の相関係数が最も１に近かった。このように、サンプルの細菌をデータベースから検索することが可能であった。
【０２５２】
［実施例２］
次に、実施例２においては、実施例１と同様の方法によりEscherichia coli K12 (E.coli K12)およびSalmonella enteritidis GTC 131 (S.enteritidis GTC 131)を含む混合サンプルおよび４種類の細菌について配列番号１７のプライマー（プライマーＡ８７）を用いてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行った。ここで、プライマーＡ８７の塩基配列は、AAGTCGTTTGGGである。
【０２５３】
得られた結果に基づいて波形データを作成した。４種類の細菌の波形データを検索用の波形データとしてデータベースに登録した。
【０２５４】
さらに、混合サンプルの波形データとデータベースに登録された図２４に示す４種類の細菌の波形データＤ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４との相関係数を求めた。図２４には、混合サンプルの波形データＳ、Escherichia coli K12の波形データＤ１、Salmonella enteritidis GTC 131の波形データＤ２、Vibrio chorelae GTC 37の波形データＤ３およびBacillus subtilis ATCC 6051の波形データＤ４が示される。
【０２５５】
本実施例では、まず、次式（１）によりノーマル相関係数を算出した。
【０２５６】
【数７】
【０２５７】
上式（１）において、ＮＣはノーマル相関係数であり、Ｓiはサンプルに含まれる細菌の波形データのｉポイント目の輝度値、ａiはデータベースに登録された波形データのｉポイント目の輝度値である。また、ｎは各波形データのポイント数である。
【０２５８】
また、以下に示す方法により算出されるクリッピング信号を用いて相関係数を算出した。クリッピング信号を用いて算出される相関係数をクリッピング相関係数と呼ぶ。
【０２５９】
図２５は混合サンプルの波形データとEscherichia coli K12の波形データとのクリッピング信号の算出方法を説明するための図である。
【０２６０】
図２５（ａ）はEscherichia coli K12およびSalmonella enteritidis GTC 131を含む混合サンプルの波形データＳを示し、図２５（ｂ）はEscherichia coli K12の波形データＤ１を示す。図２５（ａ）の波形データＳおよび図２５（ｂ）の波形データＤ１を重ね合わせると、図２５（ｃ）のようになる。
【０２６１】
次に、ＣＳi＝ｍｉｎ(Ｓi,Ｄ１i)によりクリッピング信号ＣＳを求める。ここで、Ｓiは波形データＳのｉポイント目の輝度値、Ｄ１iは波形データＤ１のｉポイント目の輝度値である。ｉは任意の整数である。また、ｍｉｎ(Ｓi,Ｄ１i)は波形データＳのｉポイント目の輝度値および波形データＤ１のｉポイント目の輝度値のうち低い方の輝度値を選択することを意味する。ＣＳiはクリッピング信号ＣＳのｉポイント目の輝度値である。このようにして求めたクリッピング信号ＣＳを図２５（ｄ）に示す。
【０２６２】
図２６は混合サンプルの波形データとSalmonella enteritidis GTC 131の波形データとのクリッピング信号の算出方法を説明するための図である。
【０２６３】
図２６（ａ）はEscherichia coli K12およびSalmonella enteritidis GTC 131を含む混合サンプルの波形データＳを示し、図２６（ｂ）はSalmonella enteritidis GTC 131の波形データＤ２を示す。図２６（ａ）の波形データＳおよび図２６（ｂ）の波形データＤ２を重ね合わせると、図２６（ｃ）のようになる。
【０２６４】
次に、ＣＳi＝ｍｉｎ(Ｓi,Ｄ２i)によりクリッピング信号ＣＳを求める。ここで、Ｓiは波形データＳのｉポイント目の輝度値、Ｄ２iは波形データＤ２のｉポイント目の輝度値である。また、ｍｉｎ(Ｓi,Ｄ２i)は波形データＳのｉポイント目の輝度値および波形データＤ２のｉポイント目の輝度値のうち低い方の輝度値を選択することを意味する。ＣＳiはクリッピング信号ＣＳのｉポイント目の輝度値である。このようにして求めたクリッピング信号ＣＳを図２６（ｄ）に示す。
【０２６５】
次に、次式（２）によりクリッピング相関係数を算出した。
【０２６６】
【数８】
【０２６７】
上式（２）において、ＣＣはクリッピング相関係数であり、ＣＳiはクリッピング信号のｉポイント目の輝度値、ａiはデータベースに登録された波形データのｉポイント目の輝度値である。また、ｎは各波形データのポイント数である。
【０２６８】
ここでは、図２５（ｂ）のEscherichia coli K12の波形データＤ１および図２５（ｄ）のクリッピング信号ＣＳを用いて上式（２）から混合サンプルの波形データＳとEscherichia coli K12の波形データＤ１とのクリッピング相関係数ＣＣを求めた。また、図２６（ｂ）のSalmonella enteritidis GTC 131の波形データＤ２および図２６（ｄ）のクリッピング信号ＣＳを用いて上式（２）から混合サンプルの波形データＳとSalmonella enteritidis GTC 131の波形データＤ２とのクリッピング相関係数ＣＣを算出した。
【０２６９】
比較のために、同様の方法で混合サンプルの波形データＳと図２４のVibrio chorelae GTC 37の波形データＤ３とのクリッピング相関係数ＣＣを算出し、混合サンプルの波形データＳと図２４のBacillus subtilis ATCC 6051の波形データＤ４とのクリッピング相関係数ＣＣを算出した。
【０２７０】
表５に混合サンプルの波形データＳとEscherichia coli K12の波形データＤ１、Salmonella enteritidis GTC 131の波形データＤ２、Vibrio chorelae GTC 37の波形データＤ３およびBacillus subtilis ATCC 6051の波形データＤ４とのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣの算出結果を示す。
【０２７１】
【表５】
【０２７２】
表５に示すように、混合サンプルの波形データＳとEscherichia coli K12の波形データＤ１とのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣならびに混合サンプルの波形データＳとSalmonella enteritidis GTC 131の波形データＤ２とのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣは、混合サンプルの波形データＳとVibrio chorelae GTC 37の波形データＤ３とのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣならびに混合サンプルの波形データＳとBacillus subtilis ATCC 6051の波形データＤ４とのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣに比べて高くなっている。
【０２７３】
この結果から、混合サンプルには、Escherichia coli K12およびSalmonella enteritidis GTC 131が含まれていることがわかる。
【０２７４】
また、クリッピング相関係数ＣＣはノーマル相関係数ＮＣに比べて高くなっている。例えば、例えば、０．５のクリッピング相関係数ＣＣを判定のしきい値とすることにより、混合サンプルに含まれている異なる種類の細菌の各々を高精度で識別することができる。
【０２７５】
［実施例３］
次に、実施例３においては、実施例１と同様の方法により６種類の細菌についてプライマーＡ８７を用いてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行った。得られた結果に基づいて波形データを作成した。６種類の細菌の波形データを検索用の波形データとしてデータベースに登録した。さらに、データベースに登録された図２７に示す６種類の細菌の波形データＥ１〜Ｅ６同士のノーマル相関係数およびクリッピング相関係数を求めた。
【０２７６】
図２７には、Escherichia coli K12の波形データＥ１、Escherichia coli GTC 837 (EAggEC)の波形データＥ２、Escherichia coli GTC 1062 (ETEC)の波形データＥ３、Salmonella enteritidis GTC 131 の波形データＥ４、Vibrio chorelae GTC 37の波形データＥ５およびBacillus subtilis ATCC 6051の波形データＥ６が示される。ここで、Escherichia coli（大腸菌）の後のK12 、GTC 837およびGTC 1062は異なる株を表している。
【０２７７】
図２８に上記の６種類の細菌の波形データＥ１〜Ｅ６同士のノーマル相関係数およびクリッピング相関係数の算出結果を示す。図２８の横軸は、Escherichia coli K12 (E.coli K12)、Escherichia coli GTC 837 (E.coli GTC 837)、Escherichia coli GTC 1062 (E.coli GTC 1062)、Salmonella enteritidis GTC 131 (S.enteritidis GTC 131)、Vibrio chorelae GTC 37 (V.chorelae GTC 37)およびBacillus subtilis ATCC 6051 (B.subtilis ATCC 6051)であり、棒グラフは横軸の各細菌の波形データと６種類の細菌の波形データＥ１〜Ｅ６とのノーマル相関係数およびクリッピング相関係数を示す。例えば、黒で塗りつぶされた棒グラフは、Escherichia coli K12の波形データＥ１と６種類の細菌の波形データＥ１〜Ｅ６とのノーマル相関係数およびクリッピング相関係数を示す。
【０２７８】
同じ細菌の波形データ同士のノーマル相関係数およびクリッピング相関係数は、いずれも１．０となっている。
【０２７９】
また、Escherichia coliの異なる株の波形データ同士のクリッピング相関係数は０．５以上となっている。これに対して、Escherichia coliの各株の波形データとSalmonella enteritidis GTC 131、Vibrio chorelae GTC 37およびBacillus subtilis ATCC 6051の波形データとのノーマル相関係数およびクリッピング相関係数は低くなっている。したがって、大腸菌の各株を識別することができるとともに、大腸菌とサルモネラ菌、ビブリオ菌および枯草菌とを区別することができる。
【０２８０】
［実施例４］
次に、実施例４においては、実施例１と同様の方法によりEscherichia coli（大腸菌）の６種類の株についてプライマーＡ８７を用いてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行った。得られた結果に基づいて波形データを作成した。６種類の株の波形データを検索用の波形データとしてデータベースに登録した。
【０２８１】
図２９には、Escherichia coliの６種類の株JCM1649、IFO 3301 (K12)、BL21、GIFU 11097 (EIEC)、GTC 1062(ETEC) およびGTC 1059 (EHEC)の波形データを示す。
【０２８２】
また、図２９に示すように、データベースに登録されたEscherichia coliの６種類の株の波形データを混合することによりEscherichia coliの６種類の株が混合された波形データを作成し、検索用の波形データとしてデータベースに登録した。
【０２８３】
さらに、データベースに登録されたEscherichia coliの６種類の株が混合された波形データとデータベースに登録されたEscherichia coliの６種類の株の各々の波形データとのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣを算出した。図２９にノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣの算出結果を示す。
【０２８４】
図２９に示すように、Escherichia coliの６種類の株が混合された波形データとEscherichia coliの６種類の株の各々の波形データとのクリッピング相関係数ＣＣはほぼ１となっている。したがって、同じ大腸菌の異なる複数の株を含むサンプルから個々の株を識別することができる。
【０２８５】
また、実施例１と同様の方法により図３０に示すEscherichia coliの４種類の株のサンプルおよびShigellaの４種類のサンプルについてプライマーＡ８７を用いてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行った。得られた結果に基づいて波形データを作成した。Escherichia coliの４種類の株の波形データおよびShigellaの４種類の株の波形データを検索用の波形データとしてデータベースに登録した。
【０２８６】
図３０には、Escherichia coliの４種類の株JM109、GTC 837 (EAggEC)、IFO 3366およびIFO 13500の波形データおよびShigellaの４種類の血清boydii GTC 779、flexneri GTC 780、sonnei GTC 781およびdysenteriae GTC 786の波形データが示される。ここで、Shigellaの後のboydii、flexneri、 sonneiおよびdysenteriaeは種名を表し、GTC 779、GTC 780、GTC 781およびGTC 786は株を表す。
【０２８７】
さらに、データベースに登録された図２９に示したEscherichia coliの６種類の株が混合された波形データと図３０に示したEscherichia coliの４種類の株の波形データおよびShigellaの４種類の波形データとのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣを算出した。
【０２８８】
図３０に、Escherichia coliの６種類の株が混合された波形データとEscherichia coliの４種類の株の波形データおよびShigellaの４種類の波形データとのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣの算出結果を示す。
【０２８９】
図３０に示すように、Escherichia coliの６種類の株が混合された波形データとEscherichia coliの異なる４種類の株の各々の波形データとのクリッピング相関係数ＣＣは１に近くなっている。したがって、データベースに登録された大腸菌の複数の株が混合された波形データを用いて同じ大腸菌の異なる株を検出することも可能である。
【０２９０】
また、Escherichia coliの６種類の株が混合された波形データとShigellaの４種類の各々の波形データとのクリッピング相関係数ＣＣも１に近くなっている。したがって、データベースに登録された大腸菌の複数の株が混合された波形データを用いて生物学的に近縁関係にある赤痢菌を検出することも可能である。
【０２９１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る微生物識別装置の一例を示す模式図である。
【図２】本発明に係る微生物識別方法の一例を示すフローチャートである。
【図３】図２の微生物識別方法に用いるＳＳＣ−ＰＣＲ法の一例を示すフローチャートである。
【図４】図３のＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ断片増幅装置の例を示す模式図である。
【図５】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第１のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図６】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの１回目のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図７】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの２回目のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図８】図２の微生物識別方法に用いる波形データの補正の工程を示すフローチャートである。
【図９】電気泳動像における背景むらの補正を示す模式図である。
【図１０】異なるゲルを用いた電気泳動像の例を示す図である。
【図１１】異なるゲルを用いた場合の泳動距離とＤＮＡサイズとの変換式を説明するための図である。
【図１２】電気泳動像の輝度分布を示す波形データの軸合わせを説明するための図である。
【図１３】電気泳動像の輝度分布を示す波形データの軸合わせおよび濃度調整を説明するための図である。
【図１４】図１０の電気泳動像から生成された波形データを示す図である。
【図１５】異なるプライマーを用いた電気泳動像の一例および連結された波形データの一例を示す図である。
【図１６】データベースに登録された細菌ごとの波形データおよびデータベースから抽出されて連結された波形データの一例を示す図である。
【図１７】サンプルから作成された波形データおよびデータベースから作成された波形データを示す図である。
【図１８】図１の解析用コンピュータとして用いられるパーソナルコンピュータの構成を示すブロック図である。
【図１９】細管型の電気泳動装置を用いた微生物識別装置のブロック図である。
【図２０】図１９の細管型の電気泳動装置により得られるセンサ出力波形の一例を示す図である。
【図２１】データベースから作成された連結された波形データを示す図である。
【図２２】サンプルから作成された連結された波形データを示す図である。
【図２３】データベースから作成された波形データとサンプルから作成された波形データとの比較による相関係数の計算を説明するための図である。
【図２４】実施例２における混合サンプルおよび４種類の細菌の波形データを示す図である。
【図２５】混合サンプルの波形データとEscherichia coli K12の波形データとのクリッピング信号の算出方法を説明するための図である。
【図２６】混合サンプルの波形データとSalmonella enteritidis GTC 131の波形データとのクリッピング信号の算出方法を説明するための図である。
【図２７】実施例３における６種類の細菌の波形データを示す図である。
【図２８】６種類の細菌同士のノーマル相関係数およびクリッピング相関係数の算出結果を示す図である。
【図２９】実施例４における大腸菌の６種類の株の波形データおよびこれらの波形データが混合された波形データを示す図である。
【図３０】大腸菌の４種類の株および赤痢菌の４種類の波形データを示す図である。
【符号の説明】
１ ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置
２ 電気泳動イメージ入力部
３ 解析用コンピュータ
４ データベース格納部
５ 結果表示手段
１１ ＤＮＡ
１２ａ，１２ｂ，１２ｃ，１２ｄ，１２ｅ １本鎖
１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄ，１３ｅ ２本鎖
２１ａ，２１ｂ，２１ｃ プライマー
５０ 支持プレート
５１，５１ａ，５１ｂ 孔部
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物識別方法および微生物識別装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、家庭等から排出される有機系廃棄物（いわゆる生ゴミ）等をコンポスト化（肥料化）する生ゴミ処理機が活発に研究開発されている。生ゴミ処理機では、細菌、原生動物等の微生物群が有機物を分解することにより肥料が作成される。
【０００３】
このような生ゴミ処理機によるコンポスト化では、そのコンポスト化過程（有機物分解過程）において、温度等をモニタすることによりコンポスト化の度合いを評価する。そして、その評価に基づき良質な肥料が作成されるように生ゴミ処理機の状態を調節する。
【０００４】
しかしながら、より良質な肥料を作成するためには、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物群（少なくとも微生物の種類）の情報が必要である。この微生物群の情報は、微生物により生ゴミの分解を良好に制御するためにも必要である。また、作成された肥料の添加により土壌の改良を進める上では、土壌中の微生物群の情報を知ることも重要である。
【０００５】
生ゴミ処理機内において、生ゴミに含まれる各種成分は、種類の異なる微生物が共同して分解を進めることによりコンポスト化される。それぞれの細菌はお互いに何らかの関係を維持しており、生ゴミ処理機内において全体的に１つの生態系を構成している。したがって、生ゴミ処理機内の菌叢を調べれば、生ゴミの処理状態をいち早く知ることが可能となる。例えば、活性の高い細菌が生ゴミ処理機内に多く存在するときには生ゴミの処理状態が良好であるのに対し、嫌気性細菌が多くなると生ゴミの処理が進まず、生ゴミ処理機内への空気供給が必要であることなどがわかる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来、微生物群の情報、例えば細菌群の情報を得る方法としては、細菌群に含まれる個々の細菌を単離して生化学検査する方法等が用いられる。しかし、この方法は時間がかかる上に、単離の難しい細菌については調べることが困難であった。
【０００７】
一方、ＤＮＡ分析を行うことにより微生物群の情報を得る方法も考えられる。ＤＮＡ分析を行うにはＤＮＡを増幅する必要がある。ＤＮＡを増幅する方法としてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction;ポリメラーゼ連鎖反応）法が用いられている（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，９６５，１８８号、第５，０３８，８５２号および第５，３３３，６７５号）。このＰＣＲ法は、増幅しようとするＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）の両端の塩基配列に相補な塩基配列を有するプライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、熱変性工程、アニーリング（熱処理）工程および伸長反応工程の３段階からなるサイクルを繰り返すことにより、鋳型ＤＮＡとほぼ同じＤＮＡ断片を増幅することを可能にするものである。このＰＣＲ法を用いると、微量にしか存在しない細菌の１個のＤＮＡ中の所定の断片を例えば１０万〜１００万倍に増幅することができる。
【０００８】
しかしながら、このＰＣＲ法を用いるためには、鋳型ＤＮＡの一領域の少なくとも両端の塩基配列が既知であることが必要である。したがって、従来のＰＣＲ法では、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物や土壌に存在する微生物の種類および塩基配列が知られていないと、それらの微生物のＤＮＡ断片を増幅することはできない。
【０００９】
そこで、単一のプライマーで塩基配列の情報なしに一種類のＤＮＡから同時に多数の種類のＤＮＡ断片を増幅するＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic ＤＮＡ）法もしくはＡＰ−ＰＣＲ（Arbitrarily Primed-Polymerase Chain Reaction) 法が提案されている。これらの方法では、ＰＣＲの反応時にプライマーのアニーリング温度を下げ、さらに反応液中のマグネシウムイオン濃度を上げることにより、プライマーの結合時の配列特異性を下げる。すると、プライマーはミスマッチを伴って微生物の染色体ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ断片が複製される。
【００１０】
これらのＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ法によれば、増幅しようとするＤＮＡの塩基配列の情報がなくても、単一のプライマーにより何らかのＤＮＡ断片が多量に増幅される。増幅されたＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により分離することによりＤＮＡフィンガープリントが得られる。このＤＮＡフィンガープリントを分析することにより微生物の状態を分析することが可能となる。
【００１１】
その反面、従来のＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ法を複数の微生物から構成される微生物群に適用する場合、増幅されるＤＮＡ断片の種類数が多すぎるために、増幅されたＤＮＡ断片と鋳型となった微生物との対応付けが困難となり、微生物群が形成する生態系を把握することが困難となる。また、増幅されたＤＮＡ断片から微生物群を構成する微生物を識別することはできない。
【００１２】
生ゴミ処理機は、処理槽の温度が例えば３０℃以上かつ含水率が例えば４０％となるように設定調整を行うとともに、撹拌機能を設けることで処理状態を安定に保つことができる。しかし、適切な微生物測定技術がないため、装置の小型化、悪臭防止、良質な堆肥生成などの機能向上を行うことは困難である。
【００１３】
このように、生ゴミ処理機に代表される微生物利用の商品およびシステムでは、内部で活動している微生物の状態、例えば微生物の種類や経時変化等を評価する適切な方法がないため、開発や改良を進める上で大きな障害が生じる。
【００１４】
本発明の目的は、微生物群を構成する複数の微生物を同時にかつ容易に識別することが可能な微生物識別方法および微生物識別装置を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段および発明の効果】
第１の発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、複数のプライマーを準備し、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する出力信号を得るステップと、出力信号に基づいて各プライマーに対応する波形データを求めるステップと、照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する出力信号に関する情報が予め記憶されたデータベースを検索し、データベースに記憶された情報に基づいて照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する波形データを求め、識別対象となる微生物について求められた波形データと照合対象となる微生物について求められた波形データとの相関関係を求めるステップと、相関関係に基づいて識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、相関関係を求めるステップは、識別対象となる微生物について求められた波形データの各点における信号出力値および照合対象となる微生物について求められた波形データの対応する各点における信号出力値のうち低い方の信号出力値を選択することによりクリッピング信号ＣＳを求めるステップと、クリッピング信号と照合対象となる微生物について求められた波形データとの相関係数ＣＣを次式により算出するステップとを含み、
【数４】
【００１６】
本発明に係る微生物識別方法によれば、単一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群のいずれを識別対象として用いる場合にも、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可能となる。
【００１７】
特に、微生物群を識別対象として用いる場合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時に識別し、さらに同定することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００１８】
本発明の微生物識別方法は、微生物群と微生物群の間の比較に用いることもできる。例えばある生ごみ処理機の微生物群から得られた電気泳動像の輝度分布を示す波形データと別の生ごみ処理機から得られた電気泳動像の輝度分布を示す波形データとを比較することで、個々の微生物の違いを調べなくとも両者の微生物群としての違いを見ることができる。
【００１９】
一方、単一の微生物を識別対象として用いる場合においては、識別対象となる微生物とデータベースの照合対象となる微生物との多型を検出することも可能となる。また、識別対象となる微生物と類似した微生物を見いだすこともできる。
【００２０】
ここで、この微生物識別方法においては、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００２１】
さらに、この微生物識別方法においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
【００２８】
既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて、参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、ポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより、参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、参照用プライマーを用いて増幅された参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、参照用ＤＮＡに対応する出力信号を得るステップと、参照用ＤＮＡに対応する出力信号に基づいて識別対象となる微生物に対応する出力信号を補正するステップとをさらに備えてもよい。
【００２９】
この場合、参照用プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法により、参照用ＤＮＡからＤＮＡ断片が確実に増幅される。このようにして増幅された参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データに基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応における参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の増幅効率を求めることが可能になる。このようにして求めた増幅効率は、識別対象となる微生物のＤＮＡ断片においても適用可能である。したがって、求めた増幅効率に基づいて識別対象となる微生物のＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データを補正し、ＤＮＡ断片の量を分析することが可能になる。
【００３２】
電気泳動像の画像データにおいてバンドの背景の輝度のむらを補正するステップをさらに備えてもよい。
【００３３】
データベースには複数種類の微生物についての出力信号に関する情報が記憶されてもよい。
【００４９】
出力信号に関する情報は、その出力信号の強度を示す波形データであってもよい。
【００５０】
出力信号に関する情報は、その出力信号の強度におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積を示すデータであり、相関関係を求めるステップは、出力信号の強度におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積を示すデータに基づいて出力信号の強度を示す波形データを求めるステップを含んでもよい。
【００５１】
相関関係を求めるステップは、出力信号の強度を示すデータに基づいて出力信号の強度を示す波形データを求めるステップを含んでもよい。
【００５２】
相関関係を求めるステップは、識別対象となる微生物について求められた複数のプライマーに対応する波形データを連結し、かつ照合対象となる微生物について求められた複数のプライマーに対応する波形データを連結し、識別対象となる微生物についての連結された波形データと照合対象となる微生物についての連結された波形データとの相関関係を求めるステップを含んでもよい。
【００５３】
これにより、識別対象となる微生物について求められた複数のプライマーに対応する波形データと照合対象となる微生物について求められた複数のプライマーに対応する波形データとの相関関係を容易かつ短時間に求めることができる。
【００５７】
ＤＮＡサイズマーカの出力信号を得るステップと、出力信号に基づいてＤＮＡサイズマーカに対応する出力信号の強度を示す波形データを求めるステップと、ＤＮＡサイズマーカに対応する波形データに基づいて識別対象となる微生物に対応する波形データを補正するステップとをさらに備えてもよい。
【００５８】
波形データを補正するステップは、ＤＮＡサイズマーカに対応する波形データに基づいて識別対象となる微生物に対応する波形データにおけるピークの位置を補正するステップを含んでもよい。
【００５９】
データベースには複数種類の微生物についての出力信号に関する情報が記憶されてもよい。これにより、識別対象となる種々の微生物を識別することができる。
【００６８】
第２の発明に係る微生物識別装置は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、増幅手段により複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段と、電気泳動手段により得られた各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換する画像データ変換手段と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における輝度分布を示す波形データを求める波形データ生成手段と、照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する電気泳動像に関する情報が予め記憶されたデータベースを検索し、データベースに記憶された情報に基づいて照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する電気泳動像における輝度分布を示す波形データを求め、識別対象となる微生物について求められた波形データと照合対象となる微生物について求められた波形データとの相関関係を作成する相関関係作成手段と、相関関係作成手段により作成された相関関係に基づいて識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、相関関係作成手段は、識別対象となる微生物について求められた波形データの各点における信号出力値および照合対象となる微生物について求められた波形データの対応する各点における信号出力値のうち低い方の信号出力値を選択することによりクリッピング信号ＣＳを求める手段と、クリッピング信号と照合対象となる微生物について求められた波形データとの相関係数ＣＣを次式により算出する手段とを含み、
【数５】
【００６９】
本発明に係る微生物識別装置によれば、第１の発明に係る微生物識別方法を容易に行うことができる。そのため、単一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群のいずれを識別対象として用いる場合にも、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可能となる。
【００７０】
特に、微生物群を識別対象として用いる場合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時に識別し、さらに同定することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００７１】
本発明の微生物識別装置は、微生物群と微生物群の間の比較に用いることもできる。例えばある生ごみ処理機の微生物群から得られた電気泳動像の輝度分布を示す波形データと別の生ごみ処理機から得られた電気泳動像の輝度分布を示す波形データとを比較することで、個々の微生物の違いを調べなくとも両者の微生物群としての違いを見ることができる。
【００７２】
一方、単一の微生物を識別対象として用いる場合においては、識別対象となる微生物とデータベースの照合対象となる微生物との多型を検出することも可能となる。また、識別対象となる微生物と類似した微生物を見いだすこともできる。
【００７３】
この微生物識別装置においては、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００７４】
さらに、この微生物識別装置においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
【００７５】
第３の発明に係る微生物識別装置は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、増幅手段により複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する出力信号を得る電気泳動手段と、出力信号に基づいて各プライマーに対応する波形データを求める波形データ生成手段と、照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する出力信号に関する情報が予め記憶されたデータベースを検索し、データベースに記憶された情報に基づいて照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する波形データを求め、識別対象となる微生物について求められた波形データと照合対象となる微生物について求められた波形データとの相関関係を作成する相関関係作成手段と、相関関係作成手段により作成された相関関係に基づいて識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、相関関係作成手段は、識別対象となる微生物について求められた波形データの各点における信号出力値および照合対象となる微生物について求められた波形データの対応する各点における信号出力値のうち低い方の信号出力値を選択することによりクリッピング信号ＣＳを求める手段と、クリッピング信号と照合対象となる微生物について求められた波形データとの相関係数ＣＣを次式により算出する手段とを含み、
【数６】
【００７６】
本発明に係る微生物識別装置によれば、第２の発明に係る微生物識別方法を容易に行うことができる。そのため、単一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群のいずれを識別対象として用いる場合にも、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可能となる。
【００７７】
特に、微生物群を識別対象として用いる場合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時に識別し、さらに同定することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００７８】
本発明の微生物識別装置は、微生物群と微生物群の間の比較に用いることもできる。例えばある生ごみ処理機の微生物群から得られた出力信号を示す波形データと別の生ごみ処理機から得られた出力信号を示す波形データとを比較することで、個々の微生物の違いを調べなくとも両者の微生物群としての違いを見ることができる。
【００７９】
一方、単一の微生物を識別対象として用いる場合においては、識別対象となる微生物とデータベースの照合対象となる微生物との多型を検出することも可能となる。また、識別対象となる微生物と類似した微生物を見いだすこともできる。
【００８０】
この微生物識別装置においては、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００８１】
さらに、この微生物識別装置においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
【００９２】
【発明の実施の形態】
図１は本発明に係る微生物識別装置を示す図である。
【００９３】
図１に示すように、微生物識別装置は、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１、電気泳動イメージ入力部２、解析用コンピュータ３、データベース格納部４および結果表示手段５からなる。
【００９４】
ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１については後述する。電気泳動イメージ入力部２は、例えばＣＣＤカメラおよびスキャナにより構成される。解析用コンピュータ３は、後述する構成を有するパーソナルコンピュータからなる。データベース格納部４はハードディスク装置等からなり、結果表示手段５はディスプレイ等からなる。
【００９５】
なお、ＳＳＣ−ＰＣＲとはSingle Strain Counting Polymerase Chain Reactionのことであり、特定の塩基配列を有するプライマーを複数用いて未知の塩基配列を有する微生物群または単一の微生物からＤＮＡ断片を連鎖反応的に増幅する反応のことである。なお、ＳＳＣ−ＰＣＲの詳細については後述する。
【００９６】
図２は、図１の微生物識別装置を用いた微生物識別方法の一例を示すフローチャートである。
【００９７】
図２に示すように、まず図１のＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１を用いて、後述のＳＳＣ−ＰＣＲ法により、微生物の解析実験を行う（ステップＳ１）。なお、この解析実験においては、単離した単一の微生物をサンプルとして用いてもよく、また、複数の微生物を含む微生物群をサンプルとして用いてもよい。
【００９８】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法による微生物の解析実験の詳細を図３に示す。まず、図３に示すように、微生物のＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応用バッファ溶液、プライマー、耐熱性の好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ2 および４種の基質となる５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）を所定量ずつ混合し、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する（ステップＳ１−１）。
【００９９】
なお、複数の微生物を含む微生物群をサンプルとして用いる場合においては、複数の微生物のＤＮＡが混合されたものを用いてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。
【０１００】
ここで、ＤＮＡポリメラーゼとは、４種の５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質とし、鋳型ＤＮＡに相補な塩基配列を有するＤＮＡ鎖の重合反応を触媒する酵素である。ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の重合の方向性は５’から３’の方向である。また、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼが作用するために不可欠な３’−ＯＨ基を末端に有するＤＮＡ断片（短鎖オリゴヌクレオチド）である。本発明では、特定の塩基配列および塩基長を有するプライマーを用いる。
【０１０１】
なお、後述するようにＳＳＣ−ＰＣＲ法においては複数のプライマーを用いるため、各々のプライマーについてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。なお、各ＰＣＲ用反応溶液は全て同時に調製するものとする。
【０１０２】
上記のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製と同時に、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを調製する（ステップＳ１−２）。
【０１０３】
なお、この場合においては、ＳＳＣ−ＰＣＲ法において、長さが１２塩基対（ｂｐ）のプライマーをそれぞれ用いている。それにより、各プライマーにおいては、確率的に４12（約１０7 ）に１回ＤＮＡ断片が出現するように調整することができ、一般に１本のＤＮＡの長さが約１０7 塩基対といわれている微生物ＤＮＡから１種類のＤＮＡ断片だけを増幅するように設定することができる。このため、後述するように、増幅されたＤＮＡ断片と微生物とを対応させることが可能となる。
【０１０４】
ここで、ポジティブコントロールとは、後述のＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において生じる誤差を除去するためのコントロール実験に用いる試料である。一般に、ＤＮＡ断片の増幅反応における増幅効率は、一連の工程において生じる誤差、例えばＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製時におけるＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム等の濃度の誤差、用いた試薬の活性の度合い、ＤＮＡ断片増幅時における温度の誤差等により影響を受けると考えられる。このような誤差を除去するために、ポジティブコントロールとして、増幅されるＤＮＡ断片の種類が既知で定量可能なＤＮＡ断片を増幅するプライマーと、このプライマーに相補な塩基配列を有する鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液を調製する。ポジティブコントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動法により定量することが可能である。したがって、ポジティブコントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片の量から、ＤＮＡ断片の増幅効率を求めることができる。このようにして求めた増幅効率をもとにして複数種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のＤＮＡ断片の量を補正することにより、ＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において生じる誤差の影響を除去することが可能となる。その結果、増幅されたＤＮＡ断片の量的な比較が可能となる。
【０１０５】
一方、ネガティブコントロールとは、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象とする微生物群または微生物のものであることを確認するためのコントロール実験に用いる試料である。一般に、細菌等の微生物は空気中等の様々な場所に存在する。このため、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製時において反応溶液に微生物が混入する可能性がある。微生物が反応溶液に混入した場合、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象とする微生物群由来のＤＮＡ断片かあるいは混入した微生物由来のＤＮＡ断片か判別不可能となる。そのため、ネガティブコントロールとして、プライマーを含むが鋳型ＤＮＡを含まないＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。このネガティブコントロールを用いてＳＳＣ−ＰＣＲおよび電気泳動を行い、ネガティブコントロールの電気泳動像においてはバンドが現れないことを確認する。これにより、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象である微生物群または微生物由来のものであることが確認できる。
【０１０６】
なお、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールに用いるプライマーは、前述のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液に用いたプライマーのうちの１つもしくは２つと同じ塩基配列であってもよい。
【０１０７】
上記のようにしてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製した後、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１により、ＤＮＡ断片の増幅反応を行う（ステップＳ１−３）。
【０１０８】
図４は、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１のＤＮＡ断片増幅装置の例を示す模式図である。図４のＤＮＡ断片増幅装置は、タイタプレートと呼ばれる支持プレート５０により構成される。
【０１０９】
支持プレート５０の上面に複数の孔部５１が形成されている。この場合には、複数の孔部５１に、前述のプライマーをそれぞれ含むＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液がプライマーの増幅確率の順に連続的に配置される。また、孔部５１ａには、前述のネガティブコントロールが配置され、孔部５１ｂには、前述のポジティブコントロールが配置される。
【０１１０】
このようなＤＮＡ断片増幅装置により、各ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールにおいて、以下のようなＳＳＣ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅が同時に行われる。
【０１１１】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、従来のＰＣＲ法と同様に、次の３段階の工程を繰り返し行う。ただし、ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、未知の塩基配列を有する微生物または微生物群に対して特定の塩基配列を有するプライマーを用いることにより分析可能な量のＤＮＡ断片を増幅する。
【０１１２】
（１）熱変性工程
ＤＮＡ（初期時）またはＤＮＡ断片を加熱変性し、１本鎖（ＤＮＡ鎖）にする。
【０１１３】
（２）プライマーのアニーリング工程（プライマーの結合工程）
プライマーがＤＮＡ鎖の増幅領域の端に結合するように熱処理を行う。
【０１１４】
（３）ポリメラーゼによる伸長反応工程（ポリメラーゼによる複製工程）
プライマーを起点としてポリメラーゼによって相補鎖を合成し、２本鎖化する。
【０１１５】
上記（１）〜（３）の工程を１サイクルとしてこのサイクルを繰り返し行う。第１のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で２分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程、および上記反応溶液を例えば７２℃で３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行う。なお、本サイクルの熱変性工程は、長い完全ＤＮＡを１本鎖に完全に分離するために下記サイクルの熱変性工程よりも長めに設定する。
【０１１６】
引続き、第２のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程および上記反応溶液を例えば７２℃で３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で例えば３３回繰り返す。
【０１１７】
最後に、第３のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程および上記反応溶液を７２℃で１０分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行う。なお、本サイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程は、最後に複製を完全化するために第１および第２のサイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程よりも長めに設定する。
【０１１８】
ここで、上記第１のサイクル、第２のサイクルの第１回目のサイクル、および第２のサイクルの第２回目のサイクルを図５〜図７を用いて説明する。なお、図は模式的に示しており、ＤＮＡの１本鎖等はプライマーと結合する部分の塩基配列を示している。
【０１１９】
図５〜図７では、ＧＧＣＴＴＣＧＡＡＴＣＧの塩基配列（配列番号１５）を有するプライマーを用いている。なお、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示す。
【０１２０】
図５（ａ）に示すように最初、上記反応溶液中には複数の異なる微生物に含まれていた長いＤＮＡ（完全ＤＮＡ）１１が存在する。ここでは、１個の完全ＤＮＡに着目して説明する。
【０１２１】
最初に、図５（ｂ）に示すように、第１のサイクルでは、第２および第３のサイクルの熱変性工程より長い熱変性工程を行うことにより、上記の長いＤＮＡ１が加熱変性し、２本鎖が互いに離れ、２つの１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｂの状態になる。
【０１２２】
次に、図５（ｃ）に示すように、プライマーのアニーリング工程でプライマー２１ａがその塩基配列に適合する各１本鎖１２ａ，１２ｂの適合位置に配置（相補な配列）するように結合する。ここで、適合位置とはプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位置およびプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列と類似の塩基配列の位置である。上記ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、プライマーのアニーリング工程のアニール温度を低く設定することにより、プライマーは、その塩基配列と類似の塩基配列を有するＤＮＡ鎖の部分にも結合する。すなわち、プライマーは、その塩基配列に完全に相補な塩基配列を有する１本鎖の位置に結合することができるのみならず、多少のミスマッチを伴って１本鎖に結合することもできる。なお、図５〜図７では、簡単のためにプライマーがその塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位置に結合する場合を図示している。
【０１２３】
続いて、図５（ｄ）に示すように、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ａ，１２ｂにそれぞれ沿って１本鎖１２ｃ，１２ｄが伸長して２本鎖化した鎖１３ａ，１３ｂが形成される。
【０１２４】
第２のサイクルの１回目のサイクルでは、第１のサイクルで２本鎖化した鎖１３ａ，１３ｂが熱変性工程でそれぞれ１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｃおよび１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ｂ，１２ｄとなるが、ここでは、鎖１３ａから分かれた１本鎖１２ｃに着目して説明する。
【０１２５】
図６に示すように、熱変性工程で分離した１本鎖１２ｃには次のプライマーのアニーリング工程でプライマー２１ｂが適合位置に配置するように結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ｅに沿って１本鎖１２ｅが伸長して２本鎖化した鎖１３ｄとなる。
【０１２６】
その後、図７に示すように、第２のサイクルの第２回目のサイクルでは、上記２本鎖化した鎖１３ｄが熱変性工程でそれぞれ１本鎖１２ｃ，１２ｅとなるが、ここでは、鎖１３ｄから分かれた１本鎖１２ｅに着目して説明する。
【０１２７】
図７に示すように、熱変性工程で分離した１本鎖１２ｅには、次のプライマーのアニーリング工程で、同様に、プライマー２１ｃが適合位置に配置するように結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ｅに沿って１本鎖１２ｆが伸長して２本鎖化した鎖（ＤＮＡ断片）１３ｅが形成される。
【０１２８】
このようにＤＮＡ断片が形成され、このＤＮＡ断片からＤＮＡ断片が形成されるとともに他の同種のＤＮＡからもＤＮＡ断片が形成され、同様の反応が連鎖反応的に続くので、この方法によりＤＮＡ断片が増幅される。
【０１２９】
その後、図３に示すように、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを用いて、電気泳動法により、各反応溶液において増幅されたＤＮＡ断片をサイズ（塩基対数）ごとに分画する。このとき、濃度が既知で定量可能なＤＮＡサイズマーカを同時に電気泳動させサイズごとに分画する（ステップＳ１−４）。
【０１３０】
さらに、電気泳動法により得られた電気泳動像を蛍光色素で染色し（ステップＳ１−５）、紫外線照射したときの蛍光像を撮影する（ステップＳ１−６）。撮影には、例えばＣＣＤカメラを用いる。このようにして得られた電気泳動像において、ＤＮＡ断片がバンド（帯）として現れる。
【０１３１】
なお、ここで、ネガティブコントロールの電気泳動像においてバンドが現れない場合、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象である微生物または微生物群由来のものであることが確認できる。
【０１３２】
続いて、図２に示すように、撮影した電気泳動像を電気泳動イメージ入力部２（図１）のスキャナで解析用コンピュータ３（図１）に画像データとして取り込み（ステップＳ２）、画像データに基づいて各プライマーについての電気泳動像の輝度分布（発光強度分布）を示す波形データを生成する（ステップＳ３）。
【０１３３】
なお、上記の方法においては、電気泳動像が歪んでいるために輝度分布を示す波形データを正確に生成できない場合がある。したがって、このような電気泳動像の歪みを補正するため、電気泳動像にアフィン変換を含む種々の画像補正を行ってもよい。
【０１３４】
ところで、上記の方法においては、電気泳動像を染色する際に染色むらが生じるおそれがある。このため、電気泳動像の背景にむらが生じるおそれがある。電気泳動像の背景にむらが生じた場合には、電気泳動像の輝度分布を正確に検出することができない。したがって、生成された波形データの信頼性が低下する。
【０１３５】
また、ＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅する際において、所定の塩基配列を有する鋳型ＤＮＡの適合位置にプライマーが強く結合して配置する場合は、ＤＮＡ断片の増幅効率が高い。このようなプライマーにより増幅されたＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性の高い明瞭なバンドとして現れる。一方、プライマーと鋳型ＤＮＡの適合位置との結合が弱い場合、鋳型ＤＮＡの適合位置よりも結合が強い他の位置にプライマーが結合する。このように、ＤＮＡ断片の増幅反応においては競争的に反応が進行するため、プライマーと鋳型ＤＮＡとの結合が弱い場合にはＤＮＡ断片の増幅効率が低くなる。このような結合の弱いプライマーにより増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性が低く不明瞭バンドとして現れる。上記のような再現性の低いＤＮＡ断片を含むことにより、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータは全体の信頼性が低くなる。
【０１３６】
そこで、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータの信頼性を向上させるために、解析コンピュータ３（図１）を用いて、以下のような電気泳動像の輝度分布を示す波形データの補正を行う（ステップＳ４）。
【０１３７】
図８は波形データの補正の工程の一例を示すフローチャートである。図８に示すように、波形データの補正の工程（ステップＳ４）は以下の４つの工程（Ｓ４−１〜Ｓ４−４）から構成される。
【０１３８】
図８に示す一連の波形データの補正の工程（ステップＳ４）においては、まず、電気泳動像の背景むらの補正を行う（ステップＳ４−１）。以下、背景むらの補正工程（ステップＳ４−１）について説明する。
【０１３９】
図９（ａ）は、染色むらが生じたために背景にむらが生じた電気泳動像を示す図である。図９（ａ）においては、レーンＡおよびレーンＢにそれぞれ３つのバンド▲１▼〜▲３▼，▲４▼〜▲６▼が表れている。この場合、電気泳動像の対角線左上側の輝度が最も低く右下側が最も高く、レーンＡ側の輝度がレーンＢ側の輝度に比べて低くなっている。このため、図９（ｂ）に示す輝度分布において、レーンＡおよびレーンＢの各バンド▲１▼〜▲６▼に対応するピークのうち、特にレーンＢのバンド▲５▼，▲６▼のピークにおいて背景の輝度の影響が大きくなる。このように背景の輝度の影響が大きくなると、正確にバンド▲１▼〜▲６▼に対応する輝度分布のピークを検出することができない。
【０１４０】
そこで、電気泳動像における背景の輝度の影響を補正するために、図９（ｃ）に示すように、画像処理により、レーンＡおよびレーンＢのバンド▲１▼〜▲６▼を含む矩形領域を除去し、除去した矩形領域の周辺の輝度に基づいて図９（ｄ）に示すように除去した矩形領域の補間を行う。このようにして得られた図９（ｄ）に示す電気泳動像の背景のデータをもとに、下記式（１）に基づいて、背景の輝度の影響を取り除いたバンド▲１▼〜▲６▼に対応する輝度分布の波形データを求める。
【０１４１】
Ｚnew ＝Ｚmax ・（Ｚ1 −Ｚ0 ）／（Ｚmax −Ｚ0 ） ・・・（１）
なお、式（１）中のＺnew は電気泳動像の補正後の輝度分布における輝度値を示しており、Ｚmax は電気泳動像の輝度分布における最大輝度値を示し、Ｚ0 は電気泳動像の輝度分布における最小輝度値を示し、Ｚ1 は電気泳動像の輝度分布におけるある点の輝度値を示している。（Ｚ1 −Ｚ0 ）／（Ｚmax −Ｚ0 ）によりある点の全体に対する相対輝度の割合が得られ、これにＺmax を乗算することにより相対輝度が得られる。
【０１４２】
また、全体的にむらの少ない場合には、各サンプルのレーンの輝度値から対応するネガティブコントロールの輝度値を引き算したり、各レーンに隣接するレーン間隙の輝度値を引き算することによって、補正することも可能である。
【０１４３】
以上のようにして電気泳動像における背景のむらを補正することにより、背景の輝度の影響を除去して、電気泳動像の輝度分布を示す波形データを正確に生成することが可能となる。
【０１４４】
図８に示すように、輝度分布を示す波形データにおいて、ポジティブコントロールのバンドの発光強度と量が既知であるＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度とを比較することにより、ポジティブコントロールにおいて増幅されたＤＮＡ断片を定量する。さらにこの定量した値を用いてＤＮＡ断片増幅反応の増幅効率を求める。この増幅効率に基づいて各ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の波形データの輝度を補正する（ステップＳ４−２）。それにより、ＤＮＡ増幅反応時における反応条件等の誤差がＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響が除去される。なお、ここでの発光強度とは、輝度分布におけるピークの高さのことである。
【０１４５】
また、ポジティブコントロールの定量方法としては、ＤＮＡ断片精製後に２６０ｎｍの紫外線吸収量を測定するなどの他の方法を用いることもできる。
【０１４６】
さらに、定量可能なＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度を基準として用い、複数種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液に対応する波形データの輝度を補正する。このようにして、電気泳動像の波形データの補正を行う（ステップＳ４−３）。
【０１４７】
一般に、エチジウムブロマイド染色時の染色度合いおよび写真撮影時の露光の程度によって、得られる電気泳動像の階調に誤差が生じる。しかしながら、濃度が既知のＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づいて電気泳動像の画像データの階調補正を行うことにより、このような誤差を除去することができる。
【０１４８】
続いて、ＤＮＡサイズマーカの波形データに基づいて以下に示す軸合わせおよび濃度調整を行う（ステップＳ４−４）。なお、上記のような画像補正は、解析用コンピュータ３（図１）により行う。
【０１４９】
図１０（ａ），（ｂ）は電気泳動像の例を示す図である。図１０（ａ），（ｂ）において、レーン１，８は、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を示している。また、レーン２〜７およびレーン９〜１４は、１２種類の各プライマーにおける電気泳動像をそれぞれ示している。
【０１５０】
なお、上記において、図１０（ａ）はゲルＡを用いて電気泳動させた場合の電気泳動像を示しており、図１０（ｂ）はゲルＢを用いて電気泳動させた場合の電気泳動像を示している。
【０１５１】
ゲルＡおよびゲルＢは同一種類のゲルであり、いずれのゲルを用いる場合においても電気泳動の条件は同一とする。また、ゲルＡ上およびゲルＢ上で電気泳動させるＤＮＡサイズマーカ（レーン１，８）としては同一のものを用いている。
【０１５２】
ここで、図１０（ａ）に示されたＤＮＡサイズマーカの電気泳動像（レーン１）と図１０（ｂ）に示されたＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の（レーン８）とを比較すると明らかなように、同一のＤＮＡサイズマーカを異なるゲル上（この場合はゲルＡ上およびゲルＢ上）で電気泳動させる場合においては、同一のものを同一の条件で電気泳動させたにもかかわらず、同一サイズのバンドが各ゲル上においてそれぞれ異なる位置に現れる。
【０１５３】
このように、電気泳動に用いるゲルが異なると、同一の条件で電気泳動させたにもかかわらず、用いたゲルによりバンドの移動度が異なってくる。このため、異なるゲル間においては、バンドの位置とＤＮＡサイズとの関係が異なる。そこで、本例においては、以下の方法により、異なるゲル間でも波形データの比較が可能となるように、波形データの標準化を行う。この波形データの標準化を軸合わせと呼ぶ。
【０１５４】
波形データの軸合わせを行う方法としては、ＤＮＡサイズマーカの波形データに基づいて所定の変換式のパラメータを決定し、この変換式に基づいて各ゲルごとに波形データを補正する。このような変換式としては、例えば以下の式（２）を用いる。
【０１５５】
ｙ＝ｍ１＋ｌｏｇ（ｍ２−ｍ３・ｘ）/（ｍ４−ｍ５・ｘ） ・・・（２）
ここで、式（２）中のｘは電気泳動のスタート位置からの距離、すなわち泳動距離（画素/１０００ )を示しており、ｙはＤＮＡのサイズを対数値（ｌｏｇ（ｂｐ））で示している。
【０１５６】
図１１（ａ）は、図１０（ａ）に示したゲルＡについて、ＤＮＡサイズマーカの各バンドをプロットしたものである。また、図１１（ｂ）は、図１０（ｂ）に示したゲルＢについて、ＤＮＡサイズマーカの各バンドをプロットしたものである。
【０１５７】
図１１（ａ）および図１１（ｂ）の各点のｘおよびｙの値を用いて最小二乗法により、ゲルＡおよびゲルＢの各々について各パラメータｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４およびｍ５を求める。この場合においては、例えば下記表１に示すようなパラメータｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４およびｍ５がゲルＡおよびゲルＢについて求められる。
【０１５８】
【表１】
求めた各パラメータｍ１〜ｍ５を代入した変換式（２）により表される曲線とＤＮＡサイズマーカの各バンドをプロットした点との相関係数は、ゲルＡおよびゲルＢともに０．９９９８６となる。図１１（ａ）および（ｂ）に示すように、ＤＮＡサイズマーカの各バンドの点はほぼ変換式（２）で表される曲線上にのる。
【０１６０】
図１２（ａ）は上記の変換式（２）による軸合わせを行う前のＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示す波形データを示す図であり、図１２（ｂ）は上記の変換式（２）による軸合わせを行ったのちのＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示す波形データを示す図である。図１２において、太線はゲルＡにおけるＤＮＡサイズマーカの波形データであり、細線はゲルＢにおけるＤＮＡサイズマーカの波形データである。
【０１６１】
図１２（ａ）に示すように、同一のＤＮＡサイズマーカを用いて同一の条件で電気泳動を行った場合においても、異なるゲル間（ゲルＡおよびゲルＢ）においては、波形データのピーク（バンドに相当）が異なる位置に現れる。これは、前述のように、異なるゲル間（ゲルＡおよびゲルＢ）においては、バンドの移動度に差が生じるためである。
【０１６２】
そこで、前述の図１１に示す方法により、ゲルＡおよびゲルＢにおいてそれぞれパラメータｍ１〜ｍ５を求めるとともに、各ゲルにおいて求めたパラメータｍ１〜ｍ５を代入した変換式（２）に基いて波形データの軸合わせを行う。その結果、図１２（ｂ）に示すように、ゲルＡおよびゲルＢを用いた場合の波形データのピークの位置を一致させることができる。
【０１６３】
図１３（ａ）は、上記の変換式（２）による軸合わせを行う前のＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示す波形データおよびある細菌についての電気泳動像の輝度分布を示す波形データを示す図である。また、図１３（ｂ）は、上記の変換式（２）による軸合わせを行った後のＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示す波形データおよびある細菌についての電気泳動像の輝度分布を示す波形データを示す図である。さらに、図１３（ｃ）は、後述する濃度調整を行った後のＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示す波形データおよびある細菌についての電気泳動像の輝度分布を示す波形データを示す図である。
【０１６４】
図１３（ａ），（ｂ），（ｃ）には、図１０（ａ）に示すゲルＡを用いた場合の波形データおよびゲルＢを用いた場合の波形データが示される。
【０１６５】
図１３（ａ）に示すように、ゲルＡおよびゲルＢを用いて電気泳動を行った場合、ＤＮＡサイズマーカおよび細菌の電気泳動像の輝度分布を示す波形データにおいてピークが異なる位置に現れる。
【０１６６】
そこで、上記の波形データの軸合わせを行うと、図１３（ｂ）に示すように、ゲルＡおよびゲルＢを用いた場合の波形データのピークの位置を一致させることができる。
【０１６７】
この場合、図１１（ａ），（ｂ）からわかるように、泳動距離の中間付近（軸合わせ前の４００付近）では、泳動距離とＤＮＡサイズとの関係が直線に近いが、両端では、泳動距離とＤＮＡサイズとの関係が直線にならず、泳動距離に対するＤＮＡサイズの変化量が増大する。これにより、変換式（２）に基いて波形データの軸合わせを行うと、波形データの両端に近い領域において「引き伸ばし」が起こり、ピークの幅が広くなる。その結果、波形データの両端に近い領域においてピークの面積が大きくなる。このピークの面積は、ＤＮＡの濃度に相当する。そこで、軸合わせ前の波形データとピークの面積が等しくなるように、軸合わせ後の波形データのピークの高さを補正する。この補正を濃度調整と呼ぶ。
【０１６８】
ここで、濃度調整の方法を説明する。上記の軸合わせにおいて変換式（２）のパラメータｍ１〜ｍ５を確定する。確定したパラメータｍ１〜ｍ５を代入した変換式（２）をｙ＝ｆ（ｘ）とする。次に、変換式（２）の１次微分（傾き）ｙ’＝ｆ’（ｘ）を求める。さらに、変換式（２）の２次微分ｙ”＝ｆ（ｘ）を求める。そして、２次微分が０となる変曲点ｘ０を求める。変曲点ｘ０における傾きｆ’（ｘ０）から各点での引き伸ばし率ｆ’（ｘ）／ｆ”（ｘ０）を求める。波形データの各点での輝度値を引き伸ばし率ｆ’（ｘ）／ｆ”（ｘ０）で割る。これにより、波形データの両端に近い領域においてピークの高さが低減され、図１３（ｃ）に示すように、ピークの面積が軸合わせ前と等しくなるように補正される。
【０１６９】
このようにして、軸合わせおよび濃度調整を行うことにより、ゲルの違いによるバンドの移動度の差を補正することが可能となり、異なるゲル間においても波形データを標準化することが可能となる。
【０１７０】
なお、上記においては、図１１に示すように、各ゲル上のＤＮＡサイズマーカのバンドの泳動距離をｘとするとともにＤＮＡサイズの対数値をｙとして上記の変換式（２）に基づいて最小二乗法によりパラメータｍ１〜ｍ５を求める場合について説明したが、波形データの標準化のための変換式は泳動距離とＤＮＡサイズとの関係を近似することができれば、任意の変換式を用いることができる。例えば、平方根、立方根、整関数等を含む式を変換式として用いてもよい。
【０１７１】
上記のようにしてＤＮＡサイズマーカの波形データの軸合わせおよび濃度調整を行った後、ゲルＡおよびゲルＢ上のレーン２〜７，９〜１４の各プライマーの波形データについても、上記と同様の方法により、各ゲルについて求めたパラメータｍ１〜ｍ５を用いて変換式（２）により軸合わせおよび濃度調整を行う。それにより、異なるゲルを用いて電気泳動を行ったプライマーの全ての波形データを標準化することができる。
【０１７２】
なお、上記のような波形データの標準化は、解析用コンピュータ３（図１）により行う。
【０１７３】
図１４（ａ）は図１０（ａ）に示すゲルＡ上で電気泳動させた６種類のプライマー（レーン２〜７）の波形データを示す図である。また、図１４（ｂ）はゲルＢ上で電気泳動させた６種類のプライマー（レーン９〜１４）の波形データを示す図である。なお、波形データにおけるピークの高さはバンド強度に相当する。
【０１７４】
上記のような波形データの補正を行った後、図２に示すように、複数のプライマーについての波形データを連結する（ステップＳ５）。例えば、上記のようにして作成した図１４（ａ）に示すレーン２〜７の各プライマーの波形データを連結し、サンプルの微生物の波形データとする。同様に、図１４（ｂ）に示すレーン９〜１４の各プライマーの波形データを連結し、サンプルの微生物の波形データとする。
【０１７５】
なお、図１の微生物識別装置の解析用コンピュータ３において、このようにして作成されたサンプルの微生物の波形データは、後述するように、データ格納部４（図１）に格納されたデータベース中の微生物の波形データとの比較に用いられる。
【０１７６】
次に、上記のようにして作成したサンプルの微生物の波形データに基づいてサンプルの微生物の識別・同定を行う方法について説明する。
【０１７７】
図１５（ａ）はサンプルの微生物に図２に示すステップＳ１およびステップＳ２の工程により得られた電気泳動像の一例を示す図である。
【０１７８】
なお、図１５（ａ）において、レーン１はＤＮＡサイズマーカＭの電気泳動像を示しており、レーン２はプライマーｐ０１における電気泳動像を示しており、レーン３はプライマーｐ０３における電気泳動像を示しており、レーン４はプライマーｐ０４における電気泳動像を示しており、レーン５はプライマーｐ０６における電気泳動像を示しており、レーン６はプライマーｐ０７における電気泳動像を示している。
【０１７９】
図１５（ｂ）は、図１５（ａ）に示す各プライマーｐ０１，ｐ０３，ｐ０４，ｐ０６，ｐ０７について、図２に示すステップＳ３からステップＳ５の工程により得られた波形データを示す図である。図１５（ｂ）に示すように、各プライマーｐ０１，ｐ０３，ｐ０４，ｐ０６，ｐ０７の波形データが連結されて１つの波形データが作成されている。
【０１８０】
続いて、図２に示すように、解析用コンピュータ３（図１）を用いて、サンプルの微生物の波形データ（図１５（ｂ））に基づいて、データベース格納部４のデータベースを検索する（ステップＳ６）。
【０１８１】
以下に、データベース検索（ステップＳ６）の詳細について、順を追って説明する。
【０１８２】
図１に示すように、微生物識別装置のデータベース格納部４のデータベースには、生化学検査等により同定された複数の微生物の各々に関して、ＳＳＣ−ＰＣＲのデータ、例えば、複数のプライマーについての波形データおよび電気泳動像の画像データが登録されている。
【０１８３】
データベースに登録されている微生物の波形データの一例を図１６（ａ）に示す。図１６（ａ）においては、Escherichia coli（大腸菌）（以下、E.coliと略記する）およびBacillus subtilis （枯草菌）（以下、B.sub と略記する）についてのプライマーｐ０１〜ｐ０７に関する波形データが示されている。
【０１８４】
データベース格納部４には、上記に示すE.coli（大腸菌）およびB.sub （枯草菌）以外の微生物についても、上記のような波形データが登録されている。
【０１８５】
図１６（ｂ）は、サンプルの微生物の波形データとの比較のために、データベース格納部４に格納されているE.coli（大腸菌）、B.sub （枯草菌）およびStaphylococcus aureus （黄色ブドウ球菌）（以下、S.aur と略記する）の波形データからプライマーｐ０１，ｐ０３，ｐ０４，ｐ０６，ｐ０７に関する波形データを抽出して連結したものである。
【０１８６】
なお、データベースに一部のプライマーのデータがなかった場合には、ピークなしの波形データとして連結された波形データを作成するか、あるいはサンプルと同じピークを補って連結された波形データを作成する。前者のようにピークなしの波形データとして連結された波形データを作成する場合においては、後述の相関係数が小さくなる。一方、後者のようにサンプルと同じピークを補って連結された波形データを作成する場合においては、後述の相関係数が大きくなる。
【０１８７】
図１６（ｂ）に示すE.coli（大腸菌）、B.sub （枯草菌）およびS.aur （黄色ブドウ球菌）以外のデータベースに登録されている複数の微生物についても、それぞれ図１６（ｂ）に示すような連結された波形データを作成する。
【０１８８】
さらに、図１７に示すように、上記において作成した図１５（ａ）に示すサンプルの微生物の波形データと、図１６（ａ）に示すようなデータベース格納部４に格納されている複数の既知の微生物の波形データとを比較し、両者の相関関係を調べる。
【０１８９】
ここでは、一例として、サンプルの微生物の波形データとE.coli（大腸菌）、B.sub （枯草菌）およびS.aur （黄色ブドウ球菌）の波形データとを比較した場合について説明する。
【０１９０】
図１７に示すように、サンプルの微生物の波形データとE.coli（大腸菌）、B.sub （枯草菌）およびS.aur （黄色ブドウ球菌）の波形データとを比較してサンプルの微生物の波形データと各微生物の波形データとの相関係数を計算する。この例では、E.coli（大腸菌）との間の相関係数は０．５６８となり、B.sub （枯草菌）との間の相関係数は０．３６８となり、S.aur （黄色ブドウ球菌）との間の相関係数は０．１２１となる。相関係数が１に近いほど相関関係が高い。
【０１９１】
したがって、波形データより求めた相関係数から、サンプルの微生物はE.coli（大腸菌）である確率が最も高い。このように、サンプルの微生物の波形データとデータベース格納部４に格納された各微生物の波形データとを比較することにより、サンプルの微生物を識別することが可能となる。なお、このような相関係数の計算は、解析用コンピュータ３（図１）を用いて行う。
【０１９２】
最後に、図２に示すように、結果表示手段５（図１）により、微生物の名称を相関係数の高い順に検索結果として表示する（ステップＳ７）。
【０１９３】
なお、必要に応じて以下の工程（ステップＳ８）を設けてもよい。
例えば、図２に示すように、画像データの比較等による確認の工程を設けてもよい。この工程においては、検索結果として表示された微生物がサンプルの微生物と同一であること、あるいはサンプルを構成する微生物の１つであることを以下のような方法により確認する。
【０１９４】
例えば、サンプルの微生物の電気泳動像の画像データを読み出すとともに、検索された微生物の電気泳動像の画像データをデータベース格納部４から読み出し、両者の電気泳動像の画像データの比較を行ってもよい。また、サンプルの微生物の波形データと検索された微生物の波形データとの相関図を表示することにより、両者の相関の状態を調べてもよい。これらの方法により、検索結果の確認を行うことが可能となる。
【０１９５】
また、データベースへの登録工程を設けてもよい。この工程は、単一の微生物をサンプルに用いて波形データの検索を行った結果、データベースに同じ微生物の波形データが存在しないことが明らかとなった場合に、このサンプルの微生物に関する波形データを新たにデータベース格納部４のデータベースに登録するものである。それにより、検索可能な微生物の範囲がより広がる。
【０１９６】
また、パラメータ等を変更して再び検索を行う工程を設けてもよい。この工程においては、例えば、データベース検索の工程（ステップＳ６）において説明した相関係数の計算方法を変更し、再検索を行う。それにより、サンプルの微生物に適した検索を行って結果を得ることができる。
【０１９７】
ここで、サンプルに単一の微生物を用いて１種類の微生物が検索された場合においては、サンプルの微生物の波形データと検索された微生物の波形データとの間の不一致ピークが、サンプルの微生物と検索された微生物との区別を可能にする多型（異なる性質）に相当する可能性がある。一方、サンプルが複数の微生物の混合物である場合、サンプルの微生物の波形データと検索された微生物の波形データとの間の不一致ピークは、データベースに登録されていない微生物のバンドである可能性が高い。このように、不一致ピークはサンプルの微生物に関する重要な情報となり得るので、データとして残すことが好ましい。
【０１９８】
なお、上記においては、各プライマーにおける波形データを連結して１つの波形データを作成しているが、各プライマーにおける波形データを個々に比較してもよい。この場合においては、各プライマーについて相関係数を求めるとともに、求められた各相関係数の平均を求めてサンプルの微生物を識別する。
【０１９９】
以上のような本発明に係る微生物識別方法によれば、単一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群のいずれをサンプルとして用いる場合においても、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可能となる。
【０２００】
特に、微生物群をサンプルとして用いる場合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時に識別し、さらに同定することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。この方法によれば、１００種類程度の微生物を同時に識別することが可能となる。
【０２０１】
一方、単一の微生物をサンプルとして用いる場合においては、サンプルの微生物とデータベースの微生物との多型を検出することも可能となる。また、サンプルの微生物と類似した微生物を見い出すこともできる。
【０２０２】
ここで、この微生物識別方法においては、ＳＳＣ−ＰＣＲによりサンプルの微生物（または微生物群）のＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。この方法によれば、混在する多数の微生物を数時間で識別することが可能となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になる。また、このような方法においては、単離が困難な微生物の識別および同定も可能になる。さらに、ＳＳＣ−ＰＣＲは塩基配列が未知のサンプルに対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなくサンプルの微生物の識別および同定を行うことができる。
【０２０３】
したがって、この微生物識別方法は全ての微生物に適用可能であり、さらに、この方法によれば、微生物の種の違いだけでなく、株の違いまで検出することが可能となる。
【０２０４】
さらに、この微生物識別方法においては、複数のプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ反応を行い、複数のＰＣＲ反応の結果を用いて分析を行うため、諸条件によって個々のＰＣＲ反応が良好に進まない場合においても、個々のＰＣＲ反応の影響は小さい。このため、良好な分析を安定して行うことが可能となる。
【０２０５】
例えば、上記の微生物識別方法を生ごみ処理機の処理槽内または土壌中から採取した複数の微生物に適用することにより、生ごみ処理機の処理槽内または土壌中の微生物を同定することができる。また、この結果にしたがって生ごみ処理機の処理槽の条件を変えることにより、生ごみの処理を良好に行えるとともに良好な肥料を作製することができる。
【０２０６】
実際に生ゴミ処理機の菌叢に本発明に上記の微生物識別方法を適用した結果、生ゴミ処理機には約４０種類の微生物が存在して菌叢を構成しており、この菌叢は経時的に変化することが明らかとなった。また、処理状態が良好な生ゴミ処理機においては２０〜３０種類の微生物が処理槽内に定着することが明らかとなった。
【０２０７】
さらに、このような微生物識別方法は、水銀、砒素、ダイオキシン、環境ホルモン等の有害な汚染物質に汚染された土壌、食品等の発見、およびこれらの汚染状態を知るのに有効である。すなわち、この微生物識別方法により検索された微生物の中に汚染物質に関係のある微生物が含まれている場合には、微生物を採取した土壌等にこの汚染物質が含まれる可能性が示唆される。また、汚染物質に関係のある微生物の存在の程度により、汚染状態が示唆される。
【０２０８】
大便・唾液・たんなどからの病原性細菌の検出、水質浄化設備などの移動状況の把握なども可能である。
【０２０９】
図１８は図１の解析用コンピュータ３として用いられるパーソナルコンピュータの構成を示すブロック図である。
【０２１０】
図１８のパーソナルコンピュータは、ＣＰＵ（中央演算処理装置）３１０、ディスプレイ３２０、入力装置３３０、ＲＯＭ（リードオンリメモリ）３４０、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）３５０、記録媒体駆動装置３６０、スキャナ３７０および外部記憶装置３８０を備える。
【０２１１】
ディスプレイ３２０は、液晶表示パネル、ＣＲＴ（陰極線管）等からなり、図１の結果表示手段５として用いられる。入力装置３３０は、キーボード、マウス等からなり、各種データおよび各種指令を入力するために用いられる。ＲＯＭ３４０にはシステムプログラムが記憶される。
【０２１２】
記録媒体駆動装置３６０は、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、フロッピィディスクドライブ等からなり、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピィディスク等の記録媒体３９０に対してデータの読み書きを行う。記録媒体３９０には、図２の微生物識別方法におけるステップＳ２〜Ｓ８の処理を行う微生物識別プログラムが記録されている。
【０２１３】
スキャナ３７０はＣＣＤカメラにより撮影された電気泳動像を画像データとして入力し、外部記憶装置３８０に格納する。スキャナ３７０は図１の電気泳動イメージ入力部２として働く。
【０２１４】
外部記憶装置３８０は、ハードディスク装置等からなり、記録媒体駆動装置３６０を介して記録媒体３９０から読み込まれた微生物識別プログラムを記憶する。また、外部記憶装置３８０は、上記のデータベースを記憶する。図１のデータベース格納部４は外部記憶装置３６０により構成される。ＣＰＵ３１０は、外部記憶装置３８０に記憶された微生物識別プログラムをＲＡＭ３５０上で実行する。
【０２１５】
なお、微生物識別プログラムを記録する記録媒体３９０として、ＲＯＭ等の半導体メモリ、ハードディスク等の種々の記録媒体を用いることができる。また、微生物識別プログラムを通信回線等の通信媒体を介して外部記憶装置３６０にダウンロードし、ＲＡＭ３５０上で実行してもよい。この場合、通信媒体が記録媒体に相当する。
【０２１６】
本実施の形態では、図１のＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１が増幅手段に相当し、電気泳動イメージ入力部２が画像データ変換手段に相当し、解析用コンピュータ３が波形データ生成手段、相関関係作成手段および識別手段を構成する。
【０２１７】
なお、データベース格納部４に格納されるデータベースは、照合対象となる微生物について図２のステップＳ１〜Ｓ４の処理を行うことにより作成される。
【０２１８】
本実施の形態では、データベース格納部４に電気泳動像の輝度分布を示す波形データが格納されているが、データベース格納部４に電気泳動像の輝度分布におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積を示すデータを格納してもよい。この場合には、解析用コンピュータ３がデータベース格納部４に格納された電気泳動像の輝度分布におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積を示すデータに基づいて電気泳動像の輝度分布を示す波形データを作成し、サンプルの微生物についての電気泳動像の輝度分布を示す波形データと比較して相関係数を計算する。例えば、データベース格納部４に格納された電気泳動像の輝度分布におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積に基づいて個々のピークをガウス関数、デルタ関数、矩形等で表現する。
【０２１９】
また、データベース格納部４に電気泳動像を示す画像データを格納してもよい。この場合には、解析用コンピュータ３がデータベース格納部４に格納された電気泳動像の画像データに基づいて電気泳動像の輝度分布を示す波形データを作成し、サンプルの微生物についての電気泳動像の輝度分布を示す波形データと比較して相関係数を計算する。
【０２２０】
一般的に、電気泳動法としては、大きく分けて２種類の方法が知られている。アガロースゲル等の平板ゲルを用いる方法と、ゲルを詰めた細管（キャピラリ）を用いる方法とがある。ＤＮＡ断片の分離の原理は、いずれの方法でも同じであり、大きな分子はゲル内を移動しにくく、小さな分子ほど移動しやすいことを利用している。
【０２２１】
平板ゲル法では、一定時間の電気泳動後のＤＮＡ断片の移動距離を画像データから測定するのに対して、細管法では、ＤＮＡ断片が一定距離の細管を通って出てくるまで、あるいは細管中で一定距離を移動するまでの時間をセンサを用いて測定している。なお、平板ゲルを用いてＤＮＡ断片が一定距離を移動する時間をセンサにより測定する場合もあり、あるいは細管に沿ってセンサを並べておいてＤＮＡ断片の一定時間の移動距離を測定することも可能である。
【０２２２】
図１９は細管型の電気泳動装置を用いた微生物識別装置を示すブロック図である。図１９の微生物識別装置が図１の微生物識別装置と異なるのは、電気泳動イメージ入力部２の代わりに電気泳動・信号検出装置２ａが設けられている点である。電気泳動・信号検出装置２ａは、細管型の電気泳動装置を含む。この電気泳動・信号検出装置２ａでは、例えばＤＮＡ断片を蛍光色素で染色し、ゲルを詰めた細管に、その色素を励起させる波長の光を発光する発光部とその光を受光する受光部とを対応させて設けることにより、電気泳動法を実行している最中に受光部からＤＮＡ断片の移動に応じた出力信号を得ることができる。
【０２２３】
図２０は図１９の電気泳動・信号検出装置２ａにより得られるセンサ出力波形の一例を示す図である。図２０の横軸は、ＤＮＡ断片の移動時間であり、縦軸はセンサの信号強度である。マーカー１および２は、標準化のために用いられる。ＤＮＡ断片１〜４は増幅されたＤＮＡ断片である。センサの信号強度を示す波形データを標準化することにより、図１の微生物識別装置と同様の方法で微生物の識別を行うことができる。
【０２２４】
以下の実施例では、平板ゲルを用いて電気泳動を行った結果を画像データとして採取し、その画像データを波形データに加工したが、図１９の微生物識別装置を用いる場合には、細管型の電気泳動装置から直接波形データを得ることができる。
【０２２５】
【実施例】
［実施例１］
実施例１においては、以下に示す１６種類の細菌についてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行い、得られた結果に基づいて波形データを作成した。さらに、この１６種類の細菌の波形データを検索用の波形データとしてデータベースに登録した。以下に、詳細について説明する。
【０２２６】
１．データベースの作成
▲１▼１６種類の細菌のＤＮＡ分析
ここでは、まず表２に示す１６種類の細菌を用意するとともに、各細菌の染色体ＤＮＡを調製してＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製を行った。
【０２２７】
【表２】
なお、各細菌の染色体ＤＮＡはCurrent Protocols in Molecular Biology (published by Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience) の2.4.1 〜2.4.2 に記載の“Preparation of Genomic DNA from Bacteria”の方法に従って調製した。
【０２２９】
次に、上記のようにして調製した反応溶液を用いて、PE Applied Biosystemの PCR System 9700および三洋電機株式会社製ＤＮＡ増幅器ＭＩＲ−Ｄ４０により、以下に示すＳＳＣ−ＰＣＲ法で各細菌についてＤＮＡ分析を行った。
【０２３０】
本実施例のＳＳＣ−ＰＣＲ法においては、１６種類のプライマー（配列番号１〜１６）を用いた。なお、以下においては、配列番号１のプライマーをＰ０１、配列番号２のプライマーをＰ０２と表し、以下、配列番号３から配列番号１６のプライマーまでを同様にしてＰ０３〜Ｐ１６と表すものとする。
【０２３１】
本実施例のＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いた反応溶液の組成を表３に示す。
【０２３２】
【表３】
表３において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのＴｒｉｓは、Tris(hydroxymethyl)aminomethane の略である。ｄＮＴＰｍｉｘはｄＡＴＰ(2--デオキシアデノシン-5--三燐酸）、ｄＣＴＰ(2--デオキシシチジン- 5-- 三燐酸) 、ｄＧＴＰ(2--デオキシグアノシン-5--三燐酸) 、ｄＴＴＰ(2--デオキシチミジン-5--三燐酸) の等濃度混合溶液である。反応溶液量は２０μＬとした。
【０２３４】
ここでは、１６種類の細菌の各々について、プライマーとして配列番号１〜１６の各プライマー（Ｐ０１〜Ｐ１６）をそれぞれ含む１６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を同時に調製した。また、配列番号１のプライマー（Ｐ０１）とこれに対応する塩基配列を有する鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液をポジティブコントロールとして、また、配列番号１のプライマー（Ｐ０１）を含むがＤＮＡを含まない反応溶液をネガティブコントロールとして各細菌の１６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液と同時に調製した。
【０２３５】
次に、１６種類の細菌の各々について、上記のようにして調製した１６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を図４に示すＤＮＡ断片増幅装置の孔部５１にそれぞれ収納するとともに、孔部５１ａおよび孔部５１ｂにネガティブコントロールおよびポジティブコントロールをそれぞれ収納した。このＤＮＡ断片増幅装置を用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行った。ＳＳＣ−ＰＣＲのサイクルを表４に示す。
【０２３６】
【表４】
続いて、ＳＳＣ−ＰＣＲ後の反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの１０μＬを１％アガロースゲル電気泳動法で分析した。電気泳動条件は、３．６Ｖ／ｃｍ定電圧とした。また、この場合においては、増幅されたＤＮＡ断片のバンドサイズを測定するために、濃度が既知で定量可能なＤＮＡサイズマーカ（ニッポンジーン株式会社製Smart Ladder）を反応溶液と同時に電気泳動させた。
【０２３８】
電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色し、波長２５４ｎｍの紫外線を照射したときのエチジウムブロマイド蛍光像をポラロイドカメラまたはＣＣＤカメラで撮影した。
【０２３９】
▲２▼各プライマーについての波形データの生成
次に、１６種類の細菌の各々について、電気泳動写真をスキャナでコンピュータに取込んだ後、電気泳動像の画像データから、ソフトウェア（Genomic Solutions Advanced Quantifier 1-D Match ）を用いて、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示す波形データ、各プライマーについての電気泳動像の輝度分布を示す波形データ、ポジティブコントロールについての電気泳動像の輝度分布を示す波形データおよびネガティブコントロールについての電気泳動像の輝度分布を示す波形データを生成した。
【０２４０】
ここでは、ネガティブコントロールの電気泳動像においてバンドが検出されなかった。このことから、現れたバンドはサンプルとして用いた細菌由来のものであることが確認できた。
【０２４１】
この場合においては、行っていないが、電気泳動像の歪みを補正するためにアフィン変換を行ってもよい。
【０２４２】
また、ポジティブコントロールのバンドの発光強度をもとにして他のバンドの発光強度を補正してもよい。例えば、測定したポジティブコントロールのバンドの発光強度が７０％であった場合、このバンドの発光強度が１００％になるように補正するとともに、他のバンドの発光強度も同様の割合で補正する。これにより、ＤＮＡ断片増幅反応時における反応条件等の誤差がＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響を除去することができる。
【０２４３】
また、各々の電気泳動像の画像データにおいて、測定により求めたＤＮＡサイズマーカの１０００ｂｐのバンドの発光強度が１００％になるような割合で補正するとともに、他のバンドの発光強度についても同様の割合で補正を行ってもよい。このように画像データの階調の補正を行うことにより、各々の画像データにおける階調の誤差を除去することができる。
【０２４４】
▲３▼各プライマーについての波形データの補正
各プライマーについての波形データに対して図２に示した波形データの補正（ステップＳ４）を行った。ここでは、図８のステップＳ４−１の背景むらの補正ならびにステップＳ４−４の軸合わせおよび濃度調整を行った。
【０２４５】
なお、前述のように、この場合においては、電気泳動像の画像データの各バンドについてポジティブコントロールのバンドの発光強度をもとにして他のバンドの発光強度を補正することは行わず、また、ＤＮＡサイズマーカの発光強度による補正は行わなかった。
【０２４６】
▲４▼各プライマーについての波形データの連結
細菌ごとに１６種類のプライマーＰ０１〜Ｐ１６についての波形データをデータベースに登録した。そして、細菌ごとに１６種類のプライマーＰ０１〜Ｐ１６についての波形データを連結した。細菌ごとの１６種類のプライマーＰ０１〜Ｐ１６についての連結された波形データを図２１に示す。
【０２４７】
２．単離した単一細菌をサンプルとして用いた場合のデータ検索
ここでは、単一細菌をサンプルとしてを用いた検索をテストするために、単離した細菌E.coli（大腸菌）について前述のＳＳＣ−ＰＣＲを行ってＤＮＡの分析を再度行い、１６種類のプライマーＰ０１〜Ｐ１６について得られたサンプルの波形データを連結した。
【０２４８】
サンプルの細菌の１６種類のプライマーＰ０１〜Ｐ１６についての連結された波形データを図２２に示す。
【０２４９】
３．相関係数の計算
この場合においては、図２３に示すように、サンプルから作成した波形データとデータベースから作成した１６種類の細菌についての波形データとを比較し、相関係数を次式により求めた。
【０２５０】
Ｒa,s ＝Σａn ・Ｓn ／｛√(Σａn 2)√(ΣＳn 2)｝
ここで、Ｒa,s はデータベース中の微生物ａとサンプルＳの相関係数、ａn はデータベース中の微生物の波形データのｎポイント目の輝度値、Ｓn はサンプルＳの微生物の波形データのｎポイント目の輝度値である。
【０２５１】
なお、相関係数の計算は、本発明者がMicrosoft Visual Basicで作成したソフ３トウェアを用いて行った。上記のようにして相関係数を計算したところ、細菌E.coli K12Ga（大腸菌）の相関係数が最も１に近かった。このように、サンプルの細菌をデータベースから検索することが可能であった。
【０２５２】
［実施例２］
次に、実施例２においては、実施例１と同様の方法によりEscherichia coli K12 (E.coli K12)およびSalmonella enteritidis GTC 131 (S.enteritidis GTC 131)を含む混合サンプルおよび４種類の細菌について配列番号１７のプライマー（プライマーＡ８７）を用いてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行った。ここで、プライマーＡ８７の塩基配列は、AAGTCGTTTGGGである。
【０２５３】
得られた結果に基づいて波形データを作成した。４種類の細菌の波形データを検索用の波形データとしてデータベースに登録した。
【０２５４】
さらに、混合サンプルの波形データとデータベースに登録された図２４に示す４種類の細菌の波形データＤ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４との相関係数を求めた。図２４には、混合サンプルの波形データＳ、Escherichia coli K12の波形データＤ１、Salmonella enteritidis GTC 131の波形データＤ２、Vibrio chorelae GTC 37の波形データＤ３およびBacillus subtilis ATCC 6051の波形データＤ４が示される。
【０２５５】
本実施例では、まず、次式（１）によりノーマル相関係数を算出した。
【０２５６】
【数７】
上式（１）において、ＮＣはノーマル相関係数であり、Ｓiはサンプルに含まれる細菌の波形データのｉポイント目の輝度値、ａiはデータベースに登録された波形データのｉポイント目の輝度値である。また、ｎは各波形データのポイント数である。
【０２５８】
また、以下に示す方法により算出されるクリッピング信号を用いて相関係数を算出した。クリッピング信号を用いて算出される相関係数をクリッピング相関係数と呼ぶ。
【０２５９】
図２５は混合サンプルの波形データとEscherichia coli K12の波形データとのクリッピング信号の算出方法を説明するための図である。
【０２６０】
図２５（ａ）はEscherichia coli K12およびSalmonella enteritidis GTC 131を含む混合サンプルの波形データＳを示し、図２５（ｂ）はEscherichia coli K12の波形データＤ１を示す。図２５（ａ）の波形データＳおよび図２５（ｂ）の波形データＤ１を重ね合わせると、図２５（ｃ）のようになる。
【０２６１】
次に、ＣＳi＝ｍｉｎ(Ｓi,Ｄ１i)によりクリッピング信号ＣＳを求める。ここで、Ｓiは波形データＳのｉポイント目の輝度値、Ｄ１iは波形データＤ１のｉポイント目の輝度値である。ｉは任意の整数である。また、ｍｉｎ(Ｓi,Ｄ１i)は波形データＳのｉポイント目の輝度値および波形データＤ１のｉポイント目の輝度値のうち低い方の輝度値を選択することを意味する。ＣＳiはクリッピング信号ＣＳのｉポイント目の輝度値である。このようにして求めたクリッピング信号ＣＳを図２５（ｄ）に示す。
【０２６２】
図２６は混合サンプルの波形データとSalmonella enteritidis GTC 131の波形データとのクリッピング信号の算出方法を説明するための図である。
【０２６３】
図２６（ａ）はEscherichia coli K12およびSalmonella enteritidis GTC 131を含む混合サンプルの波形データＳを示し、図２６（ｂ）はSalmonella enteritidis GTC 131の波形データＤ２を示す。図２６（ａ）の波形データＳおよび図２６（ｂ）の波形データＤ２を重ね合わせると、図２６（ｃ）のようになる。
【０２６４】
次に、ＣＳi＝ｍｉｎ(Ｓi,Ｄ２i)によりクリッピング信号ＣＳを求める。ここで、Ｓiは波形データＳのｉポイント目の輝度値、Ｄ２iは波形データＤ２のｉポイント目の輝度値である。また、ｍｉｎ(Ｓi,Ｄ２i)は波形データＳのｉポイント目の輝度値および波形データＤ２のｉポイント目の輝度値のうち低い方の輝度値を選択することを意味する。ＣＳiはクリッピング信号ＣＳのｉポイント目の輝度値である。このようにして求めたクリッピング信号ＣＳを図２６（ｄ）に示す。
【０２６５】
次に、次式（２）によりクリッピング相関係数を算出した。
【０２６６】
【数８】
上式（２）において、ＣＣはクリッピング相関係数であり、ＣＳiはクリッピング信号のｉポイント目の輝度値、ａiはデータベースに登録された波形データのｉポイント目の輝度値である。また、ｎは各波形データのポイント数である。
【０２６８】
ここでは、図２５（ｂ）のEscherichia coli K12の波形データＤ１および図２５（ｄ）のクリッピング信号ＣＳを用いて上式（２）から混合サンプルの波形データＳとEscherichia coli K12の波形データＤ１とのクリッピング相関係数ＣＣを求めた。また、図２６（ｂ）のSalmonella enteritidis GTC 131の波形データＤ２および図２６（ｄ）のクリッピング信号ＣＳを用いて上式（２）から混合サンプルの波形データＳとSalmonella enteritidis GTC 131の波形データＤ２とのクリッピング相関係数ＣＣを算出した。
【０２６９】
比較のために、同様の方法で混合サンプルの波形データＳと図２４のVibrio chorelae GTC 37の波形データＤ３とのクリッピング相関係数ＣＣを算出し、混合サンプルの波形データＳと図２４のBacillus subtilis ATCC 6051の波形データＤ４とのクリッピング相関係数ＣＣを算出した。
【０２７０】
表５に混合サンプルの波形データＳとEscherichia coli K12の波形データＤ１、Salmonella enteritidis GTC 131の波形データＤ２、Vibrio chorelae GTC 37の波形データＤ３およびBacillus subtilis ATCC 6051の波形データＤ４とのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣの算出結果を示す。
【０２７１】
【表５】
表５に示すように、混合サンプルの波形データＳとEscherichia coli K12の波形データＤ１とのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣならびに混合サンプルの波形データＳとSalmonella enteritidis GTC 131の波形データＤ２とのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣは、混合サンプルの波形データＳとVibrio chorelae GTC 37の波形データＤ３とのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣならびに混合サンプルの波形データＳとBacillus subtilis ATCC 6051の波形データＤ４とのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣに比べて高くなっている。
【０２７３】
この結果から、混合サンプルには、Escherichia coli K12およびSalmonella enteritidis GTC 131が含まれていることがわかる。
【０２７４】
また、クリッピング相関係数ＣＣはノーマル相関係数ＮＣに比べて高くなっている。例えば、例えば、０．５のクリッピング相関係数ＣＣを判定のしきい値とすることにより、混合サンプルに含まれている異なる種類の細菌の各々を高精度で識別することができる。
【０２７５】
［実施例３］
次に、実施例３においては、実施例１と同様の方法により６種類の細菌についてプライマーＡ８７を用いてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行った。得られた結果に基づいて波形データを作成した。６種類の細菌の波形データを検索用の波形データとしてデータベースに登録した。さらに、データベースに登録された図２７に示す６種類の細菌の波形データＥ１〜Ｅ６同士のノーマル相関係数およびクリッピング相関係数を求めた。
【０２７６】
図２７には、Escherichia coli K12の波形データＥ１、Escherichia coli GTC 837 (EAggEC)の波形データＥ２、Escherichia coli GTC 1062 (ETEC)の波形データＥ３、Salmonella enteritidis GTC 131 の波形データＥ４、Vibrio chorelae GTC 37の波形データＥ５およびBacillus subtilis ATCC 6051の波形データＥ６が示される。ここで、Escherichia coli（大腸菌）の後のK12 、GTC 837およびGTC 1062は異なる株を表している。
【０２７７】
図２８に上記の６種類の細菌の波形データＥ１〜Ｅ６同士のノーマル相関係数およびクリッピング相関係数の算出結果を示す。図２８の横軸は、Escherichia coli K12 (E.coli K12)、Escherichia coli GTC 837 (E.coli GTC 837)、Escherichia coli GTC 1062 (E.coli GTC 1062)、Salmonella enteritidis GTC 131 (S.enteritidis GTC 131)、Vibrio chorelae GTC 37 (V.chorelae GTC 37)およびBacillus subtilis ATCC 6051 (B.subtilis ATCC 6051)であり、棒グラフは横軸の各細菌の波形データと６種類の細菌の波形データＥ１〜Ｅ６とのノーマル相関係数およびクリッピング相関係数を示す。例えば、黒で塗りつぶされた棒グラフは、Escherichia coli K12の波形データＥ１と６種類の細菌の波形データＥ１〜Ｅ６とのノーマル相関係数およびクリッピング相関係数を示す。
【０２７８】
同じ細菌の波形データ同士のノーマル相関係数およびクリッピング相関係数は、いずれも１．０となっている。
【０２７９】
また、Escherichia coliの異なる株の波形データ同士のクリッピング相関係数は０．５以上となっている。これに対して、Escherichia coliの各株の波形データとSalmonella enteritidis GTC 131、Vibrio chorelae GTC 37およびBacillus subtilis ATCC 6051の波形データとのノーマル相関係数およびクリッピング相関係数は低くなっている。したがって、大腸菌の各株を識別することができるとともに、大腸菌とサルモネラ菌、ビブリオ菌および枯草菌とを区別することができる。
【０２８０】
［実施例４］
次に、実施例４においては、実施例１と同様の方法によりEscherichia coli（大腸菌）の６種類の株についてプライマーＡ８７を用いてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行った。得られた結果に基づいて波形データを作成した。６種類の株の波形データを検索用の波形データとしてデータベースに登録した。
【０２８１】
図２９には、Escherichia coliの６種類の株JCM1649、IFO 3301 (K12)、BL21、GIFU 11097 (EIEC)、GTC 1062(ETEC) およびGTC 1059 (EHEC)の波形データを示す。
【０２８２】
また、図２９に示すように、データベースに登録されたEscherichia coliの６種類の株の波形データを混合することによりEscherichia coliの６種類の株が混合された波形データを作成し、検索用の波形データとしてデータベースに登録した。
【０２８３】
さらに、データベースに登録されたEscherichia coliの６種類の株が混合された波形データとデータベースに登録されたEscherichia coliの６種類の株の各々の波形データとのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣを算出した。図２９にノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣの算出結果を示す。
【０２８４】
図２９に示すように、Escherichia coliの６種類の株が混合された波形データとEscherichia coliの６種類の株の各々の波形データとのクリッピング相関係数ＣＣはほぼ１となっている。したがって、同じ大腸菌の異なる複数の株を含むサンプルから個々の株を識別することができる。
【０２８５】
また、実施例１と同様の方法により図３０に示すEscherichia coliの４種類の株のサンプルおよびShigellaの４種類のサンプルについてプライマーＡ８７を用いてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行った。得られた結果に基づいて波形データを作成した。Escherichia coliの４種類の株の波形データおよびShigellaの４種類の株の波形データを検索用の波形データとしてデータベースに登録した。
【０２８６】
図３０には、Escherichia coliの４種類の株JM109、GTC 837 (EAggEC)、IFO 3366およびIFO 13500の波形データおよびShigellaの４種類の血清boydii GTC 779、flexneri GTC 780、sonnei GTC 781およびdysenteriae GTC 786の波形データが示される。ここで、Shigellaの後のboydii、flexneri、 sonneiおよびdysenteriaeは種名を表し、GTC 779、GTC 780、GTC 781およびGTC 786は株を表す。
【０２８７】
さらに、データベースに登録された図２９に示したEscherichia coliの６種類の株が混合された波形データと図３０に示したEscherichia coliの４種類の株の波形データおよびShigellaの４種類の波形データとのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣを算出した。
【０２８８】
図３０に、Escherichia coliの６種類の株が混合された波形データとEscherichia coliの４種類の株の波形データおよびShigellaの４種類の波形データとのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣの算出結果を示す。
【０２８９】
図３０に示すように、Escherichia coliの６種類の株が混合された波形データとEscherichia coliの異なる４種類の株の各々の波形データとのクリッピング相関係数ＣＣは１に近くなっている。したがって、データベースに登録された大腸菌の複数の株が混合された波形データを用いて同じ大腸菌の異なる株を検出することも可能である。
【０２９０】
また、Escherichia coliの６種類の株が混合された波形データとShigellaの４種類の各々の波形データとのクリッピング相関係数ＣＣも１に近くなっている。したがって、データベースに登録された大腸菌の複数の株が混合された波形データを用いて生物学的に近縁関係にある赤痢菌を検出することも可能である。
【０２９１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る微生物識別装置の一例を示す模式図である。
【図２】本発明に係る微生物識別方法の一例を示すフローチャートである。
【図３】図２の微生物識別方法に用いるＳＳＣ−ＰＣＲ法の一例を示すフローチャートである。
【図４】図３のＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ断片増幅装置の例を示す模式図である。
【図５】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第１のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図６】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの１回目のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図７】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの２回目のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図８】図２の微生物識別方法に用いる波形データの補正の工程を示すフローチャートである。
【図９】電気泳動像における背景むらの補正を示す模式図である。
【図１０】異なるゲルを用いた電気泳動像の例を示す図である。
【図１１】異なるゲルを用いた場合の泳動距離とＤＮＡサイズとの変換式を説明するための図である。
【図１２】電気泳動像の輝度分布を示す波形データの軸合わせを説明するための図である。
【図１３】電気泳動像の輝度分布を示す波形データの軸合わせおよび濃度調整を説明するための図である。
【図１４】図１０の電気泳動像から生成された波形データを示す図である。
【図１５】異なるプライマーを用いた電気泳動像の一例および連結された波形データの一例を示す図である。
【図１６】データベースに登録された細菌ごとの波形データおよびデータベースから抽出されて連結された波形データの一例を示す図である。
【図１７】サンプルから作成された波形データおよびデータベースから作成された波形データを示す図である。
【図１８】図１の解析用コンピュータとして用いられるパーソナルコンピュータの構成を示すブロック図である。
【図１９】細管型の電気泳動装置を用いた微生物識別装置のブロック図である。
【図２０】図１９の細管型の電気泳動装置により得られるセンサ出力波形の一例を示す図である。
【図２１】データベースから作成された連結された波形データを示す図である。
【図２２】サンプルから作成された連結された波形データを示す図である。
【図２３】データベースから作成された波形データとサンプルから作成された波形データとの比較による相関係数の計算を説明するための図である。
【図２４】実施例２における混合サンプルおよび４種類の細菌の波形データを示す図である。
【図２５】混合サンプルの波形データとEscherichia coli K12の波形データとのクリッピング信号の算出方法を説明するための図である。
【図２６】混合サンプルの波形データとSalmonella enteritidis GTC 131の波形データとのクリッピング信号の算出方法を説明するための図である。
【図２７】実施例３における６種類の細菌の波形データを示す図である。
【図２８】６種類の細菌同士のノーマル相関係数およびクリッピング相関係数の算出結果を示す図である。
【図２９】実施例４における大腸菌の６種類の株の波形データおよびこれらの波形データが混合された波形データを示す図である。
【図３０】大腸菌の４種類の株および赤痢菌の４種類の波形データを示す図である。
【符号の説明】
１ ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置
２ 電気泳動イメージ入力部
３ 解析用コンピュータ
４ データベース格納部
５ 結果表示手段
１１ ＤＮＡ
１２ａ，１２ｂ，１２ｃ，１２ｄ，１２ｅ １本鎖
１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄ，１３ｅ ２本鎖
２１ａ，２１ｂ，２１ｃ プライマー
５０ 支持プレート
５１，５１ａ，５１ｂ 孔部
Claims (11)
- 識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、
複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、
前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する出力信号を得るステップと、
前記出力信号に基づいて各プライマーに対応する波形データを求めるステップと、
照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する出力信号に関する情報が予め記憶されたデータベースを検索し、前記データベースに記憶された情報に基づいて前記照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する波形データを求め、前記識別対象となる微生物について求められた前記波形データと前記照合対象となる微生物について求められた前記波形データとの相関関係を求めるステップと、
前記相関関係に基づいて前記識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、
前記相関関係を求めるステップは、
前記識別対象となる微生物について求められた前記波形データの各点における信号出力値および前記照合対象となる微生物について求められた前記波形データの対応する各点における信号出力値のうち低い方の信号出力値を選択することによりクリッピング信号ＣＳを求めるステップと、
前記クリッピング信号と前記照合対象となる微生物について求められた前記波形データとの相関係数ＣＣを次式により算出するステップとを含み、
前記識別するステップは、前記相関係数ＣＣに基づいて前記識別対象となる微生物が前記照合対象となる微生物であるか否かを判定するステップを含むことを特徴とする微生物識別方法。 - 前記出力信号に関する情報は、前記出力信号の強度を示す波形データであることを特徴とする請求項１記載の微生物識別方法。
- 前記出力信号に関する情報は、前記出力信号の強度におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積を示すデータであり、
前記相関関係を求めるステップは、前記出力信号の強度におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積を示すデータに基づいて出力信号の強度を示す波形データを求めるステップを含むことを特徴とする請求項１記載の微生物識別方法。 - 前記相関関係を求めるステップは、前記出力信号の強度を示すデータに基づいて出力信号の強度を示す波形データを求めるステップを含むことを特徴とする請求項１記載の微生物識別方法。
- 既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて、前記参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、前記ポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより、前記参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、
前記参照用プライマーを用いて増幅された前記参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、前記参照用ＤＮＡに対応する出力信号を得るステップと、
前記参照用ＤＮＡに対応する出力信号に基づいて前記識別対象となる微生物に対応する出力信号を補正するステップとをさらに備えたことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微生物識別方法。 - ＤＮＡサイズマーカの出力信号を得るステップと、
前記出力信号に基づいてＤＮＡサイズマーカに対応する出力信号の強度を示す波形データを求めるステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカに対応する波形データに基づいて前記識別対象となる微生物に対応する波形データを補正するステップとをさらに備えたことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の微生物識別方法。 - 前記データベースには複数種類の微生物についての前記出力信号に関する情報が記憶されたことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の微生物識別方法。
- 前記相関関係を求めるステップは、前記識別対象となる微生物について求められた複数のプライマーに対応する前記波形データを連結し、かつ前記照合対象となる微生物について求められた複数のプライマーに対応する前記波形データを連結し、前記識別対象となる微生物についての連結された波形データと前記照合対象となる微生物についての連結された波形データとの相関関係を求めるステップを含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の微生物識別方法。
- 前記波形データを補正するステップは、前記ＤＮＡサイズマーカに対応する波形データに基づいて前記識別対象となる微生物に対応する波形データにおけるピークの位置を補正するステップを含むことを特徴とする請求項６記載の微生物識別方法。
- 識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、
複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、
前記増幅手段により前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段と、
前記電気泳動手段により得られた各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換する画像データ変換手段と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における輝
度分布を示す波形データを求める波形データ生成手段と、
照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する電気泳動像に関する情報が予め記憶されたデータベースを検索し、前記データベースに記憶された情報に基づいて前記照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する電気泳動像における輝度分布を示す波形データを求め、前記識別対象となる微生物について求められた前記波形データと前記照合対象となる微生物について求められた前記波形データとの相関関係を作成する相関関係作成手段と、
前記相関関係作成手段により作成された相関関係に基づいて前記識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、
前記相関関係作成手段は、
前記識別対象となる微生物について求められた前記波形データの各点における信号出力値および前記照合対象となる微生物について求められた前記波形データの対応する各点における信号出力値のうち低い方の信号出力値を選択することによりクリッピング信号ＣＳを求める手段と、
前記クリッピング信号と前記照合対象となる微生物について求められた前記波形データとの相関係数ＣＣを次式により算出する手段とを含み、
前記識別手段は、前記相関係数ＣＣに基づいて前記識別対象となる微生物が前記照合対象となる微生物であるか否かを判定する手段を含むことを特徴とする微生物識別装置。 - 識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、
複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、
前記増幅手段により前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する出力信号を得る電気泳動手段と、
前記出力信号に基づいて各プライマーに対応する波形データを求める波形データ生成手段と、
照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する出力信号に関する情報が予め記憶されたデータベースを検索し、前記データベースに記憶された情報に基づいて前記照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対応する波形データを求め、前記識別対象となる微生物について求められた前記波形データと前記照合対象となる微生物について求められた前記波形データとの相関関係を作成する相関関係作成手段と、
前記相関関係作成手段により作成された相関関係に基づいて前記識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、
前記相関関係作成手段は、
前記識別対象となる微生物について求められた前記波形データの各点における信号出力値および前記照合対象となる微生物について求められた前記波形データの対応する各点における信号出力値のうち低い方の信号出力値を選択することによりクリッピング信号ＣＳを求める手段と、
前記クリッピング信号と前記照合対象となる微生物について求められた前記波形データとの相関係数ＣＣを次式により算出する手段とを含み、
前記識別手段は、前記相関係数ＣＣに基づいて前記識別対象となる微生物が前記照合対象となる微生物であるか否かを判定する手段を含むことを特徴とする微生物識別装置。
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